CN111781361A - 利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法，包括：第一步骤：准备无底孔板以及特异性检测芯片；第二步骤：将特异性检测芯片覆盖待测样品捕获抗体，以便对待测样品的量进行特异性检测；第三步骤：配制待测样品浓度标准样品；第四步骤：向待测样品标准样品浓度中加入待测样品检测抗体，并用酶标仪记录特定波长下的动力曲线；第五步骤：利用采集到的动力曲线数据，计算出结合动力学参数。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种以新型冠状病毒(SARS-COV-2)为例利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法。
背景技术
分子相互作用动力学的测量在药物发现，遗传筛查和临床诊断中越来越重要，因为动态结合信息可以提高对疾病的认识和可以为治疗提供新思路。表面等离子体共振(SPR)传感器，如商业Biacore SPR生物传感器系统，能够实时监测动力学生物分子相互作用，无需标记，不受大量背景的影响。由于商业Biacore SPR生物传感器系统属于传统SPR设备，所以其需要特制的设备，专人的操作，使得购买或使用该生物传感器系统需要大量的金钱。
冠状病毒直径约80～120nm，在电镜下可以观察到它们的表面有类似日冕的放射状突起，就像王冠一样，故而被命名为冠状病毒。新型冠状病毒(SARS-COV-2)是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株。该病毒症状一般为发热、乏力、干咳、逐渐出现呼吸困难。因此，尤其对于SARS-COV-2的分子间动力学参数的测定，希望能够解决生物传感器系统检测成本较高的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在上述缺陷，提供一种以SARS-COV-2为例利用酶标仪测定分子间动力学参数的方法，以解决商业Biacore SPR生物传感器系统检测成本较高的问题。
根据本发明，提供了一种利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法包括：
第一步骤：准备无底孔板以及特异性检测芯片；
第二步骤：将特异性检测芯片覆盖待测样品捕获抗体，以便对待测样品蛋白的量进行特异性检测；
第三步骤：配制待测样品浓度标准样品；
第四步骤：向待测样品标准样品浓度中加入待测样品检测抗体，并用酶标仪记录特定波长下的动力曲线；
第五步骤：利用采集到的动力曲线数据，计算出动力学参数。
优选地，所述待测样品是SARS-COV-2。
优选地，特定波长为565nm和705nm。
优选地，动力曲线数据是光学密度数据。
优选地，特异性检测芯片采用复制成形工艺制作，其中，利用激光干涉光刻在石英基板上制作锥形纳米柱图案，然后将紫外光固化聚合物均匀散布在模具上，顶部以聚对苯二甲酸乙二醇酯支撑；用紫外光进行固化处理，然后将聚对苯二甲酸乙二醇酯基板连同周期性纳米孔道图案从模具上剥除；通过电子束蒸发沉积形成一个钛粘附层和一个黄金层，以实现等离激元器件成形；然后利用射频等离子体溅射沉积二氧化钛谐振腔层，而后通过钛粘附层和顶部黄金层的电子束蒸发形成纳米谐振腔。
优选地，所述钛黏附层、黄金层和二氧化钛谐振腔层的厚度分别是16nm、220nm和180nm。
优选地，第五步骤将采集到的动力曲线数据进行回归拟合分析以计算出动力学参数。
优选地，特异性检测芯片覆盖SARS-COV-2捕获抗体包括：在室温条件下将特异性检测芯片置于11-巯基十一烷酸溶液中，清洗后吹干；加入1-乙烷基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的1:1混合液中孵育；孵育结束后放入单克隆抗SARS-COV-2抗体内孵育，清洗后吹干；加入牛血清白蛋白阻断液中室温孵育，去除牛血清白蛋白阻断液并加入乙醇胺溶液室温孵育，以覆盖未反应的NHS酯；清洗吹干后放置于干燥环境中。
优选地，配制SARS-COV-2浓度标准样品包括：采用250仩g/ml的SARS-COV-2蛋白溶液为母液，稀释配制为不同浓度梯度的SARS-COV-2标准样品溶液；稀释底液为PBS缓冲液。
本发明利用普通酶标仪实现病毒和抗体结合动力学参数的测定，可最大限度减少特殊仪器系统需求，而且具有选择性好、敏感度高等优点，且无需额外的检测标记物质，简化了检测过程，降低了检测成本；芯片在565nm和705nm段透射光强度的改变而对表面折射率的变化有极高的敏感性。本发明利用普通的酶标仪对芯片进行动力学检测，通过MATLAB软件回归拟合分析动力学常数；所测得的动力学常数与其他文献报道在同一数量级，检测效率高。
附图说明
