CN108469419A - 采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法。本法采用市售抗人IgG抗体溶液，代替抗人IgG血清；采用酶标仪代替紫外‑可见分光光度计，定量检测人血浆或其他含有人IgG的血浆类似物中的IgG含量。提高多个样品的检测速度；同一样品可做多个平行重复检测，提高了检测准确度；降低实验手动操作误差，降低检测成本，从而实现人血浆及其他含有人IgG的血浆类似物中IgG含量的快速、准确、高通量检测。

Description

采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法
技术领域
本发明涉及IgG含量检测技术领域，特别是涉及采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，能够快速、准确、高通量检测人血浆及其他含有人IgG的血浆类似物中IgG含量的方法。
背景技术
IgG是在人体血浆中占主导地位的免疫球蛋白，快速、准确检测人血浆及其他含有人IgG的料液中IgG含量，对于临床血浆中IgG含量诊断、血液制品IgG分离纯化过程分析和成品质量检定等相关领域都有很大的实用价值。
免疫比浊技术是在免疫沉淀反应检测法的基础上建立的。免疫球蛋白G(IgG)与相应的抗体特异性结合后，在适宜的电解质、温度、 pH条件下，产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，在特定的缓冲环境中形成浊度，其浊度在合适的抗体浓度存在时与抗原含量成正比，与相同条件下操作的校准品比较，即可求出样品中IgG的含量。
传统上都是采用紫外-可见分光光度计免疫透射比浊法检测富含 IgG料液中IgG的含量。但是这种紫外-可见分光光度计免疫透射比浊法测定IgG含量的方法存在以下问题：
1.反应体系大，抗人IgG血清使用量多。每个反应体系中需要加入抗人IgG血清1ml。按照每次检测，标准品需要5个稀释度，供试品3个稀释度，每个稀释度做2管，那么一次检测实验至少需要 16ml抗人IgG血清。如果进行10个样品以上的大批量检测，那么抗人IgG血清的使用量至少需要70ml。实验要求稀释抗体最终效价为1:4(例如，抗人IgG血清效价为1:100，那么原液2ml加抗体缓冲液48ml，获得可供实验使用的抗人IgG血清50ml)，那么做一次检测 10个样品的大批量实验，至少需要溶解2支冻干抗人IgG血清(2ml/ 支)。为保证实验结果均一性，两支血清需要均匀混合后，再进行后续处理。实验步骤繁琐，抗人IgG血清使用量多，极大的提高了检测成本。
2.检测通量低，操作复杂，对检测设备有特殊要求。传统的这种紫外-可见分光光度计，需要将反应体系溶液放入比色皿中，读取特定波长处的吸光值。一般紫外-可见分光光度计的样品槽内能同时放置3-8个比色皿，大批量检测时需要读取70个以上的吸光值，即使使用可以同时读取8个比色皿的紫外-可见分光光度计，也需要进行9个循环操作。如果重复使用比色皿，还需要进行润洗等操作，难以满足所有反应管必须在10分钟内测量完毕的要求。如果使用一次性比色皿，检测速度也不能快速提升，但是检测成本也随之增加。
3.实验重复性差。即使同一样品同一个稀释度做了2管重复，但是如果使用只能同时放置3个，或5个比色皿的紫外-可见分光光度计，则不能同时读取重复反应管的吸光值，造成样品检测重复性较差。
4.水平穿过溶液，读取吸光值，检测结果会受反应体系中抗原抗体复合物不断沉降的影响。免疫比浊技术是基于抗原抗体复合物，在特定的缓冲环境中形成浊度的原理，而采用垂直放置的比色皿读取吸光值时，抗原抗体复合物不断沉降，如果不能再短时间内快速读取反应管的吸光值，因样品放置时间过长，导致沉淀沉降，因此读取反应管的吸光值会偏低，从而影响检测准确度。
采用传统的紫外-可见分光光度计免疫透射比浊法用于测定IgG 含量存在以上缺点和不足，本发明采用抗人IgG抗体溶液，代替抗人 IgG血清；采用酶标仪代替紫外-可见分光光度计，能够快速、准确、高通量检测人血浆及其他含有人IgG的血浆类似物中IgG含量，可应用于常规生物化学分析实验室，并且能够更省时、省力、省材料。
发明内容
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法。本发明能够快速、准确、高通量检测人血浆及其他含有人IgG的料液中IgG含量。具有反应体系小、检测通量高，操作简单、实验重复性好，检测时间短，检测准确度高、垂直透射检测读取吸光值的方式不受反应体系抗原抗体复合物沉降的影响的优点。
本发明采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法的技术方案为，采用市售抗人IgG抗体溶液，代替抗人IgG血清；采用酶标仪代替紫外-可见分光光度计，定量检测人血浆或其他含有人 IgG的血浆类似物中的IgG含量。
所述的采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，包括以下步骤：
(1)试剂配制：配制缓冲液、抗人IgG抗体溶液和IgG标准品溶液；
(2)供试品溶液的制备：用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释度，其IgG含量均应在标准曲线范围内；
(3)测定法：
用酶标仪测定供试品溶液和IgG标准品溶液吸光度；
(4)结果计算：
计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值；
将标准品溶液的IgG含量的对数对其相应的吸光度的对数进行直线回归，相关系数(r值)r应≥0.99；然后将供试品溶液吸光度的对数值代入回归方程，求得值的反对数，再乘以稀释倍数，求得每1ml 供试品溶液IgG含量(g/L)，再由供试品各稀释度IgG含量求平均值，为供试品IgG含量(g/L)。
步骤(1)具体为：
缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠9g、聚乙二醇(PEG 6000)50g、牛血清(BSA)1g、叠氮钠(NaN3)1g，加水溶解，用1.0mol/L盐酸调pH至7.4，加水稀释至1000ml；
抗人IgG抗体溶液：根据抗体效价检测结果，将抗人IgG抗体溶液采用上述缓冲液进行稀释，稀释至抗体最终效价1:1(取原液1ml加抗体缓冲液99ml)，充分均匀，现配现用；
IgG标准品溶液的制备：用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每1ml 含0.2～6.0mg范围内做适当的系列稀释(通常做5个稀释度)。
步骤(2)中，供试品中间体按40倍、60倍、80倍稀释，半成品、成品按20倍、30倍、40倍稀释。
步骤(3)中酶标仪波长340nm，每孔读取中间点，连续读取吸光值，预热30分钟。
步骤(3)具体为，取供试品溶液1-2μl，加已预热至37℃的抗体液100-200ul，混匀，每个稀释度做3管，37℃水浴中保温1小时，充分混匀；
用酶标仪于340nm处分别测定吸光度；
用IgG标准品溶液2μl替代供试品溶液，同法操作；所有反应管必须在5分钟内测量完毕。
步骤(4)中，吸光度的均值OD＝(OD第一管+OD第二管+OD第三管)÷3。
本发明的有益效果为：
1.反应体系小，抗人IgG抗体溶液使用量少。每个反应体系中仅需要加入抗人IgG抗体溶液100-200ul，将入样品1-2ul混匀。一次检测实验，抗人IgG抗体溶液仅需1.6-3.2ml，相比原方法需要16ml，本法抗人IgG抗体溶液使用量减少了5～10倍。同时，也大大降低了样品使用量，痕量的样品也能够进行IgG含量检测。
2.检测通量高，操作简单。本检测方法读取最终反应吸光值时，不需要紫外-可见分光光度计，仅需可以读取340nm吸光值的酶标仪即可。采用排枪，可以将多个反应管的混合溶液反复吸打混匀后，转入酶标板，不需要进行润洗，所有反应管的样品可在5分钟内完成检测。
3.实验重复性好，检测时间短，检测准确度高。本方法可以实现同一样品同一个稀释度做3个以上的重复检测，能够同时读取多个重复反应的吸光值，一个96孔板所有酶标孔的吸光值能在3分钟内完成读取，省时省力。同一个样品通过多次同时重复检测也提高检测准确度，减少误差。
4.垂直透射检测读取吸光值的方式不受反应体系抗原抗体复合物沉降的影响。传统的紫外-可见分光光度计比色皿垂直放置，光线水平透过比色皿读取吸光值。酶标仪的光束都是垂直通过待测溶液和微孔板的，光束既可是从上到下，也可以是从下到上穿过比色液，因此读取吸光值不会因为反应体系抗原抗体复合物沉降而导致结果偏低。另外，由于酶标仪读取一个酶标板的时间短，读取的吸光值也不受抗原抗体复合物的沉降的影响。
附图说明：
图1所示为实施例1中检测的标准品溶液的IgG含量的对数与其相应的吸光值的对数进行直线回归，得到R2＞0.99的标准曲线；
图2所示为实施例2中检测的标准品溶液的IgG含量的对数与其相应的吸光值的对数进行直线回归，得到R2＞0.99的标准曲线
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1
样品及试剂：
健康人血浆3份，国家人血清免疫球蛋白标准品，抗人IgG抗体溶液，以及Tris、氯化钠、PEG6000、BSA、NaN3等其他试剂。
操作步骤：
1.试剂配制：
1.1缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠 9g、聚乙二醇(PEG6000)50g、牛血清(BSA)1g、叠氮钠(NaN3) 1g，加水溶解，用1.0mol/L盐酸调pH至7.4，加水稀释至1000ml。
1.2抗人IgG抗体溶液：根据抗体效价检测结果1:100，可将抗人IgG抗体溶液采用上述缓冲液进行稀释，稀释至抗体最终效价1:1 (取原液1ml加抗体缓冲液99ml)，充分均匀，现配现用。
1.3IgG标准品溶液的制备：用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每1ml含0.2～6.0mg范围内做适当的系列稀释(通常做5个稀释度)。
2.酶标仪：接通电源，设置波长为340nm，每孔读取中间点，连续读取吸光值，预热30分钟。
3.供试品溶液的制备：用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释度，其IgG含量均应在标准曲线范围内(中间体按 40倍、60倍、80倍稀释，半成品、成品按20倍、30倍、40倍稀释)。
4.测定法：
4.1取供试品溶液2μl，加已预热至37℃的抗体液200ul，混匀，每个稀释度做3管，37℃水浴中保温1小时，充分混匀。
4.2用酶标仪于340nm处分别测定吸光度。
4.3用IgG标准品溶液2μl替代供试品溶液，同法操作。所有反应管必须在5分钟内测量完毕。
5.结果计算：
5.1计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值。
即OD＝(OD第一管+OD第二管+OD第三管)÷3
5.2将标准品溶液的IgG含量的对数对其相应的吸光度的对数进行直线回归，相关系数(r值)r应≥0.99；然后将供试品溶液吸光度的对数值代入回归方程，求得值的反对数，再乘以稀释倍数，求得每1ml供试品溶液IgG含量(g/L)，再由供试品各稀释度IgG含量求平均值，即为供试品IgG含量(g/L)。
本实验结果：
1.将检测的标准品溶液的IgG含量的对数与其相应的吸光值的对数进行直线回归，得到R2＞0.99的标准曲线，如说明书附图图1 所示。
2.血浆样品检测值如表1所示：
表1
实施案例2
抗人IgG抗体溶液：根据抗体效价检测结果，可将抗人IgG抗体溶液采用上述缓冲液进行稀释，稀释至抗体最终效价1:4(例如，抗人IgG抗体溶液效价为1:100，取原液2ml加抗体缓冲液48ml)，充分均匀，现配现用。
取供试品溶液1.5μl，加已预热至37℃的抗体液150ul，混匀，每个稀释度做3管，37℃水浴中保温1小时，充分混匀。用酶标仪于 340nm处分别测定吸光度。用IgG标准品溶液1.5μl替代供试品溶液，同法操作。所有反应管必须在5分钟内测量完毕。
本实验结果：
1.将检测的标准品溶液的IgG含量的对数与其相应的吸光值的对数进行直线回归，得到R2＞0.99的标准曲线，如说明书附图图2 所示：
2.血浆样品检测值如表2所示：
表2

Claims (7)

1.一种采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，其特征在于，采用市售抗人IgG抗体溶液，代替抗人IgG血清；采用酶标仪代替紫外-可见分光光度计，定量检测人血浆或其他含有人IgG的血浆类似物中的IgG含量。
2.根据权利要求1所述的采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)试剂配制：配制缓冲液、抗人IgG抗体溶液和IgG标准品溶液；
(2)供试品溶液的制备：用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释度，其IgG含量均应在标准曲线范围内；
(3)测定法：
用酶标仪测定供试品溶液和IgG标准品溶液吸光度；
(4)结果计算：
计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值；
将标准品溶液的IgG含量的对数对其相应的吸光度的对数进行直线回归，相关系数(r值)r应≥0.99；然后将供试品溶液吸光度的对数值代入回归方程，求得值的反对数，再乘以稀释倍数，求得每1ml供试品溶液IgG含量(g/L)，再由供试品各稀释度IgG含量求平均值，为供试品IgG含量(g/L)。
3.根据权利要求2所述的采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，其特征在于，步骤(1)具体为：
缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠9g、聚乙二醇(PEG 6000)50g、牛血清(BSA)1g、叠氮钠(NaN3)1g，加水溶解，用1.0mol/L盐酸调pH至7.4，加水稀释至1000ml；
抗人IgG抗体溶液：根据抗体效价检测结果，将抗人IgG抗体溶液采用上述缓冲液进行稀释，稀释至抗体最终效价1:1(取原液1ml加抗体缓冲液99ml)，充分均匀，现配现用；
IgG标准品溶液的制备：用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每1ml含0.2～6.0mg范围内做适当的系列稀释(通常做5个稀释度)。
4.根据权利要求2所述的采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，其特征在于，步骤(2)中，供试品中间体按40倍、60倍、80倍稀释，半成品、成品按20倍、30倍、40倍稀释。
5.根据权利要求2所述的采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，其特征在于，步骤(3)中酶标仪波长340nm，每孔读取中间点，连续读取吸光值，预热30分钟。
6.根据权利要求2所述的采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，其特征在于，步骤(3)具体为，取供试品溶液1-2μl，加已预热至37℃的抗体液100-200ul，混匀，每个稀释度做3管，37℃水浴中保温1小时，充分混匀；
用酶标仪于340nm处分别测定吸光度；
用IgG标准品溶液2μl替代供试品溶液，同法操作；所有反应管必须在5分钟内测量完毕。
7.根据权利要求2所述的采用酶标仪免疫透射比浊法高通量检测IgG含量的方法，其特征在于，步骤(4)中，吸光度的均值OD＝(OD第一管+OD第二管+OD第三管)÷3。
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