PT2274623E - Método para o diagnóstico de hipertensão arterial pulmonar - Google Patents

Description

ΡΕ2274623 1

DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO DE HIPERTENSÃO ARTERIAL PULMONAR" O invento diz respeito ao diagnóstico e seguimento de hipertensão arterial pulmonar.

Estado da técnica: A hipertensão arterial pulmonar (HTAP) é uma patologia rara, responsável pelo aparecimento de descom-pensação cardíaca direita podendo conduzir à morte. 0 HTAP é definido quando evidenciado por cataterismo direito de uma pressão arterial pulmonar média superior ou igual a 25 mm Hg em repouso ou a 30 mm Hg em esforço na ausência de aumento da pressão capilar pulmonar (Rubin, 1997). 0 aparecimento de HTAP é consequência de uma obstrução crónica das pequenas artérias pulmonares na sequência da proliferação das células endoteliais, das células musculares lisas vasculares e de fibroblastos (Dorfmuller et al., 2003). Em particular, no decurso de HTAP grave, forma-se uma camada de miofibroblastos e de matriz extracelular que se localiza entre o endotélio e a membrana limitante elástica interna, designada neo-intima, que é caracte-rística desta afecção. 2 ΡΕ2274623 A HTAP pode surgir da evolução de patologias com uma componente imune que são as doenças do tecido conjuntivo, em particular a esclerodermia sistémica (Hachulla et al., 2005), a sindrome de Sharp e o lúpus eritematoso sistémico. Ainda, no decurso de HTAP idiopático, encontra-se de vez em quando os estigmas da auto-imunidade, ou seja anticorpos anti-nucleares ou anticorpos anti-tiroglobulina. A presença de anticorpos anti-células endoteliais (Tamby et ai., 2005) e de anticorpos anti-fibroblastos (Tamby et ai., 2006) foi descrita no decurso de HTAP idio-pática ou associada à esclerodermia sistémica. No entanto, o valor prognóstico destes anticorpos no aparecimento de HTAP não foi investigado e o papel potencial dos fenómenos auto-imunes na patogénese de HTAP idiopática mantém-se incerto (Mouthon et ai., 2005). Na maior parte dos casos, a HTAP é despistada quando o doente apresenta uma dispneia no estádio III ou IV. A partir do momento em que o doente é seguido para uma doença crónica como a esclerodermia sistémica, a HTAP é despistada por uma ecografia cardíaca anual. Assim, um teste simples e fiável de despistagem de HTAP é necessário e será importante para um diagnóstico o mais precoce possível, que permita estabelecer rapidamente estratégias terapêuticas para melhorar o estado do doente e as suas hipóteses de sobrevivência.

Sumário do invento: O invento fornece agora um processo in vitro de 3 ΡΕ2274623 detecção de HTAP ou de risco de desenvolver HTAP, compreendendo a determinação da presença e/ou quantidade de anticorpos anti-Tenascina C (TN-C) numa amostra biológica proveniente de um doente, a presença do anticorpo anti-TN-C sendo indicadora de HTAP ou de um risco de desenvolver HTAP.

De preferência, a presença de anticorpos anti-Tenascina C numa amostra biológica foi comparada com um valor controlo, a presença de anticorpos anti-Tenascina C numa quantidade superior ao valor controlo sendo indicador de HTAP ou de risco de desenvolver HTAP.

Um outro objectivo do invento é um processo in vitro de prognóstico ou de seguimento de HTAP, compreendendo a determinação da presença e/ou da quantidade de anticorpos anti-TN-C numa amostra biológica proveniente de um doente, em diferentes tempos, o aumento da quantidade de anticorpos anti-TN-C ao longo do tempo sendo indicador de um agravamento da HTAP.

Um outro objectivo do invento é um processo in vitro de avaliação da eficácia de um tratamento contra HTAP, compreendendo a determinação da presença e/ou da quantidade de anticorpos anti-TN-C numa amostra biológica proveniente de um doente, em diferentes tempos antes, durante ou após o tratamento, a diminuição da quantidade de anticorpos anti-TN-C ao longo do tempo sendo indicadora de melhoria da HTAP. 4 ΡΕ2274623

Descrição detalhada do invento: A TN-C é expressa no interior e à volta dos vasos sanguíneos no pulmão fetal (Rettig e tal., 1994), mas é mais expressa em seguida nas artérias pulmonares adultas normais (Jones e tal., 1996) . Assim, a perda de sinalização via BMPRII, na origem de um defeito das células T reguladoras, pode predispor ao aparecimento de HTAP (Nicolls et al., 2005), pode igualmente induzir a expressão da TN-C in vivo e nas células vasculares em cultura (Ihida-Stansbury et al., 2006). Nesta base, os inventores coloca ram a hipótese de os doentes com HTAP poderem desenvolver uma resposta imune dirigida contra a TN-C. Igualmente decidiram pesquisar anticorpos anti-TN-C no soro de doentes que sofrem de HTAP.

