WO2010023749A1 - 血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法 - Google Patents

血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010023749A1
WO2010023749A1 PCT/JP2008/065444 JP2008065444W WO2010023749A1 WO 2010023749 A1 WO2010023749 A1 WO 2010023749A1 JP 2008065444 W JP2008065444 W JP 2008065444W WO 2010023749 A1 WO2010023749 A1 WO 2010023749A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bnp
molecule
blood sample
group
value
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/065444
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
宏隆 藤本
鈴木 亨
Original Assignee
株式会社 島津製作所
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社 島津製作所, 国立大学法人東京大学 filed Critical 株式会社 島津製作所
Priority to US13/060,552 priority Critical patent/US9366680B2/en
Priority to JP2010526469A priority patent/JP5550021B2/ja
Priority to EP08809519.5A priority patent/EP2322935B1/en
Priority to PCT/JP2008/065444 priority patent/WO2010023749A1/ja
Publication of WO2010023749A1 publication Critical patent/WO2010023749A1/ja

Links

Images

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2317/00Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575Hormones
    • G01N2333/58Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32Cardiovascular disorders

Definitions

  • the present invention relates to the fields of diagnostic medicine, diagnostic testing equipment, cardiovascular medicine, medical checkup, and mass spectrometry. More specifically, the present invention relates to a method for evaluating myocardial ischemia using a blood sample (Method for Assessing Myocardial Ischemia using a Blood Sample).
  • BNP B-type natriuretic hormone
  • the amount of BNP present is measured by an immunochemical method such as EIA or ELISA, and if the BNP value is 100 pg / mL or higher or 150 pg / mL or higher, “there is a suspicion of heart failure. Is almost established in general clinical settings.
  • the BNP value is 18.4 pg / mL or less, which is the upper limit of the reference value, a diagnosis of “no abnormality” is generally made.
  • the threshold range of 18.4 to 100 pg / mL or 18.4 to 150 pg / mL there is a general clinical suspicion of some cardiovascular disease. Is determined.
  • cardiovascular diseases those performed in clinical practice as diagnostic methods for ischemic heart disease include outpatient tests such as an electrocardiogram, a loaded electrocardiogram, and an echocardiogram.
  • outpatient tests such as an electrocardiogram, a loaded electrocardiogram, and an echocardiogram.
  • a cardiac catheter examination requiring hospitalization is usually required to make an accurate diagnosis.
  • PCI percutaneous coronary intervention
  • DES drug-eluting stents
  • BNP3-108 discriminates unstable angina or myocardial infarction from congestive heart failure from measurement results for patients with a BNP value of 353.5 pg / mL and patients with a BNP value of 905.5 pg / mL. It is described that it will do.
  • Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2007-322187 discloses measuring the abundance of denatured low density lipoprotein (modified LDL) in blood as a method for determining the risk of developing restenosis after PCI. A method is described.
  • Diagnosis of heart failure by measuring the BNP level in blood is clinically effective.
  • the present condition is that the diagnostic method of ischemia by measuring the BNP value in the blood is not established.
  • the threshold range of 18.4 to 100 pg / mL or 18.4 to 150 pg / mL for judging whether or not there is suspicion of heart failure it is only considered that there is some suspicion of cardiovascular disease, The actual situation is unknown.
  • the BNP value indicates the threshold range, it is currently impossible to evaluate a cardiovascular disease.
  • the same measurement is performed for a patient with a low BNP value (specifically, 39.6 pg / mL), but for a patient with such a low BNP value, No information has been obtained since no specific BNP peptide has been detected.
  • an object of the present invention is to provide a method that makes it possible to evaluate myocardial ischemia (for example, ischemic heart disease and restenosis) in a minimally invasive manner.
  • the present invention is based on a blood sample showing a BNP value (that is, a threshold range of 18.4 to 150 pg / mL for determining whether or not there is a suspected heart failure) in which it is impossible to determine the presence or absence of a cardiovascular disease including heart failure by the conventional method. Even so, an object of the present invention is to provide an index that makes it possible to determine the presence or absence of cardiovascular diseases other than heart failure, particularly myocardial ischemia.
  • the present inventors are patients who undergo cardiac catheterization, and when a blood sample of a patient whose BNP value includes the threshold range is measured from a qualitative viewpoint, a specific selected from a group of BNP molecules having different mass numbers The ratio of the detected amount of BNP molecules to the detected amount of other specific BNP molecules was not significantly reduced in patients with significant stenosis in cardiac catheterization. The present inventors have found that it is significantly different from patients and completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a blood sample derived from a subject comprising BNP1-32 molecule (SEQ ID NO: 1), BNP3-32 molecule (SEQ ID NO: 2), BNP4-32 molecule (SEQ ID NO: 3), BNP5-32 molecule (SEQ ID NO: 4), And a blood sample containing at least two B-type natriuretic hormone (BNP) molecules selected from the group consisting of molecules having a mass number 16 Da larger than that of BNP5-32 molecules, and distinguishing each of the BNP molecules having different mass numbers
  • BNP B-type natriuretic hormone
  • detecting the BNP molecule group by subjecting it to a detection step capable of quantification, Using the ratio of the detection intensity of at least one molecule selected from the BNP molecule group and the detection intensity of at least one other molecule selected from the molecule group as an index, the myocardial ischemic state in the subject is determined. How to evaluate.
  • Assessing the myocardial ischemia is also examining the presence or absence of coronary artery stenosis. Specifically, determining the presence or absence of ischemic heart disease and determining the presence or absence of restenosis after PCI are included.
  • the BNP1-32 molecule is a mature B-type natriuretic hormone consisting of 32 amino acids and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • BNP77-108 corresponds to the mature B-type natriuretic hormone BNP1-32 in the present invention.
  • the BNP3-32 molecule is a fragment produced by processing the N-terminal 2-amino acid SP (indicated by one letter abbreviation of the amino acid, the same applies hereinafter) of the BNP1-32 molecule, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the BNP4-32 molecule is a fragment produced by processing the N-terminal 3 amino acids SPK of the BNP1-32 molecule, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the BNP5-32 molecule is a fragment produced by processing the N-terminal 4-amino acid SPKM of the BNP1-32 molecule, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • B-type natriuretic hormone (BNP) molecule group includes mature B-type natriuretic hormone molecule (ie, BNP1-32 molecule), BNP3-32 molecule, BNP4-32 molecule, BNP5-32 molecule, and BNP5-32 It also includes at least two kinds selected from the group consisting of molecules having a larger mass number of 16 Da, and may further include a fragment generated by processing from BNP1-32 and a derivative based thereon.
  • the ratio of the detection intensity of at least one molecule selected from the molecule group to the detection intensity of at least one other molecule selected from the molecule group is:
  • the method according to (1) which is a ratio of the detected intensity of the BNP1-32 molecule and the detected intensity of the BNP3-32 molecule to the detected intensity of the BNP5-32 molecule.
  • the ratio described in (2) has the following formula: ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 5-32) (Formula 1) Where I (BNP 1-32) is the detected intensity of the BNP1-32 molecule, I (BNP 3-32) is the detected intensity of the BNP3-32 molecule, I (BNP 5-32) is the detected intensity of the BNP5-32 molecule. ) And its inverse ratio.
  • the ratio of the detection intensity of at least one molecule selected from the molecule group to the detection intensity of at least one other molecule selected from the molecule group is: The method according to (1) or (2), which is a ratio of the detection intensity of the BNP3-32 molecule and the detection intensity of the BNP5-32 molecule.
  • the ratio described in (3) has the following formula: I (BNP 3-32) / I (BNP 5-32) (Formula 2) (In the formula, I (BNP 3-32) is the detection intensity of the BNP3-32 molecule, and I (BNP 5-32) is the detection intensity of the BNP5-32 molecule.) And its inverse ratio.
  • the BNP measurement value of the blood sample is preferably 18 pg / mL or more, or 21.9 pg / mL or more.
  • the myocardial ischemic state is due to ischemic heart disease or restenosis after PCI,
  • the ratio of the detection intensity of at least one molecule selected from the molecule group to the detection intensity of at least one other molecule selected from the molecule group is: The method according to any one of (1) to (3), which is a ratio of the detection intensity of a molecule having a mass number 16 Da larger than that of the BNP5-32 molecule and the detection intensity of the BNP5-32 molecule.
  • the ratio described in (4) has the following formula: I (BNP 5-32 +) / I (BNP 5-32) (Formula 3) (Where I (BNP 5-32) is the detected intensity of the BNP5-32 molecule, I (BNP 5-32 +) is a detection intensity of a molecule whose mass number is 16 Da larger than that of the BNP5-32 molecule. ) And its inverse ratio.
  • the blood sample is prepared from a blood sample of a subject having a BNP measurement value of 18 to 150 pg / mL, or a blood sample.
  • the blood sample may be prepared from a blood sample obtained by collecting blood from the subject using a blood collection tube containing at least aprotinin.
  • the blood sample is a plasma sample.
  • the method capable of distinguishing and quantifying each BNP molecule having a different mass number may be a method based on biospecific affinity or a mass spectrometry method.
  • a pathological condition caused by a myocardial ischemic state can be evaluated in a minimally invasive manner.
  • the BNP value that is, the determination of whether or not there is a suspicion of heart failure
  • the presence or absence of cardiovascular disease is determined ambiguously only by the previous method if there is any suspicion of cardiovascular disease. Even from a blood sample having a threshold range of 18.4 to 150 pg / mL, it is possible to determine the presence or absence of cardiovascular disease.
  • the present invention is a method using an index based on a qualitative viewpoint for BNP, unlike an index based on a quantitative viewpoint for BNP (that is, a BNP value) that has been conventionally used. It made it possible to obtain information that could not be obtained from blood samples. In other words, the present invention makes it possible for the first time to perform a test for myocardial ischemia only by a blood test.
  • a new index is used in the present invention, a blood sample showing a BNP value of 18.4 to 150 pg / mL, whose pathological condition cannot be determined because it is ambiguous whether it is a heart disease in a conventional blood test, It became possible to evaluate such pathological conditions.
  • the usefulness of the new index used in the present invention is specifically shown in an ischemic state, determination of the presence or absence of a myocardial ischemic state even in a disease showing a high BNP value (for example, chronic heart failure). It became possible to do.
  • the present invention is used in blood tests, it is very easy and less invasive than conventional invasive testing methods (cardiac catheter testing, etc.). For this reason, it becomes possible to apply the invasive test
  • the conventional cardiac catheter test which was performed approximately every six months, could not be performed even if restenosis requiring treatment occurred earlier than half a year, and an accurate treatment was impossible. Then, since repeated inspection can be performed easily, accurate treatment can be performed earlier.
  • the method of the present invention enables highly reliable evaluation and early detection of ischemia only by an easy, minimally invasive and economical blood test. As a result, it can be applied to the determination of arteriosclerosis. Further, as described above, since the significance of BNP in a blood sample showing a BNP value, which was ambiguous whether or not it was a heart disease in a conventional blood test and the pathological condition could not be determined, became clear. The possibility is found that the modified fragment leads to drug discovery.
  • FIG. 5 is an MS spectrum showing that in Example 2, the antibody KYBNPII is an antibody that specifically recognizes BNP1-32, BNP3-32, BNP4-32, and BNP5-32.
  • 6 is an MS spectrum showing the detection limit of the method of the present invention examined in Experimental Example 3.
  • FIG. 6 is an MS spectrum showing that, in Experimental Example 4, BNP3-32, BNP4-32 and BNP5-32 in which the N-terminus was processed from BNP1-32 were detected from clinical specimens together with BNP1-32.
  • Example 1 an MS spectrum showing that plasma of two clinical specimens having a BNP measurement value by the conventional EIA method equivalent to about 90 pg / mL was detected as qualitatively different by the method of the present invention. is there.
  • Example 2 with respect to 24 clinical specimens having a BNP value of 40.8 pg / mL to 147.8 pg / mL, I (BNP 5-32 +) / I (BNP 5-32) was used as an index, and the pattern of MS signal It is the result of investigating the correlation between the analysis and the presence of indicator and significant stenosis.
  • Example 3 for 41 clinical specimens having a BNP value of 21.4 pg / mL to 147.8 pg / mL, I (BNP 5-32 +) / I (BNP 5-32) was used as an index, and the pattern of MS signal It is the result of investigating the correlation between the analysis and the presence of indicator and significant stenosis.
  • Example 4 it is the result of having analyzed the pattern analysis of MS signal, and the investigation of the correlation with index I (BNP 5-32 +) / I (BNP 5-32) and the presence or absence of significant stenosis using ROC curve. .
  • Example 5 for 33 clinical specimens having a BNP value of 21.9 pg / mL to 645.8 pg / mL, ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 5- 32) and MS signal pattern analysis and correlation between the index and the presence or absence of significant stenosis.
  • Example 6 the pattern analysis of the MS signal and the investigation of the correlation between the index ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 5-32) and the presence or absence of significant stenosis were It is the result of analyzing using a curve.
  • Example 7 with respect to 33 clinical specimens having a BNP value of 21.9 pg / mL to 645.8 pg / mL, I (BNP 4-32) / I (BNP 5-32) was used as an index, and MS signal pattern analysis It is the result of investigating the correlation between the index and the presence or absence of significant stenosis.
