WO2018074533A1 - 抗ヒトｂｎｐ断片（４－３２）抗体を用いた免疫測定方法 - Google Patents

抗ヒトｂｎｐ断片（４－３２）抗体を用いた免疫測定方法 Download PDF

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宮崎　修
鈴木　亨
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Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a human BNP fragment utilizing an immune reaction and a measurement reagent. More specifically, the present invention relates to a method and reagent for measuring a human BNP fragment using an anti-human BNP fragment (4-32) specific antibody.
  • BNP is an abbreviation for brain natriuretic peptide and is a hormone composed of 32 amino acids synthesized and secreted in the heart. It is known that BNP increases in blood concentration when the load on the heart increases or when the myocardial hypertrophy occurs.
  • BNP is widely used in clinical settings as a biochemical marker of heart failure, and BNP concentration measurement is used as a screening for heart disease, evaluation of the severity of heart failure, determination of therapeutic effect on heart failure, or as a prognostic indicator of heart failure patients. It is considered useful.
  • Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 disclose a method for diagnosing myocardial ischemia by measuring BNP in blood.
  • BNP in blood samples and its processing products are selected with specific antibodies. Then, each processing product is detected by a mass spectrometer, and the relationship between the ratio of a specific processing product and the presence or absence of restenosis is clarified.
  • Patent Document 2 uses an antibody specific for human BNP (3-32), which reacts with human BNP fragment (3-32) but does not react with full-length human BNP and human proBNP.
  • a method for specifically measuring the human BNP fragment (3-32) is disclosed. This method suggests the usefulness of diagnosing diseases using the increase or decrease of human BNP (3-32) as an index, such as diagnosis of hypertension, cardiac function, and renal function.
  • Patent Document 1 an antibody that reacts with any of human BNP (1-32), BNP (3-32), BNP (4-32), and BNP (5-32) is used. Then, the BNP fragment in the sample is concentrated and then subjected to mass spectrometry, and the respective abundance ratios are calculated from the signal intensity ratio of the obtained MS spectrum. Therefore, in this method, each BNP fragment is distinguished and detected by using a mass spectrometer, so that the apparatus configuration becomes large, the operation is complicated, and it is not suitable for rapidly processing a large amount of specimens.
  • the method of Patent Document 2 discloses an antibody that reacts with a human BNP fragment (3-32) but does not react with full-length human BNP or human proBNP.
  • the present invention aims to provide information useful for the diagnosis and prediction of heart disease simply by detecting various human BNP fragments and measuring the ratio of human BNP fragments only by immunoassay. It is an object of the present invention to provide a method capable of measuring a non-human BNP fragment (4-32) with a specific antibody.
  • the present invention has the following configuration. ⁇ 1> A method for immunoassay of a human BNP fragment (4-32) in a sample, which reacts with a human BNP fragment (4-32), and is a human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32) And an immunoassay method comprising using an antibody that does not react with the human BNP fragment (5-32).
  • ⁇ 2> An antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) and does not react with human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32), and human BNP fragment (5-32) is a human BNP fragment.
  • the immunoassay method according to ⁇ 1> which is an antibody that reacts with a site containing the N-terminus.
  • An antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) and does not react with human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32), and human BNP fragment (5-32) is a human BNP fragment.
  • the immunoassay method according to ⁇ 1> or ⁇ 2> which is an antibody that reacts with (4-10).
  • An antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) and does not react with human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32), and human BNP fragment (5-32) is a monoclonal antibody.
  • the immunoassay method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • An immunoassay reagent for human BNP fragment (4-32), which reacts with human BNP fragment (4-32), and is human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32) and human BNP The immunoassay reagent described above, wherein an antibody that does not react with the fragment (5-32) is used.
  • ⁇ 6> An antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) and does not react with human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32), and human BNP fragment (5-32) is a human BNP fragment.
  • the immunoassay reagent according to ⁇ 5> which is an antibody that reacts with a site containing the N-terminus.
  • An antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) and does not react with human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32), and human BNP fragment (5-32) is a human BNP fragment.
  • the immunoassay reagent according to ⁇ 5> or ⁇ 6> which is an antibody that reacts with (4-10).
  • ⁇ 8> An antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) and does not react with human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32), and human BNP fragment (5-32) is a monoclonal antibody.
  • the immunoassay reagent according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 7>.
  • ⁇ 9> An antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) and does not react with human full-length BNP (1-32), human BNP fragment (3-32), and human BNP fragment (5-32).
  • ⁇ 10> The antibody according to ⁇ 9>, which reacts with a site containing the N-terminus of human BNP fragment (4-32).
  • ⁇ 11> The antibody according to ⁇ 9> or ⁇ 10>, which reacts with a human BNP fragment (4-10).
  • ⁇ 12> The antibody according to any one of ⁇ 9> to ⁇ 11>, which is a monoclonal antibody.
  • human BNP fragment (4-32) in a sample can be specifically immunologically measured. Therefore, even in a sample containing BNP and various human BNP fragments, only human BNP fragment (4-32) can be immunologically measured.
  • each fragment other than the antibody of the present invention with an antibody that can be specifically detected, the abundance ratio of each fragment can be measured immunologically, and the prediction of a disease using the ratio as an index is possible. Can contribute to realization.
  • 2A Three types of antibodies of the present invention (96201 antibody, 96204 antibody, 96207 antibody) 2B: Antibody that recognizes the cyclic site of human BNP (A) 2C: IgG antibody (B) as a negative control 3 is a graph showing the results of confirming the reactivity of each antibody combination to human BNP (1-32) and human BNP fragment (4-32) by sandwich ELISA.
  • Primary antibody Antibody 96207 antibody of the present invention
  • Secondary antibody Antibody 33236 antibody that recognizes human BNP (26-32) It is a graph which shows the result confirmed by the sandwich ELISA method about the reactivity with respect to the human BNP fragment (4-32) by the combination of each antibody, changing the human BNP fragment (4-32) density
  • Antibody 96207 antibody of the present invention Secondary antibody: Antibody 33236 antibody that recognizes human BNP (26-32) Three types of antibodies of the present invention and synthetic peptides (BNP (4-6), BNP (4-7), BNP (4-8), BNP (4-9), BNP (4-10)) at various concentrations It is a graph which shows the result of having confirmed the reactivity of (2) by the competition ELISA method.
  • 5A 96201 antibody
  • 5B 96204 antibody
  • 5C 96207 antibody Reactivity of each antibody with each synthetic peptide ((1) BNP (1-32), (2) BNP (3-32) (3) BNP (4-32), (3) BNP (5-32)) It is an electrophoresis pattern which shows the result confirmed by Western blotting.
  • 6A Three types of antibodies of the present invention (96201 antibody, 96204 antibody, 96207 antibody) 6B: Antibody recognizing the cyclic site of human BNP (A) 6C: IgG antibody as a negative control (B) Reactivity to human BNP fragments (4-32) and (1-32) by each antibody combination was confirmed by sandwich ELISA method with different concentrations of human BNP fragments (4-32) and (1-32). It is a graph which shows a result.
  • an antibody of the present invention and a compound means that the antibody of the present invention does not substantially react with the compound, and “does not substantially react” refers to, for example, the above ELISA method.
  • human BNP is a human mature B-type natriuretic hormone consisting of 32 amino acids, consisting of 17 amino acids due to intramolecular disulfide bonds by cysteine residues present in the 7th and 23rd amino acids. It consists of a cyclic part, an N-terminal part consisting of 9 amino acids, and a C-terminal part consisting of 6 amino acids. Further, it corresponds to amino acid sequence 77-108 of human B-type natriuretic hormone precursor (sometimes referred to as human proBNP) consisting of 108 amino acids.
  • the BNP fragment (3-32) of the present invention is a fragment produced by processing the N-terminal 2 amino acids (SP in capital letters) of BNP (1-32), and the BNP fragment (4-32) is BNP (4-32).
  • the N-terminal 3 amino acids (SPK) of 1-32) are processed fragments, and the BNP fragment (5-32) is processed from the N-terminal 4 amino acids (SPKM) of BNP (1-32).
  • SPK N-terminal 3 amino acids
  • SPKM N-terminal 4 amino acids
  • the antibody of the present invention is an antibody that reacts with human BNP fragment (4-32) but does not react with human full-length BNP (1-32).
  • it is an antibody that reacts with the site including the N-terminus of human BNP fragment (4-32), and an antibody that reacts with human BNP fragment (4-10). More preferred is an antibody that does not react with either the human BNP fragment (3-32) or the human BNP fragment (5-32).
  • the antibody of the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and is preferably a monoclonal antibody.
  • monoclonal antibodies include monoclonal antibodies produced by hybridomas 96201 (NITE BP-02331), 96204 (NITE BP-02332), and 96207 (NITE BP-02333) (hereinafter referred to as 96201 antibody, 96204 antibody, 96207, respectively).
  • monoclonal antibodies that cross-react with 96201 antibody, 96204 antibody, 96207 antibody, or competing monoclonal antibodies are also included in the scope of the antibody of the present invention.
