CN106501526A - 一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白（pa）的试剂盒 - Google Patents
一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白（pa）的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的试剂盒，所述试剂盒的检测方法基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用一种组合定向剂：定向剂1与定向剂2，按照定向剂1先结合PA抗体，形成PA抗体复合物，定向剂2再结合PA抗体复合物，最后分别与两种不同粒径的羧基胶乳微球偶联形成PA胶乳颗粒。本试剂盒灵敏度高，精密度和线性好，试剂配制简单，值得进一步推广使用。
Description
技术领域：
本发明涉及医学检测及体外诊断领域，一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的试剂盒。
背景技术：
前白蛋白(Prealbumin，PA)，又称转甲状腺素蛋白(transthyretin)，分子量5.4万，由肝细胞合成，在电泳分离时，常显示在白蛋白的前方，其半衰期很短，仅约1.9天。因此，测定其在血浆中的浓度对于了解蛋白质的营养不良、肝功能不全、比之白蛋白和转铁蛋白具有更高的敏感性。除了作为一种灵敏的营养蛋白质指标，PA在急性炎症、恶性肿瘤、肝硬化或肾炎时其血浓度下降。
目前临床尚无公认的血清PA测定的参考方法，临床实验室测定血清PA含量的方法主要有免疫比浊法，包括免疫散射比浊法和免疫透射比浊法。近年来，比浊法测定技术因其具有简便、快速、自动、微量等特点，逐渐成为临床实验室测定血清PA的常规方法，又由于胶乳微球偶联技术的兴起及快速发展，渐渐使免疫比浊与胶乳微球结合，形成了普通免疫比浊技术的衍生，成为一种相较于免疫比浊法更简便快速，灵敏度更高，信号更强的检测方法，但该方法也存在其局限性，及偶联效果的不可控性，使得胶乳微球的利用率不高，因此，找到一种提升抗体与胶乳微球间偶联效果的方法，提高胶乳微球的利用率，增强反应效果是本领域亟需解决的技术问题。
发明内容：
鉴于以上技术问题，本发明的目的在于提供一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的试剂盒，所述试剂盒的检测方法基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用一种组合定向剂：定向剂1与定向剂2，按照定向剂1先结合PA抗体，形成PA抗体复合物，定向剂2再结合PA抗体复合物，最后分别与两种不同粒径的羧基胶乳微球偶联形成PA胶乳微球颗粒。
本发明的技术方案：将组合定向剂中的定向剂1与PA抗体结合，形成PA抗体复合物。将组合定向剂中的定向剂2与PA抗体复合物再结合。最后加入两种不同粒径的经活化的羧基胶乳微球进行偶联，形成PA胶乳颗粒。本检测试剂盒为液体双试剂，试剂1包括缓冲液、稳定剂和防腐剂，试剂2包括PA胶乳微球、缓冲液、保护剂、助悬剂、稳定剂和防腐剂。
本技术方案所述的定向剂1为N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)或长臂活化生物素(BCNHS)，更优选长臂活化生物素(BCNHS)。所述的定向剂2为链霉亲和素。
本发明试剂盒所述试剂1与试剂2中的缓冲液包括但不限于Tris-HCL缓冲液，PBS缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或几种，更优选PBS缓冲液。PH范围为7.0-8.0，更优选PH7.5-8.0。
本发明试剂盒所述试剂1中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选聚乙二醇8000与氯化钠，浓度比为2：1。
本发明试剂盒所述试剂1与试剂2中的防腐剂包括但不限于叠氮钠，proclin 300，硫柳汞中的一种或几种。
本发明试剂盒所述试剂2中的保护剂为EDTA。
本发明试剂盒所述试剂2中的助悬剂包括但不限于乙二醇，丙三醇，麦芽糖，蔗糖中的一种或几种，更优选丙三醇。
本发明试剂盒所述试剂2中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选蔗糖。
本发明中，包括PA胶乳颗粒的制备及PA检测试剂盒的制备。具体操作如下：
PA胶乳颗粒的制备：
5)定向剂1结合PA抗体
取浓度为0.5-5μg/ml羊抗人前白蛋白单克隆抗体，与定向剂1：长臂活化生物素(BCNHS)用量比为1∶2(mg∶mg)，混合于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，按BCNHS与二甲基甲酰胺(DMF)投料比为40∶1(w/v)加入DMF，37℃恒温振荡反应60min后，通过superdex 200层析分离去除多余BCNHS，PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒温振荡反应20min重悬，获得PA抗体复合物。