  • Example 8 33 clinical specimens having a BNP value of 21.9 pg / mL to 645.8 pg / mL were used as indices: ⁇ I (BNP321-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 4- 32) and MS signal pattern analysis and correlation between the index and the presence or absence of significant stenosis.
  • the present invention is a method for examining the myocardial ischemia of a subject.
  • the myocardial ischemic state refers to a state in which oxygen supply to the heart is not sufficiently performed due to stenosis of the coronary artery caused by arteriosclerotic change or the like. Therefore, the present invention can also be said to be a method for examining the presence or absence of stenosis of the subject's coronary artery.
  • specific pathological conditions caused by myocardial ischemia are not particularly limited, and include ischemic heart disease and restenosis occurring after PCI.
  • ischemic heart disease examples include normal angina pectoris and myocardial infarction.
  • the present invention enables diagnosis of myocardial ischemia that could not be diagnosed by blood tests so far. This is useful in that it can be applied to angina pectoris, which was previously impossible to diagnose with blood tests.
  • the present invention is very useful in that it can be applied at the time of diagnosis prior to cardiac catheterization when diagnosing the presence or absence of restenosis that may occur after PCI.
  • PCI include stent placement, coronary angioplasty using a balloon, cutting balloon catheter, and atherectomy.
  • the degree of stenosis is 75% or more in the coronary angiography findings (50% or more of the left main coronary artery trunk).
  • Examples of the blood sample used in the present invention include whole blood, plasma, and serum. Among these, plasma is preferable.
  • unnecessary fragmentation for example, cleavage from the C-terminal
  • BNP BNP to be detected in the detection step described later
  • the blood sample may contain a blood stabilizer as appropriate.
  • blood stabilizers include protease inhibitors and anticoagulants.
  • examples of such blood stabilizers include aprotinin, ethylenediaminetetraacetic acid, heparin, citric acid, and sodium fluoride. These blood stabilizers can be appropriately selected and used by those skilled in the art.
  • a blood collection tube containing aprotinin and EDTA By using a blood collection tube containing aprotinin and EDTA, unnecessary fragmentation of BNP to be detected in the detection step described later can be prevented, and more accurate evaluation can be performed.
  • the BNP measurement value or BNP value refers to an index that is widely clinically applied as a marker for heart failure and the like.
  • the BNP value is measured by a known method, for example, EIA method (enzyme immunoassay).
  • EIA method enzyme immunoassay
  • the BNP value is the concentration of the entire BNP molecule mixture having different molecular weights, including the BNP molecule group to be detected in the detection step described later.
  • the present invention is useful for diagnosis of an ischemic state, and the BNP value of a blood sample to be processed is not particularly limited, and blood samples having any BNP value may be used as a target.
  • the present invention is useful when the BNP value of a blood sample is 18 to 150 pg / mL.
  • the BNP value in this range has not been important information for diagnosing heart failure because the presence or absence of abnormality in blood tests has been vague so far.
  • the indices described in 4-1-1, 4-1-2, and 4-1-3 described later can be given.
  • blood samples having BNP values in the above range blood samples having a BNP value of 20 to 150 pg / mL, 30 to 150 pg / mL, or 40 to 150 pg / mL show the range of 18 to 150 pg / mL.
  • an index showing such a tendency an index described in 4-1-3 described later can be given.
  • the present invention is also useful when the blood sample has a BNP value in a range exceeding 150 pg / mL.
  • this range previous blood tests could only diagnose a diagnosis of suspected heart failure, but the method of the present invention allows coronary artery stenosis at a BNP value in this range, that is, even in patients with a strong suspected heart failure. It is possible to determine whether or not.
  • the upper limit value of the BNP value in this range is not particularly limited, and includes any clinically occurring BNP value exceeding 150 pg / mL. For example, a BNP value of about 650 pg / mL may occur clinically, but a BNP exceeding this may of course occur.
  • the present invention is useful even when the BNP value of the blood sample exceeds 150 pg / mL. Therefore, the present invention can be applied in the range of 18 pg / mL or more including the above-mentioned range of 18 to 150 pg / mL. It can be usefully used. In this case, it is also preferable that the range is 20 pg / mL or more.
  • indexes described in 4-1-1 and 4-1-2 described later can be cited.
  • the present invention can also be used when the BNP value is in a range below 18 pg / mL. In this range, it has been evaluated that there is no abnormality in blood tests so far, but it is also possible to analyze in more detail from the qualitative viewpoint by the method of the present invention.
  • the amount of sample used is about 500 ⁇ L, for example, when a detection method based on mass spectrometry is used, the detection limit may be exceeded, but the amount of sample used may be increased appropriately (for example, by increasing to 1 mL or 2 mL, for example). Analysis is possible.
  • a blood sample refers to a sample subjected to a detection process. Therefore, the blood sample may be prepared by subjecting the blood sample to an appropriate treatment, or the blood sample itself.
  • the molecule to be detected in the present invention is a group of B-type natriuretic hormone (BNP) molecules present in a blood sample.
  • BNP B-type natriuretic hormone
  • the molecules constituting the BNP molecule group may include BNP1-32, fragments generated by processing from BNP1-32, and / or derivatives based on them. These molecules constituting the BNP molecule group must include those generated in the body of the subject.
  • the molecules constituting the BNP molecule group may include those in which the molecules generated in the subject's body change during blood collection or sample preparation (for example, processing or chemical changes that cannot occur in the body). It is preferred to prepare the blood sample so that no molecules are contained. For example, preparing a blood sample that suppresses C-terminal cleavage or non-specific cleavage of N-terminal of BNP by using a blood sample in the form of plasma or using a blood collection tube containing aprotinin and EDTA Is preferred.
  • BNP1-32 is a mature B-type natriuretic hormone consisting of 32 amino acids and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • BNP77-108 corresponds to the mature B-type natriuretic hormone BNP1-32 in the present invention.
  • the BNP3-32 molecule is a fragment produced by processing the N-terminal 2-amino acid SP (indicated by one letter abbreviation of the amino acid, the same applies hereinafter) of the BNP1-32 molecule, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the BNP4-32 molecule is a fragment produced by processing the N-terminal 3 amino acids SPK of the BNP1-32 molecule, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the BNP5-32 molecule is a fragment produced by processing the N-terminal 4-amino acid SPKM of the BNP1-32 molecule, and has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • derivatives based on BNP1-32 or fragments generated by processing from BNP1-32 include those generated by chemically changing the basic molecule. More specifically, the chemical change includes oxidation. Mainly methionine can undergo oxidation.
  • one of the molecules constituting the BNP molecule group includes a molecule whose mass number is 16 Da larger than that of BNP5-32.
  • This molecule has a mass number difference of 16 Da from BNP5-32, can be immunologically enriched with other BNP fragments by one antibody, and acts as a deoxidizing reagent, as will be described later. Since it has been confirmed by the present inventors that it disappears by the treatment, it is considered to be an oxide of BNP5-32.
  • the notation of this molecule is not specified from the structural point of view, but only from the viewpoint of the mass number, “a molecule whose mass number is 16 Da larger than BNP5-32”. Included in “derivatives”.
  • the BNP molecule group is at least 2 selected from the group consisting of BNP1-32 molecules, BNP3-32 molecules, BNP4-32 molecules, BNP5-32 molecules, and molecules having a mass number 16 Da larger than BNP5-32. In addition to these, it is also allowed to include other fragments produced by processing from BNP1-32 and derivatives based on them.
  • a BNP molecule group is specifically enriched by contacting a BNP molecule group in a blood sample with an antibody against the BNP molecule group under conditions where an immune complex can be formed. Any method can be used as long as it can be used, and can be appropriately selected by those skilled in the art. Also, a specific protocol can be easily selected by those skilled in the art.
  • the immunological concentration method include an immunoprecipitation method and an affinity column chromatography method. These methods are well known to those skilled in the art, and the protocol is appropriately determined by those skilled in the art.
  • an immunoprecipitation method it is preferable to use an immunoprecipitation method.
  • an immunoprecipitate is obtained by allowing a blood sample, an antibody against a target BNP molecule group, and a carrier for precipitation to coexist under conditions that an immune complex can form. This method is preferable in terms of simple operation, good cost, and very high versatility.
  • antibodies used in immunological concentration include antibodies capable of simultaneously recognizing BNP contained in the BNP molecule group to be concentrated. This antibody can be appropriately prepared by those skilled in the art as an antibody that uses a region common to BNP molecules contained in the BNP molecule group to be enriched and can recognize a peptide fragment having the common region.
  • Other examples of antibodies used in immunological enrichment include a mixture of multiple types of antibodies that separately recognize each of the BNP molecules contained in the BNP molecule group to be enriched.
  • This antibody can be appropriately prepared by those skilled in the art as an antibody that uses a characteristic region in a specific BNP molecule contained in the BNP molecule group to be concentrated and can recognize a peptide fragment having the region.
  • KYBNPII Yamashio Shionogi
  • KYBNPII can simultaneously recognize at least BNP1-32 molecules, BNP3-32 molecules, BNP4-32 molecules, BNP5-32 molecules, and molecules having a mass number 16 Da greater than BNP5-32.
  • the blood sample is subjected to a detection process.
  • a method capable of distinguishing and quantifying BNP molecules having different mass numbers is used. That is, a method capable of distinguishing and quantifying each molecule included in the BNP molecule group is used.
  • the term “quantitative” used here is sufficient if it is possible to measure the relative amount of each BNP molecule, not the absolute amount.
  • the method used in the detection step may be any method as long as it is as described above, and can be appropriately selected by those skilled in the art. Specific examples include a method based on biospecific affinity and mass spectrometry.
  • the blood sample When using a method based on biospecific affinity, the blood sample may be subjected to the above immunological concentration, and the obtained blood sample may be subjected to the detection step, or without performing the above immunological concentration.
  • a blood sample (for example, a plasma sample) itself may be used as a blood sample for the detection step.
  • a method based on biospecific affinity is a method well known to those skilled in the art, and is obtained by bringing a blood sample into contact with a biospecific affinity substance under conditions that can form a complex with biospecific affinity. Any method can be used as long as it is performed by measuring the amount of signal to be obtained, and can be appropriately selected by those skilled in the art. Also, a specific protocol can be easily selected by those skilled in the art.
  • an immunoassay is preferable as the method. That is, it is carried out by contacting a blood sample with an antibody and measuring the amount of signal obtained under conditions capable of forming an immune complex.
  • a plurality of types of antibodies that recognize each of the BNP molecules included in the BNP molecule group separately are used.
  • This antibody can be appropriately prepared by those skilled in the art as an antibody that uses a characteristic region in a specific BNP molecule contained in the BNP molecule group to be concentrated and can recognize a peptide fragment having the region.
  • Mass spectrometry When using mass spectrometry, it is preferable to subject the blood sample to the above-described immunological concentration and subject the obtained blood sample to the detection step.
  • Mass spectrometry is a method well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected by those skilled in the art without any particular limitation on ionization means and detection means capable of detecting protein / peptide molecules. Examples of ionization methods include electron ionization (EI), chemical ionization (CI), fast atom bombardment (FAB), electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), matrix-assisted laser desorption.
  • EI electron ionization
  • CI chemical ionization
  • FAB fast atom bombardment
  • ESI electrospray ionization
  • APCI atmospheric pressure chemical ionization
  • matrix-assisted laser desorption matrix-assisted laser desorption.
  • a deionization method (MALDI), a surface enhanced laser desorption ionization method (SELDI), or the like can be used.
  • a MALDI-TOF mass spectrometer can be used.
  • SELDI method the antibody used in the immunological concentration can be used.
  • the ratio between the detection intensity of at least one molecule selected from the BNP molecule group detected by the above method and the detection intensity of at least one other molecule selected from the BNP molecule group is evaluated.
  • As an indicator for This index is an index based on a qualitative viewpoint regarding BNP, unlike an index based on a quantitative viewpoint regarding BNP so far (that is, a BNP value). For this reason, unlike conventional methods, information that cannot be obtained only from a quantitative viewpoint can be obtained from a blood sample.
  • An example of the index used in the present invention is the ratio of the sum of the detection intensity of BNP1-32 molecules and the detection intensity of BNP3-32 molecules to the detection intensity of BNP5-32 molecules.
  • ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 5-32) (Formula 1) (Wherein (BNP 1-32) is the detected intensity of the BNP1-32 molecule, I (BNP 3-32) is the detected intensity of the BNP3-32 molecule, I (BNP 5-32) is the detected intensity of the BNP5-32 molecule. ) And the inverse ratio thereof.
  • Equation 1 The value of the ratio expressed by Equation 1 is significantly lower in the patient group with stenosis than in the patient group without stenosis. This tendency is more strongly observed when the BNP value of the specimen is, for example, 18 pg / mL or more, or 21.9 pg / mL or more.
  • index used in the present invention is the ratio between the detection intensity of the BNP3-32 molecule and the detection intensity of the BNP5-32 molecule.
  • the following formula: I (BNP 3-32) / I (BNP 5-32) (Formula 2) In the formula, I (BNP 3-32) is the detection intensity of the BNP3-32 molecule, and I (BNP 5-32) is the detection intensity of the BNP5-32 molecule.
  • I (BNP 3-32) is the detection intensity of the BNP3-32 molecule
  • I (BNP 5-32) is the detection intensity of the BNP5-32 molecule.
  • the value of the ratio expressed by Equation 2 is significantly lower in the patient group with stenosis than in the patient group without stenosis. This tendency is more strongly observed when the BNP value of the specimen is, for example, 18 pg / mL or more, or 21 pg / mL or more. In particular, this tendency is strong when the BNP1-32 molecule signal in the blood sample is not observed or when the signal intensity is negligible.
  • Still another example of the index used in the present invention is the ratio between the detection intensity of a molecule having a mass number 16 Da higher than that of a BNP5-32 molecule and the detection intensity of a BNP5-32 molecule.
  • the following formula: I (BNP 5-32 +) / I (BNP 5-32) (Formula 3) In the formula, I (BNP 5-32) is the detection intensity of the BNP5-32 molecule, and I (BNP 5-32 +) is the detection intensity of the molecule whose mass number is 16 Da larger than that of the BNP5-32 molecule. ) And the inverse ratio thereof.
  • Equation 3 The value of the ratio expressed by Equation 3 is significantly higher in the patient group with stenosis than in the patient group without stenosis. This tendency is more strongly observed when the BNP value of the specimen is, for example, 18 to 150 pg / mL. Further, it is more intense in the case of 21 pg / mL to 150 pg / mL, 30 to 150 pg / mL, or 40 to 150 pg / mL.
  • the value of the ratio for a blood sample derived from a patient may be compared with a predetermined reference value.
  • the reference value can be set, for example, by analyzing a result of whether or not there is stenosis by cardiac catheterization for a plurality of subjects whose values of the above ratio have been confirmed in advance using a statistical analysis technique. .
  • An example of a statistical analysis method is an analysis using a Receiver-operating characteristics (ROC) curve.
  • ROC Receiver-operating characteristics
  • a value indicating a minimum difference between the sensitivity and specificity for identifying the stenosis group can be used as a reference value.
  • the said standard value can adjust suitably the value optimal for each request
  • the method of the present invention may be combined with any other method.
  • a more reliable test can be performed by combining with other cardiovascular disease test methods.
  • Plasma preparation Subject Blood was collected from healthy subjects with informed consent. Blood collection: Blood was collected from the cubital vein by a general method. As blood collection tubes, EDTA-aprotinin blood collection tubes and EDTA blood collection tubes were examined. For serum preparation, a general blood collection tube containing a serum separating agent was used. Treatment after blood collection: Immediately after blood collection, BNP1-32 (final concentration 200 fmol / mL) was spiked from the outside, and plasma separation was performed immediately after blood collection (actual time required for preparation was 15 to 30 minutes) . In addition, as a result of examining the time change, when plasma separation was impossible immediately, plasma separation was performed at 4 degrees or within 6 hours after storage on ice. The plasma was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at minus 80 degrees.
  • FIGS. 1 (i) to (iii) a fragment (BNP3-32) in which two amino acids of SP at the N-terminus (indicated by an abbreviation of one amino acid symbol, the same applies hereinafter) is produced. all right. It has been reported that two amino acids of the N-terminal SP are processed.
  • Plasma preparation Subject Blood was collected from healthy subjects with informed consent. Blood collection: Blood was collected from the elbow vein using an EDTA-aprotinin blood collection tube. Treatment after blood collection: Immediately after blood collection, it was stored on ice or at 4 degrees. Plasma separation was performed within 6 hours after blood collection, and the plasma was immediately frozen with liquid nitrogen and stored at minus 80 degrees. The plasma was thawed and BNP1-32, BNP3-32, BNP4-32, and BNP5-32 (each 5 fmol) were added as a BNP mixture (Mixed BNP). Two such BNP-added specimens (500 ⁇ L) were prepared. Separately, a sample that was subjected to plasma separation without adding BNP was also prepared and stored frozen as described above. Two such BNP-free specimens (500 ⁇ L) were also prepared.
  • BNP KYBNPII provided by Shionogi & Co., Ltd.
  • anti-mouse IgG-conjugated beads Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG, Veritas, catalog
  • No. 112.03 was used to immunoprecipitate BNP in plasma.
  • immunoprecipitation was performed for each of one of the BNP-added samples and one of the BNP-free samples by the following method.
  • PBS (10 ⁇ ) 50 ⁇ L, DDW 440 ⁇ L, 10% (w / v) Zwittergent (Calbiochem) was added to the thawed specimen (500 ⁇ L) to make 1 mL.
  • 20 ⁇ L of the beads to which the above KYBNPII was bound was added.
  • 20 ⁇ L of the beads incubated for 1 hour without adding KYBNPII was added.
  • the beads were washed 4 times with PBS. Furthermore, it washed once with 20mM NH 4 HCO 3. BNP elution from the beads was performed using 5 ⁇ L of 0.5% (v / v) TFA.
  • the entire amount eluted from the beads was dropped onto the MALDI target plate.
  • the samples (b) and (d) that were not subjected to the BNP concentration operation the entire amount eluted from the beads was dropped onto the MALDI target plate.
  • a matrix a mixed matrix of 5 mg / mL DHB and 2.5 mg / mL CHCA was used. After air drying, analysis was immediately performed with AXIMA-CFR plus. Analysis with AXIMA-CFR plus was performed in linear mode, and ACTH (18-39) fragment and insulin oxidized B-chain were used for m / z calibration.
  • FIG. 2 shows the mass analysis results for the specimens (a), (b), (c) and (d).
  • specific signals of BNP1-32, BNP3-32, BNP4-32, and BNP5-32 were obtained only in the BNP-added specimen (a) subjected to the BNP concentration operation. Therefore, it was confirmed that the KYBNPII antibody was an antibody that specifically recognizes BNP1-32, BNP3-32, BNP4-32, and BNP5-32.
  • the obtained MS spectrum is shown in FIG. As FIG. 3 shows, it was possible to detect BNP in sample (i) 1 fmol (3.5 pg) /0.5 mL serum. That is, the detection limit is 2 fmol (7 pg) / mL.
  • the reference value upper limit of the BNP value in the clinical field is 18.4 pg / mL. Therefore, it was confirmed that the BNP value near the upper limit of the reference value also has a measurable detection sensitivity in principle.
  • Plasma preparation Subject Blood was collected from a patient (# 1037) with informed consent among patients undergoing cardiac catheterization. Blood collection: Blood was collected from the catheter sheath before introduction of the catheter, and the blood was dispensed into EDTA-aprotinin blood collection tubes. The BNP value for this patient was 117.1 pg ( ⁇ 33 fmol) / mL. Treatment after blood collection: Stored at 4 degrees after blood collection, and plasma separation was performed within 6 hours. The plasma was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at minus 80 degrees until analysis.
  • Example 1 Plasma analysis of clinical samples
  • blood collected from patient # 1086 (BNP value: 89.0 pg / mL) and patient # 1067 (BNP value: 92.6 pg / mL) from which informed consent was obtained was the same as in Experimental Example 4.
  • the obtained MS spectrum is shown in FIG. As shown in FIG. 5, it was found that the relative intensity ratio patterns of the four signals BNP1-32, BNP3-32, BNP4-32, and BNP5-32 differed in the two. Further, focusing on the signal of BNP5-32 and the signal having a larger 16 Da mass number, in the case of # 1086, a signal having a larger 16 Da mass number than BNP5-32 is detected with higher intensity. In the case of # 1067, it was found that the signal of BNP5-32 was detected with higher intensity.
  • the BNP measurement value according to the conventional EIA method does not change so much at about 90 pg / mL, but the qualitative difference that cannot be detected by the conventional EIA method by using the method of the present invention. It is possible to detect.
  • Example 2 Pattern analysis of MS signal and correlation investigation with significant stenosis 1-1
  • blood BNP value: 40.8 pg / mL to 147.8 pg / mL
  • BNP concentration 40.8 pg / mL to 147.8 pg / mL
  • I BNP 5 -32 +
  • I denoted as BNP 5-32
  • Example 3 Correlation investigation between pattern analysis of MS signal and presence / absence of significant stenosis 1-2
  • BNP value 21.4 pg / mL to 147.8 pg / mL
  • I (BNP 5) is not found between patients diagnosed with significant stenosis and those diagnosed with no significant stenosis. A significant correlation was found in the value of -32 +) / I (BNP 5-32).
  • Example 4 Correlation investigation between pattern analysis of MS signal and presence / absence of significant stenosis 1-3
  • analysis using a ROC curve was performed for two-group discrimination of presence or absence of significant stenosis.
  • FIG. 8 shows the obtained ROC curves for the cases where the range of the BNP value x (pg / mL) is 10 ⁇ x ⁇ 150, 40 ⁇ x ⁇ 150, and 10 ⁇ x ⁇ 40.
  • the accuracy is particularly good when the range of the BNP value is 40 ⁇ x ⁇ 150.
  • the AUC is 0.94
  • Example 5 Correlation investigation 2-1 between pattern analysis of MS signal and presence / absence of significant stenosis
  • BNP value 21.9 pg / mL to 645.8 pg / mL
  • FIG. 9 shows that patients diagnosed with significant stenosis have ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) compared to patients diagnosed with no significant stenosis.
  • Example 6 Correlation survey between pattern analysis of MS signal and presence / absence of significant stenosis 2-2
  • analysis using a ROC curve was performed for two-group discrimination of presence or absence of significant stenosis.
  • the resulting ROC curves for 33 patients with BNP values between 21.9 pg / mL and 645.8 pg / mL are shown in FIG.
  • the specificity was 93%.
  • FIG. 13 shows, there is a ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I () between a patient determined to have diabetes (DM +) and a patient not determined (DM ⁇ ).
  • DM + a patient determined to have diabetes
  • DM ⁇ a patient not determined
  • FIG. 14 shows the relationship between the value of ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 5-32) and gender for these 33 patients.
  • ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 5-32) between male (M) and female (F).
  • the index used in the present invention shows a specific correlation in the presence or absence of stenosis, and the presence or absence of hypertension, hyperlipidemia, diabetes, Gender shows no correlation.
  • Example 7 Correlation investigation 3 between pattern analysis of MS signal and presence / absence of significant stenosis
  • I (BNP 4-32) / I (BNP 5-32) was used as an index
  • pattern analysis of MS signal and investigation of correlation between the pattern and the presence or absence of significant stenosis were conducted in the same manner as in Example 5. went. The result is shown in FIG. As FIG. 15 shows, the p value of the index was 0.0771 between a patient diagnosed with significant stenosis and a patient diagnosed with no significant stenosis.
  • Example 8 Correlation investigation 4 between pattern analysis of MS signal and presence / absence of significant stenosis
  • MS signal pattern analysis as in Example 5, except that ⁇ I (BNP 1-32) + I (BNP 3-32) ⁇ / I (BNP 4-32) was used as an index.
  • the correlation with the presence or absence of significant stenosis was investigated. The result is shown in FIG. As FIG. 16 shows, the p value of the index was 0.3820 between a patient diagnosed with significant stenosis and a patient diagnosed with no significant stenosis.
  • the present invention it is possible to evaluate a pathological condition caused by a myocardial ischemia such as ischemic heart disease and restenosis in a minimally invasive manner.
  • the BNP value that is, the determination of whether or not there is a suspicion of heart failure
  • the BNP value that is, the determination of whether or not there is a suspicion of heart failure
  • the presence or absence of cardiovascular disease Even from a blood sample having a threshold range of 18.4 to 150 pg / ml, it is possible to determine the presence or absence of cardiovascular disease.
  • the present invention is a method that uses an index based on a qualitative viewpoint for BNP, unlike an index based on a quantitative viewpoint for BNP (that is, a BNP value) that has been conventionally used. This makes it possible to obtain information from a blood sample that cannot be obtained only from a quantitative point of view. In other words, the present invention makes it possible for the first time to perform a test for myocardial ischemia only by a blood test.
  • a new index is used in the present invention, a blood sample showing a BNP value of 18.4 to 150 pg / ml, which was ambiguous whether or not it was a heart disease in a conventional blood test and could not be determined, It became possible to evaluate such pathological conditions.
  • the usefulness of the new index used in the present invention is specifically shown in an ischemic state, determination of the presence or absence of a myocardial ischemic state even in a disease showing a high BNP value (for example, chronic heart failure). It became possible to do.
  • the present invention is used in blood tests, it is very easy and less invasive than conventional invasive testing methods (cardiac catheter testing, etc.). For this reason, it becomes possible to apply the invasive test
  • the conventional cardiac catheter test which was performed approximately every six months, could not be performed even if restenosis requiring treatment occurred earlier than half a year, and an accurate treatment was impossible. Then, since repeated inspection can be performed easily, accurate treatment can be performed earlier.
  • the method of the present invention enables highly reliable evaluation and early detection of ischemia only by an easy, minimally invasive and economical blood test. As a result, it can be applied to the determination of arteriosclerosis. Furthermore, as described above, since the significance of BNP in a blood sample showing a BNP value that was ambiguous whether or not it was a heart disease in a conventional blood test and the pathological condition could not be determined, The possibility is found that the modified fragment leads to drug discovery.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

 虚血性心疾患や冠動脈インターベンション後の再狭窄などの、心筋虚血状態を低侵襲的に判断することを可能にする方法および指標を提供する。また、従前の方法では心不全以外の心血管疾患を判断することができないBNP値を示す血液試料からであっても、心不全以外の心血管疾患を判断することを可能にする指標を提供する。被験者に由来する血液試料であって、BNP1-32分子、BNP3-32分子、BNP4-32分子、BNP5-32分子、及びBNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子を含む群から選ばれる少なくとも2種を含むBNP分子群を含有する血液試料を、質量数の異なる前記各BNP分子の区別及び定量が可能な検出工程に供することによって、前記BNP分子群を検出し、前記BNP分子群から選択される少なくとも1つの分子の検出強度の量と、前記分子群から選択される少なくとも1つの他の分子の検出強度の量との比を指標として、前記被験者における心筋虚血状態を判断する方法。

Description

血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法
 本発明は、診断医学、診断検査機器、循環器内科学、人間ドック、質量分析学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法(Method for Assessing Myocardial Ischemia using a Blood Sample)に関する。
 臨床現場における心不全の診断には、主に心筋から分泌されるホルモンであるB型ナトリウム利尿ホルモン(BNP)の血液中存在量を測定することが、日本をはじめ世界中の臨床現場で広く行われている。BNPは、これまで世界中において、その血液中の存在量と慢性心不全の重篤度との相関が極めて高いことが検証されてきたものであり、現在、心不全の重篤度を知る唯一のバイオマーカーとして用いられているものである。
 具体的な心不全診断においては、BNPの存在量をEIA法、ELISA法などの免疫化学的方法によって測定し、特にBNP値が100pg/mL以上或いは150pg/mL以上であれば、「心不全の疑い有り」と診断することが一般臨床の現場ではほぼ確立されている。またBNP値が基準値上限の18.4pg/mL以下であると一般的には「異常なし」との診断がなされている。一方、閾値範囲である18.4~100pg/mL或いは18.4~150pg/mLにおいては、一般臨床上何がしかの心血管疾患の疑いがありということで、「要経過観察、場合によって検査」と判断される。
 心血管疾患のうち、虚血性心疾患の診断法として臨床現場で行われているものには、心電図、負荷心電図、心エコーといった外来で行われる検査が挙げられる。しかしながら虚血性心疾患をこれらの検査で完全にとらえることは因難であるため、正確な診断をするためには通常、入院を要する心臓カテーテル検査が必要となる。
 虚血性心疾患の非薬物治療としては、冠動脈の狭窄を広げる手術が一般的に行われている。そのような手術として汎用されるものとして、経皮的冠動脈インターベンション(PCI)が挙げられる。従来、PCI施術後の患者においては、術後3~6ヶ月後に20~40%程度の頻度で拡張した血管に再狭窄を起こすことがわかっている。近年、当該手術に薬剤溶出ステント(DES)が用いられるようになったことにより、再狭窄の頻度は10%以下にまで低減されている。
 一方、最近の例として、米国特許第7341838号明細書、特表2006-527190号公報に、試験試料における、BNP79~108、BNP77~106、BNP39~86、BNP53~85、BNP66~98、BNP30~106、BNP11~107、BNP9~106、BNP69~100、BNP76~107、BNP69~108、BNP80~108、BNP81~108、BNP83~108、BNP30~103、BNP3~108、およびBNP79~106からなる群より選択される少なくとも1つのBNPポリペプチド(ここでは、108アミノ酸からなるBNP前駆体すなわちBNP1~108を基準として、これらのBNPポリペプチドを表示している)の量を特異的に測定することによって、試験試料の病態を分類する方法が記載されている。具体的には、BNP値353.5pg/mLの患者及びBNP値905.5pg/mLの患者についての測定結果から、BNP3~108が、鬱血性心不全から不安定な狭心症または心筋梗塞を区別するであろうということが記載されている。
 また、最近の他の例として、特開2007-322187号公報に、PCI後の再狭窄の発症リスクを判定する方法として、血液中の変性低比重リポ蛋白(変性LDL)の存在量を測定する方法が記載されている。
米国特許第7341838号明細書 特表2006-527190号公報 特開2007-322187号公報
 血液中のBNP値を測定することによる心不全の診断は臨床上有効である。しかしながら、血液中のBNP値を測定することによる虚血の診断法は確立されていないのが現状である。また、心不全疑いの有無の判断の閾値範囲である18.4~100pg/mL或いは18.4~150pg/mLにおいては、何がしかの心血管疾患の疑いがあるとされるのみであり、その実態は不明である。すなわち、BNP値が当該閾値範囲を示す場合に、心血管疾患についての評価が不可能であるのが現状である。
 現在、心血管疾患の中でも虚血性心疾患の診断のために行われる検査のひとつとして負荷心電図検査が挙げられるが、その感度・特異度は70%前後であり、診断の信頼性としてはそれほど高いものではない。また、この検査は、被検査者に運動を課さなければならならず、患者への負担が大きい。また、下肢の弱い又は下肢関節に障害のある高齢者においては実施不可能である。診断時には常に医師による観察が必要であるが、運動負荷による心事故を引き起こす危険性がある。加えて、不安定狭心症等の疑いがある者の場合は禁忌となっている。
 また、PCI後に起こる再狭窄は、その頻度が少なくなったとはいえ、確実に一定の頻度で起こることには変わりない。そのため、再狭窄の有無の診断のための検査は依然として必須である。具体的には心臓カテーテル検査が汎用されている。しかしながら、心臓カテーテル検査は侵襲的検査であるため、患者への負担が大きい。そのため、頻繁に検査を行うことは事実上不可能である。さらに造影剤を用いるため、特に腎機能障害を有する患者においては、造影剤の腎毒性も問題となる。
 一方、上述の米国特許第7341838明細書、特表2006-527190号公報には、BNP3~108が、鬱血性心不全から不安定な狭心症または心筋梗塞を区別するであろうということが記載されているが、これはBNP値353.5pg/mLの患者及びBNP値905.5pg/mLの患者についての測定結果に依拠している。さらに、当該公報には、特定のBNPペプチドが、評価対象となる心血管疾患を有する検体と対照検体との間で有意差をもって検出されることは全く示されていない。従って、心血管疾患を評価するための有用な指標は全く記載されていない。
 また、当該公報においては、上記の測定とともに、BNP値が低い(具体的には39.6pg/mL)患者についても同様の測定を行っているが、このようなBNP値が低い患者については、特定のBNPペプチドの検出に至っていないため、全く情報は得られていない。
 そこで本発明は、心筋虚血状態(例えば虚血性心疾患や再狭窄など)を低侵襲的に評価することを可能にする方法を提供することを目的とする。
 また、本発明は、従前の方法では心不全を含む心血管疾患の有無を判断することができないBNP値(すなわち心不全疑いの有無の判断の閾値範囲18.4~150pg/mL)を示す血液試料からであっても、心不全以外の心血管疾患、特に心筋虚血状態の有無を判断することを可能にする指標を提供することを目的とする。
 本発明者らは、心臓カテーテル検査を受検する患者であって、BNP値が当該閾値範囲を含む患者の血液試料を質的観点から測定した場合に、質量数の異なるBNP分子群から選ばれる特定のBNP分子の検出量と、特定の他のBNP分子の検出量との比の値が、当該患者のうち心臓カテーテル検査で有意な狭窄が見られた患者と、有意な狭窄が見られなかった患者との間で有意に異なることを見出し、本発明を完成するに至った。
 本発明は、以下の発明を含む。
(1)
 被験者に由来する血液試料であって、BNP1-32分子(配列番号1)、BNP3-32分子(配列番号2)、BNP4-32分子(配列番号3)、BNP5-32分子(配列番号4)、及びBNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも2種を含むB型ナトリウム利尿ホルモン(BNP)分子群を含有する血液試料を、質量数の異なる前記各BNP分子の区別及び定量が可能な検出工程に供することによって、前記BNP分子群を検出し、
 前記BNP分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比を指標として、前記被験者における心筋虚血状態を評価する方法。
 心筋虚血状態を評価することは、すなわち冠動脈の狭窄の有無を調べることでもある。具体的には、虚血性心疾患の有無を判断すること、PCI後の再狭窄の有無を判断することが含まれる。
 本発明において、BNP1-32分子は、32アミノ酸からなる成熟B型ナトリウム利尿ホルモンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列を有する。(或いは、108アミノ酸からなるB型ナトリウム利尿ホルモン前駆体をBNP1~108と表記した場合、BNP77-108が本発明における成熟B型ナトリウム利尿ホルモンBNP1-32に相当する。)
 BNP3-32分子は、BNP1-32分子のN末端の2アミノ酸SP(アミノ酸一文字略号により表示、以下において同様)がプロセスされて生じる断片であり、配列番号2に示すアミノ酸配列を有する。BNP4-32分子は、BNP1-32分子のN末端の3アミノ酸SPKがプロセスされて生じる断片であり、配列番号3に示すアミノ酸配列を有する。BNP5-32分子は、BNP1-32分子のN末端の4アミノ酸SPKMがプロセスされて生じる断片であり、配列番号4に示すアミノ酸配列を有する。
 本発明において、B型ナトリウム利尿ホルモン(BNP)分子群は、成熟B型ナトリウム利尿ホルモン分子(すなわちBNP1-32分子)、BNP3-32分子、BNP4-32分子、BNP5-32分子、及びBNP5-32より質量数が16Da大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも2種も含み、それら以外の、BNP1-32からプロセシングを受けて生じた断片及びそれを基本とする誘導体をさらに含んでよい。
(2)
 前記分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比は、
 前記BNP1-32分子の検出強度及び前記BNP3-32分子の検出強度の和と、前記BNP5-32分子の検出強度との比
である、(1)に記載の方法。
 すなわち、(2)に記載の比は、下記式:
  {I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)      (式1)
(式中、I(BNP 1-32)は前記BNP1-32分子の検出強度であり、
 I(BNP 3-32)は前記BNP3-32分子の検出強度であり、
 I(BNP 5-32)は前記BNP5-32分子の検出強度である。)
及びその逆比のいずれかで表される。
(3)
 前記分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比は、
 前記BNP3-32分子の検出強度と、前記BNP5-32分子の検出強度との比
である、(1)又は(2)に記載の方法。
 すなわち、(3)に記載の比は、下記式:
  I(BNP 3-32)/I(BNP 5-32)      (式2)
(式中、I(BNP 3-32)は前記BNP3-32分子の検出強度であり、I(BNP 5-32)は前記BNP5-32分子の検出強度である。)
及びその逆比のいずれかで表される。
 上記(2)及び(3)において、好ましくは、血液検体のBNP測定値が18pg/mL以上、又は21.9pg/mL以上である。
 上記(2)及び(3)において、好ましくは、前記心筋虚血状態が、虚血性心疾患によるもの、又はPCI後の再狭窄によるものである、
(4)
 前記分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比は、
 前記BNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子の検出強度と、前記BNP5-32分子の検出強度との比
である、(1)~(3)のいずれかに記載の方法。
 すなわち、(4)に記載の比は、下記式:
  I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)      (式3)
(式中、I(BNP 5-32)は前記BNP5-32分子の検出強度であり、
 I(BNP 5-32+)は前記BNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子の検出強度である。)
及びその逆比のいずれかで表される。
(5)
 前記血液試料は、BNP測定値が18~150pg/mLである被験者の血液検体そのもの又は血液検体から調製されたものである、(1)~(4)のいずれかに記載の方法。
(6)
 前記心筋虚血状態が、虚血性心疾患によるもの、又はPCI後の再狭窄によるものである、(1)~(5)のいずれかに記載の方法。
 前記(1)~(6)において、前記血液試料が、少なくともアプロチニンを含む採血管を用いて前記被験者から採血して得た血液検体から調製されたものであってよい。
 前記(1)~(6)において、好ましくは、前記血液検体は血漿検体である。
(7)
 前記血液試料が、前記被験者の血液検体を、前記B型ナトリウム利尿ホルモン分子群に対する抗体を用いた免疫学的濃縮に供することによって調製されるものである、(1)~(6)のいずれかに記載の方法。
 前記(1)~(7)において、前記質量数の異なる各BNP分子の区別及び定量が可能な方法は、生体特異的親和性に基づく方法又は質量分析法とすることができる。
 本発明によると、心筋虚血状態が引き起こす病態(例えば虚血性心疾患や再狭窄など)を低侵襲的に評価することが可能になる。
 また、本発明によると、従前の方法では何らかの心血管疾患の疑いがあるとあいまいに判断されるのみで、心血管疾患の有無を判断することができないBNP値(すなわち心不全疑いの有無の判断の閾値範囲18.4~150pg/mL)を示す血液試料からであっても、心血管疾患の有無を判断することが可能になる。
 より具体的に、本発明の効果を以下に示す。
 本発明は、従来用いられていたBNPについての量的観点に基づいた指標(すなわちBNP値)とは異なり、BNPについての質的観点に基づいた指標を用いる方法であるため、量的観点のみでは得られない情報を血液試料から得ることを可能にした。すなわち、本発明は、心筋虚血状態の検査を、血液検査のみによって行うことを初めて可能にした。
 本発明では新しい指標が用いられるため、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であった18.4~150pg/mLのBNP値を示す血液試料から、そのような病態の評価が可能になった。また、本発明で用いられる新しい指標の有用性は、虚血状態において特異的に示されるものであるため、高いBNP値を示す疾患(例えば慢性心不全)においても、心筋虚血状態の有無の判断を行うことが可能になった。
 また、本発明は血液検査で用いられるため、従来の侵襲的な検査法(心臓カテーテル検査など)と比較して非常に容易且つ低侵襲である。このため、あらかじめ行った血液検査で狭窄の疑いが有ると判断された患者のみに、より確実性を期すための侵襲的な検査法を適用することが可能になる。すなわち、不必要な心臓カテーテル検査などを回避できるため、患者の体への負担、及び検査費用を大幅に削減することが可能となる。また、従来約半年ごとに行っていた心臓カテーテル検査では処置の必要な再狭窄が半年より早くに生じていても処置ができず、的確な処置が不可能であったが、低侵襲な血液検査では簡便に繰り返し検査ができるため、より早期に的確な処置が可能となる。
