JPS6093353A - Ｆｄｐの免疫学的測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生体試料中のＦｌ）Ｐ＜フィブリン、フィブリ
ノ−ケン分周イ産物　Ｆｉｂｒｉｎ　ａｎｄ　Ｆｉｂｒ
ｉｎｏｇｅｎｌ）ｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｌ’ｒｏｄｕ
ｃｔ　）の免疫学的凝集反応を光学的に測定する方法に
関する〇 更に詳しくは、ＦＬ）Ｐを含む生体試料（血清、尿等）
、及びＦＤＰ抗原を感作した不溶性担体粒子にＦＤＰ抗
体を混合反応せしめ、その結果生しる凝集現象をレーザ
ーを光源とする光散乱強度の変化として検出し、Ｆｌ）
Ｐを定量する方法に関する。

生体試料中のＦ　Ｄ　Ｐ　Ｍ　’ａ＝知ることば、生体
内での凝固、線維素浴解現象を知る上で極めて■をであ
り、臨床横骨の面で帰裡性皿省内凝固ｈＥ候群（ＤＩＣ
）、血栓症ならびに血栓俗解療法などの診断や社過観緊
に必要な横骨となっており、ｌｉ’Ｌ）Ｐの高精度且つ
迅速な測定方法が強く望まれている。

従来、Ｆ　Ｄ　Ｐ抗体を感作した不溶性担体粒子をカラ
ス平板上で被横試料と混合し・抗原−抗体反応Ｖこよる
不溶性担体粒子の凝集の有無を肉眼てイυｌ察する事に
よってＦＬ）Ｐ量を半疋量する方法が知られている。

又、凝集状悲を定量的に測定する為にＦＤＰ抗体を感作
した不溶性担体粒子を浴Ｒｋ内でｂＬ原−抗体反応させ
、これに波長が不溶性担体粒子の平均粒径の１５倍以上
の近赤外光を照射して凝集反応を光学的に測定する方法
等が知られている。

しかし、これらの方法はいずれもＦＤＰ抗体を不溶性担
体粒子に感作した方法である為、試料中の共存物質、特
にリウマチ因子による影響を受け易く、それにより非特
異的凝集反応が起って正確な測定１直が得られないので
、このリウマチ因子による非特異的凝集度ＬＥ、を防ぐ
為に通常、使用する抗体を予め消化酵素（ペブンン、パ
パイン等）により不活性化してから用いることを余儀な
くさｉｔでいる。又、抗体を不耐性］Ｕ体に感作した方
法では、抗原過剰域に於て凝集反り巳、の遅滞現象を起
し易く、測定の誤差を牛し易い。その為５試料の希釈等
の処置を必要としていた。

本発明者らｔま、Ｆｌ）Ｐの６１１１定に関して上記し
た従来法の欠点を解決すべく鋭、を研冗を重ねた結果、
Ｆｌ）Ｐを含有する生体試料、及びＦ　Ｌ）　Ｐ抗原を
感作した不溶性担体粒子に、ＦＤＰ抗体を混合反応させ
、この反Ｉ６ｒ昆合物−こ波Ｂｏ、ｓミクロノ未滴のレ
ーデ−元＃！を照射し、該灰化、混合物の散乱光の強度
を散乱角θ＝３０°〜６Ｃ）０で選択的に検出すること
により、ＦＤＰ量を正確月、つ迅速に測定し得ることを
見出し、本発明を完成するに到った。

本発明者らは先に、レーザーを光源として凝集反応の散
乱光を測定する方法に於て反応の初期段階で凝集による
散乱光の変化を幌めて鋭敏に捉えることができる慣用角
度が存在することを見出し、免疫学的凝集反応による抗
原或いは抗体の定量法として二件の特許出願を行ってい
る（特願昭５７−５５８６２号及び特願昭５７−５６４
３２号）、。

更に、この技術を利用し、発展させたものとして、本発
明者らは、平均粒径が０．１　ミクロン未満の不溶性担
体粒子を抗体或いは抗原の担体とし、該粒子の免疫学的
凝集をレーザー光線を照射した場合のｌ持定の角度に於
ける元敗乱強１反の変化として１突出する抗原あるいは
抗体の篩相変な定量法を並立し、特許出願している（特
願昭５７−７０１　：３６号）。

