CN104198696A - 一种肌钙蛋白i致敏微球的制备方法 - Google Patents

一种肌钙蛋白i致敏微球的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法，其包括胶乳微球颗粒与亲和素结合，生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合，联接乳胶和抗体等制备工序，本发明制备的肌钙蛋白I致敏微球在使用时可以提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度。

Description

一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法
技术领域
本发明涉及一种高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备方法。
背景技术
肌钙蛋白是由3个亚单位，即肌钙蛋白C、肌钙蛋白I及肌钙蛋白T组成的复合物。肌钙蛋白(cTn)被认为是目前用于ACS诊断最特异的生化marker，它们出现早，最早可在症状发作后2h出现；具有较宽的诊断窗：cTnT(5～14天)，cTnI(4～10天)。在它们的诊断窗中，cTn增高的幅度要比CK-MB高5～10倍。由于在无心肌损伤时cTn在血液中含量很低，因此也可用于minor mycardial damage(MMD，微小心肌损伤)的诊断，这是以前酶学指标所难以做到的。cTn还具有判断预后的价值，对任何冠状动脉疾患病人，即便ECG或其他检查(如运动试验)阴性，只要cTn增高，应视为具有高危险性。
心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，CTnI)是一项新的心肌损伤的特异性和敏感性指标，同其它检测指标相比，CTnI在血液中出现早、持续时间长、特异性强，作为心肌轻度受损的指标，对急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)、不稳定型心绞痛(unstable angina Oectoris，UAP)、围手术期心肌损伤等疾病的诊断、病情监测、疗效观察及预后评估都具有较高的临床价值。
Tnl存在三种不同的亚基，即慢收缩骨骼肌TnI、快收缩骨骼肌TnI和心肌收缩Tnl(CTnI)，分别有三种不同基因编码，快、慢收缩骨骼肌TnI与CTnI在氨基酸排列顺序上仅有4％相同，且后者比前者在N末端多31个氨基酸残基。前者分子量为19.8 kDa，后者为225 kDa，不同组织来源的TnI有组织特异性而无种属特异性，而CTnI仅存在于心房肌和心室肌中，且只有一种TnI存在，胎儿、新生儿及成年人各阶段的CTnI均相同，所以CTnI是一种理想的心肌细胞特异性标志。在心肌细胞膜完整时CTnI不能透过细咆膜进人血循环，当心肌细胞因缺血缺氧而发生变性坏死时，CTnI可通过破损的细胞膜弥散进人细胞间质，随之进人血管和淋巴管中。由于CTnI分子量较小，并持续从变性细胞内逸出，心肌损伤后CTnI3～6 h开始升高，14～20 h达高峰，血中可持续5～7天，故CTnI作为心肌损害的指标有较高特异性。
肌钙蛋白I（CTnI）检测方法主要有：放射免疫法（RIA）、酶免疫测定法（ELISA）、酶免疫化学发光法（CLIA）、胶乳增强免疫比浊法。现在放射免疫法存在辐射，酶免疫测定法灵敏度较差，而酶免疫化学发光法成本较高，所以胶乳增强免疫比浊法结合全自动生化分析仪进行检测的方法，最为常见。其原理为将特异性抗体结合于胶乳颗粒表面，制备致敏微球，样本与致敏微球颗粒在缓冲液中混合，样本中的TnI与致敏微球颗粒表面的抗体结合，使相邻的致敏微球颗粒彼此交联，在505nm波长下检测溶液浊度变化，变化程度与样本中的TnI含量成正比。
常规方法制备致敏微球颗粒的方式有物理吸附法和化学交联法，但是两种方法都会影响抗肌钙蛋白I（CTnI）抗体的免疫活性，而且一些非特异性吸附造成本底较大，严重影响了抗肌钙蛋白I（CTnI）抗体致敏微球的应用。
发明内容
针对于上述常规方法制备抗肌钙蛋白I（CTnI）抗体致敏微球颗粒方法存在的问题，本发明提供了一种高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备工艺，应用本制备工艺获得的抗肌钙蛋白I抗体致敏微球作为原材料配制的肌钙蛋白I检测试剂盒（胶乳增强免疫比浊法），检测试剂的空白吸光度变化比常规的试剂要低，有利于提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度，与化学发光检测的结果具有高度的一致性（相关系数r≥0.990），保证了试剂盒的准确度。
本发明是通过以下措施实现的：
一种高活性肌钙蛋白I致敏微球的制备工艺，其操作流程如下：
（1）胶乳微球颗粒与亲和素结合：选择粒径为70-140nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为6.0-7.0的0.05M的MES缓冲液中，微球浓度为0.5-5%，加入亲和素，最终浓度为1-10%，在37℃恒温箱中震荡孵育2小时，用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，用浓度为0.05M， pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，使结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为5‰；
（2）生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合：将市购的抗肌钙蛋白I抗体用0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 8.0）稀释到0.1-1 mg/mL，加入S-NHS生物素（羟基琥珀酰亚胺活化的生物素）100-1000μg，37℃恒温箱中震荡孵育2小时，后在4℃透析，以除去游离的生物素，用浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，使结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体浓度为10mg/L；
（3）联接乳胶和抗体：将结合了亲和素的胶乳微球颗粒（5‰）和结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体（10mg/L）悬浊液，按照1-5:10的体积比，加入到pH为6.0-7.0的0.05M的MES缓冲液中，在37℃恒温箱中震荡孵育4小时，用含1g/LBSA浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，获得高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球。
本发明的有益效果：
本发明提供的高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球的制备工艺，利用生物素-亲和素桥联接法原理，在聚苯乙烯微球表面结合一层亲和素，与被生物素标记的抗肌钙蛋白I抗体进行结合，形成抗肌钙蛋白I抗体致敏微球，由于生物素结合的抗体Fc端，不影响抗体活性端（Fab端）的活性，保证了制备的致敏微球活性高，而且采用桥联接法的方式，有效增大了致敏微球的比表面积，从而更容易结合肌钙蛋白I抗原，强化了免疫反应能力。应用本制备工艺获得的抗肌钙蛋白I抗体致敏微球作为原材料配制的肌钙蛋白I检测试剂盒（胶乳增强免疫比浊法），检测试剂的空白吸光度变化比常规的试剂要低，有利于提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度，与化学发光检测的结果具有高度的一致性（相关系数r≥0.990），保证了试剂盒的准确度。
附图说明
图1为实施例1检测结果与化学发光检查结果的相关性图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1
（1）胶乳微球颗粒与亲和素结合：选择粒径为70nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为6.0的0.05M的MES缓冲液中，微球浓度为0.5%。加入亲和素，最终浓度为1%，在37℃恒温箱中震荡孵育2小时。用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，去除有力的亲和素。用浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，使结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为5‰；