6)定向剂2结合PA抗体复合物
按定向剂2：链霉亲和素与PA抗体复合物的投料比为1∶2(w/v)混合于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，37℃恒温振荡反应30min，通过superdex 200层析分离去除多余链霉亲和素，PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒温振荡反应30min重悬，获得链霉亲和素-PA抗体复合物。
7)胶乳微球的活化
取粒径分别为50nm-100nm(2.5％w/v)与200nm-300nm(5.0％w/v)的羧基聚苯乙烯胶乳微球，按颗粒比例为80∶20分别用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤后，重新溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，分别加入1％(w/v)碳化二亚胺(EDC)活化，37℃恒温振荡反应20min，离心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤两次后，分别溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒温振荡反应30min重悬，获得活化的两种粒径的胶乳微球，。
8)链霉亲和素-PA抗体复合物与胶乳微球偶联
将步骤2)获得的链霉亲和素-PA抗体复合物按3-5∶1的体积比分别加入到步骤3)获得的两种粒径的活化胶乳微球中，37℃恒温振荡反应2h，用0.5％(w/v)赖氨酸封闭20min后，分别进行高速离心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤三次，分别溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒温振荡反应30min重悬，最后将两种粒径的PA胶乳微球颗粒混合。
PA检测试剂盒的制备：
以上述优选材料配制试剂盒(液体双试剂，R1∶R2为3∶1)，浓度分别为
本发明试剂盒，其检测方法为胶乳增强免疫比浊法，测试条件及参数如下：
1)检测仪器：具有600nm波长、37℃恒温装置的生化分析仪。
2)待测样本：新鲜不溶血血清，可2-8℃保存。
3)具体检测程序：
4)校准品的使用及曲线绘制方法：用2.0ml蒸馏水复溶，以蒸馏水对校准液进行倍比稀释，采用多点定标校准模式。
5)计算结果
样品中PA含量(mg/L)＝ΔAT/ΔAS×校准液浓度
式中：
ΔAT：以空白管吸光度为对照的样品管吸光度
ΔAS：以空白管吸光度为对照的校准管吸光度
本发明的优势在于：利用两种不同粒径羧基聚苯乙烯胶乳微球，在提升灵敏度的同时，具有较好的线性，提高了产品性能。利用组合定向剂提升了抗体与胶乳微球间偶联效果，提高了胶乳微球的利用率，增强反应效果。
附图说明：
图1：采用AU480全自动生化分析仪，对5个梯度浓度的试剂进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是稀释浓度，Y轴表示的是测定值均值。相关系数：r2＝0.9931，线性方程为：y＝0.9932x-0.3201。
图2：采用AU480全自动生化分析仪，对5个梯度浓度的试剂进行测定，并对测定值进行相关分析。其中X轴表示的是稀释浓度，Y轴表示的是测定值均值。相关系数：r2＝0.9952，线性方程为：y＝0.9941x+1.5590。
图3：分别采用本发明试剂盒与市售试剂盒A，采用AU480全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定。其中X轴表示的是本发明试剂盒的测定值，Y轴表示的是市售试剂盒A的测定值。相关系数：r2＝0.9940，线性方程为：y＝0.996x+2.497。
图4：分别采用本发明试剂盒与市售试剂盒B，采用AU480全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定。其中X轴表示的是本发明试剂盒的测定值，Y轴表示的是市售试剂盒B的测定值。相关系数：r2＝0.9930，线性方程为：y＝1.007x+0.513。
具体实施方式：
以下通过实施例具体阐明本发明，仅作为说明本发明具体内容而不用于限制本发明范围。
实施例1.前白蛋白(PA)检测试剂盒的配制(1)
PA胶乳颗粒的配制与技术方案中的所提到的过程相同。
前白蛋白(PA)检测试剂盒具体成分配制如下：
1)精密度测定：同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表1 精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表1中CV值小于5％，表明本发明试剂盒具有优良的精密度。