Os inventores puderam assim pôr em evidência uma correlação entre o aparecimento de HTAP e a produção de anticorpos anti-TN-C. Com base nisto, eles propõem um processo in vitro de diagnóstico ou de prognóstico de HTAP ou de risco de desenvolver HTAP, compreendendo a determinação da presença e/ou da quantidade de anticorpos anti-TN-C numa amostra biológica proveniente de um doente. Os anticorpos anti-TN-C detectados são preferencialmente imunoglobulinas G (IgG).

Definições A Tenascina C (ou TN-C) é uma glicoproteina da matriz extracelular. É igualmente conhecida como 5 ΡΕ2274623 "hexabrachion" ou citotactina. Uma sequência da TN-C humana está descrita em anexo (SEQ ID N0:1). 0 termo "amostra biológica" refere-se a qualquer amostra biológica proveniente de um doente. Exemplos de amostras incluem fluidos biológicos, biopsias de tecidos. De preferência, a amostra pode ser sangue, soro, saliva, urina, esperma. Ainda mais de preferência, a amostra biológica é uma amostra de sangue ou de soro. 0 termo "doente" refere-se a qualquer indivíduo susceptível de ser testado. De preferência, trata-se de um ser humano, mas o termo inclui qualquer outro mamífero, como sejam cães, gatos, roedores, gado, cavalos, símios, etc. 0 doente pode ser testado qualquer que seja o seu sexo ou idade. 0 doente pode ser um indivíduo em risco, ser assintomático ou apresentar sinais precoces ou avançados de HTAP. Por exemplo, o doente pode ser um indivíduo com predisposição para desenvolver HTAP, em particular um indivíduo portador de uma ou mais mutações no gene codificador de BMPRII. 0 termo "diagnóstico" significa a identificação da patologia ou a avaliação do estado de gravidade da patologia. 0 termo "prognóstico" significa a avaliação do risco de agravamento e das suas consequências. 6 ΡΕ2274623 0 termo "valor controlo" refere-se a um valor basal correspondendo à média dos valores obtidos com a amostra biológica de indivíduos saudáveis, não afectados por HTAP ou doença susceptível de conduzir a HTAP. Pode-se tratar de um valor estatístico de referência.

Para avaliar a evolução da patologia, pode ser útil testar um doente e controlar o efeito de um tratamento ou a evolução da patologia, testando de novo o doente, por exemplo com vários meses de intervalo. Neste caso, os resultados do segundo teste são comparados com os resultados do primeiro teste, assim como por vezes com o valor "controlo". Uma quantidade de anticorpo anti-TN-C "superior ao valor controlo" significa geralmente um aumento estatisticamente significativo, por exemplo em pelo menos dois desvios padrões acima da média das densidades ópticas das reacções de IgG do conjunto dos indivíduos saudáveis.

Por "antigénio de captura", entende-se um antigénio, de preferência fixado numa fase sólida, que é capaz de reter o anticorpo anti-TN-C presente numa amostra biológica, por ligação de afinidade. 0 antigénio de captura pode ser marcado. 0 termo "marcado" refere-se assim a uma marcação directa (por ligação de enzimas, isótopos radioactivos, fluorocromos, compostos luminescentes, etc.) e igualmente a uma marcação indirecta (por exemplo, pela ligação de 7 ΡΕ2274623 anticorpos eles próprios marcados de forma directa ou com a ajuda de reagentes de um "par de afinidade" marcado, tais como o par avidina marcada-biotina, etc mas não lhe estando limitado).

Doseamento de anticorpos: A amostra biológica é de preferência uma amostra de soro, diluída a 1/100 ou ainda, por exemplo, a 1/200 ou 1/400.

De forma vantajosa, a quantidade de anticorpo anti-TN-C pode ser determinada por um imunoensaio. A amostra biológica pode ser eventualmente tratada numa etapa prévia, ou adicionada directamente ao antigénio de captura. 0 processo de acordo com o invento pode ser realizado de acordo com diversos formatos conhecidos dos familiarizados com a matéria: em fase sólida ou em fase líquida; num passo ou em dois passos; em método competitivo, apenas como exemplos não limitantes.

De acordo com uma realização preferida, o antigénio de captura é imobilizado numa fase sólida. Pode-se utilizar, como exemplos não limitantes de fase sólida, microplacas, em particular microplacas de polistireno, tais como as comercializadas pela empresa Nunc, Dinamarca. Pode- 8 ΡΕ2274623 se igualmente utilizar partículas ou esferas sólidas, esferas paramagnéticas, como sejam as comercializadas pela Dynal ou pela Merck-Eurolab (França) (com a marca EstaporTM) ou ainda tubos de ensaio em polistireno ou em polipropileno, etc.

Um formato de imunoensaio de detecção de anticorpos por competição é igualmente possível. Outras modalidades de imunoensaio podem ser ainda consideradas e são conhecidas dos familiarizados com a matéria.

Os ensaios de ELISA, radioimunoensaios ou qualquer outra técnica de detecção podem ser empregues para revelar a presença de complexos antigénios-anticorpos formados.

De acordo com uma realização preferida, o processo do invento compreende o contacto de uma amostra biológica com uma proteína compreendendo o fragmento de aminoácidos 181 a 290 da sequência TN-C humana conforme apresentado em SEQ ID NO:l.

