PT1573335E

PT1573335E - Ensaio de dcv

Info

Publication number: PT1573335E
Application number: PT03786143T
Authority: PT
Inventors: Erling Sundrehagen
Original assignee: Axis Shield Asa
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-22
Publication date: 2007-12-21
Also published as: DK1739430T3; EP1739430A2; CN1729398B; EP1739430A3; PL377476A1; US20060134705A1; JP5744385B2; JP2006510895A; JP2010019849A; AU2003295142A1; US20190049439A1; CN1729398A; DE60317931D1; EP1573335A2; DE60327007D1; ES2323475T3; GB0229747D0; CA2729365C; ATE380345T1; CA2504876A1

Description

DESCRIÇÃO "ENSAIO DE DCV" A presente invenção refere-se a um método de ensaio para detectar potencial ou propensão para doença cardiovascular (DCV) num indivíduo, e. g., um animal humano ou não humano, especialmente um mamífero, e em particular a um método de ensaio que pode ser utilizado para detectar um potencial para DCV ou uma propensão para DCV antes do início de sintomas de DCV notadas pelo indivíduo. A DCV é uma fonte principal de doença entre a população humana. Em 1998, aproximadamente 40% de todas as mortes no mundo ocidental foi resultado de DCV (i. e., 1 em cada 2,5 mortes).

Para 2002, é estimado que, nos EUA, mais do que um milhão de pessoas sofrerão de um ataque cardíaco novo ou recorrente, e mais do que 40% das pessoas que sofrem estes ataques morrerão. Muitas destas pessoas morrerão subitamente sem nunca terem sido hospitalizadas ou tratadas. Muitos nem sequer suspeitavam que eram susceptíveis a DCV. O tratamento precoce ou antecipado tal como uma alteração na dieta, redução ou cessação de fumar, aumento do exercício, redução do peso corporal, etc., possui, contudo, uma taxa de sucesso elevada na prevenção de DCV ou redução da propensão de DCV. Deste modo, se a DCV ou potencial ou propensão para DCV poder ser detectada, existe disponível um tratamento eficaz.

Existe, desta forma, uma necessidade para métodos que podem ser utilizados para detectar DCV e especialmente, o potencial ou propensão para DCV, antes que a doença progrida para além do estágio em que o tratamento (e. g., alteração do estilo de vida e/ou hábito) tem rotineiramente sucesso. Em particular, existe a necessidade de métodos que podem ser utilizados para detectar DCV em estádios precoces quando os sintomas não são aparentes para um indivíduo ou para um terceiro, e. q.r um médico, i. e., são necessários métodos para testar indivíduos "sem sintomas".

Estes métodos podem ser utilizados para rastrear a população geral (i. e., em rastreio em massa) ou em grupos de risco na população, e. g., homens acima dos 40, trabalhadores em empregos de stresse elevado, com dietas não saudáveis, indivíduos que sofrem de obesidade clínica, fumadores, etc. Em casos em que o potencial para DCV ou propensão para DCV é diagnosticado, o tratamento antecipado pode ser dado e/ou o doente pode ser encorajado a fazer ajustamento ao estilo de vida e hábitos.

Do mesmo modo, quando é detectado o potencial para DCV ou propensão para DCV, um doente podem ser submetido a outros testes, e. g., utilizando técnicas mais dispendiosas ou demoradas, tal como ECG, com e sem actividade física, imagiologia por radioisótopos de perfusão do miocárdio, angiografia do miocárdio por raios X (e. g., CT), angiografia do miocárdio MR ou imagiologia de perfusão, etc. assim, confirmando a possível presença de, ou potencial para, ou propensão para, DCV, utilizando o método de ensaio pouco dispendioso e fácil da invenção, num rastreio inicial (e. g., num rastreio em massa de indivíduos saudáveis "sem sintomas") a probabilidade de detectar ou identificar DCV não descoberta, ou potencial para DCV, antes que os danos na saúde se tornem irreversíveis, é aumentada 2 enquanto, ao mesmo tempo, a utilização desnecessária de testes dispendiosos e morosos é limitada.

Por "DCV" entende-se qualquer estado do coração, artérias, ou veias que interrompe o suprimento de oxigénio a áreas de sustentação de vida do corpo, tal como o cérebro, coração etc. Exemplos de DCV são arteriosclerose, enfarte agudo do miocárdio, angina de peito, doença isquémica do coração, doença cérebrovascular, trombose, hemorragia subaracnóide, hemorragia intra-cerebral, enfarte cerebral, falha congestiva do coração, angina, ataque de coração, paragem cardiaca e arritmia. A presente invenção é baseada na observação surpreendente de que a proteina calprotectina é um "marcador" ou "indicador" útil do potencial para DCV ou propensão para DCV antes do inicio de sintomas de DCV (í. e., em indivíduos sem sintomas). Em particular, foi surpreendentemente observado que níveis anormalmente elevados de calprotectina em vários fluidos corporais é indicador de susceptibilidade para DCV antes do início de sintomas de DCV ser aparente num indivíduo ou para um terceiro (e. g., um médico).

Para evitar a dúvida, o termo calprotectina é aqui utilizado como sinónimo de "proteína Ll", "MRP 8/14", "antigénio da fibrose cística (CFA) (associada)" e "calgranulina". A calprotectina existe em ambas as formas dimérica e trimérica. Como um dímero, a calprotectina compreende as cadeias polipeptídicas S100A8 e S100A9. Como um trímero, a calprotectina é uma proteína heterotrimérica de 36 kDa com duas cadeias pesadas (14 kD) e uma cadeia leve (8 kD) não ligadas covalentemente. 3 A calprotectina é uma proteína de ligação a cálcio e quando ligada ao cálcio, a calprotectina é resistente ao aquecimento e à proteólise. Isto pode permitir que sejam empregues uma grande variedade de técnicas e condições de ensaio. 0 mapeamento de epitopo da calprotectina demonstra que podem ser produzidos anticorpos com especificidade para o complexo e/ou as suas cadeias de proteína simples. Foi demonstrada a existência de, pelo menos, quatro sítios imunogénicos separados no complexo de calprotectina. Alguns anticorpos reconhecem ou a cadeia pesada ou a cadeia leve, enquanto que outros reconhecem ambas. A calprotectina é encontrada em células, tecidos e fluidos em todas as partes do corpo humano e é derivada, predominantemente, de neutrófilos e monócitos. A calprotectina está provavelmente presente em todos os indivíduos, uma vez que de entre mais de 5000 indivíduos testados, não foi encontrada calprotectina livre individual. A calprotectina também se encontra em ratos, murganhos, coelhos, ovelhas, bovinos e porcos. É por isso uma molécula ubíqua abundante. A calprotectina está envolvida em numerosas funções biológicas in vivo, incluindo transdução de sinal intracelular, activação de neutrófilos, inibição de enzimas intracelulares envolvidas na proliferação celular, actividade antimicrobiana e na defesa por neutrófilos. A calprotectina é também uma proteína reguladora em reacções inflamatórias e neste papel pode funcionar para estimular a 4 produção de imunoglobulina, actividade de factor quimiotáctico e factor de imobilização de neutrófilos.

Enquanto que os fluidos corporais provavelmente compreendem sempre calprotectina, a concentração de calprotectina em vários fluidos corporais demonstrou alterar, por exemplo, aumentar, em vários estados de doença (e. g., doenças inflamatórias, infecciosas e malignas). Assim, a medição da concentração de calprotectina no fluido corporal de doentes que sofrem desses estados de doença (í. e., em indivíduos que apresentam sintomas evidentes para o indivíduo e/ou para uma terceira pessoa) e a comparação da concentração de calprotectina determinada para essa pessoa no fluido corporal de, por exemplo, um indivíduo saudável (í. e., um não doente) podem ser utilizados como um meio de diagnóstico dessas doenças.

Por exemplo, enquanto que os sintomas de infecções bacterianas e virais são muito semelhantes e o diagnósticoa partir apenas dos seus sintomas isoladamente pode ser difícil, a concentração de calprotectina no plasma/soro do indivíduo infectado aumenta aproximadamente 1 a 2 vezes com infecções virais, mas cerca de 1 a 18 vezes com infecções bacterianas. Assim, o indivíduo que reparou nos sintomas de infecção, pode possuir a concentração de calprotectina no seu fluido corporal medida e a sua infecção diagnosticada e tratada em conformidade.

Outras doenças nas quais a calprotectina pode ser utilizada como um teste de diagnóstico incluem: doenças reumáticas (e. g., artrite reumatóide, artrite reumática juvenil, lupus eritematoso sistémico), síndrome de Sjogrens, estado inflamatório intraocular, fibrose cística, doença pulmonar aguda e crónica, carcinoma do pulmão (células escamosas), cancros pulmonares, 5 cancro colorrectal, doença inflamatória do intestino, cancro gástrico, adenoma ou cancro colorrectal, doença de Chrohn, colite ulcerosa, inflamação da mucosa gastrointestinal, pedras urinárias, doença do figado alcoólico, doença da mucosa inflamatória oral, doença inflamatória do SNC (e. g.r esclerose múltipla e encefalite aguda), infecção com vih, infecções do SNC secundárias em doentes infectados com VIH, infecções do tracto urinário, cistite, pielonefrite, uveite posterior endógena, estados hematológicos (e. g., leucemia), estados febris (infecciosos e não infecciosos), enfarte do miocárdio agudo e aférese. A concentração de calprotectina no plasma também revelou aumentar durante cirurgia de coração aberto (Semb, A.G. et al.,

Eur. J. Cardio- -thorac Surg. (1991) 5: 363- 367, Saatvedt, K. et al., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. (1996) 30: 53-60, Moen, 0. et al. ,, Perfusion (1994) 9: 109-117) . Mais especificamente, Saatvedt et al. relataram que a concentração de calprotectina aumenta após o inicio de "bypass" cardiopulmonar e tem um pico 48 horas após a operação.

Foi surpreendentemente descoberto que o potencial para DCV ou a propensão para DCV num indivíduo pode ser avaliado através da determinação da concentração de calprotectina numa amostra contendo calprotectina recolhida do referido indivíduo. Por outras palavras, verificou-se que a determinação da concentração de calprotectina numa amostra contendo calprotectina recolhida de um indivíduo pode ser utilizada para prever, antes do início dos sintomas, que são perceptíveis para o indivíduo ou para uma terceira pessoa (e. g., um médico) quer o indivíduo seja, ou quanto seja, provável que sofra de DCV. 6

Por "potencial para" ou "propensão para" entende-se a verosimilhança ou probabilidade de que o indivíduo a ser testado sem os presentes sintomas venha a sofrer de DCV no futuro.

Isto pode tomar a forma de um índice, proporção, percentagem ou número semelhante que reflecte o risco relativo de DCV no futuro (e. g., nos próximos 1-2 anos, pelo menos nos 6 meses seguintes).

Assim, visto por um aspecto a invenção proporciona um método de ensaio para a detecção de potencial para DCV ou propensão para DCV num humano ou indivíduo não humano, compreendendo o método avaliar a concentração de calprotectina numa amostra contendo calprotectina recolhida de um indivíduo, e. g., uma amostra de sangue, plasma, soro, líquido cerebroespinal, fluido oral, urina, fezes, líquido sinoval ou empiema.

Por "avaliar" entende-se que é determinado um valor quantitativo ou semi-quantitativo para a concentração de calprotectina. Este pode ser o valor para a concentração da amostra como testada, e. g., após tratamento para remover as células ou outras componentes de amostra que não são testadas, ou para concentrar ou diluir a amostra ou para transferir a calprotectina para um meio separado, e. g., substrato sólido.

Alternativamente, a avaliação pode ser simplesmente qualitativa, i. e., indicar se a calprotectina está acima ou abaixo de um ou mais valores de limiar pré-seleccionados, e. g., valores indicadores da ausência de potencial para DCV ou propensão para DCV como detectável pelo ensaio. 7

Os valores precisos para estes valores de limiar ou outros valores de referência para calprotectina podem depender da natureza da amostra, idade, peso, sexo e espécie de um indivíduo e podem ser determinados de um modo rotineiro pela medição da concentração de calprotectina do fluido corporal relevante de indivíduos equivalentes sem DCV ou com DCV em vários estádios de desenvolvimento.

Um valor indicador da concentração de calprotectina determinada ou "avaliada" de acordo com o método da invenção podem ser uma concentração absoluta de calprotectina ou pode ser alternativamente um índice, proporção, percentagem ou número semelhante que reflecte a concentração de calprotectina.

Uma amostra corporal utilizada no método de ensaio da invenção pode ser qualquer amostra contendo calprotectina, e. g., um fluido corporal ou amostra de tecido, ou uma suspensão etc.

De um modo preferido, a amostra será um fluido corporal, e. g., urina, líquido cerebroespinal, fluido oral, líquido sinovial ou fluido empiema, ou de um modo mais preferido, sangue ou uma amostra derivada de sangue. Quando é este o caso (i. e., quando é utilizada uma amostra de sangue ou derivado de sangue), a amostra utilizada para análise será, de um modo preferido, isenta de células (e. g., soro ou plasma). Alternativamente, podem ser utilizadas fezes. A amostra pode ser tratada antes de ser utilizada no método de ensaio da invenção. Assim, a amostra pode ser tratada para remover quaisquer células e/ou quaisquer componentes de amostra não ensaiados. A amostra pode também ser tratada para concentrar ou diluir a amostra ou para transferir a calprotectina para um meio separado, e. g., substrato sólido. Por exemplo, a amostra pode ser diluida adicionando um tampão ou outro meio aquoso.

Alternativamente, uma amostra, particularmente uma amostra de plasma ou soro, pode ser utilizada directamente. A amostra é opcionalmente tratada com cálcio ou um mimetizador de cálcio (e. g., iões de outro metal alcalino-terroso), antes de ser utilizado no método de ensaio da invenção. 0 cálcio ou mimetizador de cálcio pode ser qualquer forma que proporciona iões de Ca2+ (e. g., CaCl2) . Se o cálcio é utilizado, então, de um modo preferido, é adicionado cálcio ou mimetizador de cálcio suficiente à amostra para saturar os sítios de ligação ao cálcio de calprotectina. Por exemplo, pode ser adicionado um excesso molar de dez vezes de fonte de cálcio, de um modo mais preferido, um excesso molar de cinco vezes ou, de um modo especialmente preferido, um excesso molar de três vezes.

Embora os ensaios para calprotectina sejam conhecidos e possam ser utilizados no método da invenção, não foi sugerido anteriormente que a calprotectina seja um marcador ou indicador de potencial para DCV ou propensão para DCV. Por outras palavras, não houve qualquer sugestão anterior de que a concentração de calprotectina de indivíduos sem sintomas possa ser utilizada como um marcador ou indicador de potencial ou propensão para DCV e, em particular, não houve qualquer sugestão de que a concentração de calprotectina possa ser utilizada como o marcador ou indicador num método de ensaio adequado para rastreio em massa de indivíduos saudáveis (í. e., sem sintomas). 9

Qualquer método de ensaio conhecido para calprotectina pode ser utilizado no método de ensaio da invenção. Assim, por exemplo, o método divulgado em US-A-4833074 (Fagerhol et al.) para o isolamento de calprotectina e para a produção subsequente de anti-soros monoespecificos desta podem ser utilizados para produzir anticorpos anticalprotectina para utilização em qualquer método de ensaio convencional. Os anticorpos anticalprotectina produzidos podem ser utilizados, por exemplo, em ensaios ligados a enzima e radio-imunológicos. 0 formato de imunoensaio ANycoCards (Axis-Shield PoC, Oslo, Noruega) para a calprotectina pode também, por exemplo, ser utilizado. Este ensaio utiliza um formato em sanduíche em fase sólida, no qual o dispositivo de teste compreende uma membrana revestida com anticorpos anticalprotectina imobilizados. Assim, a amostra (opcionalmente diluída) é aplicada ao dispositivo e quando a amostra flui através da membrana, qualquer calprotectina presente é capturada. A calprotectina imobilizada na membrana é então tratada com um conjugado ouro-anticorpo que se liga ao complexo calprotectina-anticorpo e à intensidade da cor (devido às esferas de ouro), como determinado pela absorvência de luz vermelha, é proporcional à quantidade de calprotectina. A concentração de calprotectina pode, por isso, ser calculada a partir de uma curva de calibração preparada do modo convencional.

Alternativamente, pode ser utilizado o teste comercial (Calpresto) para a calprotectina, por exemplo, em fezes (disponível em Eurospital®) . Este ensaio utiliza um anticorpo policlonal contra calprotectina num sistema de ensaio de imunoabsorção ligado a enzima. Assim, a calprotectina presente na amostra recolhida de um indivíduo fica ligada ao anticorpo, 10 que é adsorvida à superfície de um poço de plástico. Um substrato para a enzima é então adicionado e a intensidade do produto corado produzido é proporcional à quantidade de enzima e, consequentemente, à quantidade de calprotectina. A concentração de calprotectina pode, consequentemente, ser calculada a partir de uma curva de calibração preparada do modo convencional.

Na verdade, ambos os anticorpos mono- e policlonal anticalprotectina estão disponíveis comercialmente. Policlonais de ovo e coelho estão, por exemplo, disponíveis de Norwegian Antibodies AS e Axis-Shield Diagnostics, respectivamente, enquanto que o anticorpo monoclonal de murganho pode ser obtido de Dako A/s, Dinamarca. Qualquer anticorpo anticalprotectina obtido, por exemplo, por qualquer técnica convencional para produzir anticorpos, pode ser utilizado no método da invenção. Por exemplo, o anticorpo anticalprotectina de coelho, assim como os anticorpos monoclonais, podem ser produzidos de acordo com o protocolo descrito em Harlow e Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, NY.

Alternativamente, podem ser preparados anticorpos anticalprotectina injectando regularmente uma solução contendo calprotectina em galinhas, e depois recolher as gemas dos ovos de galinha. 0 anticorpo policlonal de ovo de galinha pode ser então isolado de acordo com técnicas convencionais e purificado por cromatografia de afinidade.

De um modo preferido, o método de ensaio da invenção é utilizado para rastreio em massa de indivíduos saudáveis (e. g., sem sintomas de DCV). Quando o potencial para DCV ou propensão 11 para DCV é detectado, o indivíduo pode ser submeetido a outros testes (e. g., utilizando técnicas mais caras específicas para DCV) para confirmar a presença ou ausência de DCV.

Em geral, para além da amostra em avaliação, também serão avaliadas, na realização do método de ensaio, amostras de calibração com teor de calprotectina conhecido.

Essas determinações podem ser utilizadas para registar uma curva de calibração a partir da qual o teor em calprotectina da amostra a ser investigada pode ser determinado. A natureza das amostras de calibração e a selecção de factores de conversão ou ajustamento utilizados na determinação da calprotectina pode variar dependendo, por exemplo, do modo pelo qual a calprotectina é detectada na técnica de ensaio actualmente utilizada e noutros aspectos do método que afectam o resultado do ensaio, por exemplo, composição do tampão, condições de ensaio, etc.

Serão utilizadas, tipicamente, amostras de calibração possuindo teores de calprotectina desde 0 a 5000 mg/L. O intervalo de referência dentro do qual o valor para a concentração de calprotectina de encontra geralmente é de 0,1 a 10 mg/L.

Em geral, a concentração de calprotectina no soro e no plasma de humanos com pouco ou nenhum potencial para DCV ou propensão para DCV estará no intervalo de 0,01-0,75 mg/L. Mais especificamente, a concentração de calprotectina no soro e plasma desses humanos estará no intervalo de 0,05-0,70 mg/L, ainda mais especificamente de 0,10-0,66 mg/L, por exemplo, no intervalo de 0,15-0,45 mg/L. Por exemplo, a concentração de 12 calprotectina no soro ou plasma de uma fêmea com pouco ou nenhum potencial para DCV ou propensão para DCV estará no intervalo de 0,09-0,53 mg/L, por exemplo, cerca de 0,31 mg/L ou 0,30 mg/L. A concentração de calprotectina no soro ou plasma de um macho com pouco ou nenhum potencial para DCV ou propensão para DCV estará no intervalo de 0,12-0,66 mg/L, por exemplo, de 0,30-0,39 mg/L, especialmente de 0,31 mg/L. A concentração de calprotectina no soro ou plasma superior a 0,75 mg/L será geralmente um indicador muito forte de potencial para DCV ou propensão para DCV.

Desse modo, um valor de limiar acima do qual o ensaio pode ser considerado como sendo previsor de potencial para DCV ou propensão para DCV pode estar geralmente no intervalo de 0,32-0, 77 mg/L, por exemplo, cerca de 0,67 mg/L, de um modo preferido cerca de 0,70 mg/L, especialmente cerca de 0,76 mg/L. De um modo mais preferido o valor limiar acima do qual o ensaio pode ser considerado como potencial ou propensão para DCV está no intervalo de 0,30-0,50 mg/L, de um modo ainda mais preferido, no intervalo de 0,32-0,47 mg/L, por exemplo, cerca de 0,45 mg/L.

Em geral, a concentração de calprotectina nas fezes de humanos com pouco ou nenhum potencial para DCV ou propensão para DCV estará no intervalo de 0,01-10 mg/L.

Mais especificamente, a concentração de calprotectina nas fezes desses humanos estará no intervalo de 0,05-9,0 mg/L, ainda mais especificamente de 0,50-8,0 mg/L. A concentração de calprotectina nas fezes superiores a 10 mg/L será, geralmente, fortemente indicadora de potencial 13 para DCV ou propensão para DCV. Assim, um valor de limiar acima do qual o ensaio pode ser considerado como de previsão para potencial de DCV ou propensão para DCV pode ser geralmente de cerca de 9 mg/L, de um modo mais preferido cerca de 10,5 mg/L, especialmente cerca de 11 mg/L.

Todavia, os valores de limiar são melhor calculados a partir de determinações de calprotectina utilizando as mesmas técnicas de ensaio par o mesmo tipo de amostra de fluido corporal de um grupo de doentes de tipo semelhante (idade, sexo, peso, espécie, etc.) desde saudáveis, passando por DCV em estágio precoce até DCV grave. De um modo ainda mais preferido, os valores de limiar serão valores determinados para o mesmo doente num estádio saudável precoce. Deste modo, particularmente indivíduos em risco, podem monitorizar os seus níveis de calprotectina numa base de rotina (e. g., cada 6 meses a 1 ano) em programas de rastreio em massa.

Num método de ensaio preferido da presente invenção, o referido método compreende ainda avaliar adicionalmente a concentração de outro marcador para potencial para DCV na amostra recolhida de um indivíduo. Exemplos de marcadores adequados podem ser homocisteína, factor XII activado, colesterol, proporção colesterol:HDL, fibrinogénio, activador de plasminogénio de tipo tecido, Factores V, VII e VIII, lipoproteína (a), factor de antigénio de von Willebrand, complexo plasmina-a2 antiplasmina, fragmento da protrombina 1+2, complexo trombina-antitrombina III, fibrinopéptido A, produtos de degradação da fibrina, D-dímero, resistência à proteína C activada, factor VIIc e Vila, trombina, soro amilóide A, moléculas de adesão vascular e cálcio coronário. De um modo 14 preferido, o segundo marcador é seleccionado a partir de homocisteina ou proteína C reactiva.

De um modo mais preferido, o método de ensaio da presente invenção compreende ainda avaliar adicionalmente a concentração da proteína C reactiva (CRP) na amostra recolhida do indivíduo. De um modo preferido, a concentração de CRP é avaliada simultaneamente ou sequencialmente ao referido ensaio de calprotectina. A medição de CRP pode ser realizada utilizando qualquer técnica de imunoensaio convencional (e. g., ELISA, RIA etc.) ou pode ser determinada por NycoCard (disponível de Axis-Shield

PoC, Oslo, Noruega). A concentração de calprotectina no soro ou plasma superior a 0,75 mg/L adicionalmente à concentração de CRP superior a 1,75 mg/L será geralmente um indicador muito forte de potencial para DCV ou propensão para DCV. De um modo preferido, a presença das concentrações acima mencionadas é um indicador mais forte de potencial para DCV ou propensão para DCV do que uma calprotectina ou concentraçãoisolada de CRP.

Deste modo, os valores de limiar da calprotectina e CRP acima dos quais o ensaio pode ser considerado como altamente previsível de potencial ou propensão para DCV, ou para DCV pode ser geralmente de 0,32-0,77 mg/L e 1,70 mg/L respectivamente, de um modo mais preferido cerca de 0,67 mg/L e 1,75 mg/L respectivamente, de um modo ainda mais preferido cerca de 0,70 mg/L e 2,00 mg/L, respectivamente, especialmente cerca de 0,76 mg/L e 2,25 mg/L, respectivamente. De um modo mais preferido, os valores de limiar acima dos quais o ensaio pode 15 ser considerado como prevendo potencial ou propensão para DCV estão no intervalo de 0,30-0,50 mg/L e 0,75 mg/L respectivamente, de um modo ainda mais preferido no intervalo de 0,32-0,47 mg/L e 0,75 mg/L, respectivamente, por exemplo cerca de 0,45 mg/L e 0,75 mg/L, respectivamente.

Visto de um outro aspecto, a presente invenção proporciona um kit de ensaio para utilização no método da invenção, compreendendo o referido kit reagentes e instruções para a realização do método de ensaio e para a interpretação dos resultados e, opcionalmente, amostras de referência contendo calprotectina e, opcionalmente, um detector. De um modo preferido, o referido kit de ensaio compreende ainda os reagentes e instruções para a determinação da concentração de CRP .

As instruções no kit podem, por exemplo, estar na forma de um rótulo, um manual ou um folheto de instruções; todavia, podem, alternativamente, ter a forma de um programa de computador ou um veiculo de dados, e. g., um disco de computador. O detector, quando presente, será geralmente um que seja capaz de detectar uma espécie repórter, e. g.f um espectrómetro, um detector de radiação nuclear, um detector de luz dispersa, etc.

Os reagentes serão agentes adequados para a determinação de calprotectina, e. g., reagentes adequados são especificados na literatura, associados com os testes disponíveis para calprotectina, tais como de Eurospital e NycoCard (disponíveis em Axis Shield ASA, Oslo, Noruega) citado aqui. Os reagentes 16 mencionados no documento US-A-4833074 podem também ser adequados.

Um método de ensaio particularmente preferido para avaliar a concentração de calprotectina na presente invenção é um imunoensaio à base de partículas, isto é uma técnica sensível que é baseada na determinação turbidimétrica da concentração de calprotectina. A sensibilidade proporcionada pelo ensaio permite, que vantajosamente, sejam determinadas concentrações de calprotectina relativamente baixas em amostras de fluido corporal (e. g., plasma ou soro) com um nível elevado de precisão. Ao mesmo tempo, podem também ser medidas com precisão concentrações relativamente elevadas de calprotectina. A determinação turbidimétrica também possui a vantagem de não ser necessária superfície sólida para a separação física no ensaio e não são necessários numerosos passos de lavagem e/ou separação. Assim, em comparação com as técnicas da técnica anterior (e. g., ELISA), a determinação turbidimétrica homogénea da calprotectina é rápida e fácil de realizar e pode, por exemplo, ser automatizada.

Em comparação com a automação de técnicas não homogéneas envolvendo, por exemplo, uma superfície sólida, a automatização de um ensaio com base turbidimétrica é relativamente fácil. Também, o processo homogéneo automatizado resultante é frequentemente mais fiável sendo menos susceptível, por exemplo, a quebra.

Um ensaio turbidimétrico automatizado é também rápido, permitindo um elevado processamento de amostras, e é relativamente barato de operar. Tipicamente, pode ser realizado 17 utilizando um robot comercialmente disponível, e. g., Cobas Mira ou Hitachi 711, em que ambos estão disponíveis na Roche Diagnostics Um tal ensaio automatizado é particularmente atractivo quando os testes de rotina de indivíduos para potencial ou propensão para DCV estão contemplados.

Para a determinação turbidimétrica da concentração de calprotectina, a amostra contendo calprotectina será geralmente um fluido corporal, e. g., urina, líquido cerebroespinal, fluido oral, líquido sinovial ou líquido de empiema, ou de um modo mais preferido, sangue ou uma amostra derivada de sangue. Quando é este o caso, a amostra utilizada para análise será, de um modo preferido, isenta de células (e. g., soro ou plasma). Assim, a amostra pode ser tratada para remover quaisquer células e/ou quaisquer componentes de amostra que não estão a ser ensaiados. A amostra pode também ser tratada para concentrar ou diluir a amostra ou para transferir a calprotectina para o meio separado, e. g., substrato sólido. Por exemplo, a amostra pode ser diluída adicionando água, um tampão ou outro meio aquoso. Alternativamente, pode ser utilizada directamente uma amostra, particularmente uma amostra de soro ou plasma. A amostra é opcionalmente tratada com cálcio ou um mimetizador de cálcio, antes de ser utilizada no método de ensaio. 0 cálcio ou mimetizador de cálcio pode ser qualquer forma que proporciona iões de Ca2+ (e. g., CaCl2) . Se é utilizado cálcio, então, de um modo preferido, é adicionado à amostra suficiente cálcio ou mimetizador de cálcio para saturar os sítios de ligação ao cálcio da calprotectina. Por exemplo, pode ser adicionado um excesso molar de 10 vezes de fonte de cálcio, de um modo mais preferido, um excesso molar de cinco vezes ou de um modo especialmente preferido um excesso molar de três vezes. 18 A opacidade, para a determinação turbidimétrica da concentração de calprotectina, será geralmente criada pelo contacto da amostra contendo calprotectina, ou uma fracção desta, com um anticorpo anticalprotectina fragmento de anticorpo ou mistura de anticorpos anticalprotectina (e. g., uma mistura de anticorpos monoclonais) . 0 anticorpo contra calprotectina anti-humano policlonal de ovo comercialmente disponível em Norwegian Antibodies AS pode, por exemplo, ser utilizado para criar opacidade. Qualquer anticorpo anticalprotectina obtido, por exemplo, por qualquer técnica convencional para produzir anticorpos, pode ser utilizado no método da invenção.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo que são utilizados para determinação turbidimétrica da concentração de calprotectina, de um modo preferido apresentam poucas ou nenhumas reacções cruzadas com outras proteínas de sangue que podem estar presentes no eluato. A quantidade de anticorpo, ou fragmento de anticorpo utilizado deve, obviamente, ser optimizado contra amostras padrão contendo calprotectina na medida em que a opacificação surge do efeito de gancho pelo qual a ligação múltipla da calprotectina cria os centros de opacificação. A calprotectina, como mencionado acima, possui numerosos sítios de ligação ao anticorpo e é, particularmente adequada para a detecção num tal ensaio.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo anticalprotectina ou fragmento de anticorpo, pode ser imobilizado por ligação ou acoplamento, quer directamente ou indirectamente, a qualquer suporte sólido bem conhecido ou matriz que é normalmente utilizado para imobilização. De um modo preferido, o suporte sólido ou matriz toma a forma de 19 partículas, de um modo preferido, nanopartículas. Convenientemente, o suporte sólido pode ser fabricado de vidro, sílica, látex, metal (e. g., ouro) ou um material polimérico (e. g., polietileno). De um modo preferido o suporte sólido é fabricado de um material polimérico tal como polietileno. A ligação ou imobilização do anticorpo anticalprotectina ou fragmento de anticorpo pode ser alcançada utilizando qualquer técnica convencional. Por exemplo, a avidina (disponível de Pierce Chemical Company) pode ser imobilizada em nanopartículas de poliestireno activadas com clorometilo (disponível em Interfacial Dynamic Corporation, US) por agitação em tampão (e. g., à temperatura ambiente durante 24 horas) e depois utilizado em conjunto com anticorpos anticalprotectina marcados com biotina (preparados de acordo com técnicas convencionais na técnica). Assim, por exemplo, plasma retirado do indivíduo a ser testado para potencial para, ou propensão para DCV é adicionado a uma solução de nanopartículas revestidas com avidina numa cuvete de quartzo de um espectrofotómetro, seguido pela adição de anticorpo anticalprotectina marcado com biotina. As leituras turbidimétricas são então retiradas.