 このように、本発明の方法は、従前の検査法とは異なり、容易、低侵襲的、且つ経済的な血液検査のみで、虚血の信頼性高い評価及び早期発見が可能となる。ひいては動脈硬化の判定にも応用可能である。さらに、上述のように、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であったBNP値を示す血液試料におけるBNPの意義が明らかになったため、BNPのフラグメント及びその修飾フラグメントが創薬へとつながる可能性が見出される。
実験例1において、採血にEDTA採血管を用いた場合とEDTA-アプロチニン採血管を用いた場合とにおける、BNPのプロセシングの違いを示したMSスペクトルである。 実験例2において、抗体KYBNPIIがBNP1-32、BNP3-32、BNP4-32、及びBNP5-32を特異的に認識する抗体であることを示したMSスペクトルである。 実験例3において検討された本発明の方法の検出限界を示すMSスペクトルである。 実験例4において、臨床検体から、BNP1-32とともに、BNP1-32からN末端がプロセスされたBNP3-32、BNP4-32及びBNP5-32が検出されたことを示すMSスペクトルである。 実施例1において、従来のEIA法によるBNP測定値が約90pg/mLと同等である2つの臨床検体の血漿が、本発明の方法によって質的に異なるものとして検出されたことを示すMSスペクトルである。 実施例2において、BNP値が40.8pg/mL~147.8pg/mLの24臨床検体について、指標としてI(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)を用い、MSシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。 実施例3において、BNP値が21.4pg/mL~147.8pg/mLの41臨床検体について、指標としてI(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)を用い、MSシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。 実施例4において、MSシグナルのパターン解析及び指標I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)と有意狭窄の有無との相関の調査を、ROC曲線を用いて解析した結果である。 実施例5において、BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)を用い、MSシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。 実施例6において、MSシグナルのパターン解析及び指標{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)と有意狭窄の有無との相関の調査を、ROC曲線を用いて解析した結果である。 比較例1において、BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)を用い、その指標と高血圧の有無との相関の調査を行った結果である。 比較例2において、BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)を用い、その指標と高脂血症の有無との相関の調査を行った結果である。 比較例3において、BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)を用い、その指標と糖尿病の有無との相関の調査を行った結果である。 比較例4において、BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)を用い、その指標と性別との相関の調査を行った結果である。 実施例7において、BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33臨床検体について、指標としてI(BNP 4-32)/I(BNP 5-32)を用い、MSシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。 実施例8において、BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33臨床検体について、指標として{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 4-32)を用い、MSシグナルのパターン解析及び指標と有意狭窄の有無との相関の調査を行った結果である。
[1.血液検体]
[1-1.被験者]
 本発明の方法において被験者となりうる者は、主訴の有無を問わずどのような者でも許容される。具体的には、人間ドック患者、虚血性心疾患患者、PCIを受けた患者、心不全患者などが挙げられる。特に、従前の検査法で心臓カテーテル検査が必要とされる患者が挙げられる。また、高血圧、高脂血症、糖尿病などの疾患に罹患している者又はその疑いがある者であっても良い。
 本発明は、被験者の心筋虚血状態を調べる方法である。心筋虚血状態とは、動脈硬化性変化などがもたらす冠動脈の狭窄によって、心臓の酸素供給が十分に行われていない状態をいう。従って、本発明は、被験者の冠動脈の狭窄の有無を調べる方法ということもできる。本発明において、心筋虚血状態が引き起こす具体的な病態としては、特に限定されず、虚血性心疾患、PCI後に起こる再狭窄が含まれる。
 虚血性心疾患の具体例としては、通常狭心症と心筋梗塞とが挙げられるが、本発明は、これまで血液検査では診断できなかった心筋虚血状態の診断を可能にするものであるため、従前では血液検査による診断が不可能であった狭心症に適用できる点で有用である。
 特に本発明は、PCI後に起こり得る再狭窄の有無を診断する場合に、心臓カテーテル検査の前段階の診断時に適用できるという点で非常に有用である。PCIは具体的には、ステント留置術、バルーンを用いる冠動脈形成術、カッティングバルーンカテーテル、アテレクトミーなどが挙げられる。
 なお、本発明において、狭窄が有る、或いは有意な狭窄が有るとする場合、その狭窄の度合いは冠動脈造影所見で75%以上(左冠動脈主幹部は50%以上)である。
[1-2.血液検体の形態]
 本発明で用いられる血液検体の形態としては、全血、血漿、血清が挙げられるが、中でも血漿の形態であることが好ましい。血漿の形態の血液検体を用いることによって、後述の検出工程での検出対象となるBNPの不必要な断片化(例えばC末端からの切断)を防ぐことができ、より正確な評価を行うことが可能になる。
[1-3.血液検体に加えられうる成分]
 血液検体には、血液安定剤が適宜含まれてよい。
血液安定剤としては、プロテアーゼ阻害剤や抗凝固剤などが挙げられる。このような血液安定剤としては、例えば、アプロチニン、エチレンジアミン四酢酸、ヘパリン、クエン酸、フッ化ナトリウムが含まれる。これらの血液安定剤は、当業者が適宜選択して用いることができる。本発明では、特にアプロチニンを少なくとも用いることが好ましい。具体的には、採血管にアプロチニン、EDTAを含むものを用いることが好ましい。アプロチニン、EDTAを含む採血管を用いることによって、後述の検出工程での検出対象となるBNPの不必要な断片化を防ぐことができ、より正確な評価を行うことが可能になる。
[1-4.血液検体のBNP値]
 本発明において、BNP測定値又はBNP値とは、心不全などのマーカーとして広く臨床応用されている指標をいう。BNP値は、公知の方法、例えばEIA法(酵素免疫測定法)によって測定される。本発明における質的観点からみれば、BNP値とは、後述の検出工程での検出対象となるBNP分子群を含む、異なる分子量を有するBNP分子混合物全体の濃度である。
 本発明は、虚血状態の診断に有用であり、対象となる血液検体のBNP値は特に限定されるものではなく、あらゆるBNP値の血液検体を対象としてよい。
 例えば、本発明は血液検体のBNP値が18~150pg/mLである場合にも有用である。この範囲のBNP値は、これまで血液検査では異常の有無が曖昧であったため、心不全の診断を行うための重要な情報ではなかった。しかしながら、本発明の方法では、この範囲のBNP値において、後述する指標の値が、冠動脈狭窄の有無の間で有意な差を示すことを利用して異常の有無の判断を行うことが可能である。
 このようなBNP値を示す血液検体に対して好ましい指標としては、後述の4-1-1、4-1-2、4-1-3に記載する指標が挙げられる。
 上記範囲のBNP値を有する血液検体の中でも、20~150pg/mL、30~150pg/mL、或いは40~150pg/mLのBNP値を示す血液検体においては、上記18~150pg/mLの範囲を示す血液検体に比べて異常の有無の判断をより信頼性高く行うことが可能となる場合がある。このような傾向を示す指標としては、後述4-1-3に記載する指標が挙げられる。
 さらに、本発明は血液検体のBNP値が150pg/mLを上回る範囲の場合にも有用である。この範囲においては、これまでの血液検査では心不全の疑い有りという診断のみが可能であったが、本発明の方法では、この範囲のBNP値において、すなわち、心不全疑いの濃厚な患者においても冠動脈狭窄の有無を判断することが可能である。なお、この範囲のBNP値の上限値としては特に限定されず、臨床的に生じうる150pg/mLを上回るBNP値のいかなるものも含まれる。例えば、650pg/mL程度のBNP値が臨床で生じることがあるが、これを上回るBNPが生じることももちろんある。
 このように本発明は血液検体のBNP値が150pg/mLを上回る範囲の場合にも有用であるため、上述の18~150pg/mLの範囲をあわせた18pg/mL以上の範囲において、本発明を有用に用いることができる。この場合、さらに20pg/mL以上の範囲であることも好ましい。
 このようなBNP値を示す血液検体に対して好ましい指標としては、後述4-1-1、4-1-2に記載する指標が挙げられる。
 一方、本発明はBNP値が18pg/mLを下回る範囲の場合にも用いることができる。この範囲においては、これまでの血液検査で異常なしと評価されてきたが、本発明の方法で、質的観点からさらに詳細に分析することも可能である。検体使用量が500μL程度の場合には、例えば質量分析による検出法を用いた場合には検出限界を下回ることがあるが、検体使用量を適宜増やす(例えば1mLや2mLに増やすなどによって、同様な分析は可能である。
[2.血液試料]
 本発明において、血液試料とは、検出工程に供される試料をいう。従って、血液試料は、上記の血液検体を適当な処理に供して調製したものであっても良いし、上記の血液検体そのものであっても良い。
[2-1.血液試料に含まれる検出対象分子]
 本発明で検出対象となる分子は、血液試料中に存在するB型ナトリウム利尿ホルモン(BNP)分子群である。BNP分子群を構成する分子には、BNP1-32、BNP1-32からプロセシングを受けて生じた断片、及び/又はそれらを基本とする誘導体が含まれうる。BNP分子群を構成するこれら分子には、被験者の生体内で生じたものが含まれなければならない。
 BNP分子群を構成する分子には、被験者の生体内で生じた分子が採血時や試料調製時に変化(例えば生体内で起こり得ないプロセシングや化学変化)したものも含まれうるが、できるだけそのような分子が含まれないように血液試料を調製することが好ましい。例えば、血液検体として血漿の形態のものを用いる、アプロチニン、EDTAを含む採血管を用いることなどによって、BNPのC末端の切断やN末端の非特異的な切断を抑制した血液試料を調製することが好ましい。
 より具体的には、BNP1-32は、32アミノ酸からなる成熟B型ナトリウム利尿ホルモンであり、配列番号1に示すアミノ酸配列を有する。或いは、108アミノ酸からなるB型ナトリウム利尿ホルモン前駆体をBNP1~108と表記した場合、BNP77-108が本発明における成熟B型ナトリウム利尿ホルモンBNP1-32に相当する。
 BNPからプロセシングを受けて生じた断片としては、被験者の体内状態をより良く反映させる観点から、BNP3-32分子、BNP4-32分子、BNP5-32分子などが少なくとも挙げられる。BNP3-32分子は、BNP1-32分子のN末端の2アミノ酸SP(アミノ酸一文字略号により表示、以下において同様)がプロセスされて生じる断片であり、配列番号2に示すアミノ酸配列を有する。BNP4-32分子は、BNP1-32分子のN末端の3アミノ酸SPKがプロセスされて生じる断片であり、配列番号3に示すアミノ酸配列を有する。BNP5-32分子は、BNP1-32分子のN末端の4アミノ酸SPKMがプロセスされて生じる断片であり、配列番号4に示すアミノ酸配列を有する。
 BNP1-32又はそれからプロセシングを受けて生じた断片を基本とする誘導体としては、具体的には、当該基本となる分子が化学変化して生じたものが挙げられる。より具体的には、当該化学変化として酸化が挙げられる。主に、メチオニンが酸化を受けうる。
 本発明においては、BNP分子群を構成する分子のひとつとして、BNP5-32より質量数が16Da大きい分子を含む。この分子は、BNP5-32との質量数の差が16Daであること、後述のように、1つの抗体によって他のBNP断片とともに免疫学的濃縮が可能であること、及び、脱酸化試薬を作用させることにより消失することが本発明者らによって確認されていることから、BNP5-32の酸化物とも考えられる。本発明では、この分子の表記としては、構造の観点から特定することなく、質量数の観点のみから、「BNP5-32より質量数が16Da大きい分子」とし、便宜上の観点から、この分子を上記「誘導体」に含めている。
 すなわち、本発明において、BNP分子群は、BNP1-32分子、BNP3-32分子、BNP4-32分子、BNP5-32分子、及びBNP5-32より質量数が16Da大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも2種を含むものであり、さらに、それら以外の、BNP1-32からプロセシングを受けて生じた断片及びそれを基本とする誘導体を含むことも許容する。
[2-2.免疫学的濃縮]
 本発明においては、血液検体中に含まれるBNP分子群を免疫学的に濃縮することが好ましい。免疫学的濃縮法としては、免疫複合体が形成しうる条件下で、血液試料中のBNP分子群と、BNP分子群に対する抗体とを接触させることにより、BNP分子群を特異的に濃縮することができる方法であればどのような方法であっても良く、当業者によって適宜選択されうる。また、具体的なプロトコルも当業者によって容易に選択されうる。
 免疫学的濃縮法の具体例としては、免疫沈降法、親和的カラムクロマトグラフィ法などが挙げられる。これらの方法は、当業者に良く知られた方法であり、そのプロトコルは当業者によって適宜決定されるものである。
 本発明においては、免疫沈降法を用いることが好ましい。この方法においては、免疫複合体が形成しうる条件下で、血液試料と、対象となるBNP分子群に対する抗体と、沈降用の担体とを共存させ、免疫沈降物を得る。この方法は、操作が簡便でコスト性が良く、非常に汎用性が高い点で好ましい。
 免疫学的濃縮において用いられる抗体の例としては、濃縮対象とするBNP分子群に含まれるBNPを同時に認識することができる抗体が挙げられる。この抗体は、濃縮対象となるBNP分子群に含まれるBNP分子に共通する領域を使用し、その共通領域を有するペプチド断片を認識することができる抗体として、当業者によって適宜調製されうる。
 免疫学的濃縮において用いられる抗体の他の例としては、濃縮対象とするBNP分子群に含まれるBNP分子の各々を別々に認識する複数種の抗体の混合物が挙げられる。この抗体は、濃縮対象とするBNP分子群に含まれる特定のBNP分子における特徴的な領域を使用し、その領域を有するペプチド断片を認識することができる抗体として、当業者によって適宜調製されうる。
 より具体的な抗体の例として、KYBNPII(塩野義製薬)が挙げられる。KYBNPIIは、少なくともBNP1-32分子、BNP3-32分子、BNP4-32分子、BNP5-32分子、及びBNP5-32より質量数が16Da大きい分子を同時に認識することができる。
[3.検出工程]
