JP4782249B2 - インスリン測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫反応を利用したインスリンの測定方法及び測定試薬に関する。さらに詳しくは、抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を用いるインスリン測定方法及び測定試薬に関する。

インスリンは、膵臓中のランゲルハンス島β細胞において、前駆体であるプロインスリンを経て生成される分子量約５８００のペプチドホルモンである。糖代謝ならびにアミノ酸代謝や脂質代謝に関与し、代表的な生理作用は血糖降下である。糖尿病は、β細胞の減少や機能低下に基づくインスリン分泌不足や末梢組織でのインスリン作用不足によりもたらされる。それゆえ、β細胞のインスリン分泌機能を反映する血中インスリン濃度の測定は、糖尿病の診断や病態把握及び耐糖能異常の原因鑑別に有用な指標となっている。

モノクローナル抗体を用いたインスリンの測定方法としては、次のような技術が知られている。
特許文献１には、不溶性担体に結合させたモノクローナル抗体と、該抗体とエピトープを競合せず、かつ酵素で標識されたモノクローナル抗体とを用いた酵素免疫測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法という）によるインスリンの定量方法が開示されている。
特許文献２には、不溶性担体に結合させた認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体を用いた粒子凝集イムノアッセイ法によるインスリンの定量方法が開示されている。
上記文献は、いずれもインスリンに対する認識部位の異なる複数のモノクローナル抗体を用いてインスリンを測定する方法であるが、プロインスリン、インスリンアナログ製剤などのインスリン類似化合物との交差反応性については何ら開示されていないことから、インスリンのみを正確に、かつ、高感度で測定できるかどうかは不明である。

特開平１−１４８９６２号公報 特開平３−１１８４７２号公報

本発明は、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けず、インスリンのみを高感度に正確に測定することのできる、インスリン特異的な測定方法及び測定試薬の提供を課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために、鋭意検討した結果、驚くべきことに、インスリンに反応する第１のモノクローナル抗体と、当該第１のモノクローナル抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、当該第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する第２モノクローナル抗体を組み合わせることで、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けず、インスリンのみを高感度に正確に測定できることを見出した。さらに検討した結果、上記、抗インスリン抗体が結合したインスリン（インスリン−抗インスリン抗体複合体：以下「インスリン−抗体複合体」ということがある）に反応する抗体を使用して、さまざまな態様のインスリン測定方法を構築できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を有する。

〔１〕抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を用いることを特徴とする、インスリン測定方法。
〔２〕２種の抗体を用いるインスリン測定方法であって、
１）第１の抗体は、インスリンと反応する性質を有し、
２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
〔１〕に記載のインスリン測定方法。
〔３〕第１の抗体及び第２の抗体が、ともにモノクローナル抗体である〔２〕に記載のインスリン測定方法。
〔４〕第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、〔２〕に記載のインスリン測定方法。
〔５〕第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、〔３〕に記載のインスリン測定方法。
〔６〕少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔７〕第２のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔３〕〜〔６〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔８〕第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する〔３〕，〔５〕，〔６〕，〔７〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔９〕第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する〔３〕，〔５〕，〔６〕，〔７〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔１０〕第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する〔３〕，〔５〕，〔６〕，〔７〕のいずれかに記載のインスリン測定方法。
〔１１〕抗インスリン抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、該抗インスリン抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する抗体を含むことを特徴とするインスリン測定試薬。
〔１２〕２種の抗体を含むインスリン測定試薬であって、
１）第１の抗体はインスリンと反応する性質を有し、
２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
〔１１〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１３〕第１の抗体及び第２の抗体がