JPH01147367A - 凝血因子の測定方法及び測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、モノクロナール抗体を用いて被検液中の凝血
因子の存在ならびにその量を定量するための測定方法と
その試薬に関するものである。

〔従来の技術及びその問題点〕

血液の凝固及び線溶の現象には、血液中の多くの因子が
関係することが知られており、血液関連の疾患の診断及
び治療には、これら因子量の測定が必要である。例えば
、凝血因子の一つである安定化ヒト・フィブリン分解産
物（以下「ＦＤＰ　Ｊと略称する）は、凝固先進、線溶
亢進及び外科的手術時に、血液及び尿中に病的に存在し
てくる事が知られている。

そして、それが生体で生成される原因は、生体内で、フ
イブリノグンがトロンビン等によって安定化フィブリン
とな９、さらにこの安定化フィブリンがプラスミンなど
により分解はれることによるものとされている。

従って、このＦＤＰを測定する事は生体中の血液凝固線
溶全検知する上で重要な事項であり、この測定結果を正
確にかつ迅速に知ることは臨床上非常に重要な事でもあ
る。

周知なように、血液の凝固あるいは線溶の現象は３０分
以内の短時間でその反応が終了する。そして、その現象
の結果は、生体にとって非常に危険な状態をもたらす可
能性が高く、臨床治療の観点からは、血液の凝血因子の
測定が不正確であったｐ１測定する時間が１時間以上を
必要としたり、あるいはその測定に特殊な技術全必要と
することは非常に不都合であり、場合によっては意味の
ないものとなることもある。

従来、凝血因子、例えばＦＤＰについて定量的な測定が
望まれていたが、公知な方法は、定量的に測定するには
測定上の技術や測定時間を必要としたり、高価な特殊機
器を必要とする欠点を持っておシ、現実には定性的な測
定が中心であった。

例えば、ラテックス粒子を利用したスライド板凝集反応
は判定が肉眼判定であり、測定者の主観的判断に委ねら
れる部分があり、その測定も定性的にならざるをえない
。また、酵素免疫法を利用した定量方法（％願昭５９−
８８４９８号）はＦＤＰを定量的に測定する方法である
が、測定時間が長く、ある程度の技術を必要とした。一
方、ラテックスを利用した比濁定量法が考えられるが、
この方法は非特異反応を受は易く、測定は比色定量法が
一般的であるので、検体ブランク又は反応中の経時的な
吸光度変化を捕える方法となり、精度良く測定するため
には特殊な測定機器を必要とする欠点があった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、従来の凝血因子測定法の欠点を克服した
、迅速に凝血因子を測定する方法を得べく鋭意研冗をお
こなった結果、凝血因子に対するモノクロナール抗体及
び不溶性担体粒子を用い、生じた凝集中の凝集粒子量と
非凝集粒子量を比較すれば容易に凝血因子を定量できる
ことを見出し１本発明全完成した０ すなわち、本発明は、凝血因子に対するモノクロナール
抗体を感作させた不溶性担体粒子試薬と、凝血因子を含
む被検体とを反応させ、次いで非凝集粒子量と凝集粒子
量を比較することを特徴とする凝血因子の測定方法であ
る。

本発明方法で用いるモノクロナール抗体は、凝血因子を
用い、常法により調製される。凝血因子としては、　　
ＦＤＰのほか、プロティンＣ１β−ＴＧ％ＡＴＩＩＩ％
ＰＬＧ、α２Ｐ１、スロンビン、ＦＸＩＩ等が挙げられ
る。このモノクロナール抗体は、常法により選択したも
のをそのままで用いることもできるが、これをペプシン
、ノｅ、ｅイン等で消化加工し、Ｆ（ａｂ′）２あるい
はＦ’ａｂとして用いた方が、補体関連の妨害がなくな
り、非特異反応が減少するのでより好ましい。本発明方
法において用いられる凝血因子に対するモノクロナール
抗体の例としては、ＦＤＰＫ対するモノクロナール抗体
（特願昭５９−２０８４２号）等が挙げられる。

また、本発明方法において用いられる不溶性担体粒子と
しては、ホリアミド系、？す塩化ビニリデン系、？り塩
化ビニル系、アクリに系％ｄｅ’）酢酸ビニル系、？リ
ステレン系、？リゾロビレン系、？リエ？キシ系、ウレ
タン系、−リエチレン系、アガロース系、キトサン系お
よびゾルラン系などの高分子粒子を用いることができる
。これらの不溶性担体粒子ハ、一定割合で、カルボキシ
ル基、スルホン酸基等の酸基を有することが好ましく、
高分子の調製は、酸基を有さないモノマーと、酸基を有
するモノマーを共重合させることが望ましい。具体的に
は、不溶性担体粒子の酸基による変性度合が０１〜１０
％であるものが良く、市販品の例としては、例えば日本
合成ゴム社製５ＦＬ−１４０Ｌシリーズ、５ＦＬ−１５
５ンリーズ、５ＦＬ−２００Ｌシリーズ、　　５ＦＬ−
１４０Ｓシリーズのラテックス粒子や、積水化学社のＮ
シリーズ、ダウ社のカル？キシ変性うテックス粒子、エ
スタ？−ル社のにシリーズのラテックス粒子等が挙げら
れる。この不溶性担体粒子の粒径としては、好ましくは
０５〜２μｍ％特に０６〜１．２μｍの範囲のものを用
いることができる。

