CN105223356A - Gpi胶乳增强免疫比浊法体外定量测定诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种胶乳增强免疫比浊法测定人GPI(葡萄糖6磷酸异构酶，Glucose-6-phosphateisomerase)含量的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括GPI？R1试剂、GPI？R2试剂和GPI校准品，其中GPI？R1试剂包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；GPI？R2试剂包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；GPI校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、GPI抗原及缓冲液。本试剂盒特异性强、灵明度高、均一稳定、快速简便，可用于各种生化分析仪。

Description

GPI胶乳增强免疫比浊法体外定量测定诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定人体体液(包括血清和关节腔积液)中GPI(葡萄糖6磷酸异构酶，Glucose-6-phosphateisomerase)含量的试剂盒，属于医学免疫体外诊断领域。
背景技术
葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphateisomerase，GPI或G6PI)是糖酵解和糖异生过程中的一种重要酶类，GPI缺乏会引起人非球形红细胞性溶血性贫血，在类风湿性关节炎(RA)患者的血清和关节液中其浓度明显增高，在多种癌症比如胃肠癌，胸腺癌，肾脏癌症中也被发现其浓度明显增高。
GPI广泛存在于各种细胞胞质内，目前研究发现，GPI存在24个同种异构体，其结构特点极其相似。GPI存在于各种细胞胞质内，是糖酵解和糖异生的重要酶类，并可作为一种细胞因子或生长因子分泌于细胞外，刺激细胞运动，与肿瘤的代谢与发展密切相关。其基因位于第十九号染色体，基因跨度大于40kbp，包括18个内含子。17个外显子，蛋白全长约56ku，是一种多功能分子，于真核生物、细菌和原核生物以及人体各组织细胞中广泛存在。它的主要功能是催化6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖之间的转化，并可诱导髓样干细胞向单核细胞以及B细胞向成熟抗体分泌细胞的分化。GPI缺乏会引起人非球形红细胞性溶血性贫血，同时会出现神经损害症状。这是一种常染色体隐性遗传性疾病，而实验发现该病由于插入了脯氨酸，H20→P和L339→P变异影响酶的折叠和活化从而引起相应临床症状。
GPI是体内的一种自身抗原，有研究表明，GPI在RA患者尤其在活动期血清和关节液中明显增高，并出现GPI水平与RA疼痛和肿胀关节数呈正相关。RA是以关节慢性炎症损伤为主的自身免疫性疾病，发病两年内即可出现不可逆的骨关节破坏，其确切病因和发病机制至今尚不完全清楚。因而RA的早期诊断，治疗对控制该病的病情非常重要。而RA作为一种免疫功能紊乱所引起的自身免疫性疾病，患者体内有多种自身抗原和自身抗体，不同患者的自身抗原可能不同。有文献报道，GPI抗原存在于大多RA患者血清和关节液中，血清中GPI抗原以0.33ug/ml或0.2ug/ml作为阳性分界点，可检测出大部分的RA患者。有研究显示，GPI与RA患者的病程、功能分级、肿胀关节数、压痛关节数、握力及晨僵持续时间存在相关性，而与年龄无关，提示GPI对于RA患者的病情发展程度以及预后判断也有一定的指导意义。
在RA患者中，GPI作为自身抗原可诱导机体其它免疫细胞产生细胞因子引起关节炎，GPI同时也与抗GPI自身抗体结合，形成免疫复合物引起关节炎症状的进一步加重。近年来有文献报道在RA患者的血清和关节液中检测到了高水平的GPI抗体和可溶性GPI分子。此外，Kassahn等在RA患者的血清和关节液中发现高水平的GPI及其免疫复合物，通过激光共聚焦显微镜和免疫组化发现RA患者的关节滑膜或滑膜的小动脉及毛细血管有高密度的GPI表达，认为可能与血管内皮生长因子(VEGF)有关。因此，一些文献认为GPI可能是通过内皮细胞或滑膜液中的可溶性蛋白递呈给免疫系统，同时GPI免疫复合物还可通过FC受体介导替代途径激活补体诱发或加重关节炎症。另外，有学者还发现IgG的沉淀干扰了软骨表面的保护因子通路，GPI-抗GPI抗体复合物覆盖在软骨表面，引起硅酸盐类物质的破坏，从而引起关节破坏。而Yu等在肿瘤细胞内发现GPI可以调节基质金属酶蛋白23(matrixmetalloproteinase23，MMP23)，MMP23在RA患者的滑膜细胞和血管内皮细胞、成纤维细胞中高表达，有明显促进骨破坏的作用，甚至有促进淋巴细胞增生的作用。由此说明GPI抗原与RA滑膜增生、血管翳形成、骨与软骨的破坏密切相关。总之，GPI与RA发病有高度的相关性，高水平的GPI通过多种可能机制诱发RA的发生。
目前常用的葡萄糖-6-磷酸异构酶的检测是采用双抗体夹心法(ELISA)原理对人血清或人关节腔积液中GPI进行检测。ELISA法试剂盒用纯化的抗体包被微孔板制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入GPI、生物素化的抗人GPI抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GPI呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值(OD值)，计算样品浓度，其浓度在0.16ug/ml以下为正常，在0.16-0.33ug/ml为可疑，大于0.33ug/ml时为阳性。ELISA法虽然对设备要求较低，但是步骤繁琐，耗时耗力，不利于大规模检测。