  • the 96201 antibody, the 96204 antibody, and the 96207 antibody include an antibody that can specifically recognize the amino acid sequence (human BNP (4-10)) of the same epitope (antigenic determinant) as the antibody.
  • Monoclonal antibodies that compete with the 96201 antibody, the 96204 antibody, and the 96207 antibody include monoclonal antibodies that compete with the antibody against human BNP (4-10), and the degree of competitive inhibition is 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
  • the antibody of the present invention in addition to the whole antibody molecule, it is also possible to use a functional fragment of an antibody having antigen-antibody reaction activity, in addition to those obtained through the immunization process for animals as described above, Those obtained using genetic recombination techniques and chimeric antibodies can also be used.
  • the functional fragment of the antibody include F (ab ′) 2, Fab ′ and the like. These functional fragments are obtained by converting the antibody obtained as described above into a proteolytic enzyme (for example, pepsin or papain). It can manufacture by processing with.
  • a synthesized peptide containing the N-terminus of human BNP (4-32) is used as an antigen (immunogen).
  • the peptide is not particularly limited as long as it contains an N-terminus, and for example, a peptide corresponding to the amino acid residue at position 4-26 of human BNP or a human BNP fragment (4-32) may be used as it is.
  • a peptide corresponding to the N-terminal of human BNP (4-32) preferably the amino acid residue at position 4-10 of human BNP (hereinafter referred to as human BNP (4-10)) is phosphate buffered.
  • BSA bovine serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • Adjuvants include water-in-oil emulsions, water-in-oil-in-water emulsions, oil-in-water emulsions, liposomes, aluminum hydroxide gels, and other commonly used adjuvants, as well as protein and peptide substances derived from biological components. Also good. For example, Freund's incomplete adjuvant or Freund's complete adjuvant can be preferably used. Although there are no particular limitations on the route of administration, dosage, and timing of adjuvant, it is desirable to select appropriately so that the desired immune response can be enhanced in animals immunized with the antigen.
  • the type of animal used for immunization is not particularly limited, but mammals are preferable, and for example, mice, rats, cows, rabbits, goats, sheep, and the like can be used, and mice can be more preferably used.
  • the animal may be immunized according to a general method.
  • the animal can be immunized by injecting a solution of an antigen, preferably a mixture with an adjuvant, into the animal subcutaneously, intradermally, intravenously, or intraperitoneally. . Since the immune response generally varies depending on the type and strain of the animal to be immunized, it is desirable to set the immunization schedule as appropriate according to the animal used.
  • the antigen administration is preferably repeated several times after the first immunization.
  • the present invention is not limited to these operations, and the production method of the monoclonal antibody itself is described in, for example, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)).
  • spleen cells or lymph node cells which are antibody-producing cells
  • hybridomas can be produced by cell fusion with myeloma cells having high proliferation ability.
  • cells having high antibody production ability quality / quantity
  • myeloma cells are preferably compatible with the animal from which the antibody-producing cells to be fused are derived.
  • Cell fusion can be performed according to a method known in the art. For example, a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, a method using an electric current, or the like can be employed.
  • the obtained hybridoma can be grown according to a known method, and a desired hybridoma can be selected while confirming the properties of the antibody produced.
  • the hybridoma can be cloned by a known method such as a limiting dilution method or a soft agar method.
  • Hybridoma selection can be performed efficiently at the stage of selection in consideration of the conditions under which the produced antibody is used for actual measurement. For example, it can be obtained by selecting a hybridoma that produces an antibody that reacts with a human BNP fragment by ELISA, RIA, Western blotting, or the like. Specifically, a culture supernatant produced by culturing a single hybridoma is further used as an antigen sample for detecting human BNP (1-32), human BNP (4-32), or human BNP (5-32). By Western blotting used as a hybridoma, a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically recognizes only human BNP (4-32) can be obtained. Or human BNP (3-10), human BNP (4-10), human BNP (5-10), human BNP (1-32), human BNP (3-32), human BNP (4-32), It can also be obtained by competitive ELISA using human BNP (5-32) or the like.
  • Monoclonal antibodies having desired characteristics can be produced by mass-culturing the hybridomas thus selected.
  • the mass culture method is not particularly limited.
  • the hybridoma is cultured in an appropriate medium and a monoclonal antibody is produced in the medium, or the hybridoma is injected into the abdominal cavity of a mammal to be proliferated, and then in ascites.
  • Examples thereof include a method for producing an antibody.
  • Purification of the monoclonal antibody can be performed by appropriately combining, for example, anion exchange chromatography, affinity chromatography, ammonium sulfate fractionation method, PEG fractionation method, ethanol fractionation method and the like.
  • monoclonal antibodies 96201, 96204, and 96207 were obtained.
  • This antibody reacts with human BNP (4-10), but does not react with human BNP (3-10) or human BNP (5-10), as shown in the Examples below.
  • 4-32) is an antibody specific for the site containing the N-terminus.
  • the present invention further includes an antibody specific to human BNP (4-32) (first monoclonal antibody) and a recognition site for human BNP (4-32) after treating a sample with a protein denaturing treatment agent.
  • a method of measuring human BNP (4-32) using an antibody (second antibody) different from the monoclonal antibody of 1 can be provided.
  • the second antibody may be an antiserum, a polyclonal antibody, or a monoclonal antibody, or may be a chimeric antibody or an antibody fragment that retains immunological properties. Monoclonal antibodies are particularly preferred.
  • a method commonly used by those skilled in the art to produce monoclonal antibodies by immunizing mice with a 7-residue peptide in the C-terminal region of human BNP the method of Kohler and Milstein ( For example, an anti-human BNP (26-32) monoclonal antibody (Clone # 33236) that recognizes human BNP (26-32) obtained according to Nature, Vol. 256, page 495 (1975), and the like.
  • a monoclonal antibody that recognizes the cyclic site of human BNP may be used.
  • the first or second monoclonal antibody can be used as an immobilized (solid phase) antibody in which either or both are immobilized on an insoluble carrier, or a labeled antibody labeled with a commonly used labeling substance known to those skilled in the art described later.
  • an immobilized antibody can be produced by physically adsorbing a monoclonal antibody to an insoluble carrier or chemically binding it (may be via an appropriate spacer).
  • an insoluble carrier an insoluble carrier comprising a polymer substrate such as polystyrene resin, an inorganic substrate such as glass, or a polysaccharide substrate such as cellulose or agarose can be used. Any shape such as a shape (for example, a microplate or a membrane), a bead or fine particles (for example, latex particles, gold colloid particles), or a tubular shape (for example, a test tube) can be selected.
  • the human BNP fragment (4-32) in a sample can be measured by using a labeled antibody, labeled protein A, labeled protein G or the like that can bind to the first or second monoclonal antibody of the present invention.
  • the labeling substance for producing the labeled antibody include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, biotin, avidin, or radioactive isotopes, colloidal gold particles, and colored latex.
  • methods for binding the labeling substance and the antibody methods such as glutaraldehyde method, maleimide method, pyridyl disulfide method, or periodic acid method available to those skilled in the art can be used.
  • the types and methods for producing them are not limited to the above examples.
  • an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP horseradish peroxidase
  • HRP O-phenylenediamine
  • ALP p-nitrophenyl phosphate, etc.
  • biotin is used as a labeling substance.
  • at least avidin or enzyme-modified avidin is generally reacted.
  • insoluble carrier is “solid phase”, antigen or antibody is physically or chemically supported on an insoluble carrier, or the state in which it is supported is “fixed”, “immobilized”, “solid phased” ”,“ Sensitization ”, and“ adsorption ”.
  • detection or “measurement” should be interpreted in the broadest sense including proof and / or quantification of the existence of the human BNP fragment (4-32), and should be interpreted in a limited manner in any sense. should not be done.
  • the human BNP fragment it is preferable to denature the human BNP fragment to be measured by allowing a protein denaturing treatment agent to act on the specimen. That is, after the sample is treated with a protein denaturing treatment agent, the human BNP fragment is reacted with the human BNP fragment (4-32) of the present invention and is not reacted with human full-length BNP (1-32).
  • a measuring method is preferred.
  • denaturation means changing the three-dimensional structure of the BNP fragment to expose at least a part of the inside of the protein. Any protein denaturing treatment agent may be used as long as it has a protein denaturing effect, and examples thereof include surfactants, chaotropic agents, acids, and organic solvents.
  • protein denaturing treatment agents may be used alone or in combination with a plurality of protein denaturing treatment agents.
  • the surfactant include surfactants such as an anionic surfactant, a cationic surfactant, and a nonionic surfactant, preferably an anionic surfactant, and more preferably dodecyl sulfate. Sodium (SDS) is mentioned.
  • the chaotropic agent include urea and guanidine.
  • the acid include inorganic acids and organic acids. Examples of the organic acids include acetic acid, formic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, and mixtures thereof. Acetic acid is preferred.
  • Examples of the treatment with the protein denaturing treatment agent include treatment at 15 to 100 ° C. for 1 to 60 minutes.
