CN109324192A - 快速定量检测抗核抗体含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物检测分析技术领域，涉及快速定量检测抗核抗体含量的检测方法。本发明提供了利用超微量全自动蛋白质表达定量分析系统，同时快速检测样品中多种抗体的每一种的含量的方法。该方法能快速、精准定量检测，又具有特异性强、灵敏度高等优点，可定量分析患者血清中抗核抗体含量的高低，更易实现自动化。本发明进一步建立了用于评价样本抗体量值的定量分级标准和最佳筛查阳性临界值，用于预测或评估人体是否可能发展或已经发展多种自身免疫疾病。

Description

快速定量检测抗核抗体含量的检测方法

技术领域

本发明属于生物检测分析技术领域，涉及快速定量检测抗核抗体含量的检测方法。

背景技术

每种自身免疫疾病都伴有特征性的自身抗体谱，是早期诊断、病情评估、疾病分期、预后判断等必不可少的生物学指标。某些自身抗体因对疾病诊断具有高度的特异性及敏感性已成为诊断相应疾病的金标准。

抗核抗体是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称，是一组对细胞核内的DNA、RNA、蛋白或这些物质的分子复合物产生的自身抗体。在临床中，用于辅助诊断检测的混合抗原中，nRNP/Sm、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1、核小体、dsDNA、组蛋白、核糖体P蛋白、AMA-M2、PM-Scl、CENP-B及PCNA等是常见抗核抗体的靶成分。

由于医疗检测水平与国外存在较大的差距，目前国内部分医院检测自身抗体仍采用定性检测的方法，如免疫荧光法、免疫印迹法和金标法等，定性检测有着操作简单，成本较低的独特优势，但定性检测存在准确性差，易出现假阳性和假阴性结果，不能准确反映自身抗体量值等问题。间接免疫荧光分析法可在组织标本中提示自身抗体的存在，但无法对自身抗体的种类进行具体客观的评价。酶联免疫吸附法(ELISA)可检测的抗原种类多，操作方法简易。但一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高，需要人工操作而且出现假阳性的几率大。

线性免疫膜条是现行临床检测中对抗核抗体定性检测最常用的检测方法。它将各种不同组合的纯化抗原成分通过点样机划线于硝酸纤维素膜上进行包被，裁剪后粘贴在膜条上，制成检测膜条。检测膜条上包被的抗原越多，粘贴次数越多，膜条被污染的可能性也就越大，从而使得检测膜条检测结果重复性差，也可能因为粘贴错误而致使检测结果的误读。这种印迹法虽然具有特异性强，操作简便，结果相对客观等优点，但是该方法只能对患者的血清抗体水平做出定性(阴性、阳性、强阳性)的判断，无法准确定量，因此不能反映病程转归和做出预后判断。此外，临床实践中该检测项目对部分靶抗原的检测具有一定的假阳性和假阴性率，且成本费用较高，因此其临床诊断的参考价值和应用具有一定的局限性。

此外，与定性检测相比，定量检测根据受试者群体及生物标记物的特点制定最佳的阈值(Cut-off)，并且自身抗体定量检测更准确，更易实现自动化及标准化，更能反映与疾病的相关性。定量检测自身抗体不仅可以更好地帮助临床诊断自身免疫疾病，并且数值的高低能够有效反映病程，预测发病风险，预后及指导下一阶段的治疗，这对疾病的监测以及疗效的评估有重要价值。目前，在国内完全实现自动化、高通量、高准确性的定量检测项目仍较少，如何将最新检测技术应用于自身抗体的定量检测成为推动我国自身抗体检测技术革新的一个重要研究方向。

发明内容

本发明提供了同时快速检测样品中多种抗体的每一种的含量的方法。本发明进一步建立了用于评价样本抗体量值的定量分级标准和最佳筛查阳性临界值Cut-off值，用于预测或评估人体是否可能发展或已经发展多种自身免疫疾病，其中自身免疫疾病于人体的生物学样品中存在至少一种抗核抗体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种快速定量检测抗核抗体含量的检测方法，利用超微量全自动蛋白质表达定量分析系统Wes系统，使生物学样本与所述抗核抗体的抗原接触，利用含有可检测标签的第二抗体与所述抗核抗体特异性结合，形成抗原-抗核抗体-第二抗体的复合物，通过测定第二抗体的可检测标签的光信号，对所述生物学样本中的抗核抗体含量进行检测及归一化数据处理，确定所述抗核抗体的存在及相对含量；在检测系统中，所述每种抗核抗体的抗原充分结合其对应的抗核抗体。

本发明所属方法中具体包括以下步骤：

1)向Wes检测板的上样孔中加入所述生物学样本、所述抗核抗体的抗原、含有可检测标签的第二抗体和内参多肽对照抗原、多肽对照抗原抗体、稀释液、封闭液、显色液；

2)利用Wes系统自动检测可检测标签的光信号；

3)检测结束后，根据检测信号值进行生物学样本、内参之间的归一化数据处理，确定所述抗核抗体的存在及进行相对定量。

使用上述方法进行检测时，所述生物学样本包括来自哺乳动物的尿、血液、血浆、血清的一种或两种以上。所述可检测标签包括辣根过氧化酶HRP标签。

本发明所述抗核抗体的抗原为核糖体P蛋白P0、干燥综合征A抗原Ro-52、系统性硬化症抗原蛋白复合物PM-Scl、增殖细胞核抗原PCNA、干燥综合征A抗原SSA-60、DNA拓扑异构酶I Scl-70中的一种或两种以上的混合物。

上述检测方法的步骤1)检测板的一行上样孔中为所述抗核抗体的抗原与内参多肽对照抗原、缓冲液混合而成的靶抗原组合液，所述每一种抗核抗体的抗原浓度为0.01μg/μL以上，含有所述内参多肽对照抗原的试剂的体积浓度为20％。

步骤1)检测板的一行上样孔中所述生物学样本由封闭液稀释，稀释为原生物学样本采样体积的50倍-150倍。

优选的，稀释为原生物学样本采样体积的100倍。

步骤3)中利用抗原-抗核抗体-第二抗体复合物在抗原分子量位置产生光信号的积峰面积值，与所述内参多肽对照抗原分子量位置产生光信号的积峰面积值，归一化处理得所述抗核抗体归一化积峰面积值，计算公式如下：

进一步地，对所述抗核抗体含量的检测结果的积峰面积值进行归一化数据处理，利用受试者工作特征曲线对归一化数据处理结果进行计算分析，确定所述抗核抗体的最佳筛查阳性临界值；依据最佳筛查阳性临界值和检测结果的归一化积峰面积值Pav的数据分布，界定抗核抗体的阴性、弱阳性、阳性和强阳性的分级标准。

所述抗核抗体最佳筛查阳性临界值如下：抗P0抗核抗体为7000，抗Ro-52抗体为8000，抗PM-Scl抗体为70000，抗PCNA抗体为15000，抗SSA-60抗体为5000，抗Scl-70抗体为70000。

所述抗核抗体的阴性、弱阳性、阳性和强阳性的分级标准，及信噪比如下：

抗P0抗核抗体，S/N＜10，Pav<7000为阴性；S/N≥10，50000＞Pav≥7000为弱阳性，300000>Pav≥50000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗Ro-52抗核抗体，S/N＜10，Pav<8000为阴性；S/N≥10，60000>Pav≥8000为弱阳性，300000>Pav≥60000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗PM-Scl抗核抗体，S/N＜20，Pav<7000为阴性；S/N≥20，10000＞Pav≥70000为弱阳性，300000>Pav≥100000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗PCNA抗核抗体，S/N＜10，Pav<15000为阴性；S/N≥10，20000＞Pav≥15000为弱阳性，300000>Pav≥20000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗SSA-60抗核抗体，S/N＜10，Pav<5000为阴性；S/N≥10，50000＞Pav≥5000为弱阳性，300000>Pav≥50000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗Scl-70抗核抗体，S/N＜20，Pav<70000为阴性；S/N≥20，100000＞Pav≥70000为弱阳性，300000>Pav≥10000为阳性，Pav≥300000为强阳性。

本发明进一步提供了上述检测方法的检测对象，用于检测哺乳动物自身免疫疾病特征性抗核抗体含量，其中所述自身免疫疾病在所述哺乳动物的生物学样品中存在至少一种抗核抗体。

本发明通过超微量全自动蛋白质表达定量分析系统(Wes系统)，对预先加入的所有的靶抗原和血清进行免疫杂交，捕获血清中相应的疾病标志物抗核抗体，检测发光底物的信号强度，实现多种抗核抗体的同时定量分析。

本发明具有如下优点：

1、本发明利用Wes系统快速自动定量检测自身免疫病患者血清中抗核抗体含量。类似于传统Western-blot蛋白免疫学检测方法的原理，Wes系统是对蛋白样品(抗原)进行定量检测的方法，而本发明利用Wes系统对常规方法中的探针(抗体)进行定量检测，通过大量抗原与样本中的抗体进行免疫反应，获得样品中多种微量抗体的相对含量结果。

2、本发明公开的方法能快速、精准定量检测，又具有特异性强、灵敏度高等优点，可定量分析患者血清中抗核抗体含量的高低，更易实现自动化，有效帮助监测病情和疗效，预测疾病的发生和预后。并且避免由于传统定性检测对结果笼统地判断为阳性或阴性，而出现的假阳性或假阴性的错误判断。

3、本发明可实现任意组合式免疫反应和多组分检测。针对检测对象和检测项目的不同，调整检测系统中重组纯化靶抗原的组合，可以同步快速多组分检测。

4、本发明还建立了人群数据的定量标准和最佳筛查阳性临界值，并可形成相应的关联表达分析谱，探索相关抗核抗体连锁表达的情况，进而对临床常见的40余种自身免疫病进行更加精准的辅助诊断。本发明确定了采用Wes系统检测中国人血清自身抗核抗体含量的正常范围标准及异常变化水平的分级标准，用于确定结果高于还是低于临床或分析决断点，提高了检测指标的有效性和准确性。

5、由于本发明的方法只需3-5μL血清就可满足检测需要，因此可从指间末端采血一滴即可快速进行定量检测。其操作的便捷性不但可以让患者更易接受，还可大范围推广应用，作为自身免疫性疾病普查或跟踪检测项目。

附图说明

图1是组合1靶抗原P0、Ro-52、PM-Scl和内参抗原(sys ctrl)检测血清样品中相应抗核抗体的光信号积峰示意图。

图2是组合1靶抗原P0、Ro-52、PM-Scl和内参抗原(sys ctrl)检测血清样品中相应抗核抗体的在毛细管中的电泳成像图。

图3是组合2毛细管中靶抗原PCNA、SSA-60、Scl-70和内参抗原(sys ctrl)检测血清样品中相应抗核抗体的光信号积峰示意图。

图4是组合2毛细管中靶抗原PCNA、SSA-60、Scl-70和内参抗原(sys ctrl)检测血清样品中相应抗核抗体在毛细管中的电泳成像图。

图5-图10分别是P0、Ro-52、PM-Scl、PCNA、SSA-60、Scl-70对应抗核抗体浓度与光信号积峰面积值的四参数拟合曲线图。

图11-图16分别是P0、Ro-52、PM-Scl、PCNA、SSA-60、Scl-70对应抗核抗体的定量检测的经验和拟合ROC曲线图。

图17是P0、Ro-52、PM-Scl、PCNA、SSA-60、Scl-70对应抗核抗体含量检测的光信号积峰面积值Pav数据分布图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下列实施例所用的6种抗原全部购自德国Diarect公司商品化的重组纯化抗原：核糖体P蛋白P0(货号14100)、增殖细胞核抗原PCNA(货号15400)、干燥综合征A抗原SSA-60(货号17400)、干燥综合征A抗原Ro-52(货号12700)、系统性硬化症抗原蛋白复合物PM-Scl(货号16000)、DNA拓扑异构酶I Scl-70(货号12400)。

血清样本是临床确认的592例自身免疫性疾病患者的血清，和86例健康对照血清，以及350例随机采样血清，收集于2017年07月至2018年08月期间，由青岛大学附属医院、青岛市立医院、青岛齐鲁医院和淄博中心医院检验科及输血科提供。

测试膜条及配套试剂盒购自欧蒙医学诊断(中国)有限公司。

辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗人IgG抗体购自北京中山金桥生物技术有限公司。

Wes超微量全自动蛋白质表达分析系统(美国ProteinSimple公司)。

Wes系统配套试剂盒购自普诺森生物科技(上海)有限公司，以及配套12-230kDa的抗原分离毛细管模块(12-230kDa Wes Separation Module 8×25capillarycartridges)，试剂盒中含有多肽对照抗原抗体10×System Control Primary Antibody–Rabbit和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体Anti-Rabbit Secondary Antibody。

一、抗核抗体Wes检测

实施例1

步骤1、Wes检测板的样本布局

检测反应的组分均预先加入到Wes系统配套的检测板中，检测反应在含25根毛细管的配套卡盒中进行。

检测板(检测孔25孔/行，从左向右依次为1-25孔)中样品布局如下：

第一行A行：A1为分子量标准品，A2-A25为多组合的靶抗原样本；

第二行B行：全部为封闭液；

第三行C行：C1为封闭液，C2-C25为经稀释后的血清样品；

第四行D行：D1为HRP标记的链霉素Streptavidin-HRP，D2-D25为二抗-HRP混合物；

第五行E行：全部为发光底物显色液；

第六行F行：空。

封闭液、Streptavidin-HRP、发光底物显色液为Wes系统配套试剂盒配备，二抗-HRP混合物为HRP标记的山羊抗人IgG抗体和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体。每块检测板匹配有同样含25根毛细管的卡盒，可从检测板不同行的各孔中吸取组分进行反应，并在毛细管中进行发光检测。

步骤2、多组合的靶抗原样品混合配制

靶抗原组合液1：P0、Ro-52、PM-Scl各0.1μL，3.3μL 1×Sample Buffer,0.9μL 5×Master Mix；每个上样孔配制终体积4.5μL靶抗原样品备用；

靶抗原组合液2：PCNA、SSA-60、Scl-70各0.1μL，3.3μL 1×Sample Buffer,0.9μL5×Master Mix；每个上样孔配制成终体积4.5μL靶抗原样品备用。

各抗原终浓度如下：P0为0.021μg/μL，Ro-52为0.016μg/μL，PM-Scl为0.020μg/μL，PCNA为0.021μg/μL，SSA-60为0.022μg/μL，Scl-70为0.024μg/μL。

Sample Buffer和Master Mix为Wes系统配套试剂盒配备，Master Mix中含有等浓度的分析内标多肽对照抗原sys ctrl。

步骤3、抗核抗体的检测

依据步骤1中确定的Wes检测板的样品布局，向检测板各孔中加入配制好的样品。

A1：将含分子量标准品的粉末与16μL二流苏糖醇DTT，2μL 10×Sample Buffer混合，吹打均匀后95℃变性5分钟，取3μL加入到A1中；

A2-A3：将靶抗原组合液1、2分别混匀后95℃变性5分钟，各孔加入3μL；

B1-B3：加封闭液10μL/孔；

C1:加封闭液10μL/孔；C2-C3：将血清样品用封闭液按1:100稀释后，取13.5μL与1.5μL多肽对照抗原抗体混匀后，各孔加入10μL；

D1：加Streptavidin-HRP 10μL/孔；D2-D3：将HRP标记的山羊抗人IgG抗体1μL和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体299μL混匀后，各孔加入10μL；

E1-E3：取Lumino-S和Peroxide各200μL，涡旋混匀后，各孔加入15μL。

DTT、Lumino-S和Peroxide均为Wes系统配套试剂盒配备。

将上样后的检测板进行上机检测，自动进行样本的检测，约3h后检测结束，获得血清样品中6种抗体的检测结果。Wes系统自动检测发光底物的信号强度的检测结果如图1-图4所示。由图2、图4的电泳结果可以看到，抗原抗体复合物在相应分子量位置产生光信号，光信号强弱与C2、C3中抗核抗体含量呈正相关。

二、确立样本稀释倍数

实施例2

步骤1、定量数据的归一化处理

各毛细管中稳定表达分析内标多肽对照抗原sys ctrl的光信号积峰面积值(peakarea value，Pav)为65000，将其作为进行各个抗核抗体(ANA)数据归一化处理的对照内参。血清样本中ANA归一化积峰值计算公式如下：

归一化Pav值可以作为血清中抗体含量水平的定量标准单位。

步骤2、确立样本稀释倍数

随着抗核抗体浓度增强，发光底物的信号强度增大，但是受限于检测系统对于谱带亮度的检测灵敏度和检测动态范围，过低或过高水平的样本检测结果不准确。为了减少检测的系统误差，确认样本中抗核抗体浓度与检测信号之间的变化关系，获得信号对抗核抗体浓度最敏感相应区间，确立样本稀释倍数。

对60例(每种抗核抗体10例)临床确认的自身免疫性疾病患者血清样本进行不同比例浓度的稀释，稀释倍数如表1所示。采用实施例1的操作步骤，获得稀释倍数(抗核抗体浓度)与归一化积峰面积值均值的变化曲线，如图5-10所示。

表1.患者血清样本稀释倍数表

抗原抗体复合物在相应分子量位置产生光信号的Pav值的计算采用高斯曲线拟合(Gaussian Fitting)：

一维高斯函数：

a表示曲线的高度，b表示曲线在x轴的中心，c表示曲线的半峰全宽width。

由图5-图10的四参数拟合曲线图可以看出，样本稀释倍数(抗核抗体浓度)与积峰面积值之间的变化曲线呈“S”型变化，稀释倍数介于1:50倍～150倍之间时，信号对抗核抗体浓度最敏感，为简化该方法的使用，样本稀释倍数取1:100。

三、确立抗核抗体的定量分级标准

从临床确认的592例自身免疫性疾病患者获得血清样本，以及86例健康者获得对照血清样本。对自身抗核抗体P0检测421人份，Ro-52检测413人份，PM-Scl检测419人份，PCNA检测396人份，SSA-60检测393人份，Scl-70检测393人份。

实施例3

步骤1、最佳筛查阳性临界值(Cut-off值)

受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)主要用于选择最佳的信号侦测模型或在同一模型中设定最佳阈值，本实施例应用ROC曲线设定最佳阈值。

采用实施例1的操作步骤，以实施例2归一化处理方法，样本稀释倍数取1:100，分别获得对患者样本(阳性)、对照样本(阴性)中六种抗核抗体的信噪比S/N值和归一化Pav值。

利用SPSS数据处理软件进行ROC曲线的绘制，具体方法是将Pav值作为数据列，样本阳性、阴性真实情况作为状态列，以“阳性”为正状态值，绘制ROC曲线，并给出众多Cut-off值对应的敏感性参数、1-特异性参数，利用约登指数(Youden index)＝敏感性-(1-特异性)，约登指数最大值所对应的Cut off值为最佳筛查阳性临界值，如图11-图16所示：

对应血清抗核抗体Cut-off值：P0为7000，Ro-52为8000，PM-Scl为70000，PCNA为15000，SSA-60为5000，Scl-70为70000。

步骤2、抗核抗体含量的分级

对于大多数光信号检测、荧光成像，高的信噪比(S/N)将使得成像有着锐利的对比度和良好的清晰度，而随着信噪比降低，背景信号增加，图像清晰度和对比度下降。由于样本中，各种抗核抗体的含量、分子量差异较大，抗原抗体反应中也会有交叉反应的影响，因此需要确定合适的S/N值，以提高各种抗核抗体的检测精度。

根据Cut-off值和Pav值的分布，对所有检测样本的数据进一步的分级。利用临床确认的健康者、弱阳性、阳性、强阳性患者样本，用GraphPad Prism软件选取不同等级的分界值，确定相应的阴性值、弱阳性值、阳性值和强阳性值的范围分布，如表2所示。

表2.六种血清抗核抗体的Cut-off值、信噪比和定量分级标准

*S/N：信噪比；**Pav：积峰面积值。

对阴性值、弱阳性值、阳性值和强阳性值四组数据利用SPSS10.0分析软件进行单因素方差分析和q检验，结果显示组间均有显著性差异(P＜0.05)，可以用于血清中抗核抗体的分级标准。

血清样本检测的Pav数据散点分布如图17所示，由图中散点数据分布可以看出，各血清抗核抗体的临界值Cut-off值、S/N值的确定和分级，可以准确地细分健康样本和抗体含量异常程度不同的样本，提高检测的有效性和准确性。

四、和传统印迹法对自身抗核抗体检测的对照分析

随机采集350例血清样本。对其中自身抗核抗体P0检测335人份，Ro-52检测327人份，PM-Scl检测333人份，PCNA检测310人份，SSA-60检测307人份，Scl-70检测307人份。

实施例4

采用实施例1的操作步骤检测自身抗核抗体P0、Ro-52、PM-Scl、PCNA、SSA60、Scl-70，检测结果如表3所示。

对比例1

采用传统印迹法分别检测自身抗核抗体P0、Ro-52、PM-Scl、PCNA、SSA60、Scl-70，检测结果如表3所示。

传统印迹法的操作步骤如下：

1.预处理：将检测膜条放入温浴槽中，并在每槽中加入1.5mL样本缓冲液，摇摆摇床温浴5分钟；

2.温育：吸去槽内液体，在温浴槽中分别加入1.5mL已稀释血清，摇摆摇床温育30分钟；

3.清洗：吸去槽内液体，在摇摆床上用1.5mL工作浓度的清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5分钟；

4.温育：吸去槽内液体，在温浴槽中分别加入1.5mL酶结合物，摇摆摇床温育30分钟；

5.清洗：清洗：吸去槽内液体，在摇摆床上用1.5mL工作浓度的清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5分钟；

6.显色：吸去槽内液体，在槽内分别加入1.5mL底物液，摇摆摇床温育10分钟；

7.结果判断：吸去槽内液体，用蒸馏水清洗3次，每次1.5mL，观察显色结果。

表3.实施例4和对比例1对血清样本检测结果的统计表

通过对六种抗核抗体在血清样本中的检出率比较可以看出，在实施例4中，P0、Ro-52、PM-Scl、PCNA和Scl-70的检出率要明显高于对比例传统印迹法，如P0抗体的检出率提高了18.20％，PCNA提高了9.70％。这说明本发明检测方法的敏感性相对于传统印迹法有显著性提升，降低了假阴性率。

将实施例4中判定为强阳性、阳性和弱阳性的血清样本，用印迹法进行验证；再用本发明所述方法验证对比例1印迹法的判定结果，相互对比符合率如表5所示。

表4.阳性血清样本交叉验证对比表

通过本发明所述方法和印迹法阳性数据结果的对照验证，可以发现，除SSA-60外，对另外五种抗核抗体检出结果经验证结果一致的符合率，本发明的验证符合率明显高于印迹法验证的符合率。说明本发明对抗核抗体的检测在敏感性和特异性方面都显著优于传统印迹法。

当然，上述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定对本发明的实施例范围。本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围内。

Claims (10)

1.一种快速定量检测抗核抗体含量的检测方法，其特征在于，利用超微量全自动蛋白质表达定量分析系统Wes系统，使生物学样本与所述抗核抗体的抗原接触，利用含有可检测标签的第二抗体与所述抗核抗体特异性结合，形成抗原-抗核抗体-第二抗体的复合物，通过测定第二抗体的可检测标签的光信号，对所述生物学样本中的抗核抗体含量进行检测及归一化数据处理，确定所述抗核抗体的存在及相对含量；在检测系统中，所述每种抗核抗体的抗原充分结合其对应的抗核抗体。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)向Wes检测板的各行上样孔中加入所述生物学样本、所述抗核抗体的抗原、含有可检测标签的第二抗体和内参多肽对照抗原、多肽对照抗原抗体、缓冲液、封闭液、显色液；

2)利用Wes系统自动检测可检测标签的光信号；

3)检测结束后，根据检测信号值进行生物学样本、内参之间的归一化数据处理，确定所述抗核抗体的存在及进行相对定量。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述生物学样本包括来自哺乳动物的尿、血液、血浆、血清的一种或两种以上；所述可检测标签包括辣根过氧化酶HRP标签。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述抗核抗体的抗原为核糖体P蛋白P0、干燥综合征A抗原Ro-52、系统性硬化症抗原蛋白复合物PM-Scl、增殖细胞核抗原PCNA、干燥综合征A抗原SSA-60、DNA拓扑异构酶I Scl-70中的一种或两种以上的混合物。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤1)检测板的一行上样孔中为所述抗核抗体的抗原与内参多肽对照抗原、缓冲液混合而成的靶抗原组合液，所述每一种抗核抗体的抗原浓度为0.01μg/μL以上，含有所述内参多肽对照抗原的试剂体积浓度为20％。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1)检测板的一行上样孔中所述生物学样本由封闭液稀释，稀释为原生物学样本采样体积的50倍-150倍，优选的，稀释为原生物学样本采样体积的100倍。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤3)中利用抗原-抗核抗体-第二抗体复合物在抗原分子量位置产生光信号的积峰面积值，与所述内参多肽对照抗原分子量位置产生光信号的积峰面积值，归一化处理得所述抗核抗体归一化积峰面积值，计算公式如下：

。

8.根据权利要求4-7任一项所述的检测方法，其特征在于，所述抗核抗体含量的检测结果，进行归一化数据处理，利用受试者工作特征曲线对归一化处理结果进行计算分析，获得所述抗核抗体的最佳筛查阳性临界值；依据最佳筛查阳性临界值和所述抗核抗体含量的数据分布，界定抗核抗体的分级标准。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述抗核抗体最佳筛查阳性临界值如下：抗P0抗核抗体为7000，抗Ro-52抗体为8000，抗PM-Scl抗体为70000，抗PCNA抗体为15000，抗SSA-60抗体为5000，抗Scl-70抗体为70000。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述抗核抗体的分级标准，及信噪比如下：

抗P0抗核抗体，S/N＜10，Pav<7000为阴性；S/N≥10，50000＞Pav≥7000为弱阳性，300000>Pav≥50000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗Ro-52抗核抗体，S/N＜10，Pav<8000为阴性；S/N≥10，60000>Pav≥8000为弱阳性，300000>Pav≥60000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗PM-Scl抗核抗体，S/N＜20，Pav<7000为阴性；S/N≥20，10000＞Pav≥70000为弱阳性，300000>Pav≥100000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗PCNA抗核抗体，S/N＜10，Pav<15000为阴性；S/N≥10，20000＞Pav≥15000为弱阳性，300000>Pav≥20000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗SSA-60抗核抗体，S/N＜10，Pav<5000为阴性；S/N≥10，50000＞Pav≥5000为弱阳性，300000>Pav≥50000为阳性，Pav≥300000为强阳性；

抗Scl-70抗核抗体，S/N＜20，Pav<70000为阴性；S/N≥20，100000＞Pav≥70000为弱阳性，300000>Pav≥10000为阳性，Pav≥300000为强阳性。