Num exemplo particular, o antigénio de captura, que pode ser uma proteína compreendendo o fragmento de aminoácidos 181 a 2 90 da sequência TN-C humana, pode ser acoplado a uma glutationa S transferase (GST), antes de ser colocado numa microplaca. As amostras de soro a testar, previamente diluídas a 1/100, são incubados na microplaca. Após lavagem, os anticorpos anti-Fc γ humana marcados (por 9 ΡΕ2274623 exemplo com uma fosfatase alcalina) são adicionados, os complexos sendo revelados (por exemplo pela adição de um substrato da fosfatase cuja clivagem pode ser detectada pela leitura da absorvância).

Doentes alvo:

Os doentes alvo são os susceptiveis de desenvolver HTAP. Pode tratar-se de um doente que sofre de uma doença do tecido conjuntivo, como seja esclerodermia sistémica, uma sindrome de Sharp (que é uma doença do tecido conjuntivo misto), um lúpus eritematoso sistémico. 0 doente pode igualmente sofrer de HTAP idio-pática ou familiar. Mais geralmente, qualquer doente atingido por uma doença vascular pulmonar pode ser vantajosamente submetido a um processo de detecção de HTAP como definido no invento.

Por outro lado, a HTAP detectada pode ser também hipertensão porto-pulmonar (ou seja uma HTAP associada a uma hipertensão portal) ou estar associada a uma cardiopatia congénita ou a uma infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH) ou ainda ser uma hipertensão pulmonar pós-embólica, complicação da evolução de uma bronquite crónica obstrutiva ou de uma cardiopatia cianótica.

Outros doentes alvo são os expostos a deter- 10 ΡΕ2274623 minados medicamentos para emagrecimento como a fenfluramina cuja prescrição pode contribuir para o aparecimento de HTAP. Outras pessoas susceptiveis de beneficiar deste tipo de teste são as portadoras de uma mutação no gene codificador de BMPRII e que eventualmente não apresentam HTAP detectável na ecografia, de forma a despistar os indivíduos susceptiveis de desenvolver subsequentemente HTAP.

Avaliação da eficácia de um tratamento

Um outro objectivo do invento é um processo in vitro de avaliação da eficácia de um tratamento contra HTAP, compreendendo a determinação da presença e/ou quantidade de anticorpo anti-TN-C numa amostra biológica proveniente de um doente, em diferentes tempos antes, durante ou após tratamento, a diminuição da quantidade de anticorpo anti-TN-C durante o tratamento sendo indicadora de uma melhoria da HTAP. O tratamento clássico actual da HTAP associa um tratamento sintomático e um tratamento vasodilatador. O tratamento sintomático associa anticoagulantes, oxigeno-terapia e diuréticos. O tratamento vasodilatador assenta nas seguintes moléculas: bloqueadores dos canais de cálcio, epoprostenol (prostaciclina) prescrito por via intravenosa em perfusão continua, os inibidores dos receptores da endotelina, selectivos ou não, em particular o bosentan e o ambrisentan, os inibidores de fosfodiesterases do tipo 5 em 11 ΡΕ2274623 particular o sildenafil, o conjunto destes medicamentos sendo administrado por via oral, e o iloprost inalado, análogo da prostaciclina administrada por via inalada. Estes tratamentos podem ser eventualmente combinados. Em caso de falência destes fármacos, um transplante pulmonar ou de coração-pulmões pode ser proposto.

As figuras e exemplos que se seguem ilustram o invento sem limitar o seu âmbito.

Legenda das figuras: A figura 1 é um gráfico que mostra a detecção de anticorpos anti-TN-C pelo ensaio de ELISA. As IgG séricas dos doentes atingidos por HTAP idiopática, de doentes atingidos por esclerodermia sistémica e de indivíduos saudáveis agrupados pelo género e idade, foram testados relativamente a um fragmento de TN-C recombinante, a uma diluição de 1/100. Os limites inferior e superior da zona a ponteado representam os patamares definidos por duas e três vezes o desvio padrão acima da média das densidades ópticas obtidas nos indivíduos saudáveis. As diferenças significativas entre os grupos de doenças e os indivíduos saudáveis são calculadas com a ajuda de um teste de Mann Whitney para dois grupos independentes e estão indicadas por: *:p<0,01 **:p<0,001. 12 ΡΕ2274623 A figura 2 representa as curvas de sobrevivência segundo Kaplan e Meier em função da presença ou da ausência de anticorpos anti-TN-C. Em abcissa, o tempo em meses; em ordenada, a sobrevivência acumulada em percentagem.