2)准确度测定：用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±15％范围内。
表2 准确度检测结果
表2中相对偏差CB＝5.32％，处于±15％范围内，表明本发明试剂盒具有优良的准确度。
3)线性测定：使用去离子水将试剂稀释成5个梯度浓度，每个梯度浓度检测3次，取平均值，对测定值与预期值作回归分析，计算r值和相对偏差(结果见图1，单位mg/L)。
表3 线性相关检测结果
| 稀释浓度 | 90.00 | 150.00 | 300.00 | 450.00 | 600.00 |
| 测定值 | 85.67 | 155.48 | 308.66 | 430.73 | 595.86 |
| 82.62 | 151.40 | 321.38 | 416.25 | 624.90 | |
| 83.78 | 155.26 | 306.23 | 409.11 | 605.38 | |
| 均值 | 84 | 154 | 312 | 419 | 609 |
| 绝对偏差 | 5.04 | 5.39 | 14.45 | 27.92 | 13.12 |
| 相对偏差 | 5.66％ | -3.62％ | -4.86％ | 6.25％ | -2.20％ |
通过表3得到相关系数：r2＝0.9931，线性方程为：y＝0.9932x-0.3201，结果表明本发明试剂盒相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
4)稳定性测定：将本发明试剂盒分别放置在室温和4℃冰箱，以新鲜配制的300mg/L前白蛋白标准品替代样品，每隔1个月测定1次，记录出现凝集所需时间，结果见表4。结果表明，试剂盒在4℃冰箱放置至少6个月以上不会有明显活性丧失，但不宜在室温存放。
表4 稳定性检测结果
| 室温下 | 出现凝集的时间(min) | 4℃下 | 出现凝集的时间(min) |
| 新配制 | 0.5 | 新配制 | 0.5 |
| 存放1个月 | 2 | 存放1个月 | 0.5 |
| 存放2个月 | 3 | 存放2个月 | 1 |
| 存放3个月 | 8 | 存放3个月 | 2 |
| 存放4个月 | 不凝集 | 存放4个月 | 2 |
| 存放5个月 | 不凝集 | 存放5个月 | 2 |
| 存放6个月 | 不凝集 | 存放6个月 | 2 |
5)特异性测定：选取进行干扰实验测定，分别取5份质控，其中一份做为对照，.其他三份分别加入4种潜在干扰物：胆红素、甘油三酯、血红蛋白、类风湿因子，用本发明试剂盒进行测定，均无抑制效果，表明该试剂盒有良好特异性，结果如表5所示：
表5 特异性检测结果
| 模拟干扰物 | 加入浓度 | 测定值 | 对照组测定值 | 准确(CB％) |
| 胆红素 | 342μmol/L | 296mg/L | 300mg/L | -1.3％ |
| 甘油三酯 | 8.7mmol/L | 297mg/L | 300mg/L | -1.0％ |
| 血红蛋白 | 5.0g/L | 288mg/L | 300mg/L | -4.0％ |
| 类风湿因子 | 75U/L | 307mg/L | 300mg/L | 2.3％ |
实施例2.前白蛋白(PA)检测试剂盒的配制(2)
PA胶乳颗粒的配制与技术方案中的所提到的过程相同。
前白蛋白(PA)检测试剂盒具体成分配制如下：
1)精密度测定：同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表6 精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表6中CV值小于5％，表明本发明试剂盒具有优良的精密度。
2)准确度测定：用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±15％范围内。
表7 准确度检测结果
表7中相对偏差CB＝8.68％，处于±15％范围内，表明本发明试剂盒具有优良的准确度。
3)线性测定：使用去离子水将试剂稀释成5个梯度浓度，每个梯度浓度检测3次，取平均值，对测定值与预期值作回归分析，计算r值和相对偏差(结果见图2，单位mg/L)。
表8 线性相关检测结果
| 稀释浓度 | 90.00 | 150.00 | 300.00 | 450.00 | 600.00 |
| 测定值 | 87.43 | 142.89 | 312.19 | 434.63 | 600.10 |
| 82.69 | 145.74 | 323.77 | 435.32 | 586.58 | |
| 80.95 | 143.72 | 340.97 | 455.60 | 592.74 | |
| 均值 | 84 | 144 | 326 | 442 | 593 |
| 绝对偏差 | 7.34 | 6.56 | 25.85 | 7.06 | 4.89 |
