ES2297250T3 - Metodo de ensayo para la deteccion potencial del desarrollo de una enfermedad cardiovascular. - Google Patents
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Abstract
Un método de ensayo para la detección de potencial de desarrollo de enfermedad cardiovascular (CVD), o propensión a CVD, en un sujeto animal humano o no humano, comprendiendo dicho método la evaluación de la concentración de calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina, tomada de dicho sujeto.
Description
Método de ensayo para la detección potencial del
desarrollo de una enfermedad cardiovascular.
La presente invención está relacionada con un
método de ensayo para detectar un potencial o propensión a
desarrollar una enfermedad cardiovascular (CVD) en un sujeto, e.g.,
un animal humano o no humano, especialmente un mamífero y, en
particular, con un método de ensayo que puede ser utilizado para
detectar un potencial para desarrollar CVD, o una propensión a CVD,
antes de que el sujeto se de cuenta del inicio de los síntomas de la
CVD.
La CVD es una de las principales fuentes de
problemas de salud entre la población humana. En 1998,
aproximadamente el 40% de todas las muertes acaecidas en el mundo
occidental fue resultado de CVD (i.e., 1 de cada 2,5 muertes). Para
2002, se estima que en los EE.UU. alrededor de un millón de personas
sufrirán un nuevo ataque coronario, o uno recurrente, y más del 40%
de la gente que sufra estos ataques morirá. Muchas de estas personas
morirán súbitamente sin haber llegado a ser nunca hospitalizadas o
tratadas. Muchas de ellas no se habrán dado cuenta de que eran
susceptibles de padecer CVD.
Un tratamiento temprano o preventivo, como un
cambio de dieta, una reducción del número de cigarrillos o el
abandono del hábito de fumar, el incremento en el ejercicio, la
reducción del peso corporal, etc., presentan, sin embargo, un alto
porcentaje de éxito a la hora de prevenir la CVD o de reducir la
propensión a CVD. De esta forma, si pudieran ser detectados la CVD
o el potencial o propensión a CVD, se encuentra disponible el
tratamiento efectivo.
En consecuencia, existe la necesidad de
descubrir métodos que puedan ser utilizados para detectar la CVD y,
especialmente, el potencial o propensión a desarrollar la CVD, antes
de que la enfermedad haya progresado más allá de la fase donde el
tratamiento (e.g. un cambio de estilo de vida y/o hábitos) tiene por
lo general éxito. En particular, existe la necesidad de encontrar
métodos que puedan ser utilizados para detectar la CVD en sus fases
iniciales, cuando los síntomas no son evidentes para un sujeto o
para una tercera persona, e.g., un médico, i.e. se precisan métodos
para someter a prueba a sujetos "libres de síntomas".
Tales métodos pueden ser utilizados para someter
a escrutinio a la población general (i.e., escrutinio en masa) o a
grupos de riesgo dentro de la población, e.g. hombres de más de 40
años, trabajadores en puestos de trabajo con un alto estrés,
individuos que siguen dietas poco saludables, individuos que sufren
de obesidad clínica, fumadores, etc. En los casos donde es
diagnosticado el potencial de desarrollo de CVD, o la propensión a
CVD, puede ser facilitado tratamiento preventivo y/o el paciente
puede ser animado a realizar ajustes en su estilo de vida y
hábitos.
De igual forma, donde es detectado un potencial
de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, un paciente puede ser
sometido a pruebas adicionales, e.g. utilizando técnicas más caras o
que requieran de un tiempo más largo, tales como el ECG
(electrocardiograma de esfuerzo) -con y sin actividad física-, el
estudio radioisotópico de perfusión miocárdica, la angiografía
coronaria por rayos X -e.g. CT (tomografía computerizada)-, la
angiografía coronaria por MR (resonancia magnética) o el estudio de
perfusión, etc. De esta manera, al confirmar la posible presencia
de CVD -o potencial o propensión a padecerla- por medio de la
utilización del barato y fácil método de la invención en un
escrutinio inicial (e.g. en un escrutinio en masa de sujetos sanos
"sin síntomas"), se ve incrementada la probabilidad de
detección o identificación de la CVD no descubierta -o potencial
para desarrollar CVD- antes de que los daños a la salud se vuelvan
irreversibles, mientras que, al mismo tiempo, se limita la
utilización innecesaria de pruebas costosas que precisan de mucho
tiempo.
Por "CVD" se entiende cualquier dolencia
del corazón, arterias o venas que interrumpa el aporte de oxígeno a
áreas vitales para la vida dentro del organismo, tales como el
cerebro, el corazón, etc. Ejemplos de CVDs son la
arterioesclerosis, el infarto de miocardio agudo, la angina
pectoral, la enfermedad cardíaca isquémica, la enfermedad
cerebrovascular, la apoplejía, la hemorragia subaracnoide, la
hemorragia intracerebral, el infarto cerebral, el fallo cardíaco
congestivo, la angina, el ataque cardíaco, la parada cardíaca y la
arritmia.
La presente invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de que la proteína calprotectina es un útil
"marcador" o "indicador" de potencial de desarrollo de CVD
-o de propensión a CVD- antes del inicio de los síntomas de CVD
(i.e., en sujetos libres de síntomas). En particular, de ha
descubierto sorprendentemente que niveles anormalmente altos de
calprotectina en distintos fluidos corporales es indicativo de
susceptibilidad a sufrir CVD antes de que sea evidente para un
sujeto, o para una tercera persona (e.g., un médico), el inicio de
los síntomas de la CVD.
Con el fin de evitar dudas, el término
calprotectina es utilizado aquí como sinónimo de
"L1-proteína", "MRP 8/14", "antígeno
(asociado) a fibrosis cística (CFA)" y "calgranulina".
La calprotectina existe tanto en forma dimérica
como en la trimérica. Como un dímero, la calprotectina comprende
las cadenas polipeptídicas S100A8 y S100A9. Como un trímero, la
calprotectina es una proteína heterotrimérica de 36 kDa con dos
cadenas pesadas (14kD) y una cadena ligera (8 kD) ligadas de forma
no covalente.
La calprotectina es una proteína fijadora de
calcio y, cuando se fija al calcio, la calprotectina es resistente
al calor y a la proteólisis. Esto puede permitir una amplia gama de
técnicas de ensayo y condiciones en las que puede ser empleada.
El mapeo de epítopes de la calprotectina muestra
que pueden ser producidos anticuerpos con especificidad para el
complejo y/o sus cadenas proteínicas sencillas. Se ha demostrado que
existen al menos cuatro sitios inmunogénicos distintos en el
complejo de la calprotectina. Algunos anticuerpos reconocen la
cadena pesada o la ligera, mientras que otros reconocen ambas.
La calprotectina se halla en células, tejidos y
fluidos de todas las partes del cuerpo humano, y procede
predominantemente de neutrófilos y monocitos. La calprotectina se
encuentra presente probablemente en todos los individuos ya que,
entre más de 5.000 individuos testados, no se encontró ninguno en el
que no se hallara presente. La calprotectina se encuentra también
en ratas, ratones, conejos, ovejas, ganado y cerdos. Por lo tanto,
es una abundante y ubicua molécula.
In vivo, la calprotectina se encuentra
implicada en numerosas funciones biológicas, incluyendo la
transducción de señal intracelular, la activación de neutrófilos,
la inhibición de enzimas intracelulares implicadas en la
proliferación celular, la actividad antimicrobiana y en la defensa
neutrófila. La calprotectina es también una proteína reguladora en
reacciones inflamatorias y, en este papel, puede funcionar para
estimular la producción inmunoglobulínica, la actividad del factor
quimiotáctico y del factor de inmovilización neutrófilo.
Aunque la calprotectina probablemente se
encuentra siempre presente en los fluidos corporales, se ha
descubierto que la concentración de calprotectina en los distintos
fluidos corporales cambia, por ejemplo, incrementándose en un
número de trastornos (e.g., enfermedades inflamatorias, infecciosas
y malignas). De esta forma, la medición de la concentración de
calprotectina en el fluido corporal de pacientes que sufren de tales
trastornos (i.e., en individuos que muestran síntomas apreciables
para el sujeto y/o para una tercera persona) y comparándola con la
concentración de calprotectina determinada en un fluido corporal,
por ejemplo, para un sujeto sano (i.e., no enfermo), puede ser
utilizada como un medio de diagnóstico de tales enfermedades.
Por ejemplo, aunque los síntomas de las
infecciones bacterianas y víricas son muy similares y el diagnóstico
partiendo únicamente de sus síntomas puede ser difícil, la
concentración de calprotectina en el plasma/suero del sujeto
infectado aumenta aproximadamente de 1 a 2 veces en las infecciones
víricas, pero alrededor de 1 a 18 veces en las infecciones
bacterianas. De esta forma, el sujeto que haya notado los síntomas
de la infección puede hacer que se mida la concentración de
calprotectina en su fluido corporal y que su infección sea
diagnosticada y tratada en conse-
cuencia.
cuencia.
Otras enfermedades en las que la calprotectina
puede ser usada como un test diagnóstico incluyen: las enfermedades
reumáticas (e.g., artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil,
lupus eritematoso sistémico), el síndrome de Sjøgren, los
trastornos inflamatorios intraoculares, la fibrosis cística, la
enfermedad pulmonar aguda y crónica, el carcinoma pulmonar (de
células escamosas), los cánceres pulmonares, el cáncer colorrectal,
la enfermedad inflamatoria intestinal, el cáncer gástrico, el
adenoma o cáncer colorrectal, la enfermedad de Chrohn, la colitis
ulcerativa, la inflamación de la mucosa gastrointestinal, las
piedras urinarias, la enfermedad hepática alcohólica, la enfermedad
inflamatoria de la mucosa oral, la enfermedad inflamatoria del
sistema nervioso central (CNS) (e.g., esclerosis múltiple y
encefalitis aguda), la infección VIH, las infecciones CNS
secundarias en pacientes infectados con VIH, las infecciones del
tracto urinario, la cistitis, la pielonefritis, la uveítis
posterior endógena, los trastornos hematológicos (e.g., leucemia),
los trastornos febriles (infecciosos y no infecciosos), el infarto
de miocardio agudo y la
aféresis.
aféresis.
Se ha descubierto también que la concentración
en plasma de la calprotectina se incrementa durante la cirugía a
corazón abierto (Semb, A.G. et al., Eur. J.
Cardio-thorac Surg. (1991)
5:363-367, Saatvedt, K. et al., Scand. J.
Thor. Cardiovasc. Surg. (1996) 30:53-60, Moen, O.
et al., Perfusion (1994) 9:109-117). Más
específicamente, Saatvedt et al. informa de que la
concentración de calprotectina aumenta después del comienzo del
bypass cardiopulmonar y alcanza su máximo 48 horas después de la
operación.
Ha sido descubierto ahora sorprendentemente que
el potencial para desarrollar CVD, o la propensión a CVD, en un
sujeto pueden ser evaluados determinando la concentración de
calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina tomada de
dicho sujeto. En otras palabras, se ha descubierto que la
determinación de la concentración de calprotectina en una muestra
conteniendo calprotectina tomada de un sujeto, puede ser usada para
predecir si el sujeto puede sufrir CVD, o si es susceptible de
ello, con anterioridad a que comiencen los síntomas, los cuales son
evidentes para el sujeto o para una tercera persona (e.g., un
médico).
Por "potencial para" o "propensión a"
se quiere decir la posibilidad o probabilidad de que el sujeto
libre de síntomas sometido a prueba en ese momento sufra CVD en el
futuro. Esto puede tomar la forma de un índice, proporción,
porcentaje o número similar, que refleje el riesgo relativo de
padecer CVD en el futuro (e.g., en los siguientes
1-2 años, al menos en los siguientes 6 meses).
Visto de esta forma desde uno de los aspectos,
la invención proporciona un método de ensayo para la detección de
potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, en un sujeto
animal humano o no humano, comprendiendo dicho método la evaluación
de la concentración de calprotectina en una muestra conteniendo
calprotectina tomada de dicho sujeto, e.g., una muestra de sangre,
plasma, suero, fluido cerebroespinal, fluido oral, orina, heces,
fluidos sinovial o empiema.
Por "evaluación" se quiere decir que es
determinado un valor cuantitativo o
semi-cuantitativo para la concentración de
calprotectina. Éste puede ser el valor para la concentración de la
muestra cuando es testada, e.g., después del tratamiento para
eliminar las células o otros componentes en la muestra que no están
sometidos al ensayo, o para concentrar o diluir la muestra, o para
transferir la calprotectina a un medio aparte, e.g., un sustrato
sólido.
Alternativamente, la evaluación puede ser
simplemente cualitativa, i.e., para indicar si la calprotectina se
encuentra por encima o por debajo de uno o más valores umbral
predeterminados, e.g., valores indicativos de la ausencia de
potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, conforme es
detectable por medio del ensayo. Los valores precisos para estos
valores umbral, o para otros valores de referencia para la
calprotectina, pueden depender de la naturaleza de la muestra, de
la edad, del peso, del sexo y de la especie de un sujeto, y pueden
ser determinados de una manera rutinaria midiendo la concentración
de calprotectina del fluido corporal relevante de sujetos
equivalentes sin CVD, o con CVD en distintas fases de
desarrollo.
Un valor indicativo de la concentración de
calprotectina determinado o "evaluado" conforme al método de la
invención puede ser una concentración absoluta de calprotectina o,
alternativamente, puede ser un índice, proporción, porcentaje o
número similar que refleje la concentración de calprotectina.
Una muestra corporal utilizada en este método de
ensayo de la invención puede ser cualquier muestra conteniendo
calprotectina, e.g., un fluido corporal o muestra tisular, o una
suspensión, etc. Preferiblemente, la muestra será un fluido
corporal, e.g., orina, fluido cerebroespinal, fluido oral, fluido
sinovial o fluido empiema, o, más preferiblemente, sangre o una
muestra procedente de sangre. Cuando es este el caso (i.e., cuando
es utilizada sangre o una muestra derivada de sangre), la muestra
utilizada para análisis se encontrará preferiblemente libre de
células (e.g., suero o plasma). Alternativamente, pueden ser
utilizadas heces.
La muestra puede ser tratada con anterioridad a
ser utilizada en el método de ensayo de la invención. De esta
forma, la muestra puede ser tratada para eliminar cualquier tipo de
células y/o cualquier tipo de componentes en la sangre que no vayan
a ser sometidos a ensayo. La muestra puede ser tratada también para
concentrar o diluir la muestra, o para transferir la calprotectina
a un medio aparte, e.g., un sustrato sólido. Por ejemplo, la
muestra puede ser diluida añadiendo un tampón u otro medio acuoso.
Alternativamente, puede ser usada directamente una muestra,
particularmente una muestra de plasma o de suero.
La muestra es tratada opcionalmente con calcio o
con un compuesto calcio-mimético (i.e., iones de
otro metal de tierra alcalina), previamente a ser utilizada en el
método de ensayo de la invención. El calcio, o el compuesto
calcio-mimético, puede ser cualquier forma que
proporcione iones Ca^{2+} (e.g., CaCl_{2}). Si es utilizado
calcio, entonces es añadido a la muestra preferiblemente el
suficiente calcio, o compuesto calcio-mimético,
como para saturar los sitios de fijación del calcio a la
calprotectina. Por ejemplo, puede ser añadido un exceso molar de
fuente cálcica de diez veces, más preferiblemente, un exceso molar
de cinco veces o, especialmente preferible, un exceso molar de tres
veces.
Aunque los ensayos para la calprotectina son
conocidos y pueden ser utilizados en el método de la invención, no
ha existido previamente ninguna sugerencia de que la calprotectina
fuera un marcador o indicador del potencial de desarrollo de CVD, o
propensión a CVD. En otras palabras, no ha existido previamente
ninguna sugerencia de que la concentración de calprotectina en
sujetos libres de síntomas pudiera ser utilizada como un marcador o
indicador de potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD y,
en particular, no ha existido ninguna sugerencia de que la
concentración de calprotectina pudiera ser utilizada como el
marcador o indicador en un método de ensayo adecuado para el
escrutinio en masa de sujetos sanos (i.e., sin síntomas).
Puede ser utilizado en el método de ensayo de la
invención cualquier método de ensayo conocido para la detección de
calprotectina. De esta forma, por ejemplo, el método revelado en la
US-A-4833074 (Fagerhol et
al.) para el aislamiento de la calprotectina y para la
subsiguiente producción de antisuero monoespecífico de la misma,
puede ser utilizado para producir anticuerpos
anti-calprotectina para su uso en cualquier método
de ensayo convencional. Los anticuerpos
anti-calprotectina producidos pueden ser utilizados,
por ejemplo, en inmunoensayos ligados a enzima y en
radio-inmunoensayos.
Por ejemplo, puede ser utilizado también un
formato de inmunoensayo NycoCard® (Axis-Shield PoC,
Oslo, Noruega) para la detección de calprotectina. Este ensayo
utiliza un formato de fase sólida de tipo sándwich, en el cual el
dispositivo de prueba comprende una membrana revestida de
anticuerpos inmovilizados anti-calprotectina. De
esta manera, la muestra (opcionalmente diluida) es aplicada al
dispositivo y cuando la muestra fluye a través de la membrana, es
capturada cualquier calprotectina que se encuentre presente. La
calprotectina inmovilizada sobre la membrana es tratada a
continuación con un conjugado de oro-anticuerpo, el
cual se une al complejo de
calprotectina-anticuerpo, y la intensidad de color
(debido a las partículas de oro) -conforme es determinado por medio
de absorbancia de luz roja- es proporcional a la cantidad de
calprotectina. Por lo tanto, la concentración de calprotectina
puede ser calculada a partir de la curva de calibración preparada de
manera convencional.
Alternativamente, puede ser utilizado el test
comercial (Calprest®) para detección de calprotectina, por ejemplo,
en heces (disponible en Eurospital®). Este ensayo utiliza un
anticuerpo policlonal contra la calprotectina en un sistema de
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima. De esta forma, la
calprotectina presente en una muestra tomada de un sujeto se une al
anticuerpo, el cual es adsorbido hasta la superficie de un pocillo
de plástico. A continuación, es añadido un sustrato para la enzima
y la intensidad del producto coloreado producido es proporcional a
la cantidad de enzima y, por lo tanto, a la cantidad de
calprotectina. La cantidad de calprotectina puede ser calculada,
por lo tanto, tomando una curva de calibración preparada de forma
convencional.
De hecho, tanto los anticuerpos
anti-calprotectina monoclonales como los
policlonales se encuentran disponibles comercialmente. Los
anticuerpos policlonales de huevo y de conejo se encuentran
disponibles, por ejemplo, en Norwegian Antibodies AS y en
Axis-Shield Diagnostics, respectivamente, mientras
que el anticuerpo monoclonal de ratón puede ser obtenido en Dako
A/S, Dinamarca. Puede ser utilizado en este método de la invención
cualquier anticuerpo anti-calprotectina obtenido,
por ejemplo, por medio de cualquier técnica convencional de
obtención de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo
anti-calprotectina de conejo, así como los
anticuerpos monoclonales, pueden ser producidos conforme al
protocolo descrito en Harlow y Lane (1988), Antibodies, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, N.Y.
Alternativamente, los anticuerpos
anti-calprotectina pueden ser preparados por medio
de la inyección regular de una solución conteniendo calprotectina
en gallinas y, después, recolectando las yemas de los huevos de
gallina. A continuación, el anticuerpo policlonal de huevo de
gallina puede ser aislado conforme a técnicas convencionales y
puede ser purificado por medio de cromatografía de afinidad.
Preferiblemente, el método de ensayo de la
invención es utilizado en escrutinio en masa de sujetos sanos (e.g.,
libres de síntomas de CVD). Donde es detectado un potencial de
desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, el sujeto puede ser
sometido a pruebas adicionales (e.g., utilizando técnicas más
costosas específicas para la CVD) con el fin de confirmar la
presencia o ausencia de CVD.
Por lo general, además de la muestra bajo
evaluación, serán evaluadas también en la realización del método de
ensayo muestras de calibración con un contenido conocido de
calprotectina. Tales determinaciones pueden ser utilizadas para
confeccionar una curva de calibración, a través de la cual puede ser
determinado el contenido de calprotectina de la muestra bajo
investigación. La naturaleza de las muestras de calibración y la
selección de los factores de conversión o ajuste utilizados a la
hora de determinar el contenido de calprotectina pueden variar,
dependiendo, por ejemplo, de la manera en la que es detectada la
calprotectina en la técnica de ensayo utilizada en ese momento y de
otros aspectos del método que afectan al resultado del ensayo, por
ejemplo, la composición del tampón, las condiciones del ensayo,
etc.