Exemplo: detecção de anticorpos anti-Tenascina C em doentes atingidos por hipertensão arterial pulmonar

Materiais e métodos:

Doentes A HTAP foi despistada por ecografia cardíaca trans-torácica de uma pressão arterial pulmonar sistólica superior a 40 mm Hg. Em todos os casos, a HTAP foi confirmada pela realização de um cataterismo direito e uma pressão arterial pulmonar média superior ou igual a 25 mm Hg em repouso e de 30 mm Hg em esforço. Por convenção, a HTAP foi qualificada como idiopática se o doente não demonstrava qualquer patologia associada, a HTAP pode então corresponder a uma HTAP esporádica, familiar ou associada a uma exposição à fenfluramina. 91 doentes foram incluídos no estudo compreendendo 66 (72,5%) dos doentes com HTAP idio pática (IPAH) e 25 doentes com esclerodermia sistémica que responde aos critérios do American College of Rheumatology (ACR) e/ou aos critétios de LeRoy et Medsger (Masi et al., 1980; LeRoy et al., 2001). 13 ΡΕ2274623

Todos os doentes com esclerodermia sistémica difusa sem HTAP tinham uma lesão intersticial pulmonar evidenciada por uma tomografia axial computarizada torácica de alta resolução e uma capacidade vital inferior a 80% do valor previsto e/ou um coeficiente de transferência de monóxido de carbono (DLCO) inferior a 75% do valor previsto. Nenhum dos doentes recebeu corticóides ou imuno-supressores no momento da colheita das amostras, nenhum entre eles tinha tumor sólido ou outra doença do tecido conjuntivo associada. 46 indivíduos saudáveis concordantes em género e idade foram utilizados como controlos.

Doseamento por ELISA A Tenascina c (TN-C) foi adquirida à empresa Abnova (Abnova Corporation, Taipei, Taiwan). O antigénio utilizado era constituído pelo fragmento 181 a 290 da TN-C (SEQ ID NO:l) acoplado a um motivo GST. A TN-C foi diluída em tampão de bicarbonato e depositada em placas de 96 alvéolos (Maxisorb, NalgeNunc Int. Rochester, NY, USA) numa concentração final de 4 pg/ml a 4°C. Os soros de doentes e de indivíduos saudáveis foram diluídos a 1/100 num tampão fosfato (PBS) a 1% de albumina e incubados uma hora a 37°C. Após uma lavagem, anticorpos de coelho anti-FcY humana conjugados com fosfatase alcalina (Dakocytomation, Golstrup, Denmark) foram adicionados e incubados durante uma hora à temperatura ambiente. As reactividades foram reveladas através da adição de p-nitrofenilfosfato a 0,05M em tampão 14 ΡΕ2274623 de carbonato de magnésio (pH 9,8) e a absorvância a 405 nm foi determinada usando um leitor de placas de ELISA (Fusion, Packard BioScience, Meriden, CT, USA). Para avaliar a variabilidade entre os poços, a densidade óptica de um soro de referência foi arbitrariamente definida como 100% da actividade anti-TN C. Os resultados das amostras testadas foram calculados a partir da média da absorvância dos poços em duplicado e expressos como uma percentagem deste valor de referência. Todas as amostras foram testadas em duplicado.

Análises estatísticas

Todas as análises estatísticas foram efectuadas usando o programa Systat (versão 11.0 Systat Software Inc., Point Richmond, CA, USA) . Um teste de Mann-Whitney foi usado para comparar as densidades ópticas relativas dos diferentes grupos. Valores de P inferiores a 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos. A sobrevivência foi calculada pelo método de Kaplan e Meier (Kaplan e Meier, 1958) .

Resultados:

As reactividades das IgGs dos doentes atingidos por HTAP idiopática, dos doentes atingidos por esclero-dermia sistémica com ou sem HTAP e dos indivíduos controlo para TN-C foram estudados por ELISA. Usando um patamar 15 ΡΕ2274623 definido por dois desvios padrões acima da média das densidades ópticas das reactividades de IgG do conjunto de indivíduos saudáveis, 36/66 (54,5%) dos doentes com uma HTAP idiopática e 2/25 (8%) dos doentes esclerodérmicos tinham IgGs anti-TN-C. Nenhum dos indivíduos saudáveis tinha IgG anti-TN-C (Figura 1). Quando o patamar era deslocado para três desvios padrões acima da média das reactividades de IgG dos indivíduos saudáveis, 12/66 (18,1%) dos doentes com HTAP idiopática tinham IgG anti-TNC e nenhum doente esclerodérmico tinha IgG anti-TN-C. As reactividades das IgGs séricas dos anticorpos anti-TN-C de doentes tendo HTAP idiopática eram significativamente mais elevadas que as de doentes esclerodérmicos (p<0,001) e que as de indivíduos saudáveis (p<0,001). Do mesmo modo, as reactividades das IgG séricas dos anticorpos antiTN-C de doentes esclerodérmicos eram significativamente mais elevadas que as de indivíduos saudáveis (p=0,021) (Figura D · Não foi posta em evidência diferença significativa na apresentação clínica e nos dados da ecografia cardíaca, do cataterismo direito e do teste da marcha de 6 minutos entre os dois grupos de doentes. A sobrevivência estava diminuída no grupo dos doentes com anticorpos anti-TN-C comparativamente com os doentes que não tinham anticorpos anti-TN C sem que, no entanto, esta diferença fosse significativa (p=0,17). 16 ΡΕ2274623 0 aparecimento de uma resposta imune dirigida contra TN C poderá resultar dos mesmos mecanismos que conduzem à indução da expressão de TN C e à proliferação de células musculares lisas. A presença de anticorpos anti-TN C estaria assim correlacionada com o aparecimento de uma remodelação vascular, constituindo um marcador do surgimento de HTAP.