| 相对偏差 | 8.06％ | 4.35％ | -8.62％ | 1.57％ | 0.82％ |
通过表8得到相关系数：r2＝0.9952，线性方程为：y＝0.9941x+1.5590，结果表明本发明试剂盒相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
4)稳定性测定：将本发明试剂盒分别放置在室温和4℃冰箱，以新鲜配制的300mg/L前白蛋白标准品替代样品，每隔1个月测定1次，记录出现凝集所需时间，结果见表9。结果表明，试剂盒在4℃冰箱放置至少6个月以上不会有明显活性丧失，但不宜在室温存放。
表9 稳定性检测结果
5)特异性测定：选取进行干扰实验测定，分别取5份质控，其中一份做为对照，其他三份分别加入4种潜在干扰物：胆红素、甘油三酯、血红蛋白、类风湿因子，用本发明试剂盒进行测定，均无抑制效果，表明该试剂盒有良好特异性，结果如表10所示：
表10 特异性检测结果
| 模拟干扰物 | 加入浓度 | 测定值 | 对照组测定值 | 准确(CB％) |
| 胆红素 | 342μmol/L | 289mg/L | 300mg/L | -3.7％ |
| 甘油三酯 | 8.7mmol/L | 305mg/L | 300mg/L | 1.7％ |
| 血红蛋白 | 5.0g/L | 309mg/L | 300mg/L | 3.0％ |
| 类风湿因子 | 75U/L | 291mg/L | 300mg/L | -3.0％ |
实施例3.本发明试剂盒与市售试剂盒A的性能指标比较：
前白蛋白(PA)检测试剂盒的配制：
PA胶乳颗粒的配制与技术方案中的所提到的过程相同。
前白蛋白(PA)检测试剂盒具体成分配制如下：
对照的市售试剂盒A，其信息如下：
产品名称：前白蛋白测定试剂盒(四川迈克科技有限责任公司)
方法：免疫透射比浊法
剂型：液体单一试剂(R：2×35ml)
试剂盒组成：
R：
PA试剂
羊抗人PA血清
消脂剂
STD：
前白蛋白校准血清
基本参数：
方法：终点法；样品/试剂：1/100；主波长：340nm；副波长：700nm；反应温度：37℃；反应时间：10min。测定步骤：
计算：使用多点非线性/样条函数校准模式由仪器自动生成校准曲线后测定样品含量或以各标准管浓度值作为横坐标，吸光度变化值作为纵坐标，手工绘制标准曲线图，查阅该图即可得样品含量。
市售试剂盒A按说明书操作。
1)精密度测定：同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表11 精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表11中CV值小于5％，表明本发明试剂盒比市售试剂盒A具有更好的精密度。
2)准确度测定：用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±15％范围内。
表12 准确度检测结果
表12中本发明试剂盒相对偏差CB＝4.20％，处于±15％范围内，表明本发明试剂盒较市售试剂盒A具有更好的准确度。
3)线性测定：分别采用本发明试剂盒与市售试剂盒A，采用AU480全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图3，X轴表示的是本发明试剂盒的测定值，Y轴表示的是市售试剂盒A的测定值)。相关系数：r2＝0.9940，线性方程为：y＝0.996x+2.497，结果表明本发明试剂盒与市售试剂盒A相关性良好。
表13 线性相关检测结果
实施例4.本发明试剂盒与市售试剂盒B的性能指标比较：
前白蛋白(PA)检测试剂盒的配制：
PA胶乳颗粒的配制与技术方案中的所提到的过程相同。
前白蛋白(PA)检测试剂盒具体成分配制如下：
对照的市售试剂盒B，其信息如下：
产品名称：前白蛋白测定试剂盒(美国西门子)
方法：免疫比浊法
剂型：液体单一试剂(R：4×30ml)
市售试剂盒B按说明书操作。
1)精密度测定：同一样品中连续抽取20次进行测定，计算测定值的均数、标准差和变异系数，
表14 精密度检测结果
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该测定方法的结果精密度越好。对于临床化学检验项目而言，CV小于5％的方法精密度公认是可以接受的。表14中CV值小于5％，表明本发明试剂盒与市售试剂盒B同样具有较好的精密度。
2)准确度测定：用同一质控品，重复测定3次，取平均值，与质控品靶值相对偏差应在±15％范围内。
表15 准确度检测结果
表15中本发明试剂盒相对偏差CB＝3.56％，处于±15％范围内，表明本发明试剂盒较市售试剂盒B具有更好的准确度。
3)线性测定：分别采用本发明试剂盒与市售试剂盒B，采用AU480全自动生化分析仪，对50份样本(包含正常和异常样本)，按各自参数进行测定，并对测定值进行相关分析(结果见图4，X轴表示的是本发明试剂盒的测定值，Y轴表示的是市售试剂盒B的测定值)。相关系数：r2＝0.9930，线性方程为：y＝1.007x+0.513，结果表明本发明试剂盒与市售试剂盒B相关性良好。
