CN110286104A - 局域表面等离子体共振纳米传感器及其蛋白质定量方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种局域表面等离子体共振纳米传感器及其蛋白质定量方法。根据本发明的局域表面等离子体共振纳米传感器包括：两头开口的多孔板100以及粘在所述孔板底部上的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片；其中Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片包括多个Au－TiO2－Au纳米杯组成的阵列，其中每个Au－TiO2－Au纳米杯包括锥形纳米柱以及依次布置在锥形纳米柱上的第一Au层、中间TiO2层和第二Au层。

Description

局域表面等离子体共振纳米传感器及其蛋白质定量方法
技术领域
本发明涉及一种局域表面等离子体共振纳米传感器及其蛋白质定量方法。
背景技术
分子相互作用动力学的测量在药物发现、遗传筛查和临床诊断学中越来越重要，因为动态结合信息可提高对疾病的认识并为治疗提供新思路。表面等离子体共振(SPR)传感器，如商业Biacore SPR生物传感器系统，能够实时监测动力学生物分子相互作用，无需标记且不受整体背景影响，同时采集表面生物分子和药物结合事件的高质量延时数据。传统SPR传感器通常是沉积到玻璃或其他介质基板上的金或银薄膜。值得注意的是，作为表面分子结合事件的结果，小等离子体共振角或共振波长由于SPR传感器芯片表面附近的折射率变化而偏移。传统SPR仪器(如Biacore系统) 中的高精度光学和光机械元件，可在表面蛋白质相互作用过程中实时检测金薄膜传感器上的小共振角或波长偏移，但Biacore系统上可靠的SPR灵敏度仍然受限于μg/ml浓度水平。中等分子灵敏度和卓越的仪器要求会阻碍传统SPR传感在应用和基础生物医学研究以及临床诊断学中更广泛的分析应用。
另一方面，还可将金属周期性纳米结构和纳米粒子用作等离子体生物传感器9，称为局域表面等离子体共振(LSPR)传感器。LSPR是由介电材料所包围金属纳米结构中的电子气体集体振荡产生的光学现象。与传统 SPR相比，LSPR不需要棱镜或其他光学耦合器件激发且具有更高的表面积与体积比。LSPR传感器的这些功能使得在常见实验室设备中进行检测成为可能。
测量生物流体中各种蛋白质生物标志物的结合动力学和定量，除了药物开发和筛查，还对有效诊断、靶向治疗和预后至关重要。例如，C-反应蛋白(CRP)是钙依赖性五聚体环状分子，其由五个相同的非糖基化多肽亚单位组成。它是一种针对许多心血管疾病、呼吸道疾病、代谢紊乱的生物标志物，经证明对治疗效果有用。健康人血液中CRP水平的截止值为5μg/ml。在炎症的急性期反应期间，血液中CRP浓度会突然升高至600-1000 μg/ml并在大约48小时后达到峰值。
在许多研究实验室中，几乎没有针对通用酶标仪的分析检定方法(比色法或荧光法)能够动态测量蛋白质-蛋白质结合或定量蛋白质相互作用的动力学结合和解离速率常数。另一方面，在昂贵的特殊表面等离子体共振 (SPR)传感器系统设备上可以独特地完成蛋白质结合动力学定量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在上述缺陷，提供一种使得能够使用许多化学和生物医学研究实验室中的通用酶标仪实现蛋白质结合动力学的SPR测量的局域表面等离子体共振纳米传感器及其蛋白质定量方法。
根据本发明，提供了一种局域表面等离子体共振纳米传感器，包括：两头开口的多孔板100以及粘在所述孔板底部上的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片；其中Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片包括多个Au－TiO2－Au纳米杯组成的阵列，其中每个Au－TiO2－Au纳米杯包括锥形纳米柱以及依次布置在锥形纳米柱上的第一Au层、中间TiO2层和第二Au层。
