CN115190886A - 循环bmp10（骨形态发生蛋白10）的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于评定受试者的心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：在来自所述受试者的样品中确定BMP10的量，以及将BMP10的所述量与参考量进行比较，由此评定心房颤动。此外，本发明涉及一种用于基于对来自受试者的样品中BMP10的确定来诊断心力衰竭的方法。另外，本发明涉及一种用于基于对来自受试者的样品中BMP10‑型肽的确定来预测受试者因心力衰竭而住院的风险的方法。本发明进一步关于与一种或多种BMP10‑型肽例如NT‑proBMP10结合的抗体。

Description

循环BMP10(骨形态发生蛋白10)的检测方法
本发明涉及一种用于评定受试者的心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及将一种或多种BMP10-型肽的量与参考进行比较，由此评定心房颤动。此外，本发明涉及一种基于对来自受试者的样品中的一种或多种BMP10-型肽的确定来诊断心力衰竭的方法。此外，本发明涉及一种基于对来自受试者的样品中的一种或多种BMP10-型肽的确定来预测受试者因心力衰竭住院的风险的方法。本发明进一步涉及与一种或多种诸如NT-proBMP10的BMP10-型肽结合的抗体。
背景技术
心房颤动(AF)是最常见的心律失常类型，也是老年人口中最普遍的状况之一。心房颤动的特征是不规则的心脏跳动并且通常以短暂的异常跳动开始，该短暂的异常跳动会随着时间的推移增加并且可能成为永久性病症。估计270-610万美国人患有心房颤动，并且全球约有3300万人患有心房颤动(Chugh S.S.等人，Circulation 2014；129:837-47)。
诸如心房颤动的心律失常的诊断通常涉及对心律失常原因的测定及对心律失常的分类。根据美国心脏病学会(ACC)、美国心脏协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)的心房颤动分类的指南主要基于简单性和临床相关性。第一类别称为“首次检测到AF”。此类别中的人最初被诊断患有AF，并且可能已经具有或可能尚未具有先前未检测到的发作。如果首次检测到的发作在不到一周的时间内自行停止，但随后又发生了另一次发作，则类别变为“阵发性AF”。尽管此类别中的患者的发作可持续长达7天，但在大多数阵发性AF病例中，发作将在不到24小时内停止。如果发作持续超过一周，则将其分类为“持续性AF”。如果这种发作无法停止，即，无法通过电复律或药物复律停止，并且持续一年以上，则分类变为“永久性AF”。由于心房颤动是脑卒中和全身性栓塞的重要危险因素，因此非常需要早期诊断心房颤动(Hart等人，Ann Intern Med 2007；146(12):857-67；Go AS等人JAMA 2001；285(18):2370-5)。脑卒中作为高收入国家中损失失能调整的寿命年数的原因和作为全球范围内的死亡原因而排在缺血性心脏病之后的第二位。为了降低脑卒中风险，抗凝疗法似乎为最合适的疗法。
非常期望允许评定心房颤动的生物标志物。
Latini R.等人(J Intern Med.2011Feb；269(2):160-71)测量了患有心房颤动的患者中的各种循环生物标志物(hsTnT、NT-proBNP、MR-proANP、MR-proADM、肽素(copeptin)和CT-内皮素原-1)。
骨形态发生蛋白10(缩写为BMP10)是TGF-β(转化生长因子-β)蛋白超家族的配体。该家族的配体结合各种TGF-β受体，导致募集和激活某些调节基因表达的转录因子。BMP10与激活素受体样激酶1(ALK1)结合，并已被证明是内皮细胞中这种激酶的功能激活剂(David等人，Blood.2007,109(5):1953-61)。
骨形态发生蛋白以不同的形式(未切割、加工或复合)在血液中循环。Kienast等人，J.Biol.Chem.(2016)293(28)10963–10974检查了BMP9的循环变体，并发现与其他BMP9变体相比，成熟BMP9仅占人血浆中总BMP9的0.5％。
人preproBMP10包含短信号肽(氨基酸1至21)，它被酶促切割以释放proBMP10，一种无活性的前体蛋白(人preproBMP10的氨基酸22至424)。proBMP10被蛋白酶切割，产生108aa的非糖基化C末端肽(～14kDa；BMP10、氨基酸317至424)和～50kDa的N末端前区段(氨基酸22至424，Susan-Resiga等人，J Biol Chem.2011 Jul 1；286(26):22785-94)。成熟的BMP10和BMP-10的N末端前区段均保持结构接近，形成BMP10的同二聚体或异二聚体，或与其他BMP家族蛋白组合(Yadin等人，CYTOGFR 2016,27(2016)13–34)。通过在两个结合配偶体的C末端肽中形成Cys-Cys桥或强粘附发生二聚化。因此，形成了由两个亚单元组成的架构。
US 8,287,868公开了一种分离的单克隆抗体，其与成熟的人源化或完全人抗体BMP10肽结合并与BMP10前肽竞争结合成熟的BMP10。针对BMP10或其前体的其他抗体公开于US 5,932,216中。
已经表明，BMP10在心血管发育(包括心肌细胞增殖和心脏大小调节、动脉导管闭合、血管生成和心室小梁形成)中发挥作用。
已发现参与组织修复调节的可溶性BMP10为心血管疾病也参与组织纤维化的诊断和治疗靶标(参见例如US2013209490)，并且BMP10参与血管纤维化和心脏纤维化已有描述。
US 2012/0213782公开了BMP10前肽可用于治疗心脏疾病。
BMP10的一般作用是用于血管重塑的发育调节中(Ricard等人，Blood.2012Jun21；119(25):6162–6171)。此外，BMP10是一种心脏发育因子(Huang等人，J ClinInvest.2012；122(10):3678-3691)并在心肌梗塞时诱导心肌细胞增殖(Sun等人，J CellBiochem.2014；115(11):1868-1876)。它也被描述为起源于内皮细胞(Jiang等人，JBC2016,291(6):2954–2966)。
转录组学分析表明，健康状况下的BMP10 mRNA在心脏右心房和右心耳中强烈表达。与左心耳相比，它主要在右侧表达(Kahr等人，Plos ONE,2010,6(10):e26389)。
在2019年8月29日至2019年9月2日在巴黎举行的ESC(欧洲心脏病学会)会议期间，Larissa Fabritz就心房颤动的生物标志物发表了演讲。提到的生物标志物之一是BMP(FP编号：2365)。
国际专利申请PCT/EP2019/072042公开了用于评定心房颤动的循环BMP10(骨形态发生蛋白10)。
需要可靠的方法来评定心房颤动，包括心房颤动的诊断，患有心房颤动患者的风险分层(诸如脑卒中的发生)，心房颤动严重程度的评定，以及患有心房颤动患者的治疗的评定。此外，需要可靠地评定心力衰竭。
Tillet等人(J.Biol.Chem.(2018)293(28)10963–10974)发现BMP9和BMP10的异二聚体负责血浆中发现的大部分生物BMP活性。然而，Tillet等人发现血浆中BMP10水平较低，表明血浆中存在掩蔽蛋白。
本发明的技术问题可以看作是提供满足上述需要的方法。本技术问题由权利要求书及下文所表征的实施例解决。
有利的是，在本发明的研究背景下发现，对来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量的确定允许改进对心房颤动和心力衰竭的评定。因此，它可以是例如诊断受试者是否患有心房颤动或心力衰竭，是否有患有与心房颤动相关的卒中的风险，或在治疗干预后是否有复发性Afib的风险。
此外，在本文所述的研究中显示，一种或多种BMP10-型肽的量与患者中白质病变(WML)的存在相关。由于WML程度可能由临床静息性卒中引起(Wang Y,Liu G,Hong D,ChenF,Ji X,Cao G.White matter injury in ischemic stroke.Prog Neurobiol.2016；141:45–60)，BMP10-型肽可用于评定白质病变的程度以及评定受试者过去是否经历过一次或多次静息性卒中，即临床静息性卒中。由于WML与痴呆症的预测风险相关，一种或多种BMP10-型肽也允许预测痴呆症，诸如血管性痴呆症和/或阿尔茨海默病。
有利地，在本文所述的研究中发现，与使用针对成熟BMP10激素本身的抗体相比，当使用针对人preproBMP10的氨基酸区域22至316(即针对BMP10的N末端前区段)的抗体时，在血液、血清或血浆样品中检测BMP10-型肽是最佳的。因此，使用结合在人preproBMP10的氨基酸区域22至316内而不是与成熟BMP10结合的检测剂，允许改进对心房颤动和心力衰竭的评定。此外，发明人已经鉴定了人preproBMP10的氨基酸区域22至316内的亚区域，这些亚区域是特别适合检测剂的靶区域。在这种情况下，鉴定出允许改进BMP10-型肽检测的抗体。抗体能够结合NT-proBMP10和包含诸如preproBMP10和proBMP10的NT-proBMP10片段的任何BMP10-型肽。
发明内容
本发明涉及用于评定受试者心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此评定心房颤动。
本发明进一步涉及辅助心房颤动的评定的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供来自受试者的至少一份样品，
b)在步骤a)中提供的至少一个样品中，确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量，以及任选地，确定选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
c)向医师提供关于确定的一种或多种BMP10-型肽的量的信息及任选地关于确定的至少一种其他生物标志物的量的信息，从而辅助对心房颤动的评定。
此外，本发明设想了辅助心房颤动的评定的方法，该方法包括：
a)提供对一种或多种BMP10-型肽的测定及任选地对选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的其他生物标志物的至少一种另外的测定，以及
b)提供关于在心房颤动的评定中使用通过所述测定获得或可获得的测定结果的说明。
此外，本发明涉及用于评定受试者的白质病变程度的方法，所述方法包括
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)根据在步骤a)中确定的量评定受试者的白质病变的程度。
此外，本发明涉及一种用于评定受试者是否经历过一次或多次静息性卒中的方法，所述方法包括
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，
b)将步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)评定受试者是否经历过一次或多次静息性卒中。
此外，本发明涉及一种用于预测受试者的痴呆症，诸如血管性痴呆症和/或阿尔茨海默病的方法，所述方法包括
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，
b)将步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)预测所述受试者患有痴呆症的风险。
本发明还考虑了一种在治疗干预之前采集的样品中预测在治疗干预(诸如肺静脉隔离(PVI)或心房颤动中的消融疗法)之后AFib复发风险的方法，包括：
a)提供对一种或多种BMP10-型肽的测定及任选地对选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的其他生物标志物的至少一种另外的测定，以及
b)提供关于在心房颤动的复发风险的评定中使用通过所述一种或多种测定获得或可获得的测定结果的说明。
本发明还涵盖用于评定心房颤动的计算机实现的方法，该方法包括：
a)在处理单元处接收一种或多种BMP10-型肽的量的值，以及任选地接收选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量的至少一个另外的值，其中所述一种或多种BMP10-型肽的量以及任选地至少一种其他生物标志物的量已经在来自受试者的样品中确定，
b)通过所述处理单元，将在步骤(a)中接收到的一个或多个值与一个或多个参考值进行比较，以及
c)基于比较步骤b)评定心房颤动。
本发明进一步涉及一种用于诊断心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤
(a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
(b)将一种或多种BMP10-型肽的量与BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此诊断心力衰竭。
本发明还涉及一种用于预测受试者因心力衰竭住院的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，
(b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，以及
(c)预测受试者因心力衰竭住院的风险。
在本发明方法的一个优选实施例中，对一种或多种BMP10-型肽的量的确定包括使样品与至少一种结合(即，能够结合)BMP10的N末端前区段(NT-proBMP10，有时也称为BMP10的N末端前结构域)的试剂接触。因此，它不应结合成熟的BMP10。因此，所述试剂结合在SEQID NO:1所示多肽的氨基酸区域22至316内(即，能够结合)。例如，使样品与至少一种结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域37至299内的试剂接触。
本发明还涉及一种用于确定一种或多种BMP10-型肽的量的方法，包括使含有一种或多种BMP10-型肽的样品与至少一种结合BMP10的N末端前区段的试剂接触的步骤，因此处于SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域22至316内，从而允许形成BMP10-型肽和至少一种试剂的复合物，并确定形成的复合物的量。
在一些实施例中，通过夹心免疫确定进行用于确定一种或多种BMP10-型肽的量的方法。
本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含至少一种与一种或多种BMP10-型肽特异性结合的试剂，诸如结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域22至316内的试剂，和至少一种选自由以下各项组成的组的其他试剂：特异性结合利钠肽的试剂、特异性结合ESM-1的试剂、特异性结合Ang2的试剂和特异性结合FABP3的试剂。
此外，本发明涉及以下各项的体外用途：
i)一种或多种BMP10-型肽和任选地至少一种选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的其他生物标志物，和/或
ii)与一种或多种BMP10-型肽特异性地结合的至少一种试剂，以及任选地，选自由以下各项组成的组的至少一种另外的试剂：与利钠肽特异性地结合的试剂、与ESM-1特异性地结合的试剂、与Ang2特异性地结合的试剂以及与FABP3特异性地结合的试剂，
用于评定心房颤动，用于预测卒中的风险，或用于诊断心力衰竭，或用于预测受试者因心力衰竭住院的风险。
在上述用途的一个优选实施例中，与一种或多种BMP10-型肽特异性结合的至少一种试剂是与NT-proBMP10结合的试剂，即，与SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域22至316结合的试剂。NT-proBMP10的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:6中。
本发明进一步提供结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域22至316内(即，能够结合)的试剂，诸如抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。
在一些实施例中，试剂是与包含在SEQ ID NO:1中所示多肽的氨基酸区域37至47中的表位(SLFGDVFSEQD,SEQ ID NO 2)结合的试剂。
在一些实施例中，试剂是与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域171至185中的表位(LESKGDNEGERNMLV,SEQ ID NO:3)结合的试剂，诸如与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域173至181中的表位(SKGDNEGER,SEQ ID NO:4)结合的试剂。
在一些实施例中，试剂是与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域291至299中的表位(SSGPGEEAL，SEQ ID NO:5)结合的试剂。
本发明还涉及一种结合一种或多种BMP10-型肽的抗体(诸如单克隆抗体)或其片段。
在一个实施例中，抗体或其片段包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域，其中重链可变结构域与包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14或15中所示序列(参见表A)的重链可变结构域至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，轻链可变结构域按递增的优先次序与包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23或24中所示序列(见表B)的轻链可变结构域至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同。
另外或可替代地，本发明的抗体或其片段包括
(a)轻链可变结构域，其包含：
(a1)表D中所示的轻链CDR1(并因此是选自SEQ ID NO:34-42的轻链CDR1序列)，
(a2)表D中所示的轻链CDR2(并因此是选自SEQ ID NO:52-60的轻链CDR2序列)，和
(a3)表D中所示的轻链CDR3(并因此是选自SEQ ID NO:70-78的轻链CDR3序列)，
以及
(b)重链可变结构域，其包含：
(b1)表C中所示的重链CDR1(并因此是选自SEQ ID NO:25-33的重链CDR1序列)，
(b2)表C中所示的重链CDR2(并因此是选自SEQ ID NO:43-51的重链CDR2序列)，和
(b3)表C中所示的重链CDR3(并因此是选自SEQ ID NO:61-69的重链CDR3序列)。
具体实施方式/定义
本发明涉及用于评定受试者心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量，以及
b)将BMP10-型肽的量与BMP10-型肽的参考量进行比较，由此评定心房颤动。
BMP10-型肽优选选自由以下各项组成的组：BMP10、BMP10的N末端前区段(N末端proBMP10)、proBMP10和preproBMP10。更优选地，BMP10-型肽选自由以下各项组成的组：BMP10的N末端前区段(N末端proBMP10)、proBMP10和preproBMP10。甚至更优选地，BMP10-型肽是proBMP10和/或N末端proBMP10。最优选地，BMP10-型肽是NT-proBMP10。
根据本发明，应确定一种或多种BMP10-型肽的量。如本文别处所述，优选使用至少一种结合NT-proBMP10或其特定亚区的试剂进行确定。因此，可以确定包含NT-proBMP10肽序列的所有BMP10-型肽(诸如proBMP10、preproBMP10和NT-proBMP10)的量(即，组合的)。因此，表述“确定一种或多种BMP10-型肽的量”优选是指确定具有包含NT-proBMP10氨基酸序列的氨基酸序列的多肽的组合量(即，量的总和)，特别是确定proBMP10、preproBMP10和NT-proBMP10的组合量(即，量的总和)。由于preproBMP10原则上不存在于许多样品中，因此该表述还可能指确定NT-proBMP10和proBMP10的总和。因此，确定NT-proBMP10和/或BMP10的量。
在本发明的方法的一个实施例中，该方法还进一步包括在步骤a)中确定来自受试者的样品中选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及在步骤b)中比较至少一种其他生物标志物的量与参考量。
因此，本发明涉及一种用于评定受试者的心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此评定心房颤动。
心房颤动(AF)的评定应基于比较步骤b)的结果。
因此，本发明优选地包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，以及
c)基于比较步骤b)的结果评定心房颤动。
根据本发明的方法包括基本上由上述步骤组成的方法或包括其他步骤的方法。此外，本发明的方法优选地是离体方法，更优选地是体外方法。此外，它还可以包括除上述明确提及的步骤之外的步骤。例如，其他步骤可涉及测定其他标志物和/或样品预处理或评估通过该方法获得的结果。该方法可以手动执行或由自动化辅助。优选地，步骤(a)、(b)和/或(c)可全部或部分地由自动化辅助，例如通过合适的机器人和感觉设备进行步骤(a)中的测定或步骤(b)中由计算机实现的计算。
根据本发明，应评定心房颤动。如本文所用，术语“评定心房颤动”优选地是指心房颤动的诊断，AF的最近发作的诊断，阵发性和持续性心房颤动之间的区分，与心房颤动相关的不良事件(诸如卒中和/或心房颤动的复发，诸如干预后AF的复发)的风险的预测，应当接受心电图(ECG)的受试者的鉴别，或心房颤动的治疗的评定。
如本领域技术人员应理解的，本发明的评定通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。该术语优选地要求能够对受试者的统计上显著部分进行正确的评定(诸如本文所述的治疗的诊断、区分、预测、鉴别或评定)。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden,Statisticsfor Research,John Wiley&Sons,New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.4、0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
根据本发明，表述“心房颤动的评定”被理解为对于心房颤动的评定的辅助，并且因此被理解为对于心房颤动的诊断的辅助，对于区分阵发性和持续性心房颤动的辅助，对于预测与心房颤动相关的不良事件的风险的辅助，对于鉴别应接受心电描记术(ECG)的受试者的辅助，或被理解为对于评定心房颤动的治疗的辅助。原则上，最终诊断将由医师进行。
在本发明的一个优选实施例中，心房颤动的评定是心房颤动的诊断。因此，诊断受试者是否患有心房颤动。
因此，本发明设想了一种用于诊断受试者的心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，由此诊断出心房颤动。
在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：
(a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
(b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此诊断出心房颤动。
优选地，与用于诊断心房颤动的方法相关的待测受试者是被怀疑患有心房颤动的受试者。然而，还设想，先前已经诊断出受试者患有AF，并且通过实施本发明的方法来确认先前的诊断。
在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是区分阵发性心房颤动与持续性心房颤动。因此，测定受试者患有阵发性还是持续性心房颤动。
因此，本发明设想了一种用于区分受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，由此区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动。
在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动。
在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是与心房颤动相关联的不良事件(诸如脑卒中)的风险的预测。因此，预测受试者有和/或没有所述不良事件的风险。
因此，本发明设想了一种用于预测受试者的与心房颤动相关联的不良事件的风险的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，由此预测与心房颤动相关联的不良事件的风险。
在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此预测与心房颤动相关联的不良事件的风险。
设想可以预测各种不良事件。要预测的优选不良事件是脑卒中。
因此，本发明特别设想一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，由此预测卒中的风险。
前述方法可以进一步包括基于步骤b)的比较结果来预测脑卒中的步骤c)。因此，步骤a)、b)、c)优选如下：
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，以及
c)基于步骤b)的比较结果预测脑卒中
在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是评定心房颤动的治疗。
因此，本发明设想了一种用于评定受试者的心房颤动的治疗的方法，该方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，由此评定心房颤动的治疗。
在一个实施例中，前述方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此评定用于心房颤动的疗法。
优选地，与前述区分、前述预测及心房颤动治疗的评定相关的受试者是患有心房颤动、特别是已知患有心房颤动(并因此具有已知心房颤动病史)的受试者。然而，对于上述预测方法，还设想受试者没有已知心房颤动病史。
在本发明的另一个优选实施例中，心房颤动的评定是鉴别应该接受心电图(ECG)检查的受试者。因此，鉴别是否应该接受心电图检查的受试者。
该方法可包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此鉴别出应当接受心电图的受试者。
优选地，与上述鉴别应该接受心电图检查的受试者的方法有关的受试者是没有已知心房颤动病史的受试者。在本文的别处定义了表达“没有已知心房颤动病史”。
在本发明的另一优选实施例中，心房颤动的评定是对受试者抗凝治疗的功效的评定。因此，评定了所述治疗的功效。
在本发明的另一优选实施例中，心房颤动的评定是对受试者脑卒中风险的预测。因此，预测本文所指的受试者是否处于脑卒中的风险中。
在本发明的另一优选实施例中，心房颤动的评定是鉴别受试者适合于施用至少一种抗凝药物或适合于增加至少一种抗凝药物的剂量。因此，评定受试者是否适合于所述施用和/或所述剂量增加。
在本发明的另一优选实施例中，心房颤动的评定是抗凝治疗的监测。因此，评定受试者是否对所述治疗有响应。
术语“心房颤动”(缩写为“AF或AFib”)在本领域中是众所周知的。如本文所用，该术语优选地指以心房不协调激活和随之导致心房机械功能恶化为特征的室上性快速心律失常。特别地，该术语指以快速且不规则的跳动为特征的不正常的心律。它涉及心脏的两个上腔室。在正常的心律中，窦房结产生的脉冲通过心脏传播，并引起心肌收缩和血液泵送。在心房颤动时，窦房结的规则电脉冲被无组织、快速的电脉冲所取代，该无组织、快速的电脉冲导致不规则的心跳。心房颤动的症状是心悸、晕厥、呼吸急促或胸痛。然而，大多数发作都没有症状。在心电图上，心房颤动的特征是用在振幅、形状和定时上变化的快速振荡或震颤波代替一致的P波，该振荡或震颤波与房室传导完整时的不规则、频繁的快速心室反应有关。
美国心脏病学会(ACC)、美国心脏病协会(AHA)和欧洲心脏病学会(ESC)提出了以下分类体系(参见Fuster V.等人,Circulation 2006；114(7):e257–354，本文件的全部内容通过引用合并于此，参见例如文件中的图3)：首次检测到AF、阵发性AF、持续性AF和永久性AF。
所有患有AF的人最初都属于被称为首次检测到AF的类别。然而，该受试者可能有或可能没有先前未被检测到的发作。如果AF持续超过一年，特别是不会发生(或仅在医疗干预下发生)窦性心律恢复，则受试者患有永久性AF。如果AF持续超过7天，则受试者患有持续性AF。该受试者可能需要药物或电干预来终止心房颤动。优选地，持续性AF在发作时发生，但心律失常不会自发(即在没有医学干预的情况下)恢复为窦性心律。阵发性心房颤动优选地指持续长达7天的间歇性心房颤动发作。在大多数阵发性AF的病例中，发作持续小于24小时。心房颤动发作是自发终止的，即在没有医学干预的情况下终止。因此，虽然阵发性心房颤动的发作优选自发终止，但是持续性心房颤动优选不自发终止。优选地，持续性心房颤动需要通过电复律或药理复律终止，或采用其他程序，诸如消融程序(Fuster V.等人,Circulation 2006；114(7):e257–354)终止。持续性AF和阵发性AF均可能复发，因此，通过ECG记录来区分阵发性AF和持续性AF：当患者已经发生2次或更多次发作时，AF被认为是复发性的。如果心律失常自发终止，则将AF、特别是复发性AF指定为阵发性的。如果AF持续超过7天，则将其指定为持续性的。
在本发明的一个优选实施例中，术语“阵发性心房颤动”定义为自发终止的AF发作，其中所述发作持续少于24小时。在一个替代性实施例中，自发终止的发作持续长达7天。
这里所指的“受试者”优选地是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。优选地，该受试者是人受试者。
优选地，待测受试者为任何年龄，更优选地，待测受试者为50岁或更高年龄，更优选60岁或更高年龄，且最优选65岁或更高年龄。进一步地，设想待测受试者为70岁或更高年龄。
此外，设想待测受试者为75岁或更高年龄。同样，该受试者可能在50岁与90岁之间。
在评定心房颤动的方法的优选实施例中，待测受试者应患有心房颤动。因此，受试者应具有已知心房颤动病史。因此，在获得测试样品之前，受试者应该经历过心房颤动发作，并且例如通过ECG应该已经诊断出先前的心房颤动发作中的至少一种。例如，设想如果心房颤动的评定是区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动，或者如果心房颤动的评定是预测与心房颤动相关联的不良事件的风险，或者如果心房颤动的评定是评定心房颤动的治疗，则受试者患有心房颤动。
在评定心房颤动的方法的另一个优选实施例中，例如，如果心房颤动的评定是诊断心房颤动或鉴别应该接受心电图(ECG)检查的受试者，则怀疑待测受试者患有心房颤动。
优选地，被怀疑患有心房颤动的受试者是在实施用于评定心房颤动的方法之前已经显示出心房颤动的至少一种症状的受试者。所述症状通常是短暂的，可能会在几秒钟内出现，并且可能会很快消失。心房颤动的症状包括头晕、昏厥、呼吸急促、特别是心悸。优选地，在获得样品之前的六个月内，受试者已经表现出至少一种心房颤动的症状。
替代地或另外地，被怀疑患有心房颤动的受试者应是70岁或更高年龄的受试者。
优选地，被怀疑患有心房颤动的受试者应没有已知心房颤动病史。
根据本发明，没有已知心房颤动病史的受试者优选是先前未诊断出患有心房颤动的受试者，即在实施本发明的方法之前(特别是在获得来自受试者的样品之前)。然而，该受试者可能已经具有或可能尚未具有先前未被诊断到的心房颤动发作。
优选地，术语“心房颤动”是指所有类型的心房颤动。因此，该术语优选涵盖阵发性心房颤动、持续性心房颤动或永久性心房颤动。
然而，在本发明的一个实施例中，待测受试者未患有永久性心房颤动。在该实施例中，术语“心房颤动”仅是指阵发性和持续性心房颤动。
然而，在本发明的另一实施例中，待测受试者不患有阵发性和永久性心房颤动。在该实施例中，术语“心房颤动”仅是指持续性心房颤动。
当获得样品时，待测受试者可能经历或可能没有经历心房颤动发作。因此，在评定心房颤动的一个优选实施例中(诸如在心房颤动的诊断中)，当获得样品时，受试者没有经历心房颤动发作。在该实施例中，当获得样品时，受试者应具有正常窦性心律(并且因此应当处于窦性心律)。因此，即使在ECG中(暂时)无心房颤动的情况下，也可以用生物标志物诊断心房颤动。根据本发明的方法，本文所述的生物标志物的升高应在心房颤动发作后得以保留，从而提供对患有心房颤动的受试者的诊断(“记忆效应”)。优选地，在实施本发明的方法之后(或者更确切地说，在获得样品之后)约三天内、约一周内、约一个月内、约三个月内或约6个月内诊断AF。在一个优选实施例中，发作后约六个月内诊断心房颤动是可行的。在一个优选实施例中，发作后约六个月内诊断心房颤动是可行的。因此，如本文提及的心房颤动的评定，特别是如本文提及的与心房颤动的评定相关的诊断、风险预测或区分优选地在心房颤动的最后一次发作之后约三天之后、更优选地约一个月之后、甚至更优选地约三个月之后、并且最优选约地六个月之后实施。因此，设想待测样品优选地在心房颤动的最后一次发作之后约三天之后、更优选地约一个月之后、甚至更优选地约三个月之后且最优选地约六个月之后获得。因此，心房颤动的诊断优选还包括心房颤动发作的诊断，这些发作优选在获得样品之前约三天内、更优选约一周内、甚至更优选约三个月内、并且最优选约六个月内发生。因此，本发明允许诊断AF的最近发作，诸如在实施本发明的方法之前约三天内、或更优选地约一周内发生的发作(或更准确地说，在获得待测样品之前)。此外，在实施本发明的方法之前大约两周可能已经发生了AF的最近发作。
因此，本发明允许辅助诊断处于窦性心律的受试者的心房颤动的最近发作，包括确定一种或多种BMP10-肽(和任选地，如所述的至少一种其他生物标志物)的量本文其他地方)，并将由此确定的量(或量)与参考量(或参考量)进行比较，从而辅助AF的最近的发作的诊断。在一个实施例中，所述受试者应被怀疑最近患有AF的发作，例如该受试者可以是最近已表现出AF症状的受试者(诸如在实施本发明的方法前三天、一周或两周内)。心房颤动的症状是心悸、晕厥、呼吸急促或胸痛。
然而，还设想，当获得样品时(例如，关于脑卒中的预测)，受试者经历心房颤动的发作。
术语“样品”是指体液样品、分离细胞样品或来自组织或器官样品。体液样品可以通过众所周知的技术获得，并且包括血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、痰、腹水，或任何其他身体分泌物或其衍生物的样品。组织或器官样品可以通过例如活检从任何组织或器官获得。分离细胞可以通过诸如离心或细胞分选等分离技术从体液或组织或器官中获得。例如，可以从表达或产生生物标志物的那些细胞、组织或器官中获得细胞、组织或器官样品。样品可以是冷冻、新鲜、固定(例如福尔马林固定)、离心和/或包埋(例如石蜡包埋)的等。在评定估样品中一种或多种生物标志物的量之前，细胞样品当然可以接受各种众所周知的收集后制备和贮存技术(例如核酸和/或蛋白质提取、固定、贮存、冷冻、超滤、浓缩、蒸发、离心等)。
在本发明的一个优选实施例中，样品是血液(即全血)、血清或血浆样品。血清是在使血液凝固后所获得的全血的液体级分。为了获得血清，通过离心去除血凝块并收集上清液。血浆是血液中无细胞的流体部分。为了获得血浆样品，将全血收集在抗凝处理过的试管(例如柠檬酸盐处理过的试管或EDTA处理过的试管)中。通过离心将细胞从样品中取出，并获得上清液(即血浆样品)。
如上所述，在获得样品时受试者可能处于窦性心律或可能患有AF心律发作。
BMP10-型肽在本领域是众所周知的。优选的BMP10-型肽例如公开于Susan-Resiga等人(J Biol Chem.2011 Jul 1；286(26):22785-94)，其通过引用整体并入本文(参见例如Susan-Resiga等人的图3A，或US2012/0213782)。
在一个实施例中，BMP10-型肽是未加工的preproBMP10(参见下面的SEQ ID NO:1)。在另一个实施例中，BMP10-型肽是前肽proBMP10。该标志物包括N末端前区段和BMP10。在另一个实施例中，BMP10-型肽是BMP10的N末端前区段(N末端proBMP10，或NT-proBMP10)。
在一个实施例中，BMP10-型肽是同二聚体或异二聚体复合物的一部分。
人preproBMP10(即，未加工的preproBMP10)的长度为424个氨基酸。人preproBMP10的氨基酸序列例如显示于SEQ ID NO:1或US2012/0213782的图3中，其通过引用整体并入本文。此外，preproBMP10的氨基酸序列可以通过Uniprot(参见登录号O95393-1下的序列)进行评定。
此外，人preproBMP10的氨基酸序列在本文的下文示出(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0003806278890000201
人preproBMP10包含短信号肽(氨基酸1至21)，它被酶促切割以释放proBMP10(在上述序列中，该信号肽以斜体表示)。因此，人proBMP10包含人preproBMP10(即，具有SEQ IDNO 1所示序列的多肽)的氨基酸22至424。人proBMP10被进一步切割成BMP10和活性形式的(非糖基化的)BMP10的N末端前区段。BMP10的N末端前区段包含具有SEQ ID NO 1所示序列的多肽(即人preproBMP10)的氨基酸22至316。NT-proBMP10的序列在上面的序列中以下划 线标出。因此，NT-proBMP10具有如下所示的序列(SEQ ID:6)：
SPIMNLEQSPLEEDMSLFGDVFSEQDGVDFNTLLQSMKDEFLKTLNLSDIPTQDSAKVDPPEYMLELYN KFATDRTSMPSANIIRSFKNEDLFSQPVSFNGLRKYPLLFNVSIPHHEEVIMAELRLYTLVQRDRMIYDGVDRKITI FEVLESKGDNEGERNMLVLVSGEIYGTNSEWETFDVTDAIRRWQKSGSSTHQLEVHIESKHDEAEDASSGRLEIDTS AQNKHNPLLIVFSDDQSSDKERKEELNEMISHEQLPELDNLGLDSFSSGPGEEALLQMRSNIIYDSTARIRR
BMP10包含具有SEQ ID NO 1所示序列(在上述序列中以粗体表示)的多肽的氨基酸317至424。
优选的BMP10-型肽是proBMP10和N末端proBMP10。在proBMP10切割后，BMP10和N末端proBMP10保持结构接近，形成BMP10的同二聚体或异二聚体，或与其他BMP家族蛋白组合(Yadin等人，CYTOGFR2016,27(2016)13–34)。通过在两个结合配偶体的C末端肽中形成Cys-Cys桥或强粘附发生二聚化。因此，形成了由两个亚单元组成的架构。
优选地，通过使用至少一种与BMP10-型肽特异性结合的试剂(诸如一种或多种与BMP10-型肽特异性结合的抗体(或其抗原结合片段))来确定BMP10-型肽的量。
如上所述，在本发明的基础研究中发现，与针对成熟的BMP10激素本身的抗体相比，当使用针对人preproBMP10的氨基酸区域22至316的抗体时，更好地检测BMP10-型肽。
因此，特别考虑通过使用至少一种结合BMP10的N末端前区段并因此结合SEQ IDNO:1的氨基酸区域22至316的试剂(即，其结合在具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽的氨基酸22至氨基酸316的氨基酸区域内)来确定一种或多种BMP10-型肽的量。因此，该试剂应结合该区域中包含的表位，诸如本文别处描述的或实施例12的表中所示的表位。
SEQ ID NO:1是人preproBMP10的序列。该序列在本文中用作参考序列。在本文中指出，该试剂应结合具有如SEQ ID NO:1所示序列的多肽内的某些区域，例如与SEQ ID NO:5的氨基酸区域37至299或区域171至185结合。这意味着该试剂将与BMP10-型中对应于这些区域的区域结合。例如，proBMP10和NT-proBMP10缺少人preproBMP10的前21个氨基酸。因此，该试剂与NT-proBMP10或proBMP10的氨基酸区域16至278和区域150至164结合
鉴定出特别适用于检测BMP10-型肽的SEQ ID NO:1的氨基酸区域22至316内的亚区。
在一个优选的实施例中，结合BMP10-型肽的至少一种试剂(诸如抗体或其片段)结合在SEQ ID NO:1的氨基酸区域37至299内，即所述至少一种试剂与包含在SEQ ID NO:1的从第37位氨基酸开始并以第299位氨基酸结束的区域中的表位结合。
在另一个优选的实施例中，至少一种试剂结合在SEQ ID NO:1的氨基酸区域110至200内，即，所述至少一种试剂与包含在该区域中的表位结合。
在另一个优选的实施例中，所述至少一种试剂结合在SEQ ID NO:1的氨基酸区域37至195内，诸如在氨基酸区域37至185内，即所述至少一种试剂与包含在该区域中的表位结合。
在另一个优选的实施例中，所述至少一种试剂结合在SEQ ID NO:1的氨基酸区域160至299内，诸如在氨基酸区域171至299内，即所述至少一种试剂与包含在该区域中的表位结合。
在另一个优选的实施例中，所述至少一种试剂结合在SEQ ID NO:1的氨基酸区域160至195内，诸如在氨基酸区域171至185内。
在进一步优选的实施例中，所述至少一种试剂与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域37至47中的表位(SLFGDVFSEQD,SEQ ID NO 2)结合。在一个实施例中，所述试剂的表位基本上由SLFGDVFSEQD(SEQ ID NO:2)组成。
在进一步优选的实施例中，所述至少一种试剂与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域171至185中的表位(LESKGDNEGERNMLV,SEQ ID NO:3)结合。例如，所述至少一种试剂与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域173至181中的表位(SKGDNEGER,SEQ ID NO:4)结合。在一个实施例中，所述试剂的表位基本上由SKGDNEGER(SEQ ID NO:4)组成。
在进一步优选的实施例中，所述至少一种试剂与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域291至299中的表位(SSGPGEEAL,SEQ ID NO:5)结合。在一个实施例中，所述试剂的表位基本上由SSGPGEEAL(SEQ ID NO:5)组成。
在一个优选的实施例中，可以使用特异性结合BMP10的N末端前区段的一种或多种抗体或其抗原结合片段。由于此类抗体(或片段)也将结合proBMP10和preproBMP10，所以可以在本发明方法的步骤a)中确定BMP10的N末端前区段、proBMP10和preproBMP10的量的总和。因此，表述“确定BMP10的N末端前区段的量”也应意指“确定BMP10的N末端前区段、proBMP10和preproBMP10的量的总和”。由于preproBMP10基本上不存在于许多样品中，因此该表达也可意指“确定BMP10的N末端前区段和preproBMP10的量的总和”。
例如，可以使用一种或多种特异性结合BMP10的抗体。由于此类抗体(或片段)也将结合proBMP10和preproBMP10，所以在本发明方法的步骤a)中确定BMP10、proBMP10和preproBMP10的量的总和。因此，表述“确定BMP10的量”也应意指“确定BMP10、proBMP10和preproBMP10的量的总和”。
此外，设想确定如上所述所有四种BMP10-型肽(即BMP10、BMP10的N末端前区段、proBMP10和preproBMP10)的量的总和。
因此，可以根据本发明确定以下BMP10-型肽的量：
·BMP10的量
·BMP10 N末端前区段的量
·proBMP10的量
·preproBMP10的量
·BMP10、proBMP10和preproBMP10量的总和
·BMP10的N末端前区段、proBMP10和preproBMP10的量的总和，或
·BMP10、BMP10的N末端前区段、proBMP10和preproBMP10的量的总和
具体而言，可以根据本发明确定以下BMP10-型肽的量：
·BMP10 N末端前区段的量
·proBMP10的量
·preproBMP10的量
·BMP10的N末端前区段、proBMP10和preproBMP10的量的总和，或
·BMP10的N末端前区段和proBMP10和preproBMP10的量的总和。
术语“利钠肽”包括心房利钠肽(ANP)型和脑利钠肽(BNP)型肽。因此，根据本发明的利钠肽包含ANP型和BNP型肽及其变体(参见例如Bonow RO.等人，Circulation 1996；93:1946-1950)。
ANP型肽包含pre-proANP、proANP、NT-proANP和ANP。
BNP型肽包含pre-proBNP、proBNP、NT-proBNP和BNP。
前体原肽(在pre-proBNP的情况下为134个氨基酸)包含短信号肽，其被酶裂解以释放前导肽(在proBNP的情况下为108个氨基酸)。将前导肽进一步裂解为N端前导肽(NT-pro肽，在NT-proBNP的情况下为76个氨基酸)和活性激素(在BNP的情况下为32个氨基酸，在ANP的情况下为28个氨基酸)。
根据本发明的优选的利钠肽是NT-proANP、ANP、NT-proBNP、BNP。ANP和BNP是活性激素，并且具有比其各自的非活性对应物NT-proANP和NT-proBNP更短的半衰期。BNP在血液中代谢，而NT-proBNP作为完整分子在血液中循环，因此被肾脏清除。
根据本发明的最优选的利钠肽是NT-proBNP和BNP，特别是NT-proBNP。如以上简要讨论的，根据本发明所指的人NT-proBNP是一种多肽，其优选包含对应于人NT-proBNP分子的N-末端部分的长度为76个的氨基酸。人BNP和NT-proBNP的结构已在现有技术中详细描述，例如，WO 02/089657、WO 02/083913和Bonow RO.等人，New Insights into thecardiac natriuretic peptides.Circulation 1996；93:1946-1950。优选地，本文所用的人NT-proBNP是如EP 0 648 228 B1中公开的人NT-proBNP。
如本文所用，术语“FABP-3”是指脂肪酸结合蛋白3。FABP-3又称心脏脂肪酸结合蛋白或心脏型脂肪酸结合蛋白(简称H-FABP)。优选地，该术语还包括FABP-3的变体。如本文所用，FABP-3优选涉及人FABP-3。编码人FABP-3多肽的多肽以及人FABP-3的蛋白质序列的DNA序列是本领域众所周知的，并且首先由Peeters等人(Biochem.J.276(Pt 1),203-207(1991))描述。此外，人H-FABP的序列可以优选地在Genbank条目U57623.1(cDNA序列)和AAB02555.1(蛋白质序列)中找到。FABP的主要生理功能被认为是转运游离脂肪酸，参见例如Storch等人，Biochem.Biophys.Acta.1486(2000),28-44。FABP-3和H-FABP的其他名称是：FABP-11(脂肪酸结合蛋白11)、M-FABP(肌肉脂肪酸结合蛋白)、MDGI(乳腺来源的生长抑制剂)和O-FABP。
生物标记物内皮细胞特异性分子1(缩写为ESM-1)是本领域众所周知的。生物标记物通常也被称为endocan。ESM-1是分泌蛋白，其主要在人肺和肾组织的内皮细胞中表达。公共领域数据表明，甲状腺、肺和肾中也表达，但在心脏组织中也表达，参见例如蛋白Atlas数据库中ESM-1的条目(Uhlén M.等人，Science 2015；347(6220):1260419)。该基因的表达受细胞因子调节。ESM-1是由20kDa成熟多肽和30kDa O-连接的聚糖链构成的蛋白聚糖(Bechard D等人，J Biol Chem 2001；276(51):48341-48349)。在本发明的一个优选实施例中，在来自受试者的样品中测定人ESM-1多肽的量。人ESM-1多肽的序列是本领域众所周知的(例如参见Lassale P.等人，J.Biol.Chem.1996；271:20458-20464并且可以例如通过Uniprot数据库进行评定，参见条目Q9NQ30(ESM1_HUMAN)。通过选择性剪接产生ESM-1的两种同工型，即同工型1(具有Uniprot标识符Q9NQ30-1)和同工型2(具有Uniprot标识符Q9NQ30-2)。同工型1的长度为184个氨基酸。在同工型2中，缺少同工型1的氨基酸101至150。氨基酸1至19形成信号肽(可能会被裂解)。
在一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-1所示的序列的同工型1的量。
在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型2、即具有如UniProt登录号Q9NQ30-2所示的序列的同工型2的量。
在另一个优选实施例中，测定ESM-1多肽的同工型1和同工型2、即总ESM-1的量。
例如，可以用针对ESM-1多肽的氨基酸85至184的单克隆抗体(诸如小鼠抗体)和/或用山羊多克隆抗体测定ESM-1的量。
生物标记物血管生成素-2(缩写为“Ang-2”，通常也称为ANGPT2)在本领域中是众所周知的。其为Ang-1和TIE2两者的天然存在的拮抗剂(参见例如Maisonpierre等人，Science 277(1997)55-60)。在没有ANG-1的情况下，该蛋白可诱导TEK/TIE2的酪氨酸磷酸化。在没有血管生成诱导因子(诸如VEGF)的情况下，ANG2介导的细胞基质接触的松动可诱导内皮细胞凋亡，以及随之发生的血管退行。通过与VEGF的配合，其可促进内皮细胞的迁移和增殖，从而作为允许性血管生成信号。人类血管生成素的序列在本领域中是众所周知的。Uniprot列出了血管生成素-2的三种同种型：同种型1(Uniprot标识符：O15123-1)、同种型2(标识符：O15123-2)和同种型3(O15123-3)。在一个优选实施例中，测定血管生成素-2的总量。总量优选为复合和游离血管生成素-2的量之和。
生物标志物的量的确定
术语“确定”如本文所述的生物标志物(诸如一种或多种BMP10-型肽或利钠肽)的量是指生物标志物的量化，例如使用本文别处描述的适当检测方法来测量样品中生物标志物的水平。术语“测量”和“测定”在本文中可互换使用。
在一个实施例中，生物标志物的量的确定包括：使样品与特异性地结合生物标志物的试剂(诸如本发明的抗体)接触，由此在该试剂与所述生物标志物之间形成复合物，检测所形成的复合物的量，并由此测量所述生物标志物的量。该确定可以进一步包括使样品与第二试剂接触等的步骤。
本文提及的生物标志物(诸如一种或多种BMP10-型肽)可以使用本领域中一般已知的方法来检测。检测方法通常包括量化样品中生物标志物的量的方法(定量方法)。本领域技术人员通常已知以下方法中的何种适合于生物标志物的定性和/或定量检测。可以使用商购可得的Western和免疫测定，如ELISA、RIA、基于荧光和发光的免疫测定和邻近延伸测定法来方便地测定样品中的例如蛋白质。检测生物标志物的其他合适方法包括测量肽或多肽特有的物理或化学性质，诸如其精确的分子质量或NMR谱。所述方法包括，例如生物传感器、耦合到免疫测定的光学装置、生物芯片、分析装置(诸如质谱仪、NMR分析仪或色谱装置)。进一步地，方法包括基于微板ELISA的方法、全自动或机器人免疫测定(例如在ElecsysTM分析仪上可用)、CBA(例如在Roche-HitachiTM分析仪上可用的酶钴结合测定)和乳胶凝集测定(例如在Roche-HitachiTM分析仪上可用)。
对于本文所述的生物标志物蛋白的检测，可以使用这种检定形式的各种免疫测定技术，参见例如美国专利号4016043、4424279和4018653。这些技术包括非竞争性类型的单位点和双位点或“夹心”测定，以及传统的竞争性结合测定。这些测定还包括标记抗体与靶标生物标志物的直接结合。
采用电化学发光标签的方法是众所周知的。此类方法利用特殊金属复合物的借助于氧化实现激发态的能力，所述特殊金属复合物从该激发态衰变为基态，从而发出电化学发光。关于综述请参见Richter,M.M.,Chem.Rev.2004；104:3003-3036。
在一个实施例中，用于测量生物标志物的量的抗体(或其抗原结合片段)被钌化或铱化。因此，抗体(或其抗原结合片段)应包含钌标签。在一个实施例中，所述钌标签是联吡啶钌-(II)复合物。替代性地，抗体(或其抗原结合片段)应包含铱标签。在一个实施例中，所述铱标签是如WO2012/107419中所公开的复合物。
在用于确定一种或多种BMP10-型肽的夹心测定的一个实施例中，该测定包含特异性结合一种或多种BMP10-型肽的生物素化的第一单克隆抗体(或其片段)和钌化的第二单克隆抗体(或其片段)。两种抗体与样品中的一种或多种BMP10-型肽形成夹心免疫测定复合物。
测量多肽(诸如BMP10-型肽或利钠肽)的量可优选地包括以下步骤：(a)将多肽与特异性地结合所述多肽的试剂接触，(b)(任选地)移除未结合的试剂，(c)测量结合的结合试剂的量，即在步骤(a)中形成的试剂的复合物的量。根据一个优选实施例，所述接触、移除和测量步骤可由分析器单元执行。根据一些实施例，所述步骤可由所述系统的单个分析器单元或由彼此可操作通信的多于一个分析器单元来执行。例如，根据一个特定实施例，本文所公开的所述系统可包括用于执行所述接触和移除步骤的第一分析器单元；以及第二分析器单元，所述第二分析器单元通过传输单元(例如，机械臂)可操作地连接到所述第一分析器单元，所述第二分析器单元执行所述测量步骤。