发明内容
本发明提供一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定人体体液(包括血清和关节腔积液)中GPI含量的试剂盒，所述试剂盒包括：(1)GPIR1试剂；(2)GPIR2试剂；(3)GPI校准品。
为实现上述目的，本发明的技术方案包括：
(1)GPIR1试剂，是一种为试剂盒提供适当反应环境、使抗原保持天然构象并控制反应达到终点的时间和速率的试剂，包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液。
(2)GPIR2试剂，是一种含有抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒的均一的乳白色液体，包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液。
(3)GPI校准品，用来与样本比较进行结果计算，包含防腐剂、电解质、稳定剂、GPI抗原及缓冲液。
在本发明的一实施方案中，胶乳比浊法测定人体体液(包括血清和关节腔积液)中GPI含量的试剂盒包括：GPIR1试剂、GPIR2试剂和GPI校准品，其中：
所述GPIR1试剂的主要成分为：0.1％-5.0％电解质、2％-6％促凝剂、0.1％-1％稳定剂、0.1％-1.0％表面活性剂、0.05％-0.1％防腐剂及pH7-9、浓度范围为10-100mmol/L的缓冲液；
所述GPIR2试剂的主要成分为抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒和占其质量百分比为：0.1％-5.0％电解质、0.5％-5％稳定剂、0.1％-1.0％表面活性剂、0.05％-0.1％防腐剂及pH7-9、浓度范围为10-100mmol/L的缓冲液；
所述GPI校准品的主要成分为：0.1％-5.0％电解质、0.5％-5％稳定剂、0.05％-0.1％防腐剂、0-330ng/mlGPI抗原及溶解在预处理的人血清基质中、pH6.5-8.0、浓度为10-100mmol/L的缓冲液。
本发明所用的多克隆抗体。可选自绵羊或兔子等健康的免疫动物，此类抗体效价高成本低，具有一定优势。本发明所用的胶乳颗粒，直径范围为60-300nm，浓度为0.1-5mg/ml。本发明所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳，其表面修饰有功能团，功能团可以是羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基的一种。在本发明的一实施方案中，所用胶乳颗粒优选表面修饰羧基，直径在80-140nm，优选120nm。
本发明所用的包被抗体到胶乳颗粒表面的方法为化学交联法，该方法是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行的，所用的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼、异氰酸酯或其组合：交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，MES、MOPSO、MOPS、HEPES、磷酸盐缓冲液，pH在6.0-8.0之间。
本发明所述电解质选自无机盐类，氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁或其组合，优选氯化钠，浓度在0.1％-5.0％之间。
本发明所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白、葡萄糖、果糖、甘露醇、壳聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠或其组合。
本发明所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠，优选PEG-6000。
本发明所用表面活性剂选自吐温系列、脂肪醇聚乙二醇醚类、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯月桂醚系列或其组合，优选吐温20。
本发明所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、ProClin系列、三嗪类有机化合物等，优选叠氮钠。
本发明所述GPI校准品，包含含量在0-330ng/mlGPI抗原，其中所述GPI校准品1为不含GPI抗原的预处理人血清；GPI校准品2、3、4、5、6为添加不同GPI抗原含量的预处理血清。
本发明所述GPI校准品中的GPI选自从人体体液中提取、纯化而得的天然GPI，纯度≥95％。
本发明试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法定量检测GPI，其原理是：利用化学交联法将特异的羊抗人GPI多克隆抗体包被到胶乳颗粒表面，当被测样本中有GPI抗原时发生抗原抗体免疫反应，形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，形成的复合物可与邻近的胶乳颗粒连接，最终交织成网状引起反应体系浊度的显著变化，保持反应体系中抗体过量时，此时反应后体系浊度的变化与GPI的量成正比，根据GPI校准曲线即可进行定量分析。
在本发明中，人体体液中的GPI与胶乳颗粒包被的羊抗人GPI多克隆抗体发生抗原抗体反应，形成抗原-抗体-胶乳颗粒的复合物，导致浊度上升，测定此浊度在570nm波长处得吸光度，对照校准曲线即可求出样本中GPI的含量。
相较于现有的ELISA法试剂盒，本发明用化学交联法将特异性的羊抗人GPI抗体包被到羧基修饰过的胶乳颗粒表面，并通过添加稳定剂和表面活性剂使胶乳颗粒形成均一稳定的悬浮液，实现均相免疫反应体系，使用简便快速，适应临床快速高通量筛查的要求。
附图说明
图1为本发明所制备试剂盒的灵敏度。
图2为本发明所制备试剂盒的线性图。
图3是位本发明所制备试剂盒与酶联免疫法试剂盒检测临床样本比对的相关性比较。
具体实施方式
实施例1：亲和纯化制备羊抗人GPI多克隆抗体
羊抗人GPI多克隆抗体的制备：
取健康免疫动物，用GPI抗原进行免疫，第一次以抗原加卡介苗和福氏佐剂研匀，注射动物颈淋巴结和皮下肌肉组织，每两周一次，共免疫4-5次，抗原量根据动物的体重增减，免疫最后一次的二周后采血，动物抗人血清用饱和硫酸铵二级沉淀初步分离抗体。
羊抗人多克隆抗体的纯化：
首先，制备亲和纯化所用的分离柱：将10mg高度纯化的GPI抗原固定在HITRAPNHS-活性HP柱(来自AmershamPharmaciaBiotech)上；
其次，上样及洗脱：将初步分离的血清在磷酸盐缓冲液中稀释至2mg/ml，将200ml的血清稀释液流过柱子，然后用50ml的磷酸盐缓冲液洗冲洗柱子，再用35ml的洗脱液洗脱对GPI具有特异亲和力的抗体；
然后，透析纯化：将上述洗脱的特异性抗GPI抗体用另算呀缓冲液透析，并且使用AmiconCentricon离心过滤装置浓缩至3mg/ml，即为亲和纯化的羊抗人GPI多克隆抗体。
实施例2：制备GPIR2试剂
过程分三步：抗体交联、胶乳清洗、胶乳悬浮
抗体交联：将0.5mg上述制备的抗体用5ml0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释后，加入表面修饰羧基，直径120nm的聚苯乙烯胶乳溶液(来自JSR)，再加入5mgEDAC，在37℃反应6小时，加入0.5ml0.1M甘氨酸缓冲液(pH8.5)搅拌1小时终止反应。
胶乳清洗：离心去掉上清以清除多余的抗体、交联剂及交联反应的副产物等，底部沉淀即为包被好的胶乳。用20ml的50mM的甘氨酸缓-NaOH缓冲液洗涤3次。
胶乳悬浮：将20ml同样的甘氨酸-NaOH缓冲液加入到上述沉淀，超声波处理4min，混匀得均已的乳白色胶乳悬浮液，即为R2试剂。
其中，甘氨酸-NaOH缓冲液中含有0.9％氯化钠、0.5％EDTA、0.8％BSA、0.1％吐温20、0.1％叠氮钠，保证胶乳颗粒处于均一稳定的悬浮状态。
实施例3：制备GPIR1试剂
在50mMpH7.2的TRIS-HCL缓冲液中，添加0.9％氯化钠、0.2％吐温20、5％PEG-6000、0.2％BSA、0.5％EDTA、0.1％叠氮钠，搅拌均匀即为R1试剂。
实施例4：制备GPI校准品
在ph7.2、含有50mMTRIS-HCL缓冲物的预处理人血清基质中，加入浓度分别为0、20.625、41.25、82.5、165、330ng/ml的GPI抗原纯品，搅拌均匀，作为GPI多点校准品。此外，预处理的人血清基质中还包含0.9％氯化钠、1％BSA、0.75％EDTA、0.1％叠氮钠。
实施例5：GPI试剂盒的性能检测
1、检测试剂盒的用法：
以日立7080生化分析仪为例：测定波长为570nm，首先加入R1试剂150ul，37℃反应30秒，其后加入GPI校准品3ul，再反应60秒，其后加入R2试剂50ul，测定反应第10秒、70秒的吸光度值A1、A2，计算吸光度差值δA＝A2-A1。每管重复测定2次。将各校准品2次测得的吸光度差值为纵坐标，对应浓度为横坐标，制作“浓度-吸光度差值”校准曲线。取待测样本，同法测定样本的吸光度差值，将其代入校准曲线，即可计算得出待测样本中的GPI含量。
2、灵敏度检测：
以生理盐水为空白样本，稀释人血清样本，配制浓度分别为2、4、6、8、10ng/ml的样本，用上述GPIR1、GPIR2和GPI校准品组成的试剂盒，按照1所述的方法测定10次，计算吸光度均值和标准差(SD)，以样本吸光度-2.6SD大于空白吸光度+2.6SD的样本浓度作为GPI检测试剂盒的灵敏度范围，见图1.如下表1所示，本发明试剂盒的灵敏度能达到2ng/ml。
表1.本发明试剂盒灵敏度检测
0ng/ml 2ng/ml 4ng/ml 6ng/ml 8ng/ml 10ng/ml
1 0.50 1.35 1.95 2.80 4.10 4.20
2 0.30 1.35 2.00 2.60 3.40 4.20
3 0.40 1.40 1.70 2.65 3.30 4.35
4 0.70 1.30 1.90 2.65 3.50 4.15
5 0.65 1.25 1.75 2.50 3.40 4.20
6 0.50 1.30 2.10 2.75 3.50 4.10
7 0.60 1.40 2.05 2.55 3.45 4.45
8 0.60 1.30 2.40 2.70 3.70 4.15
9 0.55 1.05 2.15 3.00 3.40 4.35
10 0.30 1.25 1.85 2.60 3.30 4.20
Mean 0.51 1.30 1.99 2.68 3.51 4.24
SD 0.14 0.10 0.21 0.14 0.24 0.11
Mean+2.6SD 0.87 1.56 2.52 3.05 4.13 4.52
Mean-2.6SD 0.15 1.03 1.45 2.31 2.88 3.95
Limit Line 0.87 0.87 0.87 0.87 0.87 0.87
3、线性范围检测：
筛选GPI浓度约为1000ng/ml的样本，用生理盐水做10个不同比例的稀释，按照1所述的方法检测各浓度，每个浓度的样本重复测定3次，将测定浓度的平均值与理论浓度进行回收率分析，结果显示偏差小鱼10％(见表2)，证明线性能达到1000ng/ml,见图2.
表2.本发明试剂盒线性范围
理论浓度 检测浓度 回收率
稀释比例 【ng/ml】 【ng/ml】 【％】
0/10 0.0 0.0
1/10 100.0 101.0 101.0％
2/10 200.0 208.0 104.0％
3/10 300.0 310.0 103.30％
4/10 400.0 405.0 101.30％
5/10 500.0 521.0 104.20％
6/10 600.0 610.0 101.70％
7/10 700.0 704.0 100.60％
8/10 800.0 798.0 99.80％
9/10 900.0 902.0 100.20％
10/10 1000.0 1040.0 104.00％
4、本发明试剂盒与双抗体夹心法试剂盒检测临床样本的相关性比较
相关性实验所用的ELISA法试剂盒用纯化的抗体包被微孔板制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入GPI、生物素化的抗人GPI抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GPI呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值(OD值)。用本发明的试剂盒与对照试剂盒对80例病人样本同时进行检测，检测结果见附图3，以对照试剂盒检测样本的结果为横坐标，以本发明试剂盒检测结果为纵坐标作回归分析，相关方程为Y＝1.0043X-0.6272，相关系数为R2＝0.999，经过统计学处理结果表明，本方法同ELISA法试剂盒对于临床样本测纸的相关性良好。
以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种胶乳增强免疫比浊法测定人GPI含量的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括GPIR1试剂、GPIR2试剂和GPI校准品；
所述GPIR1试剂包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；
所述GPIR2试剂包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲液；
所述GPI校准品包含防腐剂、电解质、稳定剂、GPI抗原及缓冲液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中抗人GPI多克隆抗体选自绵羊或兔子等健康的免疫动物。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中抗人GPI多克隆抗体通过使用人GPI抗原亲和纯化而获得。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中胶乳颗粒为直径60-300nm、浓度为0.1-5mg/ml的聚苯乙烯胶乳颗粒，直径80-140nm。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：其中胶乳颗粒表面由功能团修饰，该功能团选自羧基、氨基、羟基、酰肼或氯甲基。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：其中抗体包被胶乳颗粒是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行的，所用的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼、异氰酸酯或其组合：交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液，MES、MOPSO、MOPS、HEPES、磷酸盐缓冲液，pH在6.0-8.0之间。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：
所述GPIR1试剂包含占其质量百分比为：0.1％-5.0％电解质、2％-6％促凝剂、0.1％-1％稳定剂、0.1％-1.0％表面活性剂、0.05％-0.1％防腐剂及pH7-9、浓度范围为10-100mmol/L的缓冲液；
所述GPIR2试剂包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒，还包含占其质量百分比为：0.1％-5.0％电解质、0.5％-5％稳定剂、0.1％-1.0％表面活性剂、0.05％-0.1％防腐剂及pH7-9、浓度范围为10-100mmol/L的缓冲液；
所述GPI校准品包含占其质量百分比为：0.1％-5.0％电解质、0.5％-5％稳定剂、0.05％-0.1％防腐剂、0-330ng/mlGPI抗原及溶解在预处理的人血清基质中、pH6.5-8.0、浓度为10-100mmol/L的缓冲液。
8.根据权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于：其中所述的电解质选自无机盐类。
9.根据权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于：其中所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白、葡萄糖、果糖、甘露醇、壳聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠或其组合。
10.根据权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于：其中所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠。
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