  • the amount of the protein denaturing treatment agent can be appropriately set according to each protein denaturing treatment agent by appropriately selecting an amount that improves the measurement sensitivity by immunoassay, but is usually 0.01% by weight at the final concentration.
  • the above is preferable, and the concentration at the time of immunoassay is preferably 0.1 wt% or less.
  • Heating is preferably performed when the protein denaturing treatment agent is allowed to act. Heating can easily promote protein denaturation. That is, the treatment conditions are preferably 60 ° C. or higher, more preferably about 100 ° C., for 5 seconds to 20 minutes, more preferably about 5 minutes to 15 minutes.
  • a reducing agent may coexist with the modifier.
  • preferred reducing agents include, but are not limited to, dithiothreitol (DTT), NaBH 4 , NaBH 3 CN and the like.
  • the concentration of the reducing agent is preferably about 0.001M to 1.0M in terms of final concentration.
  • the treatment with the reducing agent may be performed simultaneously with the treatment with the protein denaturing treatment agent, but may be performed before the protein denaturing treatment agent treatment. In this case, the reducing agent is preferably allowed to act at the above concentration at room temperature for about 20 minutes to 1 hour.
  • body fluids mainly derived from living organisms can be mentioned. Specific examples include blood (whole blood), serum, plasma, urine, saliva, sputum, pancreatic extract, tears, otorrhea or prostate fluid, but are not limited thereto.
  • the aspect of the measuring reagent provided by the present invention is not particularly limited as long as it is a reagent capable of measuring the human BNP fragment (4-32).
  • the ELISA method and immunochromatography method which are representative labeling immunoassay methods, and the latex immunoagglutination method (hereinafter referred to as LTIA method), which is a typical particle aggregation immunoassay method, will be described as examples.
  • ELISA method As an embodiment of the measuring reagent for detecting the human BNP fragment (4-32) present in the sample, the following elements: (A) a solid phase (such as a plate) on which the first monoclonal antibody is immobilized; and (b) a second monoclonal antibody labeled with a labeling substance, Can give.
  • the solid phase on which the first monoclonal antibody is immobilized captures the human BNP fragment (4-32) in the sample to form a human BNP (4-32) antibody complex.
  • the second monoclonal antibody labeled with the labeling substance reacts with the human BNP (4-32) antibody complex to form a sandwich, and by measuring the amount of the labeling substance by a method according to the labeling substance, Human BNP (4-32) in a sample can be measured.
  • Specific methods for constructing the measurement reagent such as a method for immobilizing the first monoclonal antibody on a solid phase and a method for labeling the second monoclonal antibody with a labeling substance, are described in this specification. In addition to the above methods, methods well known to those skilled in the art can be used without limitation. In the case of this configuration, it can be configured as a homogeneous measurement system, but is preferably configured as a heterogeneous measurement system.
  • ⁇ Labeled immunoassay method immunochromatographic method>
  • a sheet-like solid support such as a membrane
  • a labeled reagent site containing the labeling reagent the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance such as colloidal gold particles
  • a labeling substance such as colloidal gold particles
  • the test sample solution is continuously moved by capillary action through the capture reagent site on which the second monoclonal antibody for capturing the complex of the monoclonal antibody and human BNP (4-32) is immobilized. .
  • Human BNP (4-32) binds to a labeling reagent (including the first monoclonal antibody) to form a complex of human BNP (4-32) labeling reagent.
  • a labeling reagent including the first monoclonal antibody
  • the human BNP (4-32) labeling reagent complex develops and moves on the membrane as it is and enters the capture reagent site containing the second monoclonal antibody on the membrane, it becomes a capture reagent immobilized on the solid support.
  • Captured and a complex of capture reagent (second monoclonal antibody) -human BNP (4-32) labeling reagent (first monoclonal antibody) is formed at the capture reagent position. Then, the presence of the analyte can be determined by detecting the labeling reagent by any method (in the case of visible colloidal gold particles, the aggregated image, and in the case of enzymes, a color reaction by adding a substrate). Can do. For easy understanding, “1. Test sample supply site” and “2. Labeling reagent containing the first monoclonal antibody (the first monoclonal antibody is labeled with a labeling substance such as gold colloid particles).
  • a labeling substance such as gold colloid particles
  • the measurement reagent kit of the present invention includes a combination with a protein denaturing treatment agent.
  • conjugate solution for immunization Fragment solution containing human BNP (4-10) (10 mg / ml, dissolved in phosphate buffered saline (PBS)) and maleimide activated KLH or OVA solution (10 mg / ml) , Dissolved in PBS) was mixed at a volume ratio of 1: 1, and stirred at room temperature for 2 hours to be reacted. Then, the conjugate solution for immunization was obtained by dialyzing the reaction solution against PBS for 2 days at 4 ° C.
  • PBS protein-containing 96-well microplate
  • 50 ⁇ L of the lysate was dispensed into each well of a 96-well microplate and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • Each well was washed three times with 400 ⁇ L of PBS containing 0.05% Tween® 20 (hereinafter referred to as PBST), and then 100 ⁇ L of PBST containing 1% bovine serum albumin (hereinafter referred to as BSA-PBST) was added. Blocking was performed at room temperature for 1 hour. This was used as an ELISA plate.
  • PBST PBS containing 0.05% Tween® 20
  • BSA-PBST bovine serum albumin
  • spleen or lymph node was extracted from a mouse having a high antibody titer, and spleen-derived cells or lymph node-derived cells were prepared and used for cell fusion.
  • hybridoma antigen-immobilized ELISA method
  • the same method was performed except that the culture supernatant of the fused cells was used instead of the mouse antiserum.
  • a well having a high absorbance was selected as a well in which an anti-human BNP (4-10) antibody-producing hybridoma was present (positive well).
  • the culture supernatant of the fused cells diluted to an appropriate concentration with BSA-PBST is added onto the excised PVDF membrane and incubated at room temperature for 1 hour. Left to stand.
  • This membrane was immersed in PBST and washed with shaking, then immersed in HRP-labeled goat anti-mouse IgG ( ⁇ ) diluted 5000 times with BSA-PBST, and shaken at room temperature for 1 hour.
  • the plate was further immersed in PBST, washed with shaking, then immersed in a DAB solution (Prod # 347-00904, manufactured by Dojindo Laboratories) diluted to 0.2 mg / mL, allowed to stand for 10 minutes and then transferred to purified water to stop the reaction.
  • a DAB solution Prod # 347-00904, manufactured by Dojindo Laboratories
  • human BNP (1-32) solution and human BNP (5-32) solution were transferred, no band was detected, and when human BNP (4-32) solution was transferred
  • the well of the culture supernatant in which the band was detected was selected as a positive well for production of anti-human BNP (4-32) antibody.
  • 96201, 96204, and 96207 antibodies diluted to 0.1 ⁇ g / mL with BSA-PBST were dispensed at a rate of 25 ⁇ L / well, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Each well was washed 3 times with 400 ⁇ L PBST, and then 50 ⁇ L of HRP-labeled goat anti-mouse IgG ( ⁇ ) diluted 5000 times with BSA-PBST was dispensed into each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • each well was washed with 400 ⁇ L of PBST three times, 50 ⁇ L of citrate buffer (pH 5.0) containing 0.2% orthophenylenediamine and 0.02% hydrogen peroxide was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then, 50 ⁇ L of 4.5 N sulfuric acid was added to stop the enzyme reaction, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • citrate buffer pH 5.0
  • Test Method 4 Human BNP (4-32), human BNP (1-32) sandwich ELISA using monoclonal antibody (1) 1.
  • Each well of the ELISA plate was washed 3 times with 400 ⁇ L of PBST, and then human BNP (1-32) or human BNP (4-32) dissolved in PBS at 50 ⁇ g / mL and 1% SDS (sodium dodecyl sulfate)- 50 mM DTT (dithiothreitol)-0.2 M PB pH 8.5 was mixed at 1: 9, treated at 95 ° C for 10 minutes, and diluted with BSA-PBST to 50 ng / mL for ELISA. The plate was dispensed at 50 ⁇ L / well.
  • the ELISA plate was washed 3 times with 400 ⁇ L of PBST, and then a solution of 33236 antibody labeled with biotin that recognizes human BNP (26-32) diluted to 1 ⁇ g / mL with BSA-PBST was dispensed at 50 ⁇ L / well at room temperature. And left for 1 hour. After further washing with 400 ⁇ L of PBST three times, a solution of ImmunoPure (registered trademark) Streptavidin, HRP Conjugated (Prod # 21126 manufactured by PIERCE) diluted to 0.2 ⁇ g / mL with BSA-PBST was dispensed in 50 ⁇ L / well at room temperature. For 30 minutes.
  • Each well was washed 3 times with 400 ⁇ L of PBST and then human BNP (4-6), human BNP (4-7), human BNP (4-8), human BNP (4-9), or human BNP dissolved in PBS
  • Each synthetic peptide of (4-10) (obtained by consigning synthesis to an external supplier) was diluted to 20, 2, 0.2 ⁇ g / mL with BSA-PBST, and 25 ⁇ L / well each in an ELISA plate. Dispensed. Thereafter, the test was performed in the same manner as in [Test Example 2] “Epitope analysis of monoclonal antibody of the present invention (1)”.
