CN110988348B - 游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
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Abstract
本申请涉及一种游离前列腺特异性抗原检测试剂盒及其制备方法。试剂盒包括第一试剂、第二试剂，可选地还包括质控品和/或校准品。第一试剂包含表面活性剂和缓冲液，第二试剂包含包被有抗体的纳米颗粒和缓冲液。该试剂盒利用样本中的游离前列腺特异性抗原与第二试剂中的抗体反应。样本中游离前列腺特异性抗原浓度越高，抗体与包被有抗体的纳米颗粒反应产生的浊度变化越大，由此可建立校准曲线，从而定量测定未知样本中游离前列腺特异性抗原浓度。
Description
技术领域
本申请属于临床体外诊断、医学免疫学领域，涉及一种免疫检测试剂。更进一步地，本申请涉及一种fPSA检测试剂盒。
背景技术
人前列腺特异抗原(Prostate Specific Antigen，以下简称PSA)是由前列腺腺泡和导管的上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白，分子量约34KD。PSA在功能上属于类激肽释放酶的一种丝氨酸蛋白酶，参与精液的液化过程，是临床常规用于前列腺良性与恶性疾病的诊断、鉴别、前列腺癌患者术后随访的重要指标。
正常生理情况下，PSA通过导管分泌到精液中。PSA在精液中的浓度高于在血清中浓度的100万倍。在前列腺的腺泡、导管腔与血液循环系统之间，存在着明显的组织屏障。当患有前列腺疾病时，组织屏障就会受到不同程度的破坏。特别是患有前列腺癌时，由于肿瘤细胞的异常生长会使这一自然屏障遭受严重破坏，PSA就会大量渗漏于血中，造成血清PSA水平的大幅度升高。
研究证明，血循环中PSA以两种形式存在：结合型PSA(cPSA)大约占85％以上，游离型PSA(即fPSA)占15％左右，两者之和为总PSA(tPSA)。
临床中，通常把tPSA>4ng/ml作为筛选前列腺癌的临界值；把tPSA结果在4至10ng/ml之间称为灰色区域，前列腺癌与前列腺增生均有可能；而当tPSA>10ng/ml时，前列腺癌可能性极大。
对于fPSA/tPSA比值，各文献报道不一致。有些以0.16为临界值，也有以0.19或0.25为临界值。当血清tPSA在灰色区域时，fPSA/tPSA显得非常重要，fPSA/tPSA大于临界值时，前列腺癌的可能性小，当fPSA/tPSA值小于临界值时，前列腺癌的可能性较大。
随着医疗专业人员和患者意识到fPSA在诊断前列腺癌的潜在价值，实验室检验量激增，需要本领域提供更快、更准、更有效的检测方法，帮助医生和患者更早的得到检测结果。
目前fPSA通常用免疫学方法进行测定。常用检测方法有：
(1)化学发光免疫定量检测，本法采用全自动控制系统，以吖啶酯标记法，微磁性颗粒PSA结合的固相试剂和单抗PSA液相试剂，直接发光进行定量检测的技术。该技术灵敏度高、特异性强，但仪器、试剂昂贵，无法基层筛查；
(2)酶标测定法(EIA)，通常采用双抗夹心法对f-PSA、c-PSA、t-PSA进行测定。所采用的抗体为针对PSA上不同表位的单克隆抗体，采用的单克隆抗体不同，可以检测PSA的不同形式。该法缺点是重复性差，对操作人员素质要求较高；
(3)放射免疫测定法(RIA)，存在环境污染问题；
(4)金标记分析，该法具有使用方便、结果易读、反应迅速等优点，但准确性较差。
本申请所要解决的问题是克服上述现有试剂所存在的缺陷，提供一种新的胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒，检测样本中(例如血清或血浆)fPSA的含量，提高检测速度、降低操作复杂性、尽快得到可靠结果。
发明内容
根据本申请的一方面，提供了一种检测试剂，其包含第一抗体和第二抗体；所述第一抗体为抗-抗原抗体；所述第二抗体为抗-复合物抗体；并且所述第二抗体不单独结合所述的抗原，所述复合物是所述第一抗体和所述抗原形成的复合物。
在一些实施方案中，所述抗原是人fPSA。
在一些实施方案中，所述第一抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段；所述第二抗体为抗原结合片段。单克隆抗体源自：鼠、兔、禽、羊、重组抗体。所述的抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体。
根据本申请的另一方面，提供了一种fPSA检测试剂盒，其包含第一试剂和第二试剂。
在一些实施方案中，第一试剂包含表面活性剂和缓冲液。
在一些实施方案中，第二试剂包含：
-包被有第一抗体的第一纳米微球、
-包被有第二抗体的第二纳米微球、和
-缓冲液。
在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液各自独立地选自：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液(也作2-吗啉乙磺酸缓冲液)、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液和氯化铵缓冲液中的一种或更多种。
在一些实施方案中，缓冲液浓度为10-500mM，浓度优选20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、以及前述任意两个数值之间的范围；作为示例，缓冲液浓度为20mM、30mM、40mM、50mM、以及前述任意两个数值之间的范围。
在一些实施方案中，缓冲液的pH值为6至8，作为示例，pH是7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5以及前述任意两个数值之间的范围。
在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型可以相同也可以不同。
在一些实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度可以相同也可以不同。
在一些优选实施方案中，第一试剂和第二试剂中的缓冲液类型相同；且第一试剂和第二试剂中的缓冲液浓度不同。
在一个具体实施方案中，第一试剂的缓冲液是50mM HEPES缓冲液；在一个具体实施方案中，第二试剂的缓冲液是20mM甘氨酸缓冲液。本领域技术人员可以理解，随着缓冲液类型、浓度等因素，缓冲液的pH值可以有所不同。
在一些实施方案中，所述的第一抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段；所述的第二抗体为抗原结合片段。单克隆抗体源自：鼠、兔、禽、羊、重组抗体。抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体。
在具体的实施方案中，所述的第二抗体不建议采用分子量较大的完整的单克隆抗体。在具体的实施方案中，所述的第二抗体是分子量比单克隆抗体小的抗原结合片段，例如单域抗体(源自骆驼科动物的抗体，例如羊驼)。
在一些具体的实施方案中，所述第二抗体通过间隔臂分子连接至所述第二纳米微球。间隔臂分子是戊二醛或惰性载体蛋白。惰性载体蛋白选自：血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白、多聚赖氨酸。
在一些具体的实施方案中，当第一抗体是单克隆抗体时，第二抗体是单域抗体。
在另一些具体的实施方案中，当第一抗体是抗原结合片段时，第二抗体是抗原结合片段(段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体)。
在一些实施方案中，第一试剂包含选自如下的一种或更多种：
-0.1至0.5M NaCl、
-0.05至0.2％(w/v)防腐剂、
-0.05至0.2％(w/v)BSA、
-0.5至2％(w/v)PEG2000-PEG80000(例如6000)、和
-0.1％-0.5％(w/v)AEO7。
应当理解，尽管本申请中公开了试剂中各个组分的具体浓度，技术人员允许将试剂制备成不同的浓缩或稀释形式，因此试剂的浓缩和稀释形式仍然落入本申请的范畴。
根据需要，根据本申请的fPSA检测试剂盒还包括质控品和/或校准品。校准品主要用于校准测量系统、评价测量程序或为待测样本赋值。因此，所述校准品包含已知浓度的fPSA，校准品的值甚至可以追溯至参考物质或者追溯至参考方法(NIBSC 96/668)。本领域技术人员可以根据待测物质的浓度范围，采用本领域常用的方法自行制备适当浓度的校准品，也可以使用市售校准品(例如，fPSA纯度国家标准品150544-200702)、或制造商提供的工作校准品。
在一些具体实施方案中，根据本申请的fPSA检测试剂盒还包括若干不同浓度的校准品，例如但不限于2个、3个、4个、5个甚至更多浓度的校准品。
在一个实施方案中，本申请的fPSA检测试剂盒包括6个不同浓度的校准品。校准品含有fPSA(例如但不限于0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml和10ng/ml)、缓冲液，适当时还含有稳定剂(如BSA)、或防腐剂(如NaN3)等。
校准品可制备成液体形式、干粉或冻干粉形式。
校准品中的缓冲液选自：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液和氯化铵缓冲液中的一种或更多种；缓冲液浓度为10mM至500mM。
在一些实施方案中，第二试剂包含：
-20mM pH为7.4的甘氨酸缓冲液、
-0.25％纳米微球(第一纳米微球和第二纳米微球)、和
-0.1％NaN3；
纳米微球的平均粒径为450nm。
根据本申请的另一方面，提供了一种纳米微球制备方法，包括步骤：
第一步骤，其包括：
1.1)将第一纳米微球进行活化，得到活化的纳米微球；
1.2)将第一抗体偶联至所述活化的纳米微球，得到第一抗体-纳米微球偶联物；
1.3)对步骤1.2)得到的纳米微球进行封闭，
第二步骤，其包括：
2.1)任选，将第二抗体与间隔臂分子进行交联，得到第二抗体与间隔臂分子复合物；
2.2)将所述第二抗体(或者步骤2.1所得的复合物)偶联至第二纳米微球，得到第二抗体-纳米微球偶联物；
2.3)对步骤2.2)得到的纳米微球进行封闭，