Usualmente serán utilizadas muestras de
calibración con contenidos de calprotectina de 0 a 5.000 mg/L. El
rango de referencia dentro del cual se encontrará generalmente el
valor de concentración de la calprotectina es de 0,1 a 10 mg/L.
Por lo general, la concentración de
calprotectina en el suero y plasma de humanos con poco o ningún
potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, se
encontrará en el rango de 0,01-0,75 mg/L. Más
específicamente, la concentración de calprotectina en el suero y
plasma de tales humanos se encontrará en el rango de
0,05-0,70 mg/L, incluso más específicamente, de
0,10-0,66 mg/L, por ejemplo, en el rango de
0,15-0,45 mg/L. Por ejemplo, la concentración de
calprotectina en el suero o plasma de una mujer con poco o ningún
potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, se encontrará
en el rango de 0,09-0,53 mg/L, por ejemplo,
alrededor de 0,31 mg/L o de 0,30 mg/L. La concentración de
calprotectina en el suero o plasma de un hombre con poco o ningún
potencial de desarrollo de CVD, o propensión a CVD, se encontrará
en el rango de 0,12-0,66 mg/L, por ejemplo, de
0,30-0,39 mg/L, especialmente 0,31 mg/L.
Una concentración de calprotectina en suero o
plasma superior a 0,75 mg/L generalmente será indicativa de un muy
alto potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD. De esta
manera, un valor umbral por encima del cual puede mantenerse que el
ensayo predice el potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a
CVD, puede encontrarse por lo general en el rango de
0,32-0,77 mg/L, por ejemplo, alrededor de 0,67 mg/L,
preferiblemente alrededor de 0,70 mg/L, especialmente alrededor de
0,76 mg/L. Más preferiblemente, el valor umbral por encima del cual
puede mantenerse que el ensayo predice el potencial de desarrollo de
CVD, o de propensión a la misma, se encuentra en el rango de
0,30-0,50 mg/L, aún más preferiblemente, en el rango
de 0,32-0,47 mg/L, por ejemplo, alrededor de 0,45
mg/L.
Por lo general, la concentración de
calprotectina en las heces de humanos con poco o ningún potencial de
desarrollo de CVD, o propensión a CVD, se encontrará en el rango de
0,01-10 mg/L. Más específicamente, la concentración
de calprotectina en las heces de tales humanos se encontrará en el
rango de 0,05-9,0 mg/L, incluso más específicamente,
de 0,50-8,0 mg/L.
Una concentración de calprotectina en las heces
superior a 10 mg/L generalmente será indicativa de un alto
potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD. De esta
manera, un valor umbral por encima del cual puede mantenerse que el
ensayo predice el potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a
CVD, puede ser por lo general de alrededor de 9 mg/L, más
preferiblemente alrededor de 10,5 mg/L, especialmente alrededor de
11 mg/L.
Sin embargo, los valores umbral son calculados
mejor tomando las determinaciones de calprotectina utilizando las
mismas técnicas de ensayo para el mismo tipo de muestra de fluido
corporal entre un grupo de pacientes de tipo similar (edad, sexo,
peso, especie, etc.), desde el estado sano, pasando por las etapas
tempranas de desarrollo de CVD hasta llegar a estado grave de CVD.
Aún más preferiblemente, los valores umbral serán valores
determinados en el mismo paciente un una fase más temprana, en un
estado sano. De esta forma, individuos particularmente de riesgo
podrían monitorizar sus niveles de calprotectina de forma rutinaria
(e.g., cada 6 meses o cada año) en programas de escrutinio en
masa.
En un método de ensayo preferido de la presente
invención, dicho método comprende además la evaluación adicional de
la concentración de otro marcador que determine el potencial de
desarrollo de CVD en la muestra tomada del sujeto. Ejemplos de
marcadores adecuados pueden ser la homocisteína, el factor XII
activado, el colesterol, la proporción de colesterol:HDL, el
fibrinógeno, el activador de plasminógeno de tipo tisular, los
Factores V, VII y VIII, la lipoproteína (a), el antígeno del factor
von Willebrand, el complejo plasmina-\alpha2
antiplasmina, el fragmento de protrombina 1+2, el complejo de
trombina-antitrombina III, el fibrinopéptido A, los
productos de degradación de la fibrina, el dímero D, la resistencia
a proteína C activada, el factor VIIc y VIIa, la trombina, el
amiloide A sérico, las moléculas de adhesión vascular y el calcio
coronario. Preferiblemente, el segundo marcador es seleccionado de
entre la homocisteína o la proteína C reactiva.
Más preferiblemente, el método de ensayo de la
presente invención comprende adicionalmente la evaluación adicional
de la concentración de la proteína C reactiva (CRP) en la muestra
tomada del sujeto. Preferiblemente, la concentración de CRP es
evaluada simultáneamente o secuencialmente a dicho ensayo de
calprotectina.
La medición de CRP puede ser llevada a cabo
utilizando cualquier técnica estándar de inmunoensayo (e.g. ELISA,
RIA, etc.) o puede ser determinada por medio de NycoCard®
(disponible en Axis-Shield PoC, Oslo, Noruega).
Una concentración de calprotectina en suero o
plasma superior a 0,75 mg/L junto con una concentración de CRP
superior a 1,75 mg/L será generalmente indicativa de un muy alto
potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a CVD.
Preferiblemente, la presencia de las concentraciones anteriormente
mencionadas es un indicativo mucho más alto de potencial de
desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, que únicamente una
concentración de calprotectina o de CRP.
De esta forma, los valores umbral de
calprotectina y de CRP por encima de los cuales puede mantenerse que
el ensayo es altamente predictivo en cuanto al potencial de
desarrollo de CVD, o de propensión a CVD, puede ser por lo general
de 0,32-0,77 mg/L y de 1,70 mg/L, respectivamente;
más preferiblemente, alrededor de 0,67 mg/L y de 1,75 mg/L,
respectivamente; aún más preferiblemente alrededor de 0,70 mg/L y de
2,00 mg/L, respectivamente; especialmente alrededor de 0,76 mg/L y
de 2,25 mg/L, respectivamente. Más preferiblemente, los valores
umbral por encima de los cuales puede mantenerse que el ensayo es
altamente predictivo en cuanto al potencial de desarrollo de CVD, o
de propensión a CVD, se encuentran en el rango de
0,30-0,50 mg/L y de 0,75 mg/L, respectivamente;
incluso más preferiblemente, en el rango de
0,32-0,47 mg/L y de 0,75 mg/L, respectivamente; por
ejemplo, alrededor de 0,45 mg/L y de 0,75 mg/L,
respectivamente.
Un kit de ensayo para su utilización en el
método de la invención comprende reactivos e instrucciones para la
realización del método de ensayo y para la interpretación de los
resultados y, opcionalmente, muestras de referencia conteniendo
calprotectina y, opcionalmente, un detector. Preferiblemente, dicho
kit de ensayo comprende también los reactivos e instrucciones para
la determinación de la concentración de CRP.
Las instrucciones en el kit pueden encontrarse,
por ejemplo, en forma de una etiqueta, un manual o una hoja de
instrucciones; sin embargo, en su lugar puede que presenten la forma
de un programa informático o un portador de datos, e.g., un disco
informático.
El detector, en caso de estar presente, será por
lo general uno capaz de detectar una especie reportera, e.g, un
espectrómetro, un detector de radiación nuclear, un detector de luz
difusa, etc.
Los reactivos serán agentes adecuados para la
determinación de calprotectina, e.g., reactivos adecuados
especificados en la literatura asociada a los test disponibles para
determinación de la calprotectina, tales como los de Eurospital® y
NycoCard (disponible en Axis Shield ASA, Oslo, Noruega)
anteriormente citados. Pueden ser adecuados también los reactivos
mencionados en la US-A-4833074.
Un método de ensayo particularmente preferido
para evaluar la concentración de calprotectina en la presente
invención es un inmunoensayo basado en partículas. Esta es una
técnica sensible, la cual está basada en la determinación
turbidimétrica de la concentración de calprotectina. La sensibilidad
que proporciona el ensayo permite de forma ventajosa que las
muestras de fluido corporal (e.g., plasma o suero) con
concentraciones relativamente bajas de calprotectina sean
determinadas con un alto nivel de precisión. Al mismo tiempo, pueden
ser medidas también con precisión concentraciones relativamente
altas de calprotectina.
La determinación turbidimétrica posee también la
ventaja de que no se precisa de superficie sólida para la
separación física en el ensayo, y no son necesarias numerosas fases
de lavado y/o separación. De esta forma, comparándose con técnicas
previas existentes en este campo (e.g. ELISA), la determinación
turbidimétrica homogénea de la calprotectina es rápida y fácil de
llevar a cabo y puede, por ejemplo, ser automatizada. Si se compara
con la automatización de técnicas no homogéneas que comprenden, por
ejemplo, una superficie sólida, la automatización de un ensayo
basado en la turbidimetría es relativamente fácil. También, el
proceso homogéneo automatizado resultante es, a menudo, más fiable
y menos propenso, por ejemplo, a estropearse.
Un ensayo turbidimétrico automatizado es
también más rápido, permitiendo una alta producción de muestras y
es relativamente barato de poner en funcionamiento. Usualmente puede
ser realizado utilizando un robot disponible comercialmente, e.g.,
el Cobas Mira o el Hitachi 711, ambos disponibles en Roche
Diagnostics. Un ensayo automatizado de este tipo es particularmente
atractivo cuando se prevé someter a prueba de forma rutinaria a
individuos para determinar el potencial de desarrollo de CVD, o la
propensión a la misma.
Para la determinación turbidimétrica de la
concentración de calprotectina, la muestra conteniendo calprotectina
será por lo general un fluido corporal, e.g., orina, fluido
cerebroespinal, fluido oral, fluido sinovial o fluido empiema o,
más preferiblemente, una muestra de sangre o procedente de un
derivado de la misma. Cuando es este el caso, la muestra utilizada
para análisis se encontrará preferiblemente libre de células (e.g.,
suero o plasma).
De esta manera, la muestra puede ser tratada
para eliminar cualquier célula y/o cualquier componente en la
muestra que no se esté sometiendo a ensayo. La muestra puede ser
tratada también para concentrar o diluir la muestra, o para
transferir la calprotectina a un medio aparte, e.g., un sustrato
sólido. Por ejemplo, la muestra puede ser diluida añadiendo agua,
un tampón u otro medio acuoso. Alternativamente, puede ser usada
directamente una muestra, particularmente una muestra de suero o
plasma.