  • Each well of the ELISA plate was washed with 400 ⁇ L of PBST three times and then diluted with BSA-PBST to concentrations of 10, 5, 2.5, 1.25, 0.63, 0.31, 0.16 ⁇ g / mL.
  • the human BNP (1-32) or human BNP (4-32) was dispensed into an ELISA plate at 50 ⁇ L / well.
  • the ELISA plate was washed 3 times with 400 ⁇ L of PBST, and then biotin-labeled 33236 antibody (2 ⁇ g / mL) recognizing human BNP (26-32) was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • ImmunoPure registered trademark
  • Streptavidin HRP Conjugated (Prod # 21126 manufactured by PIERCE) (0.2 ⁇ g / mL) was dispensed at 50 ⁇ L / well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • Each well was washed with 400 ⁇ L of PBST three times, 50 ⁇ L of citrate buffer (pH 5.0) containing 0.2% orthophenylenediamine and 0.02% hydrogen peroxide was added, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
  • the enzyme reaction was stopped by adding 50 ⁇ L of 5N sulfuric acid, and the absorbance at a wavelength of 492 nm was measured.
  • the value obtained by subtracting the absorbance obtained using the mouse monoclonal antibody (C) from the absorbance obtained using the 96201, 96204, or 96207 antibody was defined as the absorbance due to the reactivity of the 96201, 96204, or 96207 antibody.
  • the human BNP fragment (4-32) in the sample is specifically identified. Can be measured immunologically. Therefore, even in a sample containing BNP and various human BNP fragments, only human BNP fragment (4-32) can be immunologically measured.
  • Hybridoma 96201 producing the antibody number 96201 (A) Name and address of the depositary institution that deposited the biological material 2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818) Date of deposit of biological material at Loi depository August 18, 2016 Deposit number NITE BP-02331 attached by the depository at Hi
  • Hybridoma 96204 producing the antibody number 96204 (A) Name and address of the depositary institution that deposited the biological material 2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818) Date of deposit of biological material at Loi depository August 18, 2016 Deposit number NITE BP-02332 assigned by the depository at High
  • Hybridoma 96207 producing the antibody number 96207 (A) Name and address of the depositary institution that deposited the biological material 2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan (zip code 292-0818) Date of deposit of biological

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Abstract

本発明は、免疫測定のみで、特定のヒトＢＮＰ断片を検出し、ヒトＢＮＰ断片比率を測定することで、簡単に心疾患の診断、予測に役立つ情報を提供することを目的とし、これまで着目されていないヒトＢＮＰ断片（４－３２）を特異的抗体により測定できる方法の提供を課題とする。試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）の免疫測定方法であって、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体を用いることを特徴とする、前記免疫測定方法を提供する。また、当該抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する抗体、ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する抗体である抗体、である測定方法を提供する。

Description

抗ヒトＢＮＰ断片（４－３２）抗体を用いた免疫測定方法
　本発明は、免疫反応を利用したヒトＢＮＰ断片の測定方法及び測定試薬に関する。さらに詳しくは、抗ヒトＢＮＰ断片（４－３２）特異的抗体を用いるヒトＢＮＰ断片の測定方法及び測定試薬に関する。
　ＢＮＰは脳性ナトリウム利尿ペプチド（brain natriuretic peptide）の略で、心臓で
合成され分泌されるアミノ酸３２個よりなるホルモンである。ＢＮＰは心臓の負荷が増えたり、心筋の肥大が起こると血液中の濃度が増加することが知られている。現在、ＢＮＰは心不全の生化学的マーカーとして広く臨床現場で用いられており、ＢＮＰ濃度の測定は心疾患のスクリーニング、心不全の重症度評価、心不全に対する治療効果判定、あるいは心不全患者の予後予測指標として有用とされている。
　特許文献１、非特許文献１には、血液中のＢＮＰを測定することによる心筋虚血状態を診断する方法が開示されている。具体的には、血液試料中のＢＮＰおよびそれのプロセシング産物（ヒトＢＮＰ断片（３－３２）、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）、ヒトＢＮＰ断片（５－３２）等）を特異的抗体で選択的に濃縮し、その後、質量分析計で各プロセシング産物を検出し、特定のプロセシング産物の比と再狭窄の有無との関係を明らかにしている。
　また、特許文献２には、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）と反応するが、全長のヒトＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰとは反応しないという特徴を有するヒトＢＮＰ（３－３２）に特異的な抗体を用いて、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）を特異的に測定する方法が開示されている。そして、当該方法によれば高血圧や心機能・腎機能の診断など、ヒトＢＮＰ（３－３２）の増減を指標とする疾病の診断の有用性について示唆している。
国際公開ＷＯ２０１０／０２３７４９号パンフレット 特開２０１４－９１７１９号公報
Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５９：９（２０１３），ｐ１－８
　特許文献１、非特許文献１の方法では、ヒトＢＮＰ（１－３２）、ＢＮＰ（３－３２）、ＢＮＰ（４－３２）、ＢＮＰ（５－３２）のいずれにも反応する抗体を用いて、試料中のＢＮＰ断片の濃縮を行い、その後、質量分析に供し、得られたＭＳスペクトルのシグナル強度比からそれぞれの存在比率を算出している。したがって、本方法では質量分析計の使用により各ＢＮＰ断片を区別して検出することから、装置構成が大掛かりとなり、操作も複雑であり、大量の検体を迅速に処理するには不向きである。
　特許文献２の方法では、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）に反応するが全長のヒトＢＮＰ及びヒトプロＢＮＰとは反応しない抗体について開示されている。しかし、当該抗体が、他の断片であるヒトＢＮＰ（４－３２）、ＢＮＰ（５－３２）と反応するのかどうか、すなわち、ヒトＢＮＰ断片のうち、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）のみと特異的に反応するのかどうかについては開示されていない。また、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）以外の断片を特異的に検出できる抗体については記載も示唆もされていない。
　以上のとおり、これまで、ＢＮＰおよびＢＮＰ断片を免疫アッセイのみにより測定できる方法は確立されていない。
　本発明は、免疫アッセイのみで、各種ヒトＢＮＰ断片を検出し、ヒトＢＮＰ断片比率を測定することで、簡単に心疾患の診断、予測に役立つ情報を提供することを目的とし、これまで着目されていないヒトＢＮＰ断片（４－３２）を特異的抗体により測定できる方法の提供を課題とする。
　上記課題を解決するために、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のみを特異的に検出できる抗体の探索について鋭意検討を行ったところ、初めて当該抗体を複数取得することに成功し、当該抗体を用いて試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）の特異的な検出を実証し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）の免疫測定方法であって、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体を用いることを特徴とする、前記免疫測定方法。
＜２＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する抗体である＜１＞に記載の免疫測定方法。
＜３＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する抗体である＜１＞又は＜２＞に記載の免疫測定方法。
＜４＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、モノクローナル抗体である＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の免疫測定方法。
＜５＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）の免疫測定試薬であって、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体を用いることを特徴とする、前記免疫測定試薬。
＜６＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する抗体である＜５＞に記載の免疫測定試薬。
＜７＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する抗体である＜５＞又は＜６＞に記載の免疫測定試薬。
＜８＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、モノクローナル抗体である＜５＞～＜７＞のいずれかに記載の免疫測定試薬。
＜９＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体。
＜１０＞
ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する＜９＞に記載の抗体。
＜１１＞
ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する＜９＞又は＜１０＞に記載の抗体。
＜１２＞
モノクローナル抗体である＜９＞～＜１１＞のいずれかに記載の抗体。