结合附图，并通过参考下面的详细描述，将会更容易地对本发明有更完整的理解并且更容易地理解其伴随的优点和特征，其中：
图1示意性地示出了根据本发明优选实施例的以SARS-COV-2为例利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法的流程图。
图2示意性地示出了根据本发明优选实施例的检测不同浓度的SARS-COV-2动力曲线检测图。
图3示意性地示出了根据本发明优选实施例的检测不同浓度的SARS-COV-2动力学参数测定结果图。
需要说明的是，附图用于说明本发明，而非限制本发明。注意，表示结构的附图可能并非按比例绘制。并且，附图中，相同或者类似的元件标有相同或者类似的标号。
具体实施方式
为了使本发明的内容更加清楚和易懂，下面结合具体实施例和附图对本发明的内容进行详细描述。
图1示意性地示出了根据本发明优选实施例的以SARS-COV-2为例利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法的流程图。其中，该实施例以SARS-COV-2作为待测样品的具体示例。
如图1所示，根据本发明优选实施例的以SARS-COV-2为例利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法包括：
第一步骤S1：准备无底孔板以及特异性检测芯片；
例如，无底孔板是无底96孔板，可通过打印方式制备。
第二步骤S2：将特异性检测芯片覆盖SARS-COV-2捕获抗体，以便对SARS-COV-2蛋白的量进行特异性检测；
第三步骤S3：配制SARS-COV-2浓度标准样品；
第四步骤S4：向SARS-COV-2标准样品浓度中加入SARS-COV-2检测抗体，并用酶标仪记录特定波长(例如，特定波长为565nm和705nm)下的动力曲线；
第五步骤S5：利用采集到的动力曲线数据，计算出动力学参数。
例如，第五步骤S5将采集到的动力曲线数据(例如，通过MATLAB软件)进行回归拟合分析以计算出动力学参数。
下面描述本发明优选实施例的具体示例。
作为具体示例，例如，特异性检测芯片采用复制成形工艺。具体地，制备特异性检测芯片方法如下，利用激光干涉光刻在石英基板上制作锥形纳米柱图案，然后将紫外光固化聚合物(例如，NOA-61)均匀散布在模具上，顶部以聚对苯二甲酸乙二醇酯支撑；用紫外光进行固化处理，然后将聚对苯二甲酸乙二醇酯基板连同周期性纳米孔道图案从模具上仔细剥除；通过电子束蒸发沉积形成一个钛粘附层和一个黄金层，以实现等离激元器件成形，然后利用射频等离子体溅射沉积二氧化钛谐振腔层，而后通过钛粘附层和顶部黄金层的电子束蒸发形成纳米谐振腔。其中优选地，钛黏附层、黄金层和二氧化钛谐振腔层的厚度分别是16nm、220nm和180nm，固化处理的时间为3分钟。
作为具体示例，例如，特异性检测芯片覆盖SARS-COV-2捕获抗体的方法如下，在室温条件下将PORT芯片置于1mM 11-巯基十一烷酸溶液中12小时，用70％乙醇清洗后以氮气吹干；加入400×10-3M 1-乙烷基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和100×10-3M N-羟基丁二酰亚胺的1:1混合液中孵育30分钟；孵育结束后立即放入60g/ml单克隆抗SARS-COV-2抗体内于4度冰箱中孵育12小时，PBS清洗两次后用氮气吹干；加入30μg/ml牛血清白蛋白阻断液中室温孵育30分钟，去除牛血清白蛋白阻断液并加入10％乙醇胺溶液室温孵育30分钟，以覆盖未反应的NHS酯；超纯水清洗后两次后，氮气吹干后放置于干燥环境中。
作为具体示例，例如，配制SARS-COV-2浓度标准样品的方法如下，采用250μg/ml的SARS-COV-2蛋白溶液为母液，稀释配制为不同浓度梯度的SARS-COV-2标准样品溶液(50ng/ml～50μg/ml)；稀释底液为PBS缓冲液。
作为具体示例，例如，用于动力学监测的特定波长为565nm和705nm。最终动力曲线的处理方法虽然同时使用到565nm和705nm的光学密度(OD)值，但通过MATLAB算法处理后仅展示一条自动降噪后的动力曲线。
作为具体示例，例如，采用250μg/ml的SARS-COV-2蛋白溶液稀释配制为10种浓度梯度的SARS-COV-2标准样品溶液，分别为50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml；稀释底液为PBS缓冲液。
作为具体示例，例如，检测SARS-COV-2浓度标准样品信号及动力曲线测定：采用等离光子谐振技术及光敏传感的方法检测SARS-COV-2标准样品浓度；配置60μg/mlSARS-COV-2检测抗体，向96孔板中加入100μl在SARS-COV-2检测抗体，记录565nm和705nm的动力曲线；请参阅图3所示，记录频率为3分钟1次，总共反应120分钟。
作为具体示例，例如，将记录的OD值通过MATLAB算法处理后将自动展示已降噪处理的动力曲线并且给出动力学参数的具体数值。
本发明实施例具有如下优点：利用普通酶标仪实现病毒和抗体结合动力学参数的测定，该器件可最大限度减少特殊仪器系统需求，而且具有选择性好、敏感度高等优点，且无需额外的检测标记物质，简化了检测过程，降低了检测成本；芯片在565nm和705nm段透射光强度的改变而对表面折射率的变化有极高的敏感性。本发明的设计利用普通的酶标仪对芯片进行动力学检测，通过MATLAB软件回归拟合分析动力学常数；所测得的动力学常数与其他文献报道在同一数量级，检测效率高。
通过数据检测验证该方法的可行性，通过对不同浓度的SARS-COV-2进行动力学的检测以及动力学常数的测量，动力学的动态图如图2所示，最终通过算法求得的动力学常数如图3所示，不同浓度的SARS-COV-2的动力学参数在一个数量级上，并且也与其他文献所测得的动力学常数在同一数量级，证明此方法可行。
需要说明的是，除非特别指出，否则说明书中的术语“第一”、“第二”、“第三”等描述仅仅用于区分说明书中的各个组件、元素、步骤等，而不是用于表示各个组件、元素、步骤之间的逻辑关系或者顺序关系等。
可以理解的是，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而上述实施例并非用以限定本发明。对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (9)
1.一种利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法，其特征在于包括：
第一步骤：准备无底孔板以及特异性检测芯片；
第二步骤：将特异性检测芯片覆盖待测样品捕获抗体，以便对待测样品蛋白的量进行特异性检测；
第三步骤：配制待测样品浓度标准样品；
第四步骤：向待测样品标准样品浓度中加入待测样品检测抗体，并用酶标仪记录特定波长下的动力曲线；
第五步骤：利用采集到的动力曲线数据，计算出动力学参数。
2.根据权利要求1所述的利用酶标仪测定分子间动力学参数的方法，其特征在于，所述待测样品是SARS-COV-2。
3.根据权利要求1或2所述的利用酶标仪测定分子间动力学参数的方法，其特征在于，特定波长为565nm和705nm。
4.根据权利要求1或2所述的利用酶标仪测定分子间动力学参数的方法，其特征在于，动力曲线数据是光学密度数据。
5.根据权利要求1或2所述的利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法，其特征在于，特异性检测芯片采用复制成形工艺制作，其中，利用激光干涉光刻在石英基板上制作锥形纳米柱图案，然后将紫外光固化聚合物均匀散布在模具上，顶部以聚对苯二甲酸乙二醇酯支撑；用紫外光进行固化处理，然后将聚对苯二甲酸乙二醇酯基板连同周期性纳米孔道图案从模具上剥除；通过电子束蒸发沉积形成一个钛粘附层和一个黄金层，以实现等离激元器件成形；然后利用射频等离子体溅射沉积二氧化钛谐振腔层，而后通过钛粘附层和顶部黄金层的电子束蒸发形成纳米谐振腔。
6.根据权利要求5所述的利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法，其特征在于，所述钛黏附层、黄金层和二氧化钛谐振腔层的厚度分别是16nm、220nm和180nm。
7.根据权利要求1或2所述的利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法，其特征在于，第五步骤将采集到的动力曲线数据进行回归拟合分析以计算出动力学参数。
8.根据权利要求1或2所述的利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法，其特征在于，特异性检测芯片覆盖SARS-COV-2捕获抗体包括：在室温条件下将特异性检测芯片置于11-巯基十一烷酸溶液中，清洗后吹干；加入1-乙烷基-3-3-二甲基氨丙基碳化二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺的1:1混合液中孵育；孵育结束后放入单克隆抗SARS-COV-2抗体内孵育，清洗后吹干；加入牛血清白蛋白阻断液中室温孵育，去除牛血清白蛋白阻断液并加入乙醇胺溶液室温孵育，以覆盖未反应的NHS酯；清洗吹干后放置于干燥环境中。
9.根据权利要求1或2所述的利用酶标仪测定病毒和抗体结合动力学参数的方法，其特征在于，配制SARS-COV-2浓度标准样品包括：采用250μg/ml的SARS-COV-2蛋白溶液为母液，稀释配制为不同浓度梯度的SARS-COV-2标准样品溶液；稀释底液为PBS缓冲液。
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