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Tamby et al, 2006, Eur Respir J 28(4):799-807 17 ΡΕ2274623

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Assistance Publique Hopitaux de Paris <120> Processo de diagnóstico de hipertensão arterial pulmonar <130> B0700 <160> 1 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 2201 <212> PRT <213> Homo sapiens <22 0> <221> MISC_FEATURE <222> (181)..(290) <223> fragmento antigénico <400> 1

Met Gly Ala Met Thr Gin Leu Leu Ala Gly Vai Phe Leu Ala Phe Leu 15 10 15

Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Vai Leu Lys Lys Vai Ile Arg His Lys 20 25 30

Arg Gin Ser Gly Vai Asn Ala Thr 35 40

Leu Pro Glu Glu Asn Gin Pro Vai 45

Vai Phe Asn His Vai Tyr Asn Ile 50 55

Lys Leu Pro Vai Gly Ser Gin Cys 60

Ser Vai Asp Leu Glu Ser Ala Ser 65 70

Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro 75 80

Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gin 85

Glu His Thr Vai Asp Gly Glu Asn 90 95

Gin lie Vai Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly 100 105 110

Cys Ala Ala Ala Pro Asp Vai Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu 115 120 125

Leu Glii Asn Leu Vai Ser Ser Leu Arq Glu Gin Cys Thr Ala Gly Ala 130 135 * 140 18 ΡΕ2274623

Gly Cys Cys Leu Gin Pro Ala Thr Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe 145 150 155 160

Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Sar Thr Gly Gly Cys Gly Cys Vai Cvs 165 170 175

Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu Fro Glu Cys Pro Gly ISO 185 190

Asn Cys Eis Leu Arg Gly Arg Cys Ile Asp Gly Gin Cys Ile Cys Asp 195 200 205

Asp Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gin Leu Ala Cys Pro Ser Asp 210 215 220

Cys Asn Asp Gin Gly iys Cys Vai Asn Gly Vai Cys Ile Cys Phe Glu 225 230 235 240

Gly Tyr Ala Gly Ala Asp Cys Ser Arg Glu lie Cvs Fro Vai Pro Cys 245 250 ' 255

Ser Glu Glu Hís Gly Thr Cys Vai Asp Gly Leu Cys Vai Cys Hís Asp 260 265 270

Gly Phe Ala Gly Asp Asp Cys Asn Lys Pro Leu Cys Leu Asn Asn Cys 275 280 285

Tyr Asn Arg Gly Arg Cys Vai Glu Asn Glu Cys Vai Cys Asp Glu Gly 290 295 300

Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Leu Ile Cys Fro Asn Asp Cys Phe 305 310 315 320

Asp Arg Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Glu Glu Gly Phe 325 330 ' 335

Thr Gly Glu Asp Cys Gly Lys Pro Thr Cys Fro His Ala Cys Eis Thr 340 345 350

Gin Gly Arg Cys Glu Glu Gly Gin Cys Vai Cys Asp Glu Gly Phe Ala 355 360 365

Gly Leu Asp Cys Ser Glu Lys Arg Cys Pro Ala Asp Cys His Asn Arg 370 375 380

Gly Arg Cys Vai Asp Gly Arg Cys Glu Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly 19 ΡΕ2274623 385 390 395 400

Ala Asp Cys Gly Glu Leu Lys Cys Pro Asn Gly Cys Ser 61y His Gly 405 410 415

Arg Cys Vai Asn Gly Gin Cys Vai Cys Asp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu 420 425 430

Asp Cys Ser Gin Leu Arg Cys Pro Asn Asp Cys His Ser Arg Gly Arg 435 440 445

Cys Val Glu Gly Lys Cys Vai Cys Glu Gin Gly Phe Lys Gly Tyr Asp 450 455 460

Cys Ser Asp Met Ser Cys Pro Asn Asp Cys Hís Gin His Gly Arg Cys 465 470 475 480

Val Asn Gly Met Cys Val Cys Asp Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys 485 490 4 95

Arg Asp Arg Gin Cys Pro Arg Asp Cys Ser Asn Arg Gly Leu Cys Vai 500 505 510

Asp Gly Gin Cys Vai Cys Glu Asp Gly Phe Thr Gly Pro Asp Cys Ala 515 520 525

Glu Leu Ser Cys Pro Asn Asp Cys Hís Gly Gin Gly Arg Cys Vai Asn 530 535 540

Gly Gin Cys Val Cys His Glu Gly Phe Met Gly Lys Asp Cys Lys Glu 545 550 555 560

Gin Arg Cys Pro Ser Asp Cys His Gly Gin Gly Arg Cys Val Asp Gly 565 570 575

Gin Cys lie Cys His Giu Gly Phe Thr Gly Leu Asp Cys Gly Gin Hís 580 585 590

Ser Cys Pro Ser Asp Cys Asn Asn Leu Gly Gin Cys Val Ser Gly Arg 595 600 605

Cys lie Cys Asn Glu Gly Tyr Ser Gly Giu Asp Cys Ser Glu Val Ser 610 6X5 620

Pro pro Lys Asp Leu Vai Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val Asn 625 630 635 640 20 ΡΕ2274623

Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Vai Thr Glu Tyr Leu Vai Vai Tyr 645 650 655 Thr Pro Thr Bis Glu Gly Gly Leu Glu Mefc Gin Phe Arg Vai Pro Gly 660 665 670 Asp Gin Thr Ser Thr Ile Ile Gin Glu Leu Glu Pro Gly Vai Glu Tyr 675 680 685 Phe Ile Arg Vai Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro Vai 690 695 700 Ser Ala Arg Vai Ala Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe 705 710 715 720 Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Vai Glu Vai Glu Trp Asp Pro Leu Asp 735 730 735 Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu 740 745 750 Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr 755 760 765 Arg Gin Thr Gly Leu Ala Pro Gly Gin Glu Tyr Glu lie Ser Leu Hís 770 775 780 Ile Vai Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Vai Thr Thr 785 790 795 800 Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gin Ile Glu Vai Lys Asp Vai Thr Asp 805 810 815 Thr Thr Ala Leu lie Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly 820 825 830 Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Vai Pro Gly Asp Arg Thr Thr 835 840 845 ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gin Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys 850 855 860 Pr© Asp Thr Glu Tyr Glu Vai Ser Leu Ile Ser Arg Arg C-iy Asp Met 865 870 875 880 21 ΡΕ2274623

Ser Ser Ase Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu Asp .Ala Pro 885 890 895 Arg Asn Leu Arg Arg Vai Ser Gin Thr Asp Asn Ser Ile Thr Leu Glu 300 905 910 Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Ile Lys Tvr Ala 315 920 925 Pr o lie Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Vai Asp Vai Pro Lys Ser Gin 330 935 940 Gin AX-St Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly Leu Arg Pro Gly Thr Glu 345 950 955 960 Tyr Giy 118 Gly Vai Ser Ala Vai Lys Glu Asp Lys Glu Ser Asn Pro 965 970 975 Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp Thr Pro Lys .Asp Leu Gin 980 985 990 Vai Ser Glu Thr J Ala Glu Thr : Ser Leu Thr Leu ; Leu Trp Lys Thr Pro 395 1000 1005 Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr Ser Leu Pro Thr 1010 1015 1020 Gly Gin Trp Vai Gly Vai Gin Leu Pro Arg Asn Thr Thr Ser Tyr 1025 1030 1035 Vai Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gin Glu Tyr Asn Vai Leu Leu 1040 1045 1050 Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Vai Lys 1055 1060 1065 Ala Ser Thr Glu Gin Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Vai Thr 1070 1075 10S0 Glu Vai Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp 1085 1090 1095 Gin Ala Tyr Glu HiS Phe Ile Ile Gin Vai Gin Glu Ala Asn Lys 1100 1105 1110 22 ΡΕ2274623