　本発明によれば、試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）を特異的に免疫学的に測定することができる。したがって、ＢＮＰおよび各種のヒトＢＮＰ断片が存在する試料においても、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のみを免疫学的に測定することができる。また、本発明の抗体以外の各断片を特異的に検出できる抗体と組み合わせることにより、各断片の存在比率を免疫学的に測定することができ、当該比率を指標とするような疾病の予測の実現に貢献できる。
本発明の３種類の抗体と各濃度の合成ペプチド（ＢＮＰ（１－３２）、ＢＮＰ（３－１０）、ＢＮＰ（４－１０）、ＢＮＰ（５－１０））との反応性を競合ＥＬＩＳＡ法により確認した結果を示すグラフである。１Ａ：９６２０１抗体、１Ｂ：９６２０４抗体、１Ｃ：９６２０７抗体 各抗体と各合成ペプチド（（１）ＢＮＰ（１－３２）、（２）ＢＮＰ（４－３２）、（３）ＢＮＰ（５－３２））との反応性をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す電気泳動パターンである。２Ａ：本発明の３種類の抗体（９６２０１抗体、９６２０４抗体、９６２０７抗体）２Ｂ：ヒトＢＮＰの環状部位を認識する抗体（Ａ）２Ｃ：ネガテイブコントロールとしてのＩｇＧ抗体（Ｂ） 各抗体の組み合わせによるヒトＢＮＰ（１－３２）とヒトＢＮＰ断片（４－３２）に対する反応性について、それぞれサンドイッチＥＬＩＳＡ法により確認した結果を示すグラフである。１次抗体：本発明の抗体９６２０７抗体、２次抗体：ヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識する抗体３３２３６抗体 各抗体の組み合わせによるヒトＢＮＰ断片（４－３２）に対する反応性について、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）濃度を変えてサンドイッチＥＬＩＳＡ法により確認した結果を示すグラフである。１次抗体：本発明の抗体９６２０７抗体、２次抗体：ヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識する抗体３３２３６抗体 本発明の３種類の抗体と各濃度の合成ペプチド（ＢＮＰ（４－６）、ＢＮＰ（４－７）、ＢＮＰ（４－８）、ＢＮＰ（４－９）、ＢＮＰ（４－１０））との反応性を競合ＥＬＩＳＡ法により確認した結果を示すグラフである。５Ａ：９６２０１抗体、５Ｂ：９６２０４抗体、５Ｃ：９６２０７抗体 各抗体と各合成ペプチド（（１）ＢＮＰ（１－３２）、（２）ＢＮＰ（３－３２）（３）ＢＮＰ（４－３２）、（３）ＢＮＰ（５－３２））との反応性をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す電気泳動パターンである。６Ａ：本発明の３種類の抗体（９６２０１抗体、９６２０４抗体、９６２０７抗体）６Ｂ：ヒトＢＮＰの環状部位を認識する抗体（Ａ）６Ｃ：ネガテイブコントロールとしてのＩｇＧ抗体（Ｂ） 各抗体の組み合わせによるヒトＢＮＰ断片（４－３２）及び（１－３２）に対する反応性について、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）及び（１－３２）の各濃度を変えてサンドイッチＥＬＩＳＡ法により確認した結果を示すグラフである。７Ａ　１次抗体：本発明の抗体９６２０１抗体、２次抗体：ヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識する抗体３３２３６抗体、７Ｂ　１次抗体：本発明の抗体９６２０４抗体、２次抗体：ヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識する抗体３３２３６抗体、７Ｃ　１次抗体：本発明の抗体９６２０７抗体、２次抗体：ヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識する抗体３３２３６抗体
　本明細書中、ヒトＢＮＰまたはヒトＢＮＰ断片（合わせてヒトＢＮＰ等ということがある）と「反応する」、「認識する」、「結合する」、「交差反応性を示す」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体がヒトＢＮＰ等の抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance
）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。
　本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体がある化合物と実質的に反応しないことをいい、「実質的に反応しない」とは、例えば、上記ＥＬＩＳＡ法に基づき、本発明の抗体を固定化して測定を行った場合に、本発明の抗体の反応性の増強が認められないことをいう。詳細には、抗体と化合物との反応性が、コントロール（化合物非添加）の反応性と比べて有意な差がないことをいう。上記ＥＬＩＳＡ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できるのはいうまでもな
い。
　本発明において、ヒトＢＮＰ（１－３２）は、３２アミノ酸からなるヒト成熟Ｂ型ナトリウム利尿ホルモンであり、７番目と２３番目のアミノ酸に存在するシステイン残基による分子内ジスルフィド結合によって１７アミノ酸からなる環状部、９アミノ酸からなるＮ末端部、および６アミノ酸からなるＣ末端部から構成される。また、１０８アミノ酸からなるヒトＢ型ナトリウム利尿ホルモン前駆体（ヒトｐｒｏＢＮＰということがある）のアミノ酸配列７７－１０８位に相当する。
　本発明のＢＮＰ断片（３－３２）は、ＢＮＰ（１－３２）のＮ末端の２アミノ酸（大文字表記でＳＰ）がプロセスされて生じる断片であり、ＢＮＰ断片（４－３２）は、ＢＮＰ（１－３２）のＮ末端の３アミノ酸（ＳＰＫ）がプロセスされて生じる断片であり、ＢＮＰ断片（５－３２）は、ＢＮＰ（１－３２）のＮ末端の４アミノ酸（ＳＰＫＭ）がプロセスされて生じる断片である。なお、本明細書において、特に断らない限り、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）の様な記載とヒトＢＮＰ（４－３２）のような記載は同義で使用している。
　本発明の抗体は、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）とは反応しない抗体である。好ましくは、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する抗体であり、ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する抗体である。さらに好ましくは、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）のいずれとも反応しない抗体である。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。
　モノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマ９６２０１（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３３１）、９６２０４（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３３２）、９６２０７（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３３３）により産生されるモノクローナル抗体（以下、それぞれ、９６２０１抗体、９６２０４抗体、９６２０７抗体ということがある）が挙げられ、さらに、９６２０１抗体、９６２０４抗体、９６２０７抗体と交差反応性を有するモノクローナル抗体又は競合するモノクローナル抗体も本発明の抗体の範囲に含まれる。９６２０１抗体、９６２０４抗体、９６２０７抗体には、当該抗体と同一のエピトープ(抗原決定基)のアミノ酸配列（ヒトＢＮＰ（４－１０））を特異的に認識しうる抗体が含まれる。９６２０１抗体、９６２０４抗体、９６２０７抗体と競合するモノクローナル抗体には、ヒトＢＮＰ（４－１０）に対して当該抗体と競合するモノクローナル抗体が含まれ、競合阻害の程度は、５０％以上、好ましくは、８０％以上、更に好ましくは、９０％以上である。
　本発明の抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものや、キメラ抗体を用いることも可能である。抗体の機能性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられ、これらの機能性断片は前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。
　本発明のモノクローナル抗体の製造には、ヒトＢＮＰ（４－３２）のＮ末端を含むペプチドを合成したものを抗原（免疫原）として用いる。Ｎ末端を含むペプチドであれば特に限定はされず、例えばヒトＢＮＰの４－２６位のアミノ酸残基に相当するペプチド、もしくはヒトＢＮＰ断片（４－３２）をそのまま用いてもよい。具体的には、ヒトＢＮＰ（４－３２）のＮ末端、好ましくはヒトＢＮＰの４－１０位のアミノ酸残基に相当するペプチド（以下、ヒトＢＮＰ（４－１０）とする）をリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することにより製造できる。免疫原性を高めるために牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、オブアルブミン（ＯＶＡ）、またはキーホールリンペットヘ
モシアニン（ＫＬＨとする）などと結合させ、得られたコンジュゲートに必要に応じて適宜アジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。
　免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができ、より好ましくはマウスを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。
　モノクローナル抗体を得る場合、引き続き以下の操作が行われるが、それらの操作に限定されることはなく、モノクローナル抗体それ自体の製造方法については、例えば、Antibodies, A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1988)）に記載
の方法に準じて行うことができる。
　最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有するミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い細胞を用いることが好ましく、またミエローマ細胞は融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。
　ハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮し、選択の段階で効率的に行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウエスタンブロッティング等により、ヒトＢＮＰ断片に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。具体的には、単一のハイブリドーマを培養して生産される培養上清をさらに、ヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（５－３２）を検出用抗原サンプルとして用いたウエスタンブロッティングにより、ヒトＢＮＰ（４－３２）のみを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。もしくは、ヒトＢＮＰ（３－１０）、ヒトＢＮＰ（４－１０）、ヒトＢＮＰ（５－１０）、ヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（３－３２）、ヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（５－３２）などを用いた競合ＥＬＩＳＡにより、得ることもできる。
　このようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。
　このようにして本発明では、モノクロ－ナル抗体９６２０１、９６２０４、９６２０７を得た。この抗体は、後述の実施例に示される通り、ヒトＢＮＰ（４－１０）と反応するが、ヒトＢＮＰ（３－１０）、ヒトＢＮＰ（５－１０）とは反応しないことから、ヒトＢＮＰ（４－３２）のＮ末端を含む部位に特異的な抗体である。
　本発明はさらに、検体を蛋白質変性処理剤で処理した後、上記ヒトＢＮＰ（４－３２）に特異的な抗体（第１のモノクローナル抗体）と、ヒトＢＮＰ（４－３２）の認識部位が第１のモノクローナル抗体とは異なる抗体（第２の抗体）を用いて、ヒトＢＮＰ（４－３２）を測定する方法を提供することができる。
