BRPI0615393A2

BRPI0615393A2 - marcadores de peptìdio para diagnóstico de cáncer de bexiga

Info

Publication number: BRPI0615393A2
Application number: BRPI0615393-3A
Authority: BR
Inventors: Harald Mischak; Stefan Witke
Original assignee: Mosaiques Diagnostics & Therap
Priority date: 2005-08-26
Filing date: 2006-08-28
Publication date: 2011-05-17
Also published as: WO2007023191A2; US20150122650A1; EP2333550A2; EP1757939A1; AU2006283851A1; RU2008111496A; CA2621159A1; EP2333550A3; US20100047840A1; KR20080066664A; CN101248354A; AU2006283851B2; JP2009506310A; MX2008002602A; WO2007023191A3; EP1917531A2

Abstract

MARCADORES DE PEPTìDIO PARA DIAGNóSTICO DE CáNCER DE BEXIGA A presente invenção refere-se a um processo para diagnóstico de câncer de bexiga (BC) e/ou para determinação de um estágio de tumor de câncer de bexiga, que compreende a etapa da determinação de uma presença ou ausência ou amplitude de pelo menos seis marcadores de polipeptídio em uma amostra, sendo que os marcadores de polipeptídio são escolhidos dos marcadores 1a 836 e os marcadores de polipeptídio estão caracterizados por valores para as massas moleculares e o tempo de migração (tempo de CE).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MARCA-DORES DE PEPTÍDIO PARA DIAGNÓSTICO DE CÂNCER DE BEXI-GA".

A presente invenção refere-se ao uso da presença ou ausên-cia ou amplitude de um ou mais marcadores de peptídio em uma amostrade um indivíduo para o diagnóstico (diferencial) de câncer de bexiga, bemcomo a um processo para diagnóstico de câncer de bexiga, sendo que apresença ou ausência ou a amplitude do ou dos marcador(es) de peptídioé indicativa da existência, bem como do estágio do tumor de câncer dabexiga.

Câncer da bexiga é um tumor maligno na mucosa da bexiga.Câncer da bexiga é uma das doenças malignas mais freqüentes. Na áreaurológica, depois de câncer de próstata, ela é a segunda doença de câncermais freqüente. Na região de língua alemã, são atingidas cerca de 22 de100.000 pessoas por ano. Em homens, o câncer de bexiga ocorre com fre-qüência aproximadamente duas a três vezes maior do que em mulheres.Calcula-se que, anualmente, 13.000 homens e 5.000 mulheres adoecem naRepública Federal da Alemanha. Câncer de bexiga é uma doença da idademais avançada. O risco de adoecer aumenta com idade crescente, a partirdo 40° ano de vida.

Diagnóstico do Câncer de Bexiga:

Uma verdadeira identificação precoce não existe no câncer debexiga. No caso de sangue na urina ou problemas ao urinar, recomenda-se,urgentemente, procurar rapidamente um médico. Desse modo, o câncer debexiga possivelmente pode ser descoberto mais cedo. Existindo uma suspei-ta de um tumor na bexiga, por exemplo, se foi observado sangue na urina ouse houver sintomas continuados de uma irritação da bexiga, é realizada umatomada de imagem da bexiga, citoscopia. Se o examinador detectar um tu-mor na parede da bexiga, ele pode avaliar quais camadas de parede o tumorpenetra e também retirar amostras, que depois são examinadas microscopi-camente. Dependendo do crescimento do tumor, distinguem-se carcinomassuperficiais e infiltrantes (penetrados no tecido). Estes últimos já crescerampara dentro da musculatura da bexiga e podem propagar-se para os órgãosadjacentes (no homem, por exemplo, a próstata, na mulher, por exemplo, oútero). A classificação histopatológica dos tumores da mucosa dá-se de a -cordo com o sistema de TNM.

Carcinomas superficiais:

pTa = carcinoma papilar, não invasivo, da mucosa (urotel)

pTcis = carcinoma in situ

pT1 = crescimento (infiltração) para abaixo da mucosa (tecido conjuntivosubepitelial), subclassificação pT1a-c

Carcinomas infiltrantes:

pT2 = crescimento para dentro da camada muscular (Muscularis própria),subclassificação pT2a-b

pT3 = crescimento para além da camada muscular, subclassificaçãopT3a-b

pT4 = crescimento para dentro de órgãos adjacentes, tais como próstata,útero, vagina, parede da bacia

Adicionalmente, pode ser realizado um exame radiológico (u-rografia) de todo o trato urinário. Complementarmente, a urina é examina-da microscopicamente quanto a células malignas. Para classificação deestágio, são usados outros processos de diagnóstico, tal como ultra-som,CT (tomografia computadorizada) ou MRT (tomografia de ressonânciamagnética). Por um exame de ultra-som do abdome, podem ser determi-nados a posição e tamanho de um tumor. Além disso, com ajuda domesmo, os rins são examinados quanto a uma retenção de urina e os nó-dulos linfáticos, bem como o fígado, são examinados quanto à presençade metástases.<table>table see original document page 4</column></row><table><table>table see original document page 5</column></row><table><table>table see original document page 6</column></row><table>

Tradução: Número Massa Tempo de CE

Com a presente invenção é possível diagnosticar o câncer debexiga muito precocemente. Desse modo, a doença pode ser tratada em umestágio precoce por processos conhecidos. A invenção possibilita, ainda,uma avaliação de baixo custo, rápida e segura do estágio do tumor, bemcomo um diagnóstico com intervenções, em parte, não invasivas ou apenasminimamente invasivas.

O tempo de migração é realizado-determinado por meio de ele-troforese capilar (capillary electrophoresis, CE) - tal como descrito, por e-xemplo, no exemplo sob o ponto 2. Nesse exemplo, um capilar de vidro comcomprimento de 90 cm, com um diâmetro interno (ID) de 50 μm e um diâme-tro externo (OD) de 360 μm é operado a uma tensão aplicada de 30 kV.Como agente de extração são usados, por exemplo, 30% de metanol, 0,5%de ácido fórmico em água.

É sabido que o tempo de migração de CE pode variar. Não obs-tante, a seqüência, com a qual marcadores de polipeptídio realizam a extra-ção, é tipicamente igual para cada sistema de CE utilizado, sob as condiçõesindicadas. Para, não obstante, compensar diferenças que se apresentam notempo de migração, o sistema pode ser normatizado sob uso de padrões,para os quais os tempos de migração são conhecidos exatamente. Essespadrões podem ser, por exemplo, os polipeptídios indicados nos exemplos(veja exemplo ponto 3).

A caracterização dos polipeptídios, que estão mostrados nastabelas 1 a 8, deu-se por meio de espectrometria de massa por eletroforesecapilar (CE-MS), um processo, que foi descrito detalhadamente, por exem-plo, por Neuhoff et al., Rapid Comm. in mass spectrometry 2004 (20) 149-156. A variação das massas moleculares entre medições individuais ou entrediferentes espectrômetros de massa é relativamente pequena a uma calibra-ção exata, tipicamente, no âmbito de ± 0,1%, de preferência, no âmbito de ±0,05, de modo particularmente preferido, ± 0,03%.

Os marcadores de polipeptídio de acordo com a invenção sãoproteínas ou peptídios ou produtos de decomposição de proteínas ou peptí-dios. Eles podem estar modificados quimicamente, por exemplo, por modifi-cações pós-translacionais, tais como glicolização, fosforilação, alquilação ouligação em ponte de dissulfeto, ou modificados por outras reações, por e-xemplo, no âmbito da decomposição. Além disso, os marcadores de polipep-tídio também podem estar modificados quimicamente no âmbito da purifica-ção das amostras, por exemplo, oxidados.

Partindo dos parâmetros, que determinam os marcadores depolipeptídio (massa molecular e tempo de migração), é possível identificarpor processos conhecidos no estado da técnica a seqüência dos polipeptí-dios correspondentes.

Os polipeptídios de acordo com a invenção (veja tabelas 1 a8) são usados, por um lado, para diagnosticar câncer de bexiga, comotambém, por outro lado, para possibilitar uma diferenciação entre diver-sos estágios de tumor. Por diagnóstico, é entendido o procedimento daobtenção de identificação, pela associação de sintomas ou fenômenos auma doenças ou lesão. No presente caso, pela presença ou ausência ouamplitude de terminados marcadores de polipeptídio é deduzida a exis-tência de câncer de bexiga, bem como o estágio do tumor do carcinomade bexiga. Para esse fim, os marcadores de polipeptídio de acordo coma invenção são determinados em uma amostra de um indivíduo, sendoque, no caso de marcadores de freqüência, sua presença ou ausênciaou, no caso de marcadores de amplitude, a diferença na intensidade desinais, é possível deduzir a existência de câncer de bexiga. A presençaou ausência ou amplitude de um marcador de polipeptídio pode ser me-dida por qualquer processo conhecido no estado da técnica. Processos,que podem ser utilizados, estão descritos, exemplificadamente, mais a-baixo.

Um marcador de polipeptídio está presente quando seu valorde medição tem pelo menos o mesmo tamanho do valor limite. Se seuvalor de medição estiver situado abaixo, o marcador de polipeptídio estáausente. O valor limite pode ser determinado pela sensibilidade do pro-cesso de medição (limite de comprovação) ou ser definido com base emexperiências.

Em conexão com a presente invenção, o valor limite é, de prefe-rência, excedido, quando o valor de medição da amostra para uma determi-nada massa molecular tiver pelo menos o dobro do tamanho do de uma a-mostra vazia (por exemplo, apenas tampão ou solvente).

O ou os marcador(es) de polipeptídio é/são usados de tal mo-do que sua presença ou ausência é medida, sendo que a presença ouausência é indicativa de câncer de bexiga (marcador de freqüência). Des-se modo, existem marcadores de polipeptídio que estão presentes, tipi-camente, em pacientes com câncer de bexiga (doentes), tais como, porexemplo, os marcadores de polipeptídio No. 1 a 14, mas não estão pre-sentes, ou apenas raramente, em pacientes examinados sem câncer debexiga (controle). Além disso, existem marcadores de polipeptídio, queestão presentes em indivíduos sem câncer de bexiga, mas ocorrem rara-mente ou não ocorrem em indivíduos com câncer de bexiga, por exemplo,No. 45 a 149 (tabela 2).

Um marcador de freqüência é uma variante do marcador deamplitude, no qual em algumas amostras a amplitude é pequena. Épossível converter esses marcadores de freqüência em marcadores deamplitude, sendo que no cálculo da amplitude, as amostras correspon-dentes, nas quais o marcador não foi encontrado, com uma amplitudemuito pequena - no âmbito do limite de comprovação - são incluídas noTabela 2: marcador de polipeptídio (marcador de freqüência),para diagnóstico de câncer de bexiga, suas massas moleculares e temposde migração, bem como sua presença e ausência (ocorrência) em grupos depacientes acometidos de câncer de bexiga (BC), bem como grupos de con-trole como fator (1=100%; 0=0%, acabamento de amostras e medição, taiscomo descritos no exemplo).<table>table see original document page 10</column></row><table>

Tradução: Número Ocorrência grupo BC Ocorrência controle

O uso dos marcadores 1-146 é particularmente preferido.

Adicionalmente, ou também alternativamente, aos marcadores defreqüência (determinação da presença ou ausência), também podem ser usa-dos os marcadores de amplitude indicados nas tabelas 3 e 4, para diagnósticode câncer de bexiga (números 150-836). Marcadores de amplitude são usadosde tal modo que a presença ou ausência não é decisiva, mas decide o tamanhodo sinal (a amplitude), na presença do sinal nos dois grupos. Nas tabelas 3 e 4estão indicados os sinais correspondentes (caracterizados através de massa etempo de migração) sobre todas as amostras medidas. Nesse caso, são possí-veis dois processos de normalização, para obter uma comparação entre amos-tras de concentração diferente ou métodos de medição diferentes:

Na primeira combinação, todos os sinais de peptídio de umaamostra são normatizados para uma amplitude de 1 milhão de contagens.As amplitudes, em cada caso, médias dos marcadores individuais estão in-dicadas, portanto, como partes por milhão (ppm). Os marcadores de ampli-tude resultantes de acordo com esse processo são mostrados na tabela 3(números 150-185).

Adicionalmente, existe a possibilidade de definir outros marcado-res de amplitude através de um processo de normatização alternativo: nessecaso, todos os sinais de peptídio de uma amostra são postos em escala comum fator de normatização comum. Para isso, é formada uma regressão linearentre as amplitudes de peptídio das amostras individuais e os valores de refe-rência de todos os polipeptídios conhecidos. A inclinação da reta de regressãocorresponde exatamente à concentração relativa e é usada como fator de nor-matização para essa amostra. Os biomarcadores resultantes de acordo comesse processo de normatização são mostrados na tabela 4 (números 186-836).

O uso dos marcadores 150-185 é particularmente preferido.

Todos os grupos utilizados consistem em pelo menos 40 amostrasde pacientes ou de controle individuais, para obter uma amplitude média confi-ável. A decisão para um diagnóstico (câncer de bexiga ou não) é tomada nadependência do tamanho da amplitude dos respectivos polipeptídios na amos-tra do paciente, em comparação com as amplitudes médias no grupo de contro-le ou grupo do câncer de bexiga. Se a amplitude corresponder mais às amplitu-des média do grupo de câncer de bexiga, presume-se câncer de bexiga, se elacorresponder mais às amplitudes média do grupo de controle, não se deve pre-sumir câncer de bexiga. A distância entre o valor de medição e a amplitude médiapode ser considerada como uma probabilidade de inclusão em um grupo.

Através do exemplo do marcador n9 162 (Tabela 3) um esclare-cimento mais exato deve ser ferro sobre a combinação 1. A amplitude médiados marcadores no câncer de bexiga é claramente elevada (6370 ppm conra1431 ppm do grupo contrle). Em uma amostra de paciente os valores destesmarcadores vão de 0 a 1431 ppm, ou no máximo 20% deste, assim, os valo-res de 0 a 1717 ppm pertencem a amostra do grupo controle. Os valorespara câncer na bexiga podem ser de 6370 ppm ou 20% deste; ou mais, outambém ficar entre 5096 ppm e valores maiores ainda.

Sobre a combinação 2 exemplifica-se o marcador N2 192 (Tabe-la 4) ao qual um esclarecimento mais exato deve ser feito. A amplitude mé-dia dos marcaodres no câncer de bexiga é claramente elevada (contagemde 374,91 contra a contagem de 44,29 do grupo controle). Em uma amostrade paciente, os valores destes marcadores vão de 0 a 44,29 contagens, ouno máximo 20% deste, assim os valores de 0 a 53,15 contagens pertencemà amostra do grupo controle. Os valores para câncer na bexiga podem serde 271,91, contagens, ou 20% deste, ou mais, ou também ficar entre 300contagens e valores maiores ainda. Uma alternativa quanto a distância entreo valor de medição e a amplitude média pode ser considerada como umaprobabilidade de inclusão em um grupo.

Tabela 3: Marcadores de amplitude da normatização ppm (combinação 1)

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Tradução: Número Amplitude média Amplitude médiagrupo BC [ppm] controles [ppm]Tabela 4: Marcadores de amplitude da normatização com fator de nor-malização (combinação 2)

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Tradução: Número Amplitude média Amplitude médiagrupo BC [ppm] controles [ppm]

Os marcadores de polipeptídio também são apropriados pra de-terminar um estágio de tumor. Para o diagnóstico diferencial entre pacientessem BC e pacientes com BC superficial são apropriadas as freqüências deacordo com a tabela 5 e as amplitudes, de acordo com a tabela 6.Tabela 5: Marcadores de freqüência para diferenciação de BC superfi-cial e pacientes sem BC

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Tabela 6: Marcadores de amplitude para diferenciação de BC superficiale pacientes sem BC

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Tradução: Número Amplitude média Amplitude médiagrupo BC superficial controlesAlém disso, é possível identificar por diagnóstico diferencial BCinfiltrante. Para o diagnóstico diferencial entre pacientes sem BC e pacientescom BC infiltrante, são apropriadas as freqüências de acordo com a tabela 7e as amplitudes de acordo com a tabela 8.

Tabela 7: Marcadores de freqüência para diferenciar BC infiltrante e pa-cientes sem BC

<table>table see original document page 17</column></row><table> Tradução: Número

Ocorrência de grupo

Ocorrência controleBC invasivo

Tabela 8: Marcadores de amplitude para diferenciar BC infiltrante e pa-cientes sem BC

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Tradução: Número Amplitude média Amplitude médiagrupo BC_inf controles

Os marcadores de acordo com a invenção podem ser usadostambém para o diagnóstico diferencial dos estágios individuais pTa a pT4.

O indivíduo, do qual se origina a amostra, na qual é determinadaa presença ou ausência ou a amplitude de um ou mais marcadores de poli-peptídios, pode ser qualquer indivíduo passível de sofrer de câncer de bexi-ga, por exemplo, um animal ou uma pessoa. De preferência, no caso do in-divíduo, trata-se de um mamífero, de modo especialmente preferido, trata-sede uma pessoa.

Em uma modalidade preferida da invenção, é usado não apenasum marcador de polipeptídio, mas uma combinação de marcadores, paradiagnosticar câncer de bexiga. Nesse caso, por sua presença ou ausênciae/ou o tamanho da amplitude, é deduzida a existência de câncer de bexiga.Por comparação de uma pluralidade de marcadores de polipeptídio, a falsifi-cação do resultado geral por alguns desvios individuais da probabilidade depresença típica no doente ou no indivíduo de controle é reduzida ou podeser evitada.

No caso da amostra, na qual são medidas a presença ou ausên-cia ou a amplitude do ou do(s) marcador(es) de polipeptídio, pode tratar-sede qualquer amostra que foi obtida do corpo do indivíduo. No caso da amos-tra, trata-se de uma amostra que dispõe de uma combinação de polipeptí-dios, que é apropriada para dar indicações sobre o estado o indivíduo (cân-cer de bexiga ou não). Por exemplo, pode tratar-s de sangue, urina, um lí-quido de articulação, um líquido de tecido, uma secreção corporal, suor, Ii-quido, linfa, suco intestinal, suco gástrico, suco pancreático, bílis, líquido Ia-crimal, uma amostra de tecido, esperma, líquido vaginal ou uma amostra defezes. De preferência, trata-se de uma amostra de líquido.

Em uma modalidade preferida, no caso da amostra trata-se deuma amostra de urina ou uma amostra de sangue, sendo que em uma a-mostra de sangue, pode tratar-se de uma amostra de soro (de sangue ouplasma (de sangue).

Amostras de urina podem ser coletadas tal como conhecido noestado da técnica. Em relação à presente invenção, é usada, de preferência,uma amostra de urina de jato médio. A amostra de urina pode ser retirada,por exemplo, por meio de um cateter ou também com ajuda de um aparelhode urinar, tal como descrito no documento WO 01/74275.

Amostras de sangue podem ser tomadas por processos conhe-cidos no estado da técnica, por exemplo, de uma veia, artéria ou capilares.Normalmente, uma amostra de sangue é obtido retirando-se de um indivíduosangue venoso, por exemplo, do braço, por meio de uma injeção. O termoamostra de sangue também inclui amostras que foram obtidas de sanguepor outros processos de purificação e separação, conhecidos do estado datécnica, por exemplo, plasma de sangue e soro de sangue.

A presença ou ausência ou amplitude de um marcador de poli-peptídio na amostra pode ser determinada por qualquer processo no estadoda técnica, que é apropriado para a medição de marcadores de polipeptídio.

Esses processos são familiares ao técnico. Em princípio, a presença ou au-sência ou amplitude de um marcador de polipeptídio pode ser determinadapor processos diretos, tal como, por exemplo, espectrometria de massa, ouprocessos indiretos, tal como, por exemplo, por meio de ligantes.

Caso necessário ou desejável, a amostra do indivíduo, por e-xemplo, a amostra de urina ou sangue, pode ser tratada previamente porqualquer meio apropriado e, por exemplo, purificada ou separada, antes damedição da presença ou ausência ou amplitude do ou dos marcador(es) depolipeptídio. O tratamento pode compreender, por exemplo, uma purificação,separação, diluição ou concentração. Os processos podem ser, por exem-pio, uma centrifugação, filtração, uItrafiItração, diálise, uma precipitação ouprocessos cromatográficos, tais como separação de afinidade ou separaçãopor meio de cromatografia de troca iônica, ou uma separação eletroforética.Exemplos especiais disso são eletroforese de gel, eletroforese de gel de po-liacrilamida bidimensional (2D-PAGE), eletroforese capilar, cromatografia deafinidade de metal, cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC),cromatografia de afinidade na base de lecitinas, cromatografia de líquido,cromatografia de líquido de alta capacidade (HPLC), HPLC de fase normal ede fase de inversão, cromatografia de troca catiônica e ligação seletiva emsuperfícies. Todos esses processos são bem familiares ao técnico e o técni-co pode escolher o processo na dependência da amostra utilizada e do pro-cesso para determinação da presença ou ausência ou amplitude do ou dosmarcador(es) de polipeptídio.

Em uma modalidade da invenção, a amostra é separada antesde sua medição por meio de eletroforese capilar, purificada por meio de ul-tracentrifugação e/ou separada por meio de uItrafiItração em frações, quecontêm os marcadores de polipeptídio com determinado tamanho molecular.

De preferência, é usado um processo espectrométrico de mas-sa, para determinar a presença ou ausência ou amplitude de um marcadorde polipeptídio, sendo que a esse processo pode ser anteposta uma purifi-cação ou separação da amostra. A análise espectrométrica de massa pos-sui, em relação aos processos atualmente usuais, a vantagem, de que aconcentração de muitos (>500) polipeptídios de uma amostra pode ser de-terminada por meio de uma única análise. Pode ser usado qualquer tipo deespectrômetro de massa. Com a espectrometria de massa é possível medir,rotineiramente, 10 fmol de um marcador de polipeptídio, portanto, 0,1 ng deuma proteína de 10 kDa, com uma precisão de medição de cerca de ±0,01% de uma mistura complexa. Em espectrômetros de massa, uma unida-de formadora de íons está ligada com um aparelho de análise apropriado.Por exemplo, na maioria das vezes são usadas Interfaces de lonizações deEletrospray (ESI), para medir íons de amostras de líquido, sendo que, poroutro lado, é usada a técnica de Matrix-assisted-laser-desorption/ionisation(MALDI) [dessorção/ionização por laser assistida por matriz], para medir íonsde uma amostra cristalizada em uma matriz. Para análise dos íons forma-dos, podem ser usados, por exemplo, quadrupolos, armadilhas de íons, ana-lisadores de FT-ICR ou time-of-flight (TOF) [tempo de vôo].

Na ionização de eletrospray (ESI), as moléculas que se encon-tram em solução são pulverizadas, entre outros, sob a influência de alta ten-são (por exemplo, 1-8 kV), sendo que formam-se gotículas carregadas, quese tornam menores por evaporação do solvente. Finalmente, pelas chama-das explosões de Coulom, ocorre a formação de íons livres, que depois po-dem ser analisados e detectados.

Na análise dos íons por meio de TOF, é aplicada uma determi-nada tensão de aceleração, que confere aos íons uma energia cinética domesmo tamanho. Depois, é medido de modo muito preciso o tempo que osrespectivos íons necessitam para percorrer um trajeto de corrente pelo tubode vôo. Como a uma energia cinética igual, a velocidade dos íons dependede sua massa, a mesma pode, desse modo, ser determinada. Analisadoresde TOF têm uma velocidade de scan muito alta e atingem uma alta resolução.Processos preferidos para determinação da presença ou ausên-cia ou amplitude de marcadores de polipeptídio incluem espectrometria deíons de fase gasosa, tais como espectrometria de massa de dessor-ção/ionização por laser, MALDI-TOF-MS, SELDI-TOF-MS (surfce enhancelaser desorption ionisation) LC-MS (liquid cromatograph-mass spectrometry)[espectrometria de massa por cromatografia de líquido], 2D-PAGE-MS e es-pectrometria de massa de eletroforese capilar (CE-MS). Todos os processoscitados são conhecidos do técnico.

Um processo particularmente preferido é CE-MS, no qual a ele-troforese capilar é ligada com espectrometria de massa. Esees processoestá descrito detalhadamente, por exemplo, no pedido de patente alemãoDE 10021737, em Kaiser et al. (J. Chromatogr. A, 2003, Vol. 1013:157-171,bem como Electrophoresis, 2004, 25:2044-2055), e em Wittke et al., (J. C-hromatogr. A, 2003, 1013:173-181). A técnica de CE-MS permite determinara existência de algumas centenas de marcadores de polipeptídio de umaamostra simultaneamente, em pouco tempo, com um volume pequeno e altasensibilidade. Depois de uma amostra ter sido medida, é produzido um pa-drão dos marcadores de polipeptídio medidos. O mesmo pode ser compara-do com padrões de referência de indivíduos doentes ou saudáveis. Na maio-ria dos casos, é suficiente usar um número limitado de marcadores de poli-peptídio para o diagnóstico de câncer de bexiga e o diagnóstico diferencialentre diversos estágios do câncer de bexiga, por exemplo, pelo menos 6, 8,10, 20, 50 ou 100 marcadores.

Além disso, é preferido um processo de CE-MS, que inclui o CEon-line, ligado em uma ESI-TOF-MS;

Para CE-MS é preferido o uso de solventes voláteis, além disso,o melhor trabalho é realizado sob condições substancialmente livres de sais.Exemplos de solventes apropriados compreendem acetonitrila, metanol esimilares. Os solventes podem estar diluídos com água e com um ácido fra-co (por exemplo, ácido fórmico de 0,1 a 1%), para protonizar a substânciaanalisada, de preferência, os polipeptídios.

Com a eletroforese capilar é possível separar moléculas de a-cordo com sua carga e tamanho. Partículas neutras deslocam-se na aplica-ção de uma corrente, com a velocidade do fluxo eletroosmótico, cátions sãoacelerados para o cátodo e ânions são retardados. A vantagem de capilaresna eletroforese consiste na relação vantajosa de superfície para volume, oque possibilita uma boa evacuação do calor de Joule formado no fluxo decorrente. Isso, por sua vez, permite a aplicação de tensões altas (normal-mente, de até 30 kV) e, desse modo, uma alta eficiência de separação etempos de análise curtos.

Na eletroforese capilar, são usados, normalmente, capilares devidro de quartzo, com diâmetros internos de, tipicamente, 50 a 75 μιτι. Oscomprimentos usados perfazem 30-100 mm. Além disso, os capilares con-sistem, em geral, em vidro de quartzo envolvido com matéria sintética. Oscapilares tanto podem ser não tratados, isto é, mostrar no lado interno seusgrupos hidrófilos, como também estar revestidos no lado interno. Um reves-timento hidrófobo (coating: um processo, que oculta, por exemplo, a superfí-cie polarizada negativamente do quartzo), pode ser usado para aperfeiçoar aresolução. Adicionalmente à tensão, também pode ser aplicada uma pres-são, que se situa, tipicamente, no âmbito de 0 a 7 icPa (0-1 psi). Nesse ca-so, a pressão também pode ser aplicada só durante a separação ou ser mo-dificada durante a mesma.

Em um processo preferido para medição de marcadores de poli-peptídio os marcadores da amostra são separados por meio de eletroforesecapilar, subseqüentemente, ionizados diretamente e transferidos on-line paraum espectrômetro de massa ligada à mesma, para detecção.

No processo de acordo com a invenção podem ser usados, demodo vantajoso, diversos marcadores de polipeptídio para diagnóstico decâncer de bexiga. Particularmente, podem ser usados pelo menos três mar-cadores de polipeptídio, por exemplo, os marcadores 1, 2 e 3; 1, 2 e 4; etc.

É particularmente preferido o uso de pelo menos 4, 5 ou 6 mar-cadores.

É especialmente preferido o uso de pelo menos 15 marcadores,por exemplo, os marcadores 1 a 15.É principalmente preferido o uso de todos os marcadores apre-sentados nas tabelas 1 ou 4.

Para determinar a probabilidade da existência de câncer de be-xiga no uso de diversos marcadores, podem ser usados processos estatísti-cos, conhecidos do técnico. Por exemplo, pode ser usado o processo Ran-dom-Forests, descrito por Weissiger et al. (Kidney Int., 2004, 65:2426-2434),sob uso de um programa de computador, tal como, por exemplo, S-Plus ouas support-vector-machines, descritos na mesma publicação.

Exemplo:

1. Preparação das amostras

Para detecção dos marcadores de polipeptídio para câncer debexiga foi usada urina. A urina foi tirada de doadores saudáveis (grupo decomparação), bem como de pacientes que sofrem de câncer de bexiga.

Para a medição subseqüente de CE-MS, as proteínas, que tam-bém ocorrem na urina de pacientes em concentração mais alta, tais comoalbumina e imunoglobulinas, precisaram ser separadas por ultrafiltração.Para esse fim, foram tirados 700 μΙ de urina e misturados com 700 μΙ detampão de filtração (uréia de 2M, 10 mM de amoníaco, SDS de 0,02%). Es-se volume de amostra de 1,4 ml foi ultrafiltrado (20 kDa, Sartorius,Gõttingen, Alemanha). A UF foi realizada a 3000 rp.m. em uma centrífuga,até ser obtido 1,1 ml de produto de ultrafiltração.

O 1,1 ml de produto de ultrafiltração obtido foi depois aplicadosobre uma coluna PD 10 (Amersham Bioscience, Uppsala, Suécia) e extraí-do com 2,5 ml de NH4OH de 0,01% e liofilizada. Para medição de CE-MS, ospolipeptídios foram depois ressuspensos com 20 μΙ de água (HPLC-Reinheit,Merck).

2. Medição de CE-MS:

As medições de CE-MS foram realizadas com um sistema deeletroforese capilar de Beckman Coulter (sistema P/ACE MDQ; BeckmanCoulter Inc, Fullerton, USA) e um espectrômetro de massa de ESI-TOF deBruker (micro-TOF MS, Bruker Daltonik, Bremen, D).

Os capilares de CD foram adquiridos de Beckman Coulter, elestinham um ID/OD de 50/360 μη e um comprimento de 90 cm. A fase móvelpara a separação de CE consistiu em 20% de acetonirila e 0,25% M de áci-do fórmico em água. Para o "Sheath-Flow" no MS foram usados 30% de iso-propanol com 0,5% de ácido fórmico, aqui com uma velocidade de fluxo de 2μl/min. A ligação de CE e MS foi realizada por um kit de pulverização de CE-ESI-MS (Agilent Technologies, Waldbronn, DE).

Para injetar a amostra, foram aplicados 7 Kpa até 42 Kpa (1 até,máximo, 6 psi) de pressão, a duração da injeção perfez 99 segundos. Comesses parâmetros, foram injetados cerca de 150 a 900 nl da amostra noscapilares, isso corresponde a cerca de 10% a 50% do volume do capilar.Para concentrar a amostra no capilar, foi usada uma técnica de "stacking".Nesse caso, antes da injeção da amostra, é injetada por 7 s (a 7 kPa (1 psi))uma solução de NH3 de 1M, depois da injeção da amostra, por 5 s, uma so-lução de ácido fórmico de 2M. Depois da aplicação da tensão de separação(30 kV), as substâncias de análise são automaticamente concentradas entreessas soluções.

A separação de CD subseqüente foi realizada com um métodode pressão: 40 min com 0 Kpa (0 psi), depois, por 2 min, 0,7 Kpa (0,1 psi),por 2 min, 1,4 Kpa (0,2 psi), por 2 min, 2,06 Kpa (0,3 psi), por 2 min, 2,75Kpa (0,4 psi), no final, 32 min, a 3,4 Kpa (0,5 psi). A duração total de umaoperação de separação perfez, desse modo, 80 minutos.

Para obter por parte do MS uma intensidade de sinal a melhorpossível, o "nebulizer gas" foi ajustado para o menor valor possível. A tensãoaplicada para produção do eletrospray perfez 3700-4100 V. Os ajustes res-tantes no espectrômetro de massa foram otimizados para detecção de pep-tídios de acordo com instruções do fabricante. Os espectros foram registra-dos sobre um âmbito de massa de m/z 400 a m/z 3000 e acumulados a cada3 segundos.

3. Padrões para a medição de CE

Para controle e calibração da medição de CE foram usadas asseguintes proteínas ou polipeptídios, que, sob as condições escolhidas, es-tão caracterizadas pelos tempos de migração de CE apresentados abaixo:<table>table see original document page 27</column></row><table>

As proteínas/polipeptídios foram usadas, em cada caso, em umaconcentração de 10 pmol/μΙ em água. "VER", "ELM", "KINCON" e "GIVLY"representam peptídios sintéticos.

As massas moleculares dos peptídios, bem como as relações dem/z, visíveis na MS dos estados de carga individuais, estão indicadas natabela abaixo:

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Claims

1. Processo para diagnóstico de câncer de bexiga (BC) e/ou pa-ra determinação do estágio de um tumor de câncer de bexiga, que compre-ende a etapa da determinação de uma presença ou ausência ou amplitudede pelo menos seis marcadores de polipeptídio em uma amostra, sendo queos marcadores de polipeptídio são escolhidos dos marcadores 1 a 836 e osmarcadores de polipeptídio são através dos seguintes valores para as mas-sas moleculares e o tempo de migração (tempo de CE):<table>table see original document page 28/table>Tradução: Número Massa Tempo de CE<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que se dá uma avaliação da presença ou ausência determinada dosmarcadores 1-149 por meio dos seguintes valores de referência:<table>table see original document page 31</column></row><table> Tradução: Número Ocorrência grupo BC Ocorrência controle

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que se dá uma avaliação da amplitude dos marcadores 150-185 pormeio dos seguintes valores de referência:<table>table see original document page 32</column></row><table>Tradução: Número Amplitude média Amplitude médiado grupo BC dos controles[ppm] [ppm]

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que se dá uma avaliação da amplitude dos marcadores 186-836 pormeio dos seguintes valores de referência:Tradução: Número Amplitude média Amplitude médiado grupo BC dos controles[ppm] [ppm]<table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table>

5. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 4, sendo que são usados pelo menos dez ou 20 ou 100 ou todos os mar-cadores de polipeptídio, tais como estão definidos na reivindicação 1.

6. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 a 5, sendo que a amostra de um indivíduo é uma amostra de urina ou umaamostra de sangue (amostra de soro ou de plasma).

7. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações-1 a 6, sendo que são usados eletroforese capilar, HPLC, espectrometria tô-nica de fase gasosa e/ou espectrometria de massa, para comprovação dapresença ou ausência ou amplitude do/dos marcador(es) de polipeptídio.

8. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações-1 a 7, sendo que antes da medição da massa molecular dos marcadores depolipeptídio, é realizada uma eletroforese capilar.

9. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações-1 a 8, sendo que é usada a espectrometria de massa para comprovação dapresença ou ausência ou amplitude do/dos marcador(es) de polipeptídio.

10. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações-1 a 9, sendo que o processo é usado para diagnóstico de câncer de bexiga.

11. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações-1 a 9, sendo que o processo é usado para determinação de um estágio detumor de câncer de bexiga.

12. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações-1 a 9, sendo que o processo é usado simultaneamente para o diagnóstico decâncer de bexiga e para determinação de um estágio de tumor de câncer debexiga.

13. Uso de pelo menos um marcador de polipeptídio, escolhidodos marcadores n— 1 a 836, que está através dos valores como definidos nareivindicação 1 para as massas moleculares e o tempo de migração, paradiagnóstico e/ou determinação de um estágio de tumor de câncer de bexiga.

14. Processo para diagnóstico de câncer de bexiga (BC), quecompreende as etapasa) da separação de uma amostra em pelo menos três, de prefe-rência, 10 amostras parciais;b) análise de pelo menos duas amostras parciais para determi-nação de uma presença ou ausência ou amplitude de pelo menos um mar-cador de polipeptídio na amostra, sendo que o marcador de polipeptídio estáescolhido dos marcadores 1 a 836, que são através das massas molecularese tempo de migração (tempo de CE) de acordo com a reivindicação 1.

15. Processo para determinação de um estágio de tumor decâncer de bexiga, que compreende as etapasa) da separação de uma amostra em pelo menos três, de prefe-rência, 10 amostras parciaisb) análise de pelo menos duas amostras parciais para determi-nação de uma presença ou ausência ou amplitude de pelo menos um mar-cador de polipeptídio na amostra, sendo que o marcador de polipeptídio estáescolhido dos marcadores 1 a 836, que são através das massas molecularese tempo de migração (tempo de CE) de acordo com a reivindicação 1.

16. Processo de acordo com uma das reivindicações 14 ou 15,sendo que, nesse caso, são medidas pelo menos 10 amostras parciais.

17. Processo de acordo com uma das reivindicações 14 ou 16,caracterizado pelo fato de que o tempo de CE está relacionado a um capilarde vidro com comprimento de 90 cm e com um diâmetro interno (ID) de 50μm, a uma tensão aplicada de 25 kV, sendo que como agente de extraçãosão usados 20% de acetonitrila e ácido fórmico de 0,25 M em água.

18. Combinação de marcadores, que compreende pelo menosmarcadores, escolhidos dos marcadores 1 a 836, que são através dasmassas moleculares e tempo de migração (tempo de CE) como definidos nareivindicação 1.