（2）生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合：将市购的抗肌钙蛋白I抗体用0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 8.0）稀释到0.1 mg/mL，加入S-NHS生物素（羟基琥珀酰亚胺活化的生物素）100μg，37℃恒温箱中震荡孵育2小时。在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素，用浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体浓度为10mg/L；
（3）联接乳胶和抗体：将结合了亲和素的胶乳微球颗粒（5‰）和结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体（10mg/L）悬浊液，按照1:10的体积比，加入到pH为6.0的0.05M的MES缓冲液中，在37℃恒温箱中震荡孵育4小时，用含1g/LBSA浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，获得高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球。
利用实施例1制备的致敏胶乳微球为原材料，制备肌钙蛋白I检测试剂盒，配方如下：
试剂1（R1）：     
甘氨酸缓冲液PH 7.6                        0.1mol/L
氯化钠                                   150mmol/L
聚乙二醇6000                              1g/L 
试剂2（R2）： 
甘氨酸缓冲液PH 7.6                        0.1mol/L
抗肌钙蛋白I抗体致敏微球                               1%
在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如东芝40自动分析仪。
实施例2
（1）胶乳微球颗粒与亲和素结合：选择粒径为140nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为7.0的0.05M的MES缓冲液中，微球浓度为5%。加入亲和素，最终浓度为10%，在37℃恒温箱中震荡孵育2小时。用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，去除有力的亲和素。用浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为5‰。
（2）生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合：将市购的抗肌钙蛋白I抗体用0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 8.0）稀释到1 mg/mL，加入S-NHS生物素（羟基琥珀酰亚胺活化的生物素）1000μg，37℃恒温箱中震荡孵育2小时。在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素，用浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体浓度为10mg/L。
（3）联接乳胶和抗体：将结合了亲和素的胶乳微球颗粒（5‰）和结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体（10mg/L）悬浊液，按照5:10的体积比，加入到pH为7.0的0.05M的MES缓冲液中，在37℃恒温箱中震荡孵育4小时，用含1g/LBSA浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，获得高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球。
具体肌钙蛋白I检测试剂盒制备和测定方法同实施例1。
实施例3
（1）胶乳微球颗粒与亲和素结合：选择粒径为100nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为6.5的0.05M的MES缓冲液中，微球浓度为2%。加入亲和素，最终浓度为5%，在37℃恒温箱中震荡孵育2小时。用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，去除有力的亲和素。用浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为5‰。
（2）生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合：将市购的抗肌钙蛋白I抗体用0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH 8.0）稀释到0.5mg/mL，加入S-NHS生物素（羟基琥珀酰亚胺活化的生物素）500μg，37℃恒温箱中震荡孵育2小时。在4℃，对PBS充分透析，以除去游离的生物素，用浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体浓度为10mg/L。
（3）联接乳胶和抗体：将结合了亲和素的胶乳微球颗粒（5‰）和结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体（10mg/L）悬浊液，按照2.5:10的体积比，加入到pH为6.5的0.05M的MES缓冲液中，在37℃恒温箱中震荡孵育4小时，用含1g/LBSA浓度为0.05M的PBS缓冲液（pH为7.4）进行分散，获得高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球。
具体肌钙蛋白I检测试剂盒制备和测定方法同实施例1。
实施例4
用市场上购买的利用化学交联方式制备的致敏胶乳微球为原材料，制备肌钙蛋白I检测试剂盒，具体肌钙蛋白I检测试剂盒制备和测定方法同实施例1
实验资料
试剂空白度实验
试剂空白吸光度是指测试试剂本身而带来的测试结果的微小的正误差，试剂本身的吸光度就是试剂空白，所以试剂的空白吸光度越小，肌钙蛋白I试剂盒的灵敏度会越高。利用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4制备肌钙蛋白I检测试剂盒，将组分1和组分2的试剂按照3:1的浓度混合，利用分光光度计在505nm波长下进行吸光度检测，检测结果如下表1所示。 
表1 空白吸光度检测结果
     经过对比试剂的空白吸光度，实施例3制备的肌钙蛋白I检测试剂盒吸光度最低，实施例4肌钙蛋白I检测试剂盒吸光度最高。
线性相关性实验：
对Sigma-Aldrich超纯物质肌钙蛋白I配制成26μg/L浓度的高值样本，对该样本等比例稀释成13μg/L 、6.5μg/L 、3.25μg/L 、1.625μg/L 、0μg/L浓度的样本，分别利用实施例1和实施例4制备的肌钙蛋白I试剂盒进行检测，测定流程同实施例1。检测结果如表2所示：
表32线性相关性检测结果
通过检测理论标准品，实施例1检测结果相关性为0.9993，实施例4检测结果的相关性为0.9912，说明在应用本发明致敏胶乳微球为原材料制备的肌钙蛋白I试剂盒，通过抗体免疫活性的保护，增强了试剂检测的线性相关性，检测结果更精确。
准确度验证实验：
应用实施例1制备肌钙蛋白I检测试剂盒，对比Beckman Coulter，Inc.的肌钙蛋白I测定试剂盒(化学发光法)，对40个样本进行检测，检测的结果如图1所示：
      通过检测结果的对比，实施例1的试剂盒与Siemens Healthcare Diagnostics Inc.的化学发光试剂盒检测结果相关性为0.9983，能达到≥0.990的要求，显示应用本发明致敏胶乳微球为原材料制备的肌钙蛋白I试剂盒与Beckman Coulter，Inc.的肌钙蛋白I测定试剂盒(化学发光法)有高度一致性。
本发明提供的一种高活性肌钙蛋白I致敏微球的制备工艺，采用利用生物素-亲和素桥联接法原理，有效增大了致敏微球的比表面积，从而更容易结合肌钙蛋白I抗原，强化了免疫反应能力。应用本制备工艺获得的抗肌钙蛋白I抗体致敏微球作为原材料配制的肌钙蛋白I检测试剂盒（胶乳增强免疫比浊法），检测试剂的空白吸光度变化比常规的试剂要低，有利于提高临床检测肌钙蛋白I的灵敏度，与化学发光检测的结果具有高度的一致性（相关系数r≥0.990），保证了试剂盒的准确度，增强了市场竞争力，有利于试剂的市场推广。 