　第２の抗体としては、抗血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またキメラ抗体や免疫学的特性を保持する抗体断片でもよい。中でもモノクロ－ナル抗体が好ましく、例えば、ヒトＢＮＰのＣ末端領域の７残基のペプチドをマウスに免疫することにより、当業者がモノクローナル抗体を製造するために通常行う方法（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、第２５６巻４９５頁（１９７５年）等）により得られたヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識する抗ヒトＢＮＰ（２６－３２）モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ＃３３２３６）が挙げられる。また、例えば、ヒトＢＮＰの環状部位を認識するモノクローナル抗体を用いてもよい。
　第１または第２のモノクローナル抗体は、いずれか、あるいは両方を不溶性担体上に固定された固定（固相）化抗体として使用したり、後述する当業者に周知慣用の標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。例えば、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してもよい）させることにより固定化抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは微粒子状（例えば、ラテックス粒子、金コロイド粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。
　本発明の第１または第２のモノクローナル抗体と結合可能な標識抗体、標識プロテインＡ又は、標識プロテインＧ等を用いることにより、試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）を測定することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができるが、固定化抗体や標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は前記の例に限定されることはない。例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素を標識物質として用いる場合にはその酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）の場合には、例えばＯ－フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤという）あるいは３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン、ＡＬＰの場合には、ｐ－ニトロフェニル・ホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。
　本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。また、「検出」又は「測定」という用語は、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）の存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解
釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。
　本発明の方法では、検体にタンパク質変性処理剤を作用させて測定対象のヒトＢＮＰ断片を変性させることが好ましい。すなわち、検体をタンパク質変性処理剤で処理した後、本発明のヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）とは反応しない抗体を用いてヒトＢＮＰ断片を測定する方法が好ましい。
　ここで、「変性」とは、該ＢＮＰ断片の三次元構造を変化させてタンパク質の内側の少なくとも一部を露出させることを意味する。タンパク質変性処理剤としては、タンパク質の変性効果を有するものであればよく、例えば、界面活性剤、カオトロピック剤、酸、有機溶媒が挙げられる。これらのタンパク質変性処理剤は単独で用いてもよいし、複数のタンパク質変性処理剤を併用してもよい。
　上記界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤等の界面活性剤が挙げられ、好ましくは、陰イオン界面活性剤、更により好ましくは、硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
　上記カオトロピック剤としては、尿素、グアニジン等が上げられる。
　上記酸としては、無機酸、有機酸が挙げられ、有機酸としては酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸およびその混合物などが挙げられる。好ましくは酢酸である。
　タンパク質変性処理剤による処理としては、例えば、１５℃～１００℃で１分～６０分処理が挙げられる。
　タンパク質変性処理剤の使用量は、免疫測定による測定感度が向上する量を適宜選択することにより、各タンパク質変性処理剤に応じて適宜設定することができるが、通常終濃度で０．０１重量％以上が好ましく、免疫測定時の濃度で０．１重量％以下となることが好ましい。
　タンパク質変性処理剤を作用させる際には、加熱することが好ましい。加熱により、タンパク質の変性を容易に促進させることができる。すなわち、処理条件としては、６０℃以上、より好ましくは約１００℃で、５秒～２０分、より好ましくは５分～１５分程度が好ましい。
　また、変性剤とともに還元剤を共存させてもよい。好ましい還元剤の例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ　等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、還元剤の濃度は、終濃度で０．００１Ｍ～１．０Ｍ程度が好ましい。なお、還元剤による処理は、タンパク質変性処理剤による処理と同時に行ってもよいが、タンパク質変性処理剤処理の前に行なってもよい。この場合には、上記還元剤を上記濃度で室温で２０分間～１時間程度作用させることが好ましい。
　本発明の抗体を用いる測定方法における検出対象の「試料」としては、主に生体（生物）由来の体液を挙げることができる。具体的には、血液（全血）、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、膵臓抽出液、涙液、耳漏又は前立腺液などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明により提供される測定用試薬の態様としては、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）の測定ができる試薬であれば、特に限定されるものではない。以下、代表的な標識イムノアッセイ法であるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフ法と、代表的な粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法という）を例にそれぞれを説明する。
＜標識イムノアッセイ法：ＥＬＩＳＡ法＞
　試料中に存在するヒトＢＮＰ断片（４－３２）を検出するための測定用試薬の態様として、以下の要素：
（ａ）第１のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）、及び
（ｂ）標識物質で標識された第２のモノクローナル抗体、
をあげることができる。
　第１のモノクローナル抗体を固定化した固相は、試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）を捕捉してヒトＢＮＰ（４－３２）抗体複合体を形成する。標識物質で標識された第２のモノクローナル抗体は、当該ヒトＢＮＰ（４－３２）抗体複合体に反応してサンドイッチを形成し、標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中のヒトＢＮＰ（４－３２）を測定することができる。第１のモノクローナル抗体の固相への固定化の方法、第２のモノクローナル抗体の標識物質での標識の方法など、測定試薬を構成する上での具体的な方法は本明細書中に記載された方法のほか、当業者に周知の方法を制限なく使用することができる。この構成の場合、ホモジーニアスな測定系として構成することもできるが、ヘテロジーニアスな測定系として構成することが好ましい。
　また、測定用試薬の感度や特異性を考慮して、
（ａ）標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体、及び
（ｂ）第２のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）、
という上記とは逆の構成を採用することもできる。
　この構成の場合、被検試料と標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体含有溶液を混合し、予めヒトＢＮＰ（４－３２）抗体複合体を溶液中で形成させておき、第２のモノクローナル抗体を固定化した固相に添加することが好ましい。
＜標識イムノアッセイ法：イムノクロマトグラフ法＞
　一般的なイムノクロマトグラフ法では、メンブレンなどのシート状の固相支持体上、長さ方向に対して、端から順番に「１．被検試料供給部位」、「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」、「３．標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体とヒトＢＮＰ（４－３２）の複合体を捕捉するための第２のモノクローナル抗体を固定化した捕捉試薬部位」を被検試料溶液が毛細管現象により連続的に移動するよう構成されている。
具体的には、まず、ヒトＢＮＰ（４－３２）を含む被検試料を被検試料供給部位に所定量添加すると、試料が固相支持体を展開移動する過程で標識試薬部位に侵入し、ヒトＢＮＰ（４－３２）が標識試薬（第１のモノクローナル抗体を含む）と結合しヒトＢＮＰ（４－３２）標識試薬の複合体が形成される。ヒトＢＮＰ（４－３２）標識試薬複合体はそのままメンブレン上を展開移動し、メンブレン上の第２のモノクローナル抗体を含む捕捉試薬部位に侵入すると、固相支持体上に固定化された捕捉試薬に捕捉され、捕捉試薬（第２のモノクローナル抗体）－ヒトＢＮＰ（４－３２）標識試薬（第１のモノクローナル抗体）の複合体が捕捉試薬位置に形成される。そして、標識試薬を任意の方法（可視可能な金コロイド粒子の場合はその凝集像、酵素の場合は基質を添加することによる発色反応）で検出することで、被分析物質の存在を判定することができる。
　なお、理解を容易にするため、「１．被検試料供給部位」と「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」を、独立して被検試料の移動方向順に記載したが、上から「１」、「２」の順で積み上げられた構造など、当業者に周知の態様・構成が採用されうることを当業者は当然に理解することができる。
　また、本発明の測定試薬キットとしては、上記の基本的な試薬構成に加えて、タンパク質変性処理剤との組み合わせなどが挙げられる。
　以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔試験例１〕本発明のモノクローナル抗体の製造方法
１．合成ペプチドの調製
（１）ヒトＢＮＰ断片（以下、ヒトＢＮＰと略す）（４－１０）、ヒトＢＮＰ（３－１０）、ヒトＢＮＰ（５－１０）
　　外部業者にペプチド合成を委託した。
（２）ヒトＢＮＰ（４－３２）
　　外部業者にペプチド合成を委託した。
２．その他の材料
（１）フロインド完全アジュバント：和光純薬工業社製，０１４－０９５４１
（２）ミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ）
（３）ＲＰＭＩ１６４０, ＧｌｕｔａＭＡＸ：ＧＩＢＣＯ社製，６１８７０－０３６
（４）Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ （ＦＢＳ）：ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４－００１－１Ａ
（５）ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ）：ＳＩＧＭＡ,Ｐ７３０６
（６）ＨＡＴ 培地：コスモバイオ社製，１６２１３００４
（７）９６穴プレート：ＮＵＮＣ,１６７００８
（８）ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）抗体：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製，１０３０－０５
３．免疫用コンジュゲート液の調製
　ヒトＢＮＰ（４－１０）を含むフラグメント溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＫＬＨもしくはＯＶＡ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで溶解したもの）を、体積比で１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することにより、免疫用コンジュゲート液を得た。
４．抗ヒトＢＮＰ（４－３２）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
（１）動物への免疫