特异性地结合生物标志物的试剂(在此也称为“结合试剂”)可以共价或非共价地耦合到标签，从而允许检测和测量结合的试剂。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标签直接(共价或非共价)耦合到结合试剂。间接标记涉及二级结合试剂与第一结合试剂的结合(共价或非共价)。该二级结合试剂应特异性地与第一结合试剂结合。所述二级结合试剂可以与适当的标签耦合，并且/或者是三级结合试剂的与二级结合试剂结合的靶标(受体)。合适的二级和更高阶的结合试剂可包括抗体、二抗和众所周知的链霉亲和素-生物素体系(Vector Laboratories,Inc.)。结合试剂或底物也可以用本领域已知的一个或多个标签“标记”。此类标签可以是更高阶的结合试剂的靶标。合适的标签包括生物素、洋地黄毒苷、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，该标签优选地位于N-末端和/或C-末端。合适的标签是可通过合适的检测方法检测到的任何标签。典型的标签包括金颗粒、乳胶珠粒、吖啶酯(acridan ester)、鲁米诺、钌复合物、铱复合物、酶活性标签、放射性标签、磁性标签(“例如磁珠”，包括顺磁标签和超顺磁标签)和荧光标签。酶活性标签包括例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶，以及它们的衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP(4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐，可作为现成储备溶液从Roche Diagnostics购得)、CDP-StarTM(AmershamBio-sciences)、ECFTM(Amersham Biosciences)。合适的酶-底物组合可产生有色反应产物、荧光或化学发光，所述有色反应产物、荧光或化学发光可根据本领域已知的方法(例如使用感光胶片或合适的摄像系统)来测定。对于酶反应的测量，上述给定的标准类似地适用。典型的荧光标记包括荧光蛋白(诸如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克萨斯红、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。进一步的荧光标签可从Molecular Probes(Oregon)购得。同样，还考虑使用量子点作为荧光标签。放射性标签可以通过任何已知且适当的方法检测，所述方法为例如感光胶片或磷光成像仪。
多肽的量也可以优选地如下测定：(a)将包含如本文别处所述的多肽的结合试剂的固体支持物与包含所述肽或多肽的样品接触，以及(b)测量与支持物结合的肽或多肽的量。制造支持物的材料在本领域中是众所周知的，并且尤其包括商用柱材料、聚苯乙烯珠粒、乳胶珠粒、磁性珠粒、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维带、膜、片材、耐久细胞(duracytes)、反应盘的孔和壁、塑料管等。
在另一方面中，在测量形成的复合物的量之前，从结合试剂与至少一种标志物之间形成的复合物中移除样品。因此，在一个方面中，该结合试剂可固定在固体支持物上。在另一方面中，通过应用洗涤溶液，可以从固体支持物上形成的复合物中移除样品。
“夹心测定”是最有用和最常用的测定之一，包括夹心测定技术的许多变型。简单地说，在典型的测定中，未标记的(捕获)结合试剂被固定或可以固定在固体底物上，并且使待测样品与捕获结合试剂接触。在适当的孵育期后，在一段时间足以允许形成结合试剂-生物标志物复合物，然后添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的第二(检测)结合试剂，以及孵育允许足以形成结合试剂-生物标志物-标记的结合试剂的另一复合物的时间。可将任何未反应的材料洗去，并且通过观察由与检测结合试剂结合的报告分子产生的信号来测定生物标志物的存在。结果可以通过简单观察可见信号来定性，或者可以通过与含有已知量的生物标志物的对照样品进行比较来量化。
典型夹心测定的孵育步骤可以根据需要和在适当时进行变化。此类变化包括例如同时孵育，其中将两种或更多种结合试剂和生物标志物共孵育。例如，将待分析的样品和标记的结合试剂同时添加到固定的捕获结合试剂中。也可以首先孵育待分析的样品和标记的结合试剂，然后添加结合到固相或能够结合到固相的抗体。
特定结合试剂与生物标志物之间形成的复合物应与样品中存在的生物标志物的量成比例。应理解的是，将要应用的结合试剂的特异性和/或敏感性限定了样品中包含的能够被特异性地结合的至少一种标志物的比例程度。也可在本文别处找到关于可以如何进行测量的进一步细节。形成的复合物的量应转化为生物标志物的量，从而反映样品中真实存在的量。
术语“结合试剂”、“特异性结合试剂”、“分析物特异性结合试剂”、“检测剂”和“与生物标志物特异性地结合的试剂”在本文中可互换使用。优选地，它涉及这样的试剂，所述试剂包含特异性地结合对应的生物标志物的结合部分。“结合试剂”、“检测剂”、“试剂”的实例是核酸探针、核酸引物、DNA分子、RNA分子、适体、抗体、抗体片段、肽、肽核酸(PNA)或化合物。优选的试剂是特异性地结合待测定生物标志物的抗体。本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性(即其抗原结合片段)即可。优选地，该抗体是多克隆抗体(或其抗原结合片段)。更优选地，抗体是单克隆抗体(或来自其的抗原结合片段)。因此，如本文别处所述，设想使用在一种或多种BMP10-型肽的不同位置处结合的两种单克隆抗体(在夹心免疫测定中)。因此，将至少一种抗体用于确定BMP10-型肽的量。
在一个实施例中，至少一种抗体是小鼠单克隆抗体。在另一个实施例中，至少一种抗体是兔单克隆抗体。在又一个实施例中，抗体是山羊多克隆抗体。在又一个实施例中，抗体是绵羊多克隆抗体。
在一些实施例中，特异性结合BMP10-型肽的至少一种抗体或其片段是在下一节中描述的至少一种抗体或其片段(标题为“本发明的抗体”)。
如本文所用的术语“量”包括本文提及的生物标志物(诸如一种或多种BMP10-型肽或利钠肽)的绝对量、所述生物标志物的相对量或浓度，以及与其相关或可从其导出的任何值或参数。此类值或参数包括来自通过直接测量从所述肽获得的所有具体物理或化学性质的强度信号值，例如质谱或NMR谱中的强度值。此外，所包含的是通过在本说明书别处指定的间接测量获得的所有值或参数，例如，响应于肽或从特异性地结合的配体获得的强度信号而从生物读出系统测定的反应量。应理解的是，与上述量或参数相关的值也可以通过所有标准数学运算获得。
如本文所用，术语“比较”是指将来自受试者的样品中的生物标志物(诸如一种或多种BMP10-型肽以及利钠肽，诸如NT-proBNP或BNP)的量与本说明书其他地方指定的生物标志物的参考量进行比较。应理解的是，如本文所用的比较通常指对应的参数或值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量进行比较，而将浓度与参考浓度进行比较，或将从样品中的生物标志物获得的强度信号与从第一样品获得的相同类型的强度信号进行比较。可手动或计算机辅助进行比较。因此，可以由计算装置进行比较。例如，可以将来自受试者的样品中生物标志物的测定或检测量的值与参考量相互比较，并且可以由执行比较算法的计算机程序自动执行所述比较。执行所述评估的计算机程序将以适当的输出格式提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。对于计算机辅助比较，可将所测定的量的值与由计算机程序存储在数据库中的与适当参考相对应的值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即以适当的输出格式自动提供所需的评定。
根据本发明，将一种或多种BMP10-型肽的量和任选地至少一种其他生物标志物(诸如利钠肽)的量与参考值进行比较。参考优选为参考量。术语“参考量”被技术人员很好地理解。应该理解，参考量应允许本文所述的心房颤动评定。例如，关于用于诊断心房颤动的方法，参考量优选地指这样的量，所述量允许将受试者分配到(i)患有心房颤动的受试者的组，或(ii)未患有心房颤动的受试者的组。可从要与测试样品一起(即同时或随后)分析的第一样品确定适当的参考量。
应当理解，将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，而将至少一其他生物标志物(诸如利钠肽)的量与所述至少一种其他生物标志物(诸如利钠肽)的参考量进行比较。如果确定了两种或更多种标记物的量，则还可以设想基于两种或更多种标记物的量(诸如一种或多种BMP10-型肽的量和利钠肽的量)来计算综合得分。在随后的步骤中，将评分与参考评分进行比较。
原则上，可以基于给定生物标志物的平均值或均值，通过施加标准统计方法来计算如上文所指定的受试者同期群的参考量。特别地，测试(诸如旨在诊断发生事件或未发生事件的方法)的准确性通过其接收器操作特性(ROC)而被最好地描述(特别地参见ZweigMH.等人，Clin.Chem.1993；39:561-577)。ROC曲线图是在观察到的整个数据范围内连续改变决策阈值所产生的所有敏感性对比特异性对的曲线。诊断方法的临床性能取决于其准确性，即其能够正确地将受试者分配到某一预后或诊断中。ROC曲线通过将适用于区分的整个阈值范围的敏感性对比1-特异性绘制成曲线而显示了两种分布之间的重叠。y轴上是敏感性，即真阳性分数，其被定义为真阳性测试结果数与真阳性测试结果数和假阴性测试结果数之积的比率。其仅从受影响的子组计算。x轴上是假阳性分数，即1-特异性，其被定义为假阳性结果数与真阴性结果数和假阳性结果数之积的比率。这是一个特异性指数，并且完全由未受影响的子组计算得出。由于真阳性分数和假阳性分数是完全分开计算的，所以通过使用来自两个不同子组的测试结果，ROC曲线与同期群中事件的患病率无关。ROC曲线上的每一点代表与特定决策阈值对应的敏感性/1-特异性对。有完全区别(两种结果分布没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数为1.0或100％(完全敏感性)，并且假阳性分数为0(完全特异性)。无区别(两个组的结果分布相同)的测试的理论曲线是从左下角到右上角的45°对角线。大多数曲线落在这两个极端之间。如果ROC曲线完全落到低于45°对角线，则可以通过将“阳性”的标准从“大于”逆转为“小于”或反之亦然来轻松纠正。定性地，曲线越接近左上角，则测试的总体准确度就越高。根据期望的置信区间，可以从ROC曲线导出阈值，从而允许分别在适当的敏感性和特异性平衡下对给定事件进行诊断。因此，优选地，通过建立如上所述的所述同期群的ROC并由此导出阈值量，可以生成用于本发明方法的参考，即允许评定心房颤动的阈值。根据诊断方法所需的敏感性和特异性，ROC曲线允许得出合适的阈值。应理解的是，最佳敏感性是例如排除患有心房颤动的受试者(即排除)所需的，而最佳特异性是针对据评定患有心房颤动的受试者(即确定)设想的。在一个实施例中，本发明的方法允许预测受试者有与心房颤动相关联的不良事件的风险，诸如心房颤动和/或脑卒中的发生或复发。
在一个优选实施例中，本文的术语“参考量”是指预定值。所述预定值应允许评定心房颤动，从而诊断心房颤动，区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动，预测与心房颤动相关联的不良事件的风险，鉴别应该接受心电图(ECG)检查的受试者，或评定心房颤动的治疗。应当理解，参考量可以基于评定的类型而不同。例如，用于区分AF的一种或多种BMP10-型肽的参考量通常将高于用于诊断AF的参考量。然而，技术人员将考虑到这一点。
如上所述，术语“评定心房颤动”优选地指诊断心房颤动的诊断，阵发性心房颤动和持续性心房颤动之间的区分，与心房颤动相关联的不良事件的风险的预测，应该接受心电图(ECG)检查的受试者的鉴别，或心房颤动治疗的评定。在下文中，将更详细地描述本发明的方法的这些实施例。以上的定义相应地适用。
用于诊断心房颤动的方法
如本文所用的术语“诊断”是指评定根据本发明的方法所指的受试者是否患有心房颤动(AF)。在一个优选实施例中，诊断出受试者患有阵发性AF。在一个替代性实施例中，诊断出受试者未患有AF。
根据本发明，可以诊断所有类型的AF。因此，心房颤动可以是阵发性AF、持续性AF或永久性AF。优选地，特别是在未患有永久性AF的受试者中，诊断出阵发性或持续性心房颤动。
对受试者是否患有AF的实际诊断可以包括其他步骤，诸如确认诊断(例如，通过诸如Holter-ECG的ECG确认)。因此，本发明允许评定患者患有心房颤动的可能性。一种或多种BMP10-型肽的量高于参考量的受试者可能患有心房颤动，而一种或多种BMP10-型肽的量低于参考量的受试者不太可能患有心房颤动。因此，在本发明的上下文中，术语“诊断”还涵盖帮助医师评定受试者是否患有心房颤动。
优选地，来自测试受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或与多种参考量)相比增加指示受试者患有心房颤动，和/或来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或多种参考量)相比减少指示受试者未患有心房颤动。
在一个优选的实施例中，参考量，即一种或多种BMP10-型肽的参考量，以及如果确定的话，至少一种其他生物标志物的参考量，应允许区分患有心房颤动的受试者和不患有心房颤动的受试者。优选地，所述参考量是预定值。
在一个实施例中，本发明的方法允许诊断患有心房颤动的受试者。优选地，如果一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)高于参考量，则受试者患有AF。在一个实施例中，如果一种或多种BMP10-型肽的量高于参考量的特定百分位数(例如，第99个百分位数)参考上限(URL)，则受试者患有AF。
在诊断心房颤动的方法的一个实施例中，所述方法进一步包括基于诊断结果推荐和/或启动心房颤动治疗的步骤。优选地，如果诊断出受试者患有AF，则推荐或开始治疗。用于心房颤动的优选疗法在本文其他地方公开(诸如抗凝治疗)。
用于区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动的方法
如本文所用的术语“区分”是指区分受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动。如本文所用的术语优选包括区分地诊断受试者的阵发性心房颤动和持续性心房颤动。因此，本发明的方法允许评定患有心房颤动的受试者是患有阵发性心房颤动还是持续性心房颤动。实际的区分可以包括其他步骤，诸如区分的确认。因此，在本发明的上下文中，术语“区分”还涵盖帮助医师区分阵发性AF和持续性AF。
优选地，来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或与多种参考量)相比增加指示受试者患有持续性心房颤动，和/或来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或多种参考量)相比减少指示受试者患有阵发性心房颤动。在两种AF类型(阵发性和持续性)中，与非AF受试者的参考量相比，BMP10-型肽的量增加。
在一个优选实施例中，参考量应允许区分阵发性心房颤动的受试者和持续性心房颤动的受试者。优选地，所述参考量是预定值。
在区分阵发性心房颤动和持续性心房颤动的上述方法的一个实施例中，受试者未患有永久性心房颤动。
用于预测与心房颤动相关联的不良事件风险的方法
本发明的方法还设想了一种用于预测不良事件风险的方法。
在一个实施例中，本文所述的不良事件风险可以是与心房颤动相关联的任何不良事件的预测。优选地，所述不良事件选自心房颤动的复发(例如心脏复律后的心房颤动的复发)和脑卒中。因此，应预测受试者(患有心房颤动的患者)将来患有不良事件(诸如脑卒中或心房颤动复发)的风险。
此外，设想与心房颤动相关联的所述不良事件是没有已知心房颤动病史的受试者的心房颤动的发生。
在一个特别优选实施例中，预测脑卒中的风险。
因此，本发明涉及一种用于预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，由此预测卒中的风险。
具体的见，本发明涉及预测受试者的脑卒中风险的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
(b)将一种或多种BMP10-型肽的量与BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此预测卒中的风险。
此外，设想预测心脏复律后受试者心房颤动复发的风险，例如预测肺静脉隔离或消融疗法后心房颤动复发的风险。因此，如本文所述的生物标志物被用作在治疗干预(诸如肺静脉隔离和消融疗法)之后心房颤动复发的预测因子。此类手术的治疗成功率取决于消融策略和患者特征，据报道持续性AF的治疗成功率为50％至60％(J Am HeartAssoc.2013；2:e004549)。在该实施例中，设想受试者应在治疗干预之前进行分析，即，待测试的受试者在测试时，即在获得样品时患有AF发作。根据该实施例，一种或多种生物标志物的量应在(计划的)干预之前，优选地，计划的干预之前一个月，更优选地(计划的)干预之前的一周，最优选地在(计划的)干预之前的一天在已经获得的样品中确定。因此，可以在治疗前使用生物标志物预测AF复发风险。根据本发明的方法，如本文所指的生物标志物的升高应有助于在治疗干预后将具有高风险和低风险的复发性AFib的受试者分层。根据检测或预测的风险，可以对一些成功概率低的患者与成功概率高的患者区别治疗，这取决于手术前测量的作为PVI或消融后AF复发的预测因子的血液生物标志物。
优选地，如本文所用的术语“预测风险”是指评定受试者将患有本文所指的不良事件(例如，脑卒中的不良事件)的概率。典型地，预测受试者是有患有所述不良事件的风险(因此风险升高)还是没有患有所述不良事件的风险(因此风险降低)。因此，本发明的方法允许区分有患有所述不良事件的风险的受试者和没有患有所述不良事件的风险的受试者。进一步地，设想本发明的方法允许区分降低的、平均的或升高的风险的受试者。
如上所述，应预测在一定时间窗口内患有所述不良事件的风险(和概率)。在本发明优选实施例中，预测窗口为约三个月、约六个月或特别是约一年的时段。因此，预测短期风险。
在另一个优选实施例中，预测窗口为约五年的时段(例如，用于预测脑卒中)。此外，预测窗口可为约六年(例如用于预测脑卒中)的时段。或者，预测窗口可以是约10年。此外，设想预测窗口为1年至3年的时段。因此，预测在1至3年内患脑卒中的风险。此外，设想预测窗口为1年至10年的时段。因此，可以预测在1至10年内患脑卒中的风险。
优选地，从本发明的方法的完成起计算所述预测窗口。更优选地，从获得待测样品的时间点计算所述预测窗口。如本领域技术人员应理解的，风险的预测通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。然而，该术语要求能够以适当且正确的方式对受试者的统计上显著部分进行预测。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden,Statistics for Research,JohnWiley&Sons,New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
在一个优选实施例中，“预测患有所述不良事件的风险”的表述是指要通过根据本发明的方法分析的受试者被分配到有患有所述不良事件的风险的受试者组中，或被分配到没有患有所述不良事件(诸如，脑卒中)的风险的受试者组中。因此，可以预测受试者是否有患有所述不良事件的风险。如本文所使用的，“有患有所述不良事件的风险的受试者”优选地具有升高的患有所述不良事件的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是升高的。如本文所用的，“没有患有所述不良事件的风险的受试者”优选地具有降低的患有所述不良事件的风险(优选在预测窗口内)。优选地，与受试者同期群中的平均风险相比，所述风险是降低的。优选在约一年的预测窗口内，具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有至少20％或更优选至少30％的患有所述不良事件(诸如，心房颤动的复发或发生)的风险。优选在一年的预测窗口内，不具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有低于12％，更优选低于10％的患有所述不良事件的风险。
关于脑卒中的预测，优选在约五年、或者特别约六年的预测窗口内，具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有至少10％或更优选至少13％的患有所述不良事件的风险。优选在约五年、或者特别约六年的预测窗口内，不具有患有所述不良事件的风险的受试者优选具有低于10％，更优选低于8％，或者最优选低于5％的患有所述不良事件的风险。如果受试者未接受抗凝治疗，则风险可能更高。技术人员将考虑到这一点。
优选地，来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或与多种参考量)相比增加指示受试者存在患有与心房颤动相关的不良事件的风险，和/或来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或多种参考量)相比减少指示受试者不存在患有与心房颤动相关的不良事件的风险。
在优选实施例中，一种参考量(或多种参考量)应当允许区分存在患有如本文所提及的不良事件的风险的受试者和不存在患有所述不良事件的风险的受试者。优选地，所述参考量是预定值。
待预测的不良事件优选地是脑卒中。术语“脑卒中”在本领域是众所周知的。如本文所用，该术语优选地是指缺血性脑卒中，特别是指脑缺血性脑卒中。通过本发明的方法预测的脑卒中应为由于流向大脑或其部分的血流量减少所致，该血流量减少导致脑细胞供氧不足。特别地，由于脑细胞死亡，脑卒中会导致不可逆转的组织损伤。脑卒中的症状在本领域是众所周知的。例如，脑卒中症状包括面部、手臂或腿部突然麻木或无力，特别是在身体的一侧，突然意识混乱，说话或理解困难，一只或两只眼睛突然看不到，以及突然行走困难，头晕，失去平衡或协调。缺血性脑卒中可能为由动脉粥样硬化血栓形成或大脑主动脉栓塞、由凝血障碍或非肿瘤性血管疾病、或由导致总血流量减少的心脏缺血引起的。缺血性脑卒中优选地选自由动脉粥样硬化性血栓性脑卒中、心脏栓塞性脑卒中和腔隙性脑卒中组成的组。优选地，要预测的脑卒中为急性缺血性脑卒中，特别是心脏栓塞性脑卒中。心房颤动可以引起心脏栓塞性脑卒中(通常也称为栓塞性或血栓栓塞性脑卒中)。
优选地，所述脑卒中应与心房颤动相关联。更优选地，脑卒中应由心房颤动引起。但是，还可以设想该受试者没有心房颤动的病史。
优选地，如果脑卒中与心房颤动的发作之间存在时间关系，则脑卒中与心房颤动相关联。更优选地，如果脑卒中由心房颤动引起，则脑卒中与心房颤动相关联。最优选地，如果脑卒中可以由心房颤动引起，则脑卒中与心房颤动相关联。例如，心房颤动可引起心源性脑卒中(通常也称为栓塞性或血栓栓塞性脑卒中)。优选地，与AF相关的脑卒中可以通过口服抗凝作用来预防。同样优选地，如果待测受试者患有心房颤动和/或具有已知心房颤动病史，则认为脑卒中与心房颤动相关联。同样，在一个实施例中，如果怀疑受试者患有心房颤动，则可认为脑卒中与心房颤动相关联。
术语“脑卒中”优选地不包括出血性脑卒中。
在预测不良事件(诸如脑卒中)的前述方法的一个优选实施例中，待测受试者患有心房颤动。更优选地，受试者具有已知心房颤动病史。根据用于预测不良事件的方法，受试者优选患有永久性心房颤动，更优选患有持续性心房颤动，最优选患有阵发性心房颤动。
在预测不良事件的方法的一个实施例中，患有心房颤动的受试者在获得样品时经历心房颤动发作。在预测不良事件的方法的另一个实施例中，患有心房颤动的受试者在获得样品时没有经历心房颤动发作(因此应当具有正常的窦性心律)。此外，要预测其风险的受试者可能正在接受抗凝治疗。
在预测不良事件的方法的另一个实施例中，待测受试者没有已知心房颤动病史。特别地，设想受试者未患有心房颤动。
根据本发明的方法可以辅助个性化医疗。在一个优选实施例中，用于预测受试者的脑卒中风险的方法进一步包括如果已确定受试者有脑卒中风险i)建议抗凝疗法的步骤，或ii)建议强化抗凝疗法的步骤。在一个优选实施例中，用于预测受试者的脑卒中风险的方法进一步包括如果已确定该受试者有脑卒中风险(通过本发明的方法)i)开始抗凝疗法的步骤，或ii)强化抗凝疗法。
如果测试受试者正在接受抗凝治疗，并且如果已经确定该受试者没有脑卒中的风险(通过本发明的方法)，则可以减少抗凝治疗的剂量。因此，可以建议减少剂量。通过减少剂量，可以减少患有副作用(诸如出血)的风险。
如本文所用的术语“建议”是指建立可以应用于受试者的疗法的提议。然而，应该理解的是该术语并不包括应用实际疗法。建议的疗法取决于通过本发明的方法提供的结局。
特别地，以下规定适用：
如果待测受试者未接受抗凝疗法，则如果已确定受试者有脑卒中风险，就建议开始抗凝疗法。因此，应开始抗凝疗法。
如果待测受试者已接受抗凝疗法，则如果已确定受试者有脑卒中风险，就建议加强抗凝疗法。因此，应加强抗凝疗法。
在一个优选实施例中，通过增加抗凝剂的剂量(即，当前施用的凝结剂的剂量)来加强抗凝疗法。
在一个特别优选实施例中，通过增加使用更有效的抗凝剂替换当前施用的抗凝剂来加强抗凝疗法。因此，建议更换抗凝剂。
据描述，与维生素K拮抗剂华法林相比，用口服抗凝剂阿哌沙班实现了高风险患者中的更好预防，如Hijazi等人，The Lancet 2016 387,2302-2311(图4)所示。
因此，设想待测受试者是使用维生素K拮抗剂(诸如华法林或双香豆素)疗法的受试者。如果已确定受试者有罹患脑卒中风险(通过本发明的方法，建议使用口服抗凝剂(特别是达比加群、利伐沙班或阿哌沙班)替代维生素K拮抗剂。因此，用维生素K拮抗剂的治疗中止，开始用口服抗凝剂进行治疗。
用于鉴别应接受心电图(ECG)检查的受试者的方法
根据本发明方法的该实施例，应评定要使用生物标志物测试的受试者是否应接受心电图(ECG)检查，即心电图评定。应当进行所述评定用于诊断，即检测所述受试者中是否存在AF。
如本文所用的术语“鉴别受试者”优选地是指使用涉及受试者的样品中的一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选的至少一种另外生物标志物的量)而生成的信息或数据来鉴别受试者应当接受ECG。所鉴别的受试者患有AF的可能性增加。进行ECG评定作为确认。
心电图(简称ECG)是通过合适的ECG记录心脏电活动的过程。ECG设备记录由心脏产生的电信号，这些信号在整个身体中传播到皮肤。通过使测试受试者的皮肤与ECG设备所包含的电极接触来实现电信号的记录。获取记录的过程是非侵入性的且无风险。进行ECG用于诊断心房颤动，即用于评定测试受试者中是否存在心房颤动。在本发明的方法的实施例中，ECG设备是单导联设备(诸如单导联手持式ECG设备)。在另一个优选实施例中，ECG设备是12导联ECG设备，诸如Holter监测仪。
优选地，来自测试受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或与多种参考量)相比增加指示受试者应当接受ECG，和/或来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或多种参考量)相比减少指示受试者不应当接受ECG。
在一个优选实施例中，参考量应允许区分应当接受ECG的受试者和不应当接受ECG检查的受试者。优选地，所述参考量是预定值。
在上述方法的一个实施例中，该方法包括鉴定应接受心电图的受试者，特别是当来自测试受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与一种参考量(或多种参考量)相比增加，并且使鉴定出的受试者接受心电图。
用于评定心房颤动治疗的方法
如本文所用，术语“评定心房颤动治疗”优选地指评定旨在治疗心房颤动的治疗。具体地讲，应评定治疗的功效。
要评定的治疗可以是旨在治疗心房颤动的任何治疗方法。优选地，所述治疗选自由以下各项组成的组：至少一种抗凝剂的施用、节律控制、心率控制、复律和消融。所述治疗是本领域公知的，并且例如在Fuster V等人Circulation 2011；123:e269-e367中评述，该文件的全部内容通过引用合并于此。