 上記の血液試料は検出工程に供される。検出工程においては、質量数の異なるBNP分子の区別及び定量が可能な方法を用いる。すなわち、BNP分子群に含まれるそれぞれの分子の区別及び定量が可能な方法を用いる。ここでいう定量とは、それぞれのBNP分子の絶対量ではなく、相対量の測定が可能であれば足りる。検出工程で用いられる方法は、上記のような方法であればどのような方法であっても良く、当業者によって適宜選択されうる。具体的には、生体特異的親和性に基づく方法や、質量分析法が挙げられる。
[3-1.生体特異的親和性に基づく方法]
 生体特異的親和性に基づく方法を用いる場合は、血液検体を上記の免疫学的濃縮に供し、得られた血液試料を検出工程に供しても良いし、上記の免疫学的濃縮を行うことなく、血液検体(例えば血漿検体)そのものを血液試料として検出工程に供しても良い。
 生体特異的親和性に基づく方法は当業者に良く知られた方法であり、生体特異的親和力による複合体を形成しうる条件のもと、血液試料を生体特異的親和性物質に接触させ、得られるシグナルの量を測定することによって行われる方法であればどのような方法であっても良く、当業者によって適宜選択されうる。また、具体的なプロトコルも当業者によって容易に選択されうる。
 具体的には、当該方法としてはイムノアッセイが好ましい。すなわち、免疫複合体を形成しうる条件のもと、血液試料を抗体に接触させ、得られるシグナルの量を測定することによって行われる。具体的には、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA、サンドイッチイムノアッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル内拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集測定、補体結合分析検定、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。より具体的なプロトコルは、当業者であれば容易に選択することができる。
 上記イムノアッセイにおいては、BNP分子群に含まれるBNP分子の各々を別々に認識する複数種の抗体が用いられる。この抗体は、濃縮対象とするBNP分子群に含まれる特定のBNP分子における特徴的な領域を使用し、その領域を有するペプチド断片を認識することができる抗体として、当業者によって適宜調製されうる。
[3-2.質量分析法]
 質量分析法を用いる場合は、血液検体を上記の免疫学的濃縮に供し、得られた血液試料を検出工程に供することが好ましい。
 質量分析法は、当業者に周知の方法であり、タンパク質・ペプチド分子の検出が可能なイオン化手段及び検出手段を特に限定することなく、当業者が適宜選択することができる。例えば、イオン化法として、電子イオン化法(EI)、化学イオン化法(CI)、高速原子衝撃法(FAB)、エレクトロスプレーイオン化法(ESI)、大気圧化学イオン化法(APCI)法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(MALDI)、表面増強レーザー脱離イオン化法(SELDI)などを用いることができる。好ましくは、MALDI-TOF型質量分析装置を用いることができる。SELDI法を用いる場合は、上記免疫学的濃縮において用いられる抗体を用いることができる。
[4.評価工程]
[4-1.指標]
 本発明においては、上記の方法によって検出されたBNP分子群から選択される少なくとも1つの分子の検出強度と、当該BNP分子群から選択される少なくとも1つの他の分子の検出強度との比を評価のための指標とする。この指標は、これまでのBNPについての量的観点に基づいた指標(すなわちBNP値)とは異なり、BNPについての質的観点に基づいた指標である。このため、従来の方法と異なり、量的観点のみでは得られない情報を血液試料から得ることが可能になる。すなわち、当該指標によって、血液試料から心筋虚血の有無すなわち冠動脈の有意な狭窄(具体的には冠動脈造影所見で75%以上、左冠動脈主幹部においては50%以上)の有無を判断することが可能になる。
[4-1-1.指標例1]
 本発明において用いられる指標の一例として、BNP1-32分子の検出強度及びBNP3-32分子の検出強度の和と、BNP5-32分子の検出強度との比が挙げられる。具体的には、
下記式:
  {I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)      (式1)
(式中、(BNP 1-32)は前記BNP1-32分子の検出強度であり、
 I(BNP 3-32)は前記BNP3-32分子の検出強度であり、
 I(BNP 5-32)は前記BNP5-32分子の検出強度である。)
で表される比及びその逆比が挙げられる。
 式1で示される比の値は、狭窄が有る患者群において、狭窄が無い患者群に比べて有意に低い値となる。この傾向は、検体のBNP値が例えば18pg/mL以上、或いは21.9pg/mL以上の場合により強く見られる。
[4-1-2.指標例2]
 ここで、BNP1-32分子は、分解を受けやすく、血液採取後速やかにBNP3-32へ変化することが、本発明者らによって確認されている。そのため、臨床検体その他の条件によってはBNP1-32分子が観測されない、或いはほとんど観測されない場合もある。そのような場合においては、上記の指標において考慮されたBNP1-32分子を無視した指標を用いることもできる。
 すなわち、本発明において用いられる指標の他の一例として、BNP3-32分子の検出強度と、BNP5-32分子の検出強度との比が挙げられる。具体的には、下記式:
  I(BNP 3-32)/I(BNP 5-32)      (式2)
(式中、I(BNP 3-32)は前記BNP3-32分子の検出強度であり、I(BNP 5-32)は前記BNP5-32分子の検出強度である。)
で表される比及びその逆比が挙げられる。
 式2で示される比の値は、狭窄が有る患者群において、狭窄が無い患者群に比べて有意に低い値となる。この傾向は、検体のBNP値が例えば18pg/mL以上、或いは21pg/mL以上の場合により強く見られる。特に、血液検体中の、BNP1-32分子のシグナルが観測されない場合或いはシグナル強度が無視できる程度である場合にこの傾向が強い。
[4-1-3.指標例3]
 本発明において用いられる指標のさらなる他の一例として、BNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子の検出強度と、BNP5-32分子の検出強度との比が挙げられる。具体的には、下記式:
  I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)      (式3)
(式中、I(BNP 5-32)は前記BNP5-32分子の検出強度であり、I(BNP 5-32+)は前記BNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子の検出強度である。)
で表される比及びその逆比が挙げられる。
 式3で示される比の値は、狭窄が有る患者群において、狭窄が無い患者群に比べて有意に高い値となる。この傾向は、検体のBNP値が例えば18~150pg/mLの場合により強く見られる。また、21pg/mL~150pg/mL、30~150pg/mL或いは40~150pg/mLの場合にはさらに強く見られる。
[4-2.評価手段]
 このような指標を利用して狭窄の有無を判断する場合、患者に由来する血液試料についての当該比の値を、あらかじめ定めた基準値と比較すると良い。基準値は、例えば、予め上記の比の値を確認した複数の被験者について、心臓カテーテル検査による狭窄があったか否かの結果を、統計学的解析手法を用いて解析することにより設定することができる。
 統計学的解析手法の例としては、Receiver-operating characteristics(ROC)曲線を用いた解析が挙げられる。ROC曲線を用いた解析においては、狭窄群を識別する感度と特異度との差が最小値を示す値を基準値とすることができる。或いは、当該基準値は、予測精度、予防効果等の臨床現場における要望や事情を勘案して、それぞれの要望や事情に最適な値を当業者が適宜調整することができる。
 さらに、本発明の方法は、他のいかなる方法と組み合わせられても良い。例えば、他の心血管疾患検査法と組み合わせることによって、より信頼性の高い検査を行うことができる。
 以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、質量分析による解析においては、同一臨床検体を同時に2サンプルを分析したそれぞれのサンプルをMSで2回分析した。合計4つの分析データを解析し、CV値が15%以内の結果のみ採用した。
[実験例1:採血管等の検討]
1)血漿調製
 被験者:インフォームドコンセントの得られた健常者から採血を行った。
 採血:肘静脈より一般的な方法で採血した。採血管としては、EDTA-アプロチニン採血管及びEDTA採血管を検討した。血清調製のためには血清分離剤を含む一般的な採血管を使用した。
 採血後の処理:採血後直ちに外部からBNP1-32(最終濃度200fmol/mL)をスパイクし、採血後ただちに血漿分離を行った(実際に調製のために要した時間は15~30分である)。また、時間変化を検討した結果、ただちに血漿分離が不可能な場合は、4度もしくは氷上にて保管後6時間以内に血漿分離を行った。その血漿は直ちに液体窒素で凍らせ、マイナス80度にて保存した。
 融解した血漿サンプルを、後述の実験例2に詳述するBNP濃縮及び濃縮BNPの質量分析を行った。
 その結果を図1に示す。図1(i)~(iii)が示すように、いずれもN末端のSPの2アミノ酸(アミノ酸一文字略号で表記、以下において同様)がプロセスされたフラグメント(BNP3-32)が生じていることがわかった。N末端のSPの2アミノ酸がプロセスされることは、従来から報告のあるとおりである。
 しかしながら、図1(i)が示すように、EDTA採血管を使用した場合、さらにN末端のSPKがプロセスされたフラグメントや、C末端のRH、或いはRRHがプロセスされたフラグメントも検出された。なお、C末端の切断は、氷上において時間とともに生じやすくなることも確認された(N末端の切断も、時間とともに生じやすくなることを確認した。いずれもデータ示さず)。
 一方、図1(ii)及び(iii)が示すように、EDTA-アプロチニン採血管を使用した場合、N末端のSPKがプロセスされたフラグメントが極微量検出されたものの、C末端がプロセスされたフラグメントはほとんど検出されなかった。
 従って、EDTA採血管を使用した場合はBNP1-32のN末端やC末端からの切断が生じやすく、EDTA-アプロチニン採血管を使用した場合、BNP1-32のC末端からの切断が抑制されることが確認された。すなわち、EDTA-アプロチニン採血管を使用すると、EDTA採血管を使用した場合より、生体内のBNPの存在状態をよく反映していると考えられる。
 なお、採血から血漿調製までの時間変化についても検討した。すなわち、採血後ただちに血漿分離を行った場合、4度で6時間保管後に血漿分離を行った場合のそれぞれについて分析した。その結果、この両者で変化のないことを確認した(データ示さず)。
 一方、血漿分離の代わりに血清分離を行った以外は上記と同様の実験を行ったところ、血清中ではBNP1-32はN末端、C末端ともにすみやかに切断されることが確認された(データ示さず)。
[実験例2:抗体の特異性の確認]
1)血漿調製
 被験者:インフォームドコンセントの得られた健常者から採血を行った。
 採血:肘静脈よりEDTA-アプロチニン採血管を使用して採血した。
 採血後の処理:採血後はすみやかに氷上、もしくは4度にて保存した。採血後6時間以内に血漿分離を行い、その血漿はただちに液体窒素で凍らせ、マイナス80度にて保存した。この血漿を融解し、BNP混合物(Mixed BNP)として、BNP1-32、BNP3-32、BNP4-32及びBNP5-32(各々5fmolずつ)を添加した。このようなBNP添加検体(500μL)を2個調製した。
 また別途、BNP添加を行わずに血漿分離を行った検体も調製し、上記と同様に凍結保存した。このようなBNP非添加検体(500μL)も2個調製した。
2)BNPの濃縮
 1次抗体にKYBNPII((株)塩野義製薬より供与を受けたもの)を、2次抗体に抗マウスIgG結合ビーズ(Dynabeads M-280 Sheep anti-Rabbit IgG、ベリタス社、カタログNo.112.03)を用いて、血漿中のBNPを免疫沈降した。
 具体的には、上記BNP添加検体のうち1個と、上記BNP非添加検体のうち1個とのそれぞれについて、以下の方法により免疫沈降を行った。
 抗マウスIgG結合ビーズ20μLをPBSで3回洗浄した。
 次に、KYBNPII 2μLを加え、室温で1時間インキュベートすることにより、KYBNPIIをビーズに結合させた。
 対照としては、KYBNPIIを加えずに、ビーズを室温で1時間インキュベートした。
 これらのビーズをPBSで5回洗浄した後、KYBNPIIを結合させたビーズを20μLのPBSに懸濁し、氷上においた。
 マイナス80度にて保存しておいた検体を、37度の温浴槽にてすみやかに融解し、氷上においた。
 融解した検体(500μL)に、PBS(10×)50μL、DDW 440μL、10%(w/v) Zwittergent (Calbiochem社)を加え1mLとした。
 上記のKYBNPIIを結合させたビーズを20μL加えた。
 対照として、上記でKYBNPIIを加えずに1時間インキュベートしたビーズを20μL加えた。
 室温にて1時間インキュベートし、血漿中のBNPをビーズに結合させた。
 このビーズをPBSで4回洗浄した。
 さらに、20mM NHHCOで1回洗浄した。
 このビーズからのBNPの溶出は、5μLの0.5%(v/v) TFAを用いて行った。
3)濃縮BNPの質量分析
 以下の(a)~(d)の検体について、質量分析を行った。
   (a):BNP濃縮操作を行ったBNP添加検体
   (b):BNP濃縮操作を行わなかったBNP添加検体
   (c):BNP濃縮操作を行ったBNP非添加検体
   (d):BNP濃縮操作を行わなかったBNP非添加検体
 BNP濃縮操作を行った検体(a)及び(c)についてはビーズから溶出した全量をMALDIターゲットプレートに滴下した。一方、BNP濃縮操作を行わなかった検体(b)及び(d)についてもビーズから溶出した全量をMALDIターゲットプレートに滴下した。
 マトリックスには5mg/mL DHBと2.5mg/mL のCHCAの混合マトリックスを用いた。
 風乾後、すみやかにAXIMA-CFR plusにて分析を行った。
 AXIMA-CFR plusでの分析はリニアモードで行い、m/zの較正にはACTH (18-39) fragment、Insulin oxidized B-chainを用いた。
 検体(a)、(b)、(c)及び(d)についての質量分析結果を図2に示す。図2が示すように、BNP濃縮操作を行ったBNP添加検体(a)のみにおいて、BNP1-32、BNP3-32、BNP4-32、及びBNP5-32の特異的なシグナルを得た。従って、KYBNPII抗体は、BNP1-32、BNP3-32、BNP4-32、及びBNP5-32を特異的に認識する抗体であることが確認された。
[実験例3:検出限界(Limit of detection;LOD)の検討]
 ヒト市販血清0.5mLに、下記濃度のBNP1-32を加えて調製した血清サンプル(e)、(f)、(g)、(h)、(i)及び(j)を、実験例2と同様のBNP濃縮及び質量分析に供した。
   (e):20fmol(70pg)/0.5mL血清
   (f):10fmol(35pg)/0.5mL血清
   (g):5fmol(17.5pg)/0.5mL血清
   (h):2.5fmol(8.75pg)/0.5mL血清
   (i):1fmol(3.5pg)/0.5mL血清
   (j):0fmol(0pg)/0.5mL血清
 得られたMSスペクトルを図3に示す。図3が示すとおり、サンプル(i)1fmol(3.5pg)/0.5mL血清のBNPを検出することが可能であった。すなわち検出限界は2fmol(7pg)/mLである。一方、臨床現場におけるBNP値の基準値上限は18.4pg/mLである。従って、この基準値上限付近のBNP値も原理的には測定可能な検出感度を有することが確認された。
[実験例4:臨床検体におけるBNP検出例]
1)血漿調製
