CN108196066A - 一种测定钙防卫蛋白的试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定钙防卫蛋白的试剂盒，涉及医学及生物化学技术领域，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，试剂R1包括：MES缓冲液、TWEEN 20、PEG‑8000、NaCl，溶剂为纯化水；试剂R2包括：MES缓冲液、EDC、乳胶微球、钙防卫蛋白抗体、BSA，溶剂为纯化水。本发明还公开了一种测定钙防卫蛋白的试剂盒的制备和使用方法。本发明相比现有技术的优点在于：采用本发明试剂盒测定钙防卫蛋白，操作方便、耗时短、精度高，有利于检测工作的大规模开展。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，尤其涉及一种适用于全自动生化分析的测定钙防卫蛋白的试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
钙防卫蛋白是一种来源于中性粒细胞和巨噬细胞的含钙蛋白，其表达具有组织或细胞特异性，可作为急性炎性细胞活化的标志物。该蛋白于1980年由Fagerhol等首先从中性粒细胞中分离出来，并命名为L1蛋白质；1987年，Odink等报道该蛋白是与巨噬细胞移动抑制因子相关的蛋白(MRP)；同年，Dorin等报道是与囊性纤维化有关的抗原；1988年，Wilkinsoin等根据此种抗原特征又命名为钙粒蛋白；同年，Anderson等证实L1蛋白质、囊性纤维化抗原、MRP-8/14均为同一蛋白质；Dorin和Freemont等进一步证实这种蛋白质具有S-100蛋白的结构特征，后来将此种具有保护性、多功能、与钙结合的蛋白质命名为钙防卫蛋白。
钙防卫蛋白广泛分布在人体细胞、组织以及体液中，是粒细胞、单核细胞和角质细胞的主要蛋白质。嗜中性粒细胞钙防卫蛋白分布在溶酶体外的细胞液中，约占细胞总蛋白的5％，并为中性粒细胞更新的标志物，在许多炎症情况下升高，它可以在血浆、尿液、粪便、脑脊液、唾液、滑膜液以及结肠活检中被检测。
不同部位钙防卫蛋白的含量不同。其中，健康成人血浆钙防卫蛋白的含量为0.1-0.6mg/L，病毒感染者的含量为0.1-11.4mg/L，细菌感染者为0.6-11.0mg/L。在健康成人中，男性血浆钙防卫蛋白的含量又明显高于女性，而粪便钙防卫蛋白的含量则大约是血浆钙防卫蛋白含量的6倍并且无性别差异。
因此，钙防卫蛋白的精准检测对于临床的指导意义十分巨大。
目前，国内基本无钙防卫蛋白的检测试剂盒，国外也只有电酶联免疫法。然而，采用电酶联免疫法检测钙防卫蛋白的方式基本为手工操作，且检测时间达90min以上，不利于大规模开展。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种操作方便、耗时短、精度高的测定钙防卫蛋白的试剂盒及其制备使用方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种测定钙防卫蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1的pH值为7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2的pH值为7.5。
一种测定钙防卫蛋白的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置12-18min；
c.按照试剂R2的组分含量，将钙防卫蛋白抗体溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置5-8h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1-2h，调节pH值，得试剂R2。
一种测定钙防卫蛋白的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将待测样品与试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)加入试剂R2，混合均匀；
(3)采用全自动生化分析仪测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；
(4)300s后，采用全自动生化分析仪再测定一次混合液的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值计算出样本中的钙防卫蛋白的浓度。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)和步骤(2)中，试剂R1和试剂R2按照体积比4:1混合。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)和步骤(4)中，在主波长580nm、副波长800nm处用全自动生化分析仪测定其吸光度。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中，吸光度变化值为ΔA，即ΔA＝A2-A1。
反应原理：在缓冲体系中，钙防卫蛋白抗体与乳胶微球以共价结合的方式存在，当样本中含有钙防卫蛋白时，就会被钙防卫蛋白抗体快速的结合；此时，乳胶微球因为结合变会聚集形成浊度，在特定的波长下样本中钙防卫蛋白的含量与其形成的浊度成正比，通过以下公式计算出样本中钙防卫蛋白的含量：
式中：ΔAT：以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值；
ΔAS：以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值；
CS：校准液中CALPRO的浓度。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)采用本发明试剂盒测定钙防卫蛋白，可应用于全自动生化分析仪上，适合全自动测试，操作方便，且利于大批量开展；
(2)本发明试剂盒的检测时间仅需要10min，相比现有技术的90min，大大压缩了反应时间，有利于检测工作的大规模开展；
(3)本发明试剂盒与样品反应过程中，钙防卫蛋白抗体与乳胶微球以共价结合的方式存在，当样本中含有钙防卫蛋白时，就会被钙防卫蛋白抗体快速精准的结合，此时乳胶微球便形成浊度。
附图说明
图1是实施例9中的本试剂盒对不同浓度样本的测定结果相关性表示图；
图2是实施例9中的本试剂盒与进口试剂A的检测结果对比图；
图3是实施例9中的本试剂盒检测结果的精密度测试图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种测定钙防卫蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水；
试剂R2(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水。
实施例2
本实施例的一种测定钙防卫蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水；
试剂R2(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水。
实施例3
本实施例的一种测定钙防卫蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水；
试剂R2(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水。
实施例4
本实施例的一种测定钙防卫蛋白的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水；
试剂R2(pH 7.5)：
其溶剂为纯化水。
实施例5
本实施例的一种制备上述实施例中测定钙防卫蛋白的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置12min；
c.按照试剂R2的组分含量，将钙防卫蛋白抗体溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置5h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1h，调节pH值，得试剂R2。
