JP3806694B2 - 急性冠状動脈症候群の診断マーカーおよびその使用方法 - Google Patents

急性冠状動脈症候群の診断マーカーおよびその使用方法 Download PDF

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Description

【０００１】
この出願は、２００１年５月４日に出願された米国仮特許出願番号６０／２８８，８７１（Ａｔｔｙ整理番号０７１９４９−６５０１）；および２００１年８月２８日に出願された米国仮特許出願番号６０／３１５，６４２（Ａｔｔｙ整理番号０７１９４９−５５０１）に関連し、かつこられの優先権を主張するものであり、引用することによりそのすべてをそれぞれ本明細書の１部として取り込むものである。
【０００２】
【発明の属する技術分野】
本発明は、急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）の診断マーカーの同定と使用に関連する。種々の見地において、この発明は、ＡＣＳの早期の検出および識別の方法に関し、また、ＡＣＳ症状の状態の不利な事象の危険性についての個々人の同定に関する。
【０００３】
（発明の背景）
本発明の背景に関する以下の議論は、単に本発明を理解する上で読み手を助けるために提供するものであり、本発明の先行技術を記述または構成するものと認めるものではない。
【０００４】
ＡＣＳは、心臓への血管傷害の発現であり、また心筋傷害または心筋損傷とも呼ばれ、これは、一般にアテローム硬化症や高血圧症に従属的なものであり、米国における主要な死亡原因である。ＡＣＳは、一般にアテローム硬化症のプラーク形成による冠状動脈疾患に関係した閉塞、およびさらなる閉塞または裂のいずれかの進行に起因する。ＡＣＳは、安定狭心症、不安定狭心症、または心筋梗塞として発現しうる。
【０００５】
「急性冠状動脈症候群」（「ＡＣＳ」）の用語は、心臓への虚血性の傷害から生じる冠状動脈疾患のグループに適用されてきた。ＡＣＳの患者は、病態生理学、臨床的状態、および不利な事象の危険性において異なった、異種のグループを形成する。このような患者は、不安定狭心症、非−ＳＴ−上昇（「ＮＳＴ」） 非−Ｑ波心筋梗塞（「ＭＩ」）、ＳＴ−上昇 非−Ｑ波ＭＩ、および経壁（Ｑ波）ＭＩ等の連続体を形成する状態を医師に示す。ＡＣＳは、１またはそれ以上の冠状動脈中での血栓の沈着と成長に大きく起因すると考えられており、動脈の部分的若しくは完全な閉塞をもたらし、そして頻繁にプラークの破裂を伴い、虚血性傷害をもたらす。ＡＣＳは、冠状動脈痙攣や心筋への要求の増加によっても引き起こされうる。総説として、例えばDavis,Clin.Cardiol.20(増補I):I2-I7(1997)を参照のこと。
【０００６】
ＡＣＳの重大さは、虚血性傷害の結果としての罹患率と死亡率により強調される。例えば、ＡＣＳの状態の４から６週間以内で、死亡またはこれに続く心筋梗塞（ＭＩ）の危険性は８〜１４％であり、死亡、ＭＩ、または難治性虚血の割合は１５〜２５％であると、研究者は推定している(TherouxおよびFuster、Circulation 97:1195-1206、1998)。米国における急性ＭＩによる死亡者の総数は約６００，０００とされ、ＡＣＳの診断、予後、および対処に関連する情報のこの分野の調査は、当然のことながら広範囲に渡っている。循環している心臓トロポニン濃度（例えば、Antman et al.,N.Eng.J.Med.335:1342-9,1996を参照；また、米国特許番号６，１４７，６８８、６，１５６，５２１、５，９４７，１２４、および５，７９５，７２５を参照。これらは、引用することによりそのすべてをそれぞれ本明細書の１部として取り込むものである。）、ＳＴ部分の降下（例えば、Savonitto et.al.,JAMA 281:707-13,1999を参照。）、循環しているクレアチンキナーゼ濃度（例えば、Alexander et.al.,Circulation(増補)1629,1998を参照）、および循環しているｃ−反応性タンパク質濃度（例えば、Morrow et.al.,J.Am.Coll.Cardol.31:1460-5,1998参照）等の、ある患者集団においてこのような情報を提供しうるいくつかの可能性のあるマーカーが確認されている。
【０００７】
安定狭心症は、激しい活動やストレスによって起こる狭窄した胸部痛により特徴づけられ、休息や舌下のニトログリセリンにより軽減される。不安定狭心症は、舌下のニトログリセリンにより軽減される休息時の狭窄した胸部痛により特徴づけられる。狭心症の胸部痛は、通常舌下のニトログリセリンにより軽減され、痛みは、通常３０分以内に治まる。心筋梗塞は、診断の心電図検査（ＥＣＧ）のＱ波を伴いうる、３０分以上続く狭窄した胸部痛により特徴づけられる。不安定狭心症は、安定狭心症と心筋梗塞との間の臨床的状態を示すと考えられており、通常アテローム硬化症のプラーク破裂および血栓の形成に関係する。この点において、アテローム硬化症のプラーク破裂は、心筋梗塞の最も一般的な原因となる。
【０００８】
安定狭心症の間に炎症が起こり、プラーク破裂のマーカー、血小板の活性化、および早期血栓症が、不安定狭心症の重篤度の進行の同定とモニターに用いられる。定義によれば、狭心症の発作の間に起こる心筋損傷は可逆であり、一方、心筋梗塞の間に起こる損傷は不可逆である。この形式によれば、心筋傷害の特異的マーカーは、心筋梗塞を同定するために用いることができる。穏和な不安定狭心症から重篤な不安定狭心症および心筋梗塞への冠状動脈疾患の進行は、プラークの不安定さおよび動脈の閉塞の度合いに関連する。安定なプラークが増大してより閉塞的になるとこの進行はゆっくりと起こり、不安定なプラークが破裂し、血小板の活性化および閉塞性血栓の形成をもたらすと、これは急激に起こりうる。心筋梗塞は、不安定狭心症と同様の病態生理を最も頻繁に共有するので、これら２つの事象間の唯一の区別が心筋損傷の可逆性とすることが可能である。しかし、重篤な不安定狭心症と穏和な心筋梗塞との間の唯一の区別が臨床的診断に基づいているので、心筋損傷のマーカーは不安定狭心症を有していると診断された患者の末梢循環においても現れるであろう。
【０００９】
現在のＡＣＳの診断方法は、一般的に臨床的症状、心電図検査（ＥＣＧ）、および末梢循環の心臓マーカーの測定を含むものである。血管造影も、通常不安定狭心症および急性心筋梗塞（ＡＭＩ）に関係する重篤な胸部痛の場合に用いられる。ＡＣＳの患者は、頻繁に首、あご、肩、または左若しくは両方の腕の内側にしばしば広がる狭窄した胸部痛を有し、呼吸困難、発汗、動悸、頭のふらつき、および吐き気の症状を伴いうる。心筋虚血は、Ｑ波およびＳＴ部分の変化等の診断のＥＣＧの変化を引き起こしうる。心臓酵素の血漿濃度の上昇は、重篤な不安定狭心症および心筋梗塞に関係した心臓組織壊死の度合いを反映するであろう。
【００１０】
従って、この技術分野において、ＡＣＳの型を識別し、遅発の不利な事象の危険性を有するこれら個体をも同定できる、ＡＣＳの迅速、高感度で特異的な診断方法が現在求められている。このような診断方法は、有益な処置および治療を受けられる患者の数を非常に増加させ、間違った診断に関係する費用を減少させることとなる。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、ＡＣＳ、虚血、および／または壊死の診断および／または予後のマーカーの同定および使用に関連する。ここに記載された方法および組成物は、種々の形態のＡＣＳの診断、識別および予後に用いるために、迅速、高感度で特異的な診断方法に対するこの技術分野の要求に合致しうるものである。さらに、本発明の方法および組成物は、ＡＣＳ患者の処置およびさらなる診断指標の発展を容易にするために用いることもできるものである。
【００１２】
「虚血および虚血性の」の用語は、心臓への血流の減少の結果としての心筋への損傷と関連する。「狭心症」、「安定狭心症」、「不安定狭心症」、「無症候性虚血」の用語は、一般的に心筋虚血に関連する。当業者はこれらの用語を認識するはずであり、そしてこれらは「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」第１７版、1999、Ed.Keryn A.G.Lane、pp.1662-1668に記載されており、これはここに引用することのみにより本明細書に取り込まれる。虚血の用語は、当業者が軽症の心筋傷害または損傷と見なすであろうものにも関連する。虚血の用語は、Journal of the American College of Cardiology 36、959-969(2000)にさらに記載されており、これはここに引用することのみにより本明細書に取り込まれる。
【００１３】
「壊死および壊死性の」の用語は、心臓への血流の減少または停止の結果としての心筋細胞死と関係する。心筋壊死は、心筋虚血より重篤な心臓の状態である。「心筋梗塞」の用語は、一般的に心筋壊死と関連する。当業者はこれらの用語を認識するはずであり、そしてこれらは「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」第１７版、1999、Ed.Keryn A.G.Lane、pp.1668-1677に記載されており、これはここに引用することのみにより本明細書に取り込まれる。壊死の用語は、当業者が重症の心筋傷害または損傷と見なすであろうものにも関連する。心筋梗塞および壊死の用語は、Journal of the American College of Cardiology 36、959-969(2000)にさらに記載されており、これはここに引用することのみにより本明細書に取り込まれる。
【００１４】
種々の知見として、この発明は、患者のＡＣＳの診断、予後、または識別に関係するマーカーを同定する物質および工程に関係し、これらのマーカーを用いて、患者を診断および処置し、および／または処置計画の経過をモニターし、これらの状態の処置や予防の利益を提供しうる化合物および医薬組成物をスクリーニングする物質および工程に関連する。
【００１５】
最初の知見として、この発明は、患者から得た試験サンプルを心筋傷害の１またはそれ以上のマーカーの存在または量について分析することによるＡＣＳの診断方法を特徴とする。これらの方法は、その存在または量がＡＣＳの診断、予後、または識別に関係する、１またはそれ以上のマーカーを同定することを含みうる。このようなマーカーが同定されると、患者サンプル中のこれらのマーカーの濃度が測定できる。ある態様では、これらのマーカーは、ＡＣＳの診断、予後、または識別に関係する診断濃度と比較できる。患者の濃度を診断濃度と関連づけることにより、ＡＣＳの存在または不存在、および患者における将来の不利な結果の可能性を迅速かつ正確に決定できうる。
【００１６】
以下の議論の目的として、心筋梗塞の診断および予後に適用できるとして記載されている方法は、一般的に安定狭心症および不安定狭心症の診断および予後に適用できると考えられる。
【００１７】
ある態様では、複数のマーカーから個別にまたは小グループとして得られたものと比較して、分析の予測価を増加させるために、これらの複数のマーカーが組み合わされる。好ましくは、記載された方法の予測価を増強するために、心筋傷害の１またはそれ以上の特異的マーカーが、心筋傷害の１またはそれ以上の非特異的マーカーと組み合わされる。
【００１８】
ここで用いられる「マーカー」の用語は、患者の試験サンプルをスクリーニングする標的として用いられる分子を指す。このような分子標的の例としては、タンパク質またはポリペプチドがある。本発明でマーカーとして用いられる「タンパク質またはポリペプチド」は、これらのいずれのフラグメント、特に、免疫学的に検出可能なフラグメントをも含むことを企図されている。当業者は、血管傷害により損傷した心臓の細胞から放出されるタンパク質が、このようなフラグメントに分解または切断されることを認識できるはずである。さらに、あるマーカーは、不活性な形態で合成され、タンパク質分解によりその後活性化されうる。このようなマーカーの例は、以下に記載される。ここで用いられる「関連したマーカー」の用語は、マーカーそれ自身の代理として検出されうる特定のマーカーの１またはそれ以上のフラグメントを指す。
【００１９】
現在のところ、ＢＮＰおよびＢＮＰ関連ペプチドは、心筋虚血のマーカーとしては用いられてこなかった。さらに、炎症、凝固、およびプラーク破裂等の種々の病態進行の他のマーカーは、心筋虚血のマーカーの大きなパネルの部分集合としては用いられてこなかった。この発明の好ましいマーカーは、心筋梗塞、不安定狭心症、および安定狭心症の患者の診断、識別、および予後を助けることができる。
【００２０】
ここで用いられる「試験サンプル」の用語は、診断、予後、または評価の目的で得られた生物学サンプルを指す。ある態様では、このようなサンプルは、進行している状態の結果または状態の処置計画の効果を決定する目的のために得られるであろう。好ましい試験サンプルには、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿および唾液が含まれる。さらに、当業者は、いくつかの試験サンプルが分画や精製工程、例えば、全血液を血清または血漿成分に分離すること、の後に、容易に分析できることを認識できるはずである。
【００２１】
ここで用いられる「心筋傷害の特異的マーカー」の用語は、心臓組織に典型的に関係する分子であり、そしてそれは心臓傷害に関連づけられるが、他の型の傷害には関連づけられないものを指す。このような心臓傷害の特異的マーカーには、アネキシンＶ、Ｂ型ナトリウム排泄増加性ペプチド、β−エノラーゼ、心臓トロポニンＩ（遊離および／または複合体）、心臓トロポニンＴ（遊離および／または複合体）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、グリコーゲンホスホリラーゼ−ＢＢ、心臓型脂肪酸結合タンパク質、ホスホグリセリン酸ムターゼ−ＭＢ、およびＳ−１００ａｏが含まれる。これらの特異的マーカーは、以下に詳細に記載される。
【００２２】
ここで用いられる「心筋傷害の非特異的マーカー」の用語は、凝固および鬱血または急性期反応物質の典型的な一般的マーカーである分子を指す。このようなマーカーは、心臓傷害の事象において上昇しうるが、非心臓の事象によっても上昇しうる。血小板の活性化および凝固の機構の因子には、β−トロンボグロブリン、Ｄ−ダイマー、フィブリノペプチドＡ、血小板由来増殖因子、プラスミン−α−２−抗プラスミン複合体、血小板第４因子、プロトロンビンフラグメント１＋２、Ｐ−セレクチン、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体、血栓前駆体タンパク質、組織因子、およびフォン・ビルブラント因子が含まれる。これらの非特異的マーカーは、以下に詳細に記載される。
【００２３】
ここで用いられる「急性期反応物質」の用語は、感染、傷害、手術、外傷、組織壊死等を含む種々の傷害で起こるストレスの多いまたは炎症性の状態に応じてその濃度が上昇するタンパク質を指す。急性期反応物質の発現および血清濃度の上昇は、傷害の型に特異的ではなく、むしろ傷害に対する恒常性反応の一部である。
【００２４】
いくつかの成分が必要でない場合でも、恐らく広範囲の傷害を処理するために、すべての急性期反応物質は傷害に応じて産生される。古典的急性期タンパク質の例には、Ｃ−反応性タンパク質、セルロプラスミン、フィブリノーゲン、α１−酸性糖タンパク質、α１−アンチトリプシン、およびハプトグロビンを含む。インスリン様成長因子−１、インターロイキン−１β、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−６、インターロイキン−８、トランスホーミング増殖因子β、単球走化性タンパク質−１、および腫瘍壊死因子αのような種々のサイトカインおよび関連分子は、急性期反応にも深く関与する炎症反応の成分である。このようなサイトカインは、傷害部位から血流に放出され、それ自身他の急性期タンパク質の発現を誘導する能力を有する。
【００２５】
心筋傷害の他の非特異的マーカーには、アテローム硬化症のプラーク破裂のマーカーを含む。アテローム硬化症のプラークは、蓄積した脂質、平滑筋細胞、結合組織、およびグリコサミノグリカンからなる。このようなプラークを含む血管は、プラーク形成が進行すると、収縮期の膨張を減少させ、異常急激波伝播を起こし、次第に弾力性を減少させる。プラークは、重篤な狭窄と全体的な動脈閉塞を進行させうる。いくつかのプラークは安定であるが、脂質と炎症細胞を多く含む他のものは典型的に薄い繊維性の被覆を有しており、自然な破裂を受けうる。これらの不安定プラークは、急性虚血事象の発症により緊密に関係する。従って、アテローム硬化症のプラーク破裂のマーカーは、可能性あるＡＣＳの犠牲の診断および評価に有用であろう。このようなアテローム硬化症のプラーク破裂のマーカーには、ヒト好中球エラスターゼ、誘導型一酸化窒素シンターゼ、リゾホスファチド酸、マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ−９が含まれる。
【００２６】
心筋傷害の他の非特異的マーカーには、キャスパーゼ−３、ヘモグロビンα2、溶解性細胞間接着分子−１および溶解性血管細胞接着分子−１が含まれる。
【００２７】
ここで用いられる「診断」の語は、所定の疾患や状態を患者が患っているかどうかを、当業者が見積もりおよび決定することができる方法を指す。当業者はしばしば、１またはそれ以上の診断指標、即ち、その状態の存在、重篤度、または不存在の表示となるマーカー、その存在、不存在、または量、に基づいて診断を行う。
【００２８】
同様に、予後はしばしば、１またはそれ以上の「予後の指標」を試験することにより決定される。これらはマーカーであり、患者（または患者から得たサンプル）中でのその存在または量は、所定の経過または結果が起こる可能性を表示するものである。例えば、１またはそれ以上の予後の指標がこのような患者から得たサンプル中で充分に高い濃度に達した場合、その濃度は、より低いマーカー濃度を示す同様の患者と比較して、その患者が将来事象を経験する増大した可能性を有することを示すこととなる。予後の指標の濃度および濃度の変化は、次に罹患率または死亡の増大した可能性と関係し、患者に「不利な結果となる増大した疾病素因と関係する」ものとみなされる。好ましい予後のマーカーは、患者の遅発の不利な事象の発症、または将来のＡＣＳの可能性を予測できる。
【００２９】
診断および予後の指標の使用に関連してここで用いられる「関連づけ」の用語は、患者の指標の存在または量を、所定の状態で患うと知られている人若しくはその危険性がある人、または、所定の状態に影響されない、即ち、「健常人」として知られる人の指標の存在または量と比較するものを指す。例えば、患者のサンプルのマーカー濃度は、特異的な型のＡＣＳと関係しているとして知られた濃度と比較できる。サンプルのマーカー濃度は、診断と関連づけられたといわれ、これは、当業者が特異的な型のＡＣＳを患っている患者かどうかを決定するためにマーカー濃度を使用でき、これに従って対応できることを示すものである。あるいは、サンプルのマーカー濃度は、健常人の集合で見られる平均的な濃度のように、よい結果（例えばＡＣＳの不存在）に関係しているとして知られたマーカー濃度と比較することもできる。
【００３０】
ある態様では、診断または予後の指標は、単にその存在または不存在によって、状態または疾患と関連づけられる。他の態様では、診断または予後の指標の閾値濃度が確立され、そして患者サンプル中の指標の濃度が単純に閾値濃度と比較されうる。本発明のマーカーの好ましい閾値濃度は、約２５ｐｇ／ｍＬ、約５０ｐｇ／ｍＬ、約６０ｐｇ／ｍＬ、約７５ｐｇ／ｍＬ、約１００ｐｇ／ｍＬ、約１５０ｐｇ／ｍＬ、約２００ｐｇ／ｍＬ、約３００ｐｇ／ｍＬ、約４００ｐｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ、約６００ｐｇ／ｍＬ、約７５０ｐｇ／ｍＬ、約１０００ｐｇ／ｍＬ、および約２５００ｐｇ／ｍＬである。この文脈で「約」の用語は、＋／−１０％を指す。
【００３１】
また他の態様では、１またはそれ以上の診断または予後のマーカーの複合的決定が行われ、マーカーの一時的変化が診断または予後の決定に用いられうる。例えば、診断指標が１回目に決定され、そして２回目にも決定されうる。このような態様では、１回目から２回目へのマーカーの増加は、特定の型のＡＣＳの診断または所定の予後となりうる。同様に、１回目から２回目へのマーカーの減少は、特定の型のＡＣＳの表示または所定の予後となりうる。さらに、１またはそれ以上のマーカーの変化の度合いは、ＡＣＳの重篤度および将来の不利な事象に関連しうる。
【００３２】
また他の態様では、１またはそれ以上の診断または予後のマーカーの複合的決定が行われ、マーカーの一時的変化が適切な治療の効果をモニターするために用いられうる。このような態様では、効果的な治療の経過の間にわたって、マーカーの減少または増加を観察することが期待される。
【００３３】
ある態様では、比較測定が複数の時点で同一の診断マーカーについて行われるが、所定のマーカーを１時点で、第２のマーカーを第２の時点で測定し、これらのマーカーの比較が診断情報を提供しうることを、当業者は理解するであろう。
【００３４】
ここで用いられる「予後を決定すること」の語は、当業者が患者の状態の経過や結果を予測できる方法を指す。「予後」の用語は、１００％の正確さで状態の経過や結果を予測できるものを指さず、また、所定の経過や結果が試験マーカーの存在、不存在または濃度に基づいておおよそ起こりそうであると予測できるものを指すものでもない。その代わりに、当業者は、「予後」の用語がある特定の経過や結果が起こることの増大した可能性を指すものと理解できるであろうし、これは、その状態を示していない個体と比較したときに、経過や結果が所定の状態を示す患者において、より起こりそうなものである。例えば、その状態を示していない個体において、所定の結果を示す可能性は、約３％である。好ましい態様では、予後は、所定の結果を示す約５％の可能性、約７％の可能性、約１０％の可能性、約１２％の可能性、約１５％の可能性、約２０％の可能性、約２５％の可能性、約３０％の可能性、約４０％の可能性、約５０％の可能性、約６０％の可能性、約７５％の可能性、約９０％の可能性、および約９５％の可能性である。この文脈において「約」の用語は、＋／−１％を指す。
【００３５】
当業者は、予後の指標を不利な結果の疾病素因と関係づけることは統計分析であると理解するであろう。例えば、統計的優位さの濃度によって決定されるような、８０ｐｇ／ｍＬより大きなマーカー濃度は、８０ｐｇ／ｍＬより少ないかまたは同等の濃度の患者より不利な結果を患いやすい。さらに、ベースライン濃度からのマーカー濃度の変化は、患者の予後を反映するものであり、マーカー濃度の変化の度合いは不利な事象の重篤度と関連するであろう。統計的優位さは、２またはそれ以上の集団を比較することによりしばしば決定され、信頼区間および／またはｐ値が決定される。例えば、DowdyおよびWearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983を参照のこと。この発明の好ましい信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％であり、一方好ましいｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１および０．０００１である。予後の指標を不利な結果の疾病素因と関係づける典型的な統計検定は、以下に記載される。
【００３６】
他の態様では、予後または診断指標の濃度の変化の閾値度合いが確立され、患者サンプル中の指標の濃度の変化の度合いが、濃度の変化の閾値度合いと単純に比較されうる。この発明のマーカーの濃度の好ましい閾値変化は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％および約１５０％である。この文脈において「約」の用語は、＋／−１０％を指す。また他の態様では、「ノモグラム」が確立され、これにより、予後または診断指標の濃度を所定の結果に関係した疾病素因と直接関連づけることができる。集団の平均ではなく個々のサンプル測定結果が参照されるので、２つの数値をこの測定の不確定性がマーカー濃度の不確定性と同様であるとの理解と関連させるように、当業者はこのようなノモグラムの使用に熟知している。
【００３７】
また他の知見として、この発明は、ＡＣＳと診断された患者に用いる処置計画を決定する方法に関連する。この方法は、好ましくは以下に記載されるように１またはそれ以上の診断若しくは予後のマーカーの濃度を決定すること、および患者の診断を決定するためにそのマーカーを用いることを含む。診断に関係する不利な結果の増大する疾病素因を減少させることにより患者の予後を改善する１またはそれ以上の処置計画は、患者を処置するために用いることができる。このような方法は、上述のように、患者の予後を改善できる物質の薬理学的な化合物のスクリーニングにも用いられうる。
【００３８】
さらなる知見として、この発明は、患者の診断または予後を決定するためのキットに関連する。これらのキットは、好ましくは患者サンプル中の１またはそれ以上のマーカー濃度を測定する装置および試薬、また分析を行うための使用説明書を含む。任意に、このキットは、マーカー濃度を予後に変換する１またはそれ以上の方法を含みうる。このようなキットは、好ましくは１またはそれ以上のこのような決定を行うのに充分な試薬を含む。
【００３９】
（発明の詳細な記載）
本発明に従って、患者のＡＣＳの診断、予後、または識別に関係するマーカーの同定と使用のための方法および組成物が提供される。このようなマーカーは、患者の診断および処置および／または処置計画の経過のモニター；このような状態の処置または予防に有益なものを提供する化合物および医薬組成物のスクリーニングに使用できるものである。
【００４０】
心筋虚血は、心筋の酸素の供給と要求との平行失調によって起こるものである。特に、不充分な血液供給により要求が供給を超える。心臓は、全体重に対して少ない割合を占めるが、身体の酸素消費の７％の原因となる。心臓組織の代謝は、非常に酸素を消費し、不充分な血液供給に対して補償する蓄えをほとんど有していない。血液供給が心筋の要求に不充分なレベルに減少した場合、その組織は急激に低酸素となり、毒性の細胞代謝産物が取り除かれなくなる。心筋細胞は局所の微小血管内に残存している酸素供給物を急速に使用し、酸素を消費する代謝が持続する時間の長さは動脈閉塞の度合いに間接的に比例する。酸素供給物を使い果たすと、電子受容体としての酸素がもはや利用不可能なので、酸化的リン酸化が持続できなくなり、ピルビン酸はアセチルＣｏＡに変換できず、クエン酸回路に入れなくなる。心筋の代謝は、蓄えられたグリコーゲンとグルコースを用いた無酸素代謝に転換し、ピルビン酸が乳酸に発酵される。乳酸の蓄積は、ＡＣＳの個体の胸部痛の主要な原因である。虚血が持続すると、乳酸および他の酸性中間物質が蓄積するので心臓組織はより酸性となり、ＡＴＰ濃度が低下し、利用可能なエネルギー源が涸渇する。心臓組織は、虚血事象の１５〜２０分後に再灌流されれば回復できる。細胞の蓄えられたグリコーゲンが涸渇すると、細胞は徐々にミトコンドリアの膨張および細胞膜の完全性の損失等の壊死の特徴を示す。再灌流により、おそらくイオン平衡を維持する細胞の不能の結果として、これらの損傷した細胞は死ぬ。細胞膜の完全性の損失は、細胞質内容物を循環系に放出する原因となる。
【００４１】
安定狭心症、不安定狭心症、および心筋梗塞はすべて、心筋虚血に関係する狭窄した胸部痛という１つの共通する特徴を共有する。狭心症は、診断のＥＣＧの変化を伴う若しくは伴わない臨床的症状の医師による解釈を通じて安定若しくは不安定に分類される。「安定」または「不安定」という狭心症の分類は、プラークそのものの安定性を指すものではなく、むしろ胸部痛を顕在化させるのに必要な激しい活動の度合いを指す。最も注目に値するものとして、明白な心筋梗塞の場合の他は、安定または不安定（または軽症の心筋梗塞でさえ）としての胸部痛の分類は、完全に主観的なものである。診断およびこの場合の区別は、動脈の閉塞度合いを定量しうる血管造影によるのではなく、むしろ臨床的症状の医師の解釈によりなされるのである。
【００４２】