在一个实施例中，治疗是施用至少一种抗凝剂，即抗凝治疗。抗凝治疗优选地是旨在降低所述受试者抗凝风险的治疗。施用至少一种抗凝剂应旨在减少或预防血液凝固和相关的脑卒中。在一个优选实施例中，至少一种抗凝剂选自由以下项组成的组：肝素、香豆素衍生物(即维生素K拮抗剂)(特别是华法林或双香豆素)、口服抗凝剂(特别是达比加群(dabigatran)、利伐沙班(rivaroxaban)或阿哌沙班(apixaban))、组织因子途径抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III、因子Ixa抑制剂，因子Xa抑制剂、因子Va和VIIIa的抑制剂以及凝血酶抑制剂(抗IIa型)。因此，设想受试者服用上述药物中的至少一种。
在优选的实施例中，该抗凝剂为维生素K拮抗剂，诸如华法林或双香豆素。维生素K拮抗剂，诸如华法林或双香豆素价格较低，但是因为治疗不方便，繁琐，而且往往不可靠，并且治疗时间在治疗范围内波动，所以需要更好的患者依从性。NOAC(新的口服抗凝剂)包括直接因子Xa抑制剂(阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班(darexaban)、依度沙班(edoxaban))、直接凝血酶抑制剂(达比加群)和PAR-1拮抗剂(沃拉帕沙(vorapaxar)、阿托帕沙(atopaxar))。
在另一优选实施例中，抗凝剂和口服抗凝剂，特别是阿哌沙班、利伐沙班、达瑞沙班、依度沙班、达比加群、沃拉帕沙或阿托帕沙。
因此，待测受试者可以在测试时(即收到样本时)处于用口服抗凝剂或维生素K拮抗剂疗法。
在一个优选实施例中，评定心房颤动治疗是监测所述治疗。在该实施例中，参考量优选是较早获得的样品(即，在步骤a中的测试样品之前获得的样品)中BMP10-型肽或多种BMP10-型肽的量。
任选地，除一种或多种BMP10-型肽的量外，还确定本文所述的至少一种其他生物标志物的量。
因此，本发明涉及一种用于监测受试者的心房颤动治疗的方法，所述受试者优选患有心房颤动，其中所述方法包括以下步骤
(a)在来自受试者的第一样品中，确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量，以及任选地，确定选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，
(b)在来自受试者的第二样品中，确定一种或多种BMP10-型肽的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，其中所述第二样品已在获得所述第一样品之后获得，
(c)将第一样品中的一种或多种BMP10-型肽的量与所述第二样品中的一种或多种BMP10-型肽的量进行比较，并且任选地将第一样品中的所述至少一种其他生物标志物的量与所述第二样品中的所述至少一种其他生物标志物的量进行比较，由此监测抗凝治疗。
如本文所用的术语“监测”优选地涉及评定如本文别处所提及的治疗的效果。因此，监测治疗(诸如抗凝治疗)的功效。
前述方法可以包括基于在步骤c)中执行的比较步骤的结果来监测治疗的其他步骤。如本领域技术人员应理解的，风险的预测通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。然而，该术语要求能够以适当且正确的方式对受试者的统计上显著部分进行预测。因此，实际监视可以包括诸如确认的其他步骤。
优选地，通过实施本发明的方法，可以评定受试者是否对所述治疗有反应。如果受试者在获得第一样品与第二样品之间的状况得到改善，则受试者对治疗有反应。优选地，如果在获得第一样品与第二样品之间状况恶化，则受试者对治疗没有反应。
优选地，在开始所述治疗之前获得第一样品。更优选地，在开始所述治疗之前的一周内、特别是两周内获得样品。然而，还考虑到可以在所述治疗开始之后(但是在获得第二样品之前)获得第一样品。在这种情况下，监测正在进行的治疗。
因此，应在第一样品之后获得第二样品。应当理解，第二样品应在所述治疗开始后获得。
此外，特别预期的是，在获得第一样品之后的一段合理的时间之后获得第二样品。应当理解，本文提及的生物标记物的量不会立即改变(例如在1分钟或1小时内)。因此，在该缩写为中，“合理的”是指获得第一样品和第二样品之间的间隔，该间隔允许生物标记物进行调整。因此，优选地，在所述第一样品之后至少一个月，在所述第一样品之后至少三个月，或特别是至少六个月，获得第二样品。
优选地，第二样品中生物标志物(即，一种或多种BMP10-型肽和任选利钠肽)的量与第一样品中生物标志物的量相比降低，并且更优选地显著降低，并且最优选地统计学显著降低，指示受试者对治疗有响应。因此，治疗是有效的。还优选地，与第一样品中的生物标志物的量相比，第二样品中的生物标志物的量没有一种或多种BMP10-型肽浓度的变化或增加，更优选地显著增加，最优选地统计学显著增加，指示受试者对治疗无响应。因此，治疗是无效的。
术语“显著”和“统计上显著”是本领域技术人员已知的。因此，本领域技术人员可以使用各种公知的统计评定工具无需进一步努力地测定增加或减少是显著的还是统计上显著的。例如，显著增加或减少是至少10％、特别是至少20％的增加或减少。
如果治疗降低了受试者复发心房颤动的风险，则认为该受试者对治疗有反应。如果治疗不具有受试者复发心房颤动的风险，则认为该受试者对治疗没有反应。
在一个实施例中，如果受试者对治疗没有反应，则增加治疗强度。此外，设想如果受试者对治疗有反应，则降低治疗强度。例如，可以通过增加所施用药物的剂量来增加治疗强度。例如，可以通过减少所施用药物的剂量来降低治疗强度。因此，有可能避免有害的不良副作用，诸如出血。
在另一个优选实施例中，心房颤动治疗的评定是心房颤动治疗的指导。如本文所用的术语“指导”优选地涉及基于治疗期间对生物标志物即BMP10-型肽的确定来调整治疗强度，诸如增加或减少口服抗凝剂的剂量。
在另一个优选实施例中，心房颤动治疗的评定是心房颤动治疗的分层。因此，应鉴别有资格接受某种心房颤动治疗的受试者。如本文所用的术语“分层”优选地涉及基于给定或特定风险、所鉴别的分子路径、和/或特定药物或程序的预期功效来选择适当的治疗。根据检测或预测到的风险，特别是与心律失常相关的症状很少或没有症状的患者将有资格接受心室率控制、心脏复律或消融，否则他们将仅接受抗血栓治疗。根据检测或预测的风险，可以对一些成功概率低的患者与成功概率高的患者区别治疗，这取决于手术前测量的作为PVI或消融后AF复发的预测因子的血液生物标志物。
上面给出的定义和解释在细节上作必要的修改后适用于以下本发明的方法(除非另有说明)。例如，术语“受试者”、“样品”、“确定”已在上文定义。此外，确定优选包括使样品与至少一种能够结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域37至299内的试剂接触。
有趣的是，在本发明的基础研究中显示，BMP10-型肽可用于估计脑血管损伤的风险、存在和/或严重程度，作为患者诸如心房颤动患者的痴呆症和认知功能障碍的原因。具体而言，研究表明生物标志物与患者中白质病变(WML)的存在相关。生物标志物的含量越高，白质病变的程度越高(反之亦然)。因此，可作为评定白质病变程度的标志物。
此外，本发明涉及用于评定受试者的白质病变程度的方法，所述方法包括
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)根据在步骤a)中确定的量评定受试者的白质病变的程度。
术语“白质病变”在本领域是众所周知的。白质是指主要由有髓轴突组成的中枢神经系统(CNS)区域。白质病变(也称为“白质疾病”)通常在老年个体的脑MRI上检测为白质高信号(WMH)或“脑白质疏松症”。已经描述WMH的存在和程度是小脑血管疾病的影像学标志物，也是终生卒中、认知障碍和功能障碍风险的重要预测指标(Chutinet A,Rost NS.Whitematter disease as a biomarker for long-term cerebrovascular disease anddementia.Curr Treat Options Cardiovasc Med.2014；16(3):292.doi:10.1007/s11936-013-0292-z)。RET的确定允许评定WML的程度，即WML的负担。因此，生物标志物允许对受试者中的WML进行量化，即它是功能性脑组织体积损失的标志物。
白质病变的程度可以通过Fazekas评分来表示(Fazekas、JB Chawluk、A Alavi、HIHurtig和RA Zimmerman American Journal of Roentgenology 1987 149:2,351-356)。Fazekas评分范围为0到3。0表示无WML，1表示轻度WML，2表示中度WML，3表示重度WML。
WML程度可能由临床静息性卒中引起。因此，生物标志物RET可进一步用于辅助评定受试者过去是否经历过一次或多次静息性卒中，即在获得样品之前。
静息性卒中，即静息性脑卒中，在本领域中是已知的并且例如在Conen等人(Conen等人，J Am Coll Cardiol 2019；73:989–99)中进行了描述，其全部公开内容通过引用并入本文。静息性卒中是无卒中或短暂性脑缺血发作临床病史的患者的临床静息性卒中。因此，待测试的受试者应没有已知的卒中和/或TIA(短暂性脑缺血发作)病史。
此外，本发明涉及一种用于评定受试者是否经历过一次或多次静息性卒中的方法，所述方法包括
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，
b)将步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)评定受试者是否经历过一次或多次静息性卒中。
以下优选地用作诊断算法：大于参考的生物标志物的量指示经历了一次或多次静息性卒中的受试者，和/或低于参考的量指示没有经历静息性卒中的受试者。
因此，本发明涉及一种用于预测受试者的痴呆症，诸如血管性痴呆症和/或阿尔茨海默病的方法，所述方法包括
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，
b)将步骤a)中确定的量与参考进行比较，以及
c)预测所述受试者患有痴呆症的风险。
优选地，如本文所用的术语“预测痴呆症”是指评定受试者将遭受痴呆症的概率。典型地，预测受试者是有罹患痴呆症风险(因此风险升高)还是没有罹患痴呆症风险(因此风险降低)。
在一个实施例中，预测窗口为1至3年的时段。因此，预测在1至3年内罹患痴呆症的风险。在一个优选的实施例中，预测窗口为1至10年的时段。因此，可以预测受试者在1至10年内罹患痴呆症的风险。优选地，从本发明的方法的完成起计算所述预测窗口。更优选地，从获得待测样品的时间点计算所述预测窗口。
如本文所用的术语“痴呆症”优选地是指可以表征为认知和智力功能的丧失，通常是进行性的，但没有由各种病症引起的感知或意识损害，但最通常与结构性脑病相关的病况。最常见的痴呆症类型是阿尔茨海默病，占病例的50％至70％。其他常见类型包括血管性痴呆症(25％)、路易体痴呆症和额颞叶痴呆症。术语“痴呆症”包括但不限于艾滋病痴呆症、阿尔茨海默性痴呆症、早老性痴呆症、老年性痴呆症、紧张性痴呆症、路易体痴呆症(弥漫性路易体病)、多发性梗塞性痴呆症(血管性痴呆症)、麻痹性痴呆症、创伤后痴呆症、早发性痴呆症、血管性痴呆症。
在一个实施例中，术语痴呆症是指血管性痴呆症、阿尔茨海默病、路易体痴呆症和/或额颞叶痴呆症。因此，预测患有血管性痴呆症、阿尔茨海默病、路易体痴呆症和/或额颞叶痴呆症的风险。
在一个实施例中，预测患有“阿尔茨海默病”的风险。术语“阿尔茨海默病”在本领域是众所周知的。阿尔茨海默病是一种慢性神经退行性疾病，通常开始缓慢并随着时间的推移逐渐恶化。随着疾病的进展，症状可能包括语言问题、迷失方向、情绪波动、失去动力、无法自我照顾和行为问题。
在一个实施例中，预测患有“血管性痴呆症”的风险。术语“血管性痴呆症”优选是指由脑内血管损伤或疾病引起的记忆和其他认知功能的进行性丧失。因此，该术语应指由脑部血液循环问题引起的痴呆症症状。它可能发生在卒中后或随着时间的推移而累积。
关于痴呆症风险的预测，诊断算法优选如下：优选地，大于参考的生物标志物的量指示有痴呆症风险的受试者，和/或低于参考的生物标志物的量指示没有痴呆症风险的受试者。
上面给出的定义和解释在细节上作必要的修改后适用于以下本发明的方法(除非另有说明)。例如，术语“受试者”、“样品”、“确定”已在上文定义。此外，确定优选包括使样品与至少一种能够结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域37至299内的试剂接触。
本发明进一步涉及一种辅助评定心房颤动的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供来自受试者的至少一份样品，
b)在步骤a)中提供的至少一个样品中，确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及任选地，确定选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
c)向医师提供关于确定的一种或多种BMP10-型肽的量的信息及任选地关于确定的至少一种其他生物标志物的量的信息，从而辅助对心房颤动的评定。
医师应为主治医师，即要求测定生物标记物的医师。上述方法应帮助主治医师评定心房颤动。因此，该方法不包括以上结合评定心房颤动的方法提及的诊断、预测、监测、区分、鉴别。
上述样品获得方法的步骤a)不包括从受试者处提取样品。优选地，通过接收来自所述受试者的样品来获得该样品。因此，可以递送样品。
在一个实施例中，所述方法是辅助脑卒中预测的方法，所述方法包括以下步骤：
a)结合评定心房颤动的方法，特别是结合预测心房颤动的方法，提供如本文提到的来自受试者的至少一份样品，
b)确定一种或多种BMP10-型肽的量和选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
c)向医师提供关于确定的一种或多种BMP10-型肽的量的信息及任选地关于确定的至少一种其他生物标志物的量的信息，从而辅助对卒中的预测。
本发明进一步涉及一种方法，该方法包括：
a)提供对一种或多种BMP10-型肽的测定及任选地对选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的其他生物标志物的至少一种另外的测定，以及
b)提供关于在所述心房颤动的评定中使用通过所述测定获得或可获得的测定结果的说明。
前述方法的目的优选地是在心房颤动评定中的辅助。
说明应包含实施评定如上所述的心房颤动的方法的方案。进一步地，说明应包含一种或多种BMP10-型肽的参考量的至少一个值，及任选地利钠肽的参考量的至少一个值。
“测定”优选地是适于测定生物标记物的量的试剂盒。术语“试剂盒”在下文中解释。例如，所述试剂盒应包含用于一种或多种BMP10-型肽的至少一种检测剂以及任选地选自由以下项组成的组的至少一种另外的试剂：与利钠肽特异性地结合的试剂、与ESM-1特异性地结合的试剂、与Ang2特异性地结合的试剂以及与FABP-3特异性地结合的试剂。因此，可以存在一种至四种检测剂。一种至四种生物标记物的检测剂可在单个试剂盒或分开的试剂盒中提供。
通过所述测试获得或可获得的测试结果是一个或多个生物标志物的量的值。
在一个实施例中，步骤b)包括提供关于在脑卒中的预测(如本文别处所述)中使用通过所述一个或多个测试获得或可获得的测试结果的说明。
本发明进一步涉及用于评定心房颤动的计算机实现的方法，该方法包括
a)在处理单元处接收一种或多种BMP10-型肽的量的值，以及任选地接收选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量的至少一个另外的值，其中所述一种或多种BMP10-型肽的量以及任选地至少一种其他生物标志物的量已经在来自受试者的样品中确定，
b)通过所述处理单元，将在步骤(a)中接收到的一个或多个值与一个或多个参考值进行比较，以及
c)基于比较步骤b)评定心房颤动。
上述方法是计算机实现的方法。优选地，计算机实现的方法的所有步骤由计算机(或计算机网络)的一个或多个处理单元执行。因此，步骤(c)中的评定由处理单元实施。优选地，所述评定基于步骤(b)的结果。
如本文其他地方所述，步骤(a)中接收的一个或多个值应从测定来自受试者的生物标记物的量中得出。优选地，该值是生物标记物浓度的值。该值通常将由处理单元通过将值上载或发送到处理单元来接收。替代地，通过经由用户界面输入值，处理单元可以接收该值。
在前述方法的实施例中，步骤(b)中提出的一个或多个参考值是从存储器建立的。优选地，从存储器建立用于参考的值。
在本发明的上述计算机实现的方法的实施例中，步骤c)中进行的评定的结果经由显示器被提供，该显示器配置成用于呈现结果。
在本发明的上述计算机实现的方法的实施例中，该方法可包括将关于步骤c)中进行的评定的信息传送到受试者的电子医疗记录的进一步的步骤。
用于诊断心力衰竭的方法
此外，在本发明的研究中已经表明，对来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量的确定允许诊断心力衰竭。因此，本发明还考虑了一种基于一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地进一步基于利钠肽、ESM-1、Ang2和/或FABP3)来诊断心力衰竭的方法。
上文给出的与对心房颤动的评定有关的定义在细节上作必要的修改后适用于以下内容(除非另有说明)。
因此，本发明进一步涉及一种用于诊断受试者心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在来自受试者的样品中确定一种或多种BMP10-型肽的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与参考量进行比较，由此诊断心力衰竭。
用于诊断心力衰竭的方法可以进一步包括确定选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，并与合适的参考量进行比较。
因此，用于诊断心力衰竭的方法可以包括以下步骤：
a)在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此诊断出心力衰竭。
如本文所用的术语“诊断”是指评定根据本发明的方法所指的受试者是否患有心力衰竭。受试者是否患有心力衰竭的实际诊断可以包括诸如确认诊断的其他步骤。因此，对心力衰竭的诊断被理解为对心力衰竭诊断的辅助。因此，在本发明的上下文中，术语“诊断”还涵盖辅助医师评定受试者是否患有心力衰竭。
术语“心力衰竭”(缩写为“HF”)是技术人员众所周知的。如本文所用，该术语优选地涉及本领域技术人员已知的心脏收缩和/或舒张功能受损并伴有明显的心力衰竭迹象。优选地，本文所指的心力衰竭也是慢性心力衰竭。根据本发明的心力衰竭包括明显和/或晚期心力衰竭。在明显的心力衰竭中，受试者表现出本领域技术人员已知的心力衰竭症状。
在本发明的一个实施例中，术语“心力衰竭”是指具有降低的左心室射血分数(HFrEF)的心力衰竭。在本发明的另一个实施例中，术语“心力衰竭”是指具有保留的左心室射血分数(HFpEF)的心力衰竭。
HF可分为不同程度的严重性。根据NYHA(纽约心脏协会)分类，将心力衰竭患者分类为属于NYHA I、NYHA II、NYHA III和NYHA IV级。心力衰竭患者的心包、心肌、冠状动脉循环或心脏瓣膜已经发生结构和功能变化。他将无法完全恢复健康，需要治疗。NYHA I级患者没有明显的心血管疾病症状，但是已经有了功能受损的客观证据。NYHA II级患者的身体活动受到轻微限制。NYHA III级患者表现出明显的身体活动受限。NYHA IV级患者无法在没有不适的情况下进行任何身体活动。他们在休息时表现出心脏功能不全的症状。
此功能分类由美国心脏病学会和美国心脏协会的最新分类加以补充(参见J.Am.Coll.Cardiol.2001；38；2101-2113,updated in 2005,seeJ.Am.Coll.Cardiol.2005；46；e1-e82)。定义了4个阶段A、B、C和D。A和B阶段不是HF，但被认为辅助在发展“真正”HF之前及早鉴别患者。最好将A和B阶段患者定义为具有发生HF的风险因素的患者。例如，尚未表现出左心室(LV)功能受损、肥大或几何腔畸形的冠状动脉疾病、高血压或糖尿病患者将被视为A阶段，而无症状但表现出LV肥大和/或LV功能受损的患者将被指定为B阶段。C阶段则表示患有当前或过去与基础结构性心脏病相关的HF症状的患者(大部分患者具有HF)，而D阶段表示真正难治性HF的患者。
如本文所用，术语“心力衰竭”优选地包括上述ACC/AHA分类的阶段A、B、C和D。此外，该术语包括NYHA I、NYHA II、NYHA III和NYHA IV级。因此，受试者可能会或可能不会显示典型的心力衰竭症状。
在一个优选实施例中，术语“心力衰竭”是指根据上述ACC/AHA分类的心力衰竭阶段A，或者特别是心力衰竭阶段B。鉴别这些早期阶段特别是阶段A是有利的，因为可以在发生不可逆损害之前就开始治疗。
待根据诊断心力衰竭的方法进行测试的受试者优选不患有心房颤动。然而，还设想受试者患有心房颤动。结合评定心力衰竭的方法定义术语“心房颤动”。
优选地，待结合诊断心力衰竭的方法进行测试的受试者被怀疑患有心力衰竭。
术语“参考量”已经结合评定心房颤动的方法定义。用于诊断心力衰竭的方法中应用的参考量原则上可以如上所述确定。
优选地，来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与参考量相比增加指示受试者患有心力衰竭，和/或其中来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量(以及任选地至少一种其他生物标志物诸如ESM-1、Ang-2、FABP-3和/或利钠肽的量)与参考量相比减少指示受试者未患有心力衰竭。
在诊断心力衰竭的方法的一个实施例中，所述方法进一步包括基于诊断结果推荐和/或启动心力衰竭治疗的步骤。优选地，如果诊断出受试者患有心力衰竭，则推荐或开始治疗。优选地，心力衰竭治疗包括施用至少一种选自由以下各项组成的组的药物：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、β阻滞剂和醛固酮拮抗剂。血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、β受体阻滞剂和醛固酮拮抗剂的实例将在下一节中描述。
预测受试者住院风险的方法
已知一些受试者更快地发展为心力衰竭，因此由于心力衰竭而住院的风险增加。尽早确定这些受试者很重要，因为这将允许采取预防或延缓心力衰竭进展的治疗措施。
有利地，在本发明的基础研究中发现，受试者样品中一种或多种BMP10-型肽的量允许鉴定有心力衰竭住院风险的受试者。例如，与第一个四分位数中的受试者相比，所分析的队列(实施例4)的第四个四分位数的BMP10中的受试者在三年的时段内有大约四倍的心力衰竭住院风险。
因此，本发明还涉及一种用于预测受试者因心力衰竭住院的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在来自所述受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
(b)将一种或多种BMP10-型肽的量与一种或多种BMP10-型肽的参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较
关于心房颤动的评定方法和心力衰竭的诊断方法所作的定义和解释，优选地适用于预测受试者因心力衰竭住院的风险的方法
上述方法可以进一步包括步骤(c)预测受试者因心力衰竭住院的风险。因此，步骤(a)、(b)、(c)优选如下：
(a)在来自所述受试者的至少一个样品中确定一种或多种BMP10-型肽(骨形态发生蛋白10-型肽)的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2(血管生成素2)和FABP3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
(b)将BMP10-型肽的量与参考量进行比较，并且任选地将至少一种其他生物标志物的量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，以及
(c)预测受试者因心力衰竭住院的风险。
优选地，预测基于步骤(b)的比较结果。
表述“住院”是技术人员很好理解的，并且优选地意指受试者被送入医院，特别是在住院病人的基础上。住院应该是由于心力衰竭。因此，心力衰竭应是住院的原因。优选地，住院是由于急性或慢性心力衰竭而住院。因此，心力衰竭包括急性和慢性心力衰竭。更优选地，住院是由于急性心力衰竭而住院。因此，预测了受试者因心力衰竭住院的风险。
上文已对术语“心力衰竭”进行了定义。该定义相应地适用。在一些实施例中，住院是由于根据ACC/AHA分类分类为C期或D期的心力衰竭。ACC/AHA分类在本领域中是众所周知的，并且例如记载于Hunt等人(Journal of the American College of Cardiology，第46卷，第6期，2005年9月20日，第e1-e82页，ACC/AHA实践指南)，其全部内容通过引用并入本文。
根据上述方法，应预测受试者因心力衰竭住院的风险。因此，可以鉴别出有因心力衰竭住院的风险或没有因心力衰竭住院的风险的受试者。因此，根据上述方法，本文中使用的术语“预测风险”优选地是指评定因心力衰竭住院的概率。在一些实施例中，本发明的上述方法允许区分有因心力衰竭住院的风险的受试者和没有因心力衰竭住院的风险的受试者。
根据本发明，术语“预测风险”被理解为辅助预测因心力衰竭住院的风险。原则上，最终预测将由医师进行，并可能包括进一步的诊断结果。
如本领域技术人员应理解的，风险的预测通常不旨在对100％的待测受试者是正确的。优选地，该术语是指能够以适当且正确的方式对受试者的统计上显著部分进行预测。可以由本领域技术人员使用各种众所周知的统计评估工具(例如，测定置信区间、p值测定、学生t检验、Mann-Whitney检验等)在无需进一步努力的情况下测定某一部分是否是统计上显著的。详情见Dowdy和Wearden,Statistics for Research,John Wiley&Sons,New York1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。p值优选为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
优选地，预测某个时间窗口内的风险/概率。在一些实施例中，从本发明的方法的完成起计算所述预测窗口。特别地，从获得待测样品的时间点计算所述预测窗口。
在本发明的一个优选实施例中，预测窗口优选地是至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年或至少10年、或任何间歇时间范围的间隔。在本发明的另一个优选实施例中，预测窗口优选地是长达5年、更优选地长达4年、或最优选地长达3年的时段。因此，预测最长三年、最长四年或最长五年内的风险。此外，设想预测窗口为1年至5年的时段。替代性地，预测窗口可以是1至3年的时段。
在一个优选实施例中，预测三年内因心力衰竭住院的风险。
优选地，将通过本发明的上述方法分析的受试者被分配到有因心力衰竭住院风险的受试者组中，或者被分配到没有因心力衰竭住院风险的受试者组中。在有风险的受试者中，优选地，是处于因心力衰竭住院风险升高的受试者(特别是在预测窗口内)。优选地，与受试者队列(即一组受试者)中的风险相比，所述风险是升高的。在没有风险的受试者中，优选地，是处于因心力衰竭住院风险降低的受试者(特别是在预测窗口内)。优选地，与受试者队列(即一组受试者)中的平均风险相比，所述风险是降低的。因此，本发明的方法允许区分升高的风险和降低的风险。优选地，在3年的预测窗口内，有风险的受试者因心力衰竭住院的风险优选地为12％或更大、或更优选地为15％或更大、或最优选地为20％或更大。优选地，在3年的预测窗口内，没有风险的受试者因心力衰竭住院的风险优选地低于10％、更优选地低于8％、或最优选地低于7％。