Claims (1)

1.一种肌钙蛋白I致敏微球的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
（1）胶乳微球颗粒与亲和素结合：选择粒径为70-140nm的聚苯乙烯微球，均匀分散到pH为6.0-7.0的0.05M的MES缓冲液中，使微球浓度为0.5-5%，加入亲和素，使浓度为1-10%，在37℃恒温箱中震荡孵育2小时，用真空冷冻离心机离心，15000r/min离心20min，用浓度为0.05M， pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，使结合了亲和素的胶乳微球颗粒浓度为5‰；
（2）生物素与抗肌钙蛋白I抗体结合：将市购的抗肌钙蛋白I抗体用pH 8.0、浓度为0.1 mol/L 碳酸盐缓冲液稀释到0.1-1 mg/mL，加入S-NHS生物素100-1000μg，37℃恒温箱中震荡孵育2小时，后在4℃透析除去游离的生物素，用浓度为0.05M的pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，使结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体浓度为10mg/L；
（3）联接乳胶和抗体：将结合了亲和素的胶乳微球颗粒和结合了生物素的抗肌钙蛋白I抗体悬浊液，按照（1-5）:10的体积比，加入到pH为6.0-7.0的0.05M的MES缓冲液中，在37℃恒温箱中震荡孵育4小时，用含1g/LBSA浓度为0.05M的pH为7.4的PBS缓冲液进行分散，获得高活性抗肌钙蛋白I抗体致敏微球。
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