　前記免疫用コンジュゲート液（０．２～１ｍｇ／ｍｌ）とフロインド完全アジュバンドを等量ずつ混合して調製したエマルジョンを用い、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下もしくはフットパッドに１匹あたり２０～３０μｇを注射した。さらに、１週間の間隔で７～８回、該エマルジョンの注射を繰り返した。マウス尾部静脈より採血して得た抗血清中の抗体価を、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（２）１次スクリーニング（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
　前記マウス抗血清中の抗ヒトＢＮＰ（４－１０）抗体の存在を、免疫用コンジュゲート液と同様の方法で作製した、ヒトＢＮＰ（４－１０）とＢＳＡとのコンジュゲート液を固相化したＥＬＩＳＡ法（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）で確認した。抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の詳細は以下である。
（２－１）抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
　ヒトＢＮＰ（４－１０）とＢＳＡとのコンジュゲート液を１μｇ／ｍＬになるよう、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）に溶解し、該溶解液５０μＬを９６穴マイクロプレートの各ウェルに分注して、４℃で１晩静置した。
　前記各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬで３回洗浄した後、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳＴという）１００μＬを加え、室温で１時間ブロッキングを行った。これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。
（２－２）抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
　前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５００倍から１３５００倍に希釈したマウス抗血清５０μＬを前記各ウェルに添加し、室温で１時間静置した。　前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。測定の結果、抗体価の高かったマウスから、脾臓もしくはリンパ節を摘出して、脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞を調製し、細胞融合に用いた。
（３）細胞融合
　前記脾臓由来細胞もしくはリンパ節由来細胞のいずれかとミエローマ細胞を細胞数で６対１の割合で混合し、ＰＥＧを添加して細胞融合させた。該融合させた細胞をＨＡＴ培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃、５％ＣＯ２にて８日間培養して、融合細胞（ハイブリドーマ）を得た。　
（４）ハイブリドーマの選別　（抗原固相化ＥＬＩＳＡ法）
　上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法において、マウス抗血清の代わりに融合細胞の培養上清を用いた以外は、同様の方法を行った。測定の結果、吸光度の高いウェルを抗ヒトＢＮＰ（４－１０）抗体産生ハイブリドーマの存在するウェル（陽性ウェル）として選択した。
（５）２次スクリーニング（ウエスタンブロッティング）
　上述の１次スクリーニングで選択した抗体産生細胞を培養し、その培養上清を用いて抗ＢＮＰ（４－３２）抗体産生細胞の２次スクリーニングとしてウエスタンブロッティングで更に選別した。
　先ず、ＰＢＳにヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（５－３２）を６０μｇ／ｍＬに溶解し、メルカプトエタノール含有のＳＤＳ処理液（コスモバイオ社製　Ｐｒｏｄ＃４２３４３７）と１：１で混和後、９５℃で１０分間処理した。次いでこの溶液をマルチゲルミニII（コスモバイオ社製　Ｐｒｏｄ＃４２４９１６）の各ｌａｎｅに１０μＬずつ添加し、定法どおりにＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。続いて泳動後のゲルをセミドライブロッティング試薬の陰極液に浸して約１０分間振とう後、セミドライブロッティング装置を用いて定法どおりにＰＶＤＦ膜（コスモバイオ社製　Ｐｒｏｄ＃４２３５３６）に転写を行った。ＰＶＤＦ膜を切り分けた後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴに１時間浸してブロッキングしたのち、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで適当な濃度に希釈した融合細胞の培養上清を、切り分けたＰＶＤＦ膜上に添加し、室温で１時間静置した。この膜をＰＢＳＴに浸して振とう洗浄後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）に浸し、室温で１時間振とうした。更にＰＢＳＴに浸して振とう洗浄後、０．２ｍｇ／ｍＬに希釈したＤＡＢ溶液（同仁化学研究所製　Ｐｒｏｄ＃３４７－００９０４）に浸し、１０分間静置後に精製水に移して反応を停止した。ＤＡＢによる検出の結果、ヒトＢＮＰ（１－３２）溶液及びヒトＢＮＰ（５－３２）溶液を転写した場合にはバンドが検出されず、且つヒトＢＮＰ（４－３２）溶液を転写した場合にはバンドが検出される培養上清のウェルを、抗ヒトＢＮＰ（４－３２）抗体産生の陽性ウェルとして選択した。
（６）クローニング及びモノクローナル抗体採取
　上述の１次スクリーニング及び２次スクリーニングで選択された抗ヒトＢＮＰ（４－３２）抗体産生株ハイブリドーマを用いて、ハイブリドーマの単クローン化とモノクローナル抗体の精製を行った。　
　単クローン化は定法（限界希釈法）で行い、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法で陽性ウェルを選別し、最終的に３種の抗ヒトＢＮＰ（４－３２）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。　各細胞の約１０５個をプリスタン前処理したマウス腹腔に投与し、生成した腹水をそれぞれ採取した。採取した各腹水から遠心分離により不溶物を除去し、等量の飽和硫安液を加え、撹拌しながら１晩放置後、遠心分離で沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、同緩衝液で透析した。透析内容物それぞれを同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ－セファロースカラムに別個に吸着させた後、それぞれ同緩衝液中の塩化ナトリウム０～３００ｍＭの濃度勾配で溶出させて得たＩｇＧ画分を５０ｍＭグリシン緩衝液で透析して、３種の抗体を得た。
〔試験例２〕本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析（１）
１．試験方法
　９６２０１、９６２０４、９６２０７抗体と反応するヒトＢＮＰ（４－３２）のエピトープを、以下に記述する競合ＥＬＩＳＡにより決定した。先ず、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法でＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＰＢＳに溶解したヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（３－１０）、ヒトＢＮＰ（４－１０）、ヒトＢＮＰ（５－１０）をＢＳＡ－ＰＢＳＴで２０、２、０．２μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡ用プレートに２５μＬ／ウェルずつ分注した。
　次いで、その上からＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．１μｇ／ｍＬに希釈した９６２０１、９６２０４、９６２０７抗体を２５μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）を５０μＬ前記各ウェルに分注し、室温で１時間静置した。　更に前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間静置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
２．試験結果
　結果を図１に示す。図１によれば、ヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（３－１０）またはヒトＢＮＰ（５－１０）を添加したときは、吸光度の減少は観察されなかった。一方、ヒトＢＮＰ（４－１０）を添加したときは、濃度依存的に吸光度が減少した。この測定系では、吸光度は、プレートに固相化したヒトＢＮＰ（４－１０）とＢＳＡとのコンジュゲートに結合した抗体の量に依存する。つまり、ヒトＢＮＰ（４－１０）の添加により蛍光強度が減少するということは、溶液中の遊離のヒトＢＮＰ（４－１０）が、９６２０１、９６２０４、９６２０７抗体と固相化したコンジュゲートとの結合を阻害することを示している。従って、９６２０１、９６２０４、９６２０７抗体は、ヒトＢＮＰ（４－１０）のＮ末端を含む部位を認識することが明らかとなった。
〔試験例３〕本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析（２）
１．試験方法
　９６２０１、９６２０４、９６２０７抗体のエピトープを、上述のウエスタンブロッティングにより解析した。具体的には、上述のウエスタンブロッティングにおいて、融合細胞の培養上清の代わりに以下の抗体を用いた以外は、同様の方法を行った。すなわち、上述の方法でヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（５－３２）をＰＶＤＦ膜へ転写し、ブロッキングを行った後、本発明の抗体（モノクローナル抗体９６２０１、９６２０４、９６２０７）、ヒトＢＮＰの環状部位を認識する抗体（モノクローナル抗体（Ａ））、ヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（５－３２）を認識しない陰性コントロールとする抗体（モノクローナル抗体（Ｂ））を、それぞれＢＳＡ－ＰＢＳＴで５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を、切り分けたＰＶＤＦ膜上に添加した。
２．試験結果
　結果を図２に示す。図２によれば、９６２０１、９６２０４、９６２０７抗体は、ヒトＢＮＰ（１－３２）及びヒトＢＮＰ（５－３２）とは反応せず、ヒトＢＮＰ（４－３２）のみに特異的に反応することが判明した。
〔試験例４〕モノクロ－ナル抗体を用いたヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（１－３２）のサンドイッチＥＬＩＳＡ（１）
１．試験方法
　ＰＢＳに９６２０７抗体を５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を９６穴マイクロプレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、４℃で１晩静置した。次いで各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴ１００μＬを加えて室温で１時間ブロッキングを行い、これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＰＢＳに５０μｇ／ｍＬに溶解したヒトＢＮＰ（１－３２）もしくはヒトＢＮＰ（４－３２）と、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－５０ｍＭ　ＤＴＴ（ジチオスレイトール）－０．２Ｍ　ＰＢ　ｐＨ８．５処理液とを１：９で混和し、これを９５℃で１０分間処理したのち、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで５０ｎｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注した。該ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識するビオチン標識化した３３２３６抗体をＢＳＡ－ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。更にＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄後、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｕｒｅ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＨＲＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＰＩＥＲＣＥ社製　Ｐｒｏｄ＃２１１２６）をＢＳＡ－ＰＢＳＴで０．２μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で３０分間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
２．試験結果