不溶性担体全モノクロナール抗体で感作するには、常法
に従えば良く、例えば不溶性担体の緩衝液懸濁液中に、
モノクロナール抗体の緩衝液溶液を加え、１時間〜−昼
夜放置後、遠心分離等の手段により未感作のモノクロナ
ール抗体を除去する物理吸着法により実施される。しか
しながら、本発明方法において、より感度を高め、試薬
の耐久性及び安定性を良くするためには、公知の二架橋
試薬や結合剤を用いてモノクロナール抗体を不溶性担体
に感作させる化学的共有結合法を採用することが望まし
い。また、感作に当ってのモノクロナール抗体の濃度は
、２５〜３００μｆ／ｄ程度、不溶性担体粒子の濃度は
０２〜２％程度が一般に適当であるが、当然測定すべき
凝血因子の種類や濃度、用いるモノクロナール抗体の種
類やその特性、不溶性担体粒子の材質、粒径及び酸基に
よる変性度合によってこれを適宜変更することもできる
。

斯くして得られる、モノクロナール抗体で感作された不
溶性担体は（以下、「不溶性抗体試薬」と略すことがあ
る）、必要により牛血清アルブミン（以下［ＢＳＡ　Ｊ
と略す）や種々の界面活性剤などで処理した後、緩衝液
中に懸濁させたり％あるいＶｉ凍結乾燥することにより
保存される。

本発明方法を実施するには、常法に従い、不溶性抗体試
薬中に凝血因子を含む被検体を加え、インキュベートし
、次いで、生じた凝集物中の非凝集粒子量と凝集粒子量
を測定し、これを比較すれば良い。被検体としては、血
漿、血清、体液等を用いることができ、また。

インキュベートは２０〜４５℃程度で３〜３０分間おこ
なえば良い。非凝集粒子量及び凝集粒子ｆｆ１ｋ測定す
るには、レーザー散乱法等によシネ溶性抗体試薬に対応
する粒径の粒子と、これが凝集してできる凝集粒子に対
応する粒径の粒子を求めれば良い。より具体的には、例
えば予め濃度既知の凝血因子試料を用いて、凝集粒子量
と非凝集粒子量の比率（反応比率）等を求めて検量線を
作成し、これに基いて被検試料中の凝血因子量が定める
ことができる。

なお、従来の電気抵抗法（コールタ−原理）による粒子
測定機器で本発明方法を実施する場合には、そのアノＱ
チャーのオリフィス径を２０〜５０μｍとすれば良く、
本発明方法により凝血因子量を正確に測定することがで
きる０ 〔作用及び発明の効果〕 本発明方法は、１．脱フィプリノグンを必要としない。

２感度良く定量できる。ａ操作が非常に簡単でちゃ、測
定時間は採血から３０分以内と迅速に終了する。４．非
特異的反応、特にリウマチ因子等の影響を防止すること
ができる等の特長を有する。

したがって、迅速かつ簡便に生体内の凝血因子を測定す
ることができ、医療、臨床検査等の分野において極めて
有用なものである。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ モノクロナール抗体０３２０２’ｉ用いたＦ’ＤＰの測
定： （１）　　モノクロナール抗体の不溶性担体への感作方
法： 粒径１，０μｍの１０％、ｄ　ＩＪスチレンラテックス
懸濁液（日本合成ゴム社製；　５ＦＬ−１４０Ｌ　）′
ｊｔＱＯ５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８，０）で１０倍希
釈した。これに１００μｆ　／　ｄのＦＤＰモノクロナ
ール抗体（特願昭５９−２０８４２号に記載したモノク
ロナール抗体０３２０２　）を等量混合し、４°Ｃ下で
２時間静置した。ついで％０，５％牛血清アルブミン（
以下、　ＢＳＡと略す）を含む同緩衝液を１容量添加油
合させて更に２時間静置させたのち、遠心法により未感
作のモノクロナール抗体を洗浄・除去し、最終的に０２
％ＢＳＡ、０１％ＮａＮ３を含む同緩衝液に再懸濁し４
℃下で保存した。

（２１ＦＤＰの測定： ■　濃度既知のＦＤＰ標準品５０μｔと、（１）で調製
した不溶性抗体試薬５０μｔとを混合させ、３７℃下で
１０　分子’ａ’５インキュベーションした。緩衝液で
反応を停止させたのち１００〜５００倍希釈し、反応で
得られた凝集反応物の粒度分布を、コールタ−カウンタ
ーＺＢＩ＆Ｃ−１０００を用いた電気抵抗法（コールタ
−原理）によって計測した。

