ES2297250T3

ES2297250T3 - Metodo de ensayo para la deteccion potencial del desarrollo de una enfermedad cardiovascular.

Info

Publication number: ES2297250T3
Application number: ES03786143T
Authority: ES
Inventors: Erling Axis-Shield Asa Sundrehagen
Original assignee: Axis Shield ASA
Current assignee: Axis Shield ASA
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-22
Publication date: 2008-05-01
Anticipated expiration: 2023-12-22
Also published as: ES2323475T3; JP2006510895A; NO20052161D0; CN1729398A; CN1729398B; SI1573335T1; JP2010019849A; CA2729365C; GB0229747D0; DE60327007D1; CA2504876A1; WO2004057341A3; EP1573335B1; EP1739430A3; US20190049439A1; CN101893635A; PL216385B1; ATE380345T1; WO2004057341A2; ATE427498T1

Abstract

Un método de ensayo para la detección de potencial de desarrollo de enfermedad cardiovascular (CVD), o propensión a CVD, en un sujeto animal humano o no humano, comprendiendo dicho método la evaluación de la concentración de calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina, tomada de dicho sujeto.

Description

Método de ensayo para la detección potencial del desarrollo de una enfermedad cardiovascular.

La presente invención está relacionada con un método de ensayo para detectar un potencial o propensión a desarrollar una enfermedad cardiovascular (CVD) en un sujeto, e.g., un animal humano o no humano, especialmente un mamífero y, en particular, con un método de ensayo que puede ser utilizado para detectar un potencial para desarrollar CVD, o una propensión a CVD, antes de que el sujeto se de cuenta del inicio de los síntomas de la CVD.

La CVD es una de las principales fuentes de problemas de salud entre la población humana. En 1998, aproximadamente el 40% de todas las muertes acaecidas en el mundo occidental fue resultado de CVD (i.e., 1 de cada 2,5 muertes). Para 2002, se estima que en los EE.UU. alrededor de un millón de personas sufrirán un nuevo ataque coronario, o uno recurrente, y más del 40% de la gente que sufra estos ataques morirá. Muchas de estas personas morirán súbitamente sin haber llegado a ser nunca hospitalizadas o tratadas. Muchas de ellas no se habrán dado cuenta de que eran susceptibles de padecer CVD.

Un tratamiento temprano o preventivo, como un cambio de dieta, una reducción del número de cigarrillos o el abandono del hábito de fumar, el incremento en el ejercicio, la reducción del peso corporal, etc., presentan, sin embargo, un alto porcentaje de éxito a la hora de prevenir la CVD o de reducir la propensión a CVD. De esta forma, si pudieran ser detectados la CVD o el potencial o propensión a CVD, se encuentra disponible el tratamiento efectivo.

En consecuencia, existe la necesidad de descubrir métodos que puedan ser utilizados para detectar la CVD y, especialmente, el potencial o propensión a desarrollar la CVD, antes de que la enfermedad haya progresado más allá de la fase donde el tratamiento (e.g. un cambio de estilo de vida y/o hábitos) tiene por lo general éxito. En particular, existe la necesidad de encontrar métodos que puedan ser utilizados para detectar la CVD en sus fases iniciales, cuando los síntomas no son evidentes para un sujeto o para una tercera persona, e.g., un médico, i.e. se precisan métodos para someter a prueba a sujetos "libres de síntomas".

Tales métodos pueden ser utilizados para someter a escrutinio a la población general (i.e., escrutinio en masa) o a grupos de riesgo dentro de la población, e.g. hombres de más de 40 años, trabajadores en puestos de trabajo con un alto estrés, individuos que siguen dietas poco saludables, individuos que sufren de obesidad clínica, fumadores, etc. En los casos donde es diagnosticado el potencial de desarrollo de CVD, o la propensión a CVD, puede ser facilitado tratamiento preventivo y/o el paciente puede ser animado a realizar ajustes en su estilo de vida y hábitos.

De igual forma, donde es detectado un potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, un paciente puede ser sometido a pruebas adicionales, e.g. utilizando técnicas más caras o que requieran de un tiempo más largo, tales como el ECG (electrocardiograma de esfuerzo) -con y sin actividad física-, el estudio radioisotópico de perfusión miocárdica, la angiografía coronaria por rayos X -e.g. CT (tomografía computerizada)-, la angiografía coronaria por MR (resonancia magnética) o el estudio de perfusión, etc. De esta manera, al confirmar la posible presencia de CVD -o potencial o propensión a padecerla- por medio de la utilización del barato y fácil método de la invención en un escrutinio inicial (e.g. en un escrutinio en masa de sujetos sanos "sin síntomas"), se ve incrementada la probabilidad de detección o identificación de la CVD no descubierta -o potencial para desarrollar CVD- antes de que los daños a la salud se vuelvan irreversibles, mientras que, al mismo tiempo, se limita la utilización innecesaria de pruebas costosas que precisan de mucho tiempo.

Por "CVD" se entiende cualquier dolencia del corazón, arterias o venas que interrumpa el aporte de oxígeno a áreas vitales para la vida dentro del organismo, tales como el cerebro, el corazón, etc. Ejemplos de CVDs son la arterioesclerosis, el infarto de miocardio agudo, la angina pectoral, la enfermedad cardíaca isquémica, la enfermedad cerebrovascular, la apoplejía, la hemorragia subaracnoide, la hemorragia intracerebral, el infarto cerebral, el fallo cardíaco congestivo, la angina, el ataque cardíaco, la parada cardíaca y la arritmia.

La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la proteína calprotectina es un útil "marcador" o "indicador" de potencial de desarrollo de CVD -o de propensión a CVD- antes del inicio de los síntomas de CVD (i.e., en sujetos libres de síntomas). En particular, de ha descubierto sorprendentemente que niveles anormalmente altos de calprotectina en distintos fluidos corporales es indicativo de susceptibilidad a sufrir CVD antes de que sea evidente para un sujeto, o para una tercera persona (e.g., un médico), el inicio de los síntomas de la CVD.

Con el fin de evitar dudas, el término calprotectina es utilizado aquí como sinónimo de "L1-proteína", "MRP 8/14", "antígeno (asociado) a fibrosis cística (CFA)" y "calgranulina".

La calprotectina existe tanto en forma dimérica como en la trimérica. Como un dímero, la calprotectina comprende las cadenas polipeptídicas S100A8 y S100A9. Como un trímero, la calprotectina es una proteína heterotrimérica de 36 kDa con dos cadenas pesadas (14kD) y una cadena ligera (8 kD) ligadas de forma no covalente.

La calprotectina es una proteína fijadora de calcio y, cuando se fija al calcio, la calprotectina es resistente al calor y a la proteólisis. Esto puede permitir una amplia gama de técnicas de ensayo y condiciones en las que puede ser empleada.

El mapeo de epítopes de la calprotectina muestra que pueden ser producidos anticuerpos con especificidad para el complejo y/o sus cadenas proteínicas sencillas. Se ha demostrado que existen al menos cuatro sitios inmunogénicos distintos en el complejo de la calprotectina. Algunos anticuerpos reconocen la cadena pesada o la ligera, mientras que otros reconocen ambas.

La calprotectina se halla en células, tejidos y fluidos de todas las partes del cuerpo humano, y procede predominantemente de neutrófilos y monocitos. La calprotectina se encuentra presente probablemente en todos los individuos ya que, entre más de 5.000 individuos testados, no se encontró ninguno en el que no se hallara presente. La calprotectina se encuentra también en ratas, ratones, conejos, ovejas, ganado y cerdos. Por lo tanto, es una abundante y ubicua molécula.

In vivo, la calprotectina se encuentra implicada en numerosas funciones biológicas, incluyendo la transducción de señal intracelular, la activación de neutrófilos, la inhibición de enzimas intracelulares implicadas en la proliferación celular, la actividad antimicrobiana y en la defensa neutrófila. La calprotectina es también una proteína reguladora en reacciones inflamatorias y, en este papel, puede funcionar para estimular la producción inmunoglobulínica, la actividad del factor quimiotáctico y del factor de inmovilización neutrófilo.

Aunque la calprotectina probablemente se encuentra siempre presente en los fluidos corporales, se ha descubierto que la concentración de calprotectina en los distintos fluidos corporales cambia, por ejemplo, incrementándose en un número de trastornos (e.g., enfermedades inflamatorias, infecciosas y malignas). De esta forma, la medición de la concentración de calprotectina en el fluido corporal de pacientes que sufren de tales trastornos (i.e., en individuos que muestran síntomas apreciables para el sujeto y/o para una tercera persona) y comparándola con la concentración de calprotectina determinada en un fluido corporal, por ejemplo, para un sujeto sano (i.e., no enfermo), puede ser utilizada como un medio de diagnóstico de tales enfermedades.

Por ejemplo, aunque los síntomas de las infecciones bacterianas y víricas son muy similares y el diagnóstico partiendo únicamente de sus síntomas puede ser difícil, la concentración de calprotectina en el plasma/suero del sujeto infectado aumenta aproximadamente de 1 a 2 veces en las infecciones víricas, pero alrededor de 1 a 18 veces en las infecciones bacterianas. De esta forma, el sujeto que haya notado los síntomas de la infección puede hacer que se mida la concentración de calprotectina en su fluido corporal y que su infección sea diagnosticada y tratada en conse-
cuencia.

Otras enfermedades en las que la calprotectina puede ser usada como un test diagnóstico incluyen: las enfermedades reumáticas (e.g., artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, lupus eritematoso sistémico), el síndrome de Sjøgren, los trastornos inflamatorios intraoculares, la fibrosis cística, la enfermedad pulmonar aguda y crónica, el carcinoma pulmonar (de células escamosas), los cánceres pulmonares, el cáncer colorrectal, la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer gástrico, el adenoma o cáncer colorrectal, la enfermedad de Chrohn, la colitis ulcerativa, la inflamación de la mucosa gastrointestinal, las piedras urinarias, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad inflamatoria de la mucosa oral, la enfermedad inflamatoria del sistema nervioso central (CNS) (e.g., esclerosis múltiple y encefalitis aguda), la infección VIH, las infecciones CNS secundarias en pacientes infectados con VIH, las infecciones del tracto urinario, la cistitis, la pielonefritis, la uveítis posterior endógena, los trastornos hematológicos (e.g., leucemia), los trastornos febriles (infecciosos y no infecciosos), el infarto de miocardio agudo y la
aféresis.

