KR20080066664A

KR20080066664A - 방광암 진단용 폴리펩티드 마커

Info

Publication number: KR20080066664A
Application number: KR20087007204A
Authority: KR
Inventors: 하랄드 미샤크; 슈테판 비트케
Original assignee: 모자이크 다이아그노스틱스 앤드 쎄라퓨틱스 아게
Priority date: 2005-08-26
Filing date: 2006-08-28
Publication date: 2008-07-16
Also published as: US20150122650A1; CN101248354A; EP2333550A2; AU2006283851A1; RU2008111496A; WO2007023191A2; MX2008002602A; EP2333550A3; JP2009506310A; AU2006283851B2; CA2621159A1; US20100047840A1; WO2007023191A3; BRPI0615393A2; EP1757939A1; EP1917531A2

Abstract

본 발명은 시료에서 분자 질량 및 이동시간(CE 시간)에 의해 특정된, 마커 1 내지 836으로부터 선택된 6개 이상의 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭을 결정하는 단계를 포함하는, 방광암(BC)을 진단하고 및/또는 방광암의 종양 단계를 결정하는 방법에 관한 것이다.

방광암, 폴리펩티드 마커, 종양 단계

Description

방광암 진단용 폴리펩티드 마커{Polypeptide marker for the diagnosis of bladder cancer}

본 발명은 방광암의 (감별) 진단을 위한, 개체로부터 유래된 시료에서 하나 이상의 펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭(amplitude)의 이용 및 상기 펩티드 마커 또는 마커들의 존재 또는 부재 또는 진폭이 방광암의 존재 및 종양 단계를 나타내는 것인 방광암의 진단 방법에 관한 것이다.

방광암은 방광의 점막 상에 존재하는 악성 종양이다. 방광암은 가장 흔한 악성 질환들 중 하나이다. 비뇨기학 분야에서, 방광암은 전립선암에 이어 둘째로 가장 빈번한 암 질환이다. 독어권에서는, 매년 100,000명당 22명의 발생이 있다. 남성의 경우, 방광암은 여성보다 약 2배 내지 3배 빈번하게 발생한다. 매년, 독일연방공화국에서 약 13,000 명의 남성과 5,000명의 여성이 방광암에 걸리는 것으로 추정된다. 방광암은 고연령층(advanced age)의 질환이다. 방광암 위험은 연령이 증가하면서 40세부터 증가한다.

방광암의 진단:

방광암의 경우 진정한 초기 검출은 존재하지 않는다. 소변 내 혈액이 존재하거나 또는 배뇨에 문제가 있는 경우, 신속하게 의사와 상담할 것이 강하게 권고 된다. 가능하게는, 방광암은 그에 의해 보다 조기에 검출될 수 있다. 방광에 종양(neoplasm)의 의심이 있는 경우, 예를 들면, 소변에서 혈액이 관찰되거나, 지속적인 방광 자극의 증상이 있는 경우, 방광경검사가 실시된다. 검사자가 방광벽에서 종양을 발견하는 경우, 그들은 어느 벽의 층이 종양에 의해 침투되는지를 추정할 수 있고, 그들은 시료를 채취하여 육안으로 검사한다. 종양 성장에 따라, 표재성 암종(superficial carcinoma)와 침윤성(조직-침입성) 암종 간의 구별이 이루어진다. 후자는 이미 방광의 근육 내로 증식되었고, 인접 기관(예를 들면, 남성의 경우 전립선, 또는 여성의 경우 자궁)으로 확산될 수 있다. 점막 종양의 조직학적-병리적 분류는 TNM 시스템에 따라 이루어진다.

표재성 암종 (superficial carcinoma):

pTa = 점막(요로상피)의 비-침습성(non-invasive) 유두암종

pTcis = 상피내암종(carcinoma in situ)

pT1 = 점막 하부(상피하 결합 조직)로의 침윤, 세분류(subclassification) pT1a-c

침윤성 암종 (infiltrating carcinomas):

pT2 = 근육층(고유근(muscularis propria))의 침윤, 세분류 pT2a-b

pT3 = 근육층을 넘어선 증식, 세분류 pT3a-b

pT4 = 전립선, 자궁, 질, 골반벽과 같은 인접 기관의 침윤

또한, 전체 요로의 방사선학적 검사(요로조영술)가 실시될 수 있다. 보충적으로, 현미경 하에서 소변에 악성 세포의 존재 여부를 검사한다. 단계들로의 분류 를 위해, 초음파검사, CT(computer tomography), 또는 MRT(magnetic resonance tomography)와 같은 추가적인 진단 방법들이 이용된다. 복부의 초음파 검사에 의해, 종양의 위치 및 크기가 파악될 수 있다. 또한, 그와 같은 검사는 소변의 축적 여부에 대해 신장을 조사하기 위해 이용되고, 림프절 및 간이 전이에 대해 조사된다.

전술된 바와 같이, 방광암의 실질적인 조기 검진은 없다. 현재까지, 명확한 진단은 방광경검사 및 조직 생검과 같은 침습성 개입(invasive intervention)과 연관되었다. 따라서, 침습성을 최소화하고, 신속하며 저-비용인 방광암의 진단 방법 및 상기 종양의 단계를 결정하는 방법을 제공하는 것이 목적이었다.

Vlahou 등은 American Journal of Pathology 158 (2001), 1491-1501에서 SELDI를 이용한, "이행세포암종(transitional cell carcinom)"(TCC)을 갖는 환자로부터 유래된 소변 시료의 분석을 개시한다. SELDI 기술의 낮은 분해능 때문에, 소수의 마커들만이 그에 의해 동시에(in parallel) 검출될 수 있다. 이는 진단의 낮은 선택성 및 특이성을 초래하고, 이는 맹검 테스트에서 검증될 수 없었다.

W. Liu 등은 European Urology 47 (2005), 456-462에서 또한 소변 시료의 SELDI 분석을 개시한다. 발견된 적은 수의 마커들은 분석의 열등한 특이성을 제공한다.

Vlahou 등 및 Liu 등에 의해 이용된 동일한 기술에도 불구하고, 상기 두 연구에서 상이한 마커들이 발견되었고, 이는 상기 방법의 타당성 부재를 확인시킨다. 또한, 마커에 대해 제시된 질량값(mass value)은 너무 부정확해서 상응하는 측정값 들은 재현가능하지 않거나, 또는 질량이 개별적인 물질에 명확하게 지정될 수 없다.

본 발명의 목적은 선행 기술의 전술된 단점들을 극복하고, 특히, 개별적인 펩티드에 명확하게 지정될 수 있고 방광암의 진단 및/또는 종양 단계의 결정에 적합한 폴리펩티드 마커를 정의하는 것이었다.

놀랍게도, 개체로부터 유래된 시료의 특정한 펩티드 마커는 방광암의 진단 및 방광암종의 종양 단계를 평가하기 위해 이용될 수 있다는 것이 발견되었다.

결론적으로, 본 발명은 방광암의 진단을 위한, 개체로부터 유래된 시료에서 표 1에 기재된 바와 같은 분자 질량(molecular mass) 및 이동 시간(migration time)으로 특정된 폴리펩티드 마커 번호 1 내지 836번으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭의 이용에 관한 것이다.

표 1: 방광암의 진단용 폴리펩티드 마커 및 그들의 분자 질량 및 이동 시간(CE 시간):

본 발명으로, 매우 초기 단계에서 방광암을 진단하는 것이 가능하다. 따라서, 상기 질환은 초기 단계에 공지된 방법에 의해 치료될 수 있다. 본 발명은 또한 부분적으로 비-침습성(non-invasive) 또는 최소 침습성(minimal-invasive) 시술로 방광암의 값싸고, 신속하고 신뢰할만한 진단을 가능하게 한다.

이동 시간(migration time)은 예를 들면, 실시예의 항목 2에 설명된 모세관 전기영동 (CE)에 의해 측정된다. 이 실시예에서, 길이 90 cm 및 내경(ID) 50㎛ 및 외경(OD) 360㎛을 갖는 유리 모세관이 30　kV의 적용 전압에서 작동된다. 이동 용매(mobile solvent)로서, 예를 들면, 물 중의 30% 메탄올, 0.5% 포름산이 이용된다.

CE 이동 시간은 변할 수 있다는 것이 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 폴리펩티드 마커가 용출되는 순서는 임의의 CE 시스템에 대해 정해진 조건 하에서 일반적으로 동일하다. 그럼에도 불구하고 일어날 수 있는 이동 시간의 차이를 보정하기 위해, 시스템은 이동 시간이 정확히 알려진 표준 물질을 이용하여 정규화될 수 있다. 표준물질은 예를 들면, 실시예에서 언급된 폴리펩티드일 수 있다 (실시예의 항목 3 참조).

표 1 내지 8에 기재된 폴리펩티드의 특징은 예를 들면, Neuhoff 등 (Rapid Communications in mass spectrometry, Vol. 20: 149-156, 2004)에 상세히 기재된 방법인 모세관 전기영동-질량 분석법(CE-MS)을 통해 측정되었다. 보정(calibration)이 정확한 경우, 개별적인 측정값들 또는 상이한 질량 분석기들 간의 분자 질량의 변이는 비교적 작으며, 일반적으로 ±0.1%의 범위, 바람직하게는 ±0.05%의 범위, 보다 바람직하게는 ±0.03%의 범위 내이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드 마커는 단백질 또는 펩티드 또는 단백질 또는 펩티드의 분해 산물이다. 이는 예를 들면, 글리코실화, 인산화, 알킬화 또는 이황화 브리지와 같은 번역후 변형에 의해, 또는 예를 들면, 분해 범위 내의 기타 반응에 의해 화학적으로 변형될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 마커는 화학적으로 변화되며, 예를 들면, 시료의 정제 동안 산화될 수 있다.

폴리펩티드 마커를 측정하는 파라미터(분자량 및 이동 시간)로부터 나아가서, 당업계에 공지된 방법에 의해 해당하는 폴리펩티드의 서열을 동정하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 폴리펩티드 (표 1 내지 8 참조)는 한편으로는, 방광암을 진단하기 위해 이용되고, 또 다른 한편으로는 상이한 종양 단계들 간을 구별을 가능하게 하기 위해 이용된다. "진단"은 질환 또는 손상에 증상 또는 현상을 지정하는 것에 의해 지식을 습득하는 과정을 의미한다. 현재의 경우에, 방광암의 존재 및 방광 암종(bladder carcinoma)의 종양 단계는 특정 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭(amplitude)으로부터 결정된다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 마커는 개체로부터 유래된 시료에서 결정되며, 빈도 마커(frequency marker)의 경우 이의 존재 또는 부재는 방광암의 존재 여부를 결론지을 수 있게 하고, 진폭 마커(amplitude marker)의 경우 신호 강도의 차이가 방광암의 존재 여부를 결론지을 수 있게 한다. 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭은 선행 기술에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 이용될 수 있는 방법이 하기에 예시된다.

폴리펩티드 마커는 그의 측정된 값이 적어도 그의 역치(threshold value) 이상이면 존재하는 것으로 고려된다. 상기 측정값이 더 낮으면, 상기 폴리펩티드 마커는 존재하지 않는 것으로 고려된다. 역치는 측정 방법의 감도(검출한계)에 의해 결정되거나 또는 실험적으로 정의될 수 있다.

본 발명에서, 역치는 바람직하게는 특정 분자질량에 대한 시료의 측정값이 블랭크 시료 (예를 들면, 단지 완충액 또는 용매)의 것보다 2배 이상 높으면 초과되는 것으로 고려된다.

폴리펩티드 마커(들)은 그의/그들의 존재 또는 부재가 측정되는 방식으로 이용되며, 그 존재 또는 부재가 방광암을 표시한다(빈도 마커). 그리하여, 폴리펩티드 마커 번호 1 내지 44와 같이 방광암을 갖는 환자에 전형적으로 존재하나, 방광암이 없는 개체(대조군)에는 존재하지 않거나 또는 거의 존재하지 않는 폴리펩티드 마커가 있다. 또한, 방광암이 없는 개체(대조군)에는 존재하나, 방광암을 갖는 대상에는 덜 빈번하게 존재하거나 또는 전혀 존재하지 않는 폴리펩티드 마커, 예를 들면, 마커 번호 45 내지 149가 있다(표 2).

빈도 마커는 일부 시료에서 진폭이 낮은 것인 진폭 마커의 변이체이다. 그와 같은 빈도 마커를 상기 마커가 검출되지 않는 상응하는 시료를 검출 한계의 수준인, 매우 작은 진폭으로 진폭의 계산에 포함시키는 것에 의해 진폭 마커로 전환시키는 것이 가능하다.

표 2: 방광암 진단용 폴리펩티드 마커(빈도 마커), 그들의 분자 질량 및 이동 시간 및 하나의 인자인 방광암(BC)을 앓는 환자군 및 대조군에서 그들의 존재 및 부재(발생빈도)(1 = 100%, 0 = 0%; 실시예에 기재된 바와 같은 시료 처리 및 측정).

마커 1-146의 이용이 특히 바람직하다.

빈도 마커(존재 또는 부재의 결정)에 더하여, 또는 대안적으로, 표 3 및 4에 기재된 바와 같은 진폭 마커가 방광암의 진단을 위해 이용될 수 있다(마커 번호 150 내지 836). 진폭 마커는 존재 또는 부재가 중요하지 않으나, 신호의 높이(진폭)가 양 그룹에서 신호의 존재 여부를 결정하는 방식으로 이용된다. 표 3 및 4에서, 측정된 모든 시료에 대해 평균된 상응하는 신호들(질량 및 이동 시간에 의해 특정됨)의 평균 정규화된 진폭(mean normalized amplitude)이 기재된다. 상이하게 농축된 시료 또는 상이한 측정 방법 간에 비교를 가능하게 하기 위해 두 가지 정규화 방법이 이용될 수 있다.

제1 접근방식에서, 시료의 모든 펩티드 신호가 1백만 카운트의 총 진폭으로 정규화된다. 따라서, 개별 마커의 개별적인 평균 진폭은 ppm(parts per million)으로 표현된다. 이 방법에 의해 수득된 진폭 마커가 표 3에 표시된다(마커 번호 150 내지 185).

또한, 대안적인 정규화 방법에 의해 추가적인 진폭 마커를 정의하는 것이 가능하다. 이 경우, 하나의 시료의 모든 펩티드 신호는 공통의 정규화 인자(common normalization factor)로 표시된다(scale). 따라서, 개별 시료의 펩티드 진폭과 모든 공지된 폴리펩티드의 기준값(reference value) 간에 선형 회귀가 형성된다. 회귀선(regression line)의 기울기는 상대적 농도에 해당하며 이 시료를 위한 정규화 인자로 이용된다. 이 정규화 방법에 의해 수득된 바이오마커가 표 4에 표시된다(마커 번호 186 내지 836).

마커 150-185의 이용이 특히 바람직하다.

이용된 모든 군은 신뢰가능한 평균 진폭을 수득하기 위해 40명 이상의 개별 환자로 구성되거나 또는 대조구 시료로 구성된다. 진단의 결정(방광암의 존재 또는 부재)은 환자 시료에서 개별적인 폴리펩티드 마커의 진폭이 대조군 또는 방광암 군에서의 평균 진폭과 비교하여 얼마나 높은지의 함수로서 이루어진다. 진폭이 방광암군의 평균 진폭에 해당하는 경우, 방광암의 존재가 고려되며, 진폭이 오히려 대조군의 평균 진폭에 해당하는 경우, 방광암의 부재가 고려된다. 측정된 값과 평균 진폭 간의 거리는 시료가 특정 군에 속할 확률로 고려될 수 있다.

접근방식 1에 따른 절차에 대한 보다 정확한 정의는 마커 번호 162에 의해 제시될 것이다(표 3). 마커의 평균 진폭은 방광암에서 유의성 있게 증가되었다(대조군의 1431　ppm 대비, 6370 ppm). 환자 시료에서 이 마커에 대한 값이 0 내지 1431 ppm이거나 또는 이 범위를 최대 20%까지 초과하면, 즉, 0 내지 1717 ppm이면, 이 시료는 대조군에 속한다. 그 값이 6370　ppm이거나, 최대 20% 더 낮거나 또는 높으면, 즉, 5096과 매우 높은 값의 사이이면, 방광암의 존재가 고려되어야 한다.

접근방식 2의 경우, 절차의 예시적 설명이 마커 번호 192에 의해 주어질 수 있다(표 4). 상기 마커의 평균 진폭은 방광암에서 유의성 있게 증가되었다(대조군의 44.29 카운트 대비 374.91 카운트). 이 마커에 대한 값이 환자로부터 유래된 시료에서 0 내지 44.29 카운트이거나, 또는 이 범위를 최대 20%까지 초과하면, 즉, 0 내지 53.15 카운트이면, 이 시료는 대조군 시료에 속한다. 그 값이 374.91 카운트이거나, 최대 20% 더 낮거나 또는 높으면, 즉, 300 카운트와 매우 높은 값의 사이이면, 방광암의 존재가 고려되어야 한다. 대안적으로, 측정값과 평균 진폭 간의 거리는 시료가 특정 군에 속할 확률로 고려될 수 있다.

표 3. ppm 정규화로부터의 진폭 마커(접근방식 1)

표 4. 정규화 인자에 의한 정규화로부터의 진폭 마커(접근방식 2)

폴리펩티드 마커는 또한 종양 단계를 결정하기 위해 적합하다. BC를 갖지 않는 환자와 표재성 BC를 갖는 환자 간의 감별 진단(differential diagnosis)을 위해, 표 5에 따른 빈도 및 표 6에 따른 진폭이 적합하다.

표 5: 표재성 BC와 BC를 갖지 않는 환자 간의 구별을 위한 빈도 마커

표 6: 표재성 BC와 BC를 갖지 않는 환자 간의 구별을 위한 진폭 마커

또한, 감별 진단에 의해 침윤성 BC를 인식하는 것이 가능하다. BC를 갖지 않는 환자와 침윤성 BC를 갖는 환자들 간의 감별 진단을 위해, 표 7에 따른 빈도 및 표 8에 다른 진폭이 적합하다.

표 7: 침윤성 BC와 BC를 갖지 않는 환자들 간의 구별을 위한 빈도 마커

표 8: 침윤성 BC와 BC를 갖지 않는 환자들 간의 구별을 위한 진폭 마커

본 발명에 따른 마커는 또한 개별적인 단계 pTa와 pT4의 감별 진단을 위해 이용될 수 있다.

하나 이상의 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭이 결정되는 개체는 방광암을 앓을 수 있는 임의의 개체, 예를 들면, 동물 또는 인간이다. 바람직하게는, 상기 개체는 포유동물이고, 가장 바람직하게는 인간이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 하나의 폴리펩티드 마커 뿐 아니라, 마커의 조합이 방광암을 진단하기 위해 이용될 수 있고, 방광암의 존재는 진폭의 존재 또는 부재 및/또는 진폭의 높이로부터 결론지을 수 있다. 복수 개의 폴리펩티드 마커를 비교하는 것에 의해, 환자인 개체 또는 대조군 개체에서의 전형적인 존재 확률로부터의 일부 개별적인 편차에 의해 초래되는 전체 결과에서의 치우침(bias)이 감소되거나 방지될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드 마커 또는 마커들의 존재 또는 부재가 측정되는 시료는 개체의 신체로부터 수득되는 임의의 시료일 수 있다. 상기 시료는 개체의 상태 (방광암의 존재 또는 부재)에 관한 정보를 제공하기에 적합한 폴리펩티드 조성을 갖는 시료이다. 예를 들면, 이는 혈액, 소변, 윤활액, 조직액, 신체 분비물, 땀, 뇌척수액, 림프, 장액, 위액 또는 췌장액, 담즙, 눈물, 조직 시료, 정자, 질액 또는 대변 시료일 수 있다. 바람직하게는, 이는 액체 시료이다.

바람직한 구현예에서, 상기 시료는 소변 시료 또는 혈액 시료이다.

바람직한 구현예에서, 상기 시료는 소변 시료 또는 혈액 시료이고, 상기 혈액 시료는 (혈액) 혈청 또는 (혈액) 혈장 시료이다.

소변 시료는 선행 기술에서 채택된 바와 같이 채취할 수 있다. 바람직하게는, 중류 소변 시료(midstream urine sample)가 본 발명에서 소변 시료로서 이용된다. 예를 들면, 소변 시료는 카테터 또는 WO 01/74275에 기재된 배뇨 장치를 통해 채취할 수 있다.

혈액 시료는 예를 들면 정맥, 동맥 또는 모세관으로부터 선행 기술에 공지된 방법에 의해 취할 수 있다. 통상적으로, 혈액 시료는 주사기를 통해 예를 들면, 대상의 팔로부터, 정맥 혈액을 채취하여 수득된다. 용어 "혈액 시료"는 (혈액) 혈장 또는 (혈액) 혈청과 같은, 추가의 정제 및 분리 방법에 의해 혈액으로부터 수득된 시료를 포함한다.

시료 중에 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재는 폴리펩티드 마커를 측정하는데 적합한 선행 기술에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 그와 같은 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 원칙적으로, 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재는 질량 분석법과 같은 직접적인 방법, 또는 예를 들면, 리간드를 통한 간접적인 방법에 의해 측정될 수 있다.

필요하거나 또는 바람직한 경우에, 개체로부터 유래된 시료, 예를 들면, 소변 또는 혈액 시료는 임의의 적합한 수단에 의해 전처리될 수 있으며, 예를 들면, 폴리펩티드 마커(들)의 존재 또는 부재가 측정되기 전에 정제 또는 분리될 수 있다. 상기 처리는 예를 들면, 정제, 분리, 희석 또는 농축을 포함할 수 있다. 상기 방법은 예를 들면, 원심분리, 여과, 한외여과, 투석, 침전 또는 친화성 분리 또는 이온교환 크로마토그래피를 통한 분리와 같은 크로마토그래피 방법, 전기영동 분리일 수 있다. 이들의 특정 예는 겔 전기영동, 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (2D-PAGE), 모세관 전기영동, 금속 친화성 크로마토그래피, 고정화된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC), 렉틴 기재 친화성 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 정상 및 역상 HPLC, 양이온 교환 크로마토그래피 및 표면에 대한 선택적인 결합이다. 모든 이와 같은 방법은 당업자에게 알려져 있으며, 당업자는 이용되는 시료 및 폴리펩티드(들)의 존재 또는 부재를 측정하는 방법에 따라 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 측정되기 전에, 시료는 모세관 전기영동에 의해 분리되고, 초원심분리에 의해 정제되고 및/또는 한외여과에 의해 특정 분자 크기의 폴리펩티드 마커를 포함하는 분획으로 분리된다.

바람직하게는, 질량-분광분석법이 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 이용되는데, 이때, 시료의 정제 또는 분리는 그와 같은 방법으로부터의 상류에 수행될 수 있다. 현재로 이용되는 방법과 비교하여, 질량 분광분석은 시료의 많은 (100 이상) 폴리펩티드의 농도가 단일 분석에 의해 측정될 수 있는 이점을 가진다. 임의의 유형의 질량 분석기가 이용될 수 있다. 질량 분석법을 통해, 복잡한 혼합물에서 약 ±0.01%의 측정 정확도로 통상적으로 10　fmol의 폴리펩티드 마커, 즉, 10　kD 단백질의 0.1ng을 측정하는 것이 가능하다. 질량 분석기에서, 이온 형성 유닛은 적당한 분석 장치와 커플링된다. 예를 들면, 전기분무-이온화법(ESI: Electrospray-ionization) 인터페이스는 액체 시료 중의 이온을 측정하기 위해 주로 이용되는 반면, MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)는 매트릭스에 의해 결정화된 시료로부터 이온을 측정하기 위해 이용된다. 형성된 이온을 측정하기 위해, 사중극자(quadropole), 이온 트랩 또는 TOF(time-to-flight) 분석기가 이용될 수 있다.

ESI에서, 용액에 존재하는 분자는 특히 고전압(예를 들면, 1-8　kV)의 영향하에 원자화되며, 이는 용매의 증발로부터 더 작게 되는 하전된 액적을 형성한다. 최종적으로, 소위 쿨롱 폭발(Coulomb explosion)은 분석되고 검출될 수 있는 유리 이온의 형성을 유발한다.

TOF에 의한 이온의 분석에서, 이온에 동일한 양의 운동에너지를 부여하는 특정 가속 전압이 인가된다. 그 후에, 각각의 이온이 플라잉 튜브(flying tube)를 통해 특정 표류 거리를 여행하는데 걸리는 시간이 매우 정확하게 측정된다. 동일한 양의 운동 에너지에 대해, 이온의 속도는 그 질량에 의존하기 때문에, 따라서, 후자가 결정될 수 있다. TOF 분석기는 매우 높은 스캐닝 속도를 가지므로, 양호한 분해능에 이른다.

폴리펩티드 마커의 존재 및 부재의 측정에 대한 바람직한 방법은 기체상 이온 분광분석법, 예를 들면, 레이저 탈착/이온화 질량 분석법, MALDI-TOF MS (매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석법), SELDI-TOF MS(Surface-enhanced laser desorption/ionization), LC/MS, 2D-PAGE/MS 및 모세관 전기영동-질량 분석법 (CE-MS)을 포함한다. 모든 전술된 방법들은 당업자에게 알려져 있다.

특히 바람직한 방법은 모세관 전기영동이 질량 분석법과 커플링되는 CE-MS이다. 상기 방법은 예를 들면, 독일특허출원 DE 10021737, Kaiser 등 (J Chromatogr A, Vol. 1013: 157-171, 2003, and Electrophoresis, 25: 2044-2055, 2004) 및 Wittke 등 (Journal of Chromatography A, 1013: 173-181, 2003)에 상세히 기재된다. CE-MS 기술은 적은 부피에서 짧은 시간에 고감도로 수백개의 폴리펩티드 마커의 존재를 동시에 측정하게 한다. 시료가 측정된 후에, 측정된 폴리펩티드 마커의 패턴이 제조된다. 상기 패턴은 환자 또는 건강한 사람의 기준(reference) 패턴과 비교될 수 있다. 대부분의 경우에, 방광암의 진단 및 방광암의 상이한 단계 간의 감별 진단을 위해 하나 또는 제한된 수의 폴리펩티드 마커, 예를 들면, 6, 8, 10, 20, 50 또는 100개 이상의 마커를 사용하는 것으로 충분하다.

ESI-TOF MS 장치에 온라인으로 커플링된 CE를 포함하는 CE-MS 방법이 또한 바람직하다.

CE-MS의 경우, 휘발성 용매의 이용이 바람직하며, 본질적으로 염이 없는 조건하에 작업하는 것이 가장 좋다. 상기 용매의 예는 아세토니트릴, 메탄올 등을 포함한다. 상기 용매는 분석물, 바람직하게는 폴리펩티드를 양성자화하기 위해 물로 희석되거나 또는 약산 (예를 들면, 0.1% 내지 1% 포름산)과 혼합될 수 있다.

모세관 전기영동을 통해, 전하 및 크기에 의해 분자를 분리하는 것이 가능하다. 중성 입자는 전류의 인가시 전기 삼투 유동의 속도로 이동하는 반면, 양이온은 음극 쪽으로 가속되며, 음이온은 지연된다. 전기영동에서 모세관의 이점은 표면 대 부피의 바람직한 비율에 존재하며, 이는 전류 흐름 동안 생성된 Joule 열의 양호한 분산을 가능하게 한다. 이는 차례로 고전압 (통상적으로 30 kV 이하)이 인가되게 하므로, 고 분리능 및 짧은 분석 시간을 가능하게 한다.

모세관 전기영동에서, 50-75㎛의 내경을 갖는 모세관이 통상적으로 이용된다. 이용되는 길이는 예를 들면, 30-100　cm 이다. 또한, 모세관은 통상적으로 플라스틱 코팅된 실리카 유리로 제조된다. 모세관은 미처리되거나, 즉, 그 내부 표면상에 소수성 작용기를 노출시키거나, 또는 내부 표면상에 코팅될 수 있다. 소수성 코팅(코팅: 예를 들면, 실리카의 음전하로 극성화된 표면을 은폐하는 방법)이 분해능을 개선하기 위해 이용될 수 있다. 전압 외에, 압력이 또한 인가될 수 있는데, 이는 전형적으로 0 내지 1 psi의 범위 내이다. 압력은 또한 수행 동안에만 적용되거나 또는 수행 동안 변경될 수 있다.

폴리펩티드 마커를 측정하는 바람직한 방법에서, 시료의 마커는 모세관 전기영동에 의해 분리되고, 그 후, 직접 이온화되고, 검출을 위해 그에 결합된 질량 분석기로 온라인으로 전달된다.

본 발명에 따른 방법에서, 방광암의 진단을 위해 여러 개의 폴리펩티드 마커를 이용하는 것이 유리하다. 특히, 3개 이상의 폴리펩티드가 마커, 예를 들면, 마 커 1, 2 및 3; 마커 1, 2 및 4 등이 이용될 수 있다.

보다 바람직한 것은 4개, 5개, 또는 6개의 마커의 이용이다.

훨씬 더 바람직한 것은 15개 이상의 마커, 예를 들면, 마커 1 내지 15의 이용이다.

가장 바람직한 것은 표 1 또는 4에 열거된 모든 마커의 이용이다.

수 개의 마커를 이용할 때 방광암의 존재 확률을 측정하기 위해, 당업자에게 알려진 통계 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, S-Plus와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하는 Weissinger 등 (Kidney Int. 2004 Jim; 65(6): 2426-24; Random Forests method)이 개시한 Random Forest 방법 또는 동일한 문헌에 개시된 지지 벡터 기계(support vector machine)이 이용될 수 있다.

1. 시료 준비

방광암의 폴리펩티드 마커의 검출을 위해, 소변을 이용하였다. 소변을 건강한 공여자 (대조군)뿐만 아니라 방광암을 앓고 있는 환자로부터 채취하였다.

뒤이은 CE-MS 측정을 위해, 알부민 및 면역글로불린과 같은,보다 높은 농도로 환자의 소변에 포함된 단백질을 한외여과에 의해 분리해야 했다. 그리하여, 700 ㎕의 소변을 취하여, 700 ㎕의 여과 완충액(2M 우레아, 10 mM 암모이나, 0.02% SDS)과 혼합하였다. 상기 1.4　ml의 시료 부피를 한외여과하였다(20 kDa, Sartorius, Gottingen, Germany). 1.1 ml의 한외여과액이 수득될 때까지 원심분리기에서 3000　rpm에서 한외여과를 수행하였다.

수득된 1.1　ml의 여과액을 이어서 PD 10 컬럼(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden)에 적용하고 2.5 ml의 0.01% NH₄OH로 용출시키고, 동결건조시켰다. CE-MS 측정을 위해, 상기 폴리펩티드를 이어서 20 ㎕의 물 (HPLC 등급, Merck, Darmstadt, Germany)에 재현탁시켰다.

2. CE - MS 측정

CE-MS 측정을 Beckman Coulter 사의 모세관 전기영동 시스템 (P/ACE MDQ 시스템; Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) 및 Burker사의 ESI-TOF 질량 분석기 (micro-TOF MS, Burker Daltonik, Bremen, Germany)를 이용하여 수행하였다.

CE 모세관을 Beckman Coulter로부터 공급받았으며, 50/360　㎛의 ID/OD 및 90　cm의 길이를 가졌다. CE 분리의 이동상은 물 중의 20% 아세토니트릴 및 0.25% 포름산으로 구성되었다. MS 상에서 "덮개 유동(sheath flow)"를 위해, 30% 이소프로판올 및 0.5% 포름산을 2 ㎕/분의 유속으로 이용하였다. CE 및 MS의 커플링을 CE-ESI-MS Sprayer Kit(Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)에 의해 구현하였다.

시료를 주입하기 위해, 1　내지 최대 6 psi의 압력을 가하고, 주입의 지속은 99초였다. 이 파라미터로, 약 150 내지 900　nl의 시료를 모세관 내로 주입하였는데, 이는 모세관 부피의 약 10% 내지 50%에 해당한다. 스택킹(stacking) 기법을 이용하여 모세관에서 상기 시료를 농축하였다. 그리하여, 상기 시료를 주입하기 전에, 1M NH₃ 용액을 7초 (1 psi에서) 동안 주입하고, 상기 시료를 주입한 후에, 2M 포름산 용액을 5초 동안 주입하였다. 분리 전압 (30　kV)을 인가했을 때, 분석물이 상기 용액들 사이에 자동적으로 농축되었다.

뒤이은 CE 분리를 압력 방법을 이용하여 수행하였다: 0　psi에서 40 분에 이은, 0.1 psi 2분, 0.2 psi 2　분, 0.3　psi 2　분, 0.4　psi 2　분, 및 최종적으로 0.5　psi 32　분. 따라서, 분리 수행의 총 지속시간은 80 분이었다.

MS의 측면에 가능한 한 양호한 신호 강도를 수득하기 위해, 네뷸라이저 기체는 최저값에 설정하였다. 전기분무를 생성하기 위해 분무 바늘에 인가된 전압은 3700-4100　V였다. 질량 분석기에서 남은 세팅은 제조자의 프로토콜에 따라 펩티 드 검출을 위해 최적화되었다. 스펙트럼을 m/z 400 내지 m/z 3000의 질량 범위에 걸쳐 기록하고, 3초마다 누적시켰다.

3. CE 측정을 위한 표준물질

CE 측정을 확인하고 보정(calibrate)하기 위해, 선택된 조건하에서 표시된 CE 이동 시간을 특징으로 하는 하기 단백질 또는 폴리펩티드를 이용하였다:

단백질/폴리펩티드 이동 시간

아프로티닌 (SIGMA, Taufkirchen, DE, Cat. # AI 153) 9.2 분

리보뉴클레아제 (SIGMA, Taufkirchen, DE, Cat. # R4875) 10.9 분

리소자임 (SIGMA, Taufkirchen, DE, Cat. # L7651) 8.9 분

"REV", 서열: REVQSKIGYGRQIIS 15.6 분

"ELM", 서열: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR 23.4 분

"KINCON", 서열: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR 20.0 분

"GIVLY" 서열: GIVLYELMTGELPYSHIN 36.8 분

상기 단백질/폴리펩티드를 물 중에 각각 10　pmol/㎕의 농도로 이용하였다.

"REV", "ELM, "KINCON" 및 "GIVLY"는 합성 펩티드이다.

펩티드의 분자질량 및 MS에서 나타나는 개개의 전하 상태의 m/z 비는 하기의 표에 열거된다:

SEQUENCE LISTING <110> mosaiques diagnostics and therapeutics AG <120> Polypeptide markers for the diagnosis of bladder cancer <130> 061851wo <140> PCT/EP2006/06574214:40 09.01.2007 <141> 2006-08-28 <150> EP05107840.0 <151> 2005-08-26 <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Arg Glu Val Gln Ser Lys Ile Gly Tyr Gly Arg Gln Ile Ile Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Glu Leu Met Thr Gly Glu Leu Pro Tyr Ser His Ile Asn Asn Arg Asp 1 5 10 15 Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg 20 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Thr Gly Ser Leu Pro Tyr Ser His Ile Gly Ser Arg Asp Gln Ile Ile 1 5 10 15 Phe Met Val Gly Arg 20 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Glu Leu Pro Tyr Ser His 1 5 10 15 Ile Asn

Claims

시료에서 6개 이상의 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭(amplitude)을 결정하는 단계를 포함하는, 방광암(BC)을 진단하고 및/또는 방광암의 종양 단계를 결정하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드 마커는 분자 질량 및 이동 시간(CE 시간)에 대한 하기 값들에 의해 특정되는 마커 1 내지 836으로부터 선택되는 것인 방법:
제1항에 있어서, 결정된 마커 1 내지 149의 존재 또는 부재의 평가는 하기의 기준값(reference value)를 이용하는 것에 의해 이루어지는 것인 방법:
제1항에 있어서, 마커 150 내지 185의 진폭(amplitude)의 평가는 하기의 기준값을 이용하는 것에 의해 이루어지는 것인 방법:
제1항에 있어서, 마커 186 내지 836의 진폭의 평가는 하기의 기준값을 이용하는 것에 의해 이루어지는 것인 방법:
제1항 내지 제4항 중 하나 이상의 항에 있어서, 제1항에 정의된 바와 같은 10개, 또는 20개 또는 100개 이상 또는 모든 폴리펩티드 마커가 이용되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 개체로부터 유래되는 시료는 소변 시료 또는 혈액 시료(혈청 또는 혈장 시료)인 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 마커 또는 마커들의 존재 또는 부재 또는 진폭을 검출하기 위해 모세관 전기영동, HPLC, 기체상 이온 분광분석법(gas-phase ion spectrometry) 및/또는 질량 분광분석법이 이용되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 하나 이상의 항에 있어서, 모세관 전기영동은 상기 폴리펩티드 마커의 분자 질량이 측정되기 전에 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 폴리펩티드 마커 또는 마커들의 존재 또는 부재 또는 진폭을 검출하기 위해 질량 분광분석법이 이용되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 방법은 방광암의 진단을 위해 이용되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 방법은 방광암의 종양 단계를 결정하기 위해 이용되는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 하나 이상의 항에 있어서, 상기 방법은 방광암을 진단하고 동시에 방광암의 종양 단계를 결정하기 위해 이용되는 것인 방법.
방광암의 진단 및/또는 방광암의 종양 단계 결정을 위한, 제1항에 따른 분자 질량 및 이동 시간에 대한 값에 의해 특정된 마커 번호 1 내지 836으로부터 선택된 하나 이상의 펩티드 마커의 용도.
a) 시료를 3개 이상, 바람직하게는 10개의 서브 시료로 분리하는 단계;

b) 시료에서 제1항에 따른 분자 질량 및 이동 시간(CE 시간)에 의해 특정된, 마커 1 내지 836으로부터 선택된, 하나 이상의 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭을 결정하기 위해 2개 이상의 상기 서브 시료를 분석하는 단계를 포함하는, 방광암(BC)을 진단하는 방법.
a) 시료를 3개 이상, 바람직하게는 10개의 서브 시료로 분리하는 단계;

b) 시료에서 제1항에 따른 분자 질량 및 이동 시간(CE 시간)에 의해 특정된, 마커 1 내지 836으로부터 선택된, 하나 이상의 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재 또는 진폭을 결정하기 위해 2개 이상의 상기 서브 시료를 분석하는 단계를 포함하는, 방광암의 종양 단계를 결정하는 방법.
제14항 또는 제15항에 있어서, 10개 이상의 서브시료가 측정되는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 하나 이상에 있어서, 상기 CE 시간은 25 kV의 적용 전압 하에 길이 90 cm 및 내경(ID) 50　㎛의 유리 모세관을 기준으로 하며, 상기에서 물에 담긴 20% 아세토니트릴, 0.25% 포름산이 이동상으로 이용되는 것인 방법.
제1항에 따른 분자 질량 및 이동 시간(CE 시간)에 의해 특정된 마커 1 내지 836으로부터 선택된 10개 이상의 마커를 포함하는 마커의 조합.