Vai Glu 1115 Ala Ala Arg Asn Leu 1120 Thr Vai Pro Gly Ser 1125 Leu Arg Ala Vai Asp 1130 lis Pro Gly Lea Lys 1135 Ala Ala Thr Pro Tyr 1140 Thr Vai Ser Ile Tyr 1145 Gly Vai Ile Gin Gly 1150 Tyr Arg Thr Pro Vai 1155 Leu Ser Ala Giu Ala 1160 Ser Thr Gly Glu Thr 1165 Pro Asn Leu Gly Glu 1170 Vai val val Ala Glu 1175 Vai Gly Trp Asp Ala 1180 Leu Lys Leu Asn Trp 1185 Thr Ala Pro Giu Gly 1190 AI & Tyr Glu Tyr Phe 1195 Phe Ile Gin Vai Gin 1200 Giu Ala Asp Thr Vai 1205 Glu Ala Ala Gin Asn 1210 Leu Thr Vai Pro Gly 1215 Gly Leu Arg Ser Thr 1220 Asp Leu Pro Gly Leu 1225 Lys Ala Ala Thr His 1230 Tyr Thr Ile Thr ile 1235 Arg Gly Vai Thr Gin 1240 Asp Phe Ser Thr Thr 1245 Pro Leu Ser Vai Glu 1250 Vai Leu Thr Glu Glu 1255 Vai Pro Asp fíet Gly 1260 Asn Leu Thr Vai Thr 1265 Glu Vai Ser Trp Asp 1270 Ala Leu Arg Leu Asn 1275 Trp Thr Thr Pr o Asp 1280 Gly Thr Tyr Asp Gin 1285 Phe Thr Ile Gin Vai 1290 Gin Glu Ala ASP Gin 1295 Vai Glu Glu Ala His 1300 Asn Leu Thr Vai Pro 1305 Gly Ser Leu Arg Ser 1310 Mefc Giu ile Pro Gly 1315 Leu Arg Ala Gly Thr 1320 Pro Tyr Thr Vai Thr 1325 Leu His Gly Glu Vai 1330 Arg Gly His Ser Thr 1335 Arg Pro Leu Ala Vai Glu vai Vai Thr Glu Asp Pro Gin Leu Gly Asp Leu 23 ΡΕ2274623 1340 1345 1350 Ala Vai 1355 Ser Glu Val Giy Trp 1360 Asp Giy Leu Arg Leu 1365 Asn Trp Thr Ala Ala 1370 Asp Asn Ala Tyr Glu 1375 His Phe Val Ile Gin 1380 Val Gin Glu Vai Asn 1385 Lys Vai Glu Ala Ala 1330 Glu Asn Leu Thr Leu 1395 Pro Giy Ser Leu Arg 1400 Ala Vai Asp Ile Pro 1405 Giy Leu Glu Ala Ala 1410 Thr Pro Tyr Arg Vai 1415 Ser Ile Tyr Giy Val 1420 Ile Arg Giy Tyr Arg 1425 Thr Pro Val Leu Ser 1430 Ala Glu Ala Ser Thr 1435 Ala Lys Glu Pro Glu 1440 Ile Giy Asn Leu Asn 1445 Vai Ser Asp ile Thr 1450 Pro Glu Ser Phe Asn 1455 Leu Ser Trp Met Ala 1460 Thr Asp Giy He Phe 1465 Glu Thr Phe Thr Ile 1470 Glu ile Ile Asp Ser 1475 Asn Arg Leu Leu Glu 1480 Thr Val Glu Tyr Ago 1485 ile Ser Giy Ala Gus 14 30 Arg Thr Ala Bis I.le 1495 Ser Giy Leu Pro Pro 1500 Ser Thr Asp Phe Ile 1505 Vai Tyr Leu Ser Giy 1510 Leu Ala Pro Ser Ile 1515 Arg Thr Lys Thr Ile 1520 Ser Ala Thr Ala Thr 1525 Thr Glu Ala Leu Pro 1530 Leu Leu Glu Asn Leu 1535 Thr Ile Ser Asp Ile 1540 Asn Pro Tyr Giy Phe 1545 Thr Val Ser Trp Met 1550 Ala Ser Glu Asn Ala 1555 Phe Asp Ser Phe Leu 3 560 Val Thr Val Vai Asp 1565 Ser Giy Ly3 Leu Leu 1570 Asp Pro Gin Glu Phe 1575 Thr Leu Ser - 24 - ΡΕ2274623

Gly Thr 1580 Gin Arg Lys Leu Glu 1585 Leu Arg Gly Leu ile 1590 Thr Gly lie Gly Tyr 1585 Glu Vai Met Vai Ser 1600 Gly Phe Thr Gin. Gly 1605 Hís Glu Thr Lys Pro 1610 Leu Arg Ala Glu Ile 1615 Vai Thr Glu Ala Glu 1620 Pro Glu val Asp Asn 1625 Leu Leu Vai Ser Asp 1630 Ala Thr Pro Asp Gly 1635 Phe Arg Leu Se κ- Trp 1640 Thr Ala Asp Glu Gly 1645 Val Phe Asp Àsn Phe 1650 Val Leu Lys Ι le Arg 1655 Asp Thr Lys Lys Gin 1660 Ser Glu Pro Leu Glu 1665 Ile Thr Leu Leu Ala 1670 Pro Glu Arg Thr Arg 1675 Asp Leu Thr Gly Leu 1680 Arg Glu Ala Thr Glu 1685 Tyr Glu Ile Glu Leu 1690 Tyr Gly Ile Ser Lvs 1695 Gly Arg Arg Ser Glu 1700 Thr Vai Ser Aia Ile 1705 Ala Thr Thr Ala Met mo Gly Ser Pro Lys Glu 1715 Vai Ile Phe Ser Asp 1720 Ile Thr Glu Âsn Ser 1725 Ala Thr Val Ser Trp 1730 Arg Ala Pro Thr Ala 1735 Gin Val Glu Ser Phe 1740 Arg Ile Thr Tyr vai 1745 Pr o Ile Thr Gly Gly 1750 Thr Pro Ser Met Val 1755 Thr Val Asp Gly Thr 1760 Lys Thr Gin Thr Arg 1765 Leu Val Lys Leu lie 1770 Pro Gly Val Glu Tyr 1775 Leu Vai Ser Ile Ile 1780 Ala Met Lys Gly Phe 1785 Glu Glu Ser Glu Pr o 1700 Vai Ser Gly Ser Phe 17 95 Thr Thr AX a Leu Asp 1800 Gly Pro Ser 25 ΡΕ2274623

Gly Leu Vai Thr Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Arg 1805 1810 1815 írp Gin Pro Ala lie Ala Thr Vai Asp Ser Tyr Vai Ile Ser Tyr 1820 1825 1830

Thr Gly Glu Lys Vai Pro Glu lie Thr Arg Thr Vai Ser Gly Asn 1835 1840 1845

Thr Vai Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 1850 1855 1860

Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gin Lys Ser Ser Thr 1865 1870 1875

Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp Leu 1880 1885 1890

Thr Ala Thr Glu vai Gin Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg 1895 1900 1905