优选地，所述多孔板是标准96孔板格式。
优选地，第一Au层、中间TiO2层和第二Au层的厚度分别为90nm、80nm 和90nm。
优选地，所述局域表面等离子体共振纳米传感器用于执行蛋白质定量测量。
优选地，所述局域表面等离子体共振纳米传感器用于评估动态蛋白质相互作用。
根据本发明，还提供了一种局域表面等离子体共振纳米传感器制备方法，包括：采用复制成型工艺制备纳米等离子体传感器薄膜，并在支持信息中描述传感器芯片的参数；其中，通过激光干涉光刻法和离子蚀刻在氧化硅晶片上形成锥形纳米柱阵列，以形成初始模具；在复制之前，将初始模具放入充满己基硅烷的真空干燥器中以获得疏水性，然后，将光学胶均匀涂在初始模具上，并在其顶部放置聚对苯二甲酸乙二醇酯片，经过UV 光照射后剥掉聚对苯二甲酸乙二醇酯片，然后将多层金属和氧化物沉积到纳米杯阵列上，将芯片粘到底部开口的多孔板上。
根据本发明，还提供了一种蛋白质定量方法，其采用上述局域表面等离子体共振纳米传感器与酶标仪结合来执行蛋白质定量测量。
优选地，所述的蛋白质定量方法包括：
第一步骤：制造局域表面等离子体共振纳米传感器，其包括：两头开口的多孔板100以及粘在所述孔板底部上的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片；其中Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片包括多个Au－TiO2－Au纳米杯组成的阵列，其中每个Au－TiO2－Au纳米杯包括锥形纳米柱以及依次布置在锥形纳米柱上的第一Au层、中间TiO2层和第二Au层；
第二步骤：使用抗体-靶蛋白-抗体夹心法处理局域表面等离子体共振纳米传感器；
第三步骤：采用酶标仪测量透射光密度值的动态变化以实现动力学蛋白质测量。
优选地，第一步骤包括：采用复制成型工艺制备纳米等离子体传感器薄膜，并在支持信息中描述传感器芯片的参数；其中，通过激光干涉光刻法和离子蚀刻在氧化硅晶片上形成锥形纳米柱阵列，以形成初始模具；在复制之前，将初始模具放入充满己基硅烷的真空干燥器中以获得疏水性，然后，将光学胶均匀涂在初始模具上，并在其顶部放置聚对苯二甲酸乙二醇酯片，经过UV光照射后剥掉聚对苯二甲酸乙二醇酯片，然后将多层金属和氧化物沉积到纳米杯阵列上，将芯片粘到底部开口的多孔板上。
优选地，所述蛋白质定量方法用于评估动态蛋白质相互作用。
本发明的低成本纳米传感器板能够基于通用酶标仪中所测量的特定波长处透射光密度(OD)值变化对固定化蛋白质相互作用进行非常灵敏的检测。相对终点透射光密度值变化显示缓冲液和血清中蛋白质浓度(从0.05 到50μg/ml)具有良好的线性响应，蛋白质定量结果与并行的医院实验室检查一致。最重要的是，由通用酶标仪中延时的动态透射光密度值测量确定本发明的传感器板孔中蛋白质相互作用的动力学结合和解离速率常数。通过本发明的独特纳米传感器板，现在可使用许多化学和生物医学研究实验室中的通用酶标仪实现蛋白质结合动力学的SPR测量。
附图说明
结合附图，并通过参考下面的详细描述，将会更容易地对本发明有更完整的理解并且更容易地理解其伴随的优点和特征，其中：
图1示意性地示出了根据本发明优选实施例的局域表面等离子体共振纳米传感器的正视示意结构图。
图2示意性地示出了根据本发明优选实施例的局域表面等离子体共振纳米传感器的俯视示意结构图。
图3示意性地示出了根据本发明优选实施例的局域表面等离子体共振纳米传感器采用的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片的结构。
图4示意性地示出了根据本发明优选实施例的蛋白质定量方法的流程图。
需要说明的是，附图用于说明本发明，而非限制本发明。注意，表示结构的附图可能并非按比例绘制。并且，附图中，相同或者类似的元件标有相同或者类似的标号。
具体实施方式
为了使本发明的内容更加清楚和易懂，下面结合具体实施例和附图对本发明的内容进行详细描述。
在本发明中，在多孔板(例如，标准96孔板格式)中集成耦合的等离子体共振纳米传感器，并首次演示在通用酶标仪中无标记动态SPR蛋白质结合测量和动力学定量。本发明的低成本纳米传感器板能够基于通用酶标仪中所测量的特定波长处透射光密度(OD)值变化对固定化蛋白质相互作用进行非常灵敏的检测。相对终点透射光密度值变化显示缓冲液和血清中蛋白质浓度(从0.05到50μg/ml)具有良好的线性响应，蛋白质定量结果与并行的医院实验室检查一致。最重要的是，由通用酶标仪中延时的动态透射光密度值测量确定本发明的传感器板孔中蛋白质相互作用的动力学结合和解离速率常数。通过本发明的独特纳米传感器板，现在可使用许多化学和生物医学研究实验室中的通用酶标仪实现蛋白质结合动力学的SPR测量。
<第一实施例>
图1和图2示意性地示出了根据本发明优选实施例的局域表面等离子体共振纳米传感器的示意结构图。
如图1和图2所示，根据本发明优选实施例的局域表面等离子体共振纳米传感器包括：两头开口的多孔板100以及粘在所述孔板100底部上的 Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片200。
图3示意性地示出了根据本发明优选实施例的局域表面等离子体共振纳米传感器采用的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片的结构。如图3所示， Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片200包括布置在基底105上的多个Au－TiO2－Au 纳米杯组成的阵列，其中每个Au－TiO2－Au纳米杯包括锥形纳米柱101以及依次布置在锥形纳米柱101上的第一Au层102、中间TiO2层103和第二Au 层104。
例如，如图3所示，所述多孔板是标准96孔板格式。
<第二实施例>
图4示意性地示出了根据本发明优选实施例的蛋白质定量方法的流程图。
如图4所示，根据本发明优选实施例的蛋白质定量方法包括：
第一步骤S1：制造局域表面等离子体共振纳米传感器，其包括：两头开口的多孔板100以及粘在所述孔板底部上的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片；其中Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片包括多个Au－TiO2－Au纳米杯组成的阵列，其中每个Au－TiO2－Au纳米杯包括锥形纳米柱以及依次布置在锥形纳米柱上的第一Au层、中间TiO2层和第二Au层；
第二步骤S2：使用抗体-靶蛋白-抗体夹心法处理局域表面等离子体共振纳米传感器；
第三步骤S3：采用酶标仪测量透射光密度值的动态变化以实现动力学蛋白质测量。
<具体实例>
在具体实施例中，在96孔板格式中布置无标记LSPR生物传感器，仅使用常见通用酶标仪进行CRP和抗CRP抗体结合动力学的动态测量，并进行缓冲液和血清中CRP浓度的定量。在96孔LSPR传感器板中，使用抗体-靶蛋白-抗体夹心法，然后以通用酶标仪测量OD值的动态变化进行类似于常规SPR系统(如Biacore)中的动力学蛋白质测量。不同介质会在传感器芯片上呈现不同的颜色。在完成纳米等离子体96孔板器件的制备之后，将CRP捕获抗体固定在微孔底部表面上。将第二抗体用于动态测量并提高灵敏度和特异度。96孔板传感器上的蛋白质结合动力学测量会达到50ng/ml的检测限(LOD)，低于血浆中的CRP水平至少2个数量级，并低于Biacore系统的LOD。本发明的研究为酶标仪中的高通量、低成本和常见SPR蛋白质表征、结合相互作用和动态分析铺平了道路。
试剂
从Sigma-Aldrich购买己基硅烷、链霉亲和素、异丙醇、乙醇、蔗糖、 6-巯基-1-己醇(MCH)、11-巯基十一烷酸(MUA)、1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白 (BSA)、乙醇胺、纯化CRP和磷酸盐缓冲液(PBS)，从Nanocs购买硫醇化生物素，从SinoBiological购买单克隆抗CRP捕获和检测抗体。所有化学品均直接使用，无需进一步纯化。
制备工艺
可以使用复制成型工艺制备纳米等离子体传感器薄膜，并在支持信息中描述传感器芯片的参数。最初的模具通过激光干涉光刻法和离子蚀刻在氧化硅晶片上的锥形纳米柱阵列。在复制之前，将模具放入充满己基硅烷的真空干燥器中12小时，以获得疏水性。然后，将Norland光学胶(NOA－61) 均匀地涂在模具上，并在其顶部放置聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)片。经过UV光(105mW/cm2)照射3分钟后，剥掉PET片。然后，将多层金属和氧化物沉积到纳米杯阵列上。将芯片切成1cm×1cm的小片，将芯片粘到底部开口的96孔板上，该板由3D打印机(Object30primerTMStratasysLtd.) 制成，从而形成独特的纳米传感器板。
生物素－链霉亲和素结合
在进行实验之前，用异丙醇和去离子(DI)水冲洗芯片集成的微板孔两次。在室温下，将芯片在1mM硫醇化生物素(PBS中)中温育3小时，随后在室温下浸入1mMMCH(DDW中)封闭液中1小时。最后，在室温下将芯片分别浸入5μg/ml和50μg/ml链霉亲和素溶液(PBS中)中30分钟，并通过酶标仪的动态曲线函数(每10秒一个点)测量与时间相关的链霉亲和素的结合动力学。用去离子水洗涤芯片两次，洗涤后，使用每个步骤后微板孔中的磷酸盐缓冲液测量终点吸收光谱。
CRP－抗体结合动力学和定量
在进行实验之前，用异丙醇和去离子(DI)水冲洗芯片两次。在室温下，将芯片在1mMMUA溶液(乙醇中)中温育12小时。用70％乙醇和去离子水清洗芯片两次，然后测量去离子水中的吸收光谱。在室温下，将芯片在400mMEDC和100mMNHS的混合液中温育30分钟，然后在4℃下温育60μg/ml单克隆抗CRP捕获抗体(PBS中)12小时。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后测量去离子水中的吸收光谱。将芯片在60μg/mlBSA 封闭液中，然后在10％乙醇胺溶液中温育，这两个步骤在室温下持续30 分钟。用去离子水冲洗芯片两次，然后测量去离子水中的吸收光谱。将芯片在不同浓度的CRP(PBS中)中温育3小时，并且测量与时间相关的动态吸收图谱。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后，测量去离子水中的吸收光谱。最后，将芯片在60μg/ml单克隆抗CRP检测抗体(PBS中)中温育，并测量与时间相关的吸收图谱。用PBS和去离子水冲洗芯片，然后，测量去离子水中的吸收光谱。人血清样本中CRP的检测与前述方法步骤类似，但是针对CRP固定步骤，可以加入由10×PBS(而不是标准PBS溶液) 稀释而成的人血清样本。通过将血样在4℃下以2500×g离心15分钟获得血浆样本。将血清样本保存于－80℃下。
Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片传感器的制备
通过将金属－绝缘体－金属多层和3D纳米杯阵列结构结合来制备传感器。将UV固化聚合物均匀地涂在模具上并在其顶部放置PET片。经过UV光照射和聚合物固化后，剥掉PET片。然后，将90nm金(Au)、80nmTiO2和90nmAu沉积到其上方。因具有可见等离子体共振和可靠的表面官能化 (－SH)而选择Au，而TiO2具有高RI、低消光系数和良好的可制造性。优选地采用高均匀度的杯阵列结构且每个纳米杯具有相似的形态，包括纳米杯顶部的三个金属层和杯结构中的纳米粒子。
光学特性
为了解微板孔中传感器芯片的光学响应，制备了0％至60％蔗糖溶液，其相当于1.33至1.44的RI。以通用酶标仪所测不同浓度蔗糖溶液的吸收光谱。随着RI不断增加，在560nm附近透射强度增加，而在波长约705nm 附近可以观察到强度降低。在共振波长处的OD值与液体RI之间的良好线性。可通过每个RI单位(RIU)的透射强度(T)相对变化计算灵敏度，并可通过10＾－OD计算相对透射强度变化(％)。计算出的传感器灵敏度在λ＝565nm处为－566Δ％T/RIU，而在λ＝705nm处为134Δ％T/RIU。565nm 和705nm处的强度变化趋势相反，因此在后续实验中，将705nm处和565nm 处的OD值变化相互减去，以进一步提高灵敏度和减少环境光源强度波动和温差引起的误差。
生物素-链霉亲和素相互作用的检测
通过研究生物素-链霉亲和素相互作用测试器件，该相互作用以前被大量研究并因高亲和力而众所周知，可以展示检测动力学生物分子相互作用的功能。将芯片浸入具有硫醇化生物素的微孔传感器中以形成均匀的自组装单层(SAM)。然后，加入MCH以阻断非特异性结合。最后，传感器微孔分别装满5μg/ml和50μg/ml链霉亲和素，酶标仪每隔10秒测量565nm 和705nm处的OD值。由于生物素的表面结合而导致OD值增加，并在 MCH表面钝化步骤后略有减小。当加入链霉亲和素时，通过565OD-705 OD值的增加检测出生物素-链霉亲和素相互作用。
缓冲液中C-反应蛋白(CRP)的检测
首先，将传感器芯片浸入1mM MUA溶液中以形成SAM。加入EDC 和NHS以活化羧基，然后将抗CRP捕获抗体会共价结合到表面。然后，将芯片在BSA封闭液和乙醇胺中温育，以分别阻断非特异性结合和封闭剩余的NHS。然后，将一系列浓度为0.05μg/ml至50μg/ml的CRP溶液在微板孔中传感器芯片上温育，并使用通用酶标仪每隔3分钟测量共振波长处的OD值。最后，将抗CPR检测抗体在传感器芯片上温育，并每隔3分钟测量共振波长处的OD值。
对于CPR捕获步骤，能够识别从1μg/ml到50μg/ml的不同浓度的 CPR。该步骤的LOD是1μg/ml。将结果拟合为线性，从1μg/ml到50μ g/ml显示出良好的一致性。50μg/ml CRP会导致大约4％的相对透射强度变化。仅4％的相对透射强度变化而针对CRP检测的LOD仅为1μg/ml，这不足以确认某人是否健康。因此，最好找到一种扩展传感器芯片功能的新方法。在这里，将另一种抗CRP抗体引入微板孔中传感器芯片，以形成抗体-抗原-抗体夹心结构。由于两种抗体同时结合，传感器会具有极高的特异度，并使其适合在复杂的血清中进行直接检测。
血清样本准确度测试
为了评估芯片传感器针对CRP检测的准确性，采集健康志愿者和患者的一些血清样本。抽血后在武汉协和医院中通过乳胶凝集法定量CRP的浓度。将一部分血液用于通过微孔板中纳米等离子体传感器芯片检测CRP。首先，将血样在4℃下以2500×g离心15分钟。用PBS将上清液稀释10 倍。在我们的实验室和医院中分别对15份血样进行定量。可以看到，本发明的传感器芯片在低CPR浓度下表现出更符合医院测试结果，但在高 CPR浓度下，根据传感器所检测出的值则会低于医院测试的值。可以通过强烈的非特异性表面吸附与血清中的CRP发生竞争解释这一点。传感器芯片的结果与医院的报告之间存在良好相关性。此外，医院报告的LOD为 3.1μg/ml(样本1)，小3.1μg/ml的值在正常范围内。但本发明的传感器芯片在较宽的浓度范围内都足够灵敏。结果表明，本发明的传感器芯片对于临床诊断中的高通量CRP检测而言实用且准确。
本发明的无标记、高通量的低成本生物传感器，以通用酶标仪基于微板孔中纳米等离子体传感器对人血清中CRP进行结合动力学定量。传感器的灵敏度在λ＝565nm处为566Δ％T/RIU，而在λ＝705nm处为134Δ％ T/RIU。我们实现了炎症生物标志物CRP的检测，具有50ng/ml的LOD，这样完全有能力检测血清中CRP，与医院测试结果高度符合。
除了特定蛋白质定量外，纳米等离子体传感器微板还是研究动态蛋白质相互作用和测量结合动力学的利器。通过使用常见酶标仪，可以实现与商业SPR系统类似的功能。将独特的纳米传感器板与通用酶标仪结合，可以成为针对生物分子相互作用和动力学研究的新技术平台。
此外，需要说明的是，除非特别指出，否则说明书中的术语“第一”、“第二”、“第三”等描述仅仅用于区分说明书中的各个组件、元素、步骤等，而不是用于表示各个组件、元素、步骤之间的逻辑关系或者顺序关系等。
可以理解的是，虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然而上述实施例并非用以限定本发明。对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种局域表面等离子体共振纳米传感器，其特征在于包括：两头开口的多孔板100以及粘在所述孔板底部上的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片；其中Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片包括多个Au－TiO2－Au纳米杯组成的阵列，其中每个Au－TiO2－Au纳米杯包括锥形纳米柱以及依次布置在锥形纳米柱上的第一Au层、中间TiO2层和第二Au层。
2.根据权利要求1所述的局域表面等离子体共振纳米传感器，其特征在于，所述多孔板是标准96孔板格式。
3.根据权利要求1或2所述的局域表面等离子体共振纳米传感器，其特征在于，第一Au层、中间TiO2层和第二Au层的厚度分别为90nm、80nm和90nm。
4.根据权利要求1或2所述的局域表面等离子体共振纳米传感器，其特征在于，所述局域表面等离子体共振纳米传感器用于执行蛋白质定量测量。
5.根据权利要求1或2所述的局域表面等离子体共振纳米传感器，其特征在于，所述局域表面等离子体共振纳米传感器用于评估动态蛋白质相互作用。
6.一种局域表面等离子体共振纳米传感器制备方法，包括：采用复制成型工艺制备纳米等离子体传感器薄膜，并在支持信息中描述传感器芯片的参数；其中，通过激光干涉光刻法和离子蚀刻在氧化硅晶片上形成锥形纳米柱阵列，以形成初始模具；在复制之前，将初始模具放入充满己基硅烷的真空干燥器中以获得疏水性，然后，将光学胶均匀涂在初始模具上，并在其顶部放置聚对苯二甲酸乙二醇酯片，经过UV光照射后剥掉聚对苯二甲酸乙二醇酯片，然后将多层金属和氧化物沉积到纳米杯阵列上，将芯片粘到底部开口的多孔板上。
7.一种蛋白质定量方法，其特征在于采用根据权利要求1至6之一所述的局域表面等离子体共振纳米传感器与酶标仪结合来执行蛋白质定量测量。
8.根据权利要求7所述的蛋白质定量方法，其特征在于包括：
第一步骤：制造局域表面等离子体共振纳米传感器，其包括：两头开口的多孔板100以及粘在所述孔板底部上的Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片；其中Au－TiO2－Au纳米杯阵列芯片包括多个Au－TiO2－Au纳米杯组成的阵列，其中每个Au－TiO2－Au纳米杯包括锥形纳米柱以及依次布置在锥形纳米柱上的第一Au层、中间TiO2层和第二Au层；
第二步骤：使用抗体-靶蛋白-抗体夹心法处理局域表面等离子体共振纳米传感器；
第三步骤：采用酶标仪测量透射光密度值的动态变化以实现动力学蛋白质测量。
9.根据权利要求7或8所述的蛋白质定量方法，其特征在于，第一步骤包括：采用复制成型工艺制备纳米等离子体传感器薄膜，并在支持信息中描述传感器芯片的参数；其中，通过激光干涉光刻法和离子蚀刻在氧化硅晶片上形成锥形纳米柱阵列，以形成初始模具；在复制之前，将初始模具放入充满己基硅烷的真空干燥器中以获得疏水性，然后，将光学胶均匀涂在初始模具上，并在其顶部放置聚对苯二甲酸乙二醇酯片，经过UV光照射后剥掉聚对苯二甲酸乙二醇酯片，然后将多层金属和氧化物沉积到纳米杯阵列上，将芯片粘到底部开口的多孔板上。
10.根据权利要求7或8所述的蛋白质定量方法，其特征在于，所述蛋白质定量方法用于评估动态蛋白质相互作用。
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