本発明者らは、これらの先行技術をＦＩＪＰの測定に応
用すると共に、更に一歩進めて、抗体ではなく、抗原を
感作した不溶性担体粒子を本測定に於て用いることによ
り、全く意外なことに、これまで不可避と思われていた
抗体を感作した場合に生じる前記問題点を一挙に解決し
、即ち、リウマチ因子等の共存物質の影響を受けず、従
って、抗体に予め前処理を施す必要がなく、又、抗原過
剰の場合に誤った測定皿が伶らルるというようなことも
なく、従って試料の希釈など行う必要のない、正確で、
且つ、繁雑な操作を要しないＦ’ＤＰの免投学的測定法
を提供する本発明に到達したのである。

不溶性担体粒子を用い、免疫学的凝集反応を光学的に測
定する方法に関しＣは、これまで数多くの報告がなされ
ているが、不溶性担体粒子に抗体を感作し１こ場合と抗
原を感作した場合とで、これほど大きな差違があるとい
うことについて触れたものは皆無であり、本発明者らが
、独自の知見に基き、鋭意ｏｆｆ究の結果初めてなし得
たことである。

本発明で用いる不溶性担体粒子としては、本発明の測定
を行う隙に用いられる液体媒体に実質的に不溶性な微粒
子、汐りえばポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重
合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、メチルメクク
リレ−１・−メタクリル酸共重合体などの様な乳化重合
により得られる有機高分子のラテックス、或いはソリ力
、アルミナなどの様な無機酸化物粒子が用いられるが、
なかでもポリスチレンラテックスがＩ持に好適である。

本発明に用いる不溶性担体粒子の粒径については特に限
定するものではないが、初期凝集反応を相変よく検出す
るため粒子径は小さい方がよく、平均粒子径Ｏ，Ｘミク
ロン以下、好ましくは０．０８〜０．０９　ミクロンの
範囲の微粒子が用いられるが、この範囲を外れるもので
あっても特に問題はない。

かかる不溶性担体粒子ζこ目的とする抗原を感体する方
法としては、物理的に吸着さぜる方法、化学的に吸着さ
せる方法等、多くの方法が知らｎ、ているが、これら自
体公知の方法のいずれにてもよＧ）。

抗原を感作した上記不溶性担体粒子の反Ｌ５７＆中のａ
度は、通常０．Ｏ１〜０．１止ｉ１％、好ましくはｈ、
（１２〜０．（１５重量％の範囲で用いらり、る。

反応の進行に液性は重要であり、通常１）　Ｈ７，Ｏ〜
８，５の範囲て反応させるが、その為の緩衝剤としては
、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン
緩衝液等通常用いられる緩衝剤が例外なく用いられる。

生体試料、及びＦｌ）Ｐ抗原を感作させた不溶性担体粒
子に、ｌ”　Ｄ　Ｐ抗体を混合反応させる方法としては
、予め生体試料とＦＬ）Ｐ抗体とを混合反応させ、然る
後、ＦＤｐｒ、ｒ感作した不溶性担体粒子を混合反りし
させても良いし、又、初めに生体試料さ、Ｆ　Ｊ）　Ｐ
を感作した不溶性担体粒子を混合しておき、その混合液
にＦｌ）Ｐ抗体を加えることにより、Ｆｌ）Ｐ抗体に対
し、生体試別中のＦＤ’Ｐと、ＦＤＰを感作した不溶性
担体粒子とを競合反応させても良い。