安定狭心症は、激しい活動やストレスで起こる狭窄した胸部痛により特徴づけられ、休息や舌下のニトログリセリンにより軽減される。安定狭心症の患者の冠状動脈血管造影により、少なくとも１つの冠状動脈において５０〜７０％の遮断が通常見られる。安定狭心症は、通常臨床的症状とＥＣＧの変化の評価により診断される。安定狭心症の患者は、一時的なＳＴ部分の異常を有するが、安定狭心症に関係したこれらの変化の感度と特異性は低い。
【００４３】
不安定狭心症は、舌下のニトログリセリンにより軽減される休息時の狭窄した胸部痛により特徴づけられる。狭心症の胸部痛は、通常舌下のニトログリセリンにより軽減され、痛みは通常３０分以内に治まる。不安定狭心症には：クラスＩ、新規の発症で、重篤で、または促進された狭心症として特徴づけられる；クラスＩＩ、重篤度が増し、持続し、またはニトログリセリンを必要とすることを特徴とする休息時の亜急性の狭心症；そしてクラスＩＩＩ、休息時の急性狭心症として特徴づけられる；の３つの分類がある。不安定狭心症は、安定狭心症とＡＭＩとの間の臨床的状態を示し、主として、アテローム硬化症、冠状動脈痙攣、または続いて起こる血栓閉塞を伴う非閉塞性プラークへの出血の重篤度および範囲の進行によるものと考えられている。不安定狭心症の患者の冠状動脈血管造影により、少なくとも１つの冠状動脈において９０％またはそれ以上の遮断が通常見られ、ベースラインの心筋の酸素要求を満たす酸素供給でさえ不能となる結果もたらす。安定なアテローム硬化症プラークの遅い成長または後に続く血栓の形成を伴う不安定なアテローム硬化症プラークの破裂は、不安定狭心症の原因となる。これらの原因の両方が、冠状動脈の致命的な狭小をもたらす。不安定狭心症は、通常アテローム硬化症プラークの破裂、血小板の活性化、および血栓の形成に関係する。不安定狭心症は、通常臨床的症状、ＥＣＧ変化、および（もし存在すれば）心臓マーカーの変化によって診断される。不安定狭心症の患者の処置には、硝酸塩、アスピリン、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ヘパリン、およびベータ遮断薬が含まれる。血栓崩壊治療は、不安定狭心症患者に有益であるとは示されておらず、カルシウムチャネル遮断薬も効果がないであろう。患者は、血管形成術およびステントも受けうる。最後に、不安定狭心症患者は、ＡＭＩに発展する危険性がある。
【００４４】
心筋梗塞は、診断のＥＣＧのＱ波を伴いうる３０分以上継続する狭窄した胸部痛により特徴づけられる。ＡＭＩのほとんどの患者は、冠状動脈疾患を有しており、ＡＭＩの２５％もの場合で「無症候性」（ｓｉｌｅｎｔ）または無症候の梗塞であり、糖尿病の個体は無症候性梗塞の疑いがよりつよい傾向にある。集団調査により、２０〜６０％の非致命的な心筋梗塞が患者に認識されない無症候性梗塞であることが示されている。ＡＭＩの非定型の臨床的状態には、鬱血性心不全、重篤または持続した発作を伴わない狭心症、非定型の局所の痛み、脳卒中に似た中枢神経系的発現、不安および神経質、突然性躁病または精神病、失神、虚弱、急性消化障害、および末梢塞栓形成が含まれる。ＡＭＩは、通常臨床的症状、ＥＣＧの変化、および心臓性タンパク質で最も顕著には心臓トロポニン、クレアチンキナーゼ−ＭＢおよびミオグロビンの上昇、により診断される。ＡＭＩの処置は、過去１０年の間改善し、患者の結果を改善し、ＡＭＩに関係した死亡率を３０％減少させることとなった。ＡＭＩ患者の処置は、梗塞の大きさを制限し、および、閉塞物質を除去し、心臓組織への酸素供給を増加させ、または心臓組織の酸素要求を減少させることにより結果を改善する、薬を投与することにより成し遂げられる。処置には、酸素の補給、アスピリン、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ヘパリン、血栓崩壊剤（ｔＰＡ）、硝酸塩（ニトログリセリン）、マグネシウム、カルシウムチャネルアンタゴニスト、β−アドレナリンレセプター遮断薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管形成（ＰＴＣＡ）、および管内冠状動脈ステントが含まれる。
【００４５】
胸部痛発症から３０分の時点は、虚血による可逆性心筋損傷の時期を示すものと考えられる。安定狭心症および不安定狭心症は、血管造影により動脈の閉塞がそれぞれ５０〜７０％および９０％以上のものとして特徴づけられ、心筋梗塞は、完全若しくはほぼ完全な閉塞により特徴づけられる。一般的な誤解は、安定狭心症および不安定狭心症はプラークの安定性を指すもの、または、心筋梗塞と一緒に、別個の疾患であるというものである。安定狭心症はしばしば不安定狭心症に進行し、不安定狭心症はしばしば心筋梗塞に進行するので、安定狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞はすべて、重篤度の変化した冠状動脈疾患として特徴づけることができる。近年、次の冠状動脈疾患の進行の生理学的モデルが提唱された：炎症→プラーク破裂→血小板活性化→早期血栓症→早期壊死。このモデルは、安定狭心症の間に炎症が起こり、プラーク破裂、血小板活性化、および早期血栓症のマーカーが不安定狭心症の重篤度の進行を同定しモニターするのに用いることができるとの理論に合致させて設計されたものである。狭心症の発作の間に起こる心筋損傷は、定義上可逆性であるが、心筋梗塞の間に起こる損傷は、不可逆性である。従って、安定狭心症、不安定狭心症、およびＡＭＩの区別のためのこのモデルには、２つの提唱された区切りがある。第１のものは、安定狭心症ではプラーク破裂が起こらないとする理論のもとで、炎症とプラーク破裂との間に起こる。第２のものは、不安定狭心症の間に受けた心筋損傷は可逆性のものであるとの理論のもとで、早期血栓症と早期壊死との間で起こる。早期心筋壊死を除いては、これらの事象が冠状動脈疾患のすべての形態と関係でき、この診断経路に沿った進行が必ずしも疾患の進行を示すものではないとうことを理解するのは重要である。軽症の不安定狭心症から重篤な不安定狭心症および心筋梗塞への冠状動脈疾患の進行は、プラークの不安定性と動脈閉塞の度合いに関連する。安定なプラークが増大しより閉塞的になると、この進行はゆっくりと起こり、血小板活性化および閉塞性血栓の形成により不安定なプラークが破裂すると、これは急激に起こりうる。心筋梗塞は、最も頻繁に不安定狭心症と同一の病態生理を共有するので、これら２つの事象の唯一の区別が心筋損傷の可逆性であるとすることは可能である。定義上、不安定狭心症は可逆性損傷を起こし、一方心筋梗塞は不可逆的損傷を起こす。不安定狭心症の患者には心筋壊死の存在が示されると公表した報告があった。定義上、これらの患者は、実際に早期のＡＭＩを経験するかもしれない。にもかかわらず、これらの患者が早期ＡＭＩの代わりに不安定狭心症であると診断されたとしても、高い度合いの重篤度は、早期の集中的な処理により彼らが大いに利益を受けうることを示す。心筋虚血は、安定狭心症、不安定狭心症、および心筋梗塞の病因の主要な決定因子であり、これらは個々の疾患であると考えるべきではない。むしろ、これらは、虚血による心筋損傷の増大する重篤度を反映するものである。
【００４６】
ＡＣＳの凝固カスケード
血管の損傷に続く血液の損失を止めまたは防ぐために用いられる、基本的な２つのメカニズムがある。第１のメカニズムは、血管傷害部位への付着を容易にする血小板の活性化を伴う。活性化した血小板は、次いで血液の損失を減少させまたは一時的に止める血小板栓を形成するように凝集する。活性化した血小板から分泌される多数の因子によって、血小板の凝集の進行、栓の形成および組織の修復がすべて促進され、増強される。血小板の凝集および栓の形成は、活性化した血小板同士の間のフィブリノーゲン架橋の形成により媒介される。第２のメカニズムにより同時に起こる活性化である凝固カスケードは、フィブリノーゲンからのフィブリンの発生および血小板栓を強固にする不溶性のフィブリン血塊の形成をもたらす。
【００４７】
凝固カスケードは、不活性またはチモーゲンの形態で通常存在する多数のセリンプロテイナーゼを伴う酵素による経路である。血管構造または血管の傷害の異質な表面の存在は、それぞれ、内因性および外因性の凝固経路の活性化をもたらす。最終の共通の経路が続き、これは、セリンプロテイナーゼトロンビンによるフィブリン、および最終的には架橋したフィブリン血塊の発生をもたらすものである。凝固カスケードにおいて、１つの活性化酵素が最初に形成され、これは他のものを活性化する他の酵素を活性化できるものであり、この工程は、調整されずにおかれれば、すべての凝固酵素が活性化されるまで続くこととなる。都合のよいことに、フィブリン溶解並びに凝固経路および血塊形成の活性を調整する内因性のプロテイナーゼ阻害因子の作用等の、適切なメカニズムがある。
【００４８】
フィブリン溶解は、タンパク質分解による血塊溶解工程である。凝固に類似した方法により、フィブリン溶解は、チモーゲンから活性化したセリンプロテイナーゼにより媒介される。セリンプロテイナーゼプラスミンは、フィブリンを血塊から遊離された小さい分解物に分解する原因となり、血塊の溶解をもたらす。フィブリン溶解は、血塊形成を調整するために凝固のすぐ後に活性化される。内因性セリンプロテイナーゼ阻害因子も、フィブリン溶解の調整剤として機能する。
【００４９】
血小板は、２〜４μｍの平均直径を有する円形または楕円形の円盤であり、通常血液中に２００，０００〜３００，０００／μｌの濃度で見出される。これらは、血管の完全性を維持し、血管の傷害部位で血小板栓を形成することにより出血を最初に止め、血小板栓を安定化するフィブリン形成の工程に寄与することにより、止血を維持する基本的な役割を果たす。血管傷害が起こると、血小板は傷害部位および互いに付着し、付着した血小板および傷害が起こった内皮細胞から放出される種々の物質により凝集するように刺激される。これは、放出反応に次ぐものであり、この放出反応では血小板から細胞内顆粒の内容物を分泌し、血小板栓を形成する。凝固カスケードにおいてトロンビンによるフィブリンの形成は、血塊反応に続く栓の硬化およびフィブリンの架橋による栓の安定化を可能にさせる。活性トロンビンは、同時に起こる凝固カスケードで発生し、血小板の活性化および凝集を誘導する能力も有する。
【００５０】
凝固カスケードは、外因性または内因性のいずれかの経路を通じて活性化されうる。これらの酵素の経路は、１つの最終の共通経路を共有する。凝固活性化の結果は、架橋したフィブリン血塊の形成である。フィブリン溶解は、凝固活性化のすぐ後に活性化されるタンパク質分解による血塊の溶解工程であり、おそらく血塊形成の速度と量を制御する作用である。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）および組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、タンパク質分解によりプラスミノーゲンを切断し、活性セリンプロテイナーゼプラスミンを発生させる。プラスミンは、タンパク質分解により架橋フィブリンを消化し、血塊溶解およびフィブリン分解物の産生と放出をもたらす。
【００５１】
凝固カスケードの共通経路の第１の工程は、活性トロンビンを生成する第Ｘａ因子／第Ｖａ因子プロトロンビナーゼ複合体によるプロトロンビンのタンパク質分解による切断を伴う。トロンビンは、フィブリンを形成するようにフィブリノーゲンをタンパク質分解により切断するセリンプロテイナーゼであり、これは血塊形成の間の架橋ネットワーク中に最終的に蓄積される。
【００５２】
マーカーの具体例
（ｉ）心筋傷害の特異的マーカー
アネキシンＶは、リポコルチンＶ、エンドネキシンＩＩ、カルホビンジンＩ、カルシウム結合タンパク質３３、胎盤抗凝固タンパク質Ｉ、トロンボプラスミン阻害因子、血管抗凝固因子−α、およびアンコリンＣＩＩとも呼ばれ、間接阻害因子であり組織因子の調整因子である３３ｋＤａのカルシウム結合タンパク質である。アネキシンＶは、すべのアネキシンファミリー構成員に共通するコンセンサス配列を有する４つの相同繰り返しから構成され、カルシウムおよびホスファチジルセリンに結合し、心臓、骨格筋、肝臓、および内皮細胞等の広く種々の組織で発現する(Giambanco, I. et al., J. Histochem. Cytochem. 39:P1189-1198, 1991; Doubell, A.F. et al., Cardiovasc. Res. 27:1359-1367, 1993)。アネキシンＶの正常血漿濃度は、＜２ｎｇ／ｍｌである(Kaneko, N. et al., Clin. Chim. Acta 251:65-80, 1996)。アネキシンＶの血漿濃度は、ＡＭＩの個体では上昇する(Kaneko, N. et al., Clin. Chim. Acta 251:65-80, 1996)。広い組織への分布により、アネキシンＶの血漿濃度の上昇は、非心臓組織の傷害を含むいずれの状態とも関係するであろう。しかし、血漿アネキシンＶ濃度が以前の心筋梗塞、胸部痛症候群、弁の心臓疾患、肺疾患、および腎臓疾患の患者では、有意には上昇しないことが１つの研究により見出された(Kaneko, N. et al., Clin. Chim. Acta 251:65-80, 1996)。これらの先行する結果は、ＡＣＳマーカーとしてのアネキシンＶの臨床的利用が決定される前に、確認を必要とする。アネキシンＶは、ＡＭＩ発症のすぐ後に血流に放出される。ＡＭＩ患者の血漿中のアネキシンＶ濃度は、最初の（入院時の）値から減少し、これが血流から急速に除去されることを示す(Kaneko, N. et al.. Clin. Chim. Acta 251:65-80, 1996)。
【００５３】
Ｂ型ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）は、脳型ナトリウム排泄増加性ペプチドとも呼ばれ、３２のアミノ酸であり、血圧および液体平衡を調整するためのナトリウム排泄増加系に関係する４ｋＤａのペプチドである(Bonow, R.O., Circulation 93:1946-1950, 1996)。ＢＮＰの前駆体は、「プレプロＢＮＰ」と呼ばれる１０８のアミノ酸分子として合成され、これは、「ＮＴプロＢＮＰ」と呼ばれる７６のアミノ酸Ｎ末端ペプチド（アミノ酸１−７６）と、ＢＮＰまたはＢＮＰ３２と呼ばれる３２のアミノ酸の成熟ホルモン（アミノ酸７７−１０８）とに、タンパク質分解によりプロセシングされる。これは、これらの種−ＮＴプロＢＮＰ、ＢＮＰ３２、およびプレプロＢＮＰ−の各々がヒト血漿中で循環できることを示している(Tateyama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 185: 760-7 (1992); Hunt et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 214: 1175-83 (1995))。プレプロＢＮＰおよびＮＴプロＢＮＰの２つの形態、並びにＢＮＰ、プレプロＢＮＰ、およびＮＴプロＢＮＰ由来のペプチド、並びにＢＮＰ、ＮＴプロＢＮＰおよびプレプロＢＮＰのタンパク質分解の結果として血液中に存在するペプチドは、ＢＮＰに関連しまたは関係したマーカーとして集合的に記載される。ＢＮＰおよびＢＮＰに関連したペプチドのタンパク質分解による分解は、文献にも記載されており、これらのタンパク質分解によるフラグメントも、「ＢＮＰ関連ペプチド」の用語に含まれる。ＢＮＰおよびＢＮＰ関連ペプチドは、心室の分泌顆粒中に主に見出され、心室体積の拡張および圧力の過負荷の双方に応じて心臓から放出される(Wilkins, M. et al., Lancet 349:1307-1310, 1997)。ＢＮＰの上昇は、増大した心房および肺の楔入圧、心室の収縮期および拡張期の低下した機能、左心室肥大、および心筋梗塞に関係している(Sagnella, G.A., Clinical Science 95:519-529, 1998)。さらに、鬱血性心不全および腎不全に関係した上昇したＢＮＰ濃度についての多数の報告がある。ＢＮＰおよびＢＮＰ関連ペプチドはＡＣＳに特異的なものではないが、これらが虚血による細胞損傷のみではなく、ＡＣＳに関係したナトリウム排泄増加系の混乱をも示すのであり得るので、これらはＡＣＳの高感度のマーカーとなりうる。ここで用いられる「ＢＮＰ」の用語は、成熟３２アミノ酸のＢＮＰ分子そのものを指す。当業者が認識するように、しかし、ＢＮＰに関連した他のマーカーも、ＡＣＳの患者の診断または予後の指標として役に立ちうる。例えば、ＢＮＰは、７６アミノ酸の「ＮＴプロＢＮＰ」と３２アミノ酸のＢＮＰ分子とにタンパク質分解によりプロセシングされる１０８アミノ酸のプレプロＢＮＰ分子として合成される。ＢＮＰとのその関係によって、ＮＴプロＢＮＰ分子の濃度も、患者の診断または予後の情報を提供しうる。「ＢＮＰに関連するマーカーまたはＢＮＰ関連ペプチド」の語は、３２アミノ酸のＢＮＰ分子そのもの以外の、プレプロＢＮＰ分子を起源とするいずれのポリペプチドをも指す。従って、ＢＮＰに関連しまたは関係したマーカーには、ＮＴプロＢＮＰ分子、プロドメイン、全３２アミノ酸配列よりも小さいＢＮＰのフラグメント、ＢＮＰ以外のプレプロＢＮＰのフラグメント、およびプロドメインのフラグメントが含まれる。当業者は、循環系がＢＮＰおよびＢＮＰ関連分子をタンパク質分解できるプロテアーゼを含んでおり、これらのタンパク質分解された分子（ペプチド）も「ＢＮＰ関連」とみなされ、そしてこの発明のさらなる主題であることをも認識するであろう。
【００５４】
エノラーゼは、α、β、およびγサブユニットから産生される７８ｋＤａのホモまたはヘテロダイマーの細胞質タンパク質である。エノラーゼは、解糖経路における２−ホスホグリセレートとホスホエノールピルベートとの変換を触媒する。エノラーゼは、αα、αβ、ββ、αγ、およびγγアイソフォームとして存在する。αサブユニットはほとんどの組織で見出され、βサブユニットは心臓および骨格筋で見出され、γサブユニットはニューロンおよび神経内分泌組織で主として見出される。β−エノラーゼは、αβおよびββエノラーゼから構成され、筋肉に特異的なものである。β−エノラーゼの正常血漿濃度は、＜１０ｎｇ／ｍｌ（１２０ｐＭ）である。β−エノラーゼは、ＡＭＩの個体の血清中で上昇するが、狭心症の個体では上昇しない(Nomura, M. et al., Br. Heart J. 58:29-33, 1987; Herraez-Dominguez, M.V. et al., Clin. Chim. Acta 64:307-315, 1975)。不安定狭心症および安定狭心症に関係した血漿β−エノラーゼ濃度の起こりうる変化についてのさらなる研究が、必要である。β−エノラーゼの血漿濃度は、心臓手術、筋ジストロフィー、および骨格筋傷害の間で上昇する(Usui, A. et al., Cardiovasc. Res. 23:737-740, 1989; Kato, K. et al., Clin. Chim. Acta 131:75-85, 1983; Matsuda, H. et al., Forensic Sci. Int. 99:197-208, 1999)。β−エノラーゼは、心臓または骨格筋傷害に続いて直ちに血流に放出される。血漿β−エノラーゼ濃度は、心臓手術の手術時段階で１５０ｎｇ／ｍｌ以上に上昇し、１週間上昇したまま維持した。血清β−エノラーゼ濃度は胸部痛およびＡＭＩの発症の約１２〜１４時間後に最大となり、発症から１週間経過後にベースラインに近づき、最大濃度は１μｇ／ｍｌに近づいた(Kato, K. et al., Clin. Chim. Acta 131:75-85, 1983; Nomura, M. et al., Br. Heart J. 58:29-33, 1987)。
【００５５】
トロポニンＩ（ＴｎＩ）は、２５ｋＤａのトロポニン複合体の阻害要素であり、すべての横紋筋組織で見出される。ＴｎＩは、Ｃａ2+の不存在下でアクチンに結合し、アクトミオシンのＡＴＰアーゼ活性を阻害する。心臓組織で見出されるＴｎＩアイソフォーム（ｃＴｎＩ）は、骨格筋ＴｎＩから４０％分岐したものであり、双方のアイソフォームは免疫学的に識別可能である。ｃＴｎＩの正常血漿濃度は、＜０．１ｎｇ／ｍｌ（４ｐＭ）である。血漿ｃＴｎＩ濃度は、ＡＭＩの患者で上昇する。不安定狭心症の患者の血漿ｃＴｎＩ濃度の変化についての研究では、相反した結果が得られたが、ｃＴｎＩは、安定狭心症の個体の血漿では上昇しない(Benamer, H. et al., Am. J. Cardiol. 82:845-850, 1998; Bertinchant, J.P. et al., Clin. Biochem. 29:587-594, 1996; Tanasijevic, M.J. et al., Clin. Cardiol. 22:13-16, 1999; Musso, P. et al., J. Ital. Cardiol. 26:1013-1023, 1996; Holvoet, P. et al., JAMA 281:1718-1721, 1999; Holvoet, P. et al., Circulation 98:1487-1494, 1998)。心筋虚血の程度が不安定狭心症の重篤度と直接比例するので、不安定狭心症に関係した相反した結果は、ｃＴｎＩが不安定狭心症の重篤度を決定するために役立ちうることを示している。血漿ｃＴｎＩ濃度は、心臓外傷、鬱血性心不全、および心臓手術、非虚血性拡張型心筋症、筋障害、ＣＮＳ障害、ＨＩＶ感染、慢性腎不全、敗血症、肺疾患、および内分泌障害と連動して上昇しうる(Khan, I.A. et al., Am. J. Emerg. Med. 17:225-229, 1999)。この明らかな非特異性は、イムノアッセイに用いられる抗体の品質と特異性に関連するであろう。ｃＴｎＩは、心臓細胞死に続いて血流に放出される。ＡＭＩの患者のｃＴｎＩの血漿濃度は、発症の４〜６時間後に有意に上昇し、１２〜１６時間の間に最大となり、１週間上昇したまま持続しうる。不安定狭心症に関係するｃＴｎＩの放出の動態も同様であろう。遊離心臓トロポニンＩ並びに心臓トロポニンＩとトロポニンＣおよび／またはＴとの複合体等の、心臓トロポニンの特異的形態の測定は、ＡＣＳの種々の段階を同定する能力を使用者に提供しうる。
【００５６】
遊離および複合体化した心臓トロポニンＴは、上述の心臓トロポニンＩと類似の方法により用いることができるであろう。心臓トロポニンＴ複合体は、単独でも、あるいは、全心臓トロポニンＩとの一部として発現している時でも、進行している心筋損傷の存在と関連した情報を提供し、有用であろう。進行中の虚血は心臓トロポニンＴＩＣ複合体の放出をもたらし、心臓トロポニンＴＩＣ：全心臓トロポニンＩの高い比率が、解決していない虚血による継続性の損傷の表示となり得ることを示すであろう。
【００５７】
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は、ＡＴＰおよびクレアチンからＡＤＰおよびホスホクレアチンの可逆的な形成を触媒する８５ｋＤａの細胞質ゾル酵素である。ＣＫは、ＭおよびＢ鎖から構成されるホモまたはヘテロダイマーである。ＣＫ−ＭＢは、心臓組織に最も特異的であるが、骨格筋および他の組織にも存在するアイソフォームである。ＣＫ−ＭＢの正常血漿濃度は、＜５ｇ／ｍｌである。血漿ＣＫ−ＭＢ濃度は、ＡＭＩの患者では有意に上昇する。血漿ＣＫ−ＭＢは、安定狭心症の患者では上昇せず、不安定狭心症の患者における血漿ＣＫ−ＭＢ濃度の上昇に関する研究では、相反した結果が得られた(Thygesen, K. et al., Eur. J. Clin. Invest. 16:1-4, 1986; Koukkunen, H. et al., Ann. Med. 30:488-496, 1998; Bertinchant, J.P. et al., Clin. Biochem. 29:587-594, 1996; Benamer, H. et al., Am. J. Cardiol. 82:845-850, 1998; Norregaard-Hansen, K. et al., Eur. Heart J. 13:188-193, 1992)。心筋虚血の範囲が直接不安定狭心症の重篤度に比例するので、不安定狭心症に関連した相反した結果は、ＣＫ−ＭＢが不安定狭心症の重篤度を決定するのに役に立ちうることを示している。血漿ＣＫ−ＭＢ濃度の上昇は、骨格筋の傷害および腎疾患に関係している。ＣＫ−ＭＢは、心臓細胞死に続いて血流に放出される。ＡＭＩの患者のＣＫ−ＭＢの血漿濃度は、発症の４〜６時間後に有意に上昇し、１２〜１４時間の間に最大となり、３日後にベースラインに戻る。不安定狭心症に関係するＣＫ−ＭＢ放出の動態も、同様であろう。
【００５８】
グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧＰ）は、糖原分解の間無機リン酸の存在下でグリコーゲンの非還元末端からグルコースの除去（グルコース−１−リン酸として遊離される）を触媒する１８８ｋＤａの細胞間アロステリック酵素である。ＧＰはホモダイマーとして存在し、これは４量体の酵素的に活性なホスホリラーゼＡを形成するように、もう一つのホモダイマーと結びつく。免疫学的に識別できる、ＧＰの３つのアイソフォームがある。ＢＢアイソフォームは脳および心臓組織で見出され、ＭＭアイソフォームは骨格筋および心臓組織で見出され、ＬＬアイソフォームは肝臓で優位に見出される(Mair, J. et al., Br. Heart J. 72:125-127, 1994)。ＧＰ−ＢＢは、通常筋小胞体糖原分解複合体に関係し、この関係は、心筋の代謝状態に依存する(Mair, J., Clin. Chim. Acta 272:79-86, 1998)。低酸素症の発症時にはグリコーゲンが切断され、ＧＰ−ＢＢが結合形態から遊離細胞質形態に転換される(Krause, E.G. et al.. Mol. Cell Biochem. 160-161:289-295, 1996)。正常血漿ＧＰ−ＢＢ濃度は、＜７ｎｇ／ｍｌ（３６ｐＭ）である。血漿ＧＰ−ＢＢ濃度は、ＡＭＩおよび一時的ＳＴ−Ｔ上昇の不安定狭心症の患者で有意に上昇するが、安定狭心症では上昇しない(Mair, J. et al., Br. Heart J. 72:125-127, 1994; Mair, J., Clin. Chim. Acta 272:79-86, 1998; Rabitzsch, G. et al., Clin. Chem. 41:966-978, 1995; Rabitzsch, G. et al., Lancet 341:1032-1033, 1993)。さらに、ＧＰ−ＢＢは、冠状動脈バイパス手術を受けている患者の手術中のＡＭＩおよび心筋虚血の検出にも用いることができる(Rabitzsch, G. et al., Biomed. Biochim. Acta 46:S584-S588, 1987; Mair, P. et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 32:543-547, 1994)。ＧＰ−ＢＢは、ＣＫ−ＭＢ、心臓トロポニンＴ、およびミオグロビンに比べ、発症後早期の不安定狭心症およびＡＭＩのより高感度のマーカーであることが示された(Rabitzsch, G. et al., Clin. Chem. 41:966-978, 1995)。これは脳でも見出されるので、血漿ＧＰ−ＢＢ濃度は、虚血性脳傷害の間でも上昇しうる。ＧＰ−ＢＢは、通常は細胞壊死の結果である細胞膜の透過性の増加も伴う虚血状態下で血流に放出される。ＧＰ−ＢＢは、不安定狭心症および一時的ＳＴ−Ｔ ＥＣＧ変化を有する個体の胸部痛の４時間以内に有意に上昇し、ミオグロビン、ＣＫ−ＭＢ、および心臓トロポニンＴが正常濃度にとどまる一方で、有意に上昇する(Mair, J. et al., Br. Heart J. 72:125-127, 1994)。さらに、ＧＰ−ＢＢは、ＡＭＩの患者の胸部痛の発症後１〜２時間で有意に上昇しうる(Rabitzsch, G. et al., Lancet 341:1032-1033, 1993)。不安定狭心症およびＡＭＩの患者の血漿ＧＰ−ＢＢ濃度は、５０ｎｇ／ｍｌ（２５０ｐＭ）を超えうる(Mair, J. et al., Br. Heart J. 72:125-127, 1994; Mair, J., Clin. Chim. Acta 272:79-86, 1998; Krause, E.G. et al., Mol. Cell Biochem. 160-161:289-295, 1996; Rabitzsch, G. et al., Clin. Chem. 41:966-978, 1995; Rabitzsch, G. et al., Lancet 341:1032-1033, 1993)。ＧＰ−ＢＢは、ＣＫ−ＢＢの特異性と同様に、心筋虚血の非常に高感度のマーカーと思われる。ＧＰ−ＢＢ血漿濃度は、ＡＭＩ発症後の最初の４時間以内に上昇し、これは心筋損傷の早期のマーカーとして非常に役に立ちうることを示している。さらに、ＧＰ−ＢＢは心臓虚血の間に非結合形態に放出され、外傷性傷害では通常放出されないため、これは心臓組織損傷だけではなく虚血のより特異的マーカーである。これが、心臓手術中の心筋虚血の検出において、ＧＰ−ＢＢの有用性として示される最良のものである。ＧＰ−ＢＢは、ＡＭＩおよび重篤な不安定狭心症の間の早期の心筋虚血の非常に有用なマーカーであろう。