实施例6
本实施例的一种制备上述实施例中测定钙防卫蛋白的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置18min；
c.按照试剂R2的组分含量，将钙防卫蛋白抗体溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置8h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置2h，调节pH值，得试剂R2。
实施例7
本实施例的一种制备上述实施例中测定钙防卫蛋白的试剂盒的方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置15min；
c.按照试剂R2的组分含量，将钙防卫蛋白抗体溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置6.5h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1.5h，调节pH值，得试剂R2。
实施例8
本实施例的一种使用上述实施例中测定钙防卫蛋白的试剂盒的方法：
1、检测仪器：贝克曼AU680全自动生化分析仪。
2、待测样本：空腹采集，新鲜不溶血血清，无脂浊，2-8℃可稳定七天。
3、具体步骤：
(1)设置测定管组和空白管组，其中，测定管组：将5uL待测样品与200uL试剂R1混合，37℃孵育5min；空白管组：将5uL蒸馏水与200uL试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)各组中分别加入50uL试剂R2，混合均匀；
(3)采用全自动生化分析仪在主波长580nm、副波长800nm处测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；
(4)300s后，采用全自动生化分析仪在主波长580nm、副波长800nm处再测定一次混合液的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值ΔA＝A2-A1，再结合计算公式计算出样本中的钙防卫蛋白的浓度。
4、计算结果：
按照如下计算公式计算：
式中：ΔAT：以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值；
ΔAS：以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值；
CS：校准液中CALPRO的浓度。
5、参考值范围：0.1-0.6mg/L。
6、精密度：批内CV≤5％；批间相对极差≤10％。
7、准确度：相对偏差控制在±10％内。
8、线性范围：在0.05-8.00mg/L范围内，相关系数r≥0.990。
本实施例采用两点终点法，反应方向向上，从开始到结束仅需10min，操作方便、耗时短、精度高。
实施例9
本实施例对上述实施例中测定钙防卫蛋白的试剂盒进行具体实验数据分析。
1、参照图1，图1为根据本试剂盒对5个梯度浓度的样本的测定结果绘制出的检测结果相关性表示图，其中，X轴表示的是标准浓度，Y轴表示的是检测浓度。
结果分析：由图1可知，其相关性线性方程为y＝1.0247x-0.0625，相关系数r2＝0.9998，本试剂盒检测结果相关性良好。
2、参照图2，图2为基于贝克曼AU680全自动生化分析仪检测的本试剂盒与基于酶联免疫分析法检测的进口试剂盒A的检测结果对比图。本实验分别采用本试剂盒和进口试剂盒A对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自方法进行测定，并对测定值进行相关分析，图2中，X轴表示的是本发明试剂的测定值，Y轴表示的是进口试剂A的测定值。
结果分析：由图2可知，其相关性线性方程为：y＝0.9552x+0.0939，相关系数r2＝0.9594，本试剂盒结果准确性可靠，相关性良好，可应用于钙防卫蛋白的检测。
3、参照图3，图3为本试剂盒检测结果的精密度测试图。采用本试剂盒对同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数标准差SD和变异系数CV，其中，图3中，X轴表示的是重复次数，Y轴表示的是检测浓度。
结果分析：变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好；对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的；结合图3可知，其均值为标准差SD＝0.0667，CV＝3.16％，CV值小于5％，表明本发明方法具有优良的精密度。
4、参照表1，表1为本试剂盒检测结果的准确度统计表。本实验采用本试剂盒用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±10％范围内。
表1准确度统计表
结果分析：结合表1可知，相对偏差CB＝4.00％，处于±10％范围内，表明本发明方法具有优良的准确度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种测定钙防卫蛋白的试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
2.根据权利要求1所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
3.根据权利要求1所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
4.根据权利要求1-3任一项所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH值为7.5。
5.根据权利要求1-3任一项所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的pH值为7.5。
6.一种制备如权利要求1-5任一项所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1
a.按照试剂R1的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配置成R1缓冲液；
b.按照试剂R1的组分含量，将TWEEN 20溶于R1缓冲液中，搅拌均匀；再将PEG-8000和NaCl溶于其中，搅拌均匀并调节pH值，得试剂R1；
(2)配制试剂R2
a.按照试剂R2的组分含量，将MES溶于纯化水中，搅拌均匀后，配制成R2缓冲液；
b.按照试剂R2的组分含量，将EDC溶于R2缓冲液中，搅拌均匀；再将乳胶微球溶于R2缓冲液中，搅拌均匀后，室温放置12-18min；
c.按照试剂R2的组分含量，将钙防卫蛋白抗体溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置5-8h；
d.按照试剂R2的组分含量，将BSA溶于上述制得的溶液中，搅拌均匀后，室温放置1-2h，调节pH值，得试剂R2。
7.一种使用如权利要求1-5任一项所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待测样品与试剂R1混合，37℃孵育5min；
(2)加入试剂R2，混合均匀；
(3)采用全自动生化分析仪测定加入试剂R2后的混合液的吸光度A1；
(4)300s后，采用全自动生化分析仪再测定一次混合液的吸光度A2；
(5)根据吸光度变化值计算出样本中的钙防卫蛋白的浓度。
8.根据权利要求7所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)中，试剂R1和试剂R2按照体积比4:1混合。
9.根据权利要求7所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)和步骤(4)中，在主波长580nm、副波长800nm处用全自动生化分析仪测定其吸光度。
10.根据权利要求7所述的测定钙防卫蛋白的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(5)中，吸光度变化值为ΔA，即ΔA＝A2-A1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20180622 |