术语“参考量”已在本文别处定义。该定义相应地适用。上述方法中应用的参考量应允许预测因心力衰竭住院的风险。在一些实施例中，参考量应允许区分有因心力衰竭住的风险的受试者和没有因心力衰竭住院风险的受试者。在一些实施例中，所述参考量是预定值。
优选地，来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量与参考量相比是增加的，指示受试者处于因心力衰竭住院风险中。还优选地，来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量与参考量相比是降低的，指示受试者没有处于因心力衰竭住院风险中。
如果确定了超过一种生物标志物，则适用以下各项：
优选地，来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量和至少一种其他生物标志物的量(或多种量)与各自的参考量相比是增加的，指示受试者处于因心力衰竭住院的风险中。还优选地，来自受试者的样品中一种或多种BMP10-型肽的量和至少一种其他生物标志物的量(或多种量)与各自的参考量相比是降低的，指示受试者没有处于因心力衰竭住院的风险中。
术语“样品”已在本文别处定义。该定义相应地适用。在一些实施例中，样品是血液、血清或血浆样品。
术语“受试者”已在本文别处定义。该定义相应地适用。在一些实施例中，受试者为人受试者。优选地，待测受试者为50岁或更高年龄，更优选60岁或更高年龄，且最优选65岁或更高年龄。进一步地，设想待测受试者为70岁或更高年龄。此外，设想待测受试者为75岁或更高年龄。同样，该受试者可能在50岁与90岁之间。
在一个实施例中，待测试的受试者有心力衰竭的病史。在另一个实施例中，待测试的受试者没有心力衰竭病史。
根据本发明的方法可以辅助个性化医疗。在一个优选实施例中，上述用于预测受试者因心力衰竭住院的风险的方法进一步包括如果预测受试者有因心力衰竭住院的风险，则推荐和/或开始至少一种合适的治疗的步骤。因此，本发明还涉及一种治疗方法。
优选地，在用于预测受试者因心力衰竭住院的风险的方法的上下文中使用的术语“治疗”包括生活方式改变、饮食方案、对身体的干预以及药物治疗，即用一种药物(或用多种药物)治疗。优选地，所述治疗旨在降低因心力衰竭住院的风险。在一个实施例中，治疗是施用一种药物(或多种药物)。优选地，药物选自由以下各项组成的组：血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、醛固酮拮抗剂和β阻滞剂。
在一些实施例中，药物是β阻滞剂，诸如普萘洛尔、美托洛尔、比索洛尔、卡维地洛、布欣洛尔和奈必洛尔。在一些实施例中，药物是ACE抑制剂，诸如依那普利、卡托普利、雷米普利和群多普利。在一些实施例中，药物是血管紧张素II受体阻滞剂，诸如氯沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、坎地沙坦、替米沙坦和依普罗沙坦。在一些实施例中，药物是醛固酮拮抗剂，诸如依普利酮、螺内酯、坎利酮、Mexrenone和Prorenone。
生活方式的改变包括戒烟、适度饮酒、增加体力活动、减肥、钠(盐)限制、体重管理和健康饮食、每日鱼油、盐限制。
而且，本发明涉及以下各项的用途(特别是体外用途，例如在来自受试者的样品中)：
i)多种BMP10-型肽中的一种和任选地至少一种选自由利钠肽、ESM-1(内皮细胞特异性分子)、Ang2和FABP-3(脂肪酸结合蛋白3)组成的组的其他生物标志物，和/或
ii)与一种或多种BMP10-型肽特异性地结合的至少一种试剂，以及任选地，选自由以下各项组成的组的至少一种另外的试剂：与利钠肽特异性地结合的试剂、与ESM-1特异性地结合的试剂、与Ang2特异性地结合的试剂以及与FABP-3特异性地结合的试剂，
用于a)评定心房颤动b)预测受试者卒中的风险，和/或c)诊断心力衰竭。
与前述用途有关的提及的术语，诸如“样品”、“受试者”、“检测剂”、“特异性结合”、“心房颤动”和“评定心房颤动”，已经结合用于评定心房颤动的方法进行了定义。定义和解释相应地适用。
本发明进一步涉及BMP10-型肽和/或至少一种特异性结合BMP10-型肽的试剂用于预测受试者痴呆症的体外用途。
本发明进一步涉及BMP10-型肽和/或至少一种特异性结合BMP10-型肽的试剂用于评定受试者白质病变程度的体外用途。
本发明进一步涉及BMP10-型肽和/或至少一种特异性结合BMP10-型肽的试剂用于评定受试者是否经历过一次或多次静息性卒中的体外用途。
本发明进一步涉及BMP10-型肽和/或至少一种特异性结合BMP10-型肽的试剂用于预测受试者因心力衰竭住院的风险的用途(特别是体外用途，例如在来自受试者的样品中)。
优选地，上述用途是体外用途。此外，该检测剂优选地为抗体，诸如单克隆抗体(或其抗原结合片段)。
本发明还涉及一种试剂盒。在一个实施例中，本发明的试剂盒包含与一种或多种BMP10-型肽特异性地结合的至少一种试剂以及选自由以下项组成的组的至少一种另外的试剂：与利钠肽特异性地结合的试剂、与ESM-1特异性地结合的试剂、与Ang2特异性地结合的试剂以及与FABP-3特异性地结合的试剂。
优选地，所述试剂盒适于执行本发明的方法，即，用于评定心房颤动的方法，或诊断心力衰竭，或预测受试者因心力衰竭住院的风险的方法。或者，所述试剂盒包括用于实施所述方法的说明。
在一些实施例中，与一种或BMP10-型肽特异性结合的至少一种试剂是在下一节中描述的至少一种抗体或其片段(标题为“本发明的抗体”)。
如本文所用的术语“试剂盒”是指上述组分的集合，优选地，是分开提供或在单个容器内提供的。容器还包括用于实施本发明方法的说明。这些说明可以是手册的形式，或者可以由计算机程序代码提供，该计算机程序代码能够执行在本发明的方法中提及的计算和比较，并且当在计算机或数据处理设备上实现时相应地建立评定或诊断。计算机程序代码可提供于数据存储介质或装置诸如光学存储介质(例如，光盘)上或直接提供于计算机或数据处理装置上。此外，试剂盒可优选包含用于校准目的的BMP10-型肽的标准量。在优选实施例中，试剂盒进一步包含用于校准目的的本文所述的至少一种另外的生物标记物(诸如利钠肽或ESM-1)的标准量
在一个实施例中，所述试剂盒用于体外评定心房颤动。在一个替代性的实施例中，所述试剂盒用于体外诊断心力衰竭。在一个替代性的实施例中，所述试剂盒用于体外预测因心力衰竭住院的风险。
在上文和权利要求书中描述的本发明的方法和用途中，可以使用下一节中描述的抗体(其片段)。
上文作出的定义和解释在细节上作必要的修改后适用于下文。
本发明的抗体：
本发明还涉及一种结合一种或多种BMP10-型肽的抗体(诸如单克隆抗体)或其片段。特别地，它应结合NT-proBMP10。
抗体(或其片段)应能够结合具有如前一节中公开的SEQ ID NO:1所示序列的多肽的至少一个氨基酸区域。
因此，本发明的抗体(或其片段)应当能够结合NT-proBMP10，即，它应能够结合SEQID NO:1所示多肽的氨基酸区域22至316。由于区域包含在preproBMP10和proBMP10中，因此抗体(或其片段)应能够结合preproBMP10、proBMP10和NT-proBMP10。但是，抗体(或片段)不应结合BMP10，即成熟的BMP10。
在一个优选的实施例中，结合一种或多种BMP10-型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段应能够结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域37至299内，即它能够与包含在SEQ ID NO:1所示多肽的从第37位氨基酸开始并以第299位氨基酸结束的区域中的表位结合。
例如，结合一种或多种BMP10-型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段能够结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域110至200内，即所述至少一种试剂与该区域中包含的表位结合。
例如，结合一种或多种BMP10-型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段能够结合在SEQ ID NO:1所示多肽的氨基酸区域37至195内，诸如氨基酸区域37至185内，即所述至少一种试剂与该区域中包含的表位结合。
例如，结合一种或多种BMP10-型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段能够结合在SEQ ID NO:1的氨基酸区域160至299内，诸如氨基酸区域171至299内，即所述至少一种试剂与该区域中包含的表位结合。
例如，结合一种或多种BMP10-型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段能够结合在SEQ ID NO:1的氨基酸区域160至195内，诸如氨基酸区域171至185内。
例如，结合一种或多种BMP10型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段能够与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域37至47中的表位(SLFGDVFSEQD,SEQ ID NO 2)结合。
例如，结合一种或多种BMP10型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段能够与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域171至185中的表位(LESKGDNEGERNMLV,SEQ ID NO:3)结合。例如，所述至少一种试剂与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域173至181中的表位(SKGDNEGER,SEQ ID NO:4)结合。
例如，结合一种或多种BMP10型肽诸如NT-proBMP10的抗体或其片段能够与包含在SEQ ID NO:1的氨基酸区域291至299中的表位(SSGPGEEAL,SEQ ID NO:5)结合。
在本发明的基础研究中，发明人已经产生了针对人NT-proBMP10的单克隆抗体(在兔中)。对280种抗体进行了详细的动力学筛选。在该筛选中，鉴定出显示有利动力学特性的抗体，这使得它们特别适用于检测BMP10-型肽，诸如NT-proBMP10和/或proBMP10。例如，鉴定出显示NT-proBMP10-抗体复合物的快速复合物形成速度的抗体。此外，抗体显示复合物的解离缓慢，导致复合物的半衰期长。克隆11A5、11C10、13G6、14C8、2H8和9E7显示出相当的快速复合物形成速度和复合物半衰期t/2diss>15分钟。克隆13G6显示出最慢的解离(kd<1.0E-04s-1)，导致复合物半衰期t/2-diss>115分钟。
鉴定出的抗体如下：11A2、11A5、11C10、13G6、14C8、2H8、3H8、8G5和9E7。下表A至D中提供了抗体的序列。
对于上述四种抗体，可以检测到线性表位(参见实施例部分和图12)。其中两种抗体与同一区域结合。
3H8的表位包含SEQ ID NO:2中所示的序列(SLFGDVFSEQD)。
11A5的表位包含SEQ ID NO:3中所示的序列(LESKGDNEGERNMLV)。
13G6的表位包含SEQ ID NO:4中所示的序列(SKGDNEGER)。
2H8的表位包含SEQ ID NO:5中所示的序列(SSGPGEEAL)。
用于确定BMP10-型肽的量的抗体(或其片段)或试剂因此可以与上述区域结合。
表A总结了本发明的抗体的可变重(VH)链的氨基酸序列
表A：本发明的可变重(VH)链结构域
Figure BDA0003806278890000611
Figure BDA0003806278890000621
表B总结了本发明的抗体可变轻链的氨基酸序列(见下文)
表B：本发明的可变轻链(VL)链结构域
Figure BDA0003806278890000622
Figure BDA0003806278890000631
重链CDR序列显示在表C中。轻链CDR序列显示在下表D中。例如，可以通过使用Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，美国卫生与公众服务部，PHS，NIH，NIH出版号：91-3242,1991中描述的系统来鉴定抗体的互补决定区(CDR)。
Figure BDA0003806278890000641
本发明的抗体(或其片段)应特异性结合preproBMP、proBMP10和NT-proBMP10多肽。因此，抗原结合蛋白应结合SEQ ID NO:1的氨基酸区域22至316内的preproBMP、proBMP10和NT-proBMP10，如本文别处更详细描述的。应当理解它不与成熟的BMP10结合。然而，它可以与结合成熟BMP10的抗原结合蛋白组合使用。
本发明不限于已鉴定的抗体，即11A2、11A5、11C10、13G6、14C8、2H8、3H8、8G5和9E7，还包括其结合一种或多种BMP10-型的变体，优选在相同区域内。例如，13G6的变体应结合与13G6相同或基本相同的表位。
优选地，本发明的抗体或其片段应包含抗体11A2、11A5、11C10、13G6、14C8、2H8、3H8、8G5或9E7的轻链可变结构域(或其变体)和重链可变结构域(或其变体)。例如，它可以包含13G6的轻链可变结构域(或其变体)和重链可变结构域(或其变体)，例如，它可以包含抗体11C10的轻链可变结构域(或其变体)和重链可变结构域(或其变体)。
在一个优选的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含选自如表A所示的VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8和VH9的重链可变结构域(或其变体)和/或选自表B中所示的VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8和VL9的轻链可变结构域(或其变体)。上表A中所示的每个重链可变结构域可以与表B中所示的每个轻链可变结构域组合。在一个优选的实施例中，表A中的重链可变结构域与表B中相应的轻链可变结构域组合，例如VH1与VL1、VH2与VL2、VH3与VL3等。
在一些实施例中，根据本发明提及的多肽变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍然优选地与所述多肽的氨基序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％相同。
在一些实施例中，抗体的变体(或片段抗体)包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域,所述重链可变结构域与包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14或15中所示序列(参见表A)的重链可变结构域至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％相同，所述轻链可变结构域按递增的优先次序与包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23或24中所示序列(见表B)的轻链可变结构域至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％相同。
替代性地或另外，抗体的变体或其片段包含本发明的抗体或其片段，其包含亲本抗体的六个CDR，其中所述六个CDR相差不超过总共三个、两个、或特别是来自各自亲本CDR的一个氨基酸添加、取代和/或缺失(参见表C和D)。
因此，在一些实施例中，本发明的抗体或其片段可以包含重链可变结构域(与包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14或15中所示序列的重链可变结构域至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同(参见表A))和/或轻链可变结构域(与包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23或24中所示序列的轻链可变结构域按递增的优先顺序至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同(见表B))。所示的每个重链可变结构域可以与每个轻链可变结构域组合。然而，优选将相应的序列组合(例如，SEQ ID NO:7与SEQ IDNO:16)。
相对于参考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”被定义为在比对候选序列与参考序列并且引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。优选地，应用标准参数来确定两个序列的序列同一性程度。优选地，通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定相同程度，其中与参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的氨基酸序列片段可以包含添加或缺失(例如，缺口或突出端)以实现最佳对齐。百分比通过确定存在于两条序列中相同的氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数并将该结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。用于比较的最佳序列比对可以通过Smith和Waterman的同源性比对算法(Add.APL.Math.2:482(1981))，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))，通过Pearson和Lipman的搜索相似性法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988))，通过这些算法的计算机化执行(例如，威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,WI)，或者通过目检来进行。鉴于已经鉴定了两个序列进行比较，优选使用GAP和BESTFIT来确定它们的最佳比对，从而确定相同程度。最好使用缺口权重的默认值5.00和缺口权重长度的默认值0.30。在一个实施例中，两个氨基酸序列之间的百分比相同是使用Needleman和Wunsch算法(Needleman 1970,J.Mol.Biol.(48):444-453)确定的，该算法已并入EMBOSS软件包中的needle程序(EMBOSS:European Molecular Biology Open Software Suite,Rice,P.,Longden,I.和Bleasby,A.,Trends in Genetics 16(6),276-277,2000)，BLOSUM62评分矩阵以及缺口打开罚分10和缺口扩大罚分0.5。用于使用needle程序比对两个氨基酸序列的参数的优选非限制性实例是默认参数，包括EBLOSUM62评分矩阵、缺口打开罚分10和缺口扩大罚分0.5。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:7所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:16所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:8所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:17所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:9所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:18所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:10所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:19所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:11所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:20所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:12所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:21所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:13所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:22所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:14所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:23所示序列的轻链可变结构域。
在一个方面，本发明的抗体或其片段包含具有SEQ ID NO:15所示序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:24所示序列的轻链可变结构域。
替代性地或另外，本发明的抗体或其片段包括
(a)轻链可变结构域，其包含：
(a1)轻链CDR1，其与表D所示的轻链CDR1的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(a2)轻链CDR2，其与表D所示的轻链CDR2的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(a3)轻链CDR3，其与表D所示的轻链CDR3的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，和
(b)重链可变结构域，其包含：
(b1)重链CDR1，其与表C所示的重链CDR1的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(b2)重链CDR2，其与表C所示的重链CDR2的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，和
(b3)重链CDR3，其与表C所示的重链CDR3的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失。
例如，本发明的抗体或其片段包括
(a)轻链可变结构域，其包含：
(a1)轻链CDR1，其与表D所示的轻链CDRL1-4的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(a2)轻链CDR2，其与表D所示的轻链CDRL2-4的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(a3)轻链CDR3，其与表D所示的轻链CDRL3-4的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，和
(b)重链可变结构域，其包含：
(b1)重链CDR1，其与表C所示的重链CDRH1-1的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(b2)重链CDR2，其与表C所示的重链CDRH2-4的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，和
(b3)重链CDR3，其与表C所示的重链CDRH3-4的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失。
优选地，本发明的抗体或其片段包括
(c)轻链可变结构域，其包含：
(a1)表D中所示的轻链CDR1(并因此是选自SEQ ID NO:34-42的轻链CDR1序列)，
(a2)表D中所示的轻链CDR2(并因此是选自SEQ ID NO:52-60的轻链CDR2序列)，和
(a3)表D中所示的轻链CDR3(并因此是选自SEQ ID NO:70-78的轻链CDR3序列)，
以及
(d)重链可变结构域，其包含：
(b1)表C中所示的重链CDR1(并因此是选自SEQ ID NO:25-33的重链CDR1序列)，
(b2)表C中所示的重链CDR2(并因此是选自SEQ ID NO:43-51的重链CDR2序列)，和
(b3)表C中所示的重链CDR3(并因此是选自SEQ ID NO:61-69的重链CDR3序列)。
更优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段包含11A2的六个CDR、11A5的六个CDR、11C10的六个CDR、13G6的六个CDR、14C8的六个CDR、2H8的六个CDR、3H8的六个CDR、8G5的六个CDR或9E7的六个CDR(或与重链的所述六个CDR相差不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失的六个CDR)。
在一个特别优选的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含13G6的六个CDR。因此，抗体或其片段包含SEQ ID NO:28的重链CDRH1(NYAMS)、SEQ ID NO:46的重链CDRH2(YISASGNTYYASWVKG)和SEQ ID NO:64的重链CDRH3(GYSGWISGTWA)、SEQ ID NO:37的轻链CDRL1(QSSQSVVNNNRLS)、SEQ ID NO:55的轻链CDRL2(RASTLAS)和SEQ ID NO:73的轻链CDRL3(LGDYVSYSEAA)。
在另一个特别优选的实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含11C10的六个CDR。因此，抗体或其片段包含SEQ ID NO:27的重链CDRH1(RNLMS)、SEQ ID NO:45的重链CDRH2(SINFRNITWYASWAKG)、SEQ ID NO:63的重链CDRH3(GVYVNSNGYYSL)、SEQ ID NO:36的轻链CDRL1(QASQSVSNLLA)、SEQ ID NO:54的轻链CDRL2(GASKLES)、SEQ ID NO:72的轻链CDRL3(QTYWGGDGTSYLNP)。
在一些实施例中，抗体或其片段包含11A2的六个CDR。在一些实施例中，本发明的抗体或片段包含11A5的六个CDR。在一些实施例中，本发明的抗体或片段包含14C8的六个CDR。在一些实施例中，本发明的抗体或片段包含2H8的六个CDR。在一些实施例中，本发明的抗体或片段包含3H8的六个CDR。在一些实施例中，本发明的抗体或片段包含8G5的六个CDR。在一些实施例中，本发明的抗体或片段包含9E7的六个CDR。
应理解，轻链可变结构域应包含轻链CDR，其中重链可变结构域应包含重链CDR。
此外，设想本发明的抗体或其片段包含