La muestra es tratada opcionalmente con calcio o
un compuesto calcio-mimético antes de ser utilizada
en el método del ensayo. El calcio o el compuesto
calcio-mimético puede ser cualquier forma que
proporcione iones Ca^{2+} (e.g., CaCl_{2}). Si es utilizado
calcio, entonces es añadida a la muestra preferiblemente la
suficiente cantidad de calcio, o de compuesto
calcio-mimético, como para saturar los sitios de
fijación a calcio de la calprotectina. Por ejemplo, puede ser
añadido un exceso molar de fuente cálcica de diez veces, más
preferiblemente, un exceso molar de cinco veces o, especialmente
preferible, un exceso molar de tres veces.
La opacidad, para la determinación
turbidimétrica de la concentración de calprotectina, será generada
por lo general poniendo en contacto la muestra conteniendo
calprotectina -o una parte alícuota de la misma- con un anticuerpo
anti-calprotectina, con un fragmento de anticuerpo o
con una mezcla de anticuerpos anti-calprotectina
(e.g., una mezcla de anticuerpos monoclonales). El anticuerpo
policlonal antihumano de huevo de la calprotectina, disponible
comercialmente en Norwegian Antibodies AS, puede ser utilizado, por
ejemplo, para generar opacidad. Puede ser utilizado en el método de
la invención cualquier anticuerpo anti-calprotectina
obtenido, por ejemplo, por medio de cualquier técnica convencional
para la obtención de anticuerpos.
Los anticuerpos -o fragmentos de anticuerpo- que
son utilizados para la determinación turbidimétrica de la
concentración de calprotectina muestran preferiblemente pocas
reacciones cruzadas, o ninguna, con otras proteínas sanguíneas que
puedan encontrase presentes en el eluído. La cantidad del anticuerpo
-o fragmento de anticuerpo- utilizada debería ser optimizada, desde
luego, contra muestras estándar conteniendo calprotectina, ya que
la opacificación surge debido al efecto gancho por el que la
fijación múltiple de calprotectina genera los centros de
opacificación. La calprotectina, conforme es mencionado más arriba,
presenta numerosos sitios de fijación a anticuerpo, y es
particularmente adecuada para la detección en este tipo de
ensayo.
En una realización preferida, el anticuerpo
anti-calprotectina -o fragmento de anticuerpo- puede
ser inmovilizado por medio de unión o acoplamiento -bien directa o
indirectamente- a cualquier soporte sólido o matriz conocido que
sea utilizado comúnmente para la inmovilización. Preferiblemente, el
soporte sólido o matriz toma la forma de partículas,
preferiblemente nanopartículas. Convenientemente, el soporte sólido
puede ser de vidrio, sílice, látex, metal (e.g., oro) o un material
polimérico (e.g., polietileno). Preferiblemente, el soporte sólido
es confeccionado en un material polimérico, como el polietileno.
La unión o inmovilización del anticuerpo
anti-calprotectina -o fragmento de anticuerpo- puede
ser conseguida utilizando cualquier técnica convencional. Por
ejemplo, la avidina (disponible en Pierce Chemical Company) puede
ser inmovilizada sobre nanopartículas de poliestireno activadas con
clorometilo (disponibles en Interfacial Dynamic Corporation, US)
por medio de agitación en tampón (e.g., a temperatura ambiente
durante 24 horas) y, a continuación, utilizada junto con
anticuerpos anti-calprotectina marcados con biotina
(preparados conforme a técnicas convencionales en este campo). De
esta forma, por ejemplo, plasma tomado del sujeto a ser sometido a
prueba para determinar el potencial de desarrollo de CVD -o
propensión a la misma- es añadido a una solución de nanopartículas
revestidas de avidina en una cubeta de cuarzo de un
espectrofotómetro, seguido de la adición de anticuerpo
anti-calprotectina marcado con biotina. A
continuación son tomadas lecturas turbidimétricas.
Alternativamente, los anticuerpos marcados con
biotina pueden ser añadidos con anterioridad a la adición del
plasma o del suero. En otras palabras, aunque usualmente son
utilizados los mismos reactivos sin tener en cuenta el instrumento
usado para la detección de la turbidez, puede variar la secuencia
precisa en que son añadidos los distintos reactivos. Por lo
general, la secuencia usada debería ser acorde con las instrucciones
que acompañan al espectrofotómetro utilizado (e.g., un
espectrofotómetro Shimadzu UV-160).
Son realizadas lecturas turbidimétricas (i.e.,
es medida la absorción lumínica a una longitud de onda adecuada a
intervalos regulares) y es determinada la absorción lumínica en
relación con una referencia. Opcionalmente, pueden ser utilizados
instrumentos de múltiples longitudes de onda para realizar las
lecturas turbidimétricas y pueden proporcionar resultados más
precisos. Instrumentos adecuados para tomar las lecturas
turbidimétricas incluyen el Cobas Mira, el Roche Integra y el
Turbiquant de Merck.
En un sistema experimental alternativo, el
anticuerpo anti-calprotectina -o fragmento de
anticuerpo- puede ser inmovilizado directamente sobre
nanopartículas activadas con clorometilo (disponibles en Interfacial
Dynamic Corporation, US). Por ejemplo, el anticuerpo
anti-calprotectina (e.g., el anticuerpo policlonal
de huevo disponible en Norwegian Antibodies AS) puede ser mezclado
con las partículas activadas antes mencionadas en un tampón (10 mM
de borato, 15 mM de cloruro sódico, pH 9.0) y agitado (e.g., a
temperatura ambiente durante 24 horas) para facilitar
nanopartículas revestidas de anticuerpo
anti-calprotectina. Tales nanopartículas pueden ser
utilizadas para determinación turbidimétrica de la concentración de
calprotectina al añadirlas a una muestra de plasma o suero, tomado
del sujeto a ser sometido a prueba para determinar el potencial de
desarrollo de CVD -o propensión a la misma-, en un tampón y tomando
lecturas turbidimétricas en modo cinético.
Alternativamente, el plasma o suero puede ser
añadido a las nanopartículas revestidas de anticuerpo
anti-calprotectina. En otras palabras, aunque son
utilizados usualmente los mismos reactivos sin tener en cuenta el
instrumento usado para la detección de la turbidez, puede variar la
secuencia precisa en la que son añadidos los distintos reactivos.
Por lo general, la secuencia utilizada debería ser acorde con las
instrucciones que acompañan al espectrofotómetro utilizado (e.g.,
un espectrofotómetro Shimadzu UV-160).
Ejemplos de robots automatizados que son
adecuados para tomar lecturas turbidimétricas de acuerdo con el
método de ensayo de la invención incluyen el Cobas Mira y el
Hitachi 711, ambos disponibles en Roche Diagnostics.
Las partículas a las cuales puede ser unido el
anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- son usualmente esféricas. El
tamaño de las partículas utilizadas en el ensayo puede afectar la
precisión con la que es medida la concentración de calprotectina.
Aunque las partículas más grandes permiten que sean detectadas
concentraciones menores de calprotectina, su área de superficie
reducida significa que poseen una capacidad de fijación menor. Por
ejemplo, doblando el diámetro de la partícula se reduce a la mitad
la capacidad de fijación de una unidad de masa de partículas.
Adicionalmente, el aumento del diámetro de
partícula aumenta el nivel de absorbancia luminosa de fondo y
suspensión luminosa en las longitudes de onda utilizadas usualmente
en tales ensayos (e.g., 330 a 600 nm). De esta manera, aunque las
partículas mayores incrementan la sensibilidad del ensayo, esto
puede verse acompañado por algo de pérdida en la precisión y, en
particular, por un incremento en el número de resultados falsos
negativos obtenidos. Esto es particularmente probable en el caso de
muestras que contengan concentraciones relativamente altas de
calprotectina (i.e., aquellas muestras obtenidas de individuos con
un alto potencial de desarrollo de CVD, o de propensión a la
misma), en donde los sitios de fijación a nanopartículas pueden
verse saturados sin que se encuentre unida toda la
calprotectina.
Estos efectos neutralizantes asociados al cambio
de tamaño de partícula (e.g., el aumento del tamaño de partícula
incrementa la sensibilidad pero disminuye la precisión) representan
un problema significativo a ser solventado con el desarrollo de un
ensayo sensible a la hora de detectar el rango de niveles de
calprotectina presentes en los fluidos corporales.
Es preferible también en relación con el método
de ensayo de la invención que las partículas utilizadas permitan
que sea determinado con precisión un rango más amplio de
concentraciones de calprotectina. Esto puede significar que puede
ser atribuido un nivel mayor de confianza tanto a un resultado
negativo (i.e., una concentración que caiga por debajo del valor
umbral) como a un resultado positivo. Es particularmente preferido
en el método de ensayo de la invención que puedan ser medidas
muestras que presenten una concentración de calprotectina en el
rango de 0,5-50 mg/L (e.g., 1-40
mg/L).
Las partículas a las cuales puede ser fijado el
anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- son usualmente esféricas,
con un diámetro de 1-150 nm, por ejemplo,
10-90 nm o 15-60 nm, por ejemplo, 44
nm. En un método de ensayo de la invención particularmente
preferido, las partículas a las cuales son fijados el anticuerpo, o
fragmentos de anticuerpo, poseen un diámetro de
55-140 nm, más preferiblemente de
65-110 nm, por ejemplo, de 70-90
nm.
Alternativamente, el diámetro de las partículas
puede ser medido una vez que los anticuerpos -o fragmentos de
anticuerpos- se encuentren fijados a sus superficies. En este caso,
el diámetro de las partículas revestidas del anticuerpo -o
fragmento de anticuerpo- es preferiblemente de
65-140 nm, más preferiblemente de
75-120 nm, aún más preferiblemente de
80-100 nm. Las partículas revestidas de estos
tamaños son especialmente preferidas cuando la muestra sometida a
prueba es el plasma.
Las partículas, en ambos estados "desnudo"
y revestido, presentan preferiblemente un diámetro que, por sí
mismo, no permite la absorción de la longitud de onda de la luz
utilizada para la determinación espectrofotométrica. De esta forma,
la suspensión de nanopartículas revestidas es casi (e.g.,
sustancialmente) transparente hasta que tiene lugar la formación de
agregados inducida por la calprotectina, lo que da como resultado la
formación de agregados que presentan un diámetro mayor. Tales
agregados poseen la habilidad de absorber la longitud de onda de la
luz utilizada por el espectrofotómetro.