 被験者:心臓カテーテル検査を行う患者のうち、インフォームドコンセントの得られた患者(♯1037)から採血を行った。
 採血:カテーテル導入前にカテーテルシースより血液を採取し、その血液をEDTA-アプロチニン採血管に分注した。この患者のBNP値は、117.1pg(~33fmol)/mLであった。
 採血後の処理:採血後4度で保管し、6時間以内に血漿分離を行った。その血漿は直ちに液体窒素で凍らせ、分析に供するまでマイナス80度にて保存した。
2)上記の♯1037検体について、実験例2と同様にBNP濃縮を行った。
3)以下のサンプル(k)、(l)、(m)について、実施例2と同様に質量分析に供した。
   (k):BNP濃縮を行った♯1037検体
   (l):BNP濃縮を行わなかった♯1037検体
   (m):健常者由来血漿にBNP混合物(BNP1-32、BNP3-32、BNP4-32及びBNP5-32;各々5fmolずつ)を添加したサンプル
 得られたMSスペクトルを図4に示す。図4(k)より、BNP1-32以外に3つの特異的なシグナルを検出した。図4(l)及び(m)より、この特異的なシグナルは、それぞれ、N末端がプロセスされたBNP3-32、BNP4-32及びBNP5-32と考えられる。
[実施例1:臨床検体の血漿分析]
 本実施例では、インフォームドコンセントが得られた患者♯1086(BNP値:89.0pg/mL)及び患者♯1067(BNP値:92.6pg/mL)から採血した血液を、実験例4と同様に血漿分離、BNP濃縮及び質量分析に供した。
 得られたMSスペクトルを図5に示す。図5が示すように、BNP1-32、BNP3-32、BNP4-32及びBNP5-32の4つのシグナルの相対強度比のパターンが両者において異なっていることがわかった。また、BNP5-32のシグナルと、それより16Da質量数が大きいシグナルとに着目すると、♯1086の場合はBNP5-32より16Da質量数が大きいシグナルがより高い強度で検出されていることに対し、♯1067の場合はBNP5-32のシグナルがより高い強度で検出されていることがわかった。
 このように、これらの検体はいずれも、従来のEIA法によるBNP測定値は約90pg/mLであまり変わらないが、本発明の方法に供することによって従来のEIA法では検出できない質的な違いを検出することが可能である。
[実施例2:MSシグナルのパターン解析及び有意狭窄の有無との相関調査1-1]
 本実施例では、インフォームドコンセントが得られた24患者から採血した血液(BNP値:40.8pg/mL~147.8pg/mL)を、実験例4と同様に血漿分離、BNP濃縮及び質量分析に供した。
 得られたMSスペクトルにおいて、BNP5-32のシグナル(m/z=3,022)のシグナルの相対強度に対する、BNP5-32より16Da質量数が大きいシグナルの相対強度の比(以下、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)と表記する)を計算した。
 心臓カテーテルの診断結果情報から、狭窄があった患者と、有意な狭窄がなかった患者とについて、当該比の値との相関を調べた。なお、有意な狭窄の有無という2群判別にはStudentのt検定(両側)および、後述の実施例4でROC曲線を用いた検討を行った。
 BNP値が40.8pg/mL~147.8pg/mLの24患者について、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)の値と、有意な狭窄の有無との関係を表した図を、図6に示す。
 図6が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者では、有意な狭窄が無いと診断された患者と比較して、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)の値が有意に(p=0.002)大きいという結果が得られた。すなわち、BNP値が40.8pg/mL~147.8pg/mLである場合に、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者とでは、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)の値に顕著な相関が見られた。
[実施例3:MSシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査1-2]
 本実施例では、インフォームドコンセントが得られた41患者から採血した血液(BNP値:21.4pg/mL~147.8pg/mL)について、実施例2と同様にMSシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。
 BNP値が21.4pg/mL~147.8pg/mLの41患者について、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)の値と、有意な狭窄の有無との関係を表した図を、図7に示す。
 図7が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者では、有意な狭窄が無いと診断された患者と比較して、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)の値が有意に(p=0.0026)大きいという結果が得られた。すなわち、BNP値が21.4pg/mL~147.8pg/mLである場合にも、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者とでは、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)の値に顕著な相関が見られた。
[実施例4:MSシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査1-3]
 本実施例では、有意な狭窄の有無という2群判別にROC曲線を用いた解析を行った。BNP値x(pg/mL)の範囲が、10<x<150、40<x<150、及び10<x<40の場合について、得られたROC曲線を図8に示す。図8が示すように、BNP値の範囲が40<x<150の場合に特に精度が良く、この場合のAUCは0.94、I(BNP 5-32+)/I(BNP 5-32)=0.75としたときの感度は91%、特異度は85%であった。
[実施例5:MSシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査2-1]
 本実施例では、インフォームドコンセントが得られた33患者から採血した血液(BNP値:21.9pg/mL~645.8pg/mL)について、実施例2と同様にMSシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。なお、2群判別にはWilcoxon検定を用いた。
 BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33患者について、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値と、有意な狭窄の有無との関係を表した図を、図9に示す。
 図9が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者では、有意な狭窄が無いと診断された患者と比較して、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値が有意に(p=0.0007)小さいという結果が得られた。すなわち、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者とでは、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値に顕著な相関が見られた。
[実施例6:MSシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査2-2]
 本実施例では、有意な狭窄の有無という2群判別にROC曲線を用いた解析を行った。BNP値が21.9pg/mL~645.8pg/mLの33患者について、得られたROC曲線を図10に示す。図10が示すように、AUCは0.85、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32)=0.79としたときの感度は79%、特異度は93%であった。
[比較例1:MSシグナルのパターン解析と高血圧の有無との相関調査]
 実施例5における33患者について、実施例5と同様に当該パターンと高血圧の有無との相関の調査を行った。
 これらの33患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値と、高血圧の有無との関係を示した図を、図11に示す。
 図11が示すように、高血圧と判断される患者(HTN+)と判断されない患者(HTN-)との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値に有意な差はない(p=0.8411)という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例5で得られた結果と異なり、高血圧の有無と当該指標の値とでは相関がないことが示された。
[比較例2:MSシグナルのパターン解析と高脂血症の罹患の有無との相関調査]
 実施例5における33患者について、実施例5と同様に当該パターンと高脂血症の有無との相関の調査を行った。
 これらの33患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値と、高脂血症の有無との関係を示した図を、図12に示す。
 図12が示すように、高脂血症と判断される患者(HL+)と判断されない患者(HL-)との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値に有意な差はない(p=0.7680)という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例5で得られた結果と異なり、高脂血症の有無と当該指標の値とでは相関がないことが示された。
[比較例3:MSシグナルのパターン解析と糖尿病の罹患の有無との相関調査]
 実施例5における33患者について、実施例5と同様に当該パターンと糖尿病の有無との相関の調査を行った。
 これらの33患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値と、糖尿病の有無との関係を示した図を、図13に示す。
 図13が示すように、糖尿病と判断される患者(DM+)と判断されない患者(DM-)との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値に有意な差はない(p=0.5712)という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例5で得られた結果と異なり、糖尿病の有無と当該指標の値とでは相関がないことが示された。
[比較例4:MSシグナルのパターン解析と性別との相関調査]
 実施例5における33患者について、実施例5と同様に当該パターンと性別との相関の調査を行った。
 これらの33患者について、{I(BNP 1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値と、性別との関係を示した図を、図14に示す。
 図14が示すように、男性(M)と女性(F)との間には、{I(BNP  1-32)+I(BNP 3-32)}/I(BNP 5-32) の値に有意な差はない(p=0.5383)という結果が得られた。すなわち、狭窄の有無と当該指標の値との間の相関関係が示された実施例5で得られた結果と異なり、性別と当該指標の値とでは相関がないことが示された。
 上記比較例1~4と、実施例5との結果からわかるように、本発明で用いられる指標が、狭窄の有無において特異的に相関関係を示し、高血圧、高脂血症、糖尿病の有無や性別には相関関係を示さない。
[実施例7:MSシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査3]
 指標として、I(BNP 4-32)/I(BNP 5-32)を用いた以外は、実施例5と同様にMSシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。その結果を図15に示す。図15が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者との間において、当該指標のp値は、0.0771であった。
[実施例8:MSシグナルのパターン解析と有意狭窄の有無との相関調査4]
 指標として、{I(BNP 1-32)+I(BNP  3-32)}/I(BNP 4-32)を用いた以外は、実施例5と同様にMSシグナルのパターン解析、及び当該パターンと有意狭窄の有無との相関の調査を行った。その結果を図16に示す。図16が示すように、有意な狭窄が有ると診断された患者と有意な狭窄が無いと診断された患者との間において、当該指標のp値は、0.3820であった。
 上記実施例では、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他の色々な形態で実施することができる。例えば、上記実施例において、検出法として質量分析法を用いて本発明の指標の有効性が示されたことから、検出法として生体特異的親和性に基づく方法を用いた場合も同様の効果が示されることは明らかである。このような点も含め、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
 本発明によると、虚血性心疾患や再狭窄などの、心筋虚血状態が引き起こす病態を低侵襲的に評価することが可能になる。
 また、本発明によると、従前の方法では何らかの心血管疾患の疑いがあるとあいまいに判断されるのみで、心血管疾患の有無を判断することができないBNP値(すなわち心不全疑いの有無の判断の閾値範囲18.4~150pg/ml)を示す血液試料からであっても、心血管疾患の有無を判断することが可能になる。
 より具体的には、本発明は、従来用いられていたBNPについての量的観点に基づいた指標(すなわちBNP値)とは異なり、BNPについての質的観点に基づいた指標を用いる方法であるため、量的観点のみでは得られない情報を血液試料から得ることを可能にした。すなわち、本発明は、心筋虚血状態の検査を、血液検査のみによって行うことを初めて可能にした。
 本発明では新しい指標が用いられるため、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であった18.4~150pg/mlのBNP値を示す血液試料から、そのような病態の評価が可能になった。また、本発明で用いられる新しい指標の有用性は、虚血状態において特異的に示されるものであるため、高いBNP値を示す疾患(例えば慢性心不全)においても、心筋虚血状態の有無の判断を行うことが可能になった。
 また、本発明は血液検査で用いられるため、従来の侵襲的な検査法(心臓カテーテル検査など)と比較して非常に容易且つ低侵襲である。このため、あらかじめ行った血液検査で狭窄の疑いが有ると判断された患者のみに、より確実性を期すための侵襲的な検査法を適用することが可能になる。すなわち、不必要な心臓カテーテル検査などを回避できるため、患者の体への負担、及び検査費用を大幅に削減することが可能となる。また、従来約半年ごとに行っていた心臓カテーテル検査では処置の必要な再狭窄が半年より早くに生じていても処置ができず、的確な処置が不可能であったが、低侵襲な血液検査では簡便に繰り返し検査ができるため、より早期に的確な処置が可能となる。
 このように、本発明の方法は、従前の検査法とは異なり、容易、低侵襲的、且つ経済的な血液検査のみで、虚血の信頼性高い評価及び早期発見が可能となる。ひいては動脈硬化の判定にも応用可能である。さらに、上述のように、従前の血液検査では心疾患であるかどうかがあいまいで病態の判定が不可能であったBNP値を示す血液試料におけるBNPの意義が明らかになったため、BNPのフラグメント及びその修飾フラグメントが創薬へとつながる可能性が見出される。