表16 线性相关检测结果
。
Claims (6)
1.一种组合定向剂优化胶乳偶联抗体检测前白蛋白(PA)的试剂盒，所述试剂盒的检测方法基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用一种组合定向剂：定向剂1与定向剂2，按照定向剂1先结合PA抗体，形成PA抗体复合物，定向剂2再结合PA抗体复合物，最后分别与两种不同粒径的羧基胶乳微球偶联形成PA胶乳颗粒。
2.根据权利要求1所述的组合定向剂：定向剂1与定向剂2，其特征在于定向剂1为N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)或长臂活化生物素(BCNHS)，更优选长臂活化生物素(BCNHS)。所述的定向剂2为链霉亲和素。
3.根据权利要求1所述的两种不同粒径的羧基胶乳微球，其特征在于粒径分别为50nm-100nm(2.5％w/v)与200nm-300nm(5.0％w/v)，颗粒比例为80∶20。
4.以本发明方法为基础制备检测试剂盒，试剂1包括缓冲液、稳定剂和防腐剂，试剂2包括PA胶乳微球、缓冲液、保护剂、助悬剂、稳定剂和防腐剂。所述试剂1与试剂2中的缓冲液包括但不限于Tris-HCL缓冲液，PBS缓冲液，巴比妥钠-盐酸缓冲液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液中的一种或几种，更优选PBS缓冲液。PH范围为7.0-8.0，更优选PH7.5-8.0。所述试剂1中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选聚乙二醇8000与氯化钠，浓度比为2∶1。所述试剂1与试剂2中的防腐剂包括但不限于叠氮钠，proclin 300，硫柳汞中的一种或几种。所述试剂2中的保护剂为EDTA。所述试剂2中的助悬剂包括但不限于乙二醇，丙三醇，麦芽糖，蔗糖中的一种或几种，更优选丙三醇。所述试剂2中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选蔗糖。
5.PA胶乳颗粒的制备：
1)定向剂1结合PA抗体
取浓度为0.5-5μg/ml羊抗人前白蛋白单克隆抗体，与定向剂1∶长臂活化生物素(BCNHS)用量比为1∶2(mg∶mg)，混合于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，按BCNHS与二甲基甲酰胺(DMF)投料比为40∶1(w/v)加入DMF，37℃恒温振荡反应60min后，通过superdex 200层析分离去除多余BCNHS，PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒温振荡反应20min重悬，获得PA抗体复合物。
2)定向剂2结合PA抗体复合物
按定向剂2∶链霉亲和素与PA抗体复合物的投料比为1∶2(w/v)混合于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，37℃恒温振荡反应30min，通过superdex 200层析分离去除多余链霉亲和素，PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)，37℃恒温振荡反应30min重悬，获得链霉亲和素-PA抗体复合物。
3)胶乳微球的活化
取粒径分别为50nm-100nm(2.5％w/v)与200nm-300nm(5.0％w/v)的羧基聚苯乙烯胶乳微球，按颗粒比例为80∶20分别用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤后，重新溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中，分别加入1％(w/v)碳化二亚胺(EDC)活化，37℃恒温振荡反应20min，离心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤两次后，分别溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒温振荡反应30min重悬，获得活化的两种粒径的胶乳微球，。
4)链霉亲和素-PA抗体复合物与胶乳微球偶联
将步骤2)获得的链霉亲和素-PA抗体复合物按3-5∶1的体积比分别加入到步骤3)获得的两种粒径的活化胶乳微球中，37℃恒温振荡反应2h，用0.5％(w/v)赖氨酸封闭20min后，分别进行高速离心(12000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)洗涤三次，分别溶于PBS缓冲液(200mmol/L，PH7.5)中37℃恒温振荡反应30min重悬，最后将两种粒径的PA胶乳微球颗粒混合。
6.本检测试剂盒，浓度为：
。
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