Se ha descubierto también que la concentración en plasma de la calprotectina se incrementa durante la cirugía a corazón abierto (Semb, A.G. et al., Eur. J. Cardio-thorac Surg. (1991) 5:363-367, Saatvedt, K. et al., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. (1996) 30:53-60, Moen, O. et al., Perfusion (1994) 9:109-117). Más específicamente, Saatvedt et al. informa de que la concentración de calprotectina aumenta después del comienzo del bypass cardiopulmonar y alcanza su máximo 48 horas después de la operación.

Ha sido descubierto ahora sorprendentemente que el potencial para desarrollar CVD, o la propensión a CVD, en un sujeto pueden ser evaluados determinando la concentración de calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina tomada de dicho sujeto. En otras palabras, se ha descubierto que la determinación de la concentración de calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina tomada de un sujeto, puede ser usada para predecir si el sujeto puede sufrir CVD, o si es susceptible de ello, con anterioridad a que comiencen los síntomas, los cuales son evidentes para el sujeto o para una tercera persona (e.g., un médico).

Por "potencial para" o "propensión a" se quiere decir la posibilidad o probabilidad de que el sujeto libre de síntomas sometido a prueba en ese momento sufra CVD en el futuro. Esto puede tomar la forma de un índice, proporción, porcentaje o número similar, que refleje el riesgo relativo de padecer CVD en el futuro (e.g., en los siguientes 1-2 años, al menos en los siguientes 6 meses).

Visto de esta forma desde uno de los aspectos, la invención proporciona un método de ensayo para la detección de potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, en un sujeto animal humano o no humano, comprendiendo dicho método la evaluación de la concentración de calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina tomada de dicho sujeto, e.g., una muestra de sangre, plasma, suero, fluido cerebroespinal, fluido oral, orina, heces, fluidos sinovial o empiema.

Por "evaluación" se quiere decir que es determinado un valor cuantitativo o semi-cuantitativo para la concentración de calprotectina. Éste puede ser el valor para la concentración de la muestra cuando es testada, e.g., después del tratamiento para eliminar las células o otros componentes en la muestra que no están sometidos al ensayo, o para concentrar o diluir la muestra, o para transferir la calprotectina a un medio aparte, e.g., un sustrato sólido.

Alternativamente, la evaluación puede ser simplemente cualitativa, i.e., para indicar si la calprotectina se encuentra por encima o por debajo de uno o más valores umbral predeterminados, e.g., valores indicativos de la ausencia de potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, conforme es detectable por medio del ensayo. Los valores precisos para estos valores umbral, o para otros valores de referencia para la calprotectina, pueden depender de la naturaleza de la muestra, de la edad, del peso, del sexo y de la especie de un sujeto, y pueden ser determinados de una manera rutinaria midiendo la concentración de calprotectina del fluido corporal relevante de sujetos equivalentes sin CVD, o con CVD en distintas fases de desarrollo.

Un valor indicativo de la concentración de calprotectina determinado o "evaluado" conforme al método de la invención puede ser una concentración absoluta de calprotectina o, alternativamente, puede ser un índice, proporción, porcentaje o número similar que refleje la concentración de calprotectina.

Una muestra corporal utilizada en este método de ensayo de la invención puede ser cualquier muestra conteniendo calprotectina, e.g., un fluido corporal o muestra tisular, o una suspensión, etc. Preferiblemente, la muestra será un fluido corporal, e.g., orina, fluido cerebroespinal, fluido oral, fluido sinovial o fluido empiema, o, más preferiblemente, sangre o una muestra procedente de sangre. Cuando es este el caso (i.e., cuando es utilizada sangre o una muestra derivada de sangre), la muestra utilizada para análisis se encontrará preferiblemente libre de células (e.g., suero o plasma). Alternativamente, pueden ser utilizadas heces.

La muestra puede ser tratada con anterioridad a ser utilizada en el método de ensayo de la invención. De esta forma, la muestra puede ser tratada para eliminar cualquier tipo de células y/o cualquier tipo de componentes en la sangre que no vayan a ser sometidos a ensayo. La muestra puede ser tratada también para concentrar o diluir la muestra, o para transferir la calprotectina a un medio aparte, e.g., un sustrato sólido. Por ejemplo, la muestra puede ser diluida añadiendo un tampón u otro medio acuoso. Alternativamente, puede ser usada directamente una muestra, particularmente una muestra de plasma o de suero.

La muestra es tratada opcionalmente con calcio o con un compuesto calcio-mimético (i.e., iones de otro metal de tierra alcalina), previamente a ser utilizada en el método de ensayo de la invención. El calcio, o el compuesto calcio-mimético, puede ser cualquier forma que proporcione iones Ca^{2+} (e.g., CaCl_{2}). Si es utilizado calcio, entonces es añadido a la muestra preferiblemente el suficiente calcio, o compuesto calcio-mimético, como para saturar los sitios de fijación del calcio a la calprotectina. Por ejemplo, puede ser añadido un exceso molar de fuente cálcica de diez veces, más preferiblemente, un exceso molar de cinco veces o, especialmente preferible, un exceso molar de tres veces.

Aunque los ensayos para la calprotectina son conocidos y pueden ser utilizados en el método de la invención, no ha existido previamente ninguna sugerencia de que la calprotectina fuera un marcador o indicador del potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD. En otras palabras, no ha existido previamente ninguna sugerencia de que la concentración de calprotectina en sujetos libres de síntomas pudiera ser utilizada como un marcador o indicador de potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD y, en particular, no ha existido ninguna sugerencia de que la concentración de calprotectina pudiera ser utilizada como el marcador o indicador en un método de ensayo adecuado para el escrutinio en masa de sujetos sanos (i.e., sin síntomas).

Puede ser utilizado en el método de ensayo de la invención cualquier método de ensayo conocido para la detección de calprotectina. De esta forma, por ejemplo, el método revelado en la US-A-4833074 (Fagerhol et al.) para el aislamiento de la calprotectina y para la subsiguiente producción de antisuero monoespecífico de la misma, puede ser utilizado para producir anticuerpos anti-calprotectina para su uso en cualquier método de ensayo convencional. Los anticuerpos anti-calprotectina producidos pueden ser utilizados, por ejemplo, en inmunoensayos ligados a enzima y en radio-inmunoensayos.

Por ejemplo, puede ser utilizado también un formato de inmunoensayo NycoCard® (Axis-Shield PoC, Oslo, Noruega) para la detección de calprotectina. Este ensayo utiliza un formato de fase sólida de tipo sándwich, en el cual el dispositivo de prueba comprende una membrana revestida de anticuerpos inmovilizados anti-calprotectina. De esta manera, la muestra (opcionalmente diluida) es aplicada al dispositivo y cuando la muestra fluye a través de la membrana, es capturada cualquier calprotectina que se encuentre presente. La calprotectina inmovilizada sobre la membrana es tratada a continuación con un conjugado de oro-anticuerpo, el cual se une al complejo de calprotectina-anticuerpo, y la intensidad de color (debido a las partículas de oro) -conforme es determinado por medio de absorbancia de luz roja- es proporcional a la cantidad de calprotectina. Por lo tanto, la concentración de calprotectina puede ser calculada a partir de la curva de calibración preparada de manera convencional.

Alternativamente, puede ser utilizado el test comercial (Calprest®) para detección de calprotectina, por ejemplo, en heces (disponible en Eurospital®). Este ensayo utiliza un anticuerpo policlonal contra la calprotectina en un sistema de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima. De esta forma, la calprotectina presente en una muestra tomada de un sujeto se une al anticuerpo, el cual es adsorbido hasta la superficie de un pocillo de plástico. A continuación, es añadido un sustrato para la enzima y la intensidad del producto coloreado producido es proporcional a la cantidad de enzima y, por lo tanto, a la cantidad de calprotectina. La cantidad de calprotectina puede ser calculada, por lo tanto, tomando una curva de calibración preparada de forma convencional.

De hecho, tanto los anticuerpos anti-calprotectina monoclonales como los policlonales se encuentran disponibles comercialmente. Los anticuerpos policlonales de huevo y de conejo se encuentran disponibles, por ejemplo, en Norwegian Antibodies AS y en Axis-Shield Diagnostics, respectivamente, mientras que el anticuerpo monoclonal de ratón puede ser obtenido en Dako A/S, Dinamarca. Puede ser utilizado en este método de la invención cualquier anticuerpo anti-calprotectina obtenido, por ejemplo, por medio de cualquier técnica convencional de obtención de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-calprotectina de conejo, así como los anticuerpos monoclonales, pueden ser producidos conforme al protocolo descrito en Harlow y Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, N.Y.

Alternativamente, los anticuerpos anti-calprotectina pueden ser preparados por medio de la inyección regular de una solución conteniendo calprotectina en gallinas y, después, recolectando las yemas de los huevos de gallina. A continuación, el anticuerpo policlonal de huevo de gallina puede ser aislado conforme a técnicas convencionales y puede ser purificado por medio de cromatografía de afinidad.

Preferiblemente, el método de ensayo de la invención es utilizado en escrutinio en masa de sujetos sanos (e.g., libres de síntomas de CVD). Donde es detectado un potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, el sujeto puede ser sometido a pruebas adicionales (e.g., utilizando técnicas más costosas específicas para la CVD) con el fin de confirmar la presencia o ausencia de CVD.

Por lo general, además de la muestra bajo evaluación, serán evaluadas también en la realización del método de ensayo muestras de calibración con un contenido conocido de calprotectina. Tales determinaciones pueden ser utilizadas para confeccionar una curva de calibración, a través de la cual puede ser determinado el contenido de calprotectina de la muestra bajo investigación. La naturaleza de las muestras de calibración y la selección de los factores de conversión o ajuste utilizados a la hora de determinar el contenido de calprotectina pueden variar, dependiendo, por ejemplo, de la manera en la que es detectada la calprotectina en la técnica de ensayo utilizada en ese momento y de otros aspectos del método que afectan al resultado del ensayo, por ejemplo, la composición del tampón, las condiciones del ensayo, etc.

Usualmente serán utilizadas muestras de calibración con contenidos de calprotectina de 0 a 5.000 mg/L. El rango de referencia dentro del cual se encontrará generalmente el valor de concentración de la calprotectina es de 0,1 a 10 mg/L.

Por lo general, la concentración de calprotectina en el suero y plasma de humanos con poco o ningún potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, se encontrará en el rango de 0,01-0,75 mg/L. Más específicamente, la concentración de calprotectina en el suero y plasma de tales humanos se encontrará en el rango de 0,05-0,70 mg/L, incluso más específicamente, de 0,10-0,66 mg/L, por ejemplo, en el rango de 0,15-0,45 mg/L. Por ejemplo, la concentración de calprotectina en el suero o plasma de una mujer con poco o ningún potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, se encontrará en el rango de 0,09-0,53 mg/L, por ejemplo, alrededor de 0,31 mg/L o de 0,30 mg/L. La concentración de calprotectina en el suero o plasma de un hombre con poco o ningún potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, se encontrará en el rango de 0,12-0,66 mg/L, por ejemplo, de 0,30-0,39 mg/L, especialmente 0,31 mg/L.

Una concentración de calprotectina en suero o plasma superior a 0,75 mg/L generalmente será indicativa de un muy alto potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD. De esta manera, un valor umbral por encima del cual puede mantenerse que el ensayo predice el potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, puede encontrarse por lo general en el rango de 0,32-0,77 mg/L, por ejemplo, alrededor de 0,67 mg/L, preferiblemente alrededor de 0,70 mg/L, especialmente alrededor de 0,76 mg/L. Más preferiblemente, el valor umbral por encima del cual puede mantenerse que el ensayo predice el potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a la misma, se encuentra en el rango de 0,30-0,50 mg/L, aún más preferiblemente, en el rango de 0,32-0,47 mg/L, por ejemplo, alrededor de 0,45 mg/L.

Por lo general, la concentración de calprotectina en las heces de humanos con poco o ningún potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, se encontrará en el rango de 0,01-10 mg/L. Más específicamente, la concentración de calprotectina en las heces de tales humanos se encontrará en el rango de 0,05-9,0 mg/L, incluso más específicamente, de 0,50-8,0 mg/L.

Una concentración de calprotectina en las heces superior a 10 mg/L generalmente será indicativa de un alto potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD. De esta manera, un valor umbral por encima del cual puede mantenerse que el ensayo predice el potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, puede ser por lo general de alrededor de 9 mg/L, más preferiblemente alrededor de 10,5 mg/L, especialmente alrededor de 11 mg/L.

Sin embargo, los valores umbral son calculados mejor tomando las determinaciones de calprotectina utilizando las mismas técnicas de ensayo para el mismo tipo de muestra de fluido corporal entre un grupo de pacientes de tipo similar (edad, sexo, peso, especie, etc.), desde el estado sano, pasando por las etapas tempranas de desarrollo de CVD hasta llegar a estado grave de CVD. Aún más preferiblemente, los valores umbral serán valores determinados en el mismo paciente un una fase más temprana, en un estado sano. De esta forma, individuos particularmente de riesgo podrían monitorizar sus niveles de calprotectina de forma rutinaria (e.g., cada 6 meses o cada año) en programas de escrutinio en masa.

En un método de ensayo preferido de la presente invención, dicho método comprende además la evaluación adicional de la concentración de otro marcador que determine el potencial de desarrollo de CVD en la muestra tomada del sujeto. Ejemplos de marcadores adecuados pueden ser la homocisteína, el factor XII activado, el colesterol, la proporción de colesterol:HDL, el fibrinógeno, el activador de plasminógeno de tipo tisular, los Factores V, VII y VIII, la lipoproteína (a), el antígeno del factor von Willebrand, el complejo plasmina-\alpha2 antiplasmina, el fragmento de protrombina 1+2, el complejo de trombina-antitrombina III, el fibrinopéptido A, los productos de degradación de la fibrina, el dímero D, la resistencia a proteína C activada, el factor VIIc y VIIa, la trombina, el amiloide A sérico, las moléculas de adhesión vascular y el calcio coronario. Preferiblemente, el segundo marcador es seleccionado de entre la homocisteína o la proteína C reactiva.

Más preferiblemente, el método de ensayo de la presente invención comprende adicionalmente la evaluación adicional de la concentración de la proteína C reactiva (CRP) en la muestra tomada del sujeto. Preferiblemente, la concentración de CRP es evaluada simultáneamente o secuencialmente a dicho ensayo de calprotectina.

La medición de CRP puede ser llevada a cabo utilizando cualquier técnica estándar de inmunoensayo (e.g. ELISA, RIA, etc.) o puede ser determinada por medio de NycoCard® (disponible en Axis-Shield PoC, Oslo, Noruega).

Una concentración de calprotectina en suero o plasma superior a 0,75 mg/L junto con una concentración de CRP superior a 1,75 mg/L será generalmente indicativa de un muy alto potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD. Preferiblemente, la presencia de las concentraciones anteriormente mencionadas es un indicativo mucho más alto de potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, que únicamente una concentración de calprotectina o de CRP.

De esta forma, los valores umbral de calprotectina y de CRP por encima de los cuales puede mantenerse que el ensayo es altamente predictivo en cuanto al potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, puede ser por lo general de 0,32-0,77 mg/L y de 1,70 mg/L, respectivamente; más preferiblemente, alrededor de 0,67 mg/L y de 1,75 mg/L, respectivamente; aún más preferiblemente alrededor de 0,70 mg/L y de 2,00 mg/L, respectivamente; especialmente alrededor de 0,76 mg/L y de 2,25 mg/L, respectivamente. Más preferiblemente, los valores umbral por encima de los cuales puede mantenerse que el ensayo es altamente predictivo en cuanto al potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, se encuentran en el rango de 0,30-0,50 mg/L y de 0,75 mg/L, respectivamente; incluso más preferiblemente, en el rango de 0,32-0,47 mg/L y de 0,75 mg/L, respectivamente; por ejemplo, alrededor de 0,45 mg/L y de 0,75 mg/L, respectivamente.

Un kit de ensayo para su utilización en el método de la invención comprende reactivos e instrucciones para la realización del método de ensayo y para la interpretación de los resultados y, opcionalmente, muestras de referencia conteniendo calprotectina y, opcionalmente, un detector. Preferiblemente, dicho kit de ensayo comprende también los reactivos e instrucciones para la determinación de la concentración de CRP.

Las instrucciones en el kit pueden encontrarse, por ejemplo, en forma de una etiqueta, un manual o una hoja de instrucciones; sin embargo, en su lugar puede que presenten la forma de un programa informático o un portador de datos, e.g., un disco informático.

El detector, en caso de estar presente, será por lo general uno capaz de detectar una especie reportera, e.g, un espectrómetro, un detector de radiación nuclear, un detector de luz difusa, etc.

Los reactivos serán agentes adecuados para la determinación de calprotectina, e.g., reactivos adecuados especificados en la literatura asociada a los test disponibles para determinación de la calprotectina, tales como los de Eurospital® y NycoCard (disponible en Axis Shield ASA, Oslo, Noruega) anteriormente citados. Pueden ser adecuados también los reactivos mencionados en la US-A-4833074.

Un método de ensayo particularmente preferido para evaluar la concentración de calprotectina en la presente invención es un inmunoensayo basado en partículas. Esta es una técnica sensible, la cual está basada en la determinación turbidimétrica de la concentración de calprotectina. La sensibilidad que proporciona el ensayo permite de forma ventajosa que las muestras de fluido corporal (e.g., plasma o suero) con concentraciones relativamente bajas de calprotectina sean determinadas con un alto nivel de precisión. Al mismo tiempo, pueden ser medidas también con precisión concentraciones relativamente altas de calprotectina.

La determinación turbidimétrica posee también la ventaja de que no se precisa de superficie sólida para la separación física en el ensayo, y no son necesarias numerosas fases de lavado y/o separación. De esta forma, comparándose con técnicas previas existentes en este campo (e.g. ELISA), la determinación turbidimétrica homogénea de la calprotectina es rápida y fácil de llevar a cabo y puede, por ejemplo, ser automatizada. Si se compara con la automatización de técnicas no homogéneas que comprenden, por ejemplo, una superficie sólida, la automatización de un ensayo basado en la turbidimetría es relativamente fácil. También, el proceso homogéneo automatizado resultante es, a menudo, más fiable y menos propenso, por ejemplo, a estropearse.

Un ensayo turbidimétrico automatizado es también más rápido, permitiendo una alta producción de muestras y es relativamente barato de poner en funcionamiento. Usualmente puede ser realizado utilizando un robot disponible comercialmente, e.g., el Cobas Mira o el Hitachi 711, ambos disponibles en Roche Diagnostics. Un ensayo automatizado de este tipo es particularmente atractivo cuando se prevé someter a prueba de forma rutinaria a individuos para determinar el potencial de desarrollo de CVD, o la propensión a la misma.

Para la determinación turbidimétrica de la concentración de calprotectina, la muestra conteniendo calprotectina será por lo general un fluido corporal, e.g., orina, fluido cerebroespinal, fluido oral, fluido sinovial o fluido empiema o, más preferiblemente, una muestra de sangre o procedente de un derivado de la misma. Cuando es este el caso, la muestra utilizada para análisis se encontrará preferiblemente libre de células (e.g., suero o plasma).

De esta manera, la muestra puede ser tratada para eliminar cualquier célula y/o cualquier componente en la muestra que no se esté sometiendo a ensayo. La muestra puede ser tratada también para concentrar o diluir la muestra, o para transferir la calprotectina a un medio aparte, e.g., un sustrato sólido. Por ejemplo, la muestra puede ser diluida añadiendo agua, un tampón u otro medio acuoso. Alternativamente, puede ser usada directamente una muestra, particularmente una muestra de suero o plasma.

La muestra es tratada opcionalmente con calcio o un compuesto calcio-mimético antes de ser utilizada en el método del ensayo. El calcio o el compuesto calcio-mimético puede ser cualquier forma que proporcione iones Ca^{2+} (e.g., CaCl_{2}). Si es utilizado calcio, entonces es añadida a la muestra preferiblemente la suficiente cantidad de calcio, o de compuesto calcio-mimético, como para saturar los sitios de fijación a calcio de la calprotectina. Por ejemplo, puede ser añadido un exceso molar de fuente cálcica de diez veces, más preferiblemente, un exceso molar de cinco veces o, especialmente preferible, un exceso molar de tres veces.

La opacidad, para la determinación turbidimétrica de la concentración de calprotectina, será generada por lo general poniendo en contacto la muestra conteniendo calprotectina -o una parte alícuota de la misma- con un anticuerpo anti-calprotectina, con un fragmento de anticuerpo o con una mezcla de anticuerpos anti-calprotectina (e.g., una mezcla de anticuerpos monoclonales). El anticuerpo policlonal antihumano de huevo de la calprotectina, disponible comercialmente en Norwegian Antibodies AS, puede ser utilizado, por ejemplo, para generar opacidad. Puede ser utilizado en el método de la invención cualquier anticuerpo anti-calprotectina obtenido, por ejemplo, por medio de cualquier técnica convencional para la obtención de anticuerpos.

Los anticuerpos -o fragmentos de anticuerpo- que son utilizados para la determinación turbidimétrica de la concentración de calprotectina muestran preferiblemente pocas reacciones cruzadas, o ninguna, con otras proteínas sanguíneas que puedan encontrase presentes en el eluído. La cantidad del anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- utilizada debería ser optimizada, desde luego, contra muestras estándar conteniendo calprotectina, ya que la opacificación surge debido al efecto gancho por el que la fijación múltiple de calprotectina genera los centros de opacificación. La calprotectina, conforme es mencionado más arriba, presenta numerosos sitios de fijación a anticuerpo, y es particularmente adecuada para la detección en este tipo de ensayo.

En una realización preferida, el anticuerpo anti-calprotectina -o fragmento de anticuerpo- puede ser inmovilizado por medio de unión o acoplamiento -bien directa o indirectamente- a cualquier soporte sólido o matriz conocido que sea utilizado comúnmente para la inmovilización. Preferiblemente, el soporte sólido o matriz toma la forma de partículas, preferiblemente nanopartículas. Convenientemente, el soporte sólido puede ser de vidrio, sílice, látex, metal (e.g., oro) o un material polimérico (e.g., polietileno). Preferiblemente, el soporte sólido es confeccionado en un material polimérico, como el polietileno.

La unión o inmovilización del anticuerpo anti-calprotectina -o fragmento de anticuerpo- puede ser conseguida utilizando cualquier técnica convencional. Por ejemplo, la avidina (disponible en Pierce Chemical Company) puede ser inmovilizada sobre nanopartículas de poliestireno activadas con clorometilo (disponibles en Interfacial Dynamic Corporation, US) por medio de agitación en tampón (e.g., a temperatura ambiente durante 24 horas) y, a continuación, utilizada junto con anticuerpos anti-calprotectina marcados con biotina (preparados conforme a técnicas convencionales en este campo). De esta forma, por ejemplo, plasma tomado del sujeto a ser sometido a prueba para determinar el potencial de desarrollo de CVD -o propensión a la misma- es añadido a una solución de nanopartículas revestidas de avidina en una cubeta de cuarzo de un espectrofotómetro, seguido de la adición de anticuerpo anti-calprotectina marcado con biotina. A continuación son tomadas lecturas turbidimétricas.

Alternativamente, los anticuerpos marcados con biotina pueden ser añadidos con anterioridad a la adición del plasma o del suero. En otras palabras, aunque usualmente son utilizados los mismos reactivos sin tener en cuenta el instrumento usado para la detección de la turbidez, puede variar la secuencia precisa en que son añadidos los distintos reactivos. Por lo general, la secuencia usada debería ser acorde con las instrucciones que acompañan al espectrofotómetro utilizado (e.g., un espectrofotómetro Shimadzu UV-160).

Son realizadas lecturas turbidimétricas (i.e., es medida la absorción lumínica a una longitud de onda adecuada a intervalos regulares) y es determinada la absorción lumínica en relación con una referencia. Opcionalmente, pueden ser utilizados instrumentos de múltiples longitudes de onda para realizar las lecturas turbidimétricas y pueden proporcionar resultados más precisos. Instrumentos adecuados para tomar las lecturas turbidimétricas incluyen el Cobas Mira, el Roche Integra y el Turbiquant de Merck.

En un sistema experimental alternativo, el anticuerpo anti-calprotectina -o fragmento de anticuerpo- puede ser inmovilizado directamente sobre nanopartículas activadas con clorometilo (disponibles en Interfacial Dynamic Corporation, US). Por ejemplo, el anticuerpo anti-calprotectina (e.g., el anticuerpo policlonal de huevo disponible en Norwegian Antibodies AS) puede ser mezclado con las partículas activadas antes mencionadas en un tampón (10 mM de borato, 15 mM de cloruro sódico, pH 9.0) y agitado (e.g., a temperatura ambiente durante 24 horas) para facilitar nanopartículas revestidas de anticuerpo anti-calprotectina. Tales nanopartículas pueden ser utilizadas para determinación turbidimétrica de la concentración de calprotectina al añadirlas a una muestra de plasma o suero, tomado del sujeto a ser sometido a prueba para determinar el potencial de desarrollo de CVD -o propensión a la misma-, en un tampón y tomando lecturas turbidimétricas en modo cinético.

Alternativamente, el plasma o suero puede ser añadido a las nanopartículas revestidas de anticuerpo anti-calprotectina. En otras palabras, aunque son utilizados usualmente los mismos reactivos sin tener en cuenta el instrumento usado para la detección de la turbidez, puede variar la secuencia precisa en la que son añadidos los distintos reactivos. Por lo general, la secuencia utilizada debería ser acorde con las instrucciones que acompañan al espectrofotómetro utilizado (e.g., un espectrofotómetro Shimadzu UV-160).

Ejemplos de robots automatizados que son adecuados para tomar lecturas turbidimétricas de acuerdo con el método de ensayo de la invención incluyen el Cobas Mira y el Hitachi 711, ambos disponibles en Roche Diagnostics.

Las partículas a las cuales puede ser unido el anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- son usualmente esféricas. El tamaño de las partículas utilizadas en el ensayo puede afectar la precisión con la que es medida la concentración de calprotectina. Aunque las partículas más grandes permiten que sean detectadas concentraciones menores de calprotectina, su área de superficie reducida significa que poseen una capacidad de fijación menor. Por ejemplo, doblando el diámetro de la partícula se reduce a la mitad la capacidad de fijación de una unidad de masa de partículas.

Adicionalmente, el aumento del diámetro de partícula aumenta el nivel de absorbancia luminosa de fondo y suspensión luminosa en las longitudes de onda utilizadas usualmente en tales ensayos (e.g., 330 a 600 nm). De esta manera, aunque las partículas mayores incrementan la sensibilidad del ensayo, esto puede verse acompañado por algo de pérdida en la precisión y, en particular, por un incremento en el número de resultados falsos negativos obtenidos. Esto es particularmente probable en el caso de muestras que contengan concentraciones relativamente altas de calprotectina (i.e., aquellas muestras obtenidas de individuos con un alto potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a la misma), en donde los sitios de fijación a nanopartículas pueden verse saturados sin que se encuentre unida toda la calprotectina.

Estos efectos neutralizantes asociados al cambio de tamaño de partícula (e.g., el aumento del tamaño de partícula incrementa la sensibilidad pero disminuye la precisión) representan un problema significativo a ser solventado con el desarrollo de un ensayo sensible a la hora de detectar el rango de niveles de calprotectina presentes en los fluidos corporales.

Es preferible también en relación con el método de ensayo de la invención que las partículas utilizadas permitan que sea determinado con precisión un rango más amplio de concentraciones de calprotectina. Esto puede significar que puede ser atribuido un nivel mayor de confianza tanto a un resultado negativo (i.e., una concentración que caiga por debajo del valor umbral) como a un resultado positivo. Es particularmente preferido en el método de ensayo de la invención que puedan ser medidas muestras que presenten una concentración de calprotectina en el rango de 0,5-50 mg/L (e.g., 1-40 mg/L).

Las partículas a las cuales puede ser fijado el anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- son usualmente esféricas, con un diámetro de 1-150 nm, por ejemplo, 10-90 nm o 15-60 nm, por ejemplo, 44 nm. En un método de ensayo de la invención particularmente preferido, las partículas a las cuales son fijados el anticuerpo, o fragmentos de anticuerpo, poseen un diámetro de 55-140 nm, más preferiblemente de 65-110 nm, por ejemplo, de 70-90 nm.

Alternativamente, el diámetro de las partículas puede ser medido una vez que los anticuerpos -o fragmentos de anticuerpos- se encuentren fijados a sus superficies. En este caso, el diámetro de las partículas revestidas del anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- es preferiblemente de 65-140 nm, más preferiblemente de 75-120 nm, aún más preferiblemente de 80-100 nm. Las partículas revestidas de estos tamaños son especialmente preferidas cuando la muestra sometida a prueba es el plasma.

Las partículas, en ambos estados "desnudo" y revestido, presentan preferiblemente un diámetro que, por sí mismo, no permite la absorción de la longitud de onda de la luz utilizada para la determinación espectrofotométrica. De esta forma, la suspensión de nanopartículas revestidas es casi (e.g., sustancialmente) transparente hasta que tiene lugar la formación de agregados inducida por la calprotectina, lo que da como resultado la formación de agregados que presentan un diámetro mayor. Tales agregados poseen la habilidad de absorber la longitud de onda de la luz utilizada por el espectrofotómetro.

Además, las partículas son preferiblemente todas ellas sustancialmente del mismo tamaño, más específicamente, todas tienen el mismo diámetro. Preferiblemente, son utilizadas partículas poliméricas o de metal monodispersas (e.g., oro). Las partículas poliméricas monodispersas se encuentran disponibles en Dynal Biotech AS, Oslo,
Noruega.

Aunque sin desear verse constreñido por la teoría, puede resultar que la utilización de un anticuerpo inmovilizado -o fragmentos de anticuerpo- aumente la sensibilidad del ensayo al aumentar el tamaño de cualquiera de los sitios generadores de opacidad derivada de la calprotectina y, por lo tanto, la cantidad de luz diseminada desde los mismos. Utilizando un soporte sólido o matriz (e.g., nanopartículas) que sean sustancialmente todos ellos del mismo tamaño, puede ser que se vea incrementada aún más la sensibilidad del ensayo turbidimétrico.

Conforme es rutinario en los ensayos turbidimétricos, es añadido también preferiblemente al eluído un mejorador polimérico de opacidad, como el polietileno glicol.

Antes de ser realizada la determinación turbidimétrica, la fracción, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, preferiblemente unido a una nanopartícula, y opcionalmente un mejorador, puede ser incubado durante un corto período de tiempo, e.g., de 5 minutos a una hora, preferiblemente alrededor de 10 minutos, a temperatura ambiente. Opcionalmente, cuando se determina la concentración de calprotectina utilizando la técnica turbidimétrica, puede ser utilizado un modo de lectura cinético.

La luz utilizada en la determinación de la opacificación debe presentar una longitud de onda adecuada, por ejemplo, 300-600 nm. En este sentido, se ha descubierto que la utilización de un filtro de 300-450 nm, preferiblemente un filtro de 340 nm o de 405 nm, facilitó resultados particularmente buenos. La utilización de un filtro de 560 nm puede facilitar también resultados especialmente buenos.

Por lo general, junto con la muestra bajo evaluación, serán evaluadas también en la realización del método de ensayo muestras de calibración con contenidos conocidos de calprotectina. Tales determinaciones pueden ser utilizadas para confeccionar una curva de calibración, a partir de la cual puede ser determinado el contenido de calprotectina de la muestra bajo evaluación. Serán utilizadas, preferiblemente, muestras de calibración con contenidos de calprotectina de hasta 5.000 mg/L (e.g., 1.500, 1.000, 750, 250, 100) o de hasta 100 mg/L (e.g., 75, 50, 25, 5, 1,0 y 0,5 mg/L). Más preferiblemente, las muestras de calibración poseen un contenido de calprotectina de hasta 10 mg/L (e.g., 10, 8, 6, 4, 2 mg/L), aún más preferiblemente de hasta 5 mg/L (5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 mg/L).

El ensayo turbidimétrico anteriormente descrito para la determinación de calprotectina es sorprendentemente fiable, rápido, barato, fácil y susceptible de automatización. Esto es a diferencia de los métodos de ensayo disponibles actualmente, los cuales son relativamente complejos y no son aplicables directamente a las máquinas de diagnóstico multifunción automatizadas, usadas comúnmente por los laboratorios diagnósticos.

La automatización es particularmente deseable en los casos donde se dan numerosas fases de mezcla, adición y/o dilución, ya que éstas pueden ser conseguidas con un grado mayor de exactitud. Los robots pueden ofrecer también un nivel mayor de fiabilidad y/o reproducibilidad. La automatización incrementa también el rendimien-
to.

Los métodos de ensayo actualmente disponibles, los cuales pueden ofrecer niveles razonables de precisión (e.g., ELISA), sin embargo son difíciles de automatizar. Esto es debido en parte, al menos, a que usualmente comprenden numerosas fases de lavado y separación (e.g., unión a una superficie sólida) y a que la automatización de los procesos no homogéneos es a menudo problemática. También, estos procesos usualmente implican un número relativamente alto de fases, lo que incrementa la complejidad de cualquier protocolo de automatización. Otras técnicas convencionales para la determinación de la calprotectina (e.g., nefelometría) ofrecen una alta precisión, pero precisan de un equipo especial para llevar a cabo las mediciones necesarias. El equipo especializado no es usualmente fácil de incorporar a un protocolo de automatización.

La invención será descrita ahora en detalle, en relación con los siguientes Ejemplos no limitadores y las figuras que los acompañan, en los cuales:

La Figura 1 es la curva de distribución para la calprotectina en los 200 sujetos sometidos a prueba. El resumen de las estadísticas para la Figura 1 son:

Test de Normalidad de Anderson-Darling

A^{2}:	8,160
Valor P:	0,000
Media	0,403
Desviación estándar	0,238
Varianza	0,057
Asimetría	1,679
Curtosis	3,302
N	199
Mínimo	0,070
1er cuartil	0,240
Mediana	0,340
3er cuartil	0,500
Máximo	1,370
Límite de confianza al 95% para Mu	0,370
	0,436
Límite de confianza al 95% para Sigma	0,217
	0,264
Límite de confianza al 95% para Mediana	0,310
	0,370

\vskip1.000000\baselineskip

La Figura 2 es la curva de distribución para la puntuación en la escala de calcio en los 200 sujetos sometidos a prueba. El resumen de las estadísticas para la Figura 2 son:

Test de Normalidad de Anderson-Darling

A^{2}:	25,037
Valor P:	0,000
Media	217,060
Desviación estándar	399,000
Varianza	159201
Asimetría	3,462
Curtosis	15,341
N	200
Mínimo	0,00
1er cuartil	0,00
Mediana	78,00
3er cuartil	259,25
Máximo	2794,00
Límite de confianza al 95% para Mu	161,42
	272,70
Límite de confianza al 95% para Sigma	363,35
	442,46
Límite de confianza al 95% para Mediana	0,00
	117,33

\vskip1.000000\baselineskip

La Figura 3 es la curva de distribución para la proteína C reactiva altamente sensible (hsCRP) en los 200 sujetos sometidos a prueba. El resumen de las estadísticas para la Figura 3 son:

Test de Normalidad de Anderson-Darling

A^{2}:	21,221
Valor P:	0,000
Media	2,331
Desviación estándar	2,970
Varianza	8,819
Asimetría	2,243
Curtosis	5,103
N	197
Mínimo	0,150
1er cuartil	0,540
Mediana	1,150
3er cuartil	2,580
Máximo	16,30
Límite de confianza al 95% para Mu	1,913
	2,748
Límite de confianza al 95% para Sigma	2,703
	3,296
Límite de confianza al 95% para Mediana	0,933
	1,375

\vskip1.000000\baselineskip

La Figura 4 es la curva de distribución para la homocisteína en los 200 sujetos sometidos a prueba. El resumen de las estadísticas para la Figura 4 son:

Test de Normalidad de Anderson-Darling

A^{2}:	2,535
Valor P:	0,000
Media	8,391
Desviación estándar	1,966
Varianza	3,867
Asimetría	0,875
Curtosis	0,730
N	199
Mínimo	5,100
1er cuartil	7,100
Mediana	8,100
3er cuartil	9,600
Máximo	15,300
Límite de confianza al 95% para Mu	8,117
	8,666
Límite de confianza al 95% para Sigma	1,790
	2,181
Límite de confianza al 95% para Mediana	7,620
	8,400

\vskip1.000000\baselineskip

La Figura 5 es un gráfico de puntos para la distribución de la calprotectina entre los resultados positivos a calcio y los negativos a calcio; y

Las Figuras 6 y 7 son las curvas ROC para la calprotectina y para la hsCRP para los 200 sujetos sometidos a prueba y para los sujetos macho sometidos a prueba, respectivamente.

Ejemplo 1 Anticuerpo Anti-Calprotectina (a) Aislamiento de la Calprotectina

La calprotectina puede ser aislada conforme a los métodos descritos en los Ejemplos 1 y 2 de la US-A-4.833.074 (Fagerhol).

Alternativamente, la calprotectina puede ser purificada procedente de capas leucocitarias humanas. Es preparada una suspensión celular en EDTA 2,5 mM por medio de la adición de EDTA (50 mM, pH 7) a las células. A continuación, las células son lavadas en 160 mM de cloruro de amonio/10 mM de hidrógeno carbonato de sodio durante 3 minutos y son centrifugadas (160 xg) durante 10 minutos a 4ºC. El pellet resultante es lavado en EDTA (2,5 mM)/NaCl (150 mM) y centrifugado (55 xg) durante 10 minutos más a 4ºC. A continuación, el pellet es resuspendido en 0,625 mM EDTA/18,75 mM Diemal, pH 7.4 y congelado a -70ºC durante, al menos, 24 horas.

Después de descongelarlo, el material resultante es centrifugado (a 3700 xg) durante 30 minutos, después el sobrenadante es retirado y filtrado (con un filtro de 0,45 \mum disponible en Millipore), a continuación cargado en una columna de intercambio iónico de DEAE (dietilaminoetil) Sefarosa (disponible en Pharmacia), preparado con anterioridad utilizando un tampón de unión (e.g., 0,63 mM EDTA/18,75 mM Diemal, pH 7.4). Cualquier material no unido pasa a través de la columna y es eluído. Una vez se encuentra eluído todo el material procedente de la columna no unido, la calprotectina pura es eluída utilizando un tampón de elución conteniendo calcio (e.g., tampón 75 mM Diemal/10 mM CaCl_{2}). Son obtenidos alrededor de 25 mg de calprotectina por capa leucocitaria.

(b) Preparación del Anticuerpo Anti-Calprotectina

Los anticuerpos anti-calprotectina pueden ser preparados conforme al método descrito en el Ejemplo 3 de la US-A-4.833.074 (Fagerhol).

Pueden ser preparados alternativamente anticuerpos policlonales de huevo de gallina. Es inyectada una solución comprendiendo calprotectina (0,5 mg/mL) y adyuvante de Freund en gallinas cada 14 días cuatro veces (o durante dos meses) y, a continuación, una vez cada mes. Después de 12 semanas, los huevos de la gallina inyectados con calprotectina pueden ser recolectados y sus yemas retiradas (sin la película). Después de dilución en HCl (5 mM), la yema es centrifugada y el sobrenadante es recolectado. A continuación, el sobrenadante es filtrado y tratado con sulfato de amonio saturado hasta conseguir una concentración final de 3,8 M. La mezcla es centrifugada y el precipitado producido es recolectado y disuelto en tampón (0,11 M de acetato de sodio, 0,15 M de NaCl, pH 7.4). La solución resultante es dializada finalmente con una membrana presentando un tamaño de poro de 10.000 kD y, después, purificada por medio de cromatografía de afinidad.

