CN1786713A

CN1786713A - 酶标仪在胶乳增强免疫透射比浊法中的应用

Info

Publication number: CN1786713A
Application number: CN 200410097587
Authority: CN
Inventors: 陈金华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-12-09
Filing date: 2004-12-09
Publication date: 2006-06-14

Abstract

本发明提供了一种用酶标仪检测经胶乳增强浊度的不溶性免疫颗粒复合物吸光值的免疫透射比浊法，该方法是将抗体结合到具有一定光密度值的聚苯乙烯胶乳表面，形成抗体胶乳。该抗体胶乳与血清样本中相对应的蛋白抗原结合，这样，当免疫反应发生时，抗体胶乳与蛋白抗原发生连锁反应，大量胶乳通过免疫反应一层一层聚集在一起形成不溶性免疫颗粒复合物，胶乳的粒径发生改变，其透射性及吸光度值也发生明显的变化。采用具有一定透射波长的酶标仪检测这种胶乳颗粒聚集的吸光值的变化，并通过绘制某种已知浓度抗原与相应抗体胶乳颗粒反应的标准曲线来推算待测标本中同一抗原的浓度。

Description

酶标仪在胶乳增强免疫透射比浊法中的应用

所属技术领域：

本发明涉及一种免疫透射比浊法，特别是涉及用酶标仪检测的方法。

技术背景：

免疫比浊法是利用蛋白质复杂结构所具有的抗原特性，以被测蛋白质作为一种抗原与特异性抗体结合后形成不溶性免疫复合物，经可见光照射检测蛋白质含量的比浊方法。但这种免疫复合物的浊度变化太小，经可见光照射后的吸光值变化小，灵敏度很低。经过研究和改进又产生了胶乳增强免疫透射比浊法。胶乳增强免疫透射比浊法是将抗体分子结合到胶乳的表面，常用的胶乳是粒径为0.1um～0.2um的高分子微球，当胶乳的粒径小于入射光波长时，单个胶乳颗粒在入射光波长内透射性良好，两个胶乳颗粒凝聚时，则透过光减少，这种减少的程度与胶乳凝聚成正比，也与抗原量成正比。胶乳表面可以吸附多个抗体，当免疫反应发生时，胶乳表面的抗体和多个抗原结合，这些抗原又和胶乳表面的抗体结合，这样，抗原与胶乳表面结合的抗体发生连锁反应，大量的胶乳通过免疫反应一层一层地聚集在一起形成团块状不溶性免疫颗粒复合物，胶乳的粒径发生改变，其透射性能也发生明显的变化，经可见光照射检测浊度的变化。胶乳增强浊度的免疫透射比浊大大提高了检测的灵敏度，有广阔的应用前景。目前，对免疫颗粒复合物浊度检测的仪器主要是分光光度计和全自动(半自动)生化分析仪，分光光度计每次只能检测一个样本，而且每次检测完后要清洗比色池，操作烦琐，误差大。生化分析仪操作方便，准确度高，但每次检测所需试剂量大，检测成本高。我们采用酶标仪检测免疫颗粒复合物的吸光值，一次可以检测多个标本，测定速度快，所需试剂量小，成本低，适合于一般的医疗机构使用。

发明内容：

本发明提供了在胶乳增强免疫透射比浊中应用酶标仪进行检测的方法，该方法是以粒径为0.1um～0.2um的聚苯乙烯胶乳粒子为载体，将多个抗体结合到胶乳表面，形成抗体胶乳。由于胶乳是双层结构的高分子微球，表面可以结合大量的抗体，将胶乳粒子包裹起来，当免疫凝聚发生时，胶乳表面的抗体与抗原结合，抗原又和胶乳表面的抗体结合，这样，抗体胶乳和抗原发生连锁反应，大量的胶乳粒子通过免疫反应一层一层聚集在一起，形成不溶性复合物，胶乳粒子的粒径发生明显改变，其透射性也发生明显变化。采用具有一定透射波长的酶标仪检测这种不溶性免疫复合物吸光值的变化，吸光值的增大与胶乳聚集程度成正比，也与抗原量成正比。用酶标仪检测某种已知浓度的抗原与抗体胶乳反应后的吸光值，以该抗原浓度值为横坐标，对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线，将样本中该抗原与相应抗体胶乳反应后的吸光值代入标准曲线推算样本中该抗原的浓度。因此采用胶乳增强免疫透射比浊检测的产品都可采用一定波长的酶标仪进行检测。现以人血清中转铁蛋白检测为例说明，具体步骤如下：

(1).将兔抗人转铁蛋白抗体结合到聚苯乙烯胶乳的表面，形成抗转铁蛋白抗体胶乳。

(2).将已知浓度的人转铁蛋白标准品作倍比稀释，得到六个不同浓度的标准品。

(3).将(2)中六个标准品分别与抗转铁蛋白抗体胶乳反应，生成不溶性免疫复合物。

(4).用酶标仪在405nm波长处检测免疫复合物的吸光值。

(5).以六个标准品的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

(6).将待测血清样本与抗转铁蛋白抗体胶乳反应，生成不溶性免疫复合物，在酶标仪上检测该免疫复合物吸光值，通过标准曲线求血清样本中转铁蛋白的浓度。

(7).在分光光度计上405nm波长处测(3)和(6)中所述的不溶性免疫复合物的吸光值，以六个标准品的浓度为横坐标，以分光光度计所测的相应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线，将所测得的血清样本吸光值代入标准曲线计算血清样本中转铁蛋白的浓度。

比较分光光度计和酶标仪所测标准品和血清样本的浓度值及两条标准曲线的相关系数可知，两种检测方法在方法学上没有差异，所以在胶乳增强的免疫透射比浊法中用酶标仪进行检测是一种新的检测方法。

本发明的有益效果是给临床上提供了一种用酶标仪检测的免疫透射比浊的检测方法，该方法可同时检测多个标本，检测速度快，耗时短，所需试剂量小，成本低，适合于在一般的医疗机构中使用。

具体实施方式：

本发明提供了将酶标仪用于胶乳增强的免疫透射比浊的检测方法，所有通过胶乳增强浊度进行免疫透射比浊都可以用酶标仪进行检测，以人血清中转铁蛋白为例说明，具体实施方式如下：

1.聚苯乙烯胶乳按公知技术(快速检验资料汇编人民卫生出版社出版，上海第六人民医院检验组编著，1973年，1～40页)制备，取0.1mol/L pH8.2的甘氨酸缓冲液稀释的2％聚苯乙烯胶乳(胶乳粒径0.1um)1ml，加入100μl兔抗转铁蛋白抗体，加甘氨酸缓冲液稀释到5ml，10000g离心10分钟，吸去上清，再加甘氨酸缓冲液稀释，如此清洗二次，最后用甘氨酸缓冲液稀释至1ml即得兔抗转铁蛋白胶乳。

2.取转铁蛋白标准品(5mg/ml)50μl，用0.1mol/L甘氨酸缓冲液依次稀释成下列系列标准浓度：5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.31mg/ml、0mg/ml。取不同浓度的标准品5μl各一管，空白管加5μl 0.1mol/L甘氨酸缓冲液。

3.在各管中加入220μl 0.1mol/L甘氨酸缓冲液，混匀，37℃反应5分钟。

4.取2％转铁蛋白抗体胶乳，用0.1mol/L的甘氨酸缓冲液稀释至1％，各管加1％转铁蛋白抗体胶乳35μl，混匀，37℃反应5分钟。

5.在酶标仪上检测各管405nm波长处的吸光值，测得值如下：

标准品浓度值(mg/ml)	5.0	2.5	1.25	0.625	0.31	0
标准品浓度值(mg/ml)	5.0	2.5	1.25	0.625	0.31	0	吸光值	0.889	0.546	0.353	0.226	0.128	0.012

6.以标准品的浓度为横坐标，以对应吸光值减去空白管吸光值后的值为纵坐标绘制标准曲线，得相关系数r＝0.989。

7.取正常人新鲜血清两份各5μl，空白管直接加5μl 0.1mol/L的甘氨酸缓冲液。在各管中加入220μl 0.1mol/L甘氨酸缓冲液，混匀，37℃反应5分钟，再往各管加入1％转铁蛋白抗体胶乳35μl，充分混匀，37℃反应5分钟后，在酶标仪上检测405nm波长处的吸光值分别为：0.605、0.661，空白管吸光值为0.010。将血清样本吸光值减去空白管吸光值后的值代入标准曲线求得血清中转铁蛋白的浓度分别为：3.06g/l、3.39g/l。据公知技术(中华医学检验全书，人民卫生出版社出版，李影林主编，1996年)知：正常人血清中转铁蛋白的浓度范围是：2.0～4.0g/l。

8.用分光光度计代替(5)步和(7)步中的酶标仪进行测值，测得结果如下：

标准品浓度值(mg/ml)	5.0	2.5	1.25	0.625	0.31	0
标准品浓度值(mg/ml)	5.0	2.5	1.25	0.625	0.31	0	吸光值	0.913	0.561	0.385	0.244	0.151	0.008

两份正常人血清的吸光值分别为：0.633、0.701空白管吸光值为：0.009

9.以(8)步中标准品的浓度为横坐标，以各管吸光值减去空白管吸光值后的值为纵坐标绘制标准曲线，得相关系数r＝0.984。将血清样本吸光值代入标准曲线求得血清样本中转铁蛋白的浓度分别为：3.07g/l、3.46g/l。

以上两种方法所测得血清样本的浓度之间的差异低于5％，所以在胶乳增强免疫透射比浊法中用酶标仪检测和用分光光度计检测在方法学上没有差异，因此用酶标仪进行检测的胶乳增强免疫透射比浊法是一种新的检测方法，具有良好的应用前景。

Claims

1.一种用于胶乳免疫透射比浊的检测方法，其特征在于该方法是用酶标仪检测经胶乳增强浊度的免疫颗粒复合物的吸光值。