ＩＩＩ名の場合、即ち、予め生体試料とＦＤＰ抗体とを
混合反応さぜ、然る後、ＦＤＰを感作した不溶性担体粒
子を混合反応させた場合には、ＦＤＰの低濃度試料では
ＦＤＰ抗体の消費量が少ない為、多量のＦ　Ｄ　Ｐ抗体
が残り、このＦＩＪＰ抗体が分注されたＦＤＰ感作不溶
性担体粒子を急速に凝集させる。又、ＦＤＰの高濃度試
ｆ−１ではＦｌ）Ｐ抗体の消費量が多くなりその結果少
量のＦＤＰ抗体が伐り、このＦＩＪＰ抗体がＦＤＰ感作
不浴性担体粒子を緩慢に凝集させる。従って試料中のＦ
　Ｄ　Ｐ　ｈｉが低濃度の場合にはｈ”　ｖ　ｐ感作不
溶性担体粒子の凝集反応は急速に起り、これに波長ｏ、
ｓ　ミクロン未満のレーサー元を照射して借られるｙ０
赦乱動度の変化量は増大し、逆にＦ　ｌ）　Ｐ　＋′Ｆ
６跳１及の場合には九散乱強度の変化量は減少する。（
第２図蚕照）又、後者の場合、即ち、ｌ”　Ｄ　Ｐを含
む生体試料とＦ’ＤＰを感作した不溶性担体粒子の混合
液に抗１（゛ＩＪＰ浴液を力Ｕえると、抗ＦＤＰ　Ｋ対
し試和山来１ｉ”ＤＰとＦＤＩ）感作不射性担体枚子と
が競合して灰化、−３−ろ。

この時試料中のＦｌ）Ｐ量が低ｍｌ＋７１の場合抗ＦＬ
ＡＰの大部分にＦ　ｌ）　Ｐ感作不溶性担体粒子と反１
６Ｌ憩、速に凝集が起り、光散乱強度の変化量は増大す
る。

又試料中のＦＤＰ量が編製１ｔの場合は抗Ｆ”　Ｌ）　
Ｐの大部分は試料中のＦＤＰと反応しその結果ＦｖＰ感
作不浴性担体粒子との反応は緩慢に進行し光散乱強度の
変化量は減少する。（第３図参照）即ちいいずれにして
も、本発明の方、法によれば血清試料の測定で商い測定
精１反が要求されるＦＤ、Ｐ量２．５〜２０μｊｉ　／
　ｌｎｌの濃明域において尚い反応感度が得られる為、
より正確な測定結果が得られる。又Ｆ　１）　Ｐ　８０
μｇ／ｍ１以上の高姻度域に旧いても従来の抗体感作不
溶性担体粒子を用いた場合に問題となる抗原過剰−こよ
る測定結果の誤りも起し得なし）。

第１図に本発明に係るレーザー光源と元散乱源である被
恢液及び光検出器の配置の一例を示す。

反応キュヘット１２１内の被＠戚４＆まレーサー光源１
より発せられた一定光敏のレーＩＪ’−光束によって照
射され、被伏准の状態に比、して該入射光束を散乱する
。この散乱強度を測戻して電気信号に変換する光慣用器
３が反応キュヘットに対して特定の位置に配置される。

レーサー光源ｌは、例えは発振波長７８０ｎｍ付近の可
視半導体レーザーがよく、反ｔ６．キュベツト２は、例
えば内径５ｍｍの試験管キュベツト、また光検出器３は
ソリコンフォトセルでよい。反応キュヘット２の中心を
通るレーザー元軸と光検出器３のなす角度をθとすると
、凝集反応の初期過程を感度よく安矩に検出するには、
θが３０°〜６０°の範囲にある心安がある・θ≧９０
°の前方散乱光の領域では極度の濁りのため、凝集によ
る散乱光の食化合恢出することが非常に困難となるが、
これは従来の透過光測雉あるいは積分球による散乱光測
定に伴なう困難さと共通のものである。

また、θ〈３０°の領域では、凝集による散乱光の変化
自体が微／Ｊ／になると同時に、反応キュヘットによる
反射光の影響も強くなるため、やはり、測定精度が低下
する。