La columna utilizada usualmente para cromatografía de afinidad comprende una matriz activada de sefarosa activada con succinimida (HiTrap NHS activada, disponible en Amersham-Pharmacia), la cual es adecuada para la inmovilización de la calprotectina. Más específicamente, la resina activada reacciona espontáneamente, a un pH de 7-8, con las aminas libres en la calprotectina. Para la cromatografía, la solución de diálisis es diluida usualmente hasta una concentración de alrededor de 3 mg/ml en PBS con anterioridad a su aplicación a la columna. Los anticuerpos anti-calprotectina son eluídos seguidamente utilizando 6 M de urea en PBS helado, o 0,1 M de solución de citrato de sodio, pH 3.0. Preferiblemente, son utilizados 0,1 M de solución de citrato de sodio. Después de la elución, el anticuerpo anti-calprotectina conteniendo fracciones es diluido inmediatamente y dializado en PBS.

Ejemplo 2 Ensayo Turbidimétrico para la Calprotectina (a) Preparación de Nanopartículas revestidas de Avidina

600 \mum de nanopartículas activadas por clorometilo 4,2% p/v (diámetro 44 nm) disponibles en Interfacial Dynamic Corporation, US son dializadas contra agua con una membrana presentando un tamaño de poro de 10.000 kD. Son añadidos y mezclados 0,5 ml de una solución de borato (10 mM) y cloruro de sodio (15 mM), con un pH de 9.0. Son añadidos 10 mg de avidina, disueltos en 0,5 ml de una solución de 10 mM borato y 15 mM NaCl, con un pH de 9 (disponible en Pierce Chemical Company) y la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación, son añadidos 40 \mul de solución de glicina (2M, pH 9.0) y la mezcla es agitada durante 4 horas más a temperatura ambiente.

A continuación, las partículas son diuidas hasta conseguir un volumen de 100 ml y son diafiltradas, primeramente en 500 ml de una solución de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, con un pH de 9.0 y, después, en una solución de 25 mM de Tris, 150 mM de cloruro sódico y 0,01% Tween® 20, con un pH de 7.4 (disponible en Sigma US) utilizando un Filtro Pellicon XL (corte 300.000) y un Sistema TFF de báscula de laboratorio (disponible en Millipore) conforme a las instrucciones facilitadas por los proveedores de los instrumentos. La concentración deseada de nanopartículas revestidas de avidina es obtenida finalmente por medio de centrifugado y resuspensión de las partículas en una solución de 25 mM de Tris, 150 mM de cloruro sódico y 0,01% Tween® 20. Cualquiera de los agregados que se formen durante este procedimiento de preparado puede ser retirado por medio de centrifugado lento.

(b) Ensayo para Calprotectina utilizando Nanopartículas revestidas de Avidina

Es preparada una suspensión poseyendo una concentración de alrededor de 0,30 mg por ml de partículas de las anteriormente descritas nanopartículas revestidas de avidina, por medio de centrifugado y resuspensión del preparado anteriormente descrito en una solución de 25 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween® 20 y 2% PEG 6000, con un pH de 7.4 (disponible en Sigma). Son mezclados 500 \mul de esta suspensión de partículas con una muestra de plasma (alrededor de 20 \mul), tomada de un sujeto sometido a prueba para determinar su propensión a desarrolllar CVD, en una cubeta de lectura de cuarzo de un espectrofotómetro grabador (e.g., un Shimadzu UV-160). Es grabada la absorción a 340 nm de luz monocromática y, después de 60 segundos, son añadidos a la cubeta de cuarzo y mezclados 75 \mug de anticuerpo anti-calprotectina marcado con 0,15 nmol de biotina (e.g., anticuerpo policlonal de huevo purificado por medio de afinidad, marcado con biotina, comprado en Norwegian Antibodies AS, Noruega), diluidos en 50 \mul de una solución de 25 mM de Tris, 150 mM de NaCl y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4. Es grabada de inmediato la absorción a 340 nm de luz monocromática utilizando una cubeta de referencia conteniendo una solución de 25 mM de Tris, 150 mM de NaCl y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4 y, de nuevo, a intervalos regulares (e.g., cada 2 minutos) hasta haber transcurrido alrededor de 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción en cada uno de los momentos, conforme a la lectura turbidimétrica estándar en el modo cinético o a lecturas "punto final". Es decir, es calculado el incremento en la absorción lumínica en cada uno de los momentos en relación con la lectura realizada con anterioridad a la adición de las nanopartículas revestidas de anticuerpo y/o al final de la grabación.

Es construida una curva de calibración llevando a cabo un procedimiento idéntico, con los estándares presentando una concentración conocida de calprotectina. La concentración de calprotectina en la muestra puede entonces ser calculada tomando la curva de calibración.

Ejemplo 3 Ensayo Turbidimétrico Alternativo para la Calprotectina (a) Preparación de Nanopartículas revestidas de Anticuerpo anti-Calprotectina

1 ml de 4,2% p/v de nanopartículas activadas por clorometilo (diámetro 44 nm), disponibles en Interfacial Dynamic Corporation, US, son dializadas contra agua con una membrana presentando un tamaño de poro de 10.000 kD. Son añadidos a continuación 0,5 ml de una solución de borato (10 mM) y cloruro de sodio (15 mM), con un pH de 9.0. Son dializados 27 mg de anticuerpos anti-calprotectina purificados (e.g., anticuerpos policlonales de huevo purificados por medio de afinidad, disponibles en Norwegian Antibodies AS, Noruega) contra una solución de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, con un pH de 9.0.

Después de la adición de las nanopartículas a los anticuerpos anti-calprotectina purificados, la mezcla es agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. A continuación, son añadidos 40 \mul de una solución de glicina (2M, pH 9.0) y la mezcla es agitada durante 4 horas más a temperatura ambiente.

A continuación, las partículas son diluidas hasta conseguir un volumen total de 100 ml y son diafiltradas contra 1.000 ml de una solución de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, con un pH de 9.0, a la cual son añadidos 0,1% Tween® 20 y 3 mg/ml de albúmina de huevo, utilizando un filtro Pellicon XL (corte 300.000) y un Sistema TFF de báscula de laboratorio (disponible en Millipore) conforme a las instrucciones facilitadas por los proveedores de los instrumentos. La concentración deseada de nanopartículas revestidas de anticuerpo anti-calprotectina es obtenida finalmente por medio de centrifugado y resuspensión de las partículas en una solución. Cualquiera de los agregados que se formen durante este procedimiento de preparado puede ser retirado por medio de centrifugado lento.

(b) Ensayo para Calprotectina utilizando Nanopartículas revestidas de Anticuerpo anti-Calprotectina

Es preparada una suspensión comprendiendo 400 \mug de las nanopartículas revestidas de anticuerpo anteriormente descritas en 50 \mul de una solución de 10 mM de borato, 15 mM de NaCl, 0,1% Tween® 20, 3 g/l de albúmina de huevo, con un pH de 9.0.

Simultáneamente, 20 \mul de plasma procedente del sujeto sometido a prueba para determinar su potencial de desarrollo de CVD, en 500 \mul de tampón de ensayo (25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween® 20 y 2% PEG 6000, con un pH de 7.4 (disponible en Sigma)) son colocados en una cubeta de lectura de cuarzo de un espectrofotómetro grabador (e.g., Shimadzu UV-160), y es medida la absorción lumínica a 340 nm de luz monocromática. Después de 60 segundos, es añadida y mezclada en la cubeta la anteriormente mencionada suspensión comprendiendo 400 \mug de nanopartículas revestidas de anticuerpo. Es grabada la absorción lumínica inmediatamente después de la adición de las nanopartículas revestidas de anticuerpo, y de nuevo a intervalos regulares (e.g., cada 2 minutos) hasta haber transcurrido alrededor de 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción lumínica en cada uno de los momentos, en relación con la lectura realizada con anterioridad a la adición de las nanopartículas revestidas de anticuerpo y/o al final de la grabación. En otras palabras, son realizadas lecturas turbidimétricas en modo cinético o lecturas "punto final".

Es construida también una curva de calibración llevando a cabo un procedimiento idéntico, con los estándares presentando una concentración conocida de calprotectina. La concentración de calprotectina en la muestra puede entonces ser calculada tomando la curva.

Ejemplo 4 Ensayo Turbidimétrico para la Calprotectina (a) Preparación de Nanopartículas revestidas de Streptavidina

600 \mum de 4,2% p/v de nanopartículas activadas por clorometilo (diámetro 67 nm), disponibles en Interfacial Dynamic Corporation, US, son dializadas contra agua con una membrana presentando un tamaño de poro de 10.000 kD. 0,5 ml de una solución tamponadora de fosfato (10 mM) y cloruro de sodio (150 mM), con un pH de 7.4, son añadidos a 10 mg de streptavidina, disueltos en 0,5 ml de una solución tamponadora de 10 mM de fosfato y 150 mM de NaCl, con un pH de 7.4 (disponible en Pierce Chemical Company) y la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación, son añadidos 40 \mul de solución de glicina (2M, pH 9.0) y la mezcla es agitada durante 4 horas más a temperatura ambiente.

A continuación, las partículas son diluidas hasta conseguir un volumen de 100 ml y son diafiltradas, primeramente en 500 ml de una solución de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, con un pH de 9.0 y, a continuación, en una solución de 25 mM de Tris, 150 mM de cloruro sódico y 0,01% Tween® 20, con un pH de 7.4 (disponible en Sigma US), utilizando un Filtro Pellicon XL (corte 300.000) y un Sistema TFF de báscula de laboratorio (disponible en Millipore) conforme a las instrucciones facilitadas por los proveedores de los instrumentos. La concentración deseada de nanopartículas revestidas de streptavidina es obtenida finalmente por medio de centrifugado y resuspensión de las partículas en una solución de 25 mM de TRIS, 150 mM de cloruro sódico y 0,01% Tween® 20. Cualquiera de los agregados que se formen durante este procedimiento de preparado puede ser retirado por medio de centrifugado lento.

Fue medido el tamaño medio de partícula de las nanopartículas revestidas de streptavidina, siendo de 82 nm, por medio de Sinteff AS, Noruega.

(b) Ensayo para Calprotectina utilizando Nanopartículas revestidas de Streptavidina

Es preparada una suspensión presentando una concentración de alrededor de 0,60 mg por ml de partículas de las anteriormente descritas nanopartículas revestidas de streptavidina por medio de centrifugado y resuspensión del preparado anteriormente descrito en una solución de 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween® 20 y 1% PEG 6000, con un pH de 7.4 (disponible en Sigma). 500 \mul de esta suspensión de partículas son mezclados con una muestra de plasma (alrededor de 5 \mul), tomada de un sujeto sometido a prueba para determinar su propensión a desarrollar CVD, en una cubeta de lectura de cuarzo de un espectrofotómetro grabador (e.g., un Shimadzu UV-160). Es grabada la absorción a 560 nm de luz monocromática y, después de 60 segundos, 75 \mug de anticuerpo anti-calprotectina marcado con 0,15 nmol de biotina (e.g., anticuerpo policlonal de huevo purificado por medio de afinidad, marcado con biotina, adquirido en Norwegian Antibodies AS, Noruega), diluidos en 50 \mul de una solución de 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4, son añadidos a la cubeta de cuarzo y mezclados. La absorción a 340 nm de luz monocromática es grabada inmediatamente, utilizando una cubeta de referencia conteniendo una solución de 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4 y, de nuevo, a intervalos regulares (e.g., cada 2 minutos) hasta haber transcurrido alrededor de 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción en cada uno de los momentos, conforme a la lectura turbidimétrica estándar en modo cinético o a lecturas "punto final". Es decir, es calculado el incremento en la absorción lumínica en cada uno de los momentos, en relación con la lectura realizada con anterioridad a la adición de las nanopartículas revestidas de anticuerpo y/o al final de la grabación.

Ejemplo 5 (a) Preparación de Nanopartículas revestidas de Anticuerpo anti-Calprotectina

1 ml de 4,2% p/v de nanopartículas activadas por clorometilo (diámetro medio 67 nm), disponibles en Interfacial Dynamic Corporation, US, son dializadas contra agua con una membrana presentando un tamaño de poro de 10.000 kD y, a continuación, son diluidas hasta los 10 ml con agua. Son dializados 27 mg de anticuerpos policlonales de huevo purificados (e.g., anticuerpos policlonales de huevo purificados por medio de afinidad, disponibles en Norwegian Antibodies AS, Noruega) contra una solución tamponadora de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, y finalmente diluidos hasta los 6 ml en la misma solución de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, con un pH de 9.0.

Bajo agitado, las partículas son mezcladas con los anticuerpos, y se continúa con el agitado a temperatura ambiente durante 24 horas. Después, son añadidos 40 \mul de una solución de glicina (2M, con un pH de 9.0) y la mezcla es agitada durante 4 horas más a temperatura ambiente.

A continuación, las partículas son diluidas hasta conseguir un volumen total de 100 ml en tampón de 10 mM de borato, 15 mM de cloruro sódico, al cual son añadidos 0,1% Tween® 20 y 3 mg/ml de albúmina de huevo, siendo todo ello diafiltrado contra 1.000 ml de dicho tampón de borato/cloruro sódico -al cual le es añadido 0,1% Tween® 20 y 3 mg/ml de albúmina de huevo-, utilizando un filtro Pellicon XL (corte 300.000 D) y un sistema TFF de báscula de laboratorio (disponible en Millipore), conforme a las instrucciones facilitadas por los proveedores de los instrumentos y, para finalizar, las partículas son concentradas hasta conseguir un volumen de 40 a 100 ml.

Se midió que el diámetro medio de las partículas obtenidas fue de 81 nm, por medio de Sinteff AS, Noruega.

Es preparada una suspensión de 0,7 mg/ml de las partículas revestidas de anticuerpo anti-calprotectina anteriormente descritas, en 0,25 mM de TRIS, 0,15 M de NaCl y 0,1% Tween, con un pH de 8.0.

Son disueltos 5 \mul de muestra de plasma, procedente del sujeto sometido a prueba para determinar su potencial de desarrollo de CVD, en tampón de ensayo (460 \mul, 25 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween, 1,0% polietileno glicol 6000, pH= 7.4) en una cubeta de lectura de cuarzo de un espectrofotómetro grabador (e.g., Shimadzu UV-160) y es medida la absorción lumínica a 560 nm de luz monocromática. Después de 60 segundos, son añadidos 100 \mul de la suspensión anteriormente mencionada, comprendiendo 0,7 mg/ml de las nanopartículas revestidas de anticuerpo, y son mezclados en la cubeta. Es grabada la absorción lumínica antes e inmediatamente después de la adición de las nanopartículas revestidas de anticuerpo, y de nuevo a intervalos regulares (e.g., cada 20 segundos) hasta haber transcurrido 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción lumínica en cada uno de los momentos, en relación con la lectura realizada con anterioridad a la adición de las nanopartículas revestidas de anticuerpo y al final de la grabación. En otras palabras, son realizadas lecturas turbidimétricas en modo cinético y/o lecturas "punto final".

Ejemplo 6 Análisis Estadístico Comparación de Calprotectina y otros marcadores para la detección de potencial de desarrollo de CVD o de propensión a CVD

La calcificación coronaria ha demostrado estar fuertemente asociada al desarrollo de CVD y se ha demostrado también que es un método útil de predicción de potencial a sufrir CVD (e.g., infarto coronario o accidente cerebro vascular).

El grado de calcificación coronaria es medido cuantitativamente utilizando tomografía computarizada por haz de electrones -TCHE- (EBCT) y es representado por la puntuación en una escala de calcio (CS). Una puntuación alta en calcio representa un alto nivel de calcificación y un alto riesgo de desarrollar CVD.

En el siguiente estudio fue sometida a prueba la CS de 200 sujetos (100 controles poseyendo una CS <100 y 100 casos presentando una CS >100) de 45 años de edad, o de edad superior, así como sus niveles en plasma o suero de calprotectina, CRP y homocisteína. Los sujetos eran individuos referidos por sí mismos, o por un médico, como asintomáticos, y se habían realizado una prueba TCHE durante los 2 años anteriores (usualmente dentro de los 6 meses previos) para determinar sus concentraciones en plasma o suero de calprotectina, CRP y homocisteína.

Métodos Calprotectina

Fue medida la calprotectina por medio del test Calprest® (distribuido por Eurospital®, Italia) y los datos fueron resumidos para el paciente y el grupo de control utilizando desviación estándar, mediana, mínimo y máximo. Fueron calculados intervalos de confianza del 95% para la mediana. Fue utilizado el cálculo de Anderson-Darling como un test de normalidad.

La calprotectina fue resumida también por género, utilizando el mismo resumen de estadísticas.

Puntuación en la Escala de Calcio (CS)

La puntuación en la escala de calcio fue determinada por escaneo de Tomografía Computarizada por Haz de Electrones -TCHE-(EBCT). Fueron resumidos los datos para los grupos caso y control.

Proteína C Reactiva Altamente Sensible (hsCRP)

La hsCRP fue determinada por medio del ensayo "N High Sensitivity CRP" de Dade Behring (Roberts et al., Clinical Chemistry, 2000, 46:4, pags. 461-468). Fueron resumidos los datos para el paciente y para los grupos de control utilizando media, desviación estándar, mediana, mínimo y máximo.

Homocisteína (Hcy)

Fue determinada la homocisteína plasmática (Hcy) por medio del método Abbott IMx (Shipchandler, M.T. y Moore E.G., Clinical Chemistry, 1995, 41:7, pags. 991-994). Fueron resumidos los datos para el paciente y para los grupos de control utilizando desviación estándar, mediana, mínimo y máximo.

Comparación entre CS y calprotectina, hsCRP, Hcy (i) Chi-cuadrado

Fue utilizado el test del chi-cuadrado para testar la covarianza entre pares de marcadores.

(ii) Razón de probabilidad (odds ratio)

El odds ratio utilizado con la tabulación cruzada 2 x 2 (i.e., la tabla de chi-cuadrado) es el cociente de los odds de dos test covariantes y de los odds de dos test en desacuerdo. Por lo tanto, el odds ratio puede ser interpretado como una medida de la magnitud de asociación entre los dos test.

Fue calculado el odds ratio para la CS contra la calprotectina, la hsCRP y la Hcy, respectivamente.

Comparación de los valores de la mediana de los marcadores (i) Test Mann-Whitney

Este es un test no paramétrico (no es necesario que los datos se encuentren distribuidos normalmente) que fue utilizado para testar si los valores de la mediana de dos marcadores son significativamente distintos. El paquete Minitab pone por orden toda la información de ambos juegos de datos, asignando desde un 1 al más bajo hasta 200 para el valor máximo. A continuación, el paquete de software suma el rango de puntuación para comparar los dos grupos y reporta el valor "P", el cual indica la posibilidad de que el muestreo aleatorio dé como resultado medianas tan separadas entre sí como las observadas en el experimento.

Fueron comparados los valores de la mediana de la calprotectina, la hsCRP y la Hcy con los de la CS, por separado los grupo caso y control, y fue utilizado el test Mann-Whitney para determinar la significancia.

(ii) Curvas ROC para la Calprotectina y la puntuación en la escala de Calcio

La habilidad de un test para discriminar los casos de enfermos de los casos normales puede ser evaluada utilizando el análisis de curva de Características Operativas del Receptor (ROC). Fue utilizado análisis de curva ROC tanto para la calprotectina como para la hsCRP, y como una comparación de los dos marcadores.

Las curvas ROC fueron confeccionadas utilizando 11 límites de corte para el cálculo de la sensibilidad (eje y) y la especificidad 1 (eje x). Los datos procedentes de los grupos control y caso fueron agrupados y fueron clasificados desde el valor más bajo al más alto. Fue realizado un análisis sobre la población total y sobre la población masculina. Las áreas comprendidas bajo las curvas ROC fueron calculadas utilizando la regla trapezoidal.

Resultados Resumen de estadísticas para la Calprotectina

La Figura 1 muestra la curva de distribución para los 200 sujetos sometidos a prueba.

La Tabla 1 más abajo muestra el resumen de las estadísticas para la calprotectina en los grupos control y caso. La concentración de calprotectina en la mediana en el grupo control es de 0,31 mg/L, comparados con los 0,38 mg/L en el grupo caso. La concentración de calprotectina en la mediana es de 0,31 mg/L para los hombres y de 0,30 mg/L para las mujeres en el grupo control. En el grupo caso, la concentración de calprotectina en la mediana para los hombres es de 0,39 mg/L, comparados con los 0,31 mg/L para las mujeres.