Alternativamente, os anticorpos marcados com biotina podem ser adicionados antes da adição de plasma ou soro. Por outras palavras, embora os mesmos reagentes sejam tipicamente utilizados, independentemente, do instrumento utilizado para detecção de turbidez, a sequência precisa, na qual os vários reagentes são adicionados pode variar. Geralmente, a sequência utilizada deve estar de acordo com as instruções que acompanham o espectrofotómetro utilizado (e. g., um espectrofotómetro Shimadzu UV-160). 20

As leituras turbidimétricas são realizadas (í. e., a absorção da luz a um comprimento de onda adequado é medida a intervalos regulares) e a absorção de luz em relação a uma referência é determinada. Opcionalmente, podem ser utilizados instrumentos de comprimento de onda múltiplo para realizar as leituras turbidimétricas e podem proporcionar resultados mais precisos. Instrumentos adequados para realizar leituras turbidimétricas incluem o Cobas Mira, Integra da Roche e Turbiquant da Merck.

Num esquema experimental alternativo, o anticorpo anticalprotectina ou fragmento de anticorpo, pode ser imobilizado directamente em nanoparticulas activadas com clorometilo (disponíveis de Interfacial Dynamic Corporation, US). Por exemplo, o anticorpo anticalprotectina (e. g., o anticorpo policlonal de ovo disponível de Norwegian Antibodies AS) pode ser misturado com as partículas activadas acima mencionadas num tampão (borato a 10 mM, cloreto de sódio a 15 mM, pH 9,0) e agitado (e. g., à temperatura ambiente durante 24 horas) para fornecer nanoparticulas revestidas com anticorpo anticalprotectina. Essas nanoparticulas podem ser utilizadas para a determinação turbidimétrica da concentração de calprotectina adicionando-as a uma amostra de plasma ou soro, retiradas do indivíduo a ser testado para potencial para, ou propensão para DCV, num tampão e realizando leituras turbidimétricas em modo cinético.

Alternativamente, o plasma ou soro podem ser adicionados às nanoparticulas revestidas com anticorpo anticalprotectina. Por outras palavras, embora os mesmos reagentes sejam tipicamente utilizados independentemente do instrumento utilizado para detecção de turbidez, a sequência precisa na qual os vários 21 reagentes são adicionados, pode variar. Geralmente, a sequência utilizada deve estar de acordo com as instruções que acompanham o espectrofotómetro utilizado (e. g., um espectrofotómetro

Shimadzu UV-160).

Exemplos de robots automatizados que são adequados para realizar leituras turbidimétricas de acordo com o método de ensaio da invenção incluem o Cobas Mira e Hitachi 711, ambos disponíveis da Roche Diagnostics.

As partículas às quais o anticorpo ou fragmento de anticorpo, podem ser ligados são tipicamente esféricas. 0 tamanho das partículas utilizadas no ensaio pode afectar a precisão com a qual a concentração de calprotectina é medida.

Embora partículas maiores permitam que sejam detectadas concentrações de calprotectina mais baixas, a sua área de superfície reduzida significa que elas possuem uma capacidade de ligação mais baixa. Por exemplo, duplicar o diâmetro da partícula, reduz para metade a capacidade de ligação de uma unidade de massa de partículas.

Adicionalmente, aumentar o diâmetro da partícula aumenta o nível de absorvência de luz de fundo e suspensão de luz no comprimento de ondas tipicamente utilizado nesses ensaios (e. g., 330 a 600 nm) . Assim, embora as partículas maiores aumentem a sensibilidade do ensaio, isto pode ser acompanhado por alguma perda de precisão e, em particular, um aumento no número de resultados falsos negativos obtidos. Este é particularmente provável que seja o caso com amostras contendo concentrações de calprotectina relativamente elevada (í. e., essas amostras obtidas de indivíduos com um potencial elevado ou propensão para DCV), em que os sítios de ligação ligados a 22 nanopartículas podem ficar saturados sem que toda a calprotectina se torne ligada.

Estes efeitos de acção contrária associados a alteração do tamanho de partícula (e. g., aumentando o tamanho da partícula aumenta a sensibilidade, mas diminui a precisão) representam um problema significativo a ser superado no desenvolvimento de um ensaio sensível para detectar o intervalo dos níveis de calprotectina presentes nos fluidos corporais.

Também é preferido, no método de ensaio da invenção, que as partículas utilizadas permitam que um vasto intervalo de concentrações de calprotectina sejam determinadas com precisão. Isto significa que um nível de confiança elevado pode ser atribuído tanto a um resultado negativo (i. e., uma concentração situada abaixo do valor do limiar) como um resultado positivo. É particularmente preferido, no método de ensaio da invenção que amostras possuindo uma concentração de calprotectina no intervalo de 0,5-50 mg/L (e. g., 1-40 mg/L) possa ser medida.

As partículas às quais o anticorpo ou fragmento de anticorpo podem ser ligadas são tipicamente esféricas com um diâmetro de 1-150 nm, por exemplo, 10-90 nm ou 15-60 nm, por exemplo, 44 nm. Num método de ensaio particularmente preferido da invenção, as partículas às quais o anticorpo ou fragmento de anticorpos são ligados possuem um diâmetro de 55-140 nm, de um modo mais preferido 65-110 nm, por exemplo, 70-90 nm.

Alternativamente, o diâmetro das partículas pode ser medido assim que os anticorpos ou fragmento de anticorpos estejam ligados à sua superfície. Neste caso, o diâmetro das partículas revestidas com anticorpo ou fragmento de anticorpo é, de um modo 23 preferido, 65-140 nm, de um modo mais preferido, 75-120 nm, de um modo ainda mais preferido, 80-100 nm. As partículas revestidas destes tamanhos são especialmente preferidas quando a amostra testada é plasma.

As partículas, em ambos os estados "nus" e revestido, de um modo preferido possuem um diâmetro que não permite ele próprio a absorção no comprimento de onda de luz utilizado para a determinação espectrofotométrica. Assim, a suspensão de nanopartículas revestidas é aproximadamente (e. g., substancialmente) transparente até que ocorra a formação de agregados induzidos por calprotectina resultando na formação de agregados possuindo um diâmetro maior. Esses agregados possuem a capacidade para absorver no comprimento de onda de luz utilizado pelo espectrofotómetro.

Além disso, as partículas são, de um modo preferido, substancialmente todas do mesmo tamanho, mais especificamente todas do mesmo diâmetro. De um modo preferido, são utilizadas partículas de metal monodisperso (e. g., ouro) ou de polímero. Estão disponíveis partículas monodispersas da Dynal Biotech AS, Oslo, Noruega.

Embora não desejando estar limitado pela teoria, pode ser que a utilização de anticorpo ou fragmento de anticorpos imobilizado aumente a sensibilidade do ensaio, aumentando o tamanho de quaisquer sítios de criação de opacidade derivada da calprotectina e desse modo, a quantidade de luz disseminada a partir daí. utilizando um suporte sólido ou matriz (e. g., nanopartículas) que é substancialmente toda do mesmo tamanho, pode ser que a sensibilidade do ensaio de turbidimetria seja ainda aumentada. 24

Como é rotina em ensaios turbidimétricos, um intensificador de opacificação polimérico, tal como polietilenoglicol é, de um modo preferido, também adicionado ao eluato.

Antes de ser realizada a determinação turbidimétrica, a fracção, anticorpo ou fragmento de anticorpo, de um modo preferido ligado a uma nanoparticula, e opcionalmente intensificador, pode ser incubada durante um período curto, e. g., desde 5 minutos até uma hora, de um modo preferido cerca de 10 minutos até à temperatura ambiente.

Opcionalmente, na determinação da concentração de calprotectina utilizando a técnica de turbidimetria, pode ser utilizado um modo de leitura cinético. A luz utilizada na determinação da opacificação deve possuir um comprimento de onda apropriado, por exemplo, 300-600 nm. A este respeito, verificou-se que a utilização de um filtro de 300-450 nm, de um modo preferido, um filtro de 340 nm ou 405 nm, forneceu, particularmente, bons resultados. A utilização de um filtro de 560 nm pode também produzir resultados especialmente bons.

Em geral, adicionalmente à amostra sob avaliação, também serão avaliadas amostras de calibração com teores de calprotectina conhecidos, na realização do método de ensaio. Essas determinações podem ser utilizadas para representar graficamente uma curva de calibração da qual o teor de calprotectina da amostra sob avaliação pode ser determinada. 25

De um modo preferido, serão utilizadas amostras de calibração possuindo teores de calprotectina até 5000 mg/L (e. g., 1500, 1000, 750, 250, 100) ou até 100 mg/L (e. g., 75, 50, 25, 5, 1,0 e 0,5 mg/L). De um modo mais preferido, as amostras de calibração possuem um teor de calprotectina até 10 mg/L (e. g., 10, 8, 6, 4, 2 mg/L), de um modo ainda mais preferido até 5 mg/L (5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, 0,5 mg/L) . O ensaio turbidimétrico acima descrito para a determinação de calprotectina é, surpreendentemente, fiável, rápido, barato, fácil e acessível a automatização. Isto está em contraste com os métodos de ensaio presentemente disponíveis que são relativamente complexos e não são directamente aplicáveis às máquinas de diagnóstico de multi-tarefas automatizadas normalmente utilizadas em laboratórios de diagnóstico. A automatização é particularmente desejável quando estão envolvidos numerosos passos de mistura, adição e/ou diluição, uma vez que estes podem ser alcançados com um grau de precisão mais elevado. Os robots podem também oferecer um nível de fidedignidade e/ou reprodutibilidade superiores. A automatização também aumenta a produtividade.

Os métodos de ensaio presentemente disponíveis que podem oferecer níveis de precisão razoáveis (e. g., ELISA) são, todavia, difíceis de automatizar. Isto é, pelo menos, em parte, devido a eles envolverem, tipicamente, numerosos passos de lavagem e separação (e. g., ligação a uma superfície sólida) e a automatização de processos não homogéneos é frequentemente problemática. Também, estes processos envolvem tipicamente um número relativamente grande de passos que aumentam a 26 complexidade de qualquer protocolo automatizado. Outras técnicas convencionais para determinação de calprotectina (e. g., nefelometria) oferecem precisão elevada, mas requerem equipamento especial para realizar as medições necessárias. 0 equipamento especializado não é tipicamente fácil de incorporar num protocolo automatizado. A invenção será agora descrita em maior detalhe em relação aos seguintes Exemplos não limitantes e às figuras acompanhantes, nas quais: A Figura 1 é a curva de distribuição para calprotectina nos 200 indivíduos testados. As estatísticas resumidas para a Figura 1 são:

Teste de Normalidade de Anderson-Darling

Valor de P: Média

Desvio Padrão

Variância

Assimetria

Kurtosis

N 8,160 0,000 0,403 0,238 0, 057 1,679 3,302 199 Mínimo lo Quartil

Mediana 3o Quartil Máximo

Limite de confiança de 95% para Mu 0, 070 0,240 0,340 0,500 1,370 0, 370 27 (continuação) 0,436

Limite de confiança de 95% para Sigma 0,217 0,264

Limite de confiança de 95% para a Mediana 0,310 0,370 A Figura 2 é a curva de distribuição para os valores de cálcio nos 200 indivíduos testados. As estatísticas resumidas para a Figura 2 são:

Teste de Normalidade de Anderson-Darling 25,037 0,000 217,060 399.000 159201 3,462 15,341 200 0,0 0,00 78, 00 259,25 2794.00 161,42 272,70 363,35 442,46 0, 00

Valor de P: Média

Desvio Padrão

Variância

Assimetria

Kurtosis

N

Minimo Io Quartil Mediana 3o Quartil Máximo

Limite de confiança de 95% para Mu

Limite de confiança de 95% para Sigma

Limite de confiança de 95% para a Mediana 117,33 28 A Figura 3 é a curva de distribuição para hsCRP nos 200 indivíduos testados. As estatísticas resumidas para a Figura 3 são:

Teste de Normalidade de Anderson-Darling A2: 21 ,221 Valor de P: o, 000 Média 2, 331 Desvio Padrão 2, 970 Variância 8, 819 Assimetria 2, 243 Kurtosis 5, 103 N 197 Mínimo o, 150 1° Quartil 0, 540 Mediana 1, 150 3o Quartil 2, 580 Máximo 16 ,30 Limite de confiança de 95% para Um 1, 913 2 , 748 Limite de confiança de 95% para Sigma 2, 703 3, 296 Limite de confiança de 95% para a Mediana 0, 933 1, 375 A Figura 4 é a curva de distribuição para homocisteína nos 200 indivíduos testados. As estatísticas resumidas para a Figura 4 são: 29

Teste de Normalidade de Anderson-Darling A2: 2,535

Valor de P: 0,000 Média 8,391

Desvio Padrão 1,966

Variância 3,867

Assimetria 0,875

Kurtosis 0,730 N 199

Minimo 5,100

Io Quartil 7,100

Mediana 8,100 3o Quartil 9,600 Máximo 15,300

Limite de confiança de 95% para Mu 8,117 8,666

Limite de confiança de 95% para Sigma 1,790 2,181

Limite de confiança de 95% para a Mediana 7,620 8,400 A Figura 5 é uma transferência em gota para a distribuição de calprotectina entre os resultados de cálcio positivo e cálcio negativo; e

As Figuras 6 e 7 são as curvas ROC para calprotectina e hsCRP para todos os 200 indivíduos testados e para os indivíduos machos testados, respectivamente. 30

Exemplo 1: Anticorpo Anticalprotectina (a) Isolamento de Calprotectina A calprotectina pode ser isolada de acordo com os métodos descritos nos Exemplos 1 e 2 do documento US-A-4833074 (Fagerhol). A calprotectina pode, alternativamente, ser purificada a partir de camadas leucoplaquetárias humanas. Uma suspensão de células em EDTA a 2,5 mM é preparada pela adição de EDTA (50 mM, pH 7) às células. As células são então lavadas em cloreto de amónio a 160 mM/carbonato de sódio e hidrogénio a 10 mM durante 3 minutos e centrifugados (160 x g) durante 10 minutos a 4 °C. O sedimento resultante é lavado em EDTA (2,5 mM)/NaCl (150 mM) e centrifugado (55 x g) durante mais 10 minutos a 4 °C. O sedimento é então ressuspenso em EDTA a 0,625 mM/Diemal a 18,75 mM, pH 7,4 e congelados a -70 °C durante, pelo menos, 24 horas.

Após descongelação, o material resultante é centrifugado (a 3700 x g) durante 30 minutos, depois o sobrenadante é removido e filtrado (com um filtro de 0,45 pm disponível de Millipore), depois aplicado a uma coluna de permuta iónica de DEAE (dietilaminoetil) Sepharose (disponível de Pharmacia), pré-preparada utilizando um tampão de ligação (e. g., EDTA a 0,63 mM/Diemal 18,75 mM, pH 7,4). Qualquer material não ligante passa através da coluna e é eluída. Assim que todo o material de não ligação seja eluído da coluna, é eluída pura calprotectina utilizando um tampão de eluição contendo cálcio (e. g., tampão Diemal a 75 mM/CaCl2 10 mM) . Cerca de 25 mg de calprotectina é obtida por camada leucoplaquetária. 31 (b) Preparação de Anticorpo Anticalprotectina

Podem ser preparados anticorpos anticalprotectina de acordo com o método descrito no Exemplo 3 do documento US-A- 4 833 074 (Fagerhol)

Alternativamente, podem ser preparados policlonais de ovo de galinha. Uma solução compreendendo calprotectina (0,5 mg/mL) e adjuvante de Freund é injectada em galinhas a cada 14 dias quatro vezes (ou durante dois meses), e depois uma vez em cada 1 mês. Após 12 semanas, os ovos das galinhas injectadas com calprotectina podem ser recolhidos e as suas gemas removidas (sem a película). Após diluição em HC1 (5 mM), a gema é centrifugada e o sobrenadante é recolhido. O sobrenadante é então filtrado e tratado com sulfato de amónio saturado até uma concentração final de 3,8 Μ. A mistura é centrifugada e o precipitado produzido é recolhido e dissolvido em tampão (acetato de sódio a 0,11 M, NaCl a 0,15 M, pH 7,4). A solução resultante é finalmente dialisada com uma membrana possuindo um tamanho de poro de 10000 kD e depois purificada por cromatografia de afinidade. A coluna utilizada tipicamente para cromatografia de afinidade compreende uma matriz activada de sepharose activada por succinimida (HiTrap NHS activada disponível de Amersham-Pharmacia) que é adequada para a imobilização de calprotectina. Mais especificamente, a resina activada reage espontaneamente, a pH 7-8, com aminas livres na calprotectina. Para cromatografia a solução de diálise é normalmente diluída até uma concentração de cerca de 3 mg/mL em PBS antes da sua 32 aplicação à coluna. Os anticorpos anticalprotectina são subsequentemente eluídos utilizando ureia a 6 M em PBS gelado ou solução de citrato de sódio a 0,1 M, pH 3,0. De um modo preferido, é utilizada solução de citrato de sódio a 0,1 M. Após eluição, as fracções contendo anticorpo anticalprotectina são imediatamente diluídas e dialisadas em PBS.

Exemplo 2: Ensaio Turbidimétrico para a Calprotectina (a) Preparação de Nanopartículas revestidas com Avidina São dialisadas nanopartículas de 600 pm de 4,2% p/v activadas com clorometilo (diâmetro de 44 nm) disponível de Interfacial Dynamic Corporation, EUA contra água com a membrana possuindo um tamanho de poro de 10 000 kD. É adicionado e misturado 0,5 mL de uma solução de borato (10 mM) e cloreto de sódio (15 mM) a pH 9,0. É adicionado 10 mg de avidina, dissolvida em 0,5 mL de uma solução de borato a 10 mM e NaCl a 15 mM a pH 9 (disponível de Pierce Chemical Company) e a mistura é agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. É então adicionado 40 pL de solução de glicina (2 M, pH 9.0) e a mistura é agitada durante mais 4 horas à temperatura ambiente.

As partículas são então diluídas com um volume de 100 mL e diafiltradas, primeiramente, em 500 mL de uma solução de borato a 10 mM e cloreto de sódio a 15 mM a pH 9,0 e, em segundo, numa solução de Tris a 25 mM, cloreto de sódio a 150 mM e Tween® 20 a 0,01% a pH 7,4 (disponível de Sigma US) utilizando um Filtro Pellicon XL (retenção de 300000) e um Sistema labscale TTF (disponível de Millipore), de acordo com as instruções fornecidas pelos fornecedores de instrumentos. A concentração 33 desejada de nanopartículas revestidas com avidina é finalmente obtida por centrifugação e ressuspensão das partículas numa solução de TRIS a 25 mM, cloreto de sódio a 150 mM e Tween® 20 a 0,01%. Quaisquer agregados formados durante este processo de preparação podem ser removidos por centrifugação lenta. (b) Ensaio para Calprotectina utilizando Nanopartículas revestidas com Avidina

Uma suspensão das nanopartículas revestidas com avidina acima descritas possuindo uma concentração de cerca de 0,30 mg de partículas por mL é preparada por centrifugação e ressuspensão da preparação acima descrita numa solução de tris a 25 mM, NaCl a 150 mM, Tween® 20 a 0,1% e PEG 6000 a 2% a pH 7,4 (disponível de Sigma). 500 pL desta suspensão de partículas é misturada com uma amostra de plasma (cerca de 20 pL), recolhida de um indivíduo a ser testado para propensão para DCV, numa cuvete de quartzo de leitura de um espectrofotómetro de registo (e. g., um Shimadzu UV-160) . A absorção de 340 nm de luz monocromática é registada e após 60 s, 75 pg de anticorpo anticalprotectina marcado com 0,15 nmol de biotina (e. g., policlonal de ovo marcado com biotina purificado por afinidade de Norwegian Antibodies AS, Noruega), diluído em 50 pL de uma solução de TRIS a 25 mM, NaCl a 150 mM e Tween® 20 a 0,1% a pH 7,4 é adicionado à cuvete de quartzo e misturado. A absorção de 340 nm de luz monocromática é imediatamente registada utilizando uma cuvete de referência contendo a solução de TRIS a 25 mM, NaCl a 150 mM e Tween 20® a 0,1% a pH 7,4, e novamente a intervalos regulares (e. g., a cada 2 minutos) até terem decorrido cerca de 15 minutos. O aumento da absorção em cada ponto de tempo é calculado de acordo com leitura turbidimétrica 34 convencional no modo cinético ou leituras de "ponto final". Isto é, o aumento na absorção de luz a cada ponto de tempo é calculada em relação às leituras realizadas antes da adição de nanoparticulas revestidas com anticorpo e/ou no final do registo. A curva de calibração é construída realizando um processo idêntico com padrões possuindo uma concentração conhecida de calprotectina. A concentração de calprotectina na amostra pode ser então calculada a partir da curva de calibração.