Claims (7)

  1.  被験者に由来する血液試料であって、BNP1-32分子(配列番号1)、BNP3-32分子(配列番号2)、BNP4-32分子(配列番号3)、BNP5-32分子(配列番号4)、及びBNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子からなる群から選ばれる少なくとも2種を含むB型ナトリウム利尿ホルモン(BNP)分子群を含有する血液試料を、質量数の異なる前記各BNP分子の区別及び定量が可能な検出工程に供することによって、前記BNP分子群を検出し、
     前記BNP分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比を指標として、前記被験者における心筋虚血状態を評価する方法。
  2.  前記分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比は、
     前記BNP1-32分子の検出強度及び前記BNP3-32分子の検出強度の和と、前記BNP5-32分子の検出強度との比
    である、請求の範囲第1項に記載の方法。
  3.  前記分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比は、
     前記BNP3-32分子の検出強度と、前記BNP5-32分子の検出強度との比
    である、請求の範囲第1項に記載の方法。
  4.  前記分子群から選択される少なくとも1種の分子の検出強度と、前記分子群から選択される少なくとも1種の他の分子の検出強度との比は、
     前記BNP5-32分子より質量数が16Da大きい分子の検出強度と、前記BNP5-32分子の検出強度との比
    である、請求の範囲第1項に記載の方法。
  5.  前記血液試料は、BNP測定値が18~150pg/mlである被験者の血液検体そのもの又は血液検体から調製されたものである、請求の範囲第4項に記載の方法。
  6.  前記心筋虚血状態が、虚血性心疾患によるもの、又は冠動脈インターベンション後の再狭窄によるものである、請求の範囲第1項に記載の方法。
  7.  前記血液試料が、前記被験者の血液検体を、前記B型ナトリウム利尿ホルモン分子群に対する抗体を用いた免疫学的濃縮に供することによって調製されるものである、請求の範囲第1項に記載の方法。
     
PCT/JP2008/065444 2008-08-28 2008-08-28 血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法 WO2010023749A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/060,552 US9366680B2 (en) 2008-08-28 2008-08-28 Method for evaluating myocardial ischemic state using blood sample
JP2010526469A JP5550021B2 (ja) 2008-08-28 2008-08-28 血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法
EP08809519.5A EP2322935B1 (en) 2008-08-28 2008-08-28 Method for evaluating myocardial ischemic state using blood sample
PCT/JP2008/065444 WO2010023749A1 (ja) 2008-08-28 2008-08-28 血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2008/065444 WO2010023749A1 (ja) 2008-08-28 2008-08-28 血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010023749A1 true WO2010023749A1 (ja) 2010-03-04

Family

ID=41720938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2008/065444 WO2010023749A1 (ja) 2008-08-28 2008-08-28 血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9366680B2 (ja)
EP (1) EP2322935B1 (ja)
JP (1) JP5550021B2 (ja)
WO (1) WO2010023749A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014091719A (ja) * 2012-11-05 2014-05-19 Tosoh Corp ヒトb型ナトリウム利尿ペプチドの3−32位に相当するポリペプチドに対する特異抗体およびそれを用いた測定法
JP2015137272A (ja) * 2014-01-24 2015-07-30 東ソー株式会社 新規のペプチド及び疾患の検出方法
WO2018074533A1 (ja) 2016-10-18 2018-04-26 積水メディカル株式会社 抗ヒトbnp断片(4-32)抗体を用いた免疫測定方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004520598A (ja) * 2001-05-04 2004-07-08 バイオサイト インコーポレイテッド 急性冠状動脈症候群の診断マーカーおよびその使用方法
JP2006514609A (ja) * 2002-08-07 2006-05-11 バイオ−ラド パストゥール 心不全を診断するための特異性抗体
JP2006527190A (ja) 2003-04-17 2006-11-30 サイファージェン バイオシステムズ インコーポレイテッド ナトリウム利尿ペプチドに関連したポリペプチド、並びにこれらの同定および使用法
JP2007510146A (ja) * 2003-11-03 2007-04-19 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー マーカーの組合せによる急性心筋虚血性疾患の診断
JP2007322187A (ja) 2006-05-31 2007-12-13 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 再狭窄の発症リスクを判定する方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7524635B2 (en) * 2003-04-17 2009-04-28 Biosite Incorporated Methods and compositions for measuring natriuretic peptides and uses thereof
CA2598582A1 (en) * 2005-02-17 2006-08-24 Georg Hess Use of nt-proanp/nt-probnp ratio for diagnosing cardiac dysfunctions

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004520598A (ja) * 2001-05-04 2004-07-08 バイオサイト インコーポレイテッド 急性冠状動脈症候群の診断マーカーおよびその使用方法
JP2006514609A (ja) * 2002-08-07 2006-05-11 バイオ−ラド パストゥール 心不全を診断するための特異性抗体
JP2006527190A (ja) 2003-04-17 2006-11-30 サイファージェン バイオシステムズ インコーポレイテッド ナトリウム利尿ペプチドに関連したポリペプチド、並びにこれらの同定および使用法
US7341838B2 (en) 2003-04-17 2008-03-11 Biosite Incorporated Polypeptides related to natriuretic peptides and methods of their identification and use
JP2007510146A (ja) * 2003-11-03 2007-04-19 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー マーカーの組合せによる急性心筋虚血性疾患の診断
JP2007322187A (ja) 2006-05-31 2007-12-13 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd 再狭窄の発症リスクを判定する方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2322935A4 *
YASUSHI SUZUKI ET AL.: "Na Rinyo Peptide ni yoru Kyoketsusei Shinshikkan no Kento", AKITA MEDICAL JOURNAL, vol. 51, no. 2, 31 July 2000 (2000-07-31), pages 85 - 90, XP008144522 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014091719A (ja) * 2012-11-05 2014-05-19 Tosoh Corp ヒトb型ナトリウム利尿ペプチドの3−32位に相当するポリペプチドに対する特異抗体およびそれを用いた測定法
JP2015137272A (ja) * 2014-01-24 2015-07-30 東ソー株式会社 新規のペプチド及び疾患の検出方法
WO2018074533A1 (ja) 2016-10-18 2018-04-26 積水メディカル株式会社 抗ヒトbnp断片(4-32)抗体を用いた免疫測定方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP5550021B2 (ja) 2014-07-16
EP2322935A4 (en) 2011-12-28
US9366680B2 (en) 2016-06-14
EP2322935A1 (en) 2011-05-18
EP2322935B1 (en) 2016-04-13
US20110151583A1 (en) 2011-06-23
JPWO2010023749A1 (ja) 2012-01-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101194167A (zh) NT-proANP和NT-proBNP用于诊断心脏病的用途
JP2013515272A (ja) 上皮成長因子受容体(egfregfr)タンパク質srm/mrmアッセイ
JP2011530705A (ja) 肺塞栓症のためのDダイマー、トロポニン、NT−proBNP
US20220196678A1 (en) Method for the diagnosis of macce in patients who underwent gastrointestinal surgery
EP2333552B1 (en) Novel biomarkers for nonalcoholic fatty liver disease and methods for detecting nonalcoholic fatty liver disease using biomarker
KR20080066664A (ko) 방광암 진단용 폴리펩티드 마커
JP2013534315A (ja) c−Src選択反応モニタリングアッセイ
JP2007510146A (ja) マーカーの組合せによる急性心筋虚血性疾患の診断
JP5550021B2 (ja) 血液試料を用いて心筋虚血状態を評価する方法
JP2021536566A (ja) 心房細動の判定および脳卒中の予測のための循環fgfbp−1(線維芽細胞成長因子結合タンパク質1)
Ahmed et al. The additive value of copeptin for early diagnosis and prognosis of acute coronary syndromes
KR20200087799A (ko) 뇌졸중의 예측을 위한 순환하는 안지오포이에틴-2(Ang-2)와 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 7(IGFBP7)
JP6727660B2 (ja) 糖尿病性腎症の判定マーカー
JP5120843B2 (ja) 自己免疫性膵炎の検査方法及び検査試薬
JP7062063B2 (ja) 前立腺がんに特異的な糖鎖、及びこれを用いた検査方法
WO2016127278A1 (zh) 尿液补体c3蛋白的应用
Dupuy et al. Analytical assessment and performance of the 0/3h algorithm with novel high sensitivity cardiac troponin I
US20220196681A1 (en) Arteriosclerosis and arteriosclerosis-related disease marker
JP2002526764A (ja) 虚血状態の迅速鑑定のための検査およびキット
JP6555711B2 (ja) 非解離性大動脈瘤の疾患活動性の判定方法
WO2022091793A1 (ja) 糞便由来タンパク質を用いた膵臓がんバイオマーカーの開発
EP3699596A1 (en) Method for the diagnosis of macce in patients who underwent gastrointestinal surgery
JP6755649B2 (ja) 虚血性疾患の診断マーカー
AU2006319138B2 (en) Polypeptide marker for the diagnosis and evaluation of vascular diseases
JP2022068788A (ja) 軽度認知障害における酸化ストレスの評価

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08809519

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010526469

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13060552

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008809519

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE