CN109061141A - 一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法 - Google Patents

一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法，将待测样品和多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入R1试剂和R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中进行检测；其中，所述的待测样品或所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的R1试剂包含表面活性剂，所述的R2试剂包含偶联有抗体的胶乳微球。本发明采用酶标仪检测免疫颗粒复合物的吸光值，一次可以检测多达96个标本，测定速度快，操作方便，所需试剂量小，设备成本低，普及率高，易于实现高能量检测，适合于一般的医疗机构和不发达地区使用。

Description

一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法
技术领域
本发明涉及一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法。
背景技术
胶乳颗粒增强比浊法（Latex particle-enhanced turbidimetric immunoassay,LETIA）是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。LETIA法通过在高分子乳胶微球表面交联的单克隆抗体，而当抗原与交联有抗体的微球结合后，能够在短时间内迅速聚集在一起，改变反应溶液的吸光度。而且，反应液吸光度的改变与被测抗原的浓度在一定范围内具有线性关系，可用来反映被测抗原的浓度。
此方法相对于其他常用的体液蛋白检测方法有很多优势:LETIA省却了酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，并且稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量；相对胶体金层析法（俗称“金标”）具有更高的灵敏度，可用于定量检测；相比于放射免疫测定（Radioimmunoassay，RIA），则具有更好的稳定性，以及能够避免发射性污染等优点。
目前，LETIA检测试剂所采用的乳胶颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。加入氨基或者羧基等修饰的功能性微球，与抗体通过共价键的形式结合，提高与抗体结合率的同时也为抗体提供了合适的3D结构与抗原进行结合，提升了检测的敏感性和特异性。由于纳米级粒子尺寸属于原子簇和宏观体系的过度区域，具有高比表面积的特性，它的应用加快达到吸附平衡的时间和吸附平衡的稳定性，提高了反应速度和结果的稳定性。LETIA相对传统的免疫比浊方法，解决了对抗体结合的能力不强、临床检测的线性范围窄、干扰因素多、实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。胶乳增强浊度的免疫透射比浊大大提高了检测的灵敏度，有广阔的应用前景。
现有技术方案使用的试剂通常为双试剂，包含R1和R2两种试剂。R1成份为包含表面活性剂的缓冲溶液；R2的主要成份为胱抑素C抗体-胶乳微球复合物。检测使用的样品为无溶血的新鲜血清。
现有技术方案1：
(1）在特定缓冲液体系中加入一定量的表面活性剂，制得R1试剂。将抗人胱抑素C抗体通过化学耦联的方法结合到胶乳微球的表面，形成胱抑素C抗体-胶乳微球复合物，加入适量防腐剂等得到R2试剂。
）将己知浓度的胱抑素C标准品作倍比稀释，得到浓度为原浓度1/6，1/3，1/2，2/3，5/6和原倍的6个标准品。
）将（2）中6个标准品分别先后按比例与R1和R2试剂混合，在恒温、震荡条件下充分反应，生成不溶性免疫复合物。
）用分光光度仪在546nm 波长处检测免疫复合物的吸光值。
）以六个标准品的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
）将待测血清样本先后按比例与R1和R2试剂混合，在恒温、震荡条件下充分反应，生成不溶性免疫复合物，在分光光度仪上检测该免疫复合物吸光值，通过标准曲线求血清样本中胱抑素C的浓度。
现有技术方案2：
(1）在特定缓冲液体系中加入一定量的表面活性剂，制得R1试剂。将抗人胱抑素C抗体通过化学耦联的方法结合到胶乳微球的表面，形成胱抑素C抗体-胶乳微球复合物，加入适量防腐剂等得到R2试剂。
）将己知浓度的胱抑素C标准品作倍比稀释，得到浓度为原浓度1/6，1/3，1/2，2/3，5/6和原倍的6个标准品。
）在全自动生化分析仪（以日立7170为例）上按以下条件设定参数：两点终点法；测定温度：37℃；比色杯光径1.0cm；波长546nm（主）；样品量：3.0ul；试剂R1：240ul；试剂R2：60ul；测光点：16-34；上升反应。
）将（2）中6个标准品和待测样品放入生化分析仪的样品杯中。启动全自动生化仪，执行定标和检测程序。
）全自动生化仪自动给出检测结果。
目前，对免疫颗粒复合物浊度检测的仪器主要是分光光度计和全自动（半自动〕生化分析仪，分光光度计每次只能检测一个样本，而且每次检测完后要清洗比色池，操作烦琐，误差大。生化分析仪操作方便，准确度高，但生化分析仪价格昂贵，维护使用复杂，且每次检测所需试剂量大，检测成本高。
公开了一种复合胶乳粒子包被胱抑素C检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂及校准品，R1试剂为磷酸盐缓冲体系，其组分为pH值为7.2~7.6的磷酸盐缓冲液 30~60mmol/L、分子量为6000~8000的聚乙二醇60~95 mmol/L、乙二胺四乙酸二钠6~13 mmol/L。R2试剂包括羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的两种大小不同的聚苯乙烯胶乳粒子致敏颗粒；还包括乳胶稀释液以及封闭液。但是，该专利采用的检测设备也为全自动生化仪。
公开了一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法，其包括试剂R1、试剂R2及校准品，试剂R1的组分为：Tris缓冲液0.01~0.05mol/L,PEG6000 10~40g/L，NaN3 0.5~1.5 g/L，氯化钠10~20 g/L，pH值8.0~8.5。R2试剂的组分为：Tris缓冲液0.01~0.02mol/L，羊抗人胱抑素C多克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒0.5~3 g/L。但是，该专利采用的检测设备也为全自动生化仪。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够使用酶标仪进行检测的胶乳增强免疫透射比浊检测方法。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法，将待测样品和多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入R1试剂和R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中进行检测；其中，所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的R1试剂包含表面活性剂，所述的R2试剂包含偶联有抗体的胶乳微球。
优选地，所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27。
优选地，所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为2~8微升。
进一步优选地，所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为3~6微升。
优选地，所述的胶乳微球为纳米级的聚苯乙烯胶乳微球。
进一步优选地，所述的胶乳微球的平均粒径为50~150nm。
优选地，所述的偶联有抗体的胶乳微球的制备方法为将所述的胶乳微球用缓冲液稀释后，采用EDC活化，经清洗后，加入抗体进行偶联使得所述的抗体结合到所述的胶乳微球的表面制得所述的偶联有抗体的胶乳微球。
进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时的缓冲液为磷酸缓冲液或Tris。
进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，所述的胶乳微球与所述的缓冲液的投料质量比为1：100~150。
进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，所述的胶乳微球与所述的EDC的投料质量比为1.5~2：1。
进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，采用磷酸缓冲液或Tris进行所述的清洗。
进一步优选地，制备所述的偶联有抗体的胶乳微球时，所述的胶乳微球与所述的抗体的投料质量比为1：1~5。
优选地，所述的抗体包括但不限于抗人胱抑素C抗体、C反应蛋白抗体、视黄醇结合蛋白抗体、脂肪酸结合蛋白抗体、载脂蛋白A1抗体、载脂蛋白B抗体中的一种或多种。
优选地，所述的R1的组分为：浓度为15~30g/L的所述的表面活性剂、浓度为0.01~0.1mmol/L的缓冲液。
进一步优选地，所述的R1的组分为：浓度为18~28g/L的所述的表面活性剂、浓度为0.03~0.08mmol/L的缓冲液。
优选地，所述的R2试剂的组分为：浓度为0.2~2.0g/L的所述的偶联有抗体的胶乳微球、质量浓度为0.01~0.1%的防腐剂、浓度为0.01~0.1mol/L的缓冲液。
进一步优选地，所述的R2试剂的组分为：浓度为0.5~1.5g/L的所述的偶联有抗体的胶乳微球、质量浓度为0.02~0.08%的防腐剂、浓度为0.03~0.08mmol/L的缓冲液。
进一步优选地，所述的R1试剂中的表面活性剂为聚乙二醇6000；所述的R1试剂中的缓冲液为磷酸缓冲液或Tris；所述的R2试剂中的防腐剂为NaN3或Procline300；所述的R2试剂中的缓冲液为磷酸缓冲液或Tris。
优选地，所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法包括如下步骤：
步骤（1）、配制所述的R1试剂；
步骤（2）、配制所述的R2试剂；
步骤（3）、配制所述的多个不同浓度的标准品；
步骤（4）、将所述的待测样品和所述的多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入所述的R1试剂和所述的R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中，在30~40℃下恒温震荡1~5min，生成不溶性免疫复合物；步骤（5）、所述的酶标仪自动在546nm波长处检测各个所述的微孔中免疫复合物的吸光值，然后所述的酶标仪根据所述的多个不同浓度的标准品的吸光值拟合标准曲线，并自动根据所述的标准曲线计算所述的待测样品中待测物的浓度。
进一步优选地，步骤（4）的反应温度为33~38℃，反应时间为2~4min。
本发明提供了在胶乳增强免疫透射比浊中应用酶标仪进行检测的方法，该方法是以粒径为纳米级的聚苯乙烯胶乳微球为载体，将抗体耦联到胶乳微球表面，形成抗体-胶乳微球复合物。由于胶乳微球是高分子微球，具有一定的3D表面结构，表面可以结合大量的抗体，将胶乳粒子包裹起来，当免疫凝聚发生时，胶乳微球表面的抗体与抗原结合，抗原又和其他胶乳微球表面的抗体结合，这样，抗体-胶乳微球复合物和抗原发生连锁聚集反应，大量的胶乳微球通过免疫反应一层一层聚集在一起，形成不溶性复合物，胶乳微球复合物的粒径发生明显改变，其透射性也发生明显变化。采用具有一定透射波长的酶标仪检测这种不溶性免疫复合物吸光值的变化，吸光值的增大与胶乳微球聚集程度成正比，也与抗原量成正比。用酶标仪检测某种己知浓度的抗原与抗体胶乳反应后的吸光值，以该抗原浓度值为横坐标，对应的吸光值为纵坐标绘制标准曲线，将样本中该抗原与相应抗体-胶乳微球复合物反应后的吸光值代入标准曲线，即可推算样本中该抗原的浓度。因此采用胶乳增强免疫透射比浊检测的产品都可采用一定波长的酶标仪进行检测。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明采用酶标仪检测免疫颗粒复合物的吸光值，一次可以检测多达96个标本，测定速度快，操作方便，所需试剂量小，设备成本低，普及率高，易于实现高能量检测，适合于一般的医疗机构和不发达地区使用。
附图说明
附图1为实施例1的标准曲线；
附图2为实施例1的测试曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用试剂均可市购获得。
实施例1：人血清中胱抑素C检测，具体步骤如下：
（1）、配制R1试剂，其中，聚乙二醇6000的浓度为20g/L，Tris缓冲液的浓度为0.05mmol/L。（2）、将0.04g的100nm的聚苯乙烯乳胶微球用5g的Tris缓冲液稀释后加入0.025g 的EDC活化、用Tris缓冲液清洗后加入0.1g的抗人胱抑素C抗体进行耦联使其结合到胶乳微球的表面，形成胱抑素C抗体-胶乳微球复合物，即偶联有抗体的胶乳微球；然后配制R2试剂，其中，偶联有抗体的胶乳微球的浓度为1g/L、NaN3的质量浓度为0.05%，Tris缓冲液的浓度为0.05mmol/L。
（3）、将己知浓度的胱抑素C标准品作倍比稀释，得到浓度为原浓度1/6，1/3，1/2，2/3，5/6和原倍（浓度为6mg/L）的6个标准品。
（4）、将（3）中的6个标准品和待测样品分别先后与R1和R2试剂按照4ul:60ul:100ul的比例加在96孔板的微孔中，放入酶标仪，在恒温（37℃）、震荡条件下充分反应2min，生成不溶性免疫复合物。
）酶标仪自动在546nm 波长处检测96孔板各微孔中免疫复合物的吸光值。酶标仪根据标准品结果拟合标准曲线，并进一步自动计算待测样品中胱抑素C的浓度。其中，拟合标准曲线参见图1，测试曲线参见图2。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：将待测样品和多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入R1试剂和R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中进行检测；其中，所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：10~20：20~30，所述的R1试剂包含表面活性剂，所述的R2试剂包含偶联有抗体的胶乳微球。
2.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的待测样品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27，所述的标准品、所述的R1试剂、所述的R2试剂的投料体积比为1：13~17：23~27。
3.根据权利要求1或2所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为2~8微升。
4.根据权利要求3所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的待测样品或所述的标准品的投料体积为3~6微升。
5.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的胶乳微球为纳米级的聚苯乙烯胶乳微球。
6.根据权利要求1或5所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的偶联有抗体的胶乳微球的制备方法为将所述的胶乳微球用缓冲液稀释后，采用EDC活化，经清洗后，加入抗体进行偶联使得所述的抗体结合到所述的胶乳微球的表面制得所述的偶联有抗体的胶乳微球。
7.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的抗体为抗人胱抑素C抗体、C反应蛋白抗体、视黄醇结合蛋白抗体、脂肪酸结合蛋白抗体、载脂蛋白A1抗体、载脂蛋白B抗体中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的R1的组分为：浓度为15~30g/L的所述的表面活性剂、浓度为0.01~0.1mmol/L的缓冲液；
所述的R2试剂的组分为：浓度为0.2~2.0g/L的所述的偶联有抗体的胶乳微球、质量浓度为0.01~0.1%的防腐剂、浓度为0.01~0.1mol/L的缓冲液。
9.根据权利要求8所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：所述的R1试剂中的表面活性剂为聚乙二醇6000；所述的R1试剂中的缓冲液为磷酸缓冲液或Tris；所述的R2试剂中的防腐剂为NaN3或Procline300；所述的R2试剂中的缓冲液为磷酸缓冲液或Tris。
10.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫透射比浊检测方法，其特征在于：其包括如下步骤：
步骤（1）、配制所述的R1试剂；
步骤（2）、配制所述的R2试剂；
步骤（3）、配制所述的多个不同浓度的标准品；
步骤（4）、将所述的待测样品和所述的多个不同浓度的标准品分别加入酶标仪的孔板的不同微孔中，然后在各个所述的微孔中先后加入所述的R1试剂和所述的R2试剂，将所述的孔板放入所述的酶标仪中，在30~40℃下恒温震荡1~5min，生成不溶性免疫复合物；
步骤（5）、所述的酶标仪自动在546nm波长处检测各个所述的微孔中免疫复合物的吸光值，然后所述的酶标仪根据所述的多个不同浓度的标准品的吸光值拟合标准曲线，并自动根据所述的标准曲线计算所述的待测样品中待测物的浓度。
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