【００５９】
心臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）は、脂質代謝を伴う細胞質ゾルの１５ｋＤａの脂質結合タンパク質である。心臓型ＦＡＢＰ抗原は、心臓組織だけでなく、腎臓、骨格筋、大動脈、副腎、胎盤、および脳でも見出されている(Veerkamp, J.H. and Maatman, R.G., Prog. Lipid Res. 34:17-52, 1995; Yoshimoto, K. et al., Heart Vessels 10:304-309, 1995)。さらに、心臓型ＦＡＢＰ ｍＲＮＡは、精巣、卵巣、肺、乳腺、および胃に見出される(Veerkamp, J.H. and Maatman, R.G., Prog. Lipid Res. 34:17-52, 1995)。ＦＡＢＰの正常血漿濃度は、＜６ｎｇ／ｍｌ（４００ｐＭ）である。血漿Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者で上昇する(Ishii, J. et al., Clin. Chem. 43:1372-1378, 1997; Tsuji, R. et al., Int. J. Cardiol. 41:209-217, 1993)。さらに、Ｈ−ＦＡＢＰは、ＡＭＩの患者の梗塞の大きさを見積もるのに有用であろう(Glatz, J.F. et al., Br. Heart J. 71:135-140, 1994)。Ｈ−ＦＡＢＰ源としての心筋組織は、ミオグロビン／ＦＡＢＰ（グラム／グラム）比を決定することにより確かめることができる。約５の比は、ＦＡＢＰが心筋源のものであり、より高い比は骨格筋源であることを示す(Van Nieuwenhoven, F.A. et al., Circulation 92:2848-2854, 1995)。骨格筋、腎臓および脳のＨ−ＦＡＢＰの存在のために、血漿Ｈ−ＦＡＢＰ濃度の上昇は、骨格筋傷害、腎臓疾患、または脳卒中と関係しうる。Ｈ−ＦＡＢＰは、心臓組織壊死に続いて血流に放出される。血漿Ｈ−ＦＡＢＰ濃度は、ＣＫ−ＭＢおよびミオグロビンよりも早く、胸部痛の発症後１〜２時間で有意に上昇する(Tsuji, R. et al., Int. J. Cardiol. 41:209-217, 1993; Van Nieuwenhoven, F.A. et al., Circulation 92:2848-2854, 1995; Tanaka, T. et al., Clin. Biochem. 24:195-201, 1991)。さらに、Ｈ−ＦＡＢＰは急速に血流から除去され、血漿濃度はＡＭＩ発症後２４時間後にベースラインに戻る(Glatz, J.F. et al., Br. Heart J. 71:135-140, 1994; Tanaka, T. et al., Clin. Biochem. 24:195-201, 1991)。
【００６０】
ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ）は、マグネシウムの存在下で３−ホスホグリセリン酸の２−ホスホグリセリン酸への転換を触媒する、２９ｋＤａのＭまたはＢサブユニットから構成される５７ｋＤａのホモまたはヘテロダイマーの細胞間糖分解酵素である。心臓組織はアイソザイムＭＭ、ＭＢ、およびＢＢを含有し、骨格筋は主としてＰＧＡＭ−ＭＭを、他のほとんどの組織はＰＧＡＭ−ＢＢを含有する(Durany, N. and Carreras, J., Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 114:217-223, 1996)。従って、ＰＧＡＭ−ＭＢは、心臓組織に最も特異的なアイソザイムである。ＰＧＡＭは、ＡＭＩの患者の血漿中で上昇するが、ＡＭＩ、不安定狭心症および安定狭心症に関係する血漿ＰＧＡＭ濃度の変化を決定するためにはさらなる研究がなされる必要がある(Mair, J., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 34:1-66, 1997)。血漿ＰＧＡＭ−ＭＢ濃度の上昇は、関連のない心筋のまたは恐らく骨格組織の損傷と関係するかもしれない。ＰＧＡＭ−ＭＢは、細胞壊死に続いて循環系に最も放出されやすい。ＰＧＡＭは、ラットの血流中では２時間以下の半減期である(Grisolia, S. et al., Physiol. Chem. Phys. 8:37-52, 1976)。
【００６１】
Ｓ−１００は、αおよびβサブユニットから産生される２１ｋＤａのホモまたはヘテロダイマーの細胞質ゾルのＣａ2+結合タンパク質である。これは、Ｃａ2+依存シグナル導入経路に沿った細胞工程の活性化に関与すると考えられる(Bonfrer, J.M. et al., Br. J. Cancer 77:2210-2214, 1998)。Ｓ−１００ａｏ（ααアイソフォーム）は横紋筋、心臓および腎臓で見出され、Ｓ−１００ａ（αβアイソフォーム）はグリア細胞で見出されるがシュヴァン細胞では見出されず、そしてＳ−１００ｂ（ββアイソフォーム）はグリア細胞およびシュヴァン細胞で高濃度で見出され、ここではこれが主要な細胞質ゾルの構成要素である(Kato, K. and Kimura, S., Biochim. Biophys. Acta 842:146-150, 1985; Hasegawa, S. et al., Eur. Urol. 24:393-396, 1993)。Ｓ−１００ａｏの正常血清濃度は、＜０．２５ｎｇ／ｍｌ（１２ｐＭ）であり、その濃度は年齢および性別により影響され、男性および年をとった個体では高い濃度となる(Kikuchi, T. et al., Hinyokika Kiyo 36:1117-1123, 1990; Morita, T. et al., Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi 81:1162-1167, 1990; Usui, A. et al., Clin. Chem. 36:639-641, 1990)。Ｓ−１００ａｏの血清濃度は、ＡＭＩの患者で上昇するが、疑似ＡＭＩの狭心症患者では上昇しない(Usui, A. et al., Clin. Chem. 36:639-641, 1990)。不安定および安定狭心症と関係するＳ−１００ａｏの血漿濃度の変化を決定するためには、さらなる研究が必要である。血清Ｓ−１００ａｏは、腎細胞癌、膀胱癌、腎不全、および前立腺癌、並びに切開心臓手術を受けている患者の血清中で上昇する(Hasegawa, S. et al., Eur. Urol. 24:393-396, 1993; Kikuchi, T. et al., Hinyokika Kiyo 36:1117-1123, 1990; Morita, T. et al., Nippon Hinyokika Gakkai Zasshi 81:1162-1167, 1990; Usui, A. et al., Clin. Chem. 35:1942-1944, 1989)。Ｓ−１００ａｏは、細胞死に続いて細胞外空間に放出されるであろう細胞質ゾルタンパク質である。Ｓ−１００ａｏの血清濃度は、ＡＭＩの患者の入院時に有意に上昇し、入院後８時間で最大に増加し、１週間後に減少してベースラインに戻る(Usui, A. et al., Clin. Chem. 36:639-641, 1990)。さらに、Ｓ−１００ａｏは、ＣＫ−ＭＢと比べ、ＡＭＩ発症後の早期に有意に上昇すると思われる(Usui, A. et al., Clin. Chem. 36:639-641, 1990)。最大血清Ｓ−１００ａｏ濃度は、１００ｎｇ／ｍｌを超えうる。再灌流およびその尿素濃度の上昇に続いて心臓手術患者の血清Ｓ−１００ａｏ濃度の急速な減少により示されるように、Ｓ−１００ａｏは腎臓により血流から急速に除去されうるが、ＡＣＳとの関連でＳ−１００ａｏの血流への放出および血流からのクリアランスの動態を決定するためにさらなる研究が必要である(Usui, A. et al., Clin. Chem. 35:1942-1944, 1989)。Ｓ−１００ａｏは、心臓組織中で高濃度で見出され、心臓傷害の高感度のマーカーと思われる。ＡＣＳのためのこのマーカーの非特異性の主要な供給源には、骨格筋および腎臓組織の傷害が含まれる。Ｓ−１００ａｏは、ＡＭＩ発症のすぐ後に有意に上昇し、不安定狭心症からのＡＭＩの区別を可能にしうる。虚血性エピソードと関係した胸部痛で苦しんでいることを示す狭心症および疑似ＡＭＩの患者は、有意に上昇したＳ−１００ａｏ濃度を有していなかった。非特異性の危険性にもかかわらず、ＣＫ−ＭＢおよびミオグロビンのものとの区別がないと思われるが、Ｓ−１００ａｏは、医師が不安定狭心症からＡＭＩを区別することを可能にしうる。
【００６２】
（ｉｉ）凝固に関連する心筋傷害のための非特異的マーカー
プラスミンは、タンパク質分解により架橋フィブリンを消化し、血塊溶解をもたらす７８ｋＤａのセリンプロテイナーゼである。７０ｋＤａのセリンプロテイナーゼ阻害因子α２−アンチプラスミン（α２ＡＰ）は、プラスミンと共有結合の１：１化学量論的複合体を形成することによりプラスミンの活性を調整する。得られる〜１５０ｋＤａのプラスミン−α２ＡＰ複合体（ＰＡＰ）は、プラスミン阻害複合体（ＰＩＣ）とも呼ばれ、α２ＡＰがフィブリン溶解の間に活性化されたプラスミンと接触した後直ぐに形成される。ＰＡＰの正常血清濃度は、＜１μｇ／ｍｌ（６．９ｎＭ）である。ＰＡＰの血清濃度の上昇は、フィブリン溶解の活性化の結果であると考えられる。ＰＡＰの血清濃度の上昇は、血塊の存在、またはフィブリン溶解に起因し若しくはフィブリン溶解の結果であるいずれの状態にも関係しうる。これらの状態には、アテローム硬化症、播種性血管内凝固症候群、ＡＭＩ、手術、外傷、不安定狭心症、脳卒中、および血栓性血小板減少性紫斑病を含みうる。ＰＡＰは、プラスミンのタンパク質分解による活性化に続いて直ぐに形成される。ＰＡＰは、フィブリン溶解活性化および最近の若しくは継続的な凝固能亢進性状態の存在の特異的マーカーである。これはＡＣＳに特異的なものではなく、多数の他の疾患状態でも上昇しうる。
【００６３】
β−トロンボグロブリン（βＴＧ）は、血小板の活性化によって放出される３６ｋＤａの血小板α顆粒成分である。βＴＧの正常血漿濃度は、＜４０ｎｇ／ｍｌ（１．１ｎＭ）である。βＴＧの血漿濃度は、不安定狭心症およびＡＭＩの患者では上昇しているように思えるが、安定狭心症では上昇していない(De Caterina, R. et al., Eur. Heart J. 9:913-922, 1988; Bazzan, M. et al., Cardiologia 34, 217-220, 1989)。血漿βＴＧの上昇は、不安定狭心症の患者の虚血エピソードに関連づけられるように見える(Sobel, M. et al., Circulation 63:300-306, 1981)。βＴＧの血漿濃度の上昇は、血塊の存在と関係し、または血小板の活性化の原因となるいずれの状態とも関係しうる。これらの状態には、アテローム硬化症、播種性血管内凝固症候群、手術、外傷、血栓性血小板減少性紫斑病、および脳卒中を含めることができる(Landi, G. et al., Neurology 37:1667-1671, 1987)。βＴＧは、血小板の活性化および凝集の直後に循環系に放出される。これは、血漿中で延長された１時間の半減期に続く、１０分間の２相半減期を有する (Switalska, H.I. et al., J. Lab. Clin. Med. 106:690-700, 1985)。血漿βＴＧ濃度は、伝えるところによれば不安定狭心症およびＡＭＩの間で上昇するが、これらの研究は完全に信頼できるものではないであろう。血液採取工程の間の血小板の活性化を避けるために、特別な予防措置が必要である。血小板の活性化は、通常の血液採取の間で一般的なものであり、血漿βＴＧ濃度の人為的な上昇を導くこととなる。さらに、血流に放出されたβＴＧの量は、個体の血小板数に依存し、これは非常に変動しうるものである。ＡＣＳに関係したβＴＧの血漿濃度は、７０ｎｇ／ｍｌ（２ｎＭ）に近づきうるが、この値は、採取工程の間の血小板の活性化に影響されるであろう。
【００６４】
血小板第４因子（ＰＦ４）は、血小板の活性化により放出される４０ｋＤａの血小板α顆粒成分である。ＰＦ４は、血小板活性化のマーカーであり、ヘパリンに結合し中和する能力を有する。ＰＦ４の正常血漿濃度は、＜７ｎｇ／ｍｌ（１７５ｐＭ）である。ＰＦ４の血漿濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者では上昇しているように思えるが、安定狭心症では上昇していない(Gallino, A. et al., Am. Heart J. 112:285-290, 1986; Sakata, K. et al., Jpn. Circ. J. 60:277-284, 1996; Bazzan, M. et al., Cardiologia 34:217-220, 1989)。血漿ＰＦ４の上昇も、不安定狭心症の患者の虚血のエピソードと関連づけられるように見える(Sobel, M. et al., Circulation 63:300-306, 1981)。ＰＦ４の血漿濃度の上昇は、血塊の存在、または血小板の活性化の原因となるいずれの状態とも関連づけらるであろう。これらの状態には、アテローム硬化症、播種性血管内凝固症候群、手術、外傷、血栓性血小板減少性紫斑病、および急性脳卒中を含めることができる(Carter, A.M. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1124-1131, 1998)。ＰＦ４は、血小板の活性化および凝集の直後に循環系に放出される。血漿中で延長した２０分の半減期に続く、１分間の２相半減期を有する。血漿中のＰＦ４の半減期は、ヘパリンの存在により２０〜４０分間延長されうる(Rucinski, B. et al., Am. J. Physiol. 251:H800-H807, 1986)。血漿ＰＦ４濃度は、伝えるところによれば不安定狭心症およびＡＭＩの間で上昇するが、これらの研究は完全に信頼できるのもではないであろう。血液採取工程の間の血小板の活性化を避けるために、特別な予防措置が必要である。血小板の活性化は、通常の血液採取の間で一般的なものであり、血漿ＰＦ４濃度の人為的な上昇を導くこととなる。さらに、血流に放出されたＰＦ４の量は、個体の血小板数に依存し、これは非常に変動しうるものである。疾患に関係したＰＦ４の血漿濃度は、１００ｎｇ／ｍｌ（２．５ｎＭ）を超えうるが、この値は、採取工程の間の血小板の活性化に影響されうるであろう。
【００６５】
フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）は、１６アミノ酸の、トロンビンの作用によりフィブリノーゲンのアミノ末端から遊離した１．５ｋＤａのペプチドである。フィブリノーゲンは、肝臓により合成され分泌される。ＦＰＡの正常血漿濃度は、＜５ｎｇ／ｍｌ（３．３ｎＭ）である。血漿ＦＰＡ濃度は、ＡＭＩ、不安定狭心症、および異型狭心症の患者で上昇するが、安定狭心症では上昇しない(Gensini, G.F. et al., Thromb. Res. 50:517-525, 1988; Gallino, A. et al., Am. Heart J. 112:285-290, 1986; Sakata, K. et al., Jpn. Circ. J. 60:277-284, 1996; Theroux, P. et al., Circulation 75:156-162, 1987; Merlini, P.A. et al., Circulation 90:61-68, 1994; Manten, A. et al., Cardiovasc. Res. 40:389-395, 1998)。さらに、血漿ＦＰＡは狭心症の重篤度を示しうる(Gensini, G.F. et al., Thromb. Res. 50:517-525, 1988)。ＦＰＡの血漿濃度の上昇は、脳卒中、手術、癌、播種性血管内凝固症候群、ネフローゼ、および血栓性血小板減少性紫斑病等の、凝固経路の活性化を伴ういずれの状態にも関係する。ＦＰＡは、トロンビンの活性化およびフィブリノーゲンの切断に続いて循環系に放出される。ＦＰＡは小さなペプチドであるので、血流から急速に除去されやすい。ＦＰＡは、血塊形成に続いて１ヶ月以上上昇していることが示され、活性な狭心症では最大血漿ＦＰＡ濃度が４０ｎｇ／ｍｌを超えうる(Gensini, G.F. et al., Thromb. Res. 50:517-525, 1988; Tohgi, H. et al., Stroke 21:1663-1667, 1990)。
【００６６】
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、相同性サブユニットＡおよび／またはＢから構成される、２８ｋＤａの分泌されたホモまたはヘテロダイマータンパク質である(Mahadevan, D. etal., J. Biol. Chem. 270:27595-27600, 1995)。ＰＤＧＦは、間葉細胞のための能力のあるマイトジェンであり、アテローム硬化症の病因に関係している。ＰＤＧＦは、凝集した血小板および血管傷害部位の近くの単球から放出される。ＰＤＧＦの正常血漿濃度は、＜０．４ｎｇ／ｍｌ（１５ｐＭ）である。血漿ＰＤＧＦ濃度は、健康な対象や安定狭心症の個体に比べ、ＡＭＩおよび不安定狭心症の個体では、高い(Ogawa, H. et al., Am. J. Cardiol. 69:453-456, 1992; Wallace, J.M. et al., Ann. Clin. Biochem. 35:236-241, 1998; Ogawa, H. et al., Coron. Artery Dis. 4:437-442, 1993)。これらの個体での血漿ＰＤＧＦ濃度の変化は、増加した血小板および単球の活性化により最も起こりうる。血漿ＰＤＧＦは、脳腫瘍、乳癌、および高血圧の個体で上昇する(Kurimoto, M. et al., Acta Neurochir. (Wien) 137:182-187, 1995; Seymour, L. et al., Breast Cancer Res. Treat. 26:247-252, 1993; Rossi, E. et al., Am. J. Hypertens. 11:1239-1243, 1998)。血漿ＰＤＧＦは、いずれの前炎症性状態または、手術、外傷、播種性血管内凝固症候群、および血栓性血小板減少性紫斑病等の血小板の活性化の原因となるいずれの状態でも上昇しうる。ＰＤＧＦは、活性化により血小板および単球の分泌性顆粒から放出される。ＰＤＧＦは、動物では、約５分間および１時間の２相半減期を有する(Cohen, A.M. et al., J. Surg. Res. 49:447-452, 1990; Bowen-Pope, D.F. et al., Blood 64:458469, 1984)。ＡＣＳでの血漿ＰＤＧＦ濃度は、０．６ｎｇ／ｍｌ（２２ｐＭ）を超えうる(Ogawa, H. et al., Am. J. Cardiol. 69:453-456, 1992)。ＰＤＧＦは、血小板活性化の高感度かつ特異的マーカーであり得る。さらに、血管傷害並びに付随する単球および血小板活性化の高感度のマーカーであり得る。
【００６７】
プロトロンビンフラグメント１＋２は、トロンビンの活性化の間にトロンビンのアミノ末端から遊離する３２ｋＤａのポリペプチドである。Ｆ１＋２の正常血漿濃度は、＜３２ｎｇ／ｍｌ（１ｎＭ）である。ＡＣＳに関係する血漿Ｆ１＋２濃度上昇の研究報告は、対立している。Ｆ１＋２の血漿濃度は、伝えるところによればＡＭＩおよび不安定狭心症の患者で上昇するが、安定狭心症では上昇せず、その変化は大きくない(Merlini, P.A. et al., Circulation 90:61-68, 1994)。他の報告では、心臓血管疾患で血漿Ｆ１＋２濃度の有意な変化がないことを示している(Biasucci, L.M. et al., Circulation 93:2121-2127, 1996; Manten, A. etal., Cardiovasc. Res. 40:389-395, 1998)。血漿中のＦ１＋２の濃度は、脳卒中、手術、外傷、血栓性血小板減少性紫斑病、および播種性血管内凝固症候群等の凝固活性化に関係したいずれの状態の間でも、上昇しうる。Ｆ１＋２は、トロンビンの活性化により直ぐに血流に放出される。Ｆ１＋２は、血漿中で約９０分間の半減期を有し、この長い半減期がトロンビン形成の突発を遮蔽しうることが示された(Biasucci, L.M. et al., Circulation 93:2121-2127, 1996)。
【００６８】
Ｐ−セレクチンは、顆粒膜タンパク質−１４０、ＧＭＰ−１４０、ＰＡＤＧＥＭ、およびＣＤ−６２Ｐとも呼ばれ、血小板および内皮細胞で発現する〜１４０ｋＤａの接着分子である。Ｐ−セレクチンは、血小板のアルファ顆粒および内皮細胞のヴァイベル−パラーデ体に蓄えられる。活性化により、Ｐ−セレクチンは内皮細胞および血小板の表面に急速に移行し、好中球および単球との「ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）」細胞表面相互作用を容易にする。Ｐ−セレクチンの膜結合性および溶解性の型が、同定されている。溶解性Ｐ−セレクチンは、細胞外Ｐ−セレクチン分子のタンパク質分解または表面結合性Ｐ−セレクチン分子の極近傍での細胞内骨格細胞成分のタンパク質分解のいずれかによる、膜結合性Ｐ−セレクチンの発散により産生されうる(Fox, J.E., Blood Coagul. Fibrinolysis 5:291-304, 1994)。さらに、溶解性Ｐ−セレクチンは、Ｎ−末端膜内外ドメインをエンコードしないｍＲＮＡから翻訳されうる(Dunlop, L.C. et al., J. Exp. Med. 175:1147-1150, 1992; Johnston, G.I. et al., J. Biol. Chem. 265:21381-21385, 1990)。活性化血小板は、膜結合性Ｐ−セレクチンを発散して循環系にとどまることができ、Ｐ−セレクチンの発散は、血漿Ｐ−セレクチン濃度を約７０ｎｇ／ｍｌに上昇させることができる(Michelson, A.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:11877-11882, 1996)。溶解性Ｐ−セレクチンは、膜結合性Ｐ−セレクチンと異なったコンフォメーションにも適合しうる。溶解性Ｐ−セレクチンは、１つの末端に球状ドメインを有するモノマーの棒状構造であり、膜結合分子は、外側に向けた球状ドメインを有するロゼット構造を形成する(Ushiyama, S. etal., J. Biol. Chem. 268:15229-15237, 1993)。溶解性Ｐ−セレクチンは、白血球と活性化した血小板および内皮細胞との相互作用を遮蔽することにより炎症と血栓症を調整する重要な役割を果たすであろう(Gamble, J.R. et al., Science 249:414-417, 1990)。溶解性Ｐ−セレクチンの正常血漿濃度は、＜２００ｎｇ／ｍｌである。血液は、通常抗凝固剤としてクエン酸を用いて採取されるが、いくつかの研究では血小板の活性化を防ぐためにプロスタグランジンＥのような添加剤を加えたＥＤＴＡ血漿を用いていた。ＥＤＴＡは、クエン酸を用いて得たものと比較しうる結果をもたらす適切な抗凝固剤であろう。さらに、溶解性Ｐ−セレクチンの血漿濃度は、採取工程の間の潜在的な血小板活性化によっては、影響されないであろう。血漿の溶解性Ｐ−セレクチン濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者では有意に上昇したが、安定狭心症では、運動ストレス試験の後であっても上昇しなかった(Ikeda, H. et al., Circulation 92:1693-1696, 1995; Tomoda, H. and Aoki, N., Angiology 49:807-813, 1998; Hollander, J.E. et al., J.Am. Coll. Cardiol. 34:95-105, 1999; Kaikita, K. et al., Circulation 92:1726-1730, 1995; Ikeda, H. et al., Coron. Artery Dis. 5:515-518, 1994)。ＡＭＩについて、膜結合性Ｐ−セレクチン対溶解性Ｐ−セレクチンの感度および特異性は、７１％対７６％および３２％対４５％であった(Hollander, J.E. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 34:95-105, 1999)。不安定狭心症＋ＡＭＩについて、膜結合性Ｐ−セレクチン対溶解性Ｐ−セレクチンの感度および特異性は、７１％対７９％および３０％対３５％であった(Hollander, J.E. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 34:95-105, 1999)。Ｐ−セレクチン発現は、安定狭心症のものと比べ、不安定狭心症の個体からの冠状動脈内粥腫切除標本の方が大きい(Tenaglia, A.N. et al., Am. J. Cardiol. 79:742-747, 1997)。さらに、血漿の溶解性Ｐ−セレクチンは、不安定狭心症の患者に比べ、ＡＭＩの患者の方が大きい度合いで上昇しうる。血漿の溶解性および膜結合性Ｐ−セレクチンは、非インスリン依存性糖尿病および鬱血性心不全の個体でも上昇する(Nomura, S. et al., Thromb. Haemost. 80:388392, 1998; O'Connor, C.M. et al., Am. J. Cardiol. 83:1345-1349, 1999)。溶解性Ｐ−セレクチン濃度は、特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リュウマチ、高コレステロール血症、急性脳卒中、アテローム硬化症、高血圧、急性肺傷害、結合組織疾患、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、播種性血管内凝固症候群、および慢性腎不全の個体の血漿で上昇する(Katayama, M. et al., Br. J. Haematol. 84:702-710, 1993; Haznedaroglu, I.C. et al., Acta Haematol. 101:16-20, 1999; Ertenli, I. et al., J.Rheumatol. 25:1054-1058, 1998; Davi, G. et al., Circulation 97:953-957, 1998; Frijns, C.J. et al., Stroke 28:2214-2218, 1997; Blann, A.D. et al., Thromb. Haemost. 77:1077-1080, 1997; Blann, A.D. et al., J. Hum. Hypertens.11:607-609, 1997; Sakamaki, F. et al., A. J. Respir. Crit. Care Med.151:1821-1826, 1995; Takeda, I. et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 105:128-134, 1994; Chong, B.H. et al., Blood 83:1535-1541, 1994; Bonomini, M. et al., Nephron 79:399-407, 1998)。さらに、血小板の活性化を伴ういずれの状態も、潜在的にはＰ−セレクチンの血漿上昇の供給源となりうる。Ｐ−セレクチンは、内皮細胞血小板の活性化に続いて細胞表面に即座に現れる。膜内外ドメインを欠いた代替ｍＲＮＡから翻訳された溶解性Ｐ−セレクチンも、この活性化に続いて細胞外空間に放出される。溶解性Ｐ−セレクチンは、膜結合性Ｐ−セレクチンを伴う直接および間接のいずれかによるタンパク質分解によっても形成されうる。血漿の溶解性Ｐ−セレクチンは、ｔＰＡまたは冠状動脈形成の処置をされたＡＭＩの患者の入院時に上昇し、発症後４時間で最大上昇が起こる(Shimomura, H. etal., Am. J. Cardiol. 81:397-400, 1998)。血漿の溶解性Ｐ−セレクチンは、不安定狭心症の患者の狭心症の発作に続いて１時間以内に上昇し、その濃度は時間経過とともに減少し、発作の発症後５時間以上でベースラインに近づいた(Ikeda, H. etal., Circulation 92:1693-1696, 1995)。溶解性Ｐ−セレクチンの血漿濃度は、ＡＣＳで１μｇ／ｍｌに近づく(Ikeda, H. et al., Coron. Artery Dis. 5:515-518, 1994)。血流への溶解性Ｐ−セレクチンの放出および血流から除去に関するさらなる研究がなされる必要がある。Ｐ−セレクチンは、血小板および内皮細胞の活性化、血栓の形成を支持する状態、および炎症、の高感度かつ特異的なマーカーでありうる。しかし、これはＡＣＳの特異的マーカーではない。心臓組織傷害に特異的な他のマーカーとともに用いた場合、Ｐ−セレクチンは、不安定狭心症およびＡＭＩを安定狭心症から識別するのに有用であろう。さらに、溶解性Ｐ−セレクチンは、不安定狭心症よりＡＭＩにおいて大きな度合いで上昇しうる。Ｐ−セレクチンは、通常は膜結合性と溶解性の２つの型で存在する。公表された研究では、Ｐ−セレクチンの溶解型は、血小板および内皮細胞により、膜結合性Ｐ−セレクチンを遮蔽することにより、潜在的にはタンパク質分解機構により産生されるとしている。その血漿濃度が、ＰＦ４およびβＴＧのような他の血小板活性化マーカーのように血液採取工程によって影響されないので、溶解性Ｐ−セレクチンは、血小板活性化の現在同定されている最も有用なマーカーであることが証明される。
【００６９】
トロンビンは、フィブリノーゲンをタンパク質分解により切断してフィブリンを形成する３７ｋＤａのセリンプロテイナーゼであり、これは最終的には血塊形成の間に架橋したネットワーク中に蓄積される。アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）は、トロンビン、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子、および第ＩＸａ因子のタンパク質分解による活性化の生理学的調整因子である６５ｋＤａのセリンプロテイナーゼ阻害因子である。ＡＴＩＩＩの阻害活性は、ヘパリンの結合に依存する。ヘパリンは、２〜３桁の大きさでＡＴＩＩＩの阻害活性を増強し、ＡＴＩＩＩにより阻害されるプロテイナーゼのほとんど瞬時の不活性化をもたらす。ＡＴＩＩＩは、共有結合の１：１化学量論的複合体の形成を通じて、その標的プロテイナーゼを阻害する。約１００ｋＤａのトロンビンＡＴＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）の正常血漿濃度は、＜５ｎｇ／ｍｌ（５０ｐＭ）である。ＴＡＴ濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者で、特に突発性虚血エピソードの間で上昇する(Biasucci, L.M. et al., Am. J. Cardiol. 77:85-87, 1996; Kienast, J. et al., Thromb. Haemost. 70:550-553, 1993)。さらに、ＴＡＴは、安定狭心症の個体の血漿でも上昇しうる(Manten, A. et al., Cardiovasc. Res. 40:389395, 1998)。他の公表された報告では、ＡＣＳ患者の血漿のＴＡＴ濃度に有意な違いはないことが見出された(Manten, A. et al., Cardiovasc. Res. 40:389-395, 1998; Hoffmeister, H.M. et al., Atherosclerosis 144:151-157, 1999)。ＡＣＳに関係した血漿ＴＡＴ濃度の変化を決定するためには、さらなる研究が必要である。血漿ＴＡＴ濃度の上昇は、脳卒中、手術、外傷、播種性血管内凝固症候群、および血栓性血小板減少性紫斑病等の凝固活性化に関係したいずれの状態にも関係する。ＴＡＴは、ヘパリンの存在下でトロンビンの活性化に続いて直ぐに形成され、これはこの相互作用の限定因子である。ＴＡＴは、血流中で約５分間の半減期を有する(Biasucci, L.M. et al., Am. J. Cardiol. 77:85-87, 1996)。ＴＡＴ濃度は上昇し、１５分後に急激な落ち込みを示して、凝固活性化に続いて１時間以内にベースラインに戻る。ＴＡＴの血漿濃度は、ＡＣＳで５０ｎｇ／ｍｌに近づく(Biasucci, L.M. et al., Circulation 93:2121-2127, 1996)。ＴＡＴは、凝固活性化、特にトロンビンの活性化の特異的マーカーである。ＴＡＴは、プラーク破裂および／または心臓組織傷害に特異的な他のマーカーとともに診断パネルの凝固活性化のマーカーとして有用であろう。
【００７０】
Ｄ−ダイマーは、２００ｋＤａの概算分子量を有する架橋フィブリン分解物である。Ｄ−ダイマーの正常血漿濃度は、＜１５０ｎｇ／ｍｌ（７５０ｐＭ）である。Ｄ−ダイマーの血漿濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者で上昇するが、安定狭心症では上昇しない(Hoffmeister, H.M. et al., Circulation 91:2520-2527, 1995; Bayes-Genis, A. et al., Thromb. Haemost. 81:865-868, 1999; Gurfinkel, E. et al., Br. Heart J. 71:151-155, 1994; Kruskal, J.B. et al., N. Engl. J. Med. 317:1361-1365, 1987; Tanaka, M. and Suzuki, A., Thromb. Res. 76:289-298, 1994)。Ｄ−ダイマーの血漿濃度は、脳卒中、手術、アテローム硬化症、外傷、および血栓性血小板減少性紫斑病等の凝固およびフィブリン溶解活性化に関係したいずれの状態の間でも上昇するであろう。Ｄ−ダイマーは、プラスミンによるタンパク質分解による血塊溶解に続いて直ぐに血流中に放出される。血漿Ｄ−ダイマー濃度は、ＡＣＳ発症後直ぐに上昇し（６時間以内に）、個体の凝固能亢進の度合いに比例して上昇したまま維持するであろう。この点で、ＡＣＳに続く血流からのＤ−ダイマーの除去の動態を決定するためには、さらなる研究が必要である。Ｄ−ダイマーの血漿濃度は、不安定狭心症の患者では２μｇ／ｍｌを超えうる(Gurfinkel, E. et al., Br. Heart J. 71:151-155, 1994)。血漿Ｄ−ダイマーは、フィブリン溶解の特異的マーカーであり、ＡＭＩおよび不安定狭心症に関係したプロトロンビンの状態の存在を示すものである。Ｄ−ダイマーは、ＡＣＳに特異的ではなく、Ｄ−ダイマーの血漿上昇は、ＡＣＳの様々な危険因子に関係するであろう。しかし、心臓傷害に特異的なマーカーを含むパネルの構成員として用いる場合、Ｄ−ダイマーは、安定狭心症からの不安定狭心症およびＡＭＩの区別を可能にしうる。この識別は、医師が急性の胸部痛を示している患者をより効率的に処置することを可能にしうる。
【００７１】
フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）は、一連の高分子量多量体を形成することに関係する２２０ｋＤａのモノマーから構成される、血小板、巨核球、および内皮細胞により産生される血漿タンパク質である。これらの多量体は、通常６００〜２０，０００ｋＤａの分子量の範囲に入る。ｖＷＦは、循環している凝固因子ＶＩＩＩを安定化すること、および他の血小板と同様に、露出した内皮下層への血小板の接着を媒介することにより、凝固工程に参加する。ｖＷＦのＡ１ドメインは、血小板糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ−Ｖ複合体および非原繊維ＶＩ型コラーゲンに結合し、Ａ３ドメインは、原繊維ＩおよびＩＩＩ型コラーゲンに結合する(Emsley, J. et al., J. Biol. Chem. 273:10396-10401, 1998)。ｖＷＦ分子に存在する他のドメインには、血小板−血小板相互作用を媒介するインテグリン結合ドメイン、１１Ａ型フォン・ビルブラント疾患の病因に関連すると思われるプロテイナーゼ切断ドメイン、が含まれる。ｖＷＦの血小板との相互作用は、正常の生理状態では、ｖＷＦと血小板との相互作用を避けるために厳しく調整される。ｖＷＦは、通常球状の状態で存在し、高い剪断応力の状態下で伸長した鎖構造へのコンフォメーション転移を受け、これは通常血管傷害部位に見出される。このコンフォメーションの変化は、分子の分子内ドメインを露出し、ｖＷＦが血小板と相互作用することを可能にする。さらに、剪断応力は、内皮細胞からのｖＷＦの放出の原因となり、非常に多数のｖＷＦ分子を血小板と相互作用可能にする。ｖＷＦのコンフォメーションの変化は、リストセチンおよびボトロセチンのような非生理学的調整因子の添加によりｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発されうる(Miyata, S. et al., J. Biol. Chem. 271:9046-9053, 1996)。血管傷害部位では、ｖＷＦは、内皮下層マトリックスのコラーゲンと迅速に結合し、実質上不可逆的に血小板に結合し、傷害部位において血小板と血管内皮下層との間の架橋を効果的に形成する。ｖＷＦのコンフォメーションの変化が内皮下層マトリックスとの相互作用に必要ないかもしれないという証拠も示されている(Sixma, J.J. and de Groot, P.G., Mayo Clin. Proc. 66:628-633, 1991)。これは、ｖＷＦが、血管傷害部位において露出した内皮下層マトリックスに結合し、非常に局在化した剪断応力のためにコンフォメーションの変化を受け、循環している血小板に迅速に結合し、新しく形成した血栓中に蓄積されるであろうことを示している。ｖＷＦの全量の測定は、当業者が脳卒中や心臓血管疾患に関係した全ｖＷＦ濃度の変化を同定することを可能にする。この測定は、種々の形態のｖＷＦ分子を測定することを通じて行われる。Ａ１ドメインの測定は、循環系の活性ｖＷＦの測定を可能にし、Ａ１ドメインが血小板の結合に近づきやすいので、凝固促進性の状態が存在することを示すこととなる。この点において、露出したＡ１ドメインと、インテグリン結合ドメイン若しくはＡ３ドメインのいずれかと、の双方においてｖＷＦ分子を特異的に測定するアッセイは、それぞれ、血小板−血小板相互作用を媒介することを可能にするか、または血小板の血管内皮下層への架橋を媒介する、活性ｖＷＦの同定をも可能にしうる。これらのｖＷＦ形態のいずれかの測定は、プロテアーゼ切断ドメインに特異的な抗体を用いるアッセイを用いた場合に、フォン・ビルブラント疾患の存在にかかわらず、いずれの個体においても種々のｖＷＦ形態の循環している濃度を決定するために用いるアッセイを可能にしうる。ｖＷＦの正常血漿濃度は、血小板凝集物として測定した場合、５〜１０μｇ／ｍｌまたは６０〜１１０％の活性度である。ｖＷＦの特異的形態の測定は、脳卒中および心臓血管疾患等のいずれの型の血管疾患においても重要であろう。血漿ｖＷＦ濃度は、伝えるところによればＡＭＩおよび不安定狭心症の患者では上昇するが、安定狭心症では上昇しない(Goto, S. et al., Circulation 99:608-613, 1999; Tousoulis, D.et al., Int. J. Cardiol. 56:259262, 1996; Yazdani, S. et al., J Am Coll Cardiol 30:1284-1287, 1997; Montalescot, G. et al., Circulation 98:294-299)。さらに、血漿ｖＷＦ濃度の上昇は、不安定狭心症の患者の不利な臨床的結果の予測量になりうる(Montalescot, G. et al., Circulation 98:294-299)。ｖＷＦ濃度は、脳卒中およびクモ膜下出血の患者でも上昇することが示されており、脳卒中に続く死亡の危険の評価にも有用と思われる(Blann, A. et al., Blood Coagul. Fibrinolysis 10:277-284, 1999; Hirashima, Y. et al.. Neurochem Res. 22:1249-1255, 1997; Catto, A.J. et al., Thromb. Hemost. 77:1104-1108, 1997)。ｖＷＦの血漿濃度は、内皮細胞の損傷または血小板の活性化に関係するいずれの事象とも連動して上昇しうる。ｖＷＦは、血流中で高濃度で存在し、活性化により血小板および内皮細胞から放出される。ｖＷＦは、血小板の活性化、または、特に血小板の活性化および血管傷害部位への接着に好ましい状態、のマーカーとして最良の有益がありそうである。ｖＷＦのコンフォメーションは、部分的に狭窄した血管に関係するような、高い剪断応力により変化することも知られている。血液が狭窄した血管を流れると、疾患を有しない個体の循環系で遭遇するものよりも相当高い剪断応力を受ける。この発明の他の知見は、剪断応力から生じるｖＷＦの形態およびＡＣＳの存在に対するその形態の相関を測定することである。
【００７２】
組織因子（ＴＦ）は、脳、腎臓および心臓で発現する４５ｋＤａの細胞表面タンパク質であり、血管周辺の細胞および単球上で転写により調整される。ＴＦは、Ｃａ2+イオンの存在下で第ＶＩＩａ因子と複合体を形成し、それが膜結合の場合に生理学的に活性である。この複合体は、第Ｘ因子を、第Ｘａ因子を形成するようにタンパク質分解により切断する。これは、通常血流から隔離されている。組織因子は、血流中で溶解型、第ＶＩＩａ因子に結合したもの、または第ＶＩＩａ因子との複合体、および第Ｘａ因子をも含みうる組織因子経路阻害因子、として検出されうる。ＴＦは、マクロファージの表面でも発現し、これは通常アテローム硬化症プラーク中で見出される。ＴＦの正常血清濃度は、＜０．２ｎｇ／ｍｌ（４．５ｐＭ）である。血漿ＴＦ濃度は、虚血性心臓疾患の患者で上昇する(Falciani, M. et al., Thromb. Haemost. 79:495-499, 1998)。ＴＦは、不安定狭心症およびＡＭＩの患者で上昇するが、安定狭心症の患者では上昇しない(Falciani, M. et al., Thromb. Haemost. 79:495-499, 1998; Suefuji, H. et al., Am. Heart J. 134:253-259, 1997; Misumi, K. et al., Am. J. Cardiol. 81:2226, 1998)。さらに、マクロファージでのＴＦの発現およびアテローム硬化症プラークでのＴＦの活性は、安定狭心症より不安定狭心症においてより一般的である(Soejima, H. et al., Circulation 99:2908-2913, 1999; Kaikita, K. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:2232-2237, 1997; Ardissino, D. et al., Lancet 349:769-771, 1997)。不安定狭心症に対する安定狭心症の血漿ＴＦ濃度の違いは、統計的に有意なものではないであろう。ＴＦの血清濃度の上昇は、外因性経路を通じた凝固活性化の原因となるまたはその結果であるいずれの状態にも関係する。これらの状態には、クモ膜下出血、播種性血管内凝固症候群、腎不全、脈管炎、および鎌状赤血球症を含めることができる(Hirashima, Y. et al., Stroke 28:1666-1670, 1997; Takahashi, H. et al., Am. J. Hematol. 46:333-337, 1994; Koyama, T. et al., Br. J. Haematol. 87:343-347, 1994)。ＴＦは、血管傷害が血管外細胞障害と結びつくと、直ぐに放出される。虚血性心臓疾患患者のＴＦ濃度は、発症の２日以内に８００ｐｇ／ｍｌを超えうる(Falciani, M. et al., Thromb. Haemost. 79:495-499, 1998)。ＴＦ濃度は、慢性期と比べて、ＡＭＩの慢性期では減少した(Suefuji, H. et al., Am. Heart J. 134:253-259, 1997)。ＴＦは、外因性凝固経路の活性化および一般的な凝固能亢進性状態の存在の特異的マーカーである。これは、プラーク破裂による血管傷害の高感度のマーカーとなり、パネル構成員として有益であろう。これは、ＡＣＳに特異的ではなく、多くの疾患状態でも上昇し、血液採取工程により人為的にも上昇しうる。しかし、血栓崩壊治療の患者を除外するためのマーカーとしてＴＦを用いることは可能であろう。血栓崩壊治療の間の組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の注入は、フィブリン溶解の活性化をもたらし、患者は、血塊を維持できなくなる。血管傷害の個体へのｔＰＡの投与は、最終的には出血をもたらすこととなる。
【００７３】
凝固カスケードは、外因性または内因性のいずれかの経路を通じて活性化されうる。これらの酵素的経路は、１つの最終の共通経路を共有する。共通経路の第１の工程は、第Ｘａ因子／第Ｖａ因子プロトロンビナーゼ複合体によるプロトロンビンのタンパク質分解による切断を伴い、活性トロンビンを生成する。トロンビンは、フィブリノーゲンをタンパク質分解により切断するセリンプロテイナーゼである。トロンビンは、フィブリノーゲンからフィブリノペプチドＡを最初に取り除いてｄｅｓＡＡフィブリンモノマーを生成し、これは、フィブリン分解物、フィブリノーゲン分解物、ｄｅｓＡＡフィブリン、およびフィブリノーゲン等のすべの他のフィブリノーゲン由来タンパク質と複合体を形成しうる。ｄｅｓＡＡフィブリンモノマーは、フィブリノーゲン切断の最初の産物であるので、一般的には溶解性フィブリンを指すが、第ＸＩＩＩａ因子を介して不溶性フィブリン血塊に未だ架橋していない。ｄｅｓＡＡフィブリンモノマーは、トロンビンによるさらなるタンパク質分解による切断を受けて、フィブリノペプチドＢを取り除き、ｄｅｓＡＡＢＢフィブリンモノマーを生成する。このモノマーは、他のｄｅｓＡＡＢＢフィブリンモノマーと重合して溶解性ｄｅｓＡＡＢＢフィブリンポリマーを形成し、これは溶解性フィブリンまたは血栓前駆体タンパク質（ＴｐＴTM）とも呼ばれる。ＴｐＴTMは、溶解性フィブリンの直近の前駆体であり、これは「網状」構造を形成して新しく形成した血栓に構造的な強固さを提供する。この点において、血漿中のＴｐＴTMの測定は、活性な血塊形成の直接的な測定となる。ＴｐＴTMの正常血漿濃度は、＜６ｎｇ／ｍｌである(Laurino, J.P. et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 27:338-345, 1997)。アメリカンバイオジェネティックサイエンシーズは、ＴｐＴTMのアッセイを開発し（米国特許番号５４５３３５９および５８４３６９０）、ＴｐＴTMアッセイは、ＡＭＩの早期診断、胸部痛を有する患者のＡＭＩの除外、およびＡＭＩに進行するであろう不安定狭心症の患者の同定、を補助できると述べている。他の研究により、ＴｐＴTMがＡＭＩの患者において、発症の６時間以内に最もしばしば上昇することが確認された(Laurino, J.P. et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 27:338-345, 1997; Carville, D.G. etal., Clin. Chem. 42:1537-1541, 1996)。ＴｐＴTMの血漿濃度は、不安定狭心症の患者でも上昇するが、これらの上昇は、狭心症の重篤度および来るべきＡＭＩの進行の表示となりうる(Laurino, J.P. et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 27:338-345, 1997)。血漿中のＴｐＴTMの濃度は、播種性血管内凝固症候群、深層静脈血栓症、鬱血性心不全、手術、癌、胃腸炎、およびコカインの過剰投与等の凝固活性化の原因となるまたはその結果であるいずれの状態の間にも、理論的には上昇するであろう(Laurino, J.P. et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 27:338-345, 1997)。ＴｐＴTMは、トロンビンの活性化に続いて直ぐに血流に放出される。ＴｐＴTMは、血塊形成部位において不溶性フィブリンに即座に転換されるので、血流中では短い半減期を有することとなる。血漿ＴｐＴTM濃度は、ＡＭＩ発症の３時間以内に最大となり、発症から１２時間後に正常に戻る。ＴｐＴTMの血漿濃度は、ＣＶＤで３０ｎｇ／ｍｌを超えうる(Laurino, J.P. et al., Ann. Clin. Lab. Sci. 27:338-345, 1997)。ＴｐＴTMは、凝固活性化の高感度かつ特異的マーカーである。心臓組織傷害の特異的マーカーと併せて用いた場合のみであるが、ＴｐＴTMがＡＭＩの診断に有用であることが示された。ＴｐＴTMは、ＡＣＳに特異的なマーカーではなく、その濃度は、ＡＣＳの発展の危険因子と見なされる状態等の凝固活性化を伴う多数の疾患状態において上昇するであろう。ＴｐＴTMは、不安定狭心症の重篤度を決定するのにも有用であろう。アメリカンバイオジェネティックサイエンシーズ社は、ＴｐＴTMＥＬＩＳＡアッセイキットの使用者に抗凝固剤としてクエン酸を用いて血液を採取することを指示しており、彼らはＥＤＴＡを用いることに反対の提言をしている。血漿ＴｐＴTM濃度に対する血液採取の間に用いられる抗凝固剤の効果は、現状では不明確である。血液採取工程が制御できれば、ＴｐＴTMは凝固活性化の利用可能な最良のマーカーであろう。
【００７４】
（ｉｉｉ）アテローム硬化症のプラーク破裂に関連した心筋傷害の非特異的マーカー
アテローム硬化症のプラーク破裂に関連したマーカーの出現は、ＡＣＳがアテローム硬化症のプラーク破裂による場合、心筋傷害の特異的マーカーに先行するであろう。アテローム硬化症のプラーク破裂の可能性のあるマーカーには、ヒト好中球エラスターゼ、誘導型一酸化窒素シンターゼ、リゾホスファチド酸、マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質、並びにＭＭＰ−１、−２、−３および−９等のマトリックスメタロプロテイナーゼ−（ＭＭＰ）ファミリーの種々の構成員が含まれる。
【００７５】
ヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）は、好中球のアズール親和顆粒に通常含まれる３０ｋＤａのセリンプロテイナーゼである。ＨＮＥは、好中球の活性化により放出され、その活性は循環しているα１−プロテイナーゼ阻害因子により調整される。活性化した好中球は、アテローム硬化症プラーク中で通常見出され、これらのプラークの破裂はＨＮＥの放出をもたらしうる。血漿ＨＮＥ濃度は、通常ＨＮＥ−α１−ＰＩ複合体を検出することにより測定される。これらの複合体の正常濃度は、５０ｎｇ／ｍｌであり、これはＨＮＥについては約２５ｎｇ／ｍｌ（０．８ｎＭ）の正常濃度であることを示す。ＨＮＥの放出は、血漿中で、特異的ＨＮＥ由来フィブリノペプチドである、フィブリノペプチドＢβ30-43の特異的検出を通じても測定される。血漿ＨＮＥは、冠状動脈狭窄の患者で上昇し、その上昇は単純プラークを有するものよりも複合プラークを有する患者の方が大きい(Kosar, F. et al., Angiology 49:193-201, 1998; Amaro, A. et al., Eur. Heart J. 16:615-622, 1995)。血漿ＨＮＥは、安定狭心症の患者では有意に上昇しないが、不安定狭心症およびＡＭＩの患者では上昇し、フィブリノペプチドＢβ30-43の測定による決定では、不安定狭心症での濃度は、ＡＭＩに関連したものに比べ２．５倍高い(Dinerman, J.L. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 15:1559-1563, 1990; Mehta, J. et al., Circulation 79:549-556, 1989)。血清ＨＮＥは、心臓手術、運動に誘導される筋肉の損傷、巨細胞性動脈炎、急性呼吸窮迫症候群、虫垂炎、膵臓炎、敗血症、喫煙に関係した気腫、および嚢胞性繊維症で上昇する(Genereau, T. et al., J. Rheumatol. 25:710-713, 1998; Mooser, V. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19:1060-1065, 1999; Gleeson, M. et al.. Eur. J. Appl. Physiol. 77:543-546, 1998; Gando, S. et al., J Trauma 42:1068-1072, 1997; Eriksson, S. etal., Eur. J. Surg. 161:901-905, 1995; Liras, G. et al., Rev. Esp. Enferm. Dig. 87:641-652, 1995; Endo, S. et al., J. Inflamm. 45:136-142, 1995; Janoff, A., Annu Rev Med 36:207-216, 1985)。ＨＮＥは、血液凝固の間で放出されうる(Plow, E.F. and Plescia, J., Thromb. Haemost. 59:360-363, 1988; Plow, E.F., J. Clin. Invest. 69:564-572, 1982)。ＨＮＥの血清上昇は、好中級のリクルートメントおよび活性化を伴ういずれの非特異的感染または炎症にも関係しうる。活性化した好中級がアテローム硬化症プラークに存在するので、これはプラーク破裂により最も放出されやすい。ＨＮＥは、おそらくα１−ＰＩとの複合体を形成した後に肝臓により除去される。
【００７６】
誘導型一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）は、その発現がインターフェロン−γ、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、および腫瘍壊死因子α等のサイトカイン並びにリポ多糖類により調整される、上皮細胞マクロファージの１３０ｋＤａの細胞質ゾルタンパク質である。ｉＮＯＳは、Ｌ−アルギニンからの一酸化窒素（ＮＯ）の合成を触媒し、その誘導は持続した高出力のＮＯ産生をもたらし、これは抗菌活性を有し、様々な生理的および炎症性事象の媒介物である。ｉＮＯＳによるＮＯ産生は、構成的発現型ＮＯＳにより産生される量の約１００倍以上である(Depre, C. et al., Cardiovasc. Res. 41:465-472, 1999)。ＡＣＳに関連した血漿ｉＮＯＳ濃度変化についての公表された研究はない。ｉＮＯＳは、冠状動脈アテローム硬化症プラークで発現し、過酸化窒素の産生を通じてプラークの安定性を妨害し、これはＮＯと過酸化物との産物であり血小板の接着と凝固を増進するものである(Depre, C. et al., Cardiovasc. Res. 41:465-472, 1999)。心臓虚血の間のｉＮＯＳの発現は上昇せず、ｉＮＯＳがＡＭＩから狭心症を識別するために有用であり得ることを示している(Hammerman, S.I. et al., Am. J. Physiol. 277:H1579-H1592, 1999; Kaye, D.M. et al., Life Sci 62:883-887, 1998)。血漿ｉＮＯＳ濃度の上昇は、肝硬変、鉄欠乏性貧血、または細菌感染等のマクロファージの活性化をもたらすいずれの他の状態にも関係しうる(Jimenez, W. et al., Hepatology 30:670-676, 1999; Ni, Z. et al., Kidney Int. 52:195-201, 1997)。ｉＮＯＳは、アテローム硬化症のプラーク破裂の結果として血流に放出され、血流中のｉＮＯＳの増加した量の存在は、プラーク破裂が起こっただけでなく、血小板の接着を促進するための理想的な環境が創生されたことを示すであろう。しかし、ｉＮＯＳは、アテローム硬化症のプラーク破裂に特異的ではなく、その発現は、非特異的な炎症状態の間にも誘導されうる。
【００７７】
リゾホスファチチド酸（ＬＰＡ）は、ホスホグリセリド類およびトリアシルグリセロールの合成において形成されるリゾリン脂質の中間体である。これは、アシル−補酵素Ａによるグリセロール−３リン酸のアシル化により、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の穏やかな酸化の間に形成される。ＬＰＡは、血管作用性の性質を有する脂質の第２メッセンジャーであり、血小板活性化因子として機能できる。ＬＰＡは、アテローム硬化症病巣の成分であり、特に中心部にあり、最も破裂しやすい(Siess, W., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 6931-6936, 1999)。正常血漿ＬＰＡ濃度は、５４０ｎＭである。血清ＬＰＡは、腎不全並びに卵巣癌および他の婦人科の癌で上昇する(Sasagawa, T. et al., J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo) 44:809-818, 1998; Xu, Y. et al., JAMA 280:719-723, 1998)。不安定狭心症との関連で、ＬＰＡは、プラーク破裂の直接の結果として最も放出されやすい。血漿ＬＰＡ濃度は、婦人科の癌の患者において６０μＭを超えうる(Xu, Y. et al., JAMA 280:719-723, 1998)。血清ＬＰＡは、アテローム硬化症のプラーク破裂の有用なマーカーであり、安定狭心症からの不安定狭心症の区別を可能にしうる。しかし、ＬＰＡは、プラーク破裂の他のマーカーのように特異的ではないであろう。
【００７８】
マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質（ＭＤＡ−修飾ＬＤＬ）は、ホスホリパーゼ活性、プロスタグランジン合成、または血小板の活性化の結果としてのＬＤＬのａｐｏＢ−１００部分の酸化の間に形成される。ＬＤＬのＭＤＡ修飾が脂質の過酸化の不存在下で起こるので、ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、酸化ＬＤＬから識別できる(Holvoet, P., Acta Cardiol. 53:253-260, 1998)。ＭＤＡ−修飾ＬＤＬの正常血漿濃度は、４μｇ／ｍｌ（〜１０μＭ）以下である。酸化ＬＤＬの血漿濃度は、安定狭心症、不安定狭心症、およびＡＭＩで上昇し、アテローム硬化症のマーカーであり得ることを示す(Holvoet, P., Acta Cardiol. 53:253-260, 1998; Holvoet, P. et al., Circulation 98:1487-1494, 1998)。血漿ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、安定狭心症では上昇しないが、不安定狭心症およびＡＭＩでは有意に上昇する(Holvoet, P., Acta Cardiol. 53:253-260, 1998; Holvoet, P. et al., Circulation 98:1487-1494, 1998; Holvoet, P. et al., JAMA 281:1718-1721, 1999)。血漿ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、ベータ−サラセミアの個体および腎臓移植患者において上昇する(Livrea, M.A. et al., Blood 92:3936-3942, 1998; Ghanem, H. et al., Kidney Int. 49:488-493, 1996; van den Dorpel, M.A. et al., Transpl. Int. 9 Suppl. 1:S54-S57, 1996)。さらに、血清ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、低酸素症の間に上昇する(Balagopalakrishna, C. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 411:337-345, 1997)。ＭＤＡ−修飾ＬＤＬの血漿濃度は、胸部痛の発症から６〜８時間以内に上昇する。ＭＤＡ−修飾ＬＤＬの血漿濃度は、ＡＭＩの患者では２０μｇ／ｍｌ（〜５０μＭ）に、不安定狭心症の患者では１５μｇ／ｍｌ（〜４０μＭ）に近づきうる(Holvoet, P. et al., Circulation 98:1487-1494, 1998)。血漿ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、マウスで５分以下の半減期を有する(Ling, W. et al., J. Clin. Invest. 100:244-252, 1997)。ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、急性冠状動脈症候群のアテローム硬化症のプラーク破裂の特異的マーカーと思われる。しかし、ＭＤＡ−修飾ＬＤＬの血漿濃度の上昇がプラーク破裂の結果であるのか、または血小板の活性化の結果であるのかは、不明確である。最も妥当な説明は、ＭＤＡ−修飾ＬＤＬの増大した量の存在は両方の事象の表示であるというものである。ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、安定狭心症からの不安定狭心症およびＡＭＩの区別に有用でありうるが、それ単独では不安定狭心症からのＡＭＩを識別できない。この点において、ＭＤＡ−修飾ＬＤＬは、特に不安定狭心症からＡＭＩを区別できる他のマーカーとともに用いた場合に、マーカーのパネルの一部として最も有用であろう。
【００７９】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、コラゲナーゼ−１とも呼ばれ、主としてＩ型コラーゲンを切断するがＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩＩおよびＸ型コラーゲンも切断する、４１／４４ｋＤａの亜鉛およびカルシウム結合プロテイナーゼである。活性な４１／４４ｋＤａの酵素は、自己分解を受けなお活性な２２／２７ｋＤａの形態になりうる。ＭＭＰ−１は、平滑筋細胞、マスト細胞、マクロファージ由来泡沫細胞、Ｔリンパ球、および内皮細胞等の種々の細胞により合成される(Johnson, J.L. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1707-1715, 1998)。ＭＭＰ−１は、他のＭＭＰと同様に、細胞外マトリックスの再構築に関係しており、これは傷害に続いて、または血管間細胞移動の間に起こりうる。ＭＭＰ−１は、遊離またはその天然阻害因子であるＴＩＭＰ−１との複合体のいずれかの形態で血流中で見出される。ＭＭＰ−１は、血漿中で通常＜２５ｎｇ／ｍｌの濃度で見出される。ＡＣＳに関係したＭＭＰ−１の血清または血漿濃度変化についての結論的な公表された研究はない。しかし、ＭＭＰ−１は、アテローム硬化症プラークの肩領域で見出され、これは最も破裂しやすい領域であり、アテローム硬化症プラークの不安定化に関係しうる(Johnson, J.L. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1707-1715, 1998)。さらに、ＭＭＰ−１は、心筋再灌流傷害の病因に関連する(Shibata, M. et al., Angiology 50:573-582, 1999)。血清ＭＭＰ−１は、マスト細胞の分解を誘導する炎症性状態で上昇しうる。血清ＭＭＰ−１濃度は、関節炎および全身性エリテマトーデスの患者で上昇する(Keyszer, G. et al., Z Rheumatol 57:392-398, 1998; Keyszer, G. J. Rheumatol. 26:251-258, 1999)。血清ＭＭＰ−１は、前立腺癌の患者でも上昇し、その上昇の度合いは、腫瘍の転移の可能性に対応する(Baker, T. et al., Br. J. Cancer 70:506-512, 1994)。ＭＭＰ−１の血清濃度は、他の型の癌の患者においても上昇する。血清ＭＭＰ−１は、ヘモクロマトーシスの患者および慢性ウイルス性肝炎の患者で減少し、ここではその濃度が重篤度に反比例している(George, D.K. et al., Gut 42:715-720, 1998; Murawaki, Y. et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 14:138-145, 1999)。ＭＭＰ−１は、マスト細胞の脱顆粒の間で放出され、おそらくアテローム硬化症のプラーク破裂の間で放出される。ＭＭＰ−１濃度は、ＥＤＴＡ血漿または血清に比べヘパリンを加えた血漿では低く、希釈したサンプルは、希釈しないサンプルに比べＥＬＩＳＡアッセイで高い濃度値を示し、タンパク質ＭＭＰ阻害因子またはマトリックス成分の阻害効果の減少によるものと考えられる(Lein, M. et al., Clin. Biochem. 30:491-496, 1997)。血清ＭＭＰ−１は、ＡＭＩに続く最初の４日間で減少し、その後増加し、ＡＭＩ発症の２週間後に最大濃度に達した(George, D.K. et al., Gut 42:715-720, 1998)。
【００８０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）は、ゼラチナーゼＡとも呼ばれ、不活性な７２ｋＤａの前駆体として合成される、６６ｋＤａの亜鉛およびカルシウム結合プロテイナーゼである。成熟ＭＭＰ−２は、Ｉ型ゼラチン並びにＩＶ、Ｖ、ＶＩＩおよびＸ型コラーゲンを切断する。ＭＭＰ−２は、血管平滑筋細胞、マスト細胞、マクロファージ由来泡沫細胞、Ｔリンパ球、および内皮細胞等の種々の細胞により合成される(Johnson, J.L. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1707-1715, 1998)。ＭＭＰ−２は、血漿中で通常その生理学的調整因子であるＴＩＭＰ−２との複合体として見出される(Murawaki, Y. et al., J. Hepatol. 30:1090-1098, 1999)。ＭＭＰ−２の正常血漿濃度は、＜〜５５０ｎｇ／ｍｌ（８ｎＭ）である。ＭＭＰ−２の発現は、アテローム硬化症の病巣の血管平滑筋細胞で上昇し、これはプラークが不安定の場合に血流に放出されうる(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。さらに、ＭＭＰ−２は、プラークの不安定性および破裂に寄与するものとして関係する(Shah, P.K. et al., Circulation 92:1565-1569, 1995)。血清ＭＭＰ−２濃度は、安定狭心症、不安定狭心症、およびＡＭＩの患者で上昇し、不安定狭心症およびＡＭＩでは、安定狭心症に比べその上昇は有意に高かった(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。トレッドミル運動試験後の安定狭心症の個体における血清ＭＭＰ−２濃度の変化はなかった(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。血清および血漿ＭＭＰ−２は、胃癌、幹細胞癌、肝硬変、尿路上皮癌、リューマチ様関節炎、および肺癌の患者で上昇する(Murawaki, Y. et al., J. Hepatol. 30:1090-1098, 1999; Endo, K. et al., Anticancer Res. 17:2253-2258, 1997; Gohji, K. et al., Cancer 78:2379-2387, 1996; Gruber, B.L. et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 78:161-171, 1996; Garbisa, S. et al., Cancer Res. 52:4548-4549, 1992)。さらに、ＭＭＰ−２は、血小板凝集の間に血小板細胞質ゾルから細胞外空間にも転移しうる(Sawicki, G. et al., Thromb. Haemost. 80:836-839, 1998)。ＭＭＰ−２は、不安定狭心症およびＡＭＩの個体の血清で入院時に上昇し、最大濃度は１．５μｇ／ｍｌ（２５ｎＭ）に近づいた(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。血清ＭＭＰ−２濃度は、不安定狭心症およびＡＭＩの双方において発症の１〜３日後に最大となり、１週間後に正常に戻り始めた(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。
【００８１】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）は、ストメリシン−１とも呼ばれ、不活性な６０ｋＤａの前駆体として合成される４５ｋＤａの亜鉛およびカルシウム結合プロテイナーゼである。成熟ＭＭＰ−３は、プロテオグリカン、フィブリネクチン、ラミニン、およびＩＶ型コラーゲンを切断するが、Ｉ型コラーゲンを切断しない。ＭＭＰ−３は、平滑筋細胞、マスト細胞、マクロファージ由来泡沫細胞、Ｔリンパ球、および内皮細胞等の種々の細胞により合成される(Johnson, J.L. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1707-1715, 1998)。ＭＭＰ−３は、他のＭＭＰと同様に、細胞外マトリックスの再構築に関係しており、これは傷害に続いて、または血管間細胞移動の間に起こりうる。ＭＭＰ−３は、血漿中で通常＜１２５ｎｇ／ｍｌの濃度で見出される。血清ＭＭＰ−３濃度も年齢とともに増加することが示され、男性における濃度は、女性よりも約２倍高い(Manicourt, D.H. et al., Arthritis Rheum. 37:1774-1783, 1994)。ＡＣＳに関係したＭＭＰ−３の血清または血漿濃度変化についての結論的な公表された研究はない。しかし、ＭＭＰ−３は、アテローム硬化症プラークの肩領域で見出され、これは最も破裂しやすい領域であり、アテローム硬化症プラークの不安定化に関係しうる(Johnson, J.L. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18:1707-1715, 1998)。従って、ＭＭＰ−３濃度は、不安定狭心症のアテローム硬化症のプラーク破裂の結果として上昇しうる。血清ＭＭＰ−３は、マスト細胞の脱顆粒を誘導する炎症状態で上昇しうる。血清ＭＭＰ−３濃度は、関節炎および全身性エリテマトーデスの患者で上昇する(Zucker, S. et al. J. Rheumatol. 26:78-80, 1999; Keyszer, G. et al., Z Rheumatol. 57:392-398, 1998; Keyszer, G. et al. J. Rheumatol. 26:251-258, 1999)。血清ＭＭＰ−３は、前立腺および尿路上皮の癌並びに糸球体腎炎の患者でも上昇する(Lein, M. et al., Urologe A 37:377-381, 1998; Gohji, K. et al., Cancer 78:2379-2387, 1996; Akiyama, K. et al., Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 95:115-128, 1997)。ＭＭＰ−３の血清濃度は、他の型の癌の患者でも上昇しうる。血清ＭＭＰ−３は、ヘモクロマトーシスの患者で減少する(George, D.K. et al., Gut 42:715-720, 1998)。
【００８２】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）は、ゼラチナーゼＢとも呼ばれ、不活性な９２ｋＤａの前駆体として合成される８４ｋＤａの亜鉛およびカルシウム結合プロテイナーゼである。成熟ＭＭＰ−９は、ＩおよびＶ型ゼラチン、並びにＩＶおよびＶ型コラーゲンを切断する。ＭＭＰ−９は、モノマー、ホモダイマー、および２５ｋＤａのα２−ミクログロブリン−関連タンパク質とのヘテロダイマーとして存在する(Triebel, S. et al., FEBS Lett. 314:386-388, 1992)。ＭＭＰ−９は、種々の細胞型により、最も顕著には好中球により合成される。ＭＭＰ−９の正常血漿濃度は、＜３５ｎｇ／ｍｌ（４００ｐＭ）である。ＭＭＰ−９の発現は、アテローム硬化症病巣の血管平滑筋細胞で上昇し、これはプラークが不安定の場合に血流に放出されうる(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。さらに、ＭＭＰ−９は、ＡＣＳの発生に病原の役割を有しうる(Brown, D.L. et al., Circulation 91:2125-2131, 1995)。血漿ＭＭＰ−９濃度は、不安定狭心症およびＡＭＩの患者で有意に上昇するが、安定狭心症では上昇しない(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。ＡＭＩの患者での上昇は、これらの個体が不安定狭心症を患っていたことも示しうる。ＭＭＰ−９の血漿濃度の上昇は、不安定狭心症がＡＭＩに比べ大きいであろうが、これらの違いは統計的に有意ではないであろう。安定狭心症の患者のトレッドミル運動試験後の血漿ＭＭＰ−９濃度の有意な変化はなかった(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。血漿ＭＭＰ−９は、リューマチ性関節炎、敗血症性ショック、巨細胞性動脈炎および種々の癌腫の個体で上昇する(Gruber, B.L. et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 78:161-171, 1996; Nakamura, T. et al., Am. J. Med. Sci. 316:355-360, 1998; Blankaert, D. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 18:203-209, 1998; Endo, K. et al.. Anticancer Res. 17:2253-2258, 1997; Hayasaka, A. et al., Hepatology 24:1058-1062, 1996; Moore, D.H. et al., Gynecol. Oncol. 65:78-82, 1997; Sorbi, D. et al., Arthritis Rheum. 39:1747-1753, 1996; Iizasa, T. et al., Clin., Cancer Res.. 5:149-153, 1999)。さらに、血漿ＭＭＰ−９濃度は、脳卒中および脳出血で上昇しうる(Mun-Bryce, S. and Rosenberg, G.A., J. Cereb. Blood Flow Metab. 18:1163-1172, 1998; Romanic, A.M. et al., Stroke 29:1020-1030, 1998; Rosenberg, G.A., J. Neurotrauma 12:833-842, 1995)。ＭＭＰ−９は、不安定狭心症およびＡＭＩの個体の血清で入院時に上昇し、最大濃度は１５０ｎｇ／ｍｌ（１．７ｎＭ）に近づいた(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。血清ＭＭＰ−９濃度は、不安定狭心症の患者の入院時に最高であり、その濃度は処置後徐々に減少し、発症の１週間以上後にベースラインに近づいた(Kai, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:368-372, 1998)。
【００８３】
（ｉｖ）心筋傷害の他の非特異的マーカー
炎症性反応の活性化は、ＡＣＳの初期段階で明白であろう。この点において、炎症および急性期反応物の非特異的マーカーの循環系濃度の測定は、ＡＣＳの個体および発生するＡＣＳの危険性を有する個体を同定するために用いられるであろう。炎症および急性期反応物に関係するこのようなマーカーの例には、Ｃ−反応性タンパク質、インターロイキン−１β、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−６、単球走化性タンパク質−１、溶解性細胞間接着分子−１、溶解性血管細胞接着分子−１、腫瘍壊死因子α、キャスパーゼ−３およびヘモグロビンα2がある。
【００８４】
Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、宿主の防御に関連する２１ｋＤａのサブユニットを有するホモ５量体のＣａ2+結合急性期タンパク質である。ＣＲＰは、微生物の膜の一般的な構成成分であるホスホリルコリンに選択的に結合する。ホスホリルコリンは、動物細胞膜でも見出されるが、ＣＲＰと反応しうる形態では存在しない。ＣＲＰのホスホリルコリンとの相互作用は、補体カスケードを活性化するのと同様に、細菌の凝集反応およびオプソニン作用を促進し、これらすべては細菌のクリアランスに関連する。さらに、ＣＲＰは、ＤＮＡおよびヒストンと相互作用でき、これはＣＲＰが損傷細胞から循環系に放出された核物質のスカベンジャーであることを示す(Robey, F.A. et al., J. Biol. Chem. 259:7311-7316, 1984)。ＣＲＰ合成はＩＬ−６により誘導され、ＩＬ−１が肝臓洞様血管のクップファー細胞によるＩＬ−６の合成の引き金となりうるため、ＩＬ−１により間接的に誘導される。ＣＲＰの正常血漿濃度は、健康な集団の９０％では＜３μｇ／ｍｌ（３０ｎＭ）であり、健康な個体の９９％では＜１０μｇ／ｍｌ（１００ｎＭ）である。血漿ＣＲＰ濃度は、比濁法またはＥＬＩＳＡにより測定できる。ＣＲＰの血漿濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者で有意に上昇するが、安定狭心症では上昇しない(Biasucci, L.M. et al., Circulation 94:874-877, 1996; Biasucci, L.M. et al., Am. J. Cardiol. 77:85-87, 1996; Benamer, H. et al., Am. J. Cardiol. 82:845-850, 1998; Caligiuri, G. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:1295-1304, 1998; Curzen, N.P. et al., Heart 80:23-27, 1998; Dangas, G. et al., Am. J. Cardiol. 83:583-5, A7, 1999)。ＣＲＰは、変異体（ｖａｒｉａｎｔ）または消散型（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ）の不安定狭心症の個体の血漿でも上昇するが、相反した結果が報告されている(Benamer, H. et al., Am. J. Cardiol. 82:845-850, 1998; Caligiuri, G. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 32:1295-1304, 1998)。ＣＲＰは、ＡＭＩまたは不安定狭心症の患者の結果を予測するためには有用ではないであろう(Curzen, N.P. et al., Heart 80:23-27, 1998; Rebuzzi, A.G. et al., Am. J. Cardiol. 82:715-719, 1998; Oltrona, L. et al., Am. J. Cardiol. 80:1002-1006, 1997)。ＣＲＰの濃度は、感染、手術、外傷、および脳卒中のような急性期反応を顕在化させうるいずれの状態の個体でも、血漿において上昇するであろう。ＣＲＰは、合成直後に血流に放出される分泌性タンパク質である。ＣＲＰ合成は、ＩＬ−６により調整され、血漿ＣＲＰ濃度は、刺激の６時間以内に有意に上昇する(Biasucci, L.M. et al., Am. J. Cardiol. 77:85-87, 1996)。血漿ＣＲＰ濃度は、刺激後約５０時間で最大となり、血流において約１９時間の半減期で減少し始める(Biasucci, L.M. et al., Am. J. Cardiol. 77:85-87, 1996)。他の研究により、不安定狭心症の個体の血漿ＣＲＰ濃度が確認された(Biasucci, L.M. et al., Circulation 94:874-877, 1996)。ＣＲＰの血漿濃度は、ＡＣＳの個体で１００μｇ／ｍｌ（１μＭ）に近づく(Biasucci, L.M. et al., Circulation 94:874-877, 1996; Liuzzo, G. et al., Circulation 94:2373-2380, 1996)。ＣＲＰは、急性期反応の特異的マーカーである。ＣＲＰの上昇は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の個体の血漿で同定され、アテローム硬化症のプラーク破裂または心臓組織傷害と関係した急性期反応の活性化の結果として最もあり得ることである。ＣＲＰは、ＡＣＳに極めて非特異的なマーカーであり、血漿におけるＣＲＰ濃度の上昇は、免疫系の活性化を伴う状態に関連せずに起こるであろう。ＡＣＳに対する非特異性のその高い度合いにもかかわらず、心臓組織傷害に特異的な他のマーカーとともに使用された場合に、ＣＲＰは不安定狭心症およびＡＭＩの同定に有用であろう。血漿は、高濃度のＣＲＰを有し、報告された健康な個体の血液中のＣＲＰ濃度には、高い変動性がある。明らかに健康な個体の血漿のＣＲＰ濃度の上限を決定するためには、競合イムノアッセイが最も可能性が高いが、様々な血漿サンプルについての単一のアッセイを用いたさらなる研究が必要である。
【００８５】
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、急性期反応に関連する１７ｋＤａの分泌性前炎症性サイトカインであり、多くの疾患の病原性媒介物である。ＩＬ−１βは、通常マクロファージおよび上皮細胞により産生される。ＩＬ−１βは、アポトーシスが進行中の細胞からも放出される。ＩＬ−１βの正常血清濃度は、＜３０ｐｇ／ｍｌ（１．８ｐＭ）である。ＡＣＳの個体のＩＬ−１βの血漿濃度の潜在的上昇についての結論的な研究はなく、おそらくアッセイの感度限界またはＡＣＳ発症直後の血流からのＩＬ−１βのクリアランスによるものであろう。ＩＬ−１βは急性期反応の早期の関係物であるので、理論的には、ＩＬ−１βは不安定狭心症およびＡＭＩにおけるＣＲＰのような他の急性期反応タンパク質に比べ早期に上昇するであろう。さらに、ＩＬ−１βは、アポトーシスが進行中の細胞から放出され、これは虚血の早期の段階で活性化されうる。この点において、ＡＣＳに関係した血漿ＩＬ−１β濃度の上昇については、高感度のアッセイを用いたさらなる研究が必要である。血漿ＩＬ−１β濃度の上昇は、外傷および感染のような前炎症性状態における急性期反応の活性化に関係する。ＩＬ−１βは、４時間に続く５分間の２相生理学的半減期を有する(Kudo, S. et al., Cancer Res. 50:5751-5755, 1990)。ＩＬ−１βは、炎症性反応またはアポトーシスの活性化により細胞外環境に放出される。ＡＭＩおよび不安定狭心症エピソード後のわずかな短い時間だけＩＬ−１βが上昇する可能性があり、入院時のＡＣＳの患者から採取されたほとんどの血液サンプルが、発作に続くＩＬ−１β上昇の時期の範囲外となる。
【００８６】
インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、肝細胞、上皮細胞、単球、マクロファージ、および好中級において優勢的に発現する１７ｋＤａのＩＬ−１ファミリーの構成員である。ＩＬ−１ｒａは、選択的スプラシングを通じて産生される細胞内および細胞外形態の両方を有する。ＩＬ−１ｒａは、生理的ＩＬ−１活性の調整に関係すると考えられている。ＩＬ−１ｒａは、ＩＬ−１様の生理的活性を有していないが、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの結合を遮蔽してそれらの生化学的活性を阻害して、ＩＬ−１βと同様の親和性によりＴ細胞および繊維芽細胞のＩＬ−１レセプターに結合することができる(Stockman, B.J. et al., Biochemistry 31:5237-5245, 1992; Eisenberg, S.P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:5232-5236, 1991; Carter, D.B. et al., Nature 344:633-638, 1990)。ＩＬ−１ｒａは、通常血漿中でＩＬ−１に比べ高濃度で存在し、ＩＬ−１ｒａ濃度がＩＬ−１に比べて疾患の重篤度とより相関していることが示された(Biasucci, L.M. et al., Circulation 99:2079-2084, 1999)。さらに、ＩＬ−１ｒａが急性期タンパク質であるという証拠がある(Gabay, C. et al., J. Clin. Invest. 99:2930-2940, 1997)。ＩＬ−１ｒａの正常血漿濃度は、＜２００ｐｇ／ｍｌ（１２ｐＭ）である。ＩＬ−１ｒａの血漿濃度は、ＡＭＩおよびＡＭＩ、死亡、または難治性狭心症に進行する不安定狭心症の患者で上昇する(Biasucci, L.M. et al., Circulation 99:2079-2084, 1999; Latini, R. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 23:1-6, 1994)。さらに、ＩＬ−１ｒａは、合併症を伴わないＡＭＩと比較して重篤なＡＭＩで有意に上昇する(Latini, R. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 23:1-6, 1994)。これは、ＩＬ−１ｒａが不安定狭心症およびＡＭＩにおいてＡＣＳの重篤度の有用なマーカーであり得ることを示す。ＩＬ−１ｒａの血漿濃度の上昇は、感染、外傷、および関節炎等の炎症性または急性期反応の活性化を伴ういずれの状態にも関係する。ＩＬ−１ｒａは、前炎症性状態の血流に放出され、急性期反応の関連物としても放出されうる。血流からのＩＬ−１ｒａのクリアランスの主要な起点は、腎臓および肝臓であると思われる(Kim, D.C. et al., J. Pharm. Sci. 84:575-580, 1995)。ＩＬ−１ｒａ濃度は、不安定狭心症の個体の血漿で発症の２４時間以内に上昇し、これらの上昇は発症の２時間以内でさえも明白であろう(Biasucci, L.M. et al., Circulation 99:2079-2084, 1999)。不安定狭心症が重度に進行した患者では、ＩＬ−１ｒａの血漿濃度は、入院時の濃度に比べ発症の４８時間後の方が高いが、一方平穏に進行した患者では、その濃度が減少した(Biasucci, L.M. et al., Circulation 99:2079-2084, 1999)。さらに、不安定狭心症に関係したＩＬ−１ｒａの血漿濃度は、１．４ｎｇ／ｍｌ（８０ｐＭ）に近づきうる。ＩＬ−１ｒａは、ＡＣＳの重篤度の有用なマーカーであろう。これはＡＣＳの特異的マーカーではないが、ＩＬ−１ｒａの血漿濃度の変化は、疾患の重篤度に関連していると思われる。さらに、これは、前炎症性状態においてＩＬ−１の放出と連動してまたはその直後に放出されやすく、ＩＬ−１に比べ高い濃度で見出される。これは、ＩＬ−１ｒａがＩＬ−１活性の有用な間接的なマーカーであり得ることを示し、ＩＬ−１はＩＬ−６の産生を顕在化させるものである。従って、ＩＬ−１ｒａは、不安定狭心症およびＡＭＩの重篤度を等級付けするのみならず、ＩＬ−６濃度が有意に上昇する前に、急性期反応の早期の段階を同定するのに有用であろう。
【００８７】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、ヘマトポエチンファミリーの前炎症性サイトカインである２０ｋＤａの分泌性タンパク質である。ＩＬ−６は、急性期の反応物であり、接着分子等の種々のタンパク質の合成を刺激する。その主要な機能は、肝臓タンパク質の急性期産生を媒介することであり、その合成はサイトカインＩＬ−１により誘導される。ＩＬ−６は、通常マクロファージおよびＴリンパ球により産生される。ＩＬ−６の正常血清濃度は、＜３ｐｇ／ｍｌ（０．１５ｐＭ）である。ＩＬ−６の血漿濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者で上昇し、ＡＭＩにおいて大きい度合いである(Biasucci, L.M. et al., Circulation 94:874-877, 1996; Manten, A. et al., Cardiovasc. Res. 40:389-395, 1998; Biasucci, L.M. etal., Circulation 99:2079-2084, 1999)。ＩＬ−６は、安定狭心症の患者の血漿では有意には上昇しない(Biasucci, L.M. et al., Circulation 94:874-877, 1996; Manten, A. et al., Cardiovasc. Res. 40:389-395, 1998)。さらに、ＩＬ−６濃度は、重篤な進行の不安定狭心症患者の血漿では、発症の４８時間以降に増加するが、平穏の進行のものでは減少する(Biasucci, L.M. et al., Circulation 99:2079-2084, 1999)。これは、ＩＬ−６が疾患の進行の有用な指標となりうることを示している。ＩＬ−６の血漿上昇は、外傷、感染、または急性期反応を顕在化させる他の疾患のようないずれの非特異的前炎症性状態にも関係する。ＩＬ−６は、血流中で４．２時間の半減期を有し、ＡＭＩおよび不安定狭心症に続いて上昇する(Manten, A. et al., Cardiovasc. Res. 40:389-395, 1998)。ＩＬ−６の血漿濃度は、ＡＭＩ発症の８〜１２時間以内に上昇し、１００ｐｇ／ｍｌに近づきうる。不安定狭心症の患者のＩＬ−６の血漿濃度は、発症の７２時間後に最大濃度に上昇し、おそらく発作の重篤度によるものである(Biasucci, L.M. et al., Circulation 94:874-877, 1996)。ＩＬ−６は、ＡＣＳに関係した炎症の高感度のマーカーと思われる。しかし、これはＡＣＳに特異的ではなく、ＡＣＳの危険因子と見なされる種々の状態で上昇しうる。しかし、ＩＬ−６は、ＡＭＩまたは不安定狭心症の重篤度を同定するのに有用であり、医師が疾患の進行についてこれらの患者を詳しくモニターすることを可能にしうる。さらに、ＩＬ−６は、不安定狭心症およびＡＭＩを安定狭心症から識別するのに有用であろう。
【００８８】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、急性期反応に関連した１７ｋＤａの分泌性前炎症性サイトカインであり、多くの疾患の病原性の媒介物である。ＴＮＦαは、通常マクロファージおよびナチュラルキラー細胞により産生される。ＴＮＦαの正常血清濃度は、４０ｐｇ／ｍｌ（２ｐＭ）である。ＴＮＦαの血漿濃度は、ＡＭＩの患者で上昇し、不安定狭心症の患者でわずかに上昇する(Li, D. et al., Am. Heart J. 137:1145-1152, 1999; Squadrito, F. et al., Inflamm. Res. 45:1419, 1996; Latini, R. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 23:1-6, 1994; Carlstedt, F. et al., J. Intern. Med. 242:361-365, 1997)。ＴＮＦαの血漿濃度の上昇は、外傷、脳卒中、および感染等のいずれの前炎症性状態にも関係する。ＴＮＦαは、血流中で約１時間の半減期を有し、症状の発症直後に循環系から除去されうることを示す。ＡＭＩの患者では、ＴＮＦαは、胸部痛の後４時間で上昇し、発症の４８時間以内に正常濃度に徐々に減少する(Li, D. et al., Am. Heart J. 137:1145-1152, 1999)。ＡＭＩ患者の血漿中のＴＮＦαの濃度は、３００ｐｇ／ｍｌ（１５ｐＭ）を超えた(Squadrito, F. et al., Inflamm. Res. 45:14-19, 1996)。
【００８９】
溶解性細胞間接着分子（ｓＩＣＡＭ−１）は、ＣＤ５４とも呼ばれ、白血球のリクルートメントおよび移動の間の白血球の抗原存在細胞および内皮細胞への結合を促進する、８５〜１１０ｋＤａの細胞表面結合免疫グロブリン様インテグリンリガンドである。ｓＩＣＡＭ−１は、血管内皮、造血幹細胞および、非造血幹細胞により通常産生され、これは腸および表皮で見出されるものである。ｓＩＣＡＭ−１は、細胞死の間またはタンパク質分解活性の結果として細胞表面から放出されうる。ｓＩＣＡＭ−１の正常血漿濃度は、約２５０ｎｇ／ｍｌ（２．９ｎＭ）である。ｓＩＣＡＭ−１の血漿濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の患者で有意に上昇するが、安定狭心症では上昇しない(Pellegatta, F. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 30:455-460, 1997; Miwa, K. et al., Cardiovasc. Res. 36:37-44, 1997; Ghaisas, N.K. et al., Am. J. Cardiol. 80:617-619, 1997; Ogawa, H. et al., Am. J. Cardiol. 83:38-42, 1999)。さらに、ＩＣＡＭ−１は、アテローム硬化症の病巣および病巣の形成を受けやすい範囲で発現し、このためこれはプラーク破裂により血流に放出されうる(Iiyama, K. et al., Circ. Res. 85:199-207, 1999; Tenaglia, A.N. et al., Am. J. Cardiol. 79:742-747, 1997)。ｓＩＣＡＭ−１の血漿濃度の上昇は、虚血性脳卒中、頭部の外傷、アテローム硬化症、癌、子癇前症、多発性硬化症、嚢胞性線維症、および他の非特異的炎症性状態に関係する(Kim, J.S., J. Neurol. Sci. 137:69-78, 1996; Laskowitz, D.T. et al., J. Stroke Cerebrovasc. Dis. 7:234-241, 1998)。ｓＩＣＡＭ−１の血漿濃度は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の急性段階の間で上昇する。血漿ｓＩＣＡＭ−１の上昇は、ＡＭＩ発症の９〜１２時間以内にその最大に達し、２４時間以内に正常濃度に戻る(Pellegatta, F. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 30:455-460, 1997)。ｓＩＣＡＭの血漿濃度は、ＡＭＩの患者で７００ｎｇ／ｍｌ（８ｎＭ）に近づく(Pellegatta, F. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 30:455-460, 1997)。ｓＩＣＡＭ−１は、ＡＭＩおよび不安定狭心症の個体の血漿で上昇するが、これらの疾患に特異的ではない。しかし、血漿上昇が安定狭心症に関係しないため、これは安定狭心症からのＡＭＩおよび不安定狭心症の識別に有用なマーカーであろう。興味深いことに、ＩＣＡＭ−１は、アテローム硬化症プラーク中に存在し、プラーク破裂により血流に放出されうる。従って、ｓＩＣＡＭは、炎症のみならず、ＡＣＳに関係したプラーク破裂のマーカーとしても有用であろう。
【００９０】
血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）は、ＣＤ１０６とも呼ばれ、リンパ球のリクルートメントの間のＢリンパ球および発生中のＴリンパ球の抗原存在細胞への結合を促進する、１００〜１１０ｋＤａの細胞表面結合免疫グロブリン様インテグリンリガンドである。ＶＣＡＭは、通常内皮細胞により産生され、これは血管およびリンパ管、心臓、並びに他の体腔の内側を覆うものである。ＶＣＡＭ−１は、細胞死の間またはタンパク質分解活性の結果として細胞表面から放出されうる。ｓＶＡＣＭの正常血清濃度は、約６５０ｎｇ／ｍｌ（６．５ｎＭ）である。ｓＶＣＡＭ−１の血漿濃度は、ＡＭＩ、不安定狭心症、および安定狭心症の患者でわずかに上昇する(Mulvihill, N. et al., Am. J. Cardiol. 83:1265-7, A9, 1999; Ghaisas, N.K. et al., Am. J. Cardiol. 80:617619, 1997)。しかし、ｓＶＣＡＭ−１は、アテローム硬化症の病巣で発現し、その血漿濃度は、アテローム硬化症の範囲に関連づけられる(Iiyama, K. et al., Circ. Res. 85:199-207, 1999; Peter, K. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:505-512, 1997)。ｓＶＣＡＭ−１の血漿濃度の上昇は、虚血性脳卒中、癌、糖尿病、子癇前症、血管傷害、および他の非特異的炎症性状態に関係する(Bitsch, A. et al., Stroke 29:2129-2135, 1998; Otsuki, M. et al., Diabetes 46:20962101, 1997; Banks, R.E. et al., Br. J. Cancer 68:122-124, 1993; Steiner, M. et al., Thromb. Haemost. 72:979-984, 1994; Austgulen, R. et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 71:53-58, 1997)。
【００９１】
単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、単球および好塩基球を引き寄せるが、好中級および好酸球を引き寄せない１０ｋＤａの走化性因子である。ＭＣＰ−１は、通常モノマーおよびホモダイマーの形態の間で平衡して見出され、通常単球および血管内皮細胞中で産生され、かつ分泌される(Yoshimura, T. et al., FEBS Lett. 244:487-493, 1989; Li, Y.S. et al., Mol. Cell. Biochem. 126:61-68, 1993)。ＭＣＰ−１は、乾癬、リューマチ性関節炎、およびアテローム硬化症等の単球浸潤を伴う種々の疾患の病原と関係する。血漿中のＭＣＰ−１の正常濃度は、＜０．１ｎｇ／ｍｌである。ＭＣＰ−１の血漿濃度は、ＡＭＩ患者で上昇し、不安定狭心症の患者の血漿ではおそらく上昇するが、安定狭心症に関係しては上昇しない(Soejima, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 34:983-988, 1999; Nishiyama, K. et al., Jpn. Circ. J. 62:710-712, 1998; Matsumori, A. et al., J. Mol. Cell. Cardiol. 29:419-423, 1997)。興味深いことに、ＭＣＰ−１は、アテローム硬化症の間で動脈血管壁への単球のリクルートメントにも関係しうる。ＭＣＰ−１の血清濃度の上昇は、アルコール性肝臓疾患、間隙性肺疾患、敗血症、および全身性エリテマトーデス等の炎症に関係する種々の状態に関係する(Fisher, N.C. et al., Gut 45:416-420, 1999; Suga, M. et al., Eur. Respir. J. 14:376-382, 1999; Bossink, A.W. et al., Blood 86:3841-3847, 1995; Kaneko, H. et al. J. Rheumatol. 26:568-573, 1999)。ＭＣＰ−１は、単球および内皮細胞の活性化により血流中に放出される。ＡＭＩの患者からの血漿中のＭＣＰ−１の濃度は、１ｎｇ／ｍｌ（１００ｐＭ）に近づくことが報告され、１ヶ月間上昇したまま維持されうる(Soejima, H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 34:983-988, 1999)。ＡＣＳとの関連でＭＣＰ−１の血流への放出および血流からのクリアランスの動態は、現在不明である。ＭＣＰ−１は、単球の移動を伴う前炎症性状態の存在の特異的マーカーである。ＭＣＰ−１は、ＡＣＳに特異的ではないが、伝えるところによればその濃度がＡＭＩの患者の血漿中で上昇する。さらに、ＭＣＰ−１濃度は、不安定狭心症または安定狭心症の患者の血漿では上昇せず、これはＭＣＰ−１がＡＭＩを不安定および安定狭心症から区別するのに有用であろうことを示す。
【００９２】
キャスパーゼ−３は、ＣＰＰ−３２、ＹＡＭＡ、およびアポパインとも呼ばれ、細胞アポトーシスの間で活性化されるインターロイキン−１β転換酵素（ＩＣＥ）様細胞内システインプロテイナーゼである。キャスパーゼ−３は、アポトーシス誘導の間にタンパク質分解により２０ｋＤａと１１ｋＤａのサブユニットのヘテロダイマーに活性化される、不活性の３２ｋＤａの前駆体として存在する(Fernandes-Alnemri, T. et al., J. Biol. Chem. 269:30761-30764, 1994)。その細胞基質には、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）およびステロール調整因子結合タンパク質（ＳＲＥＢＰｓ）が含まれる(Liu, X. et al., J. Biol. Chem. 271:13371-13376, 1996)。キャスパーゼ−３の正常血漿濃度は、不明である。ＡＣＳに関係したキャスパーゼ−３の血漿濃度の変化に関する公表された研究はない。虚血および低酸素症に関係した心臓筋細胞のアポトーシス誘導の仮説を支持する増加する量の証拠がある(Saraste, A., Herz 24:189-195, 1999; Ohtsuka, T. et al., Coron. Artery Dis. 10:221-225, 1999; James, T.N., Coron. Artery Dis. 9:291-307, 1998; Bialik, S. et al., J. Clin. Invest. 100:1363-1372, 1997; Long, X. et al., J. Clin. Invest. 99:2635-2643, 1997)。血漿キャスパーゼ−３濃度の上昇は、アポトーシスを伴ういずれの生理的事象にも関係しうる。アポトーシスが、運動の間およびその後の骨格筋中で、および大脳虚血で誘導されることを示唆する証拠がある(Carraro, U. and Franceschi, C., Aging (Milano) 9:19-34, 1997; MacManus, J.P. et al., J. Cereb. Blood Flow Metab. 19:502-510, 1999)。ＡＭＩの患者の末梢血液中でのキャスパーゼ−３の発見に関する公表された報告がないので、心臓細胞死のマーカーとしてのキャスパーゼ−３の有用性は、現在不明である。興味深いことに、虚血誘導アポトーシスは、それを他の形態のアポトーシスから識別する特徴を有しうるが、キャスパーゼ−３の誘導は、すべてのアポトーシス経路に共通である。これらのマーカーのすべてが血漿の膜の完全性の損失に続いて放出されるので、キャスパーゼ−３は心臓細胞死の他の細胞質ゾルのマーカーより有用であるとは証明されないであろう。アポトーシスを受けている細胞が、壊死の特徴である、膜の完全性を失うということがないことを示唆する証拠もあるが、むしろ、これらは最終的にはマクロファージおよび他の近接細胞により摂取される完全な膜を有するアポトーシス体を形成する(Saraste, A., Herz 24:189-195, 1999; James, T.N., Coron. Artery Dis. 9:291-307, 1998)。この点において、細胞内容物の放出は、壊死の結果であり、キャスパーゼ−３は、特にアポトーシスの結果としての、心臓細胞死の同定に適したマーカーではないであろう。
【００９３】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、赤血球に見出される酸素運搬鉄含有球状タンパク質である。これは、２つのグロブリンユニットのヘテロダイマーである。α2γ2は胎児Ｈｂと呼ばれ、α2β2は成人ＨｂＡと呼ばれ、そしてα2δ2は成人ＨｂＡ2と呼ばれる。ヘモグロビンの９０〜９５％はＨｂＡであり、α2グロブリン鎖はすべてのＨｂ型で、鎌状赤血球ヘモグロビンでも、見出される。Ｈｂは、身体全体にわたり細胞に酸素を運搬する責任を有する。Ｈｂα2は、通常は血清中では検出されない。ＡＣＳパネルでのＨｂα2の有用性は、溶血の範囲を決定すること、および赤血球起源タンパク質の、測定された血清濃度への寄与をもたらすことにあろう。溶血の許容濃度は、赤血球に存在する血清マーカーの測定で確立されるべきものである。
【００９４】
ヒトリポカリン型プロスタグランジンＤシンターゼ（ｈＰＤＧＳ）は、β−トレースとも呼ばれ、プロスタグランジンＨからのプロスタグランジンＤ２の形成を触媒する３０ｋＤａの糖タンパク質である。明らかに健康な個体のｈＰＤＧＳ濃度の上限は、約４２０ｎｇ／ｍｌであると報告されている（欧州特許公開番号ＥＰ０９９９４４７Ａ１）。ｈＰＤＧＳの上昇は、不安定狭心症および脳梗塞の患者からの血液中で同定された（欧州特許公開番号ＥＰ０９９９４４７Ａ１）。さらに、ｈＰＤＧＳは、虚血性エピソードの有用なマーカーと思われ、ｈＰＤＧＳの濃度は、経皮的経管的冠状動脈形成（ＰＴＣＡ）の後の狭心症の患者において経時的に減少することが見出され、虚血としてのｈＰＤＧＳ濃度減少が解決することを示している（欧州特許公開番号ＥＰ０９９９４４７Ａ１）。
【００９５】
好ましい態様として、心筋傷害の１またはそれ以上の特異的マーカーは、ＡＣＳの診断パネルを作成するために、心筋傷害の１またはそれ以上の非特異的マーカーと組み合わせられる。さらに、本発明は、このような複数のマーカーの成分を決定する方法を提供する。このようなパネルが組み立てられると、種々のマーカーそれぞれの存在または濃度が１またはそれ以上の患者サンプルにおいて決定され、そして任意にそれぞれのマーカーの診断濃度とまたは正常濃度と比較される。
【００９６】
アッセイ測定方策
本発明のマーカーの検出および分析のために、非常に多くの方法および装置が当業者によく知られている。患者試験サンプルにおけるポリペプチドまたはタンパク質に関しては、イムノアッセイの装置および方法がしばしば用いられる。例えば、米国特許6,143,576; 6,113,855; 6,019,944; 5,985,579; 5,947,124; 5,939,272; 5,922,615; 5,885,527; 5,851,776; 5,824,799; 5,679,526; 5,525,524;および5,480,792を参照のこと。これらのそれぞれは、すべての表、図面および請求の範囲を含めてその全体を、引用することにより本明細書に取り込まれる。これらの装置および方法は、種々のサンドイッチ、競合、または非競合のアッセイ形態においてラベル化された分子に利用でき、目的とする分析物の存在または量と関連するシグナルを発生する。さらに、バイオセンサーおよびオプティカルイムノアッセイのような、ある特定の方法および装置は、ラベル化された分子を必要とせずに分析物の存在または量を決定するために使用することができる。米国特許5,631,171および 5,955,377を参照のこと。これらのそれぞれは、すべての表、図面および請求の範囲を含めてその全体を、引用することにより本明細書に取り込まれる。
【００９７】
好ましくは、マーカーはイムノアッセイを用いて分析されるが、他の方法も当業者にはよく知られている（例えば、マーカーＲＮＡ濃度の測定）。マーカーの存在または量は、一般的には、各々のマーカーに特異的な抗体を用いて特異的結合を検出することにより決定される。例えば、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、競合結合アッセイ等の、いずれの適当なイムノアッセイも利用しうる。マーカーへの抗体の特異的免疫的結合は、直接的または間接的に検出できる。直接ラベルには、抗体に結合した、蛍光若しくは発光タグ、金属、染料、放射性核種等が含まれる。間接ラベルには、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等のような、この技術分野でよく知られた種々の酵素が含まれる。
【００９８】
マーカーに特異的な固定化抗体の使用も、本発明により企図されたものである。抗体は、磁気またはクロマトグラフィーのマトリックス粒子、（マイクロタイターウェルのような）アッセイ場所の表面、（プラスチック、ナイロン、紙のような）固体基質物質の断片等のような、種々の固体担体上で固定化される。アッセイ片は、抗体や固体担体上に配列した複数の抗体を被覆することにより調製される。この片は、その後試験サンプル中に浸漬され、そして、洗浄および検出工程を通じて即座に処理され、着色した点のような測定可能なシグナルを発生させる。
【００９９】
複数のマーカーの分析は、１つの試験サンプルで別個にまたは同時に実行されうる。いくつかのマーカーは、多数のサンプルの効率的な処理のために１つの試験に併合されうる。さらに、当業者は、同一の個体からの（例えば、経時的な時点での）多数のサンプルを試験することの価値を認識するであろう。一連のサンプルのこのような試験は、経時的なマーカー濃度の変化の同定を可能にするであろう。マーカー濃度の増加または減少は、マーカー濃度の変化の不存在と同様に、これらに限定されないが、事象の発症からのおおよその時間、救出可能な組織の存在および量、投薬治療の適切さ、再灌流や症状の消散により示されるような種々の治療効果、種々の型のＡＣＳの識別、事象の重篤度の同定、疾患の重篤度の同定、および将来の事象の危険性等の患者の結果の同定、を同定することを含む疾患の状態についての有用な情報を提供しうる。
【０１００】
上述したマーカーからなるパネルは、ＡＣＳの診断若しくは予後およびＡＣＳの患者の管理に関連した適切な情報を提供するために構築されうる。このようなパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５または２０の個体のマーカーを用いて構築されうる。単一のマーカー、またはマーカーの多数のパネルを含むマーカーの部分集合の分析は、種々の臨床的環境において臨床的な感度または特異性を最適化することにより当業者により実行されうる。これらには、限定されないが、通院、緊急治療、危機治療、集中治療、監視室、入院患者、外来患者、医院、医療診療所、および健康診断環境が含まれる。さらに、当業者は、前述した環境の各々において臨床的感度および特異性を最適化するために、単一のマーカー、またはマーカーの多数のパネルを含むマーカーの部分集合を、診断閾値の調整と組み合わせて用いることができる。アッセイの臨床的感度は、アッセイが正確に予測する疾患を有するものの割合として定義され、アッセイの特異性は、アッセイが正確に予測する疾患を有しないものの割合により定義される(Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 2nd edition, Carl Burtis and Edward Ashwood eds., W.B. Saunders and Company, p. 496)。
【０１０１】
なお、マーカーの分析は、種々の実際的な形態において実行されうる。例えば、マイクロタイタープレートやオートメーションの使用は、多数の試験サンプルの処理を容易にしうる。あるいは、単一のサンプルの形態は、例えば、通院移動または緊急室の環境において、適時の仕方で即座の処理および診断を促進するために構築される。
【０１０２】
他の態様として、本発明は、マーカーの分析のためのキットを提供する。このようなキットは、好ましくは、少なくとも１つの試験サンプルの分析のための装置および試薬並びにアッセイ実行のための指示書を含む。任意に、キットは、患者の診断または予後のためにマーカー濃度を変換する１またはそれ以上の方法を含みうる。
【０１０３】
【実施例】
実施例１ 血液の採取
血液標本は、訓練した研究職員により採取された。サンプルは、既述のように採取され処理された。de Lemos et al., The prognostic value of B-type natriuretic peptide in patients with acute coronary syndromes（急性冠状動脈症候群の患者のＢ−型ナトリウム排泄増加性ペプチドの予後の価値）、 N Engl J Med 345:1014-21 (2001)を参照のこと。血漿サンプルは、クエン酸抗凝固剤中で採取され、採取から６０分以内に研究現場において−２０℃またはそれより冷たくして凍結された。標本は、ＴＩＭＩ小児病院心臓マーカーコア研究所（ボストン、マサチューセッツ州）にドライアイスを用いて輸送され、そこでは、これらは−７０℃で保存された。ＯＰＵＳ−ＴＩＭＩ１６試験の完了に続き、５０／５０の処置アームからのすべての血漿標本は、バイオサイトインコーポレーテッド（サンディエゴ、カリフォルニア州）にドライアイスを用いて輸送され、そこでアッセイが行われた。
【０１０４】
実施例２ 生化学的分析
マーカーは、標準的なイムノアッセイ技術を用いて測定された。これらの技術には、タンパク質標的に特異的に結合する抗体の使用が含まれた。選択されたマーカーに対して誘導されたモノクローナル抗体は、Ｎ−ヒドロキシサクシニミドビオチン（ＮＨＳ−ビオチン）を用いて、抗体当たり約５のＮＨＳ−ビオチン部分の割合で、ビオチン化された。そして、抗体−ビオチンコンジュゲートは、標準アビジン３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに加えられ、プレートに結合していない抗体コンジュゲートは除去された。これは、マイクロタイタープレートの「抗マーカー」を形成した。同一のマーカーに対して誘導された他のモノクローナル抗体は、サクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）およびＮ−サクシニミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（ＳＰＤＰ）（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）を用いてアルカリホスファターゼにコンジュゲートされた。
【０１０５】
イムノアッセイは、ＴＥＣＡＮジェネシスＲＳＰ ２００／８ワークステーションを用いて行われた。ビオチン化された抗体は、あらかじめアビジンで被覆されたマイクロタイタープレートのウェルにピペットで移され、６０分間インキュベートされた。結合していない抗体を含む溶液は除去され、細胞は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のアジ化ナトリウム、および０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含む２０ｍＭのホウ酸塩（ｐＨ７．４２）からなる洗浄バッファーを用いて洗浄された。血漿サンプル（１０μＬ）は、マイクロタイタープレートのウェルにピペットで移され、６０分間インキュベートされた。そして、サンプルは取り出され、ウェルは洗浄バッファーにより洗浄された。そして、抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートがウェルに加えられ、さらに６０分間インキュベートされ、その後、抗体コンジュゲートは取り除かれ、ウェルは洗浄バッファーにより洗浄された。基質（ＡｔｔｏＰｈｏｓ（登録商標）、プロメガ、マジソン、ウイスコンシン州）がウェルに加えられ、蛍光産物の形成速度は、患者サンプルのマーカーの濃度と関連づけされた。
【０１０６】
ＢＮＰのアッセイは、サイオスインコーポレーテッド (サニーヴェール、カリフォルニア州)から得たネズミ抗ＢＮＰモノクローナル抗体１０６．３を用いて行った。ｍＡｂ１０６．３を分泌するハイブリドーマ細胞系は、ＦＯＸ−ＮＹ細胞と、ＢＳＡにコンジュゲートされたヒトＢＮＰ１−３２により免役されたＢａｌｂ／ｃマウスからの脾臓細胞との融合により発生させた。第２のネズミ抗ＢＮＰ抗体は、バイオサイトインコーポレーテッド（サンディエゴ、カリフォルニア州）により、既述（米国特許番号６，０５７，０９８）のように抗原ファージディスプレイにより、標準技術によりＫＬＨにコンジュゲートしたヒトＢＮＰ抗原（サイオスインコーポレーテッド、サニーヴェール、カリフォルニア州；米国特許番号５，１１４，９２３）を用いて、産生された。ヒトＢＮＰ抗原は、アッセイの標準化のためにも用いた。
【０１０７】
ＭＭＰ−９のアッセイは、バイオサイトインコーポレーテッドにより、既述（米国特許番号６，０５７，０９８）のようにファージディスプレイおよび組み換えタンパク質発現を用いて発生させたネズミ抗ＭＭＰ−９抗体を用いて行った。市販のＭＭＰ−９抗原は、アッセイの標準化のために用いた（カルバイオケム−ノババイオケムコーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）。抗体産生のために用いた免疫原は、バイオサイトインコーポレーテッドにより調製された。ＰＣＲプライマーは、ヒトＭＭＰ−９の５’−末端の配列およびヒトＭＭＰ−９の３’−末端のコード配列に対応して作製した（ジェンバンク取得番号Ｊ０５０７０）。金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによる組み換えタンパク質の精製を補助するために、６つのヒスチジンコドンが、コード配列の終端と終止コドンとの間に挿入された。５’−末端ＭＭＰ−９プライマーは、プライマーＡと表され、以下のヌクレオチド配列からなる；５’−ＡＧＧＴＧＴＣＧＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）。５’プライマーは、その５’−末端において、ＥｃｏＲＩ部位および直ぐ上流の配列に対応するｐＥＡＫ１２ベクター配列（エッジバイオシステムズ、ガイサーバーグ、メリーランド州）の２１塩基対をも含む。３’−末端ＭＭＰ−９プライマーは、プライマーＢと表され、以下のヌクレオチド配列からなる；５’−ＧＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＧＧＣＣＴＴＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＧ ＧＣＡＣＴＧＣＡＧＧＡＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）。３’プライマーは、その５’末端において、ＮｏｔＩ部位の６塩基および直ぐ下流の配列等のベクター配列のさらなる２０塩基対を含む。これらのプライマーの５’−末端におけるベクター配列は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により、ｐＥＡＫ１２ベクターのものに特異的で相補的な一本鎖オーバーハングを形成するであろう。ＭＭＰ−９遺伝子挿入のＰＣＲ増幅は、１００ｐｍｏｌの５’プライマー（Ａ）、１００ｐｍｏｌの３’プライマー（Ｂ）、２．５単位のエクスパンドポリメラーゼ、１０μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ、１０μｌの１０ｘエクスパンド反応バッファー、テンプレートとしての１μｌのクロンテック−クイック−クローンヒト脾臓ｃＤＮＡ（クロンテックラボラトリーズ、パロアルト、カリフォルニア州）、および１００μｌの水を含む、２ｘ１００μｌの反応スケールで行われた。反応は、（米国特許６，０５７，０９８の）実施例１８に記載されたように、パーキン−エルマーサーマルサイクラー中で実行された。ＰＣＲ産物は、沈殿され、アガロースゲル電気泳動により分画され、完全長産物がゲルから切除され、精製され、水中に再懸濁された（米国特許６，０５７，０９８の実施例１７）。ｐＥＡＫ１２ベクターは、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ（ニューイングランドバイオラボ、ビバリー、マサチューセッツ州）を用いた消化による挿入物を受け取るために調製された。挿入物およびＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ消化ｐＥＡＫ１２ベクターは、１．０μｌの１０ｘバッファーＡを１．０μｇのＤＮＡに添加して水により最終容積が９μｌとすることによるＴ４エキソヌクレアーゼ消化のために、調製した。サンプルは、１μｌ（１Ｕ／μｌ）のＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより３０℃で４分間消化された。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、７０℃で１０分間インキュベートすることにより加熱不活性化された。サンプルは冷却され、短時間遠心分離され、新しいマイクロヒュージチューブ中で４５ｎｇの消化挿入物が１００ｎｇの消化されたｐＥＡＫ１２ベクターに添加された。１．０μｌの１０ｘアニーリングバッファーの添加後、容積は、水により１０μｌとされた。混合物は、７０℃で２分間加熱され、２０分以上室温にまで冷却され、挿入物とベクターがアニーリングできるようにした。アニーリングされたＤＮＡは、蒸留水で４倍に希釈され、３０μｌのエレクトロコンポーネントＥ．ｃｏｌｉ株、ＤＨ１０Ｂ（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）中にエレクトロポレーションされた。形質転換された細胞は、２ｘＹＴ培養液により１．０ｍｌに希釈され、アンピシリン（７５μｇ／ｍｌ）を補給されたＬＢ寒天プレートに１０μｌ、１００μｌ、３００μｌを培養し、３７℃で一夜成長させた。コロニーを取り出し、３７℃で２ｘＹＴ（７５μｇ／ｍｌのアンピシリン）中で一夜成長させた。翌日グリセロール凍結保存物を−８０℃での長期保存のために作製した。これらのクローン（ＭＭＰｐｅａｋ１２）の配列は、マコーネルリサーチ（サンディエゴ、カリフォルニア州）で、ジデオキシ鎖終了法により、シークワタームシーケンシングキット（エピセンターテクノロジー、マジソン、ウィスコンシン州）、オリゴヌクレオチドプライマーＣ、５’−ＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、およびＤ、５’−ＣＣＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＣＴＣＴＡＧ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を用い、これらはｐＥＡＫ１２ベクターの挿入物の５’および３’側にそれぞれ結合し、そしてＬＩ−ＣＯＲ４０００Ｌ自動シーケンサー（ＬＩ−ＣＯＲ、リンカーン、ネブラスカ州）を用いて確認した。トランスフェクションに適したプラスミドおよびこれに続くヒトＭＭＰ−９の発現と精製は、製造者の提案に従いエンドフリープラスミドメガキット（キアジェン、ヴァレンシア、カリフォルニア州）を用いて、クローンＭＭＰ９ｐｅａｋ１２．２から調製した。ＨＥＫ２９３（「Ｐｅａｋ」）細胞は、１ｍｌの凍結バイアル保存物（５ｘ１０6細胞／ｍｌ）からＴ−７５フラスコに、５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨバイオサイエンシーズ、レネキサ、カンザス州）、２０単位／ｍｌのヘパリン、０．１％のプルロニックＦ−６８（ＪＲＨバイオサイエンシーズ、レネキサ、カンザス州）、および５０μｌ／ｍｌのゲンタマイシン（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）を含むＩＳ２９３培地（アーバインサイエンティフィック、サンタアナ、カリフォルニア州）中で拡張された。３７℃、湿度８５％、５％ＣＯ2で２〜３日間インキュベートした後、ＦＢＳを培地中２％に減少させて細胞はＴ−１７５フラスコに拡張された。そして細胞は、２〜３週間にわたって連続的に１：２に拡張され、接着した細胞の均一な単層を確立した。上記の方法により成長したＰｅａｋ細胞は、１０００ｒｐｍで６分間遠心分離され、上清が捨てられた。密度を確立するために細胞を数え、標準染色試験により少なくとも９０％の生存力を確認した後、細胞は、５ｘ１０5細胞／ｍｌで、２％ＦＢＳおよび５０μｌ／ｍｌゲンタミシンマイシを含む４００ｍｌのＩＳ２９３中で再懸濁され、１Ｌのスピナーフラスコに加えた。そして、コニカルチューブに、４００ｍｌスピナーフラスコ当たり５ｍｌのＩＳ２９３および３２０μｇのＭＭＰ−９を加えた。これは、混合され、室温で２分間インキュベートされた。スピナー当たり４００μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＲＯ−１５３９トランスフェクション試薬（ロシュディアグノスティックス、インディアナポリス、インディアナ州）が、チューブに加えられ、そして混合され、室温で２０分間インキュベートされた。混合物は、スピナーフラスコに加えられ、３７℃、湿度８５％、５％ＣＯ2、１００ｒｐｍで、４日間インキュベートされた。上記のスピナーフラスコからの細胞培養液は、３５００ｒｐｍで２０分間沈降され、上清がＭＭＰ−９の精製のために確保された。２０ｍｌのキレーティングファーストフロー樹脂（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスケータウェイ、ニュージャージー州）を含むＮｉＣｌ2で充填されたカラムは、ＢＢＳで平衡化された。そして、スピナーフラスコからの上清は、カラムに投入され、ＢＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗浄され、２００ｍＭイミダゾールで溶出された。溶出液は、１０ｍＭにＣａＣｌ2を添加した後次の精製工程の投入のために使用された。５ｍｌのゼラチンセファロース４Ｂ樹脂（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスケータウェイ、ニュージャージー州）のカラムは、ＢＢＳ＋１０ｍＭＣａＣｌ2で平衡化された。抗原を投入後、カラムは平衡バッファーにより洗浄され、ＭＭＰ−９は平衡バッファー＋２％ジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）を用いて溶出された。ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）（０．００５％）およびＥＤＴＡ（１０ｍＭ）は、溶出液に添加され、これは最終バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、４００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ2、０．０１％ＮａＮ3、ｐＨ７．５、０．００５％ＢＲＩＪ−３５、１０ｍＭＥＤＴＡ）中に透析された。最後に、タンパク質は、４℃での保存のために約０．２５ｍｇ／ｍｌに濃縮された。ザイモグラムゲルは、ＭＭＰ−９の産生および精製の確認に用いられた。ウエスタンブロットも、タンパク質の活性を確認するために用いられた。ＭＭＰ−９（オンコジーンリサーチプロダクツ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）は、ＰＥＡＫ細胞系を用いて作製された精製抗原と既知の標準との比較のために用いられた。
【０１０８】
ＭＭＰ−９のアッセイは、バイオサイトインコーポレーテッドで発生させたネズミ抗ＭＭＰ−９抗体を用い、ファージディスプレイおよび組み換えタンパク質発現技術を用いて行った。市販のＭＭＰ−９抗原を、アッセイの標準化のために用いた（カルバイオケム−ノババイオケムコーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）。ＭＭＰ−９の濃度は、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体の結合を検出することにより定量した。このアッセイの最小検出可能濃度は、０．３ｎｇ／ｍＬであり、報告可能範囲の上限は、２０００ｎｇ／ｍＬである。
【０１０９】
血栓前駆体タンパク質（ＴｐＴTM）のアッセイは、アメリカンバイオジェネティックサイエンシーズインコーポレーテッド、コロンビア、メリーランド州から得た試薬を用いて行った。溶解性フィブリンポリマーの異なるエピトープを認識する２つのネズミモノクローナル抗体は、アッセイに使用された。アッセイは、アメリカンバイオジェネティックサイエンシーズにより供給されたＴｐＴTMを用いて検定された。サンプルは、アッセイに先立ち１：４に希釈された。最小検出可能濃度は、０．２５μｇ／ｍｌであり、報告可能範囲の上限は、２５μｇ／ｍｌである。従って、１μｇ／ｍｌと１００μｇ／ｍｌの間のサンプルは、報告可能な範囲でアッセイされうる。
【０１１０】
単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）のアッセイは、バイオサイトにおいて開発された抗体を用いて行われた。アッセイは、免疫学的測定（サンドイッチ）形態で開発された。アッセイは、社内ＭＣＰ−１リファレンス調製物を用いて検定された。このアッセイの最小検出可能濃度は、２０ｐｇ／ｍｌであり、報告可能範囲の上限は、１０，０００ｐｇ／ｍｌであった。
【０１１１】
種々の形態のトロポニンＩ（ＴＩＣ複合体および全ＴｎＩ）のアッセイは、捕捉のために市販のヤギ抗ＴｎＩを用い、酵素ラベル化コンジュゲートとしてバイオサイトで開発された抗体を用いて行われた。アッセイは、社内ＴＩＣ複合体およびＴｎＩリファレンス溶液を用いて検定された。最小検出可能濃度は、ＴｎＩが４０ｐｇ／ｍｌ、ＴＩＣ複合体が５０ｐｇ／ｍｌであった。報告可能範囲の上限は、両方のアッセイで１０，０００ｐｇ／ｍｌであった。
【０１１２】
脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）のアッセイは、市販のモノクローナル抗体および市販のＦＡＢＰ抗原を用いて行われた。最小検出可能濃度は、６ｎｇ／ｍｌであり、報告可能範囲の上限は１０，０００ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１３】
Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）およびフィブリノーゲンは、市販のアッセイ（デードベーリングインコーポレーテッド、ニューアーク、デラウエア州）を用いて測定された。
【０１１４】
実施例３ 例示的マーカーパネル
心筋損傷をもたらす種々の病理学的事象のマーカーを含むマーカーパネルを、構築することができる。このようなパネルには、炎症、アテローム硬化症のプラーク破裂、血小板の活性化、血栓症、および心筋の傷害または壊死のマーカーが含まれうる。このパネルに現れるであろう適切なマーカーは、ＩＬ−６、マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質（ＭＤＡ−修飾ＬＤＬ）、Ｐ−セレクチン、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ（ＴＡＴ）複合体、ＢＮＰ、遊離心臓トロポニンＩ、全心臓トロポニンＩ、トロポニンＴおよび／またはＣの複合体の心臓トロポニンＩ、遊離心臓トロポニンＴ、全心臓トロポニンＴ、トロポニンＩおよび／またはＣの複合体の心臓トロポニンＴ、Ｃ−反応性タンパク質、および／またはＭＭＰ−９である。マーカーパネルは、患者の臨床的な徴候および症状との関連で評価されるであろう。典型的には、ＡＣＳの患者は、胸部痛の有力な症状を有する。
【表１】
Figure 0003806694
【０１１５】
パネルの１つ以上のマーカーの経時的上昇および変化は、ＡＣＳの進行の表示となりうる。例えば、ＩＬ−６、ＭＤ−修飾ＬＤＬ、Ｐ−セレクチン、およびＴＡＴ複合体の上昇は、アテローム硬化症のプラーク破裂が起こったことを示し、そして、この破裂は血小板の凝集及び凝固の活性化の原因となり、血管の狭小をもたらしうる。さらに、Ｐ−セレクチンおよびＴＡＴ複合体の上昇は、状態が血塊形成に有利であることを示しうる。経時的なその後のマーカー濃度の減少は、病的工程が遅くなったかまたは停止したことを示しうる。例えば、経時的なＴＡＴ複合体濃度の減少は、凝固工程が遅くなったかまたは停止したことを示しうる。この点において、経時的なＭＤＡ−修飾ＬＤＬ濃度の減少は、プラーク破裂が継続していないことを示しうる。
【０１１６】
他のマーカーが、上記の例に挙げられたマーカーに置き換え、または加えられうる。代替のまたはさらなる心筋傷害のマーカーには、アネキシンＶ、ＢＮＰおよび／またはＢＮＰ関連ペプチド、β−エノラーゼ、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、グリコーゲンホスホリラーゼ−ＢＢ、心臓型脂肪酸結合タンパク質、ホスホグリセリン酸ムターゼ−ＭＢ、およびＳ−１００ａｏが含まれる。
【０１１７】
代替のまたはさらなる凝固活性化のマーカーには、プラスミン−α−２−抗プラスミン複合体、フィブリノペプチドＡ、プロトロンビンフラグメント１＋２、Ｄ−ダイマー、１またはそれ以上の形態のフォン・ビルブラント因子、組織因子、および血栓前駆体タンパク質（ＴｐＰ）が含まれる。
【０１１８】
代替のまたはさらなる血小板活性化のマーカーには、β−トロンボグロブリン、血小板第４因子および血小板由来増殖因子が含まれる。
【０１１９】
代替のまたはさらなるアテローム硬化症のプラーク破裂のマーカーには、ヒト好中球エラスターゼ、誘導型一酸化窒素シンターゼ、リゾホスファジチン酸、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）が含まれる。
【０１２０】
代替のまたはさらなる炎症または急性期反応のマーカーには、Ｃ−反応性タンパク質、インターロイキン−１β、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、腫瘍壊死因子α、溶解性細胞間接着分子−１、溶解性血管細胞接着分子−１、および単球走化性タンパク質−１が含まれる。
【０１２１】
さらに、他のマーカーがパネルの診断力を増強するためにパネルに加えられることができる。
【０１２２】
実施例４： ＡＣＳの予後マーカーとしてのＭＭＰ−９、全ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴＩＣ、ＢＮＰ、ＣＲＰ、ＦＡＢＰ、ＴｐＰ、およびＭＣＰ−１
研究母集団
不安定冠状動脈症候群の患者のオーボフィバンによる経口糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害（ＯＰＵＳ−ＴＩＭＩ１６）試験は、１０，２８８人のＡＣＳ患者における経口糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害因子、オーボフィバンをプラセボと比較した、無作為化した複数の研究機関にまたがった試験である。Cannon et al., Oral glycoprotein IIb/IIIa inhibition with orbofiban in patients with unstable coronary syndromes (OPUS-TIMI 16) trial（不安定冠状動脈症候群の患者のオーボフィバンによる経口糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害（ＯＰＵＳ−ＴＩＭＩ１６）試験）、Circulation 102:149-56 (2000)を参照のこと。患者は、彼らが虚血症状の発症から７２時間以内に現れ、次の基準の１つに適合するならば、登録する資格があるとした：糖尿病または血管疾患を有する６５歳以上；以前に冠状動脈疾患であった；動的なＥＣＧ変化を有する；または上昇した心臓マーカーを有する。研究は、各々の病院の倫理調査委員会により承認され、すべての患者から書面のインフォームドコンセントが提供された。患者は、次の３つの処置アームの１つに無作為化された：オーボフィバン５０ｍｇを１日２回（５０／５０グループ）、オーボフィバン５０ｍｇを１日２回１月間、その後にオーボフィバン３０ｍｇを１日２回（５０／３０グループ）、またはプラセボ。ＯＰＵＳ−ＴＩＭＩ１６研究は、５０／３０グループにおいて増加した死亡率が見出されたため、時期尚早に終了した。５０／５０グループでは死亡率の上昇はなかった。本研究は、５０／５０グループに割り当てられた患者により実施され、ＭＭＰ−９、全ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴＩＣ、ＢＮＰ、ＣＲＰ、ＦＡＢＰ、ＴｐＰ、およびＭＣＰ−１の分析に適したベースライン血漿標本が提供された。
【０１２３】
ＯＰＵＳ−ＴＩＭＩ１６に登録した症状の発症からの中央値時間は、４０時間であった。
【０１２４】
ＭＭＰ−９アッセイ
ＭＭＰ−９のアッセイは、バイオサイトインコーポレーテッドで発生させたネズミ抗ＭＭＰ−９抗体を用いて、ファージディスプレイおよび組み換えタンパク質技術を用いて行われた。市販のＭＭＰ−９抗原を、アッセイの標準化のために用いた（カルバイオケム−ノババイオケムコーポレーション、サンディエゴ、カリフォルニア州）。アッセイは、自動ハイスループットプラットフォームの３４８ウェルマイクロタイタープレートで行った（ＴＥＣＡＮジェネシスＲＳＰ２００／８）。ＭＭＰ−９の濃度は、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体の結合を検出することにより定量した。すべてのサンプルは、２回実行した。このアッセイの最小検出可能濃度は、３．０ｎｇ／ｍＬであり、報告可能範囲の上限は、２０００ｎｇ／ｍＬであった。
【０１２５】
クリニカルエンドポイント
死亡、致命的でないＭＩ、および鬱血性心不全のすべての原因は、３０日目および１０ヶ月の追跡期間の終了まで評価された。ＭＩは、すでに報告された基準を用いて定義され、臨床事象委員会により判断された。Antman et al., Enoxaparin prevents death and cardiac ischemic events in unstable angina/non-Q-wave myocardial infarction: Results of the thrombolysis in myocardial infarction (TIMI) 11B trial（エノキサパリンは不安定狭心症／非Ｑ波心筋梗塞の死亡および心臓虚血事象を防ぐ：心筋梗塞の血栓症の結果（ＴＩＭＩ）１１Ｂ試験）、Circulation 100:1593-601 (1999)を参照のこと。新規若しくは悪化しているＣＨＦ、または心臓性のショックのエンドポイントは、症例記録用紙から集め、判定されていない。
【０１２６】
統計的分析
被験者は、試験に登録した時点のマーカー濃度に基づいて四分位に分けた。平均値およびベースライン変数に対する割合は、連続変数についてのＡＮＯＶＡおよびカテゴリー変数についてのχ2トレンド検定を用いて四分位の間で比較した。マーカーと他の連続ベースライン変数との直接の相関は、ピアソンの積率相関係数を用いて評価された。マーカー濃度は、研究のエンドポイントに合致した患者と合致していない患者との間で、ウィルコクソンランクサム検定を用いて比較した。累積ハザード関数を用いて、不利な事象の頻度を１０ヶ月の追跡調査期間の終了時点で評価した。ログランク検定を用いて、四分位の間での結果を比較した。
【０１２７】
分析は、年齢、性別、糖尿病の存在、および徴候診断により定義されたあらかじめ特定されたサブグループにおいて行われた。追跡調査（１０ヶ月）の終了まで死亡のすべての原因について、コックスの比例ハザードモデルがフォーワードステップワイズ変数選択を用いて構築された。不変のｐ値が＜０．１で、データが＞７５％の患者で利用可能な場合は、臨床的変数がモデルに入れられ、多重変化ｐ値が＞０．１の場合は、変数が除かれた。そして、全ｃＴｎＩ、ＢＮＰ、およびＭＭＰ−９のベースライン濃度は、完成モデルに加えられた。すべての変数について完全なデータを有する患者のみが、これらの多重変化分析に含められた（ｎ＝２０６８）。モデルは、Ｃ−反応性タンパク質の測定を受けている患者の部分集合について、続いて繰り返された（ｎ＝７３６）。
【０１２８】
ＭＭＰ−９とベースライン臨床的変数との関係
ＭＭＰ−９の高いベースライン濃度は、女性、非白人種および現在のたばこ使用者に関係するが、老齢、糖尿病、または以前の高コレステロール血症、冠状動脈疾患若しくは鬱血性心不全には関係しなかった。高ＭＭＰ−９濃度は、早い心拍、キリップクラス＞Ｉ、並びにトロポニンＩおよびＣ−反応性タンパク質の上昇した濃度と関係した（表１）。対照的に、ＭＭＰ−９は、ボディマス指標、腎機能、心電図の変化、上昇したＢＮＰ、ＬＶＥＦ、または冠状動脈血管造影で測定された冠状動脈疾患の範囲には関係しなかった。ＭＭＰ−９濃度と、試験への登録のための症状発症からの時間との間には、関係はなかった。ＭＭＰ−９と、ＣＲＰ（Ｒ＝０．１６、ｐ＜０．００１）、ｃＴｎＩ（Ｒ＝０．０７、ｐ＝０．００１）、および記録された最大のＣＫＭＢ（Ｒ＝０．０５、ｐ＝０．０４）との濃度の相関は、わずかであった。ＭＭＰ−９と、ＢＮＰ（Ｒ＝０．００５、ｐ＝０．８２）またはフィブリノーゲン（Ｒ＝−０．０５、ｐ＝０．１２）との濃度の関係はなかった。
【表２】
Figure 0003806694
【表３】
Figure 0003806694
【０１２９】
ＭＭＰ−９と臨床的結果との関係
ＭＭＰ−９の濃度は、次のいずれの時点でも生存していた患者に対し、３０日以内（ｐ＝０．００２）または１０ヶ月以内（ｐ＜０．０００１）に死亡した患者では、有意に高かった。同様に、ＭＭＰ−９濃度は、非致命的ＭＩおよびＣＨＦを有する患者は、これらのエンドポイントを有しないものに比べ、高かった。（３０日および１０ヶ月の双方におけるそれぞれのエンドポイントは、ｐ＜０．０１）
【表４】
Figure 0003806694
【０１３０】
調整していない死亡率が、それぞれＭＭＰ−９濃度の連続する四分位で増加した（ｐ＜０．００１）。同様の関係が、ＭＭＰ−９と死亡および非致命的ＭＩの混合との間（ｐ＜０．００１）、並びに、ＭＭＰ−９と鬱血性心不全との間（ｐ＜０．００１）に観察された。方向性を持つ一致した関係が、ＭＭＰ−９と、症状の発症から処置までの時間、徴候による診断、性別、糖尿病、および年齢により定義された患者のサブグループにおける死亡率との間に、観察された。
【表５】
Figure 0003806694
【０１３１】
全ｃＴｎＩとベースライン臨床的変数との関係
データは、２５２３人の患者から評価した。全ｃＴｎＩの高いベースライン濃度は、男性、糖尿病の不存在、以前の冠状動脈疾患の不存在、処置を必要とする高血圧症の不存在、およびたばこの使用に関係したが、老齢または人種には関係しなかった。高い全ｃＴｎＩ濃度は、腎機能、心電図の変化、キリップクラス＞Ｉ、およびＣＫ−ＭＢの上昇した濃度に関係した（表４）。対照的に、全ｃＴｎＩは、ボディマス指標、冠状動脈血管造影で測定された冠状動脈疾患の範囲、ストレス試験、または人種とは関係しなかった。全ｃＴｎＩの濃度と症状の発症から試験への登録までの時間との間には、関係がなかった。全ｃＴｎＩとＣＲＰ（Ｒ＝０．０５、ｐ＝０．１６）またはフィブリノーゲン（Ｒ＝０．０４、ｐ＝０．１８）の濃度との間には、関係がなかった（表５）。
【表６】
Figure 0003806694
【表７】
Figure 0003806694
【表８】
Figure 0003806694
【０１３２】
全ｃＴｎＩと臨床的結果との関係
全ｃＴｎＩの濃度は、同時点で生存していた患者に対して３０日以内に死亡した患者で有意に高かった（ｐ＝０．００４）。同様に、全ｃＴｎＩ濃度は、死亡や非致命的ＭＩの組み合わされたエンドポイントを有する患者の方が、これらのエンドポイントを有さないものに比べ高かった。（３０日および１０ヶ月の両方における各々のエンドポイントについてｐ＜０．０１（表６および７））
【表９】
Figure 0003806694
【表１０】
Figure 0003806694
【０１３３】
ｃＴｎＴＩＣとベースライン臨床的変化との関係
データは、２４３９人の患者から評価した。ｃＴｎＴＩＣの高いベースライン濃度は、男性、糖尿病の不存在、以前の冠状動脈疾患の不存在、処置が必要な高血圧症の不存在、およびたばこの使用に関連したが、老齢または人種には関係しなかった。高いｃＴｎＴＩＣ濃度は、腎機能、心電図の変化、キリップクラス＞Ｉ、ｃＴｎＩの上昇した濃度、およびＣＫ−ＭＢの上昇した濃度に関係した（表８）。対照的に、ｃＴｎＴＩＣは、ボディマス指数、冠状動脈血管造影により測定された冠状動脈疾患の範囲、ストレス試験、または人種には関係しなかった。ｃＴｎＴＩＣとＣＲＰ（Ｒ＝０．０３、ｐ＝０．３６）またはフィブリノーゲン（Ｒ＝０．０４、ｐ＝０．２９）の濃度との間には、関係がなかった（表９）。
【表１１】
Figure 0003806694
【表１２】
Figure 0003806694
【表１３】
Figure 0003806694
【０１３４】
ｃＴｎＴＩＣと臨床的結果との関係
ｃＴｎＴＩＣの濃度は、同時点で生存していた患者に対して３０日以内に死亡した患者で有意に高かった（ｐ＜０．０５）（表１０）。低い四分位のｃＴｎＴＩＣ濃度のトレンドは、１０ヶ月で緊急血管再生を必要とする虚血の増加した頻度と関係があった（表１１）。対照的に、高い四分位のｃＴｎＴＩＣ濃度のトレンドは、喫煙の履歴を有しない患者において、死亡、緊急血管再生を必要とする虚血、および、死亡、非致命的ＭＩ、若しくは事象後３０日で緊急血管再生を必要とする虚血の組み合わされたエンドポイント、に関係した（表１２）。
【表１４】
Figure 0003806694
【表１５】
Figure 0003806694
【表１６】
Figure 0003806694
【０１３５】
ＢＮＰとベースラインの臨床的変化との関係
データは、２５２５人の患者から評価した。ＢＮＰの高いベースラインの四分位の濃度は、年齢、高血圧症、およびたばこの使用に関係した。高い四分位のＢＮＰ濃度は、鬱血性心不全、腎機能、心電図の変化、キリップクラス＞Ｉ、およびＣＫ−ＭＢの上昇した濃度に関係した（表１３）。対照的に、四分位のＢＮＰ濃度は、冠状動脈疾患の以前の履歴、ボディマス指標、および糖尿病とは関係しなかった。ＢＮＰと連続したベースライン変化のＣＲＰ（Ｒ＝０．２、ｐ＜０．０００１）、フィブリノーゲン（Ｒ＝０．１８、ｐ＜０．０００１）、ＬＶＥＦ（Ｒ＝０．２３、ｐ＜０．０００１）との濃度の間で有意な相関があった。ＢＮＰ濃度とボディマス指数との相関は、わずかであった（Ｒ＝０．０６）（表１４）。さらに、高い平均ＢＮＰ濃度は、５０％またはそれ以上の狭窄症の血管の数、低い駆出率、および陽性ストレス試験結果と有意に関係した（表１５）。
【表１７】
Figure 0003806694
【表１８】
Figure 0003806694
【表１９】
Figure 0003806694
【表２０】
Figure 0003806694
【０１３６】
ＢＮＰと臨床的結果との関係
ＢＮＰの濃度は、同時点で生存していた患者に対して、３０日以内（ｐ＜０．０００１）および１０ヶ月以内（ｐ＜０．０００１）に死亡した患者で有意に高かった（表１６）。さらに、ＢＮＰ濃度は、非致命的ＭＩを経験していない患者に対して、これを３０日以内（ｐ＝０．０１）および１０ヶ月以内（ｐ＝０．０２）に経験した患者で有意に高かった（表１６）。高いＢＮＰ濃度と３０日および１０ヶ月以内の死亡との関係は、徴候による診断に基づいたサブグループの分析でも観察された（表１７）。
【表２１】
Figure 0003806694
【表２２】
Figure 0003806694
【０１３７】
ＦＡＢＰとベースライン臨床的変数との関係
データは、２２８７人の患者から評価した。ＦＡＢＰとベースライン臨床的変数との関係づけは、８ｎｇ／ｍｌのＦＡＢＰの切点を用いて行った。ＦＡＢＰの高いベースライン濃度は、年齢、鬱血性心不全の履歴、腎機能、心電図の変化、キリップクラス＞Ｉ、並びにＣＫ−ＭＢ、ｃＴｎＩ、ＢＮＰ、およびＣＲＰの上昇した濃度に関係した（表１８）。対照的に、四分位のＦＡＢＰ濃度は、冠状動脈疾患の以前の履歴、ボディマス指数、高血圧症、および糖尿病には関係しなかった。ＦＡＢＰの濃度とｃＴｎＩ濃度との間に有意な相関があった（Ｒ＝０．２１、ｐ＜０．０００１）。ＦＡＢＰ濃度と他の連続変数の間の相関は、わずかであった（Ｒ2＜０．０３）（表１９）。
【表２３】
Figure 0003806694
【表２４】
Figure 0003806694
【表２５】
Figure 0003806694
【０１３８】
ＦＡＢＰと臨床的結果との関係
ＦＡＢＰの平均濃度は、同時点で生存していた患者に対して、３０日以内（ｐ＜０．０００１）および１０ヶ月以内（ｐ＜０．０００１）に死亡した患者で有意に高かった（表２０）。平均ＦＡＢＰ濃度は、エンドポイントを有しない患者に対して、３０日以内（ｐ＜０．０００１）および１０ヶ月以内（ｐ＜０．０００１）の死亡、非致命的ＭＩ、または血管再生の組み合わせたエンドポイントを有する患者で有意に高かった（表２０）。さらに、平均ＦＡＢＰ濃度は、ＣＨＦを有しないものに対し、３０日以内（ｐ＜０．０００１）および１０ヶ月以内（ｐ＜０．０００１）にＣＨＦを有した患者で有意に高かった（表２０）。ＦＡＢＰ濃度が陽性（ＦＡＢＰ＞８）または陰性（ＦＡＢＰ＝８またはそれ以下）のいずれかに分類されたときに、これらの関係は統計的な有意さを維持した（表２１）。
【表２６】
Figure 0003806694
【表２７】
Figure 0003806694
【０１３９】
ＴｐＰとベースライン臨床的変数との関係
データは、２３４９人の患者から評価した。ＴｐＰの高いベースライン濃度は、年齢、冠状動脈疾患の履歴、腎機能、ＣＨＦの履歴、アスピリンの使用に関係し、白人の人種およびヘパリン治療に逆に関係した（表２２）。対照的に、ＴｐＰ濃度は、心拍数、キリップクラス＞Ｉ、ボディマス指数、高血圧症、冠状動脈疾患の範囲、および糖尿病には関係しなかった。
【表２８】
Figure 0003806694
【表２９】
Figure 0003806694
【０１４０】
ＴｐＰと臨床的結果との関係
ＴｐＰ濃度は、同時点で生存した患者に対して、１０ヶ月以内に死亡した患者で有意に高かった（ｐ＜０．０５）（表２３）。ＴｐＰ濃度は、入院を必要とする虚血を経験しないものに対し、１０ヶ月以内に入院を必要とする虚血を経験した患者で有意に高かった（ｐ＝０．００６２）（表２３）。ＴｐＰ濃度は、エンドポイントを経験しない患者に対して、１０ヶ月以内に、死亡若しくは非致命的ＭＩ、または、死亡、非致命的ＭＩ若しくは緊急血管再生の組み合わせたエンドポイントを有する患者で有意に高かった（ｐ＜０．０２）（表２３）。
【表３０】
Figure 0003806694
【０１４１】
ＭＣＰ−１とベースライン臨床的変数との関係
データは、２２７０人の患者から評価した。ＭＣＰ−１の高いベースライン濃度は、年齢、冠状動脈疾患の履歴、腎機能、ＣＨＦの履歴、糖尿病、高血圧症、キリップクラス＞Ｉ、およびアスピリンの使用に関係した（表２４）。対照的に、ＭＣＰ−１濃度は、心拍数、ボディマス指数、冠状動脈疾患の範囲、および喫煙には関係しなかった。
【表３１】
Figure 0003806694
【表３２】
Figure 0003806694
【０１４２】
ＭＣＰ−１と臨床的結果との関係
平均ＭＣＰ−１濃度は、同時点で非致命的ＭＩを経験していない患者に対して、３０日以内（ｐ＝０．０１）または１０ヶ月以内（ｐ＝０．０４）に経験した患者で有意に高かった（表２５）。さらに、平均ＭＣＰ−１濃度は、エンドポイントを経験しない患者に対して、１０ヶ月以内に、死亡若しくは非致命的ＭＩ（ｐ＝０．０５）、または、死亡、非致命的ＭＩ若しくはＣＨＦの組み合わせたエンドポイントを有する患者で有意に高かった（ｐ＜０．０２）（表２５）。これらの所見は、四分位ＭＣＰ−１濃度および結果の分析でも観察された（表２６）。
【表３３】
Figure 0003806694
【表３４】
Figure 0003806694
【表３５】
Figure 0003806694
【０１４３】
年齢、糖尿病、腎機能、ＣＨＦの徴候、ＥＣＧの変化、並びにｃＴｎＩおよびＢＮＰの濃度等、長期の死亡率の他の独立した予測値で調整した多変量モデルにおいて、増加するＭＭＰ−９の濃度は、高い１０ヶ月の死亡率と関係したまま維持された。ＭＭＰ−９の第２、第３、および第４の四分位の患者の１０ヶ月での死亡の調整された確率比は、４．５（１．３−１５．６）、６．４（１．９−２１．４）、７．６（２．３−２５．５）であった。ＣＲＰ等のすべての変数について完全なデータで７３６人の患者においてモデルを繰り返した場合、ＭＭＰ−９は、１０ヶ月の死亡率と有意に関係したまま維持された。調整した確率比は、第２、第３、および第４の四分位において、３．１（０．９−１０．７）、３．９（１．１−１３．１）および４．２（１．３−１４．４）であった。
【表３６】
Figure 0003806694
【０１４４】
モデル１は、Ｃ−反応性タンパク質を除きすべての変数について完全なデータを有する患者を含む。モデル２は、Ｃ−反応性タンパク質を含むすべての変数について完全なデータを有する患者を含む。列挙された変数に加えて、モデルは、高コレステロール血症、鬱血性心不全、または末梢動脈疾患；ヘパリン、硝酸塩、または利尿剤の以前の使用；徴候による診断（不安定狭心症、非ＳＴ上昇ＭＩ、ＳＴ上昇ＭＩ）；徴候事象の管理のための硝酸塩またはＡＣＥ抑制剤の使用；血圧；および心電図のＳＴの変化、の以前の徴候について調整した。
【０１４５】
ＭＭＰ−９の血漿濃度は、急性冠状動脈症候群の状態後の最初の数日以内に測定され、死亡率、非致命的ＭＩ、および鬱血性心不全の危険性の予測となる。ＭＭＰ−９と死亡率の関係は、ベースライン臨床的変数、ＥＣＧ所見、およびトロポニンＩ、Ｃ−反応性タンパク質、およびＢ型ナトリウム排泄増加性ペプチドのような確立された心臓生体マーカーの濃度と独立している。多変量解析により、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、Ｃ−反応性タンパク質、Ｂ型ナトリウム排泄増加性ペプチド、およびトロポニンＩの上昇した濃度は、増加した１０ヶ月の死亡率の予測値からそれぞれ有意に独立していた。
【０１４６】
以前の研究において、ＭＭＰ−９濃度は、虚血についての症状および心電図の徴候にもかかわらず、安定狭心症の患者における運動の後では増加しなかった（Kai H et al., Peripheral blood levels of matrix metalloproteases-2 and -9 are elevated in patients with acute coronary syndrome, J Am Coll Cardiol 32:368-372 (1998)）。本研究において、ＭＭＰ−９とアテローム硬化症の範囲との間に関係はなく、ＭＭＰ−９とＣＫＭＢおよびｃＴｎＩのような心臓壊死のマーカーとの間に、一般的に貧弱な相関が観察された。ＭＭＰ−９と結果との間の関係は、不安定狭心症の患者と心筋梗塞の患者との間のものと同様であった。
【０１４７】
本実施例は、個々のマーカーの上昇と結果との間の関係の臨床的な利用を示している。さらに、危険性の層別化のための固有の病理学的工程に関連した異なる独立したマーカーを導入するという、多重マーカー方策を用いることによる利益も示される。この実施例で選択されたマーカーは、心筋損傷（ｃＴｎＩ、ｃＴｎＴＩＣ、およびＦＡＢＰ）、心室機能不全（ＢＮＰ）、マトリックス分解またはプラーク破裂（ＭＭＰ−９）、炎症（ＭＣＰ−１およびＣＲＰ）、および凝固活性化（ＴｐＰ）を示すものである。当業者は、これらの病理学的工程がこの実施例で記載された不利な事象に独立して関係していると承知している。この点において、それぞれのこれらの種々の病理学的工程の代替マーカーは、ＡＣＳ患者の危険性の層別化のためのこの実施例のマーカーに置き換えうる。さらに、種々の病理学的工程のためのマーカーの種々の組み合わせは、ＡＣＳの患者の危険性の層別化に有用であろう。
【０１４８】
実施例５：診断的利用
ＭＭＰ−９は、不安定狭心症からＳＴ部上昇心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）まで、急性冠状動脈系のすべての濃度で上昇する。ＴＩＭＩ ＯＰＵＳ−１６研究集団は、不安定狭心症（ＵＡ）、非ＳＴ部上昇心筋梗塞（ＮＳＴＥＭＩ）、およびＳＴＥＭＩの３つのグループに分離できる。特に興味深いこととは、不安定狭心症の正常健康ドナーからの区別において、９５％の特異性における感度の水準（９７．８〜１００％）である（表２８）。心臓損傷の最も広く受け入れられたマーカーであるＴｎＩは、急性冠状動脈症候群のこの部分集合においてわずかに５０％を超える感度を達成したにすぎない。
【表３７】
Figure 0003806694
【０１４９】
ＮＳＴＥＭＩまたはＳＴＥＭＩのいずれかの個体において、ＴｎＩは、特に症状発症時から６時間から２４時間の間において、優れた感度および特異性を有する（表２９および３０）。不安定狭心症においてＴｎＩがほんのわずかしか上昇しえない一方、ＭＭＰ−９が上昇するという事実は、深刻でない不安定狭心症とより深刻な心筋梗塞との間の区別の有用な方法を提供するものである。医師がこの情報を利用可能であれば、治療の選択肢は影響されることとなる。
【表３８】
Figure 0003806694
【表３９】
Figure 0003806694
【０１５０】
ＢＮＰは、不安定狭心症においても幾分上昇するが、これは、心筋梗塞の、特に事象の早期において、より表示となるものである。ＭＭＰ−９とＴｎＩの組み合わせで用いた場合、ＢＮＰは、急性冠状動脈症候群の診断の有用な情報を加えうる。
【０１５１】
ＴｐＰ、ＭＣＰ−１、およびＦＡＢＰはすべて、急性冠状動脈症候群の間の種々の時点で度合いを変化させて上昇し、その結果、診断を形成するのに使用される情報を加えうる。
【０１５２】
これらのマーカーのすべてが異なる機能を供給し、種々の供給源から由来するので、急性冠状動脈症候群の間の循環系へのこれらのマーカーの出現は、お互い独立しているようである。したがって、２またはそれ以上のマーカーを用いる診断パネルは、治療を導くことを助ける情報を提供する臨床医にとって有益であろう。
【０１５３】
実施例６： 患者の治療におけるマーカーの使用
ＭＭＰ−９、ｃＴｎＩ、ＢＮＰ、およびＣＲＰがそれぞれ独立に１０ヶ月の患者の死亡率に関係しているという所見は、ＡＣＳと疑われる患者における多重マーカー試験方策が個々のマーカーの測定と比べて危険予測を有利に改善できることを示す。このような予後および診断の利用に加え、本発明のマーカーは、ＡＣＳ患者への治療の実施を助けるために用いることもできる。例えば、これらの生体マーカーの危険「プロフィール」は、異なった基礎をなす病態生理学的機構の標的特異的治療に用いられるであろう。この「危険プロフィール」は、ＭＭＰ−９、ｃＴｎＩ、ＢＮＰ、およびＣＲＰの種々の組み合わせにより、上記マーカーに加えて、またはその置き換えとして用いる他のマーカーと同様に、決定されるであろう。
【０１５４】
加えて、アテローム硬化症およびその合併症において直接の病因の役割を果たすＭＭＰ−９のようなマーカーは、薬剤発見のための新規な治療の標的を提供できる。例えば、ＭＭＰ系は、少なくとも４つの水準で調整されている：遺伝子転写、メッセージの翻訳、前酵素の活性化、およびメタロプロテアーゼの組織阻害因子（ＴＩＭＰｓ）による阻害。これらの工程の１またはそれ以上の修飾は、アテローム硬化症のプラーク破裂を防ぎ、不利な血管および心臓の再構築を修正するであろう。
【０１５５】
治療方策には、例えば、ＭＭＰ−９の合成を妨害するためのアンチセンス組成物の実施；レセプターを基礎とする治療の実施（例えばＭＭＰ−９またはそのフラグメントに向けられた抗体組成物）；および／または小分子治療の実施（例えばヘパリンはＭＭＰ−９合成を減少させることができ、テトラサイクリン抗体は亜鉛をキレートすることによりＭＭＰを不活性化でき、そしてＨＭＧ Ｃｏ−Ａレダクターゼ阻害因子およびペルオキソーム増殖因子活性化レセプター（ＰＰＡＲ）−ガンマはマクロファージからのＭＭＰ−９の発現を減少させることができる）を、含めることができる。このような方策は、標的分子そのものに向けられ（この実施例のＭＭＰ−９）、または、その代わりに標的の活性化若しくは活性のために必要な上流の分子に向けられる（例えば、プラスミンのようなプロテアーゼで、これはＭＭＰ−９チモーゲンをその活性形態に切断する）。
【０１５６】
この発明は当業者がこれを作製し、使用するために充分詳細に既述され、例示されているが、種々の代替、修正、および改良がこの発明の精神および範囲から離れることなく明白であろう。
【０１５７】
当業者は、本発明が、これらに内在するものと同様に、その目的を実行し、言及された目的および有利な点を得るのによく適していることを、容易に認識する。ここに提供された実施例は、好ましい態様の代表であり、例示であり、この発明の範囲の限定として意図するものではない。これらの修正および他の使用は、当業者に思い浮かぶものである。これらの修正は、この発明の精神の範囲に入るものであり、請求の範囲により定義されるものである。
【０１５８】
当業者にとって、様々な置き換えや修正がこの発明の範囲および精神から離れることなくここに記載された発明に対してなされうることは、容易で明白であろう。
【０１５９】
明細書に言及されたすべての特許および刊行物は、この発明の属する通常の知識を有するものの水準を示すものである。すべての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が特別に個別に参照により取り込まれることを示したように、同様の範囲で参照することによりここに取り込まれる。
【０１６０】
ここに適して例証的に記載された発明は、ここに特別に開示されていないいずれもの要素、限定の存在なしに実施されうる。したがって、例えば、ここの各々の事例において、「含む」、「本質的に〜からなる」および「〜からなる」のいずれの用語も、他の２つのいずれの用語にも置き換えることができる。使用された用語および表現は、記述の用語として用いられ、限定のものではなく、そしてこのような用語および表現の使用において、示され、記載された特徴またはその部分のいずれの均等物をも排除する意図はないが、種々の修正がこの請求された発明の範囲に入ることが可能であると認識できる。したがって、本発明は好ましい態様および任意の特徴により特に記載されているが、ここに開示された概念の修正および多様化が当業者によって行われ、このような修正および多様化が添付の請求の範囲により定義されるこの発明の範囲に入ると見なされることを、理解すべきである。
【０１６１】
他の態様は、特許請求の範囲により明らかにされる。

Claims (8)

  1. 患者から得たサンプル中のＢＮＰの濃度およびＢＮＰに関連するマーカーの濃度から成る群より選ばれる第１の診断指標を決定すること；
    前記患者の１またはそれ以上の第２の診断指標を決定すること、ここで前記１またはそれ以上の第２の診断指標が、アネキシンＶ、β−エノラーゼ、心臓トロポニンＩ（遊離および／または複合体）、心臓トロポニンＴ（遊離および／または複合体）、クレアチンキナーゼ−ＭＢ、グリコーゲンホスホリラーゼ−ＢＢ、心臓型脂肪酸結合タンパク質、ホスホグリセリン酸ムターゼ−ＭＢ、およびＳ−１００ａｏからなる群より選ばれるマーカーの濃度であり；および、
    前記第１の診断指標および前記１またはそれ以上の第２の診断指標を前記患者の心筋虚血の存在または不存在と関連づけること；
    を含む、患者の心筋虚血の検出方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、
    前記患者の１またはそれ以上の第３の診断指標を決定すること、ここで前記１またはそれ以上の第３の診断指標が、β−トロンボグロブリン、Ｄ−ダイマー、フィブリノペプチドＡ、血小板由来増殖因子、プラスミン−α−２−抗プラスミン複合体、血小板第４因子、プロトロンビンフラグメント１＋２、Ｐ−セレクチン、トロンビン−抗トロンビンＩＩＩ複合体、血栓前駆体タンパク質、組織因子、およびフォン・ビルブラント因子からなる群より選ばれるマーカーの濃度であり；および、
    前記１またはそれ以上の第３の診断指標を前記患者の心筋虚血の存在または不存在と関連づけること；
    をさらに含む、方法。
  3. 請求項１に記載の方法であって、
    前記患者の１またはそれ以上の第３の診断指標を決定すること、ここで前記１またはそれ以上の追加の診断指標が、Ｃ−反応性タンパク質、セルロプラスミン、フィブリノーゲン、α１−酸性糖タンパク質、α１−アンチトリプシン、およびハプトグロビンからなる群より選ばれるマーカーの濃度であり；および、
    前記１またはそれ以上の第３の診断指標を前記患者の心筋虚血の存在または不存在と関連づけること；
    をさらに含む、方法。
  4. 請求項１に記載の方法であって、
    前記患者の１またはそれ以上の第３の診断指標を決定すること、ここで前記１またはそれ以上の追加の診断指標が、インスリン様成長因子−１、インターロイキン−１β、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、インターロイキン−６、インターロイキン−８、トランスホーミング増殖因子β、単球走化性タンパク質−１、および腫瘍壊死因子αからなる群より選ばれるマーカーの濃度であり；および、
    前記１またはそれ以上の第３の診断指標を前記患者の心筋虚血の存在または不存在と関連づけること；
    をさらに含む、方法。
  5. 請求項１に記載の方法であって、
    前記患者の１またはそれ以上の第３の診断指標を決定すること、ここで前記１またはそれ以上の追加の診断指標が、ヒト好中球エラスターゼ、誘導型一酸化窒素シンターゼ、リゾホスファチド酸、マロンジアルデヒド修飾低密度リポタンパク質、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２、マトリックスメタロプロテイナーゼ−３、マトリックスメタロプロテイナーゼ−９、キャスパーゼ−３、ヘモグロビンα2、溶解性細胞間接着分子−１および溶解性血管細胞接着分子−１からなる群より選ばれるマーカーの濃度であり；および、
    前記１またはそれ以上の第３の診断指標を前記患者の心筋虚血の存在または不存在と関連づけること；
    をさらに含む、方法。
  6. 前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、および血漿サンプルから成る群より選ばれる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記方法が、前記患者の心筋壊死と心筋虚血とを識別する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 心筋虚血が、狭心症、安定狭心症、不安定狭心症、および無症候性虚血からなる群から選ばれる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
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