(a)轻链可变结构域，其与包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23或24(参见表B)所示序列的轻链可变结构域按递增的优先顺序至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，其中轻链可变结构域包含
(a1)轻链CDR1，其与表D所示的轻链CDR1的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(a2)轻链CDR2，其与表D所示的轻链CDR2的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(a3)轻链CDR3，其与表D所示的轻链CDR3的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，和
(b)以及重链可变结构域，其与包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14或15(参见表A)所示序列的重链可变结构域至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，其中重链可变结构域包含
(b1)重链CDR1，其与表C所示的重链CDR1的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，
(b2)重链CDR2，其与表C所示的重链CDR2的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失，和
(b3)重链CDR3，其与表C所示的重链CDR3的差异不超过总共三个、两个或特别是一个氨基酸添加、取代和/或缺失。
在一个实施例中，本发明的抗体或其片段包括
(a)轻链可变结构域，其与包含SEQ ID NO:16、17、18、19、20、21、22、23或24(参见表B)所示序列的轻链可变结构域按递增的优先顺序至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，其中轻链可变结构域包含
(a1)表D中所示的轻链CDR1，
(a2)表D中所示的轻链CDR2，和
(a3)表D中所示的轻链CDR3，
(b)以及重链可变结构域，其与包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11、12、13、14或15(参见表A)所示序列的重链可变结构域至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％相同，其中重链可变结构域包含
(b1)表C中所示的重链CDR1，
(b2)表C中所示的重链CDR2，和
(b3)表C中所示的重链CDR3。
术语“抗体”是指免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，举例而言包括但不限于，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它们的组合以及在任何脊椎动物，例如哺乳动物诸如山羊、兔和小鼠的免疫应答期间产生的类似分子以及非哺乳动物物种，诸如鲨鱼免疫球蛋白。在一些实施例中，抗体可以是兔抗体。术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和特异性结合目标分子的“抗体片段”或“抗原结合片段”。在一个优选的实施例中，抗体是IgG抗体。
特别地，术语“抗体”是指至少包含轻链和重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其特异性识别并结合抗原的表位。抗体由重链和轻链组成，每条重链和轻链均具有可变区，称为可变重链(VH)区和可变轻链(VL)区。VH区和VL区共同负责结合由抗体识别的抗原。通常，本发明的抗体具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。如本文所用，术语“轻链”包括具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。术语“重链”包括具有足够可变区序列以赋予结合特异性的全长重链及其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3，VH结构域在多肽的氨基末端，CH结构域在羧基末端，其中CH3最接近多肽的羧基末端，
有五个主要的重链类别(或同种型)决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链各自含有恒定区和可变区(这些区也称为“结构域”)。组合在一起，重链和轻链可变区特异性结合抗原。轻链和重链可变区含有被三个高变区中断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“CDR”。CDR主要负责与抗原表位的结合。每个链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N末端开始依次编号，并且通常也通过特定CDR所位于的链来鉴定。因此，VH CDR3位于发现它的抗体的重链的可变结构域中，而VL CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变结构域的CDR1。
本发明的抗体或其片段可以是单链抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体及其片段。例如，抗体可以是IgG抗体例如IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施例中，抗体或其片段已经重组产生。
本发明还涵盖本发明的单克隆抗体的片段。该片段应为具有免疫功能的片段，即抗原结合片段。因此，本发明的单克隆抗体的片段应能够结合一种或多种BMP10-型肽。因此，如本文所用，术语抗体的“免疫功能片段”是指缺少至少一些存在于全长链中但能够特异性结合一种或多种BMP10-型肽的氨基酸的抗体的一部分。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段。如何产生抗原结合片段是本领域众所周知的。例如，可以通过酶促切割本发明的抗体来产生片段。此外，片段可以通过合成或重组技术产生。Fab片段优选通过抗体的木瓜蛋白酶消化产生，Fab'片段通过胃蛋白酶消化和部分还原产生，F(ab')2片段通过胃蛋白酶消化产生。Fv片段优选通过分子生物学技术产生。
在一个实施例中，本发明的抗体片段是F(ab`)2片段。在另一个实施例中，本发明的抗体片段是F(ab`)2片段。在另一个实施例中，本发明的抗体片段是Fab片段。在另一个实施例中，本发明的抗体片段是Fv片段。
抗体片段也可以是双抗体。双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。双体抗体优选包含与同一多肽链中的轻链可变结构域连接的重链可变结构域。
本发明的抗体优选为单克隆抗体。如本文所用，术语“单克隆抗体”是指由单个B淋巴细胞或由转染了抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。
在实施例中，本发明的抗体是分离的抗体。因此，抗体应为已纯化的抗体。可以通过本领域熟知的方法来实现抗体的纯化。
本发明的单克隆抗体或其片段(以及上节所指的试剂应能与一种或多种BMP10-型肽(诸如NT-proBMP10)结合。术语“结合”、“特异性结合”、“能够结合”和“能够特异性结合”在本文中优选地可互换使用。术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指其中结合对分子在它们没有与其他分子显著结合的条件下表现出彼此结合的结合反应。当提及蛋白质或肽作为生物标志物时，术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地指结合试剂以至少107M-1的亲和力(“结合常数”Ka)与对应的生物标志物结合的结合反应。术语“特异性结合”或“特异性地结合”优选地是指对其靶分子具有至少108M-1或甚至更优选至少109M-1的亲和力。术语“特异的”或“特异性地”用于表示样品中存在的其他分子不显著地与特异于该靶分子的结合试剂结合。然而，如上文所解释的，本文所指的试剂不仅应当能够结合NT-proBMP10，而且能够结合preproBMP10和proBMP10。
KD是解离常数，它可以通过结合确定来确定，诸如表面等离子共振技术(
Figure BDA0003806278890000731
GE-Healthcare Uppsala，瑞典)。优选地，与一种或多种BMP10-型肽结合的抗体(或其抗原结合片段)，在一些实施例中，在37℃下具有一种或多种BMP10-型肽(特别是人NT-proBMP10)在1位纳摩尔范围或亚纳摩尔范围的KD值。
描述抗体与其抗原的动力学结合特性的另一种方法是将解离平衡常数分解为其动力学速率贡献，因为存在缔合速率ka常数和解离速率常数kd。缔合速率ka常数表征了抗体/抗原复合物形成的速度并且是时间和浓度依赖性的。在一些实施例中，与一种或多种如本文所指的BMP10-型肽(特别是人NT-proBMP10)结合的本发明抗体(或其抗原结合片段)在37℃下具有大于1.0E+05M-1s-1的ka值(对于其抗原)。
解离速率常数(kd)表示抗体与其抗原的解离速率。因此，解离速率常数表示复合物在单位时间内分解的概率。解离速率常数越低，抗体与其抗原的结合越紧密。在一些实施例中，与一种或多种如本文所指的BMP10-型肽(特别是人NT-proBMP10)结合的本发明抗体(或其抗原结合片段)在37℃下具有小于1.1E-03s-1的kd值。
在一些实施例中，KD值、kd值和ka值如实施例部分中那样确定。
术语“表位”表示能够特异性结合至抗体的蛋白决定簇。因此，该术语优选地是指如本文所指的多肽中能够被本发明的抗体(或其片段)特异性结合的部分。表位通常由分子如氨基酸的化学活性表面大组组成，并且通常表位具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合而不是后者的结合会丢失。
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于与确定如本文所指的BMP10-型肽的量有关的方法中。例如，抗体或其片段允许确定用于诊断方法的样品中BMP10-型肽的量。
因此，本发明涉及一种通过使用本发明的抗体或片段来确定一种或多种BMP10-型肽的量的方法。用于确定生物标志物的量的优选方法，诸如夹心测定法，在标题为“生物标志物的量的确定”的小节中进行了描述。
例如，确定一种或多种BMP10-型肽的量的方法可以包括使含有一种或多种BMP10-型肽的样品与至少一种结合在SEQ ID NO:1中所示多肽的氨基酸区域22至316内的试剂接触的步骤，从而允许形成BMP10-型肽和至少一种试剂的复合物，并确定形成的复合物的量。
此外，抗体或其片段可包含标签，即其可共价或非共价偶联至允许检测和测量结合试剂的标签。优选的标签在上文中公开。例如，标签可以是生物素、放射性标签、荧光标签、化学发光标签、电化学发光标签、金标签，或如上文更详细描述的磁性标签。
在一个实施例中，抗体或其片段(诸如(ab')2片段)是生物素化的。在另一个实施例中，抗体或其片段是钌化的(如上所述)。
本发明进一步涉及本发明的抗体或其片段用于确定样品中一种或多种BMP10-型肽的体外用途。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含本发明的至少一种单克隆抗体或其片段。术语试剂盒已在上文进行了定义。
此外，鉴定了允许在夹心测定中改进BMP10-型肽的检测的抗体对(实施例13)。具体来说，在多个夹心中测试了生物素化和钌化的克隆2H8、3H8、8G5、9E7 11A5、11C10、14C8、13G6以鉴定夹心配偶体。如果发现克隆13G6和11C10的组合显示出与方向无关的高等级性能。对3H8和9E7的组合进行了类似的观察。其他组合实现了良好的比率。尽管仅在一个方向上，其他组合也取得了不错的比率。
因此，本发明涉及一种试剂盒，其包含结合一种或多种BMP10-型肽的第一抗体或其抗原结合片段和结合一种或多种BMP10-型肽的第二抗体或其抗原结合片段,优选地，其中所述第一抗体和第二抗体结合不同的表位，其中第一抗体选自2H8、3H8、8G5、9E7、11A5、11C10、14C8、13G6(或其变体，并且其中第二抗体选自2H8、3H8、8G5、9E7 11A5、11C10、14C8、13G6(或其变体)。
两种抗体或其片段都可以被标记。例如，第一抗体或其片段可以是钌化的，第二抗体或其片段可以是生物素化的(反之亦然)。
在一些实施例中，第一抗体是2H8。在一些实施例中，第一抗体是3H8。在一些实施例中，第一抗体是8G5。在一些实施例中，第一抗体是9E7。在一些实施例中，第一抗体是11A5。在一些实施例中，第一抗体是11C10。在一些实施例中，第一抗体是14C8。在一些实施例中，第一抗体是13G6。
优选的抗体组合在实施例14的表13和表14中公开。
例如，第一抗体可以是11C10，第二抗体可以是13G6(反之亦然)。
例如，第一抗体可以是3H8，第二抗体可以是9E7(反之亦然)。
在一个实施例中，试剂盒包含特异性结合一种或多种BMP10-型肽的生物素化的第一单克隆抗体或其片段，其中第一抗体是11C10(或其变体)，和钌化的第二单克隆抗体或其片段，其中第二抗体是13G6(或其变体)。
在一个实施例中，试剂盒包含特异性结合一种或多种BMP10-型肽的生物素化的第一单克隆抗体或其片段，其中第一抗体是13G6(或其变体)，和钌化的第二单克隆抗体或其片段，其中第二抗体是11C10(或其变体)。
本发明还涉及产生本发明的抗体或其抗原结合片段的宿主细胞。在一优选的实施例中，产生本发明抗体的宿主是杂交瘤细胞。此外，宿主细胞可以是任何类型的细胞系统，其可以被工程化以产生根据本发明的抗体。例如，宿主细胞可以是动物细胞，特别是哺乳动物细胞，诸如HEK细胞。在一个实施例中，HEK293(人胚胎肾细胞)诸如实施例部分中使用的HEK293-F细胞，或CHO(中国仓鼠卵巢)细胞用作宿主细胞。在另一实施例中，宿主细胞是非人动物或哺乳动物细胞。
宿主细胞优选包含至少一种编码本发明抗体或其片段的多核苷酸。例如，宿主细胞包含至少一种编码本发明抗体轻链的多核苷酸和至少一种编码本发明抗体重链的多核苷酸。所述多核苷酸应可操作地连接到合适的启动子。
附图显示：
图1：三个患者组(阵发性心房颤动、持续性心房颤动和窦性心律患者)中BMP10ELISA的测量
图2：阵发性Afib中BMP10的ROC曲线；AUC＝0.68
图3：持续性Afib中BMP10的ROC曲线；AUC＝0.90(探索性AFib小组：有心房颤动病史的患者，包括14例阵发性AFib、16例持续性Afib和30例对照)
图4：区分心力衰竭患者和非心力衰竭患者的BMP10[单位：ng/ml]
图5.区分心力衰竭的BMP10；BMP10的ROC曲线；AUC＝0.76
图6.Kaplan-Meier曲线通过BMP-10四分位数显示先前有心力衰竭病史的患者中因HF住院的风险。
图7.Kaplan-Meier曲线通过BMP-10四分位数显示先前没有心力衰竭病史的患者中因HF住院的风险。
图8.Kaplan-Meier曲线通过BMP-10的二分法(中位数)显示卒中的风险。
图9.Kaplan-Meier曲线通过BMP-10四分位数显示接受肺静脉隔离(BEAT-PVI)的患者中AFib的复发风险
图10.通过SPR获得的在37℃下前肽BMP10与选择的8mAb结合的动力学特征。显示的是增加前肽BMP10浓度的传感图叠加，范围在c＝3.7-300nM之间；
A)2H8 B)3H8 C)8G5
D)9E7 E)11A5 F)11C10
G)14C8 H)13G6
图11.37℃下8种mAb结合前肽BMP10的归一化解离相叠加图
图12.本发明的四种单克隆抗体的表位
图13：NT-proBMP10的检测与成熟BMP10的检测
图14：SWISS AF研究的EDTA血浆样品中的循环BMP-10的测量，Fazekas评分<2(否)与Fazekas评分≥2(是)：WML的检测/静息性卒中风险的预测：评定循环BMP-10水平。
实例
本发明仅通过以下实例来说明。无论如何，所述实例不得以限制本发明范围的方式进行解释。
实例1：绘图试验-与基于不同循环NT-proBMP10水平的患者相比，诊断患有心房颤动的患者
绘图研究与接受开胸手术的患者有关。在麻醉和手术之前获得样品。使用具有多电极阵列的高密度心外膜绘图(高密度绘图)对患者进行电生理学表征。该试验包括14例阵发性心房颤动患者、10例持续性心房颤动患者和28例对照患者，尽可能达到最佳(年龄、性别、合并症)匹配。在绘图研究的血清样品中确定了NT-proBMP10。与对照相比，观察到心房颤动患者的NT-proBMP10水平升高。NT-proBMP10水平在阵发性心房颤动患者与匹配对照相比，以及持续性心房颤动患者与对照相比升高。
此外，在绘图队列的样品中确定了生物标志物ESM-1。有趣的是，结果表明NT-proBMP10与ESM-1的联合确定允许将AUC增加到0.92，以区分持续性AF与SR(窦性心律)。
此外，在绘图队列的样品中确定了生物标志物FABP-3。有趣的是，结果显示NT-proBMP10与FABP-3的联合确定允许将AUC增加到0.73，以区分阵发性AF与SR(窦性心律)。
实例2：心力衰竭小组
心力衰竭小组包括60例慢性心力衰竭患者。根据ESC指南标准，具有典型体征和症状以及休息时心脏结构或功能异常的客观证据的患者被诊断为心力衰竭。患有缺血性或扩张型心肌病或严重心瓣膜病并且能够签署同意书的18至80岁的患者被纳入研究。排除最近6个月内发生急性心肌梗死、肺栓塞或卒中，进一步合并严重肺动脉高压和终末期肾病的患者。患者主要患有心力衰竭阶段NYHA II-IV。
健康对照队列包括33名受试者。通过评定ECG和超声心动图结果的状态来验证健康状态。排除有任何异常的参与者。
与对照相比，在心力衰竭患者的血清样品中观察到NT-proBMP10水平升高。
实例3：生物标志物测量
在骨形态发生蛋白10(BMP10)的研究级ECLIA测定中测量NT-proBMP10；ECLIA测定来自德国罗氏诊断公司。
为了检测人血清和血浆样品中的NT-proBMP10，使用了特异性结合BMP10的N末端前区段的抗体夹心。此类抗体也与proBMP10和preproBMP10结合。因此，确定了BMP10的N末端前区段、proBMP10和preproBMP10的量的总和。基于来自其他BMP-型蛋白的发现的结构预测，例如，BMP9表明BMP10与proBMP10保持在复合物中，因此对N末端前区段的检测也反映了与前域结合的BMP10的量。此外，可以检测BMP10的同二聚体形式，以及异二聚体结构，例如，与BMP9或其他BMP-型蛋白的组合。
实例4：SWISS AF研究-心力衰竭住院的风险预测
SWISS-AF研究的数据包括2387例患者，其中617例有心力衰竭(HF)病史。在这些患者中测量了BMP-10，以评定其预测因心力衰竭住院风险的能力。
由于心力衰竭住院可能发生在有心力衰竭病史的患者和没有已知心力衰竭病史的患者中，因此在这些组中独立评定了预测未来心力衰竭住院的能力。在随访期间，共有233例患者因HF住院。233例住院治疗中有125例发生在有先前已知HF的患者中。
有已知HF病史的患者HF住院的预测
表1显示了cox比例风险模型的结果，包括有已知HF病史的患者。因变量是直到HF住院的时间，自变量是log-2转换的NT-proBMP10值。
从风险比和低p值可见，NT-proBMP10能够明显预测有已知HF病史的患者的HF住院风险。由于NT-proBMP10值在输入模型之前进行了log-2转换，因此风险比可以解释为，如果NT-proBMP10值翻倍，则患者的风险增加3.43
风险比 95％置信区间 P值
3.43 2.23–5.27 <0.001
表1：NT-proBMP10(log-2转换)的cox比例风险模型总结预测有已知HF病史患者HF住院风险。
图6显示了Kaplan-Meier曲线，它通过NT-proBMP10四分位数显示了HF住院风险。可以看出，风险随着NT-proBMP10值的增加而不断增加，并且观察到NT-proBMP10水平在最高四分位数内的患者的风险最高。
没有已知HF病史的患者HF住院的预测
表2显示了cox比例风险模型的结果，包括没有已知HF病史的患者。因变量是直到HF住院的时间，自变量是log-2转换的NT-proBMP10值。
从风险比和低p值可见，NT-proBMP10能够明显预测没有已知HF病史的患者的HF住院风险。由于NT-proBMP10值在输入模型之前进行了log-2转换，因此风险比可以解释为，如果NT-proBMP10值翻倍，则患者的风险增加3.43
风险比 95％置信区间 P值
4.24 2.52-7.15 <0.001
表2：NT-proBMP10(log-2转换)的cox比例风险模型总结预测没有已知HF病史患者HF住院风险。
图7显示了Kaplan-Meier曲线，它通过NT-proBMP10四分位数显示了HF住院风险。可以看出，风险随着NT-proBMP10值的增加而增加，并且NT-proBMP10水平在两个最高四分位数内的患者的风险最高。
实例5：SWISS AF研究-卒中的风险预测
在患有记录的心房颤动的患者的前瞻性、多中心登记中，证实了循环NT-proBMP10预测卒中发生风险的能力(参考实例3)(Conen D.,Swiss Med Wkly.2017Jul 10；147:w14467)。
发生事件的65例患者和未发生事件的2269例患者出现了可用的NT-proBMP10结果。
为了量化NT-proBMP10的单变量预后值，使用具有卒中结果的成比例风险模型。
用由NT-proBMP10给出的预后信息的两种不同组合来评定NT-proBMP10的单变量预后性能。
第一成比例风险模型包括以中位数(2.2ng/mL)二值化的NT-proBMP10，因此比较NT-proBMP10低于或等于中位数的患者与NT-proBMP10高于中位数的患者的风险。
第二成比例风险模型包括原始的NT-proBMP10水平，但转换为log2尺度。执行log2转换是为了实现更好的模型校准。
为了获得基于二分基线NT-proBMP10测量(<＝2.2ng/mL对>2.2ng/mL)的两组中绝对生存率的估计，创建了Kaplan-Meier曲线。
为了评定NT-proBMP10的预后值是否独立于已知的临床和人口统计学风险因素，计算加权成比例cox模型，该加权成比例cox模型还包括以下变量：年龄和卒中/TIA/血栓栓塞病史。这些是整个同期群(包括所有对照患者)中仅有的显著的临床风险预测因子。
为了评定NT-proBMP10提高卒中预后的现有风险评分的能力，通过NT-proBMP10(log2转换的)扩展CHADS2、CHA2DS2-VASc和ABC评分。通过创建包括NT-proBMP10和相应风险评分作为独立变量的分部风险模型来进行扩展。
将CHADS2、CHA2DS2-VASc和ABC评分的c指数与这些扩展模型的c指数进行比较。
结果
表1显示了两个单变量加权成比例风险模型的结果，该两个单变量加权成比例风险模型包括经二值化或log2转换的NT-proBMP10。在使用log2转换的NT-proBMP10作为风险预测因子的模型中，经历卒中风险与NT-proBMP10基线值之间的关联并不显著，但接近0.05的显著性水平。
对于使用二值化NT-proBMP10的模型，p值略高。然而，可以说随着事件数量的增加，这种影响可能具有统计学意义。
二值化的NT-proBMP10的风险比意味着基线NT-proBMP10>2.2ng/mL的患者组的卒中风险比基线NT-proBMP10<＝2.2ng/mL的患者组的卒中风险的高1.5倍。这也可以在显示两组的Kaplan Meier曲线的图8中看到。
包括作为经log2转换的线性风险预测因子的NT-proBMP10的成比例风险模型的结果表明，经log2转换的值NT-proBMP10与经历卒中风险成比例。风险比2.038可以解释为NT-proBMP10降低2倍与卒中风险增加2.038有关。
表1：包括经二值化和log2转换的NT-proBMP10的单变量加权成比例风险模型的结果。
Figure BDA0003806278890000811
表2显示了包括NT-proBMP10(经log2转换的)的成比例风险模型与临床和人口统计学变量相结合的结果。可以看出，NT-proBMP10的预后值在一定程度上降低了，但这也可以部分地通过模型的低统计能力来解释。
表2：包括NT-proBMP10及相关的临床和人口统计学变量的多变量成比例风险模型。
Figure BDA0003806278890000821
表3显示了加权成比例风险模型的结果，该加权成比例风险模型结合了CHADS2评分与NT-proBMP10(经log2转换的)。在这个模型中，NT-proBMP10可以将预后信息添加到CHADS2评分中，但p值高于0.05，但是这对于低样品量是可以容忍的。
表3：结合CHADS2评分与NT-proBMP10的加权成比例风险模型(经log2转换的)
Figure BDA0003806278890000822
表4显示了加权成比例风险模型的结果，该加权成比例风险模型结合了CHA2DS2-VASc评分与NT-proBMP10(经log2转换的)。同样在该模型中，NT-proBMP10可以将预后信息添加到CHA2DS2-VASc评分中，但p值高于0.05，但是这对于低样品量是可以容忍的。
表4：结合CHA2DS2-VASc评分与NT-proBMP10的加权成比例风险模型(经log2转换的)
Figure BDA0003806278890000823
表5显示了加权成比例危险模型的结果，该加权成比例风险模型结合了ABC评分与NT-proBMP10(经log2转换的)。在这个模型中，估计的风险比降低了，并且NT-proBMP10可能无法增加任何预后性能
表5：结合ABC评分与NT-proBMP10的加权成比例风险模型(经log2转换的)
Figure BDA0003806278890000831
表6显示了在病例同期群选择中，单独的NT-proBMP10、CHADS2评分、CHA2DS2-VASc评分、ABC评分和加权成比例危险模型(将CHADS2、CHA2DS2-VASc、ABC评分与NT-proBMP10(log2)结合)的估计c指数。可以看出，添加NT-proBMP10提高了CHADS2的c指数，即CHA2DS2-VASc评分，但没有提高ABC评分。
CHADS2、CHA2DS2-VASc、ABC评分的c指数的差值分别为0.019、0.015和-0.002。
表6：NT-proBMP10、CHA2DS2-VASc评分、CHA2DS2-VASc评分与NT-proBMP10结合的C指数，以及CHADS2和ABC评分及其与NT-proBMP10结合的C指数。
C-指数
NT-proBMP10单变量 0.577
CHADS<sub>2</sub> 0.629
CHADS<sub>2</sub>+NT-proBMP10 0.643
CHA<sub>2</sub>DS<sub>2</sub>-VASc 0.616
CHA<sub>2</sub>DS<sub>2</sub>-VASc+NT-proBMP10 0.627
ABC评分 0.692
ABC评分+NT-proBMP10 0.690
实例6：BEAT-AF-PVI研究-预测肺静脉隔离和导管消融后复发性AFib的风险。
在BEAT-AF-PVI研究中评定了NT-proBMP10预测未来心房颤动复发风险的能力。BEAT-AF-PVI研究(Knecht S，国际心脏病学杂志，第176卷，2014年第3期，第645-650页)是一项包括接受肺静脉隔离的心房颤动患者的前瞻性队列研究。收集的研究终点之一是心房颤动第一次复发的时间。因此，循环NT-proBMP10预测PVI和导管消融后AFib复发风险的能力在患有记录的心房颤动的患者的前瞻性、多中心登记中得到验证(Zeljkovic I.,Biochem Med.2019；29:020902)。
719例患者可获得NT-proBMP10测量结果和有关心房颤动复发的信息。对于719例患者中的310例，观察到心房颤动复发。在骨形态发生蛋白10(NT-proBMP10)的研究级ECLIA测定(来自德国罗氏诊断公司)中测量NT-proBMP10。
通过Cox(比例风险)回归模型评定NT-proBMP10预测复发性心房颤动风险的能力。表1显示了比例风险模型的结果。结果表明，随着NT-proBMP10值的增加，复发性心房颤动的风险显著增加。由于NT-proBMP10包含在log2转换的模型中以改进模型校准，因此如果NT-proBMP10增加2倍，则可以将风险比解释为增加1.91风险。
表7：Cox回归模型通过NT-proBMP10的log2转换值预测复发性AFIB风险的总结。
风险比 风险比95％CI P值
NT-proBMP10(log2) 1.91 1.24–2.93 0.003
替代性地，NT-proBMP10也可以以二值化(例如，以1.7ng/mL的中位数分割)形式用于心房颤动的风险预测。表8表明NT-proBMP10水平高于中位数的患者组的风险升高了32％。这种风险差异再次具有统计学意义。
表8：Cox回归模型通过观察中位数值的二值化NT-proBMP10预测复发性AFIB风险的总结。
风险比 风险比95％CI P值
NT-proBMP10>1.7ng/mL 1.32 1.05–2.65 0.018
实例7：用循环NT-proBMP10评定复发性AF
GISSI AF研究涉及有心房颤动(AF)病史但没有明显左心室功能障碍或心力衰竭的窦性心律(SR)患者。所有患者在1年随访期间接受了3次生化NT-proBMP10评定和心电图检查。
循环NT-proBMP10水平已在6个月就诊时处于SR的n＝281例进行了采血和生物标志物检测的患者样品中、以及在6个月就诊时处于持续AF的n＝33例进行了采血和生物标志物检测的患者样品中进行了确定。使用了针对前肽BMP10的抗体。
表9在6个月就诊时处于SR和持续AF的GISSI AF患者的循环NT-proBMP10的测量
Figure BDA0003806278890000851
如表9所示，在GISSI AF研究的6个月就诊时，在采样时处于持续AF患者相对在采血时处于SR的患者，观察到NT-proBMP10。
很明显，对于NT-proBMP10，可以检测到AF患者相对SR患者标志物升高的小但非常显著的增量变化。在33例在采样时处于持续AF患者相对281例在采血时处于SR的患者中，观察到NT-proBMP10中位数值为2,31[2,04-2,67]与1,97[1,75–2,33]ng/mL。
n＝105例患者的样品在6个月就诊时处于SR，但从随机分组到6个月就诊期间经历了不止一次AF复发。所有105例患者均自发转为SR。
-0-7天n＝11例患者
-8-30天n＝17例患者
->30天n＝77例患者
Figure BDA0003806278890000852
表10处于SR的GISSI AF患者中循环NT-proBMP10的测量；采样前几天经历复发性AF的患者的病例对照
如表10所示，在患者AF后观察到NT-proBMP10滴度升高长达7天，其自发转化为SR。在11例采样前长达7天出现AF的患者，与采血前超过30天出现AF的77例患者相比，中位数值为2,30[1,65–2,45]相对1,90[1,75-2,25]ng/mL。令人惊讶的是，在采样前出现AF后长达7天内，观察到NT-proBMP10的中位数值与持续AF的患者非常相似。在11例采样时长达7天前出现AF后SR的患者中，观察到NT-proBMP10中位数值为2,30[1,65–2,45]ng/mL。如表9所示，在处于SR时持续AF的33例患者中，在采血时观察到NT-proBMP-10中位数值为2,31[2,04–2,67]ng/ml。
数据评定表明，NT-proBMP10水平(独立于其他生物标志物)高于参考值(在研究中>2.0ng/mL)的患者在治疗干预后怀疑有复发性心房颤动，例如心脏复律后。区分不良和良好的治疗应答支持作出的决策：哪些患者可能不会从治疗中受益以避免昂贵的治疗和相关负担，但对患者的结果不佳。
甚至显示，在前一次AF发作后长达7天出现窦性心律的患者中可以检测到升高的NT-proBMP10水平。
总之，在7天内出现窦性心律的患者通过单独检测到NT-proBMP10水平升高或与心脏损伤标志物(例如cTNThs)和/或心力衰竭标志物(NT-ProBNP)结合可以实现阵发性心房颤动的诊断。
实例8：NT-proBMP10的检测与成熟BMP10的检测
为了比较检测成熟BMP10和NT-proBMP10的情况，将如实施例14中所述的Elecsys原型检测方法与检测成熟BMP-10同二聚体(aa 317-424)的BMP-10ELISA(R&DsystemsDuoSet DY2926-05)进行头对头分析。测量的样品来自实施例1中描述的绘图队列。诊断为心房颤动的患者与基于不同循环BMP10水平的患者相比，应用检测NT-proBMP10的新方法与来自R&Dsystems的用于检测成熟BMP10的商业免疫测定进行比较。使用具有多电极阵列的高密度心外膜绘图(绘图研究)对来自患者的血清样品进行电生理学表征(图13，或下表)。
样品 成熟BMP10[pg/ml] 诊断
患者1 52.4 窦性心律
患者2 605 窦性心律
患者3 552 窦性心律
患者4 217 持续性AF
患者5 2374 窦性心律
患者6 74.5 阵发性AF
52个样品中只有6个可以检测到成熟的BMP10水平。这些反映了4例窦性心律、1例阵发性和1例持续性AF患者。而可以检测到如实施例1中所述的所有样品的NT-proBMP10水平。
仅11.5％的样品具有可检测水平的成熟BMP10的这一发现表明，由于受体结合后的内化，生理上成熟形式在循环中的代表性不足。因此，NT-proBMP10以更稳定的形式和更高的可检测浓度水平循环。允许根据循环NT-proBMP10水平做出临床决策。
实例9：对兔子进行免疫以产生针对BMP-10的抗体
在这里，我们描述了能够结合骨形态发生蛋白10(NT-proBMP10)的开发抗体。为了产生这种抗体，我们用rec.NT-proBMP10(一种包含preproBMP10前312个氨基酸的多肽)免疫12-16周大的NZW兔子。对所有兔子进行重复免疫。在第一个月，每周对动物进行免疫。从第二个月起，对动物每月免疫一次。对于第一次免疫，我们将500μg免疫原溶解在1mL 140mMNaCl中，然后将溶液乳化在1ml CFA中。对于随后的所有免疫，用IFA代替CFA。
实例10：开发结合NT-proBMP10的抗体
为了开发与BMP-10结合的抗体，使用如Seeber等人(2014),PLoS One.2014Feb 4；9(2)所述的B细胞克隆。首先，通过ficoll梯度离心从经免疫的动物的全血制备PBMC细胞池。为了从PBMC池中富集抗原反应性B细胞，将随机生物素化的NT-proBMP10固定在链霉亲和素包被的磁珠(Miltenyi)上。对于珠子的涂层，使用浓度为1μg/ml的蛋白质。因此，我们将制备的经免疫的动物的PBMC池与NT-proBMP10包被的珠子一起孵育1小时。为了富集抗原反应性B细胞，使用MACS柱(Miltenyi)。B细胞分选和孵育如Seeber等人(2014),PLoSOne.2014 Feb 4；9(2)中所述进行。为了通过ELISA鉴定NT-proBMP10反应性克隆，我们将NT-proBMP10固定在96孔板的表面上，用于固定的浓度为250ng/ml。洗涤后，用5％BSA封闭板以减少背景信号。再次洗涤板，将30μl原代兔B细胞上清液转移到96孔板中，并在室温下孵育1小时。为了检测与筛选肽结合的抗体，添加了HRP标记的F(ab`)2山羊抗兔Fcγ(Dianova)和ABTS(Roche)作为底物。如Seeber等人(2014),PLoS One 2014 Feb 4；9(2)中所述，选择与结合NT-proBMP10的板结合的克隆用于随后的分子克隆。
实例11：动力学筛选
信息抗原：前肽BMP10(R&D-Systems)和内部构建体“312”(前前肽BMP10)均代表BMP10±19aa N末端前导肽的前域。重组人BMP-10，R&D-Systems，货号：2926-BP/CF，批号：Qual0518031，二硫键连接的同二聚体，MW 24.40kDa。
动力学筛选
动力学筛选在37℃下在GE Healthcare Biacore 4000仪器上进行。将BiacoreCM5系列S传感器安装到仪器中，并根据制造商的说明进行流体力学处理和预处理。系统缓冲液为HBS-EP(10mM HEPES,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05％(w/v)P20)。将补充有1mg/mLCMD(羧甲基葡聚糖，Fluka)的系统缓冲液用作样品缓冲液。
将兔抗体捕获系统固定在传感器表面。根据制造商的说明，使用EDC/NHS化学将多克隆山羊抗兔IgG Fc捕获抗体GARbFcγ(代码号111-005-046；Jackson Immuno Research)胺偶联。
将10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的30μg/mL GARbFcγ预浓缩至流动池1、2、3和4中的点1、2、4和5，并以约10000RU的密度与CMD表面共价结合。随后用1M乙醇胺pH 8.5饱和游离的活化羧基。
点1和5用于相互作用测量，点2和4用作参考。每种兔抗体上清悬浮液在样品缓冲液中按1:5稀释，并以10μL/min的流速进样2分钟。以响应单位(RU)监测兔抗体捕获水平(CL)。
以30μL/min的速度将构建体“312”以单一浓度c＝150nM注射到各自表面展示的抗前肽BMP10兔mAb。缔合相和解离相各监测5分钟。在每个动力学确定循环后，通过以20μL/min注射10mM甘氨酸pH 1.5 30秒，将兔克隆从传感器表面完全清洗。从获得的传感图中提取在前肽BMP10注射结束前不久的报告点结合晚期(BL)和解离结束前不久的稳定性晚期(SL)。它们用于表征抗体/抗原结合稳定性。此外，根据Langmuir 1:1模型计算解离速率常数kd[s-1]。根据公式ln(2)/60*kd.计算抗原/抗体复合物稳定性半衰期(分钟)。使用以下公式计算代表结合化学计量的摩尔比：
MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)
使用这种方法测试了280种兔抗体。18个Abs被鉴定为具有符合Elecsys平台标准的合适的动力学特性。
动力学表征
使用来自GE Healthcare的BIAcore 8K仪器进行详细的动力学研究。兔mAbs<前肽BMP10>克隆2H8、3H8、8G5、9F7、11A5、11C10、14C8和13G6-通过动力学筛选鉴定-在37℃下详细动力学表征结合前肽BMP10。
将Biacore CM5系列S传感器(批号#10281824/10276998)安装到仪器上。
捕获分子的胺偶联
将兔抗体捕获系统固定在传感器表面。多克隆山羊抗兔IgG Fc捕获抗体GARbFcγ(编号111-005-046，批号#131053；Jackson Immuno Research)根据制造商的说明使用EDC/NHS化学进行胺偶联：运行缓冲液：HBS-N缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)，通过EDC/NHS混合物激活，捕获抗体在偶联缓冲液NaAc,pH 5.0,c＝30μg/mL中稀释；最后通过注射1M乙醇胺pH 8.5封闭剩余的活化羧基；Ab密度达到11200–12700RU
前肽BMP10在37℃下与选定的mAb结合的动力学表征
系统和样品缓冲液为HBS-EP(10mM HEPES,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05％(w/v)P20,pH 7.4)。
通道1、2、3、4、5、6、7和8的流动池2用于相互作用测量，每个通道的流动池1用作参考。每种兔抗体在样品缓冲液中稀释至3nM，并以5μL/min的流速进样2分钟。以响应单位(RU)监测兔抗体捕获水平(CL)。
以60μL/min的速度将一系列浓度增加的c＝3.7-300nM前肽BMP10“BMP10(312)”注射到显示的抗前肽BMP10兔mAb的相应表面，重复浓度c＝33.3nM。监测缔合相3分钟；监测解离相10分钟。在每个动力学确定循环后，通过注射10mM甘氨酸pH 2.0 1分钟从捕获系统中洗脱兔克隆，然后以20μL/分钟连续两次注射10mM甘氨酸pH 2.25 1分钟。
根据来自GE Healthcare的BIAcoreTM评定软件Insight SW V 2.0，使用Langmuir1:1拟合模型评定解离速率常数kd。根据公式ln(2)/60*kd.计算抗原/抗体复合物稳定性半衰期(分钟)。
使用以下公式计算代表结合化学计量的摩尔比：
MW(抗体)/MW(抗原)*BL(抗原)/CL(抗体)
由于前肽BMP10是二聚体分子，因此获得的亲和力是亲合力负载的，因此代表了明显的数据。
结果
动力学筛选
使用动力学筛选方法测试了280种兔抗体。鉴定并进一步表征了18个具有合适动力学特性的抗体。
详细的动力学表征
从280个动力学筛选的兔单克隆抗体中选择了18个抗体。
详细的浓度依赖性动力学研究表明，前肽BMP10相互作用不符合Langmuir 1:1相互作用。
前肽BMP10是一种二聚体分子，相互作用可能是亲合力负担的。动力学数据代表明显的数据，但可以通过传感图的视觉检查和抗体线性解离相的量化来表征。复杂的半衰期在t/2diss＝6和>115分钟之间变化。结合化学计量在1.2到1.4之间，表示2:1结合化学计量。
除14C8和8G5外的所有Abs均显示出合适的动力学曲线：相当快的复合物形成速度和复合物半衰期t/2diss>15分钟。所有Abs的摩尔比表明2:1结合化学计量。克隆8G5和14C8显示出比其他克隆稍慢的缔合和不太复杂的稳定性。两者都覆盖相同的表位区域。克隆2H8和3H8，每个都覆盖一个独特的表位区域。
克隆13G6显示最慢的解离(kd<1.0E-04s-1)，导致复合物半衰期t/2-diss>115分钟。克隆11A5显示出合适的动力学特征，具有快速的复合物形成速度和30分钟的复合物半衰期。摩尔比表明具有2:1结合化学计量的功能齐全的抗体。
结果总结在表11中，传感图叠加显示在图10中。8个克隆的归一化抗体解离相如图11所示
表11：通过SPR(
Figure BDA0003806278890000912
8K)在37℃下测量的前肽BMP10与选择的mAb<前肽BMP10>结合的动力学常数和亲和力数据
Figure BDA0003806278890000911
kd解离速率常数[s-1]
t/2-diss根据公式ln(2)/60*kd计算的抗原/抗体复合物稳定性半衰期[min]
Rmax最大分析物响应[RU]
MR摩尔比:每个mAb的结合分析物的Rmax实验值与理论值的比率实例12：使用肽微阵列的表位绘图
通过对应于人骨形态发生蛋白10的序列的重叠的固定肽片段(长度：15个氨基酸，14个氨基酸重叠)文库进行抗体克隆的表位映射。使用自动合成仪(Intavis MultiPep RS)在改性纤维素圆盘上合成肽，合成后溶解。然后将各个肽的溶液点到涂层的显微镜载玻片上。合成是利用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)化学在384孔合成板中的氨基改性纤维素盘上逐步进行的。在每个偶联循环中，用DIC/HOBt在DMF中的溶液活化相应的氨基酸。在偶联步骤之间，未反应的氨基用乙酸酐、二异丙基乙胺和1-羟基苯并三唑的混合物封端。合成完成后，将纤维素圆盘转移到96孔板中，并用三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合物处理以进行侧链脱保护。去除裂解溶液后，将纤维素结合的肽用TFA、TFMSA、TIS和水的混合物溶解，用二异丙醚沉淀并重新悬浮在DMSO中。随后使用Intavis载玻片点样机器人将这些肽溶液点样到Intavis CelluSpotsTM载玻片上。
对于表位分析，经制备的载玻片用乙醇洗涤，然后用Tris缓冲盐水(TBS；50mMTris，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8)洗涤，然后在37℃用5mL 10x Western BlockingReagent(Roche Applied Science)、含2.5g蔗糖的TBS,0.1％Tween 20封闭1小时进行封闭步骤。洗涤(TBS+0.1％Tween 20)后，将载玻片与TBS+0.1％Tween 20中的抗体克隆溶液(1μg/mL)在37℃下孵育1小时。洗涤后，将载玻片与抗兔二级HRP抗体(TBS-T中1:20000)一起孵育用于检测，然后与DAB底物一起孵育。将阳性SPOT分配给相应的肽序列。
表12：表位
Figure BDA0003806278890000921
Figure BDA0003806278890000931
实例13：选择用于夹心测定的抗体
生物素化和钌化克隆2H8、3H8、8G5、9E7 11A5、11C10、14C8、13G6在多个夹心中进行了测试，以识别夹心配偶体，以进一步开发Elecsys免疫测定。夹心组合中在0.01ng/ml下重组NT-proBMP10(22-312)的识别与空白值的关系(表13)反映了克隆11A2和11C2的组合在生物素化或钌化侧的信噪比为1.16和1.22。13G6和11C10的组合反映了1,22和1,23的比率，表明高等级性能与方向无关。对于比例分别为1,22和1,23的3H8和9E7的组合进行了类似的观察，但与11C10和13G6的组合相比，空白值更高。所描述的其他组合实现了良好的比率，但仅适用于一种夹心定向。
表13：关于重组NT-proBMP10(22-312)浓度水平在0,01ng/ml时在Elecsys ECLIA测量单元上的最大信号读出的抗体夹心特性和0.01ng/ml信噪比除以不含掺入重组蛋白的空白值(S/N)。
Figure BDA0003806278890000932
来自健康供体的20个天然样品的识别(表14)显示了天然血清样品中NT-proBMP10的检测范围，允许确定临床样品测量的基线值。对于11C10和13G6的Ru-和Bi-定向，这些都在相当的范围内。11C10和11A5也在两个定向上检测到类似的范围。
表14：关于所描绘的20个天然健康人血清样品的浓度水平在Elecsys ECLIA测量单元上的信号读出的抗体夹心特性是最小值、最大值和中位数值。
Figure BDA0003806278890000941
实例14：生物标志物测量(检测NT-proBMP10的示例性方法)
使用来自Roche Diagnostics(Mannheim,Germany)的商业化
Figure BDA0003806278890000942
试剂测量生物标志物NT-proBMP10的血清和血浆浓度。使用来自Roche Diagnostics(Mannheim,Germany)的原型
Figure BDA0003806278890000943
试剂测量生物标志物NT-proBMP10。
使用生物素化的兔MAB<NT-proBMP10>F(ab′)2-Bi和钌化的MAB<NT-proBMP10>-Ru进行NT-proBMP10-测定：
使用
Figure BDA0003806278890000944
cobas分析仪e601开发了一种用于特异性测量特别是人血清或血浆样品中的NT-proBMP10的电化学发光免疫测定法(ECLIA)。Elecsys NT-proBMP10免疫测定是一种通过夹心原理发挥作用的电化学发光免疫测定(ECLIA)。测定中包含两种抗体，即生物素化单克隆抗体F(ab`)2-片段MAB<BMP10>(MAB<BMP10_22-312>Bi；捕获抗体，诸如11C10)和钌化单克隆抗BMP10抗体MAB<BMP10>(MAB<BMP10_22-312>-Ru；检测抗体，诸如13G6)，与样品中的NT-proBMP10形成夹心免疫测定复合物。然后将复合物与固相链霉亲和素包被的微粒结合。这些被磁性捕获到电极表面上，在向电极施加电压时导致化学发光发射，这由光电倍增管测量。结果通过仪器特定的校准曲线确定，该曲线由6个在整个测量范围内具有不同浓度的NT-proBMP10的校准器系列确定。应用测定方案2测量样品，移液体积为20ul样品、75ul试剂1(R1)、75μl试剂2(R2)和30μl磁珠。R1含有在磷酸盐反应缓冲液中的MAB<BMP10>F(ab`)2-Bi，试剂2(R2)在含有同一反应缓冲液中的MAB<BMP10>-Ru。
实例15：基于循环BMP-10水平预测静息性脑梗死(LNCCI和SNCI)
BMP-10在评定静息性脑梗死中提供了一种用于以下各项的方法
1.根据血清/血浆中循环BMP-10水平预测心房颤动患者发生静息性脑梗死的风险(SWISSAF研究，表15+16)
2.根据血清/血浆中循环BMP-10水平(例如CHA2DS2-VASc、CHADS2评分)提高对静息性脑梗死临床卒中风险评分的临床准确性的预测(SWISS AF研究，表17)
在SWISS AF研究(Conen D.,Forum Med Suisse 2012；12:860–862；Conen等人Swiss Med Wkly.2017；147)中评定BMP-10预测静息性梗死发生风险的能力。SWISS AF队列的患者中位年龄为74岁，既往临床卒中或TIA发生率为20％，血管疾病发生率为34％，糖尿病史为17％。
在完整的SWISS AF研究中测量了BMP-10，商业前测定用于骨形态发生蛋白10(BMP-10)(高通量
Figure BDA0003806278890000951
免疫测定；Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)。为了检测BMP-10，为cobas
Figure BDA0003806278890000952
ECLIA平台开发了一种夹心免疫测定。
因为来自关于病例对照队列的单纯成比例风险模型的估计将存在偏差(由于病例与对照的变化比例)，所以使用了加权成比例风险模型。权重基于为病例对照队列选择的每个患者的逆概率。为了获得基于二分基线BMP-10测量(<＝中位数对>中位数)的两组中绝对生存率的估计，创建了Kaplan-Meier曲线的加权形式。
为了评定BMP-10提高卒中预后的现有风险评分的能力，通过BMP-10(log2转换的)扩展CHADS2、CHA2DS2-VASc和ABC评分。通过创建包括BMP-10和相应风险评分作为独立变量的分担危险模型来进行扩展。
将CHADS2、CHA2DS2-VASc和ABC评分的c指数与这些扩展模型的c指数进行比较。为了计算病例同期群中的c-指数，使用Ganna(2011)中提出的设置c-指数的加权形式。
结果
表15：脑损伤患者的BMP-10循环水平显著改变(SWISS AF研究)。脑损伤包括LNCCI和SNCI。值为中位数(第一；第三四分位数)。
Figure BDA0003806278890000961
bMRI显示LNCCI或SNCI的患者年龄较大(75.0对68.1岁，p<0.0001)，永久性AF的发生率更高(28.4％对17.8％，p＝0.0002)，收缩压水平较高(136.7对131.3mmHg，p<0.0001)以及CHA2DS2-VASc评分更高(3.2对2.1分，p<0.0001)，但口服抗凝率无差异(90.3对88.5％，p＝0.32)。如表15所示，脑损伤患者的BMP-10水平显著升高。
如表15所示，可以根据血清/血浆中的循环BMP-10水平评定心房颤动患者发生静息性脑梗死的风险。
表16：显著的多变量调整风险比(HR)(95％置信区间(CI)与静息性梗死相关的BMP-10(存在LNCCI和SNCI)
Figure BDA0003806278890000962
模型1针对年龄和性别进行了调整。
模型2还针对收缩压、既往大出血、糖尿病、外周血管疾病、BMI、吸烟状况、口服抗凝剂和抗血小板药物的使用进行了额外调整。
将生物标志物进行对数化。
如表16所示，在对年龄和性别(模型1)或年龄、性别、收缩压、既往大出血、糖尿病、外周血管疾病、BMI、吸烟状况、口服抗凝剂和抗血小板药物的使用进行多变量调整后，BMP-10与LNCCI显著相关。
因此，可以根据血清/血浆中的循环BMP-10水平评定心房颤动患者发生静息性脑梗死的风险。
表17：BMP-10显著改善与大面积非皮质梗死相关的CHAD2DS2-VASc评分。
除了CHADS2-VA2SC评分之外，预测变量是对数化的生物标志物，结果变量是存在/不存在大面积非皮质和皮质梗死。
Figure BDA0003806278890000971
当我们将单个生物标志物添加到CHA2DS2-VASc评分时，AUC(95％CI)提高了BMP-10 0.699(0.673-0.724)，如表17所示。
BMP-10与CHA2DS2-VASC评分的临床参数相结合，可以很好地预测临床静息性脑梗死，并且优于CHA2DS2-VASc评分。早期临床鉴定有认知能力下降风险的患者可以允许采取更好的诊断和预防措施。
实例16：基于循环BMP-10水平预测白质病变
SWISS-AF数据中的数据显示，BMP-10与患者存在大面积非皮质和皮质梗死(LNCCI)相关。
白质病变的程度可以通过Fazekas评分来表示(Fazekas、JB Chawluk、A Alavi、HIHurtig和RA Zimmerman American Journal of Roentgenology 1987 149:2,351-356)。Fazekas评分范围为0到3。0表示无WML，1表示轻度WML，2表示中度WML，3表示重度WML。
为了比较BMP-10与大面积非皮质和皮质梗死(LNCCI)的相关性，将患者分为两组，Fazekas评分<2(否)对Fazekas评分≥2(是)。图14显示，中度或重度WML患者与轻度或无WML患者相比，BMP-10增加。
WML程度可由临床静息性卒中引起(Wang Y,Liu G,Hong D,Chen F,Ji X,CaoG.White matter injury in ischemic stroke.Prog Neurobiol.2016；141:45–60.doi:10.1016/j.pneurobio.2016.04.005)。这进一步证明了BMP-10在预测临床卒中风险方面的有用性。
循环BMP-10区分Fazekas评分<2(否)与Fazekas评分≥2(是)的患者的能力由0.62的AUC表示。痴呆症患者大脑中的白质变化。高龄和WML评分的变化已被描述为与阿尔茨海默病患者痴呆症的严重程度相关(Kao等人，2019年)。
年龄也是临床卒中的重要预测因素。因此，循环中BMP-10水平显着增加的数据似乎不仅表明中度或重度大面积非皮质和皮质梗死(LNCCI)，而且表明与年龄相关的脑部疾病，例如血管性痴呆症。
序列表
<110> Universiteit Maastricht
F. Hoffmann-La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Academisch Ziekenhuis Maastricht
Roche Diagnostics Operations, Inc.
<120> 循环 BMP10（骨形态发生蛋白 10）的检测方法
<130> P35929
<160> 78
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 424
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gly Ser Leu Val Leu Thr Leu Cys Ala Leu Phe Cys Leu Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Leu Val Ser Gly Ser Pro Ile Met Asn Leu Glu Gln Ser Pro Leu
20 25 30
Glu Glu Asp Met Ser Leu Phe Gly Asp Val Phe Ser Glu Gln Asp Gly
35 40 45
Val Asp Phe Asn Thr Leu Leu Gln Ser Met Lys Asp Glu Phe Leu Lys
50 55 60
Thr Leu Asn Leu Ser Asp Ile Pro Thr Gln Asp Ser Ala Lys Val Asp
65 70 75 80
Pro Pro Glu Tyr Met Leu Glu Leu Tyr Asn Lys Phe Ala Thr Asp Arg
85 90 95
Thr Ser Met Pro Ser Ala Asn Ile Ile Arg Ser Phe Lys Asn Glu Asp
100 105 110
Leu Phe Ser Gln Pro Val Ser Phe Asn Gly Leu Arg Lys Tyr Pro Leu
115 120 125
Leu Phe Asn Val Ser Ile Pro His His Glu Glu Val Ile Met Ala Glu
130 135 140
Leu Arg Leu Tyr Thr Leu Val Gln Arg Asp Arg Met Ile Tyr Asp Gly
145 150 155 160
Val Asp Arg Lys Ile Thr Ile Phe Glu Val Leu Glu Ser Lys Gly Asp
165 170 175
Asn Glu Gly Glu Arg Asn Met Leu Val Leu Val Ser Gly Glu Ile Tyr
180 185 190
Gly Thr Asn Ser Glu Trp Glu Thr Phe Asp Val Thr Asp Ala Ile Arg
195 200 205
Arg Trp Gln Lys Ser Gly Ser Ser Thr His Gln Leu Glu Val His Ile
210 215 220
Glu Ser Lys His Asp Glu Ala Glu Asp Ala Ser Ser Gly Arg Leu Glu
225 230 235 240
Ile Asp Thr Ser Ala Gln Asn Lys His Asn Pro Leu Leu Ile Val Phe
245 250 255
Ser Asp Asp Gln Ser Ser Asp Lys Glu Arg Lys Glu Glu Leu Asn Glu
260 265 270
Met Ile Ser His Glu Gln Leu Pro Glu Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp
275 280 285
Ser Phe Ser Ser Gly Pro Gly Glu Glu Ala Leu Leu Gln Met Arg Ser
290 295 300
Asn Ile Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Arg Ile Arg Arg Asn Ala Lys Gly
305 310 315 320
Asn Tyr Cys Lys Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Glu Ile Gly
325 330 335
Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Glu Ala Tyr Glu Cys
340 345 350
Arg Gly Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu Thr Pro Thr Lys
355 360 365
His Ala Ile Ile Gln Ala Leu Val His Leu Lys Asn Ser Gln Lys Ala
370 375 380
Ser Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro Ile Ser Ile Leu
385 390 395 400
Tyr Leu Asp Lys Gly Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys Tyr Glu Gly Met
405 410 415
Ala Val Ser Glu Cys Gly Cys Arg
420
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Ser Leu Phe Gly Asp Val Phe Ser Glu Gln Asp
1 5 10
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Leu Glu Ser Lys Gly Asp Asn Glu Gly Glu Arg Asn Met Leu Val
1 5 10 15
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Ser Lys Gly Asp Asn Glu Gly Glu Arg
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Ser Ser Gly Pro Gly Glu Glu Ala Leu
1 5
<210> 6
<211> 295
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ser Pro Ile Met Asn Leu Glu Gln Ser Pro Leu Glu Glu Asp Met Ser
1 5 10 15
Leu Phe Gly Asp Val Phe Ser Glu Gln Asp Gly Val Asp Phe Asn Thr
20 25 30
Leu Leu Gln Ser Met Lys Asp Glu Phe Leu Lys Thr Leu Asn Leu Ser
35 40 45
Asp Ile Pro Thr Gln Asp Ser Ala Lys Val Asp Pro Pro Glu Tyr Met
50 55 60
Leu Glu Leu Tyr Asn Lys Phe Ala Thr Asp Arg Thr Ser Met Pro Ser
65 70 75 80
Ala Asn Ile Ile Arg Ser Phe Lys Asn Glu Asp Leu Phe Ser Gln Pro
85 90 95
Val Ser Phe Asn Gly Leu Arg Lys Tyr Pro Leu Leu Phe Asn Val Ser
100 105 110
Ile Pro His His Glu Glu Val Ile Met Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Thr
115 120 125
Leu Val Gln Arg Asp Arg Met Ile Tyr Asp Gly Val Asp Arg Lys Ile
130 135 140
Thr Ile Phe Glu Val Leu Glu Ser Lys Gly Asp Asn Glu Gly Glu Arg
145 150 155 160
Asn Met Leu Val Leu Val Ser Gly Glu Ile Tyr Gly Thr Asn Ser Glu
165 170 175
Trp Glu Thr Phe Asp Val Thr Asp Ala Ile Arg Arg Trp Gln Lys Ser
180 185 190
Gly Ser Ser Thr His Gln Leu Glu Val His Ile Glu Ser Lys His Asp
195 200 205
Glu Ala Glu Asp Ala Ser Ser Gly Arg Leu Glu Ile Asp Thr Ser Ala
210 215 220
Gln Asn Lys His Asn Pro Leu Leu Ile Val Phe Ser Asp Asp Gln Ser
225 230 235 240
Ser Asp Lys Glu Arg Lys Glu Glu Leu Asn Glu Met Ile Ser His Glu
245 250 255
Gln Leu Pro Glu Leu Asp Asn Leu Gly Leu Asp Ser Phe Ser Ser Gly
260 265 270
Pro Gly Glu Glu Ala Leu Leu Gln Met Arg Ser Asn Ile Ile Tyr Asp
275 280 285
Ser Thr Ala Arg Ile Arg Arg
290 295
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH-1
<400> 7
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Arg Asn Val
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ser Ile Asn Thr Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Ala Glu Gly
50 55 60
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ser
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Val
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Tyr Gly His Ser Asn Gly Tyr Tyr Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ser
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<220>
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Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gln Phe Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Leu Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr
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Thr Val Ser Ser
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Met Gly Leu Glu Tyr Ile Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2-9
<400> 51
Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2-6
<400> 57
Tyr Ala Ser Thr Leu Val Ser
1 5
<210> 58
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2-7
<400> 58
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1 5
<210> 59
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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1 5
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-1
<400> 61
Gly Val Tyr Gly His Ser Asn Gly Tyr Tyr Ser Leu
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-2
<400> 62
Gly Tyr Pro Gly Tyr Ile Ser Gly Thr Trp Ala
1 5 10
<210> 63
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-4
<400> 63
Gly Val Tyr Val Asn Ser Asn Gly Tyr Tyr Ser Leu
1 5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-4
<400> 64
Gly Tyr Ser Gly Trp Ile Ser Gly Thr Trp Ala
1 5 10
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-5
<400> 65
Asp Asn Gly Asp Ser Lys Asp Tyr Ala Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 66
<400> 66
000
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-7
<400> 67
Ala Leu Ala Gly Asp Thr Leu
1 5
<210> 68
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-8
<400> 68
Gly Arg Tyr Tyr Val Asp Gly Tyr Ala Asp Tyr Tyr Pro Gly Asp Phe
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3-9
<400> 69
Gly Pro Gly Ala Ser Gly Tyr Arg Leu Gly Leu
1 5 10
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-1
<400> 70
Gln Ser Tyr Trp Gly Gly Ser Gly Glu Arg Tyr Leu Asn Thr
1 5 10
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-2
<400> 71
Leu Gly Asp Tyr Val Ser Tyr Gly Asp Ser Ala
1 5 10
<210> 72
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-3
<400> 72
Gln Thr Tyr Trp Gly Gly Asp Gly Thr Ser Tyr Leu Asn Pro
1 5 10
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-5
<400> 73
Leu Gly Asp Tyr Val Ser Tyr Ser Glu Ala Ala
1 5 10
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-5
<400> 74
Gln Gln Thr Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Asp Asn Pro
1 5 10
<210> 75
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-8
<400> 75
Gln Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Ser Thr Tyr Gly Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-7
<400> 76
Gln Gly Thr Phe Glu Cys Ser Ser Ala Asp Cys Phe Gly
1 5 10
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-8
<400> 77
Gln Ser Tyr Tyr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Ser Ala
1 5 10
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3-9
<400> 78
Gln Gln Gly Tyr Tyr Ile Ser Gly Gly Asp Ser
1 5 10

Claims (18)

1. 一种用于评定受试者的心房颤动的方法，其包括以下步骤
a) 在来自所述受试者的至少一个样品中确定一种或多种 BMP10-型肽（骨形态发生蛋白 10-型肽）的量，以及
b) 将所述 BMP10-型肽的所述量与所述 BMP10-型肽的参考量、与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此评定心房颤动，
其中步骤 a) 包括使所述样品与至少一种试剂接触，所述至少一种试剂能够在 SEQID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至 299 内结合。
2. 根据权利要求 1 所述的方法，其中所述试剂为单克隆抗体或其抗原结合片段。
3. 根据权利要求 2 所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段能够与以下项结合
a) 包含在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸区域 171 至 185 中的表位（LESKGDNEGERNMLV，SEQ ID NO: 3），例如包含在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸区域 173 至 181 中的表位（SKGDNEGER，SEQ ID NO: 4），
b) 包含在 SEQ ID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至 47 中的表位（SLFGDVFSEQD，SEQ ID NO 2），或
c) 包含在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸区域 291 至 299 中的表位（SSGPGEEAL，SEQ IDNO 5）。
4. 根据权利要求 2 至 3 所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域，所述重链可变结构域与包含 SEQ ID NO: 7、8、9、10、11、12、13、14 或 15中所示的序列（参见表 A）的重链可变结构域至少 80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 相同，所述轻链可变结构域与包含 SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、21、22、23 或 24中所示的序列（参见表 B）的轻链可变结构域按递增的优选次序至少 80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 相同。
5. 根据权利要求 2 至 4 中任一项所述的方法，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含
(a) 轻链可变结构域，其包含
(a1) 选自 SEQ ID NO: 34-42 的轻链 CDRl 序列，
(a2) 显示选自 SEQ ID NO: 52-60 的轻链 CDR2，和
(a3) 选自 SEQ ID NO: 70-78 的轻链 CDR3，
以及
(b) 重链可变结构域，其包含
(b1) 选自 SEQ ID NO: 25-33 的重链 CDR1，
(b2) 选自 SEQ ID NO: 43-51 的重链 CDR2，和
(b3) 选自 SEQ ID NO: 61-69 的重链 CDR3。
6. 根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的方法，其中心房颤动的所述评定为对心房颤动的诊断。
7. 根据权利要求 1 至 5 中任一项所述的方法，其中心房颤动的所述评定为对与心房颤动相关的不良事件的风险的预测，
特别地，其中所述与心房颤动相关的不良事件为心房颤动的复发（例如肺静脉隔离(PVI) 或消融疗法后心房颤动的复发）和/或卒中。
8. 根据权利要求 7 所述的方法，其中所述 BMP10-型肽的量指示受试者存在罹患与心房颤动相关的不良事件的风险，且/或其中低于所述参考量的所述 BMP10-型肽的量指示受试者不存在罹患与心房颤动相关的不良事件的风险。
9. 一种用于诊断心力衰竭的方法，所述方法包括以下步骤
(a) 在来自受试者的至少一个样品中确定一种或多种 BMP10-型肽（骨形态发生蛋白10-型肽）的量及任选地选自由利钠肽、ESM-1（内皮细胞特异性分子）、Ang2 和 FABP3（脂肪酸结合蛋白 3）组成的组的至少一种其他生物标志物的量，以及
(b) 将所述 BMP10-型肽的所述量与所述 BMP10-型肽的参考量进行比较及任选地将所述至少一种其他生物标志物的所述量与所述至少一种其他生物标志物的参考量进行比较，由此诊断心力衰竭，
其中步骤 a) 包括使所述样品与至少一种试剂接触，所述至少一种试剂能够在 SEQID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至 299 内结合，所述至少一种试剂例如是如权利要求 2 至 4 中任一项中所定义的单克隆抗体或其片段。
10. (a) 与一种或多种 BMP10-型肽特异性结合的至少一种试剂用于评定心房颤动、用于诊断心力衰竭、或用于预测受试者因心力衰竭而住院的风险的体外用途，
其中所述至少一种试剂能够在 SEQ ID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至299 内结合，
例如，其中所述至少一种试剂为如权利要求 2 至 4 中任一项中所定义的单克隆抗体或其抗原结合片段。
11. 一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合一种或多种 BMP10-型肽，其中所述抗体或其片段能够与以下项结合
a) 包含在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸区域 171 至 185 中的表位（LESKGDNEGERNMLV，SEQ ID NO: 3），例如包含在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸区域 173 至 181 中的表位（SKGDNEGER，SEQ ID NO: 4），
b) 包含在 SEQ ID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至 47 中的表位（SLFGDVFSEQD，SEQ ID NO 2），
c) 包含在 SEQ ID NO: 1 的氨基酸区域 291 至 299 中的表位（SSGPGEEAL，SEQ IDNO 5）。
12. 一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合一种或多种 BMP10-型肽，其中所述抗体或其片段包含
(a) 轻链可变结构域，其包含
(a1) 选自 SEQ ID NO: 34-42 的轻链 CDRl 序列，
(a2) 显示选自 SEQ ID NO: 52-60 的轻链 CDR2，和
(a3) 选自 SEQ ID NO: 70-78 的轻链 CDR3，
以及
(b) 重链可变结构域，其包含
(b1) 选自 SEQ ID NO: 25-33 的重链 CDR1，
(b2) 选自 SEQ ID NO: 43-51 的重链 CDR2，和
(b3) 选自 SEQ ID NO: 61-69 的重链 CDR3。
13. 一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合一种或多种 BMP10-型肽，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域和/或轻链可变结构域，所述重链可变结构域与包含 SEQ ID NO: 7、8、9、10、11、12、13、14 或 15中所示的序列（参见表 A）的重链可变结构域至少 80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 相同，所述轻链可变结构域与包含SEQ ID NO: 16、17、18、19、20、21、22、23 或 24中所示的序列（参见表 B）的轻链可变结构域按递增的优选次序至少 80%、85%、90%、95%、98%、99% 或 100% 相同。
14. 一种试剂盒，其包含至少一种如权利要求 2 至 4 或 11 至 13 中任一项所定义的单克隆抗体或其片段。
15. 根据权利要求 1 至 9 中任一项所述的方法、根据权利要求 10 所述的用途、根据权利要求 11 至 13 中任一项所述的单克隆抗体或其片段、或根据权利要求 14 所述的试剂盒，其中所述 BMP10-型肽为 NT-proBMP10。
16. 一种用于评定受试者的白质病变的程度的方法，所述方法包括
a) 在来自所述受试者的样品中确定一种或多种 BMP10-型肽的量，以及
b) 基于步骤 a) 中确定的所述量评定受试者的白质病变的所述程度，
其中步骤 a) 包括使所述样品与至少一种试剂接触，所述至少一种试剂能够在 SEQID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至 299 内结合。
17.一种用于预测受试者的痴呆症诸如血管性痴呆症和/或阿尔茨海默病的方法，所述方法包括
a) 在来自所述受试者的样品中确定一种或多种 BMP10-型肽的量，
b) 将步骤 a) 中确定的所述量与参考进行比较，以及
c) 预测所述受试者的痴呆症的风险，
其中步骤 a) 包括使所述样品与至少一种试剂接触，所述至少一种试剂能够在 SEQID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至 299 内结合。
18.一种用于评定受试者是否曾经历一次或多次静息性卒中的方法，所述方法包括
a) 在来自所述受试者的样品中确定一种或多种 BMP10-型肽的量，
b) 将步骤 a) 中确定的所述量与参考进行比较，以及
c) 评定受试者是否曾经历一次或多次静息性卒中，
其中步骤 a) 包括使所述样品与至少一种试剂接触，所述至少一种试剂能够在 SEQID NO: 1 中所示的多肽的氨基酸区域 37 至 299 内结合。
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