Exemplo 3: Ensaio Turbidimétrico Alternativo para

Calprotectina (a) Preparação de Nanoparticulas Revestidas com Anticorpo Anticalprotectina É dialisado 1 mL de nanoparticulas a 4,2% p/v activadas com clorometilo (diâmetro de 44 nm) disponível de Interfacial Dynamic Corporation, EUA, contra água, com uma membrana possuindo um tamanho de poro de 10 000 kD. É então adicionado 0,5 mL de uma solução de borato a 10 mM e cloreto de sódio a 15 mM a pH 9,0. São dialisados 27 mg de anticorpos anticalprotectina purificados (e. g., anticorpos policlonais de ovo purificados por afinidade disponíveis de Norwegian Antibodies AS, Noruega) são dialisados contra uma solução de borato a 10 mM e cloreto de sódio a 15 mM a pH 9,0.

Após adição das nanoparticulas aos anticorpos anticalprotectina purificados a mistura é agitada durante 24 horas à temperatura ambiente. É então adicionado 40 pL de uma 35 solução de glicina (2 M a pH 9,0) e a mistura é agitada durante mais 4 horas à temperatura ambiente.

As partículas são então diluídas para um volume total de 100 mL e diafiltradas contra 1000 mL de uma solução de borato a 10 mM e cloreto de sódio a 15 mM a pH 9,0 à qual é adicionado Tween® 20 a 0,10% e 3 mg/mL de albumina de ovo utilizando um filtro Pellicon XL (retenção de 300000) e um sistema labscale TFF (disponível de Millipore) de acordo com as instruções fornecidas pelos fornecedores de instrumentos. A concentração desejada de nanopartículas revestidas com anticorpo anticalprotectina é finalmente obtida através da centrifugação e ressuspensão das partículas em solução. Quaisquer agregados formados durante este processo de preparação pode ser removido por centrifugação lenta. (b) Ensaio para Calprotectina utilizando Nanopartículas revestidas com Anticorpo Anticalprotectina A suspensão compreendendo 400 pg das nanopartículas revestidas com anticorpo acima descritas, em 50 pL de uma solução de borato a 10 mM, NaCl a 15 mM, Tween® 20 a 0,1%, 3 g/L de albumina de ovo a pH 9,0 é preparado.

Simultaneamente, 20 pL de plasma, recolhidos de um indivíduo a ser testado para o potencial para DCV, em 500 pL de tampão de ensaio (TRIS a 25 mM, NaCl a 150 mM, Tween® 20 a 0,11 e PEG 6000 a 2% a pH 7,4 (disponível da Sigma) é colocado numa cuvete de quartzo de leitura de um espectrofotómetro de registo (e. g.,

Shimadzu UV-160) e a absorção de luz de 340 nm de luz monocromática é medida. Após 60 s, a suspensão acima mencionada 36 compreendendo 400 pg de nanopartículas revestidas com anticorpo é adicionada, e misturada na cuvete. A absorção de luz imediatamente após adicionar as nanopartículas revestidas com anticorpo é registada, e novamente a intervalos regulares (e. g., a cada 2 minutos) até terem decorrido cerca de 15 minutos. O aumento na absorção de luz a cada ponto de tempo é calculado em relação à leitura realizada antes da adição de nanopartículas revestidas com anticorpo e/ou no final do registo. Por outras palavras, são realizadas as leituras turbidimétricas no modo cinético ou leituras de "ponto final". A curva de calibração é também construída realizando um processo idêntico com padrões possuindo uma concentração conhecida de calprotectina. A concentração de calprotectina numa amostra pode então ser calculada a partir da curva.

Exemplo 4:_Ensaio Turbidimétrico para Calprotectina (a) Preparação de Nanopartículas_Revestidas_com

Estreptavidina São dialisadas nanopartículas de 600 pm, activadas com clorometilo a 4,2% p/v (diâmetro de 67 nm) disponível de Interfacial Dynamic Corporation, EUA contra água com uma membrana possuindo um tamanho de poro de 10000 kD. É adicionado 0,5 mL de uma solução tampão de fosfato (10 mM) e cloreto de sódio (150 mM) a pH 7,4 juntamente com 10 mg de estreptavidina, dissolvido em 0,5 mL de uma solução tampão de fosfato a 10 mM e NaCl a 150 mM a pH 7,4 (disponível de Pierce Chemical Company) e a mistura é agitada à temperatura ambiente durante 24 horas. 37 É então adicionado 40 pL de solução de glicina (2 M, pH 9,0) e a mistura é agitada durante mais 4 horas à temperatura ambiente.

As partículas são então diluídas para um volume de 100 mL e diafiltradas, primeiramente, em 500 mL de uma solução de borato a 10 mM e cloreto de sódio a 15 mM a pH 9,0 e, em segundo lugar numa solução de Tris a 25 mM, cloreto de sódio a 150 mM e Tween® 20 a 0,01 % a pH 7,4 (disponível de Sigma US) utilizando um Filtro Pellicon XL (retenção 300000) e um Sistema labscale TTF (disponível de Millipore), de acordo com as instruções fornecidas pelos fornecedores de instrumentos. A concentração desejada de nanopartículas revestidas com avidina é finalmente obtida por centrifugação e ressuspensão das partículas numa solução a 25 mM de TRIS, 150 mM de cloreto de sódio e Tween 20 a 0,1%. Quaisquer agregados formados durante este processo de preparação podem ser removidos através de centrifugação lenta. O tamanho médio de partículas das nanopartículas revestidas com estreptavidina foi medido como sendo 82 nm por Sinteff AS, Noruega. (b) Ensaio para Calprotectina utilizando Nanopartículas revestidas com Estreptavidina

Uma suspensão possuindo uma concentração de cerca de 0,60 mg partículas das nanopartículas acima descritas, revestidas com avidina por mL é preparada por centrifugação e ressuspensão da preparação acima descrita numa solução a 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl, Tween 20 a 0,1% e PEG 6000 a 1% a pH 7,4 (disponível da Sigma). Foram misturados 500 pL desta suspensão de partículas p com uma amostra de plasma (cerca de 5 pL), retiradas de um 38 indivíduo a ser testado para propensão para DCV, numa cuvete de leitura de quartzo de um espectrofotómetro de registo (e. g., a Shimadzu UV-160). A absorção de luz monocromática de 560 nm é registada e após 60 s, 75 pg de anticorpo anticalprotectina marcado com 0,15 nmol de biotina (e. g., policlonal de ovo marcado com biotina purificado por afinidade adquirido de Norwegian Antibodies AS, Noruega), diluído em 50 pL de solução de 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl e Tween® 20 a 0.1% a pH 7,4 é adicionado à cuvete de quartzo e misturado. A absorção de luz monocromática a 340 nm é imediatamente registada utilizando uma cuvete de referência contendo uma solução de 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl e Tween 20 a 0,1% a pH 7,4, e de novo a intervalos regulares (e. g., a cada 2 minutos) até ter desaparecido durante cerca de 15 minutos. O aumento na absorção a cada ponto de tempo é calculado de acordo com a leitura turbidimétrica padrão no modo cinético ou leituras de "ponto final". Ou seja, o aumento na absorção de luz a cada ponto de tempo é calculado relativamente à leitura efectuada anteriormente à adição de nanopartículas revestidas com anticorpo e/ou ao final do registo.

Uma curva de calibração é construída pela realização de um processo idêntico com padrões possuindo uma concentração conhecida de calprotectina. A concentração de calprotectina na amostra pode então ser calculada a partir da curva de calibração. 39

Exemplo 5: (a) Preparação de Nanopartículas Revestidas com Anticorpo Anticalprotectina São dialisados 1 mL de 4,2% p/v de nanopartículas activadas com clorometilo (diâmetro médio 67 nm) disponível de Interfacial Dynamic Corporation, EUA, contra água com uma membrana possuindo um tamanho de poro de 10 000 kD, e depois diluídos para 10 mL com água. São dialisados 27 mg de anticorpos policlonais purificados de ovo (e. g., anticorpos policlonais purificados por afinidade disponíveis de Norwegian Antibodies AS, Noruega) contra uma solução tampão de borato a 10 mM e cloreto de sódio a 15 mM e finalmente diluídos para 6 mL na mesma solução de borato a 10 mM e cloreto de sódio a 15 mM a pH = 9, 0.

Sob agitação, as partículas são misturadas com os anticorpos, e a agitação é continuada à temperatura ambiente durante 24 horas. São então adicionados 40 pL de uma solução de glicina (2 M a pH 9,0) e a mistura é agitada por mais 4 horas à temperatura ambiente.