Además, las partículas son preferiblemente todas
ellas sustancialmente del mismo tamaño, más específicamente, todas
tienen el mismo diámetro. Preferiblemente, son utilizadas partículas
poliméricas o de metal monodispersas (e.g., oro). Las partículas
poliméricas monodispersas se encuentran disponibles en Dynal Biotech
AS, Oslo,
Noruega.
Noruega.
Aunque sin desear verse constreñido por la
teoría, puede resultar que la utilización de un anticuerpo
inmovilizado -o fragmentos de anticuerpo- aumente la sensibilidad
del ensayo al aumentar el tamaño de cualquiera de los sitios
generadores de opacidad derivada de la calprotectina y, por lo
tanto, la cantidad de luz diseminada desde los mismos. Utilizando
un soporte sólido o matriz (e.g., nanopartículas) que sean
sustancialmente todos ellos del mismo tamaño, puede ser que se vea
incrementada aún más la sensibilidad del ensayo turbidimétrico.
Conforme es rutinario en los ensayos
turbidimétricos, es añadido también preferiblemente al eluído un
mejorador polimérico de opacidad, como el polietileno glicol.
Antes de ser realizada la determinación
turbidimétrica, la fracción, anticuerpo o fragmento de anticuerpo,
preferiblemente unido a una nanopartícula, y opcionalmente un
mejorador, puede ser incubado durante un corto período de tiempo,
e.g., de 5 minutos a una hora, preferiblemente alrededor de 10
minutos, a temperatura ambiente. Opcionalmente, cuando se determina
la concentración de calprotectina utilizando la técnica
turbidimétrica, puede ser utilizado un modo de lectura
cinético.
La luz utilizada en la determinación de la
opacificación debe presentar una longitud de onda adecuada, por
ejemplo, 300-600 nm. En este sentido, se ha
descubierto que la utilización de un filtro de
300-450 nm, preferiblemente un filtro de 340 nm o
de 405 nm, facilitó resultados particularmente buenos. La
utilización de un filtro de 560 nm puede facilitar también
resultados especialmente buenos.
Por lo general, junto con la muestra bajo
evaluación, serán evaluadas también en la realización del método de
ensayo muestras de calibración con contenidos conocidos de
calprotectina. Tales determinaciones pueden ser utilizadas para
confeccionar una curva de calibración, a partir de la cual puede ser
determinado el contenido de calprotectina de la muestra bajo
evaluación. Serán utilizadas, preferiblemente, muestras de
calibración con contenidos de calprotectina de hasta 5.000 mg/L
(e.g., 1.500, 1.000, 750, 250, 100) o de hasta 100 mg/L (e.g., 75,
50, 25, 5, 1,0 y 0,5 mg/L). Más preferiblemente, las muestras de
calibración poseen un contenido de calprotectina de hasta 10 mg/L
(e.g., 10, 8, 6, 4, 2 mg/L), aún más preferiblemente de hasta 5 mg/L
(5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 mg/L).
El ensayo turbidimétrico anteriormente descrito
para la determinación de calprotectina es sorprendentemente fiable,
rápido, barato, fácil y susceptible de automatización. Esto es a
diferencia de los métodos de ensayo disponibles actualmente, los
cuales son relativamente complejos y no son aplicables directamente
a las máquinas de diagnóstico multifunción automatizadas, usadas
comúnmente por los laboratorios diagnósticos.
La automatización es particularmente deseable en
los casos donde se dan numerosas fases de mezcla, adición y/o
dilución, ya que éstas pueden ser conseguidas con un grado mayor de
exactitud. Los robots pueden ofrecer también un nivel mayor de
fiabilidad y/o reproducibilidad. La automatización incrementa
también el rendimien-
to.
to.
Los métodos de ensayo actualmente disponibles,
los cuales pueden ofrecer niveles razonables de precisión (e.g.,
ELISA), sin embargo son difíciles de automatizar. Esto es debido en
parte, al menos, a que usualmente comprenden numerosas fases de
lavado y separación (e.g., unión a una superficie sólida) y a que la
automatización de los procesos no homogéneos es a menudo
problemática. También, estos procesos usualmente implican un número
relativamente alto de fases, lo que incrementa la complejidad de
cualquier protocolo de automatización. Otras técnicas
convencionales para la determinación de la calprotectina (e.g.,
nefelometría) ofrecen una alta precisión, pero precisan de un
equipo especial para llevar a cabo las mediciones necesarias. El
equipo especializado no es usualmente fácil de incorporar a un
protocolo de automatización.
La invención será descrita ahora en detalle, en
relación con los siguientes Ejemplos no limitadores y las figuras
que los acompañan, en los cuales:
La Figura 1 es la curva de distribución para la
calprotectina en los 200 sujetos sometidos a prueba. El resumen de
las estadísticas para la Figura 1 son:
A^{2}: | 8,160 |
Valor P: | 0,000 |
Media | 0,403 |
Desviación estándar | 0,238 |
Varianza | 0,057 |
Asimetría | 1,679 |
Curtosis | 3,302 |
N | 199 |
Mínimo | 0,070 |
1er cuartil | 0,240 |
Mediana | 0,340 |
3er cuartil | 0,500 |
Máximo | 1,370 |
Límite de confianza al 95% para Mu | 0,370 |
0,436 | |
Límite de confianza al 95% para Sigma | 0,217 |
0,264 | |
Límite de confianza al 95% para Mediana | 0,310 |
0,370 |
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 2 es la curva de distribución para la
puntuación en la escala de calcio en los 200 sujetos sometidos a
prueba. El resumen de las estadísticas para la Figura 2 son:
A^{2}: | 25,037 |
Valor P: | 0,000 |
Media | 217,060 |
Desviación estándar | 399,000 |
Varianza | 159201 |
Asimetría | 3,462 |
Curtosis | 15,341 |
N | 200 |
Mínimo | 0,00 |
1er cuartil | 0,00 |
Mediana | 78,00 |
3er cuartil | 259,25 |
Máximo | 2794,00 |
Límite de confianza al 95% para Mu | 161,42 |
272,70 | |
Límite de confianza al 95% para Sigma | 363,35 |
442,46 | |
Límite de confianza al 95% para Mediana | 0,00 |
117,33 |
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 es la curva de distribución para la
proteína C reactiva altamente sensible (hsCRP) en los 200 sujetos
sometidos a prueba. El resumen de las estadísticas para la Figura 3
son:
A^{2}: | 21,221 |
Valor P: | 0,000 |
Media | 2,331 |
Desviación estándar | 2,970 |
Varianza | 8,819 |
Asimetría | 2,243 |
Curtosis | 5,103 |
N | 197 |
Mínimo | 0,150 |
1er cuartil | 0,540 |
Mediana | 1,150 |
3er cuartil | 2,580 |
Máximo | 16,30 |
Límite de confianza al 95% para Mu | 1,913 |
2,748 | |
Límite de confianza al 95% para Sigma | 2,703 |
3,296 | |
Límite de confianza al 95% para Mediana | 0,933 |
1,375 |
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 4 es la curva de distribución para la
homocisteína en los 200 sujetos sometidos a prueba. El resumen de
las estadísticas para la Figura 4 son:
A^{2}: | 2,535 |
Valor P: | 0,000 |
Media | 8,391 |
Desviación estándar | 1,966 |
Varianza | 3,867 |
Asimetría | 0,875 |
Curtosis | 0,730 |
N | 199 |
Mínimo | 5,100 |
1er cuartil | 7,100 |
Mediana | 8,100 |
3er cuartil | 9,600 |
Máximo | 15,300 |
Límite de confianza al 95% para Mu | 8,117 |
8,666 | |
Límite de confianza al 95% para Sigma | 1,790 |
2,181 | |
Límite de confianza al 95% para Mediana | 7,620 |
8,400 |
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 5 es un gráfico de puntos para la
distribución de la calprotectina entre los resultados positivos a
calcio y los negativos a calcio; y
Las Figuras 6 y 7 son las curvas ROC para la
calprotectina y para la hsCRP para los 200 sujetos sometidos a
prueba y para los sujetos macho sometidos a prueba,
respectivamente.
La calprotectina puede ser aislada conforme a
los métodos descritos en los Ejemplos 1 y 2 de la
US-A-4.833.074 (Fagerhol).
Alternativamente, la calprotectina puede ser
purificada procedente de capas leucocitarias humanas. Es preparada
una suspensión celular en EDTA 2,5 mM por medio de la adición de
EDTA (50 mM, pH 7) a las células. A continuación, las células son
lavadas en 160 mM de cloruro de amonio/10 mM de hidrógeno carbonato
de sodio durante 3 minutos y son centrifugadas (160 xg) durante 10
minutos a 4ºC. El pellet resultante es lavado en EDTA (2,5 mM)/NaCl
(150 mM) y centrifugado (55 xg) durante 10 minutos más a 4ºC. A
continuación, el pellet es resuspendido en 0,625 mM EDTA/18,75 mM
Diemal, pH 7.4 y congelado a -70ºC durante, al menos, 24 horas.
Después de descongelarlo, el material resultante
es centrifugado (a 3700 xg) durante 30 minutos, después el
sobrenadante es retirado y filtrado (con un filtro de 0,45 \mum
disponible en Millipore), a continuación cargado en una columna de
intercambio iónico de DEAE (dietilaminoetil) Sefarosa (disponible en
Pharmacia), preparado con anterioridad utilizando un tampón de
unión (e.g., 0,63 mM EDTA/18,75 mM Diemal, pH 7.4). Cualquier
material no unido pasa a través de la columna y es eluído. Una vez
se encuentra eluído todo el material procedente de la columna no
unido, la calprotectina pura es eluída utilizando un tampón de
elución conteniendo calcio (e.g., tampón 75 mM Diemal/10 mM
CaCl_{2}). Son obtenidos alrededor de 25 mg de calprotectina por
capa leucocitaria.
Los anticuerpos
anti-calprotectina pueden ser preparados conforme al
método descrito en el Ejemplo 3 de la
US-A-4.833.074 (Fagerhol).