■　■で得られた凝集反応物の粒度分布を、コールタ−
カウンターＺＢＩ　＆　ｃ−１０００に接続した日本電
気社製コンピューターＰ　Ｃ９８０１に転送して、未凝
集のモノクロナール抗体感作粒子と凝集したモノクロナ
ール抗体感作粒子の総体積の比率を解析し、反応率を算
出した０ ■　ＦＤＰ標準品で得られた反応率を縦軸に、また標準
品のＦＤＰ濃度を横軸にプロットして検量線を作成した
。これを第１図に示す。

実施例２ 種々の被検体について、実施例１に記載の方法及び特願
昭５９−８８４９８号に記載した酵素免疫学的測定法に
よってＦＤＰ　９度を測定し、これらの相関性を検討し
た。この結果を第２図に示す。この結果から明らかなよ
うに本発明におけるＦＤＰ測定値と特願昭５９−８８４
９８号に記載した酵素免疫学的測定法との相関は、γ＝
　０．８０９であシ、良好な結果が得られた。

実施例３ モノクロナール抗体０３２０４を用いたＦＤＰの測定： （１）　　モノクロナール抗体の不溶性担体への感作方
法： ？リスチレンラテックスの粒径を０８μｍとし、モノク
ロナール抗体として特願昭５９〜２０８４２号に記載の
０３２０４を用いる以外は実施例１と同様に処理して不
溶性ＦＤＰ抗体試薬全作成した。

（２１ＦＤＰの測定： ■　ＦＤＰ標準品あるいは被検体５０μｌと、（１）で
調製した不溶性抗体試薬５０μｔとを混合させ、以下実
施例１（２）の■、■及び■と同様に操作して検量線を
作成し、ＦＤＰ量を測定した。検量線を第３図に示す。

実施例４ モノクロナール抗体１１２１１および １１２２４を用いたβ−トロンボグロブリン（β−ＴＧ
　）の測定： （１１モノクロナール抗体の不溶性担体への感作方法： 粒径１．０μｍ（日本合成ゴム社製）の１０％ポリスチ
レンラテックス懸濁液’ｉ　０．０５　Ｍグリシン緩衝
液（ｐＨａｏ）で１０倍希釈した。これに１００μＦ／
ｗｌの常法により得た、１１２１１および１１２２４と
番号を付されたβ−ＴＧのモノクロナール抗体を別々に
混合させ室温下で２時間静置させたのち、０．５％ＢＳ
Ａを含む同緩衝液を等量混合し４℃下で２時間静置させ
た。ついで、遠心法により未感作のモノクロナール抗体
を洗浄・除去し、最終的に０２％ＢＳＡ、Ｏ１％Ｎ＆Ｎ
３　ｋ含む同緩衝液に再懸濁させたのち、両モノクロナ
ール抗体感作粒子を等量づつ混合し４℃下で保存した。

（２）　　β−ＴＧの測定： ■　濃度既知のβ−ＴＧ標準品と（１）で調製したモノ
クロナール抗体感作粒子５０μｔとを混合させ、３７℃
下で１０分間インキュベーションした。停止液で反応を
停止させたのち２００倍希釈し１反応で得られた凝集反
応物の粒度分布を、コールタ−カウンターＺＢｒ　＆Ｃ
−１０００を用いた電気抵抗法（コールタ−原理）によ
って計測した。

■　■で得られた凝集反応物の粒度分布を、コールタ−
カウンターＺＢＩ　＆Ｃ−１０００に接続した日本電気
社製コンピューターＰＣ９８０１に転送して、未凝集の
モノクロナール抗体感作粒子と凝集したモノクロナール
抗体感作粒子の総体積の比率を解析し、反応率を算出し
たＯ ■　β−ＴＧ標準品で得られた反応率を縦軸に、また標
準品のβ−ＴＧ濃度を横軸にゾロットして検量線を作成
した。この検量線を第４図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第３図は、　　ＦＤＰについて求めた検量線
を示す図面である。 ！８ｇ２図は、本発明方法と酵素免疫学的測定法との相
関を示す図面である。 第４図は、β−ＴＧについて求めた検量線を示す図面で
ある。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、凝血因子に対するモノクロナール抗体を感作させた
   不溶性担体粒子試薬と、凝血因子を含む被検体とを反応
   させ、次いで非凝集粒子量と凝集粒子量を比較すること
   を特徴とする凝血因子の測定方法。 ２、モノクロナール抗体が、Ｆ（ａｂ′）＿２画分又は
   Ｆａｂ画分である特許請求の範囲第１項記載の測定方法
   。 ３、被検体が血漿、血清および体液である特許請求の範
   囲第１項記載の測定方法。 ４、不溶性担体粒子が、０．５〜２μｍであり、表面が
   酸基で覆われている特許請求の範囲第１項記載の測定方
   法。 ５、電気抵抗法またはレーザー散乱法により非凝集粒子
   量と凝集粒子量を比較する特許請求の範囲第１項記載の
   測定方法。 ６、凝血因子に対するモノクロナール抗体を０．５〜２
   μｍの粒径の不溶化担体に感作させたことを特徴とする
   凝血因子測定用試薬。 ７、モノクロナール抗体がＦ（ａｂ′）＿２画分又はＦ
   ａｂ画分である特許請求の範囲第６項記載の試薬。