As partículas são então diluídas num volume total de 100 mL em 10 mM de borato, tampão de 15 mM de cloreto de sódio a que foi adicionado Tween 20 a 0,1% e 3 mg/mL de albumina do ovo e diafiltrado contra 1000 mL do referido tampão de borato/cloreto de sódio a que é adicionado Tween® 20 a 0,1% e 3 mg/mL de albumina do ovo, utilizando um filtro Pellicon XL (eliminação de 300000 D) e um sistema labscale TFF (disponível de Millipore) de acordo com as instruções fornecidas pelos fornecedores do instrumento, e no final as partículas são concentradas a um volume de 40 a 100 mL. 40 0 diâmetro médio das partículas obtidas foi medido como 81 nm por Sinteff AS, Noruega. (b) Ensaio para Calprotectina utilizando Nanopartículas revestidas com anticorpo Anticalprotectina

Uma suspensão de 0,7 mg/mL das partículas revestidas com anticorpo anticalprotectina acima descritas é preparada em 0,25 mM de TRIS, 0,15 M de NaCl e 0,1% de Tween a pH 8,0. São dissolvidos 5 pL de uma amostra de plasma, retirada do indivíduo a ser testado para DCV, em tampão de ensaio (460 pL de 25 mM de TRIS, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween, 1,0% de polietilenoglicol 6000, pH = 7,4) numa cuvete de leitura de quartzo num espectrofotómetro com registo (e. g., Shimadzu UV-160) e é medida a absorção de luz monocromática a 560 nm. Após 60 s, são adicionados 100 pL da suspensão acima mencionada compreendendo 0,7 mg/mL de nanopartículas revestidas com anticorpo, e misturados na cuvete. A absorção de luz antes e imediatamente após adicionar as nanopartículas revestidas com anticorpo é registada, e de novo a intervalos regulares (e. g., a cada 20 s) até ter desaparecido durante 15 minutos. O aumento na absorção da luz em cada ponto no tempo é calculado relativamente à leitura feita anteriormente á adição de nanopartículas revestidas com anticorpo e no final do registo. Por outras palavras, as leituras turbidimétricas são efectuadas no modo cinético e/ou no "ponto final". 41

Uma curva de calibração é também construída efectuando um processo idêntico com padrões possuindo concentrações conhecidas de calprotectina. A concentração de calprotectina é a amostra que pode ser calculado a partir da curva.

Exemplo 6: Análise Estatística

Comparação de Calprotectina e outros marcadores para detecção do potencial para DCV ou propensão para DCV

Tem sido demonstrado que a calcificação coronária está fortemente associada com a ocorrência de DCV e tem sido também demonstrado ser um método útil para a previsão do potencial para DCV (e. g., enfarte do miocárdio ou trombose). A extensão da calcificação coronária é quantitativamente medida utilizando tomografia computorizada de feixes de electrões (EBCT) e é representada pelos valores de cálcio (CS) . Um valor de cálcio elevado representa um nível elevado de calcificação e um risco elevado de desenvolver DCV.

No estudo seguinte, o CS de 200 indivíduos (100 controlos possuindo um CS < 100 e 100 casos possuindo um CS > 100) com a idade de 45 ou superior foi testado, assim como os seus níveis de calprotectina, CRP e homocisteína no plasma ou soro. Os indivíduos foram referidos, pelo próprio ou pelo médico, como indivíduos assintomáticos e tinham feito um varrimento EBCT nos 2 anos anteriores 2 (normalmente nos 6 meses anteriores) para testar o seu plasma ou soro para a concentração de calprotectina, CRP e homocisteína. 42 Métodos

Calprotectina A calprotectina foi medida pelo teste Calpreste® (distribuída por Eurospital®, Itália) e os dados foram sumariados para o grupo do doente e o controlo utilizando desvio padrão, mediana, minimo e máximo. Foram calculados intervalos de confiança de 95% para a mediana. 0 cálculo Anderson-Darling foi utilizado como um teste á normalidade. A calprotectina foi também resumida por sexo utilizando o mesmo resumo da estatística.

Valores do Cálcio (CS)

Os valores do cálcio foram determinados por Tomografia Computorizada de Feixes de Electrões (EBCT) de varrimento. Os dados para os grupos de caso e de controlo foram resumidos.

Proteína C-Reactiva de elevada sensibilidade (hsCRP) A hsCRP foi determinada por ensaio de Dade Behring "N High Sensitlvity CRP" (Roberts et al., Clinicai Chemistry, 2000, 46: 4, p 461-468). Os dados foram resumidos para os grupos de doente e de controlo utilizando média, desvio padrão, mediana, mínimo e máximo. 43

Homocisteína(Hyc) A Homocisteína do plasma (Hcy) foi determinada pelo método Abbott IMx (Shipchandler, Μ. T. e Moore E. G., Clinicai Chemistry, 1995, 41: 7, p. 991-994). Os dados foram resumidos para os grupos de doente e de controlo utilizando desvio padrão, mediana, mínimo e máximo.

Comparação entre CS e calprotectina, hsCRP, Hcy (i) Qui-quadrado 0 teste de Qui-quadrado foi utilizado para testar a covariância entre pares de marcadores. (ii) Proporção de diferença significativa A proporção de diferença significativa utilizada com a tabulação cruzada 2 x 2 (i. e., a tabela de Qui-quadrado) é a proporção das diferenças significativas que co-variam com as diferenças significativas de dois testes discordantes. Deste modo, a proporção de diferenças significativas pode ser interpretada como uma medida da magnitude da associação entre os dois testes. A proporção de diferenças significativas foi calculada para CS versus calprotectina, hsCRP e Hcy respectivamente. 44

Comparação dos valores da mediana dos marcadores (i) Teste de Mann-Whitney

Isto é um não-paramétrico (os dados não necessitam de estar normalmente distribuídos) que foi utilizado para testar se os valores da mediana de dois marcadores são significativamente diferentes. A minitabela ordena todos os dados de ambos os conjuntos de dados por valor, atribuindo 1 ao mais baixo até 200 para o mais alto. O programa de computador adiciona então a classificação dos valores para os dois grupos a ser comparados e reporta o valor de "P" que indica a probabilidade da amostragem aleatória resultar em medianas até então separadas das observadas na experiência.

Os valores da mediana de calprotectina, hsCRP e Hcy foram comparados com a separação de CS nos grupos de caso e de controlo e o teste de Mann-Whitney foi utilizado para testar a significância. (ii) Curvas ROC para a classificação de Calprotectina e Cálcio A capacidade de um teste discriminar casos de doença de casos normais pode ser avaliada utilizando a análise da curva de "Receiver Operating Characteristic" (ROC). A análise da curva ROC foi utilizada tanto para calprotectina e hsCRP e como uma comparação dos dois marcadores.

As curvas ROC foram produzidas utilizando 11 limites de exclusão para o cálculo da sensibilidade (eixo dos y) do valor 45 mais baixo para o valor mais alto. A análise foi efectuada na população total e na população masculina. As áreas abaixo das curvas ROC foram calculadas utilizando a regra do trapézio.

Resultados

Resumo das estatísticas para a Calprotectina A Figura 1 apresenta a curva de distribuição para todos os 200 indivíduos testados. A tabela 1 a seguir apresenta o resumo da estatística para a calprotectina no controlo e nos grupos de caso. A concentração média de calprotectina no grupo controlo é 0,31 mg/L em comparação com 0,38 mg/L no grupo de caso. A concentração de calprotectina mediana é 0,31 mg/L para os machos e 0,30 mg/L para as fêmeas no grupo controlo. No grupo de caso a concentração de calprotectina mediana para machos é 0,39 mg/L em comparação com 0,31 mg/L para fêmeas

Tabela 1. Resumo da estatística para Calprotectina

Calprotectina Controlos Casos Todos Fêmeas Machos Todos Fêmeas Machos N 100 59 41 100 15 85 DP 0,228 0,232 0,225 0, 503 0,202 0, 537 95% Cl para o 0,28- 0,28- 0,27- 1 OO o 0,19- 1 00 o médio 0,34 0,33 0,39 0,43 0,47 0,45 46 (continuação) Médio (mg/mL) 0,31 0,30 0,31 0,38 0,31 o, 39 Mín (mg/mL) 0,09 0,09 0,11 0,07 0,08 o, 07 Máx (mg/mL) 1,37 1,37 1,36 4,85 0,73 4, 85

Resumo da Estatística para Valores do Cálcio A Figura 2 apresenta a curva de distribuição para todos os 200 indivíduos testados. A Tabela 2 a seguir apresenta o resumo da estatística para Os valores de EBCT de cálcio nos grupos controlo e de casos. Os valores médios do cálcio no grupo controlo é 0 em comparação com 259 no grupo de caso. Os valores médio do cálcio é 0 para ambos, as fêmeas e machos, no grupo controlo e 315 e 256, respectivamente, no grupo de caso.

Tabela 2. Resumo da estatística para os valores do Cálcio

Valores do cálcio Controlos Casos Todos Fêmeas Machos Todos Fêmeas Machos N 100 59 41 100 15 85 DP 5, 6 0,7 8,7 474, 7 365,1 493,3 95% Cl para o médio O 1 o O 1 o O 1 o 313,5- 215,0 174,8-538, 0 300,4-207, 5 Médio 0 0 0 259 315 256 Mín 0 0 0 100 100 100 Máx 56 5 56 2794 1507 2794 47

Resumo da estatística para hsCRP A Figura 3 apresenta a curva de distribuição para todos os 200 indivíduos testados. A Tabela 3 a seguir apresenta o resumo da estatística para hsCRP no grupo controlo e de caso. O hsCRP médio, em ambos, o grupo controlo e o grupo de caso é 1,2 mg/L. O hsCRP médio é 1,6 mg/L para fêmeas e 0,7 mg/L para machos no grupo controlo e 1,3 mg/L e 1,1 mg/L, respectivamente, no grupo de caso.

Tabela 3. Resumo da estatística for hsCRP hsCRP Controlos Casos Todos Fêmeas Machos Todos Fêmeas Machos N 100 59 41 100 15 85 DP 6,63 8,6 1, 53 12, 70 3,16 13, 71 95% Cl para o médio 0, 79-1,47 1,36-2, 74 0, 56-0,97 0,94- 1,56 0, 65-2,53 0. 89- 1, 59 Médio (mg/mL) 1,17 1,59 0,68 1,23 1,28 1,11 Mín (mg/mL) 0,15 0,15 0,15 0,17 0,34 0, 17 Máx (mg/mL) 62,1 62,1 9,29 120,0 11, 9 120, 0 48

Resumo da estatística para Hcy A Figura 4 apresenta a curva de distribuição para todos os 200 indivíduos testados. A Tabela 4 a seguir apresenta o resumo da estatística para Hcy no grupo controlo e de caso. A concentração mediana de Hcy no grupo controlo é 7,5 pmol/L em comparação com 8,5 pmol/L no grupo de caso. A concentração mediana de Hcy é 7,15 pmol/L para fêmeas e 8,55 pmol/L para machos no grupo controlo e 7,35 pmol/L e 8, 55 pmol/L respectivamente no grupo de caso.