本発明に於ける検出角度θ二３（）０〜６０°が凝集反
応の初期過程に最も鋭敏であり、かつ＋１１１１　＞ｊ
ｌに必要とされる十分な感度合力える最適角度である。

レーザーを光源とすることは、光散乱イゴ号強度の増大
に好適であることは言うまでもない。

散乱光強度の測定は一定時間抜の増加量を測るエン１′
ポイント法も可能であるが、初期反応の変化量をめれば
相変もよく測定所要時間も短かくて済む。

本発明は従来の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合に
問題となる試料中の共存物質即ぢ、リワマチ因子等によ
る影響を受けず、さらにＦＬ）Ｐの過剰域での遅滞現家
を起さず、低濃度のＦｌ）Ｐから尚濃朋のＦＤＰ試料ま
で広範囲の測定を可能としたものであり、高感度、尚４
ｎ度でしり）も迅速なＦＤＰの免疫学的測疋法を提供す
るものであって、斯業に貢献す勺ところ甚だ大なるもの
がある。

以下に実施例を７トす。

実施例　１ １、試薬の調製 （１）　ｌｉ’　Ｄ　Ｐ感作ラテックス浴散乎均粒径１
．（１８５ミクロンのポリスチレンラテックスを１％含
有する０、（１５４Ｖ１グリシン緩＃ｅ’９Ｈ’８．０
　１容にＦ　Ｄ　Ｐ　Ｏ，１％含有す６（１，０５Ｍグ
リシン緩衝液ｐＨ８，０１谷を混合し、室温で１時間区
押抜遠心分離（：（（１，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、６０分）
し、沈渣を０．＋１５Ｍグリシン緩衝液ｐ　Ｈ８，０で
分散し、ラテックス濃１ｆ７＜　０．０４％とする。

（２）抗ＦＤＰ溶液 抗ＦＬ）Ｐ　（ウサギ）血／胃を生理食塩水を用Ｇ１て
抗体価１００μｇ　Ａｂ／　ｍｌに希釈する。

２、操作法 内径５１胆の試験官キュヘノ１−に標イ！−８試料（Ｌ
ｆｌｌ　（＋’ｔ　）０．１１Ｉｌｌｉとり、これに抗
Ｆ　Ｄ　Ｐ　ｉ’ａ液０　、　ｌ　ｍ１１！’、３２　
）Ｊｌｌえ混合して３７°Ｃで３０分間加温する。（′
ＫにＦｖ　ｉ）感作ラテックス溶液０．２ｍｌを加えて
混合後、波長７８０ｎｍのレーザー光線を照射し′Ｌ散
乱強度０〕以下存白 第１表 Ｆ　］）　Ｐ量と光散乱強度の変化量 実施例　２ ■、試薬の調製 （１）　Ｆ　Ｄ　Ｐ感作ラテックス浴数平均粒径０．（
１９ミクロンのボリスチレンラテックスヲ０．５％含有
する０、１　Ｍグリシン緩衝液ｐＨ７，５１容にＦ　Ｄ
　Ｐ　Ｏ，２チ含有する０、１　Ｍグリシン緩衝液ｐＨ
７゜５１容を混合し、３２℃で２時間加温後遠心分離（
３０，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、６０分）し、沈渣を０．１　
Ｍグリシン緩＊１ＭｐＨ７，５で分散し、ラテックス濃
度７．：Ｏ，１％とする。

（２）抗ＦＤＰ溶液 抗ＦＤＰ　（ウサギ）血清を生理食塩水を用いて抗体価
４０μｇＡｂ／ｍｌに希釈する。

２、操作法 内径５朋の試験管キュベツトに標準試料（血清）０．１
ｍ１ｆとり、これにＦＤＰ感作ラテックス０．１ｍｌを
加え混合する。次に抗Ｆ’ｌ）Ｐ浴液０．２ｍｆｆを加
え混合後波長７８０ｎｍのレーザー光線をｊ；（１射し
、散乱光強度の変化を散乱角０　＝　４００で検出する
。

試料中のＦＤＰ量と光赦乱強度の変化量との関係を第２
表及び第３図に示す。

ンス下＃Ｏ 第２表 ＦＤＰ量と光散乱強度の変化量 実施例　３ １、試薬の調製 （１）　Ｆ’　ｌ）　Ｐ感作ラテックスｆｆ４１戊平均
粒径０．０８５ミクロンのボリスチレンラテックス（！
−（Ｌ５％含有するｌＪ、＋１５Ｍグリシン緩衝液ｐ　
Ｈ８，（１１容にＦｌ）ｐＨ，２％含有する０、０５　
Ｍグリノン緩価Ｍｐ８８．０　１谷を２５℃で混合し。