Pueden ser preparados alternativamente
anticuerpos policlonales de huevo de gallina. Es inyectada una
solución comprendiendo calprotectina (0,5 mg/mL) y adyuvante de
Freund en gallinas cada 14 días cuatro veces (o durante dos meses)
y, a continuación, una vez cada mes. Después de 12 semanas, los
huevos de la gallina inyectados con calprotectina pueden ser
recolectados y sus yemas retiradas (sin la película). Después de
dilución en HCl (5 mM), la yema es centrifugada y el sobrenadante
es recolectado. A continuación, el sobrenadante es filtrado y
tratado con sulfato de amonio saturado hasta conseguir una
concentración final de 3,8 M. La mezcla es centrifugada y el
precipitado producido es recolectado y disuelto en tampón (0,11 M de
acetato de sodio, 0,15 M de NaCl, pH 7.4). La solución resultante
es dializada finalmente con una membrana presentando un tamaño de
poro de 10.000 kD y, después, purificada por medio de cromatografía
de afinidad.
La columna utilizada usualmente para
cromatografía de afinidad comprende una matriz activada de sefarosa
activada con succinimida (HiTrap NHS activada, disponible en
Amersham-Pharmacia), la cual es adecuada para la
inmovilización de la calprotectina. Más específicamente, la resina
activada reacciona espontáneamente, a un pH de 7-8,
con las aminas libres en la calprotectina. Para la cromatografía,
la solución de diálisis es diluida usualmente hasta una
concentración de alrededor de 3 mg/ml en PBS con anterioridad a su
aplicación a la columna. Los anticuerpos
anti-calprotectina son eluídos seguidamente
utilizando 6 M de urea en PBS helado, o 0,1 M de solución de
citrato de sodio, pH 3.0. Preferiblemente, son utilizados 0,1 M de
solución de citrato de sodio. Después de la elución, el anticuerpo
anti-calprotectina conteniendo fracciones es diluido
inmediatamente y dializado en PBS.
600 \mum de nanopartículas activadas por
clorometilo 4,2% p/v (diámetro 44 nm) disponibles en Interfacial
Dynamic Corporation, US son dializadas contra agua con una membrana
presentando un tamaño de poro de 10.000 kD. Son añadidos y
mezclados 0,5 ml de una solución de borato (10 mM) y cloruro de
sodio (15 mM), con un pH de 9.0. Son añadidos 10 mg de avidina,
disueltos en 0,5 ml de una solución de 10 mM borato y 15 mM NaCl,
con un pH de 9 (disponible en Pierce Chemical Company) y la mezcla
es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. A continuación,
son añadidos 40 \mul de solución de glicina (2M, pH 9.0) y la
mezcla es agitada durante 4 horas más a temperatura ambiente.
A continuación, las partículas son diuidas hasta
conseguir un volumen de 100 ml y son diafiltradas, primeramente en
500 ml de una solución de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico,
con un pH de 9.0 y, después, en una solución de 25 mM de Tris, 150
mM de cloruro sódico y 0,01% Tween® 20, con un pH de 7.4 (disponible
en Sigma US) utilizando un Filtro Pellicon XL (corte 300.000) y un
Sistema TFF de báscula de laboratorio (disponible en Millipore)
conforme a las instrucciones facilitadas por los proveedores de los
instrumentos. La concentración deseada de nanopartículas revestidas
de avidina es obtenida finalmente por medio de centrifugado y
resuspensión de las partículas en una solución de 25 mM de Tris,
150 mM de cloruro sódico y 0,01% Tween® 20. Cualquiera de los
agregados que se formen durante este procedimiento de preparado
puede ser retirado por medio de centrifugado lento.
Es preparada una suspensión poseyendo una
concentración de alrededor de 0,30 mg por ml de partículas de las
anteriormente descritas nanopartículas revestidas de avidina, por
medio de centrifugado y resuspensión del preparado anteriormente
descrito en una solución de 25 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,1%
Tween® 20 y 2% PEG 6000, con un pH de 7.4 (disponible en Sigma).
Son mezclados 500 \mul de esta suspensión de partículas con una
muestra de plasma (alrededor de 20 \mul), tomada de un sujeto
sometido a prueba para determinar su propensión a desarrolllar CVD,
en una cubeta de lectura de cuarzo de un espectrofotómetro grabador
(e.g., un Shimadzu UV-160). Es grabada la absorción
a 340 nm de luz monocromática y, después de 60 segundos, son
añadidos a la cubeta de cuarzo y mezclados 75 \mug de anticuerpo
anti-calprotectina marcado con 0,15 nmol de biotina
(e.g., anticuerpo policlonal de huevo purificado por medio de
afinidad, marcado con biotina, comprado en Norwegian Antibodies AS,
Noruega), diluidos en 50 \mul de una solución de 25 mM de Tris,
150 mM de NaCl y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4. Es grabada de
inmediato la absorción a 340 nm de luz monocromática utilizando una
cubeta de referencia conteniendo una solución de 25 mM de Tris, 150
mM de NaCl y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4 y, de nuevo, a
intervalos regulares (e.g., cada 2 minutos) hasta haber transcurrido
alrededor de 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción en
cada uno de los momentos, conforme a la lectura turbidimétrica
estándar en el modo cinético o a lecturas "punto final". Es
decir, es calculado el incremento en la absorción lumínica en cada
uno de los momentos en relación con la lectura realizada con
anterioridad a la adición de las nanopartículas revestidas de
anticuerpo y/o al final de la grabación.
Es construida una curva de calibración llevando
a cabo un procedimiento idéntico, con los estándares presentando
una concentración conocida de calprotectina. La concentración de
calprotectina en la muestra puede entonces ser calculada tomando la
curva de calibración.
1 ml de 4,2% p/v de nanopartículas activadas por
clorometilo (diámetro 44 nm), disponibles en Interfacial Dynamic
Corporation, US, son dializadas contra agua con una membrana
presentando un tamaño de poro de 10.000 kD. Son añadidos a
continuación 0,5 ml de una solución de borato (10 mM) y cloruro de
sodio (15 mM), con un pH de 9.0. Son dializados 27 mg de
anticuerpos anti-calprotectina purificados (e.g.,
anticuerpos policlonales de huevo purificados por medio de
afinidad, disponibles en Norwegian Antibodies AS, Noruega) contra
una solución de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, con un
pH de 9.0.
Después de la adición de las nanopartículas a
los anticuerpos anti-calprotectina purificados, la
mezcla es agitada durante 24 horas a temperatura ambiente. A
continuación, son añadidos 40 \mul de una solución de glicina
(2M, pH 9.0) y la mezcla es agitada durante 4 horas más a
temperatura ambiente.
A continuación, las partículas son diluidas
hasta conseguir un volumen total de 100 ml y son diafiltradas
contra 1.000 ml de una solución de 10 mM de borato y 15 mM de
cloruro sódico, con un pH de 9.0, a la cual son añadidos 0,1%
Tween® 20 y 3 mg/ml de albúmina de huevo, utilizando un filtro
Pellicon XL (corte 300.000) y un Sistema TFF de báscula de
laboratorio (disponible en Millipore) conforme a las instrucciones
facilitadas por los proveedores de los instrumentos. La
concentración deseada de nanopartículas revestidas de anticuerpo
anti-calprotectina es obtenida finalmente por medio
de centrifugado y resuspensión de las partículas en una solución.
Cualquiera de los agregados que se formen durante este procedimiento
de preparado puede ser retirado por medio de centrifugado
lento.
Es preparada una suspensión comprendiendo 400
\mug de las nanopartículas revestidas de anticuerpo anteriormente
descritas en 50 \mul de una solución de 10 mM de borato, 15 mM de
NaCl, 0,1% Tween® 20, 3 g/l de albúmina de huevo, con un pH de
9.0.
Simultáneamente, 20 \mul de plasma procedente
del sujeto sometido a prueba para determinar su potencial de
desarrollo de CVD, en 500 \mul de tampón de ensayo (25 mM de TRIS,
150 mM de NaCl, 0,1% Tween® 20 y 2% PEG 6000, con un pH de 7.4
(disponible en Sigma)) son colocados en una cubeta de lectura de
cuarzo de un espectrofotómetro grabador (e.g., Shimadzu
UV-160), y es medida la absorción lumínica a 340 nm
de luz monocromática. Después de 60 segundos, es añadida y mezclada
en la cubeta la anteriormente mencionada suspensión comprendiendo
400 \mug de nanopartículas revestidas de anticuerpo. Es grabada
la absorción lumínica inmediatamente después de la adición de las
nanopartículas revestidas de anticuerpo, y de nuevo a intervalos
regulares (e.g., cada 2 minutos) hasta haber transcurrido alrededor
de 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción lumínica en
cada uno de los momentos, en relación con la lectura realizada con
anterioridad a la adición de las nanopartículas revestidas de
anticuerpo y/o al final de la grabación. En otras palabras, son
realizadas lecturas turbidimétricas en modo cinético o lecturas
"punto final".
Es construida también una curva de calibración
llevando a cabo un procedimiento idéntico, con los estándares
presentando una concentración conocida de calprotectina. La
concentración de calprotectina en la muestra puede entonces ser
calculada tomando la curva.
600 \mum de 4,2% p/v de nanopartículas
activadas por clorometilo (diámetro 67 nm), disponibles en
Interfacial Dynamic Corporation, US, son dializadas contra agua con
una membrana presentando un tamaño de poro de 10.000 kD. 0,5 ml de
una solución tamponadora de fosfato (10 mM) y cloruro de sodio (150
mM), con un pH de 7.4, son añadidos a 10 mg de streptavidina,
disueltos en 0,5 ml de una solución tamponadora de 10 mM de fosfato
y 150 mM de NaCl, con un pH de 7.4 (disponible en Pierce Chemical
Company) y la mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 24
horas. A continuación, son añadidos 40 \mul de solución de glicina
(2M, pH 9.0) y la mezcla es agitada durante 4 horas más a
temperatura ambiente.
A continuación, las partículas son diluidas
hasta conseguir un volumen de 100 ml y son diafiltradas,
primeramente en 500 ml de una solución de 10 mM de borato y 15 mM
de cloruro sódico, con un pH de 9.0 y, a continuación, en una
solución de 25 mM de Tris, 150 mM de cloruro sódico y 0,01% Tween®
20, con un pH de 7.4 (disponible en Sigma US), utilizando un Filtro
Pellicon XL (corte 300.000) y un Sistema TFF de báscula de
laboratorio (disponible en Millipore) conforme a las instrucciones
facilitadas por los proveedores de los instrumentos. La
concentración deseada de nanopartículas revestidas de streptavidina
es obtenida finalmente por medio de centrifugado y resuspensión de
las partículas en una solución de 25 mM de TRIS, 150 mM de cloruro
sódico y 0,01% Tween® 20. Cualquiera de los agregados que se formen
durante este procedimiento de preparado puede ser retirado por
medio de centrifugado lento.
Fue medido el tamaño medio de partícula de las
nanopartículas revestidas de streptavidina, siendo de 82 nm, por
medio de Sinteff AS, Noruega.
Es preparada una suspensión presentando una
concentración de alrededor de 0,60 mg por ml de partículas de las
anteriormente descritas nanopartículas revestidas de streptavidina
por medio de centrifugado y resuspensión del preparado
anteriormente descrito en una solución de 25 mM de TRIS, 150 mM de
NaCl, 0,1% Tween® 20 y 1% PEG 6000, con un pH de 7.4 (disponible en
Sigma). 500 \mul de esta suspensión de partículas son mezclados
con una muestra de plasma (alrededor de 5 \mul), tomada de un
sujeto sometido a prueba para determinar su propensión a
desarrollar CVD, en una cubeta de lectura de cuarzo de un
espectrofotómetro grabador (e.g., un Shimadzu
UV-160). Es grabada la absorción a 560 nm de luz
monocromática y, después de 60 segundos, 75 \mug de anticuerpo
anti-calprotectina marcado con 0,15 nmol de biotina
(e.g., anticuerpo policlonal de huevo purificado por medio de
afinidad, marcado con biotina, adquirido en Norwegian Antibodies AS,
Noruega), diluidos en 50 \mul de una solución de 25 mM de TRIS,
150 mM de NaCl y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4, son añadidos a
la cubeta de cuarzo y mezclados. La absorción a 340 nm de luz
monocromática es grabada inmediatamente, utilizando una cubeta de
referencia conteniendo una solución de 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl
y 0,1% Tween® 20, con un pH de 7.4 y, de nuevo, a intervalos
regulares (e.g., cada 2 minutos) hasta haber transcurrido alrededor
de 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción en cada uno
de los momentos, conforme a la lectura turbidimétrica estándar en
modo cinético o a lecturas "punto final". Es decir, es
calculado el incremento en la absorción lumínica en cada uno de los
momentos, en relación con la lectura realizada con anterioridad a la
adición de las nanopartículas revestidas de anticuerpo y/o al final
de la grabación.
Es construida una curva de calibración llevando
a cabo un procedimiento idéntico, con los estándares presentando
una concentración conocida de calprotectina. La concentración de
calprotectina en la muestra puede entonces ser calculada tomando la
curva de calibración.
1 ml de 4,2% p/v de nanopartículas activadas por
clorometilo (diámetro medio 67 nm), disponibles en Interfacial
Dynamic Corporation, US, son dializadas contra agua con una membrana
presentando un tamaño de poro de 10.000 kD y, a continuación, son
diluidas hasta los 10 ml con agua. Son dializados 27 mg de
anticuerpos policlonales de huevo purificados (e.g., anticuerpos
policlonales de huevo purificados por medio de afinidad, disponibles
en Norwegian Antibodies AS, Noruega) contra una solución
tamponadora de 10 mM de borato y 15 mM de cloruro sódico, y
finalmente diluidos hasta los 6 ml en la misma solución de 10 mM de
borato y 15 mM de cloruro sódico, con un pH de 9.0.
Bajo agitado, las partículas son mezcladas con
los anticuerpos, y se continúa con el agitado a temperatura
ambiente durante 24 horas. Después, son añadidos 40 \mul de una
solución de glicina (2M, con un pH de 9.0) y la mezcla es agitada
durante 4 horas más a temperatura ambiente.
A continuación, las partículas son diluidas
hasta conseguir un volumen total de 100 ml en tampón de 10 mM de
borato, 15 mM de cloruro sódico, al cual son añadidos 0,1% Tween® 20
y 3 mg/ml de albúmina de huevo, siendo todo ello diafiltrado contra
1.000 ml de dicho tampón de borato/cloruro sódico -al cual le es
añadido 0,1% Tween® 20 y 3 mg/ml de albúmina de huevo-, utilizando
un filtro Pellicon XL (corte 300.000 D) y un sistema TFF de báscula
de laboratorio (disponible en Millipore), conforme a las
instrucciones facilitadas por los proveedores de los instrumentos
y, para finalizar, las partículas son concentradas hasta conseguir
un volumen de 40 a 100 ml.
Se midió que el diámetro medio de las partículas
obtenidas fue de 81 nm, por medio de Sinteff AS, Noruega.
Es preparada una suspensión de 0,7 mg/ml de las
partículas revestidas de anticuerpo
anti-calprotectina anteriormente descritas, en 0,25
mM de TRIS, 0,15 M de NaCl y 0,1% Tween, con un pH de 8.0.
Son disueltos 5 \mul de muestra de plasma,
procedente del sujeto sometido a prueba para determinar su potencial
de desarrollo de CVD, en tampón de ensayo (460 \mul, 25 mM de
Tris, 150 mM de NaCl, 0,1% Tween, 1,0% polietileno glicol 6000, pH=
7.4) en una cubeta de lectura de cuarzo de un espectrofotómetro
grabador (e.g., Shimadzu UV-160) y es medida la
absorción lumínica a 560 nm de luz monocromática. Después de 60
segundos, son añadidos 100 \mul de la suspensión anteriormente
mencionada, comprendiendo 0,7 mg/ml de las nanopartículas
revestidas de anticuerpo, y son mezclados en la cubeta. Es grabada
la absorción lumínica antes e inmediatamente después de la adición
de las nanopartículas revestidas de anticuerpo, y de nuevo a
intervalos regulares (e.g., cada 20 segundos) hasta haber
transcurrido 15 minutos. Es calculado el incremento de absorción
lumínica en cada uno de los momentos, en relación con la lectura
realizada con anterioridad a la adición de las nanopartículas
revestidas de anticuerpo y al final de la grabación. En otras
palabras, son realizadas lecturas turbidimétricas en modo cinético
y/o lecturas "punto final".
Es construida también una curva de calibración
llevando a cabo un procedimiento idéntico, con los estándares
presentando una concentración conocida de calprotectina. La
concentración de calprotectina en la muestra puede entonces ser
calculada tomando la curva.
La calcificación coronaria ha demostrado estar
fuertemente asociada al desarrollo de CVD y se ha demostrado
también que es un método útil de predicción de potencial a sufrir
CVD (e.g., infarto coronario o accidente cerebro vascular).
El grado de calcificación coronaria es medido
cuantitativamente utilizando tomografía computarizada por haz de
electrones -TCHE- (EBCT) y es representado por la puntuación en una
escala de calcio (CS). Una puntuación alta en calcio representa un
alto nivel de calcificación y un alto riesgo de desarrollar CVD.
En el siguiente estudio fue sometida a prueba la
CS de 200 sujetos (100 controles poseyendo una CS <100 y 100
casos presentando una CS >100) de 45 años de edad, o de edad
superior, así como sus niveles en plasma o suero de calprotectina,
CRP y homocisteína. Los sujetos eran individuos referidos por sí
mismos, o por un médico, como asintomáticos, y se habían realizado
una prueba TCHE durante los 2 años anteriores (usualmente dentro de
los 6 meses previos) para determinar sus concentraciones en plasma o
suero de calprotectina, CRP y homocisteína.
Fue medida la calprotectina por medio del test
Calprest® (distribuido por Eurospital®, Italia) y los datos fueron
resumidos para el paciente y el grupo de control utilizando
desviación estándar, mediana, mínimo y máximo. Fueron calculados
intervalos de confianza del 95% para la mediana. Fue utilizado el
cálculo de Anderson-Darling como un test de
normalidad.
La calprotectina fue resumida también por
género, utilizando el mismo resumen de estadísticas.
La puntuación en la escala de calcio fue
determinada por escaneo de Tomografía Computarizada por Haz de
Electrones -TCHE-(EBCT). Fueron resumidos los datos para los grupos
caso y control.
La hsCRP fue determinada por medio del ensayo
"N High Sensitivity CRP" de Dade Behring (Roberts et
al., Clinical Chemistry, 2000, 46:4, pags.
461-468). Fueron resumidos los datos para el
paciente y para los grupos de control utilizando media, desviación
estándar, mediana, mínimo y máximo.
Fue determinada la homocisteína plasmática (Hcy)
por medio del método Abbott IMx (Shipchandler, M.T. y Moore E.G.,
Clinical Chemistry, 1995, 41:7, pags. 991-994).
Fueron resumidos los datos para el paciente y para los grupos de
control utilizando desviación estándar, mediana, mínimo y
máximo.
Fue utilizado el test del
chi-cuadrado para testar la covarianza entre pares
de marcadores.
El odds ratio utilizado con la tabulación
cruzada 2 x 2 (i.e., la tabla de chi-cuadrado) es el
cociente de los odds de dos test covariantes y de los odds de dos
test en desacuerdo. Por lo tanto, el odds ratio puede ser
interpretado como una medida de la magnitud de asociación entre los
dos test.
Fue calculado el odds ratio para la CS contra la
calprotectina, la hsCRP y la Hcy, respectivamente.
Este es un test no paramétrico (no es necesario
que los datos se encuentren distribuidos normalmente) que fue
utilizado para testar si los valores de la mediana de dos marcadores
son significativamente distintos. El paquete Minitab pone por orden
toda la información de ambos juegos de datos, asignando desde un 1
al más bajo hasta 200 para el valor máximo. A continuación, el
paquete de software suma el rango de puntuación para comparar los
dos grupos y reporta el valor "P", el cual indica la
posibilidad de que el muestreo aleatorio dé como resultado medianas
tan separadas entre sí como las observadas en el experimento.
Fueron comparados los valores de la mediana de
la calprotectina, la hsCRP y la Hcy con los de la CS, por separado
los grupo caso y control, y fue utilizado el test
Mann-Whitney para determinar la significancia.
La habilidad de un test para discriminar los
casos de enfermos de los casos normales puede ser evaluada
utilizando el análisis de curva de Características Operativas del
Receptor (ROC). Fue utilizado análisis de curva ROC tanto para la
calprotectina como para la hsCRP, y como una comparación de los dos
marcadores.
Las curvas ROC fueron confeccionadas utilizando
11 límites de corte para el cálculo de la sensibilidad (eje y) y la
especificidad 1 (eje x). Los datos procedentes de los grupos control
y caso fueron agrupados y fueron clasificados desde el valor más
bajo al más alto. Fue realizado un análisis sobre la población total
y sobre la población masculina. Las áreas comprendidas bajo las
curvas ROC fueron calculadas utilizando la regla trapezoidal.
La Figura 1 muestra la curva de distribución
para los 200 sujetos sometidos a prueba.
La Tabla 1 más abajo muestra el resumen de las
estadísticas para la calprotectina en los grupos control y caso. La
concentración de calprotectina en la mediana en el grupo control es
de 0,31 mg/L, comparados con los 0,38 mg/L en el grupo caso. La
concentración de calprotectina en la mediana es de 0,31 mg/L para
los hombres y de 0,30 mg/L para las mujeres en el grupo control. En
el grupo caso, la concentración de calprotectina en la mediana para
los hombres es de 0,39 mg/L, comparados con los 0,31 mg/L para las
mujeres.
La Figura 2 muestra la curva de distribución
para los 200 sujetos sometidos a prueba.
La Tabla 2 más abajo muestra el resumen de las
estadísticas para la puntuación en la escala de calcio a través de
TCHE (EBCT), en los grupos control y caso. La puntuación de la
mediana en la escala de calcio en el grupo control es de 0,
comparada con 259 en el grupo caso. La puntuación de la mediana en
la escala de calcio es de 0 tanto para mujeres como para hombres en
el grupo control, y de 315 y 256, respectivamente, en el grupo
caso.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 muestra la curva de distribución
para los 200 sujetos sometidos a prueba.
La Tabla 3 más abajo muestra el resumen de las
estadísticas para la hsCRP en los grupos control y caso. La hsCRP
de la mediana tanto en el grupo control como en el grupo caso es de
1,2 mg/L. La hsCRP de la mediana es de 1,6 mg/L para mujeres y de
0,7 mg/L para hombres en el grupo control, y de 1,3 mg/L y 1,1 mg/L,
respectivamente, en el grupo caso.
La Figura 4 muestra la curva de distribución
para los 200 sujetos sometidos a prueba.
La Tabla 4 más abajo muestra el resumen de las
estadísticas para la Hcy en los grupos control y caso. La
concentración en la mediana de Hcy en el grupo control es de 7,5
\mumol/L, comparados con los 8,5 \mumol/L en el grupo caso. La
concentración en la mediana de Hcy es de 7,15 \mumol/L para
mujeres y de 8,55 \mumol/L para hombres en el grupo control, y de
7,35 \mumol/L y 8,55 \mumol/L, respectivamente, en el grupo
caso.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando el programa Minitab, fueron
preparadas tablas del chi-cuadrado (ver tabla 5 más
abajo). Este test compara las distribuciones esperadas entre los
grupos de datos (asumiendo una distribución aleatoria) y los
observados. El valor de significancia es una medida del grado en el
que los datos no se encuentran distribuidos aleatoriamente. Por
ejemplo, considerando los datos positivos en calprotectina, sería de
esperar que existiera una partición igual entre los positivos y
negativos en calcio (i.e., 30,5 esperado en ambas columnas). Sin
embargo, la distribución observada es de 22 negativos y 39
positivos, indicando una tendencia para los positivos en
calprotectina de covariar con los positivos en calcio.
El programa Minitab proporciona una medida
general de la significancia de estas diferencias (tanto acuerdo
como desacuerdo) y, en este caso, P es 0,009. De esta manera, existe
una covariación significativa del calcio respecto a la
calprotectina.
Fue realizada una comparación análoga entre la
calprotectina y la hsCRP (ver Tabla 6 más abajo).
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden ser calculados los odds ratios tomando
las tablas 5 y 6, y pueden dar una medida de cuánto se desvían los
valores observados de los esperados. Si las figuras en acuerdo
esperadas son multiplicadas entre sí y el resultado es dividido por
el producto de las figuras en desacuerdo esperadas, debería ser
obtenido un valor de 1.
Tomando los datos de la Tabla 6, por ejemplo, el
odds ratio de los valores esperados es 1: (88,96 x 21,96) / (50,04 x
39,04) = 1953,64/1953,6 = 1
El odds ratio observado en esta tabla es:
(100 x 33) / (39 x 28) = 3300 / 1092 = 3,02
Cuanto más alejado se encuentre el odds ratio de
1, más pronunciada es la covariación; un odds ratio de 3 es
significativo.
Son mostrados en la Tabla 7 los resultados de un
análisis odds ratio llevado a cabo con los datos de covarianza
obtenidos en el estudio.
Un odds ratio alto indica un alto grado de
covarianza entre los test. Puede apreciarse en la Tabla 7 que el
test para la calprotectina proporciona el odds ratio más alto en
relación con la escala de calcio y, por lo tanto, puede deducirse
que, entre la calprotectina, la CRP y la homocisteína, la
calprotectina presenta el grado mayor de covarianza en relación con
la escala de calcio.
Adicionalmente, la calprotectina proporciona un
alto odds ratio en relación con la CRP, otro marcador de la CVD.
Un test del chi-cuadrado sobre
los datos anteriores, utilizando los mismos cortes que el test de
odds ratio, mostró un acuerdo significativo (P 0,009) entre los
resultados de la escala de calcio y de la calprotectina. Por el
contrario, ni el test para la CRP ni el test para la homocisteína
mostraron covarianza significativa alguna con la escala de
calcio.
Un acuerdo significativo (P 0,000) fue
encontrado también entre la calprotectina y la CRP.
La Figura 5 muestra el dot-plot
(diagrama de puntos) para la distribución de la calprotectina entre
los resultados positivos en calcio y los negativos en calcio.
Los valores de la mediana para los dos grupos
son 0,310 mg/L para los negativos en calcio y 0,375 mg/L para los
positivos en calcio. El Mann-Whitney indica que la
suma de los rangos para los negativos en calcio es de 912, y 1108
para los positivos en calcio, y proporciona un valor P de
0,0113.
Fue llevado a cabo también un análisis
Mann-Whitney sobre los datos anteriores, con el fin
de testar incrementos significativos en las medianas de las
concentraciones de calprotectina, CRP y homocisteína en los grupos
de puntuación de escala de calcio altos (CS >100) y bajos
(<100). Los resultados mostraron que los valores de la mediana
para la concentración de calprotectina y de homocisteína se
encontraban significativamente altos en el grupo con calcio alto
(P= 0,0112 y 0,0037, respectivamente), mientras que la CRP no mostró
ninguna diferencia significativa en ninguno de los grupos (ver
Tabla 8 más abajo).
Las Figuras 6 y 7 muestran las curvas ROC para
la calprotectina y la hsCRP para todos los sujetos y para la
población masculina. La Tabla 9 más abajo muestra el área bajo las
curvas ROC.
\vskip1.000000\baselineskip
Fue evaluada también la exactitud de cada uno de
los test de calprotectina, CRP y homocisteína (Hcy) y de los
niveles de corte (Hcy co 12 \mumol) en la Tabla 7, como un test
para determinar el potencial de desarrollo de CVD, asumiendo que
una puntuación en la escala de calcio superior a 100 es reflejo de
un alto riesgo de desarrollo de CVD.
Los resultados del análisis son mostrados en la
Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Porcentaje de acuerdo contra calcio para
calprotectina = 58,5% (42+75/200)
Porcentaje de acuerdo contra calcio para CRP =
50% (25+75/200)
Porcentaje de acuerdo contra calcio para la
homocisteína = 50,5% (24+77/200).
Claims (14)
1. Un método de ensayo para la detección de
potencial de desarrollo de enfermedad cardiovascular (CVD), o
propensión a CVD, en un sujeto animal humano o no humano,
comprendiendo dicho método la evaluación de la concentración de
calprotectina en una muestra conteniendo calprotectina, tomada de
dicho sujeto.
2. Un método, conforme es reivindicado en la
reivindicación 1, en donde dicha muestra es un fluido corporal
seleccionado de entre sangre, suero, plasma, orina, fluido
cerebroespinal, fluido oral, fluido sinovial o fluido empiema.
3. Un método, conforme es reivindicado en la
reivindicación 1 o en la reivindicación 2, en donde dicha muestra
es sangre.
4. Un método, conforme es reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde dicha
muestra es suero o plasma.
5. Un método, conforme es reivindicado en la
reivindicación 3 o en la reivindicación 4, en donde una
concentración umbral de calprotectina por encima de la cual dicho
ensayo es indicativo de potencial de desarrollo de CVD, o
propensión a CVD, es de 0,45 mg/L.
6. Un método, conforme es reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, comprendiendo
adicionalmente la evaluación de la concentración de un segundo
marcador de CVD en dicha muestra.
7. Un método, conforme es reivindicado en la
reivindicación 6, en donde dicho segundo marcador es la proteína C
reactiva.
8. Un método, conforme es reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 7, en donde dicha
CVD es el infarto de miocardio agudo.
9. Un método, conforme es reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 8, en donde dicha
concentración de calprotectina es evaluada por medio de
turbidimetría.
10. Un método, conforme es reivindicado en la
reivindicación 9, para la determinación de calprotectina en un
fluido corporal conteniendo calprotectina, en donde dicho método
comprende las fases de:
- (a)
- puesta en contacto de dicha muestra de dicho fluido corporal con un anticuerpo -o fragmento de anticuerpo- anti-calprotectina unido a nanopartícula, con el fin de unir dicha calprotectina; y
- (b)
- evaluación del contenido de calprotectina por medio de turbidimetría,
en donde el diámetro de las
partículas revestidas de anticuerpo -o de fragmento de anticuerpo-
es de 65-140
nm.
11. Un método, conforme es reivindicado en la
reivindicación 10, en donde el diámetro de las nanopartículas
revestidas de anticuerpo -o de fragmento de anticuerpo- es de
75-120 nm.
12. Un método, conforme es reivindicado en la
reivindicación 10 o en la reivindicación 11, en donde dichas
nanopartículas son sustancialmente todas ellas del mismo tamaño
(e.g., monodispersas).
13. Un método, conforme es reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 12, en donde es
añadido polietileno glicol como un mejorador de opacidad entre las
fases (a) y (b).
14. Un método, conforme es reivindicado en
cualquiera de las reivindicaciones de la 10 a la 13, realizado como
un ensayo automatizado.
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