Tabela 4. Resumo da estatística para Hcy

Hcy Controlos Casos Todos Fêmeas Machos Todos Fêmeas Machos N 100 59 41 100 15 85 DP 1, 94 1,58 2,18 6,03 2,18 6,46 95% Cl 7,7- 7,1-7,9 8,1-9,5 8,1-10,5 6,8- 8,1- para o 8,5 9,2 10, 9 médio Médio 7,5 7,1 8,5 8,5 7,3 8, 5 (pmol/L) Mín 5,3 5,3 5,3 5/1 5,1 5, 2 (pmol/L) Máx 14, 7 11, 8 14, 7 65,8 12, 4 65,8 (pmol/L) 49

Comparação entre os valores de cálcio e a calprotectina hsCRP, Hcy (i) Teste de Qui-quadrado

Utilizando Minitab, as tabelas de Qui quadrado foram efectuadas (ver tabela 5 a seguir) . Este teste compara as distribuições esperadas entre os conjuntos de dados (assumindo uma distribuição aleatória) e as observadas. 0 valor de significância é uma medida do grau em que os dados não são aleatoriamente distribuídos. Por exemplo, considerando os dados para a calprotectina positivos, deve esperar-se que se verifique um desvio equilibrado entre o cálcio positivo e negativo (i. e., 30,5 esperado em ambas as colunas). O desvio observado é, contudo, 22 negativos e 39 positivos indicando uma tendência para a calprotectina positiva para co-variar com o cálcio positivo.

Minitab proporciona uma medida geral da significância destas diferenças (concordância e discordância) e neste caso P é 0,009. deste modo, existe uma co-variação significativa de cálcio com calprotectina. 50

Tabela 5. Comparação do Qui-Quadrado de Calprotectina versus os valores do Cálcio Cálcio (co 100) Calprotectina (co 0,45mg/L) Negativo (N) Positivo (N) Todos (N) Negativo Obs 78 61 139 Exp 69, 5 69,5 139 Positivo Obs 22 39 61 Exp 30, 5 30,5 61 Todos Obs 100 100 200 Exp 100 100 200

Foi efectuada uma comparação análoga entre a calprotectina e hsCRP (ver Tabela 6 a seguir).

Tabela 6. Comparação de Qui-Quadrado de Calprotectina versus hsCRP(P=0) hsCRP (co 1.69 mg/L) Calprotectina Negativo Positivo Todos (co 0,45mg/L) (N) (N) (N) Negativo Obs 100 39 139 Exp 88,96 50, 04 139 Positivo Obs 28 33 61 Exp 39, 04 21, 96 61 Todos Obs 128 72 200 Exp 128 72 200 51 (ii) Proporção de diferença significativa

As proporções com diferenças significativas podem ser derivadas das tabelas 5 e 6 e dão uma medida de quão distante os valores observados se desviam dos esperados. Se os números de concordância esperados são multiplicados em conjunto e divididos pelo produto dos números de discordância esperados deve ser obtido um valor de 1.

Considerando os dados da Tabela 6, por exemplo, a proporção de diferença significativa nos valores esperados é 1: (88,96 X 21,96)/(50,04 X 39,04)-1953.64/1953,6 = 1. A proporção de diferença significativa observada nesta tabela é: (100 X 33)/(39 X28) = 3300/1092=3,02.

Quanto mais a proporção de diferença significativa se desviar de 1 mais pronunciada é a co-variação; uma proporção de diferença significativa de 3, é significativa.

Os resultados de uma análise de proporção de diferença significativa efectuada nos dados de co-variância obtidos a partir do estudo são apresentados na Tabela 7. 52

Tabela 7. Resumo das observações das Proporções Com diferenças significativas

Marcadores de risco (Nl#;pos, N2#;neg) Cálcio Calprotectina CRP Valor do cálcio (co 100) Nl=100, N2=139 Calprotectina (co 0, 45mg/L) Nl=61, N2=139 2,27 CRP (co 1. 69 mg/L) Nl=72, N2=128 1,00 3,02 — Hcy (co 12 Hmol/L) Nl=ll, N2=189 1,21 1,32 1,52 (co 10 pmol/L) Nl=42, N2=158 1,63 1,55 1,12 co = eliminação

Uma proporção de diferença significativa elevada indica um elevado grau de co-variação entre os testes. Pode ser observado na Tabela 7 que o teste para a calprotectina produz a maior proporção de diferença significativa para a valores do cálcio e deste modo, pode ser deduzido que a calprotectina possui o maior grau de covariância com os valores do cálcio em vez da calprotectina, CRP e homocisteina.

Adicionalmente, a calprotectina produz uma elevada proporção de diferença significativa com CRP, outro marcador for DCV. 53

Análise de Qui-Quadrado utilizando Minitab

Um teste de Qui-quadrado na data acima utilizando os mesmos limites de eliminação do teste de proporção equilibrada, apresentou uma concordância significativa (P 0,009) entre os valores do cálcio e os resultados da calprotectina.

Em contraste, nem o teste para CRP nem o teste para a homocisteína apresentou qualquer co-variância significativa com os valores do cálcio.

Foi também encontrada uma concordância significativa (P 0,000) entre calprotectina e CRP.

Comparando os valores da mediana (i) Teste de Mann-Whitney A Figura 5 apresenta a apresentação em gráfico para a distribuição de calprotectina entre os resultados do cálcio positivo e do cálcio negativo.

Os valores da mediana para os dois grupos são 0,310 mg/L para o cálcio negativo e 0,375 mg/L para o cálcio positivo. Mann-Whitney proporciona que a soma das classificações para o cálcio negativo é 912 e 1108 para o cálcio negativo e produz um valor de P de 0,0113.

Foi também efectuado um teste de análise de Mann-Whitney para testar aumentos significativos nas medianas de cada um da concentração de calprotectina, CRP, e homocisteína nos grupos de valores do cálcio altos (CS > 100) e baixos (CS < 100), nos 54 dados acima. Os resultados apresentaram os valores da mediana da concentração para calprotectina e homocisteína foram significativamente aumentados no grupo de cálcio alto (P = 0,0112 e 0,0037, respectivamente) em que CRP não apresentou qualquer diferença significativa em qualquer dos grupos (ver Tabela 8 a seguir).

Tabela 8. Comparação dos valores da mediana de Calprotectina e Hcy

Valor da Valor da Valor de P mediana no mediana no grupo CS baixo grupo CS alto Calprotectina 0,3 mg/L 0,4 mg/L 0,0112 Homocisteína 7,5 ppmol/L 8,5 pmol/L 0,0037

(ii) Análises e curvas ROC

As Figuras 6 e 7 apresentam as curvas ROC para calprotectina e hsCRP para todos os indivíduos e para a população de machos. A Tabela 9 a seguir apresenta a área sob as curvas ROC.

Tabela 9. Area sob as curvas ROC

Grupo Calprotectina hsCRP Todos os indivíduos 0, 604 0,24 Indivíduos machos 0,622 0,502 55

Taxa de Concordância Contra os valores do Cálcio A precisão de cada um dos testes de calprotectina, CRP e homocisteína (Hcy) aos níveis da eliminação (Hcy co 12 pmol) na Tabela 7 como um teste para o potencial para DCV foi também avaliada, assumindo que os valores do cálcio > 100 é reflexo do elevado risco para DCV.

Os resultados da análise são apresentados na Tabela 10.

Tabela 10

Calprotectina Calprotectina Calprotectina Calprotectina e CRP e CRP e CRP correcto e CRP incorrecto incorrecto correcto 58 42 25 75 29% 21% 12,5% 37, 5% Calprotectina Calprotectina Calprotectina Calprotectina e Hcy e Hcy e Hcy correcto e Hcy incorrecto incorrecto correcto 59 40 24 77 29,5% 20% 12% 38,5%

Taxa de concordância contra cálcio para a calprotectina = 58,5% (42+75/200) 56

Taxa de concordância contra cálcio para CRP =50% (25+75/200)

Taxa de concordância contra cálcio para homocisteina = 50,5% (24+77/200)

Lisboa, 11 de Dezembro de 2007 57

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método de ensaio para a detecção do potencial para doença cardiovascular (DCV) ou propensão para DCV num indivíduo animal, humano ou não humano, compreendendo o referido método a avaliação da concentração de calprotectina numa amostra contendo calprotectina retirada do referido indivíduo.
2. Método como reivindicado na reivindicação 1, em que a referida amostra é um fluido corporal seleccionado a partir de sangue, soro, plasma, urina, fluido cerebroespinal, fluido oral, fluido sinovial ou fluido de enfiema.
3. Método como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que a referida amostra é sangue.
4. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a referida amostra é soro ou plasma.
5. Método como reivindicado na reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que uma concentração limiar de calprotectina acima da qual o referido ensaio é indicador de potencial para DCV ou propensão para DCV é 0,45 mg/L.
6. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 compreendendo adicionalmente a avaliação da concentração de um segundo marcador para DCV na referida amostra. 1
7. Método como reivindicado na reivindicação 6, em que o referido segundo marcador é proteina C reactiva.
8. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a referida DCV é enfarte agudo do miocárdio.
9. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que a referida concentração de calprotectina é avaliada por turbidimetria.
10. Método como reivindicado na reivindicação 9 para a determinação de calprotectina num fluido corporal contendo calprotectina, em que o referido método compreende os passos de: (a) colocar a referida amostra do referido fluido corporal em contacto com um anticorpo anticalprotectina ou fragmento de anticorpo ligado a nanopartículas, para ligar a referida calprotectina; e (b) avaliar o conteúdo em calprotectina por turbidimetria, em que o diâmetro das nanoparticulas revestidas com o anticorpo ou fragmento de anticorpo é 65-140 nm.
11. Método como reivindicado na reivindicação 10, em que o diâmetro das nanopartículas revestidas de anticorpo ou fragmento de anticorpo é 75-120 nm.
12. Método como reivindicado na reivindicação 10 ou reivindicação 11, em que as referidas nanopartículas são todas, substancialmente, do mesmo tamanho (e. g., monodispersas). 2
13. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que é adicionado polietilenoglicol como um melhorador de opacidade entre os passos (a) e (b).
14. Método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 10 a 13 realizado como um processo automatizado. Lisboa, 11 de Dezembro de 2007 3