TABLA 1 Resumen de las estadísticas para la Calprotectina

1

Resumen de las Estadísticas para la Puntuación en la Escala de Calcio

La Figura 2 muestra la curva de distribución para los 200 sujetos sometidos a prueba.

La Tabla 2 más abajo muestra el resumen de las estadísticas para la puntuación en la escala de calcio a través de TCHE (EBCT), en los grupos control y caso. La puntuación de la mediana en la escala de calcio en el grupo control es de 0, comparada con 259 en el grupo caso. La puntuación de la mediana en la escala de calcio es de 0 tanto para mujeres como para hombres en el grupo control, y de 315 y 256, respectivamente, en el grupo caso.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Resumen de las estadísticas para la puntuación en la escala de Calcio

2

Resumen de las Estadísticas para la hsCRP

La Figura 3 muestra la curva de distribución para los 200 sujetos sometidos a prueba.

La Tabla 3 más abajo muestra el resumen de las estadísticas para la hsCRP en los grupos control y caso. La hsCRP de la mediana tanto en el grupo control como en el grupo caso es de 1,2 mg/L. La hsCRP de la mediana es de 1,6 mg/L para mujeres y de 0,7 mg/L para hombres en el grupo control, y de 1,3 mg/L y 1,1 mg/L, respectivamente, en el grupo caso.

TABLA 3 Resumen de las estadísticas para la hsCRP

3

Resumen de las Estadísticas para la Hcy

La Figura 4 muestra la curva de distribución para los 200 sujetos sometidos a prueba.

La Tabla 4 más abajo muestra el resumen de las estadísticas para la Hcy en los grupos control y caso. La concentración en la mediana de Hcy en el grupo control es de 7,5 \mumol/L, comparados con los 8,5 \mumol/L en el grupo caso. La concentración en la mediana de Hcy es de 7,15 \mumol/L para mujeres y de 8,55 \mumol/L para hombres en el grupo control, y de 7,35 \mumol/L y 8,55 \mumol/L, respectivamente, en el grupo caso.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Resumen de las estadísticas para la Hcy

4

Comparación entre la puntuación en la escala de calcio y la calprotectina, la hsCRP, la Hcy (i) Test del chi-cuadrado

Utilizando el programa Minitab, fueron preparadas tablas del chi-cuadrado (ver tabla 5 más abajo). Este test compara las distribuciones esperadas entre los grupos de datos (asumiendo una distribución aleatoria) y los observados. El valor de significancia es una medida del grado en el que los datos no se encuentran distribuidos aleatoriamente. Por ejemplo, considerando los datos positivos en calprotectina, sería de esperar que existiera una partición igual entre los positivos y negativos en calcio (i.e., 30,5 esperado en ambas columnas). Sin embargo, la distribución observada es de 22 negativos y 39 positivos, indicando una tendencia para los positivos en calprotectina de covariar con los positivos en calcio.

El programa Minitab proporciona una medida general de la significancia de estas diferencias (tanto acuerdo como desacuerdo) y, en este caso, P es 0,009. De esta manera, existe una covariación significativa del calcio respecto a la calprotectina.

TABLA 5 Comparación del chi-cuadrado entre la Calprotectina y la puntuación en la escala de Calcio

5

Fue realizada una comparación análoga entre la calprotectina y la hsCRP (ver Tabla 6 más abajo).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Comparación del chi-cuadrado entre la Calprotectina y la hsCRP (P=0)

6

(ii) Odds ratio

Pueden ser calculados los odds ratios tomando las tablas 5 y 6, y pueden dar una medida de cuánto se desvían los valores observados de los esperados. Si las figuras en acuerdo esperadas son multiplicadas entre sí y el resultado es dividido por el producto de las figuras en desacuerdo esperadas, debería ser obtenido un valor de 1.

Tomando los datos de la Tabla 6, por ejemplo, el odds ratio de los valores esperados es 1: (88,96 x 21,96) / (50,04 x 39,04) = 1953,64/1953,6 = 1

El odds ratio observado en esta tabla es: (100 x 33) / (39 x 28) = 3300 / 1092 = 3,02

Cuanto más alejado se encuentre el odds ratio de 1, más pronunciada es la covariación; un odds ratio de 3 es significativo.

Son mostrados en la Tabla 7 los resultados de un análisis odds ratio llevado a cabo con los datos de covarianza obtenidos en el estudio.

TABLA 7 Resumen de los resultados del Odds Ratio

7

Un odds ratio alto indica un alto grado de covarianza entre los test. Puede apreciarse en la Tabla 7 que el test para la calprotectina proporciona el odds ratio más alto en relación con la escala de calcio y, por lo tanto, puede deducirse que, entre la calprotectina, la CRP y la homocisteína, la calprotectina presenta el grado mayor de covarianza en relación con la escala de calcio.

Adicionalmente, la calprotectina proporciona un alto odds ratio en relación con la CRP, otro marcador de la CVD.

Análisis del Chi-cuadrado utilizando el programa Minitab

Un test del chi-cuadrado sobre los datos anteriores, utilizando los mismos cortes que el test de odds ratio, mostró un acuerdo significativo (P 0,009) entre los resultados de la escala de calcio y de la calprotectina. Por el contrario, ni el test para la CRP ni el test para la homocisteína mostraron covarianza significativa alguna con la escala de calcio.

Un acuerdo significativo (P 0,000) fue encontrado también entre la calprotectina y la CRP.

Comparando los valores de la mediana (i) Test de Mann-Whitney

La Figura 5 muestra el dot-plot (diagrama de puntos) para la distribución de la calprotectina entre los resultados positivos en calcio y los negativos en calcio.

Los valores de la mediana para los dos grupos son 0,310 mg/L para los negativos en calcio y 0,375 mg/L para los positivos en calcio. El Mann-Whitney indica que la suma de los rangos para los negativos en calcio es de 912, y 1108 para los positivos en calcio, y proporciona un valor P de 0,0113.

Fue llevado a cabo también un análisis Mann-Whitney sobre los datos anteriores, con el fin de testar incrementos significativos en las medianas de las concentraciones de calprotectina, CRP y homocisteína en los grupos de puntuación de escala de calcio altos (CS >100) y bajos (<100). Los resultados mostraron que los valores de la mediana para la concentración de calprotectina y de homocisteína se encontraban significativamente altos en el grupo con calcio alto (P= 0,0112 y 0,0037, respectivamente), mientras que la CRP no mostró ninguna diferencia significativa en ninguno de los grupos (ver Tabla 8 más abajo).

TABLA 8 Comparación de los valores de la mediana de la Calprotectina y de la Hcy

8

(ii) Análisis ROC y curvas

Las Figuras 6 y 7 muestran las curvas ROC para la calprotectina y la hsCRP para todos los sujetos y para la población masculina. La Tabla 9 más abajo muestra el área bajo las curvas ROC.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 9 Área bajo las curvas ROC

9

Porcentaje de Acuerdo contra la puntuación en la escala de Calcio

Fue evaluada también la exactitud de cada uno de los test de calprotectina, CRP y homocisteína (Hcy) y de los niveles de corte (Hcy co 12 \mumol) en la Tabla 7, como un test para determinar el potencial de desarrollo de CVD, asumiendo que una puntuación en la escala de calcio superior a 100 es reflejo de un alto riesgo de desarrollo de CVD.

Los resultados del análisis son mostrados en la Tabla 10.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 10

10

Porcentaje de acuerdo contra calcio para calprotectina = 58,5% (42+75/200)

Porcentaje de acuerdo contra calcio para CRP = 50% (25+75/200)

Porcentaje de acuerdo contra calcio para la homocisteína = 50,5% (24+77/200).

Claims

1. Un método de ensayo para la detección de potencial de desarrollo de enfermedad cardiovascular (CVD), o propensión a CVD, en un sujeto animal humano o no humano, comprendiendo dicho método la evaluación de la concentración de calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina, tomada de dicho sujeto.

2. Un método, conforme es reivindicado en la reivindicación 1, en donde dicha muestra es un fluido corporal seleccionado de entre sangre, suero, plasma, orina, fluido cerebroespinal, fluido oral, fluido sinovial o fluido empiema.

3. Un método, conforme es reivindicado en la reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en donde dicha muestra es sangre.

4. Un método, conforme es reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde dicha muestra es suero o plasma.

5. Un método, conforme es reivindicado en la reivindicación 3 o en la reivindicación 4, en donde una concentración umbral de calprotectina por encima de la cual dicho ensayo es indicativo de potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, es de 0,45 mg/L.

6. Un método, conforme es reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, comprendiendo adicionalmente la evaluación de la concentración de un segundo marcador de CVD en dicha muestra.

7. Un método, conforme es reivindicado en la reivindicación 6, en donde dicho segundo marcador es la proteína C reactiva.

8. Un método, conforme es reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, en donde dicha CVD es el infarto de miocardio agudo.

9. Un método, conforme es reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde dicha concentración de calprotectina es evaluada por medio de turbidimetría.

10. Un método, conforme es reivindicado en la reivindicación 9, para la determinación de calprotectina en un fluido corporal conteniendo calprotectina, en donde dicho método comprende las fases de:

(a): puesta en contacto de dicha muestra de dicho fluido corporal con un anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- anti-calprotectina unido a nanopartícula, con el fin de unir dicha calprotectina; y

(b): evaluación del contenido de calprotectina por medio de turbidimetría,

en donde el diámetro de las partículas revestidas de anticuerpo -o de fragmento de anticuerpo- es de 65-140 nm.

11. Un método, conforme es reivindicado en la reivindicación 10, en donde el diámetro de las nanopartículas revestidas de anticuerpo -o de fragmento de anticuerpo- es de 75-120 nm.

12. Un método, conforme es reivindicado en la reivindicación 10 o en la reivindicación 11, en donde dichas nanopartículas son sustancialmente todas ellas del mismo tamaño (e.g., monodispersas).

13. Un método, conforme es reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 12, en donde es añadido polietileno glicol como un mejorador de opacidad entre las fases (a) y (b).

14. Un método, conforme es reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 13, realizado como un ensayo automatizado.