　結果を図３に示す。図３によれば、ヒトＢＮＰ（４－３２）を添加した場合は、ヒトＢＮＰ（１－３２）を添加した場合に比べて、非常に高い吸光度を示した。これは、固相化した９６２０７抗体は、変性及び還元処理したヒトＢＮＰ（４－３２）と結合するが、ヒトＢＮＰ（１－３２）と結合しないことを示している。すなわち、９６２０７抗体は、ヒトＢＮＰ（４－３２）に特異的な抗体であり、本抗体を使用することでヒトＢＮＰ（４－３２）と特異的な測定法を構築できることが明らかとなった。なお、変性または還元処理を行わない場合には、ヒトＢＮＰ（１－３２）、（４－３２）のいずれでも発色が確認されなかった（結果図示せず）。このことは、ヒトＢＮＰ（４－３２）における抗体の結合部位が、変性または還元処理により抗体に認識されやすい状態になったことを示唆するものであり、ヒトＢＮＰ（４－３２）の特異的な測定には、変性または還元処理が有用であることを示すものといえる。
〔試験例５〕モノクロ－ナル抗体を用いたヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（１－３２）のサンドイッチＥＬＩＳＡ（２）
１．試験方法
　前述のサンドイッチＥＬＩＳＡ（１）と同様にしてＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＰＢＳに２００μｇ／ｍＬに溶解したヒトＢＮＰ（４－３２）と、１％ＳＤＳ　－０．２Ｍ　ＰＢ　ｐＨ８．５処理液とを１：９で混和し、これを９５℃で１０分間処理したのち、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで２００、１００、５０、２５、１２．５ｎｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注した。
２．試験結果
　結果を図４に示す。図４によれば、１％ＳＤＳで処理を施したヒトＢＮＰ（４－３２）を添加した場合、ヒトＢＮＰ（４－３２）の濃度に依存して高い吸光度を示したことから、ヒトＢＮＰ（４－３２）に変性処理を施すことで、高い感度を得られることが明らかとなった。
〔試験例６〕本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析（３）
１．試験方法
９６２０１、９６２０４、及び９６２０７抗体と反応するヒトＢＮＰ（４－３２）のエピトープを詳細に絞り込むため、競合ＥＬＩＳＡを実施した。先ず、上述の抗原固相化ＥＬＩＳＡ法と同様の方法でＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＰＢＳに溶解したヒトＢＮＰ（４－６）、ヒトＢＮＰ（４－７）、ヒトＢＮＰ（４－８）、ヒトＢＮＰ（４－９）、またはヒトＢＮＰ（４－１０）の各合成ペプチド（いずれも外部業者に合成を委託して得た）を、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで２０、２、０．２μｇ／ｍＬに希釈してＥＬＩＳＡ用プレートに２５μＬ／ウェルずつ分注した。以降は、〔試験例２〕“本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析（１）”と同様の方法で行った。
２．試験結果
　結果を図５に示す。図５Ａ及びＣによれば、９６２０１及び９６２０７抗体については、ヒトＢＮＰ（４－６）、ヒトＢＮＰ（４－７）、ヒトＢＮＰ（４－８）、またはヒトＢＮＰ（４－９）を添加したときは吸光度の減少は観察されず、ヒトＢＮＰ（４－１０）を添加した場合に限り、濃度依存的に吸光度が減少した。従って、９６２０１及び９６２０７抗体は、ヒトＢＮＰ（４－３２）のＮ末端から７番目のアミノ酸を含む部位を認識することが明らかとなった。一方で、図５Ｂによれば、９６２０４抗体については、いずれのペプチド抗原を添加した場合においても濃度依存的に吸光度が減少した。従って、９６２０４抗体は、ヒトＢＮＰ（４－３２）のＮ末端から３番目のアミノ酸を含む部位を認識することが明らかとなった。
〔試験例７〕本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析（４）
１．試験方法
　９６２０１、９６２０４、及び９６２０７抗体のエピトープを、上述のウエスタンブロッティングによって更に解析した。具体的には、ヒトＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ（３－３２）、ヒトＢＮＰ（４－３２）、及びヒトＢＮＰ（５－３２）を用いた以外は、〔試験例３〕“本発明のモノクローナル抗体のエピトープ分析（２）”と同様の方法で行った。
２．試験結果
　結果を図６に示す。図６によれば、９６２０１、９６２０４、及び９６２０７抗体は、ヒトＢＮＰ（１－３２）、ＢＮＰ（３－３２）、及びヒトＢＮＰ（５－３２）とは反応せず、ヒトＢＮＰ（４－３２）のみに特異的に反応することが明らかとなった。
〔試験例８〕モノクロ－ナル抗体を用いたヒトＢＮＰ（４－３２）、ヒトＢＮＰ（１－３２）のサンドイッチＥＬＩＳＡ（３）
１．試験方法
　ＰＢＳに９６２０１、９６２０４、９６２０７抗体、またはヒトＢＮＰ（１－３２）とヒトＢＮＰ（４－３２）のいずれにも反応しない抗体（マウスモノクローナル抗体（Ｃ））を５μｇ／ｍＬに希釈した。この溶液を９６穴マイクロプレートに５０μＬ／ウェルずつ分注して、４℃で１晩静置した。次いで各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴ１００μＬを加えて室温で１時間ブロッキングを行い、これをＥＬＩＳＡ用プレートとした。前記ＥＬＩＳＡ用プレートの各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ＢＳＡ－ＰＢＳＴで１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６μｇ／ｍＬの各濃度に希釈したヒトＢＮＰ（１－３２）またはヒトＢＮＰ（４－３２）を、ＥＬＩＳＡ用プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注した。該ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、ヒトＢＮＰ（２６－３２）を認識するビオチン標識３３２３６抗体（２μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄後、Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｕｒｅ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＨＲＰ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＰＩＥＲＣＥ社製　Ｐｒｏｄ＃２１１２６）（０．２μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルずつ分注し、室温で３０分間静置した。前記各ウェルをＰＢＳＴ４００μＬで３回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）５０μＬを加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｎ硫酸５０μＬを加えて酵素反応を停止させ、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。９６２０１、９６２０４、または９６２０７抗体を用い得られた吸光度から、マウスモノクローナル抗体（Ｃ）を用い得られた吸光度を差し引いた数値を、９６２０１、９６２０４、または９６２０７抗体の反応性による吸光度とした。
２．試験結果
　結果を図７に示す。図７によれば、ヒトＢＮＰ（４－３２）を添加した場合は、ヒトＢＮＰ（１－３２）を添加した場合に比べて、非常に高い吸光度を示し、特に９６２０７抗体において顕著であった。更に、ヒトＢＮＰ（４－３２）では濃度依存的に反応性の上昇が認められた。従って、ヒトＢＮＰ（４－３２）に特異的な測定法を構築できることが明らかとなった。なお、本試験例では、ヒトＢＮＰ（４－３２）の変性または還元処理を行っていないが、反応させる抗原量を試験例４あるいは試験例５よりも増量している。このことは、ヒトＢＮＰ（４－３２）における抗体の結合部位が、変性または還元処理により抗体に認識されやすい状態になるものであるが、変性または還元処理が無い場合でも、抗体の結合を完全に妨害するような状態にあるわけではないことを示唆するものといえる。従来、ヒトＢＮＰ（４－３２）に対する抗体取得の報告がなかった理由は、この点の見過ごしにあったことが考えられる。
　本発明の抗体は、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）とは反応しない抗体であるから、試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）を特異的に免疫学的に測定することができる。したがって、ＢＮＰおよび各種のヒトＢＮＰ断片が存在する試料においても、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のみを免疫学的に測定することができる。
［寄託生物材料への言及］
（１）抗体番号９６２０１を産生するハイブリドーマ９６２０１
イ　当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人製品評価技術基盤機構　
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）
ロ　イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２８年８月１８日
ハ　イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３３１
（２）抗体番号９６２０４を産生するハイブリドーマ９６２０４
イ　当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人製品評価技術基盤機構　
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）　　　　　
ロ　イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２８年８月１８日
ハ　イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３３２
（３）抗体番号９６２０７を産生するハイブリドーマ９６２０７
イ　当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人製品評価技術基盤機構　
日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８（郵便番号２９２－０８１８）　　　　　
ロ　イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２８年８月１８日
ハ　イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＮＩＴＥ　ＢＰ－０２３３３

Claims (12)

  1. 試料中のヒトＢＮＰ断片（４－３２）の免疫測定方法であって、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体を用いることを特徴とする、前記免疫測定方法。
  2. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する抗体である請求項１に記載の免疫測定方法。
  3. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する抗体である請求項１又は２に記載の免疫測定方法。
  4. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、モノクローナル抗体である請求項１～３のいずれかに記載の免疫測定方法。
  5. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）の免疫測定試薬であって、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体を用いることを特徴とする、前記免疫測定試薬。
  6. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する抗体である請求項５に記載の免疫測定試薬。
  7. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する抗体である請求項５又は６に記載の免疫測定試薬。
  8. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体が、モノクローナル抗体である請求項５～７のいずれかに記載の免疫測定試薬。
  9. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）に反応し、かつ、ヒト全長ＢＮＰ（１－３２）、ヒトＢＮＰ断片（３－３２）及びヒトＢＮＰ断片（５－３２）とは反応しない抗体。
  10. ヒトＢＮＰ断片（４－３２）のＮ末端を含む部位と反応する請求項９に記載の抗体。
  11. ヒトＢＮＰ断片（４－１０）に反応する請求項９又は１０に記載の抗体。
  12. モノクローナル抗体である請求項９～１１のいずれかに記載の抗体。
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