第三步骤：将第一步骤和第二步骤所得的纳米微球混合。
在另一些实施方案中，第一步骤和第二步骤是并行的、或者二者的顺序可互换。
在一些实施方案中，采用选自如下的试剂进行活化：4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠、碳酸钠、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺、已二氨、3,3'-二氨丙基亚胺和戊二醛的一种或其组合。
在一些实施方案中，在步骤1.1)中：用乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺将第一纳米微球进行活化，得到活化的纳米微球。优选地，乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺溶于20mM pH7.0HEPES缓冲液中，浓度为1mg/ml。优选地，在35至40℃将纳米微球进行活化。所述活化的纳米微球的浓度为5mg/ml。
在具体的实施方案中，在步骤1.1)中：将溶于20mM pH 7.0HEPES缓冲液中的5mg/ml纳米微球加入0.1mg/ml乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺中，在室温下活化0.5至1小时，得到活化的纳米微球。
在一些实施方案中，在步骤1.2)中：将第一抗体偶联至所述活化的纳米微球，得到第一抗体-纳米微球偶联物。所述第一抗体为鼠抗人fPSA单克隆抗体。在一些实施方案中，将溶于20mM pH 7.0HEPES缓冲液中的0.1mg/ml鼠抗人fPSA单克隆抗体加入至所述活化的纳米微球，在37℃下反应2至3小时，从而将鼠抗人fPSA单克隆抗体偶联至活化的纳米微球，得到第一抗体-纳米微球偶联物。
在一些实施方案中，在步骤1.3)中：用含有BSA和吐温20的封闭液对步骤1.2)的产物进行封闭，从而将纳米微球表面没有结合fPSA单克隆抗体的部分封闭掉。优选地，用含有1％BSA和1％吐温20的封闭液将步骤1.2)得到的微球封闭2小时。
在一些实施方案中，在步骤1.3)之后，将得到的纳米微球进行离心，并重悬于前述缓冲液中，优选20mM pH 7.4HEPES中。优选地，使纳米微球的浓度为0.25％，任选地还可以加入防腐剂，例如0.1％NaN3。
在一些实施方案中，在步骤2.1)中，将第二抗体与戊二醛(或惰性蛋白)进行交联，得到活化的第二抗体戊二醛(或惰性蛋白)复合物。在一些具体的实施方案中，戊二醛溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中，浓度为0.1mg/ml。优选地，在20至30℃进行交联。所述第二抗体的浓度为0.1mg/ml。在具体的实施方案中，在步骤2.1)中，将溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中的0.1mg/ml第二抗体加入0.1mg/ml戊二醛中，在18-25℃下活化2至3小时，得到第二抗体戊二醛复合物。
在一些实施方案中，在步骤2.2)中，将第二抗体戊二醛复合物偶联至第二纳米微球，得到第二抗体-纳米微球偶联物。所述第二抗体为单域抗体，可特异性识别第一抗体和fPSA的复合物(但不识别fPSA)。在一些实施方案中，将溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中的第二抗体戊二醛复合物加入至第二纳米微球，在18-25℃下反应2至3小时，从而将第二抗体偶联至第二纳米微球，得到第二抗体-纳米微球偶联物。
在一些实施方案中，在步骤2.3)中，用含有BSA和吐温20的封闭液对步骤2.2)的产物进行封闭，从而将纳米微球表面没有结合fPSA单克隆抗体的部分封闭掉。优选地，用含有1％BSA和1％吐温20的封闭液将步骤2.2)得到的微球封闭2小时。
在一些实施方案中，在步骤2.3)之后，将得到的纳米微球进行离心，并重悬于前述缓冲液中，优选20mM pH 7.4HEPES中。优选地，使纳米微球的浓度为0.25％，任选地还可以加入防腐剂，例如0.1％NaN3。
在一些实施方案中，在第三步骤中，将第一抗体-纳米微球和第二抗体-纳米微球进行混合，使得两者按质量比为1:4至1:1，例如1：4、1：3.5、1：3、1：2.5、1：2、1：1.5、1:1、以及上述任意值之间的范围。第三步骤所得到的混合物在本申请的检测试剂盒中作为第二试剂。
在一些实施方案中，纳米微球为羧基或氨基修饰的微球。
根据本申请的又一方面，提供一种结合有fPSA相关抗体的纳米微球，其是通过本申请的制备方法获得的。
根据本申请的再一方面，提供一种检测试剂，其包含上述纳米微球。
在具体的实施方案中，提供一种检测试剂，其包含第一抗体-纳米微球和第二抗体-纳米微球。
根据本申请的又一方面，提供上述第一抗体-纳米微球偶联物和上述第二抗体-纳米微球偶联物联合用于制备试剂的用途。
附图说明
图1：本申请方法和对照方法所制备的试剂之间标准曲线的比较。■本申请方法；●对照方法1；▲对照方法2；▼对照方法3。
图2：本申请试剂盒与化学发光免疫分析法的血清测值的相关性。