Pro Pro Arg Ala Ser Vai Thr Gly Tyr Leu Leu Vai Tyr Glu Ser 1910 1S15 1920

Vai Asp Gly Thr Vai Lys Glu Vai Ile Vai Gly Pro Asp Thr Thr 1925 1930 1935

Ser Tyr Ser Leu Ala 1940

Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr Thr Ala 1945 1950

Lys lie Gin Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Mefc Ile Gin 1955 1960 1965

Thr lie Phe Thr Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Lys Asp 1970 1975 1980

Cys Ser Gin Ala Mefc Leu Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr 1985 1990 1995

Thr Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Ala Gin Ala Leu Glu Vai Phe 2000 2005 2010

Cys Asp Met Thr Ser Asp Gly Gly Gly Trp Ile Vai Phe Leu Arg 2015 2020 2025 26 ΡΕ2274623

Arg Lys Asn Gly Arg Glu Asn Phe Tyr Gin Asn Trp Lys Ala Tyr 2030 2035 2040

Ala Ala Gly Phe Gly Asp Arg Arg Glu Glu Phe Trp Leu Gly Leu 2045 2050 ’ 2055

Asp Asn Leu Asn Lys Ile Thr Ala Gin Gly Gin Tyr Glu Leu Arq 2060 2065 2070

Vai Asp Leu Arg Asp His Gly Glu Thr Ala Phe Ala Vai Tyr Asp 2075 2080 2085

Lys Phe Ser Vai Gly Asp Ala Lys Thr Arg Tyr Lys Leu Lys Vai 2090 2095 ' 2100

Glu Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met Ala Tyr His Asn 2105 2110 2115

Gly Arg Ser Phe Ser Thr Phe Asp Lys Asp Thr Asp Ser Ala Ile 2120 2125 2130

Thr Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe Trp Tyr Arg Asn 2135 2140 2145

Cys His Arg Vai Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp Asn Asn His 2150 2155 2160

Ser Gin Gly Vai Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu His Ser 2165 2170 2175 lie Gin Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg Asn 2180 2185 2190

Leu Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala 2195 2200

Lisboa, 15 de Dezembro de 2011

Claims (15)

1. ΡΕ2274623 1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo in vítro de detecção de hipertensão arterial pulmonar (HTAP), ou de risco de desenvolvimento de HTAP, compreendendo a determinação da presença e/ou da quantidade de anticorpos anti-Tenascina C numa amostra biológica proveniente de um doente, a presença de anticorpos anti-Tenascina C sendo indicadora de HTAP ou de risco de desenvolvimento de HTAP.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual a amostra biológica é uma amostra de sangue ou de soro.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, no qual a presença de anticorpos anti-Tenascina na amostra biológica é comparada com um valor controlo, a presença de anticorpos anti-Tenascina C em quantidade superior ao valor controlo sendo indicadora de HTAP ou de risco de desenvolvimento de HTAP.
4. 4. Processo de acordo com as reivindicçaões 1 a 3, no qual a quantidade de anticorpo anti-Tenascina C é determinada por um imunoensaio.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, no qual o imunoensaio é um ensaio de ELISA. 2 ΡΕ2274623
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, compreendendo o contacto da amostra biológica com uma proteína compreendendo o fragmento de aminoácidos 181 a 290 da sequência de Tenascina C humana como apresentado em SEQ ID NO:1. reivindica-
7. 7. Processo de acordo com uma das ções 1 a 6, na qual o doente é um ser humano.
8. 8 . ções 1 a 7, sistémica. Processo de acordo com uma das reivindica-no qual o doente sofre de esclerodermia
9. 9. Processo de acordo com uma das revindicações 1 a 7, no qual o doente sofre de síndrome de Sharp.
10. 10. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, no qual o doente sofre de lúpus eritematoso sistémico.
11. 11. Processo de acordo com uma das reivindi cações 1 a 7, no qual o doente sofre de HTAP idiopática.
12. 12. Processo de acordo com uma das reivindi cações 1 a 7, na qual a HTAP está associada a uma hipertensão portal, a uma cardiopatia congénita ou a uma infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou é hipertensão pulmonar pós-embólica. 3 ΡΕ2274623
13. 13. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, no qual o doente é um indivíduo predisposto a desenvolver HTAP, o referido indivíduo sendo de preferência portador de uma ou mais mutações no gene codificador de BMPRII.
14. 14. Processo in vitro de prognóstico ou de seguimento de HTAP, compreendendo a determinação da presença e/ou a quantidade de anticorpos anti-Tenascina C numa amostra biológica proveniente de um doente, em diferentes tempos, o aumento da quantidade de anticorpos anti-Tenascina C ao longo do tempo sendo indicador de um agravamento de HTAP.
15. 15. Processo in vitro de avaliação da eficácia de um tratamento contra HTAP compreendendo a determinação da presença e/ou da quantidade de anticorpos anti-Tenascina C numa amostra biológica proveniente de um doente, em diferentes tempos antes, durante ou após tratamento, a diminuição da quantidade de anticorpos anti-Tenascina C ao longo do tempo sendo indicadora de uma melhoria da HTAP. Lisboa, 15 de Dezembro de 2011