１時間撹拌後逮Ｉシ分離（２５，００Ｏｒ−ｐ、ｍ、　
９０分）し、沈渣を０．０５　Ｍグリソン緩債ｉ液ｐ　
Ｈｓ、ｌｌて分散し、ラテックス濃度を１１．０５％と
する。

（２）抗Ｆｌ）Ｐ浴液 抗Ｆ’１）Ｐ（ヤギ）血清を生理食塩水を用いて抗体価
２０　／１．９Ａｂ／　ｍｌｌに希釈する。

２、操作法 内径５朋の試験官キユベツトに標準試料（尿）０．２ｍ
１１ｇとり、これに抗Ｆ　Ｄ　Ｐ　浴ｉ’（Ｉ　Ｏ、ｌ
　ｍｌ’、ｙ加えて混合し、３７℃で３０分間加温する
。次にＦＩＪＰ感作ラテッうスｍ　ｆｉＯ，２ｒｎｌを
加えて混合後波長６３　ｆｌ　ｎ　ｍのレーザ゛−光線
を照射し、光散乱強度の変化を散乱角θ−６０°で検出
すの。

試料中のＦＤＰ量と元散乱蝕度の変化量とのｌ＆ｊ係を
第３表及び第４図に示す。

以下凛白 第　３　表 Ｆ’ＤＰ量と光散乱強度の変化量 実施例　４ 実施例１に於ける標飴試旧（血清）の代りに被検試料（
サンプル血清）を用い、実施例１の方法に従ってｆｔ、
散乱強度の変化量を６１１１定し、実施例１の検量線力
）ら被検試料中のＦＤＰ量をめる。

本実施例に従って被検試料中のＦＤＰ量をめ既存のラテ
ックス平板凝集法によりめ１こ呟と比較した結果を第４
表に示す。

第　４　表 不法と既存法（ラテックス平板凝集法）によるＦＤＰ測
定匝の比較 ＊ラテックス平板凝集法 段階希釈した試料を用いてスライド板上で測定する方法
で測定［直は検体の希釈倍数で示される為、５．１０，
２０，４０，８０，１６０（μｇ／ｍｌ）という１直と
なる。

【図面の簡単な説明】

第１図は測光系の原理図を示す。 ■・・・・・・レーザー光源 ２・・・・・反応キュベツト ３・・・・・光検出器 ４・・・・・・被検液 第２図、第３図及び第４図は、各々、実施例１゜実施ｆ
１．ｌ　２及び実施例３に於て得られた検量線を表わし
、横軸の各Ｆ’　Ｄ　Ｐ　批（μｉ　／　ｍ１３又はｎ
　ｉ　／　ｍｅ　）について得らｆ″した光散乱強度の
変化量（ｄｓ／ｄｔ）をｗ：、ｌｌ！ｌｌＩに浴ってプ
ロットした点を結んだものである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 第１図 第　２　図 ０　５０　１００　１５０ ＦＤＰ量（ｐｆ／ｍｅ） 第　３　図 ０　５０　１００　１５０ ＦＤＰｔ４ｔ（ｐｔ／ｍｅ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）生体試料中のＦＩＪＰ　（フィブリン、フィブリ
   ノーゲン分解産物）の測定を行うに際し、生体試料、及
   びＦＤＰ抗原を感作させた不溶性担体粒子に、ｆ”　Ｄ
   　Ｐ抗体を混合反応せしめ、この反応混合物に、波長が
   ０．８　ミクロン未満のレーザー光線を照射し、該反し
   ６混合物の散乱光の強度を散乱角０　＝　：（０°〜６
   ０°で退択的に検出Ｔることを特徴とする、ＦＤＰの免
   疫学的測定方法。
2. （２）上記レーザー光線の光源か発振波長７８０ｎｍの
   半導体レーザーである時１１請求の範囲第１項記載のＦ
   ＤＰの免疫学的ｄｔｌｌ定方法。