具体实施方式
为了使本申请易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本申请。除非另有指明，“％”表示质量/体积。以下提供了本申请实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制。与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本申请的技术方案。
实施例
实施例1：fPSA检测试剂盒的制备
1.第一试剂:
2.第二试剂制备过程如下：
2.1第一抗体-纳米微球制备：
1)用20mM HEPES缓冲液(pH 7.0)在18-25℃下溶解乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，至乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的终浓度为1mg/ml；
2)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在18-25℃下稀释10ml 450nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计0.5％；
3)加入用20mM HEPES溶液(pH 7.0)溶解的10ml 1mg/ml的EDAC溶液，37℃搅拌反应0.5h，得到活化的纳米微球；
4)用10ml 20mM pH 7.0HEPES缓冲液中稀释鼠抗人fPSA单克隆抗体至0.1mg/ml，将其加入至上述活化的纳米微球，37℃搅拌反应2h，得到第一抗体-纳米微球偶联物；
5)加入20ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液),37℃搅拌反应2h；
6)离心，弃上清，加入400ml 20mM HEPES溶液(pH 7.4)得到0.25％胶乳，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得第一抗体-纳米微球。
2.2第二抗体-纳米微球制备：
1)用20mM碳酸缓冲液(pH 9.0)在18-25℃下溶解戊二醛，至戊二醛终浓度为0.1mg/ml；
2)用20mM碳酸溶液(pH 9.0)在18-25℃下稀释4ml浓度为5mg/ml的第二抗体，使第二抗体终浓度为0.1mg/ml；
3)将步骤2)得到的第二抗体溶液缓慢滴入步骤1)获得的戊二醛溶液中，于18-25℃不断搅拌，全部滴加完毕后，再搅拌3h；
4)将步骤3)得到的溶液置于截留分子量14000的透析袋中，在20mM pH9.0碳酸缓冲液中进行透析，除去未交联的反应物，得到第二抗体戊二醛复合物；
5)用20mM碳酸溶液(pH 9.0)在18-25℃下稀释10ml 450nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计0.5％；
6)将第二抗体戊二醛复合物和胶乳混匀，18-25℃反应3h，再加入5ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液)封闭2h；
7)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤6)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得第二抗体-纳米微球。
2.3将制得的第一、第二抗体-纳米微球按体积比1：1比例混合，得到第二试剂。
3.参考校准品的制备：
3.1参考校准品的缓冲液基质成分如下：
3.2按参考校准品所需要浓度将fPSA纯品加入上述缓冲液基质中，制得10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml浓度的fPSA参考校准品。
实施例2：对照制备方法1(两种抗体混合后，共同包被到微球上)
1.第一试剂的制备同实施例1。
2.第二试剂制备过程如下：
1)用20mM HEPES缓冲液(pH 7.0)在18-25℃下溶解乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，至乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的终浓度为1mg/ml；
2)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在18-25℃下稀释10ml 450nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计0.5％；
3)加入用20mM HEPES溶液(pH 7.0)溶解的10ml 1mg/ml的EDAC溶液，37℃搅拌反应0.5h，得到活化的纳米微球；
4)用5ml 20mM pH 7.0HEPES缓冲液分别将第一抗体、第二抗体稀释至0.1mg/ml并混合均匀，将其加入至上述活化的纳米微球，37℃搅拌反应2h；
5)加入20ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液),37℃搅拌反应2h；
6)离心，弃上清，加入400ml 20mM HEPES溶液(pH 7.4)得到0.25％胶乳，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得第二试剂。
3.参考校准品的制备：同实施例1。
实施例3：对照制备方法2(无第一抗体)
1.第一试剂的制备同实施例1。
2.第二试剂制备过程如下：
1)用20mM碳酸缓冲液(pH 9.0)在18-25℃下溶解戊二醛，至戊二醛终浓度为0.1mg/ml；
2)用20mM碳酸溶液(pH 9.0)在18-25℃下分别稀释2ml浓度为5mg/ml的第二抗体，第二抗体终浓度为0.1mg/ml，并混合均匀；
3)将步骤2)的抗体溶液缓慢滴入步骤1)获得的戊二醛溶液中，于18-25℃不断搅拌，全部滴加完毕后，再搅拌3h；
4)将步骤3)得到的溶液置于截留分子量14000的透析袋中，在20mM pH9.0碳酸缓冲液中进行透析，除去未交联的反应物，得到抗体戊二醛复合物；
5)用20mM碳酸溶液(pH 9.0)在18-25℃下稀释10ml 450nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计0.5％；
6)将抗体戊二醛复合物和胶乳混匀，18-25℃反应3h，再加入5ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液)封闭2h；
7)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤6)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得第二试剂。
3.参考校准品的制备：同实施例1。
实施例4：对照制备方法3(第一抗体和第二抗体互换包被形式)
1.第一试剂的制备同实施例1。
2.第二试剂制备过程如下：
2.1第一抗体-纳米微球制备：
1)用20mM碳酸缓冲液(pH 9.0)在18-25℃下溶解戊二醛，至戊二醛终浓度为0.1mg/ml；
2)用20mM碳酸溶液(pH 9.0)在18-25℃下稀释4ml浓度为5mg/ml的第一抗体，使第一抗体终浓度为0.1mg/ml；
3)将步骤2)得到的第一抗体溶液缓慢滴入步骤1)获得的戊二醛溶液中，于18-25℃不断搅拌，全部滴加完毕后，再搅拌3h；
4)将步骤3)得到的溶液置于截留分子量14000的透析袋中，在20mM pH9.0碳酸缓冲液中进行透析，除去未交联的反应物，得到第一抗体戊二醛复合物；
5)用20mM碳酸溶液(pH 9.0)在18-25℃下稀释10ml 450nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计0.5％；
6)将第一抗体戊二醛复合物和胶乳混匀，18-25℃反应3h，再加入5ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液)封闭2h；
7)离心，弃上清，用20mM HEPES溶液(pH 7.0)稀释步骤6)得到的胶乳至0.25％，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得第一抗体-纳米微球。
2.2第二抗体-纳米微球制备：
1)用20mM HEPES缓冲液(pH 7.0)在18-25℃下溶解乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺，至乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺的终浓度为1mg/ml；
2)用20mM HEPES溶液(pH 7.0)在18-25℃下稀释10ml 450nm按重量计10％的胶乳溶液，使胶乳浓度为按重量计0.5％；
3)加入用20mM HEPES溶液(pH 7.0)溶解的10ml 1mg/ml的EDAC溶液，37℃搅拌反应0.5h，得到活化的纳米微球；
4)用10ml 20mM pH 7.0HEPES缓冲液中稀释第二抗体至0.1mg/ml，将其加入至上述活化的纳米微球，37℃搅拌反应2h，得到第二抗体-纳米微球偶联物；
5)加入20ml封闭液(含1％BSA和1％吐温20的溶液),37℃搅拌反应2h；
6)离心，弃上清，加入400ml 20mM HEPES溶液(pH 7.4)得到0.25％胶乳，并加入0.1％防腐剂，超声分散后得第二抗体-纳米微球。
2.3将制得的第一、第二抗体-纳米微球按体积比1：1比例混合，得到第二试剂。
3.参考校准品的制备：同实施例1。
实施例5：fPSA检测试剂盒测定步骤
表1.本申请的测定步骤
以校准品浓度为横轴，相应的△OD800为纵轴，采用非线性拟合，如spline绘制出标准曲线，见图1。
采用本申请制备方法所制备的试剂与对照方法所制备的试剂绘制的标准曲线相比，本申请的试剂定标吸光度变化较大，灵敏度较好，线性较好。
实施例6：fPSA检测试剂的线性和最低检测限
1.线性实验：
采用本领域技术人员已知的方法，将某一高浓度fPSA样本做倍比稀释。然而，采用本申请方法所制备的试剂盒测定稀释后的浓度，测定三次求平均值，与理论浓度相比较，计算其线性偏差。
表2.线性偏差
从表2可以看出本申请试剂盒线性范围可达0.67-10ng/ml。对照试剂盒按实施例2线性范围可达2-10ng/ml，低值线性不及实施例1。对照试剂盒按实施例3、实施例4几乎没有反应信号，无法用于线性检测。
申请人出乎意料地发现，在实施例4中虽然第一抗体和第二抗体仅仅是互换了包被方法，但是却检测不到反应信号。不限于具体理论，但是可以尝试性理解为，当第一抗体和抗原形成复合物后，要想识别其中的表位，采用较大的抗体则由于受到空间位阻而难以结合。申请人意外地注意到，当采用较小分子量的抗体(或抗原结合片段)时(例如单域抗体)并连接间隔臂分子(戊二醛、惰性载体蛋白)，则能够接触到预期的表位并实现结合。
2.最低检测限：
采用本领域技术人员已知的方法，将空白液和同一份用生理盐水进行稀释的几个低浓度样品，重复测定15次，读取吸光度变化量。然后计算出扣除空白吸光度后的各样品的吸光度值，计算均值，标准偏差。采用99.7％的可能性来计算最低检测限。将每个样本的均值减去3倍的各自的标准偏差，然后与空白液的3倍的标准偏差比较，如果前者高于后者，我们就认定有99.7％的可能性出现的最小吸光度大于空白吸光度，能定量的报告结果。测定结果如表3。
表3.最低检测限测试数据
| ng/ml | 生理盐水 | 血清样本1 | 血清样本2 | 血清样本3 |
| 1 | -0.02 | 0.02 | 0.06 | 0.12 |
| 2 | 0.00 | 0.04 | 0.05 | 0.07 |
| 3 | 0.00 | 0.03 | 0.07 | 0.11 |
| 4 | 0.01 | 0.03 | 0.03 | 0.09 |
| 5 | -0.01 | 0.03 | 0.07 | 0.12 |
| 6 | -0.01 | 0.03 | 0.07 | 0.07 |
| 7 | 0.00 | 0.04 | 0.08 | 0.07 |
| 8 | 0.00 | 0.04 | 0.04 | 0.08 |
| 9 | -0.01 | 0.02 | 0.06 | 0.10 |
| 10 | 0.01 | 0.04 | 0.06 | 0.09 |
| 11 | 0.00 | 0.04 | 0.05 | 0.07 |
| 12 | 0.00 | 0.03 | 0.07 | 0.11 |
| 13 | 0.01 | 0.03 | 0.03 | 0.09 |
| 14 | -0.01 | 0.03 | 0.07 | 0.12 |
| 15 | -0.01 | 0.03 | 0.07 | 0.07 |
| 均值 | 0.00 | 0.03 | 0.06 | 0.09 |
| sd | 0.009486833 | 0.007888106 | 0.015238839 | 0.019888579 |
| cv％ | 24.65033243 | 25.97529421 | 21.61802013 | |
| 3sd | 0.023664319 | 0.045716518 | 0.059665736 | |
| M+3sd | 0.025793832 | |||
| M-3sd | 0.008335681 | 0.012950149 | 0.032334264 |
由表3得知，样本浓度0.09ng/ml时，测定均值减去3倍标准偏差后结果高于生理盐水加上3倍标准差，且此时CV％接近于20％，因此本申请检测试剂的最低检测限为0.09ng/ml。
对照试剂盒按实施例2检测限在1.5ng/ml，检测限不及实施例1。对照试剂盒按实施例3、实施例4几乎没有反应信号，无法用于检测限检测。
实施例7：本申请的fPSA检测试剂与化学发光免疫分析法测值的相关性
分别采用本申请的fPSA检测试剂盒与现有技术中的化学发光免疫分析法，对血清样本进行检测。所得的测定值进行比较(见图2)，并进行回归分析，获知相关性R2＝0.979，y＝0.9702x+0.2228。显示出本方法与化学发光免疫分析法在血清fPSA测定方面具有良好的相关性。
本申请的的构思是：第二试剂包含两种抗体，第一抗体和第二抗体。第一抗体可结合样本中的fPSA，形成第一抗体-抗原复合物，第二抗体不结合fPSA，但可以特异性结合第一抗体-抗原复合物。因此，纳米微球上的抗体与样本中fPSA反应形成网状复合物，在700nm下检测反应产生的吸光度，吸光度的实际改变与样本fPSA浓度成正比。绘制出校准曲线后可以快速有效的推算出样本中fPSA的含量。
本申请的主要优点是：
(1)第一组试剂中含有表面活性剂、促聚剂，两者的优化比例可以提高反应吸光度，同时降低非特异性反应。
(2)第二组试剂含有第一抗体和第二抗体。第二抗体可特异性结合第一抗体-抗原复合物，可以直接反应产生网状复合物，产生吸光度信号，不必采用竞争法，提高了反应信号。
(3)利用胶乳增强免疫比浊的方法原理，均相反应，反应时间短，10分钟之内可出结果。
(4)操作简单；对仪器设备要求不高，没有环保和操作人员自身防护等问题。而目前市场上还未出现胶乳增强免疫透射比浊法测定人血清或血浆中fPSA浓度的试剂盒，与其他测定方法比较，本方法简便快速、灵敏可靠，普通自动或半自动生化分析仪就可，有较大应用范围和实用价值。
以上显示和描述了本申请的基本原理、主要特征和本申请的优点。本申请不受上述实施例的限制。在不脱离本申请精神和范围的前提下本申请还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本申请范围内。
Claims (22)
1.一种游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其包含：
第一试剂，
第二试剂；和
其中，
所述第一试剂包含：
-按w/v计0.01％至3％表面活性剂、
-按w/v计0.05至0.2％稳定剂、
-按w/v计0.05至0.2％防腐剂、和
-10mM至500mM缓冲液pH 6至8；
所述第二试剂包含：
-包被有第一抗体的第一纳米微球、
-包被有第二抗体的第二纳米微球、和
-10mM至500mM缓冲液pH 6至8；
所述第一抗体为抗人fPSA单克隆抗体或其抗原结合片段；
所述第二抗体为抗复合物的单域抗体，且所述第二抗体不单独结合人fPSA；所述复合物是所述第一抗体和人fPSA形成的复合物；
所述第二抗体通过间隔臂分子连接至所述第二纳米微球；
所述第一试剂和第二试剂中的缓冲液独立地选自以下的一种或组合：磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸盐缓冲液、氯化铵缓冲液；
所述的表面活性剂选自以下的一种或组合：脂肪醇聚氧乙烯醚、吐温20、Brij；
所述间隔臂分子选自以下任一项：戊二醛、血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白、多聚赖氨酸；
所述第一纳米微球的平均粒径为400nm至500nm
所述第二纳米微球的平均粒径为400nm至500nm。
2.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其中：
所述的单克隆抗体源自：鼠、兔、禽、羊、重组抗体；
所述的抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体。
3.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自以下的一种或组合：AEO7、AEO9、AEO3。
4.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其还包含质控品和/或校准品；
所述校准品包含已知浓度的人fPSA；
所述质控品包含已知浓度的人fPSA。
5.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，所述第一试剂和第二试剂中缓冲液的浓度独立地为20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、或100mM。
6.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，所述第一试剂和第二试剂中缓冲液的pH独立地为7.0至7.5。
7.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，其中：
所述的纳米微球是由选自以下中的一种或更多种聚合而成：聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸酯。
8.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，所述第一纳米微球的平均粒径为450nm；所述第二纳米微球的平均粒径为450nm。
9.根据权利要求1所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，所述第一试剂还包含以下的一种或组合：
0.1至0.5M盐离子、
按w/v计0.5至2％PEG。
10.根据权利要求4所述的游离前列腺特异性抗原的检测试剂盒，所述校准品包含：0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml或10ng/ml fPSA、缓冲液、稳定剂、防腐剂。
11.一种纳米微球的制备方法，所述方法包括步骤：
第一步骤，其包括：
1.1)将第一纳米微球进行活化，得到活化的纳米微球；
1.2)将第一抗体偶联至所述活化的纳米微球，得到第一抗体-纳米微球偶联物；
1.3)对步骤1.2)得到的第一抗体-纳米微球偶联物进行封闭，
第二步骤，其包括：
2.1)将第二抗体与间隔臂分子进行交联，得到第二抗体与间隔臂分子的复合物；
2.2)将步骤2.1)所得复合物通过所述间隔臂分子偶联至第二纳米微球，得到第二抗体-纳米微球偶联物；
2.3)对步骤2.2)得到的第二抗体-纳米微球偶联物进行封闭，
第三步骤：将所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物混合，
其中所述第一步骤和所述第二步骤的顺序是并行的、或者能够互换的；
所述第一抗体为抗人fPSA单克隆抗体或其抗原结合片段；
所述第二抗体为抗复合物的单域抗体，且所述第二抗体不单独结合人fPSA；所述复合物是所述第一抗体和人fPSA形成的复合物；
所述间隔臂分子选自：戊二醛、血清白蛋白、甲状腺球蛋白、铜蓝蛋白、卵蛋白、多聚赖氨酸；
所述第一纳米微球的平均粒径为400nm至500nm
所述第二纳米微球的平均粒径为400nm至500nm。
12.根据权利要求11所述的纳米微球的制备方法，其中，
所述的纳米微球是由选自以下中的一种或更多种聚合而成：聚苯乙烯、丙烯酸、丙烯酸酯。
13.根据权利要求11所述的纳米微球的制备方法，所述第一纳米微球的平均粒径为450nm；所述第二纳米微球的平均粒径为450nm。
14.根据权利要求11所述的纳米微球的制备方法，其中：
所述第一纳米微球是羧基修饰的纳米微球，
所述第二纳米微球是氨基修饰的纳米微球。
15.根据权利要求11所述的纳米微球的制备方法，其中：
所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物按照质量比1:4至1:1进行混合；或者
所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物按照物质的量比1:4至1:1进行混合；或者
所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物按照浓度比1:4至1:1进行混合；或者
所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物按照等当量进行混合。
16.根据权利要求15所述的纳米微球的制备方法，其中：
所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物按照质量比1:1进行混合；或者
所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物按照物质的量比1:1进行混合；或者
所述第一抗体-纳米微球偶联物和所述第二抗体-纳米微球偶联物按照浓度比1:1进行混合。
17.根据权利要求11所述的纳米微球的制备方法，其中：
所述的单克隆抗体源自：鼠、兔、禽、羊、重组抗体；
所述的抗原结合片段选自：Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv、dsFv、单域抗体。
18.根据权利要求11所述的纳米微球的制备方法，其中所述活化是采用选自以下的试剂进行的：4-羟乙基哌嗪乙磺酸、碳酸氢钠、碳酸钠、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺、已二氨、3,3'-二氨丙基亚胺和戊二醛中的一种或其组合。
19.根据权利要求11所述的纳米微球的制备方法，其中：
第一步骤：
1.1)用乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺将第一纳米微球进行活化，得到活化的纳米微球；
1.2)将鼠抗人fPSA单克隆抗体加入至所述活化的纳米微球，在25-40℃下反应2至3小时，得到第一抗体-纳米微球偶联物；
1.3)用封闭液对步骤1.2)所得第一抗体-纳米微球偶联物进行封闭；
第二步骤：
2.1)将溶于缓冲液中的第二抗体加入戊二醛中，在18-25℃活化，得到第二抗体戊二醛复合物；
2.2)将溶于缓冲液中的第二抗体戊二醛复合物加入至第二纳米微球，在18-25℃反应2至3小时，得到第二抗体-纳米微球偶联物；
2.3)用封闭液对步骤2.2)所得第二抗体-纳米微球偶联物进行封闭。
20.根据权利要求19所述的纳米微球的制备方法，其中：
第一步骤：
1.1)在35至40℃，用溶于20mM pH 7.0HEPES缓冲液中浓度为1mg/ml的乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺将第一纳米微球进行活化，得到活化的纳米微球，所述活化的纳米微球浓度为5mg/ml；
1.2)将溶于20mM pH7.0 HEPES缓冲液中的0.1mg/ml鼠抗人fPSA单克隆抗体加入至所述活化的纳米微球，在25-40℃下反应2至3小时，得到第一抗体-纳米微球偶联物；
1.3)用含有BSA和吐温20的封闭液对步骤1.2)所得第一抗体-纳米微球偶联物封闭2小时；
第二步骤：
2.1)将溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中的0.1mg/ml第二抗体加入0.1mg/ml戊二醛中，在18-25℃活化2至3小时，得到第二抗体戊二醛复合物；
2.2)将溶于20mM pH 9.0碳酸缓冲液中的第二抗体戊二醛复合物加入至第二纳米微球，在18-25℃反应2至3小时，得到第二抗体-纳米微球偶联物；
2.3)用含有BSA和吐温20的封闭液对步骤2.2)所得第二抗体-纳米微球偶联物封闭2小时。
21.一种纳米微球，其是通过权利要求11至20中任一项所述纳米微球的制备方法所获得的。
22.一种检测试剂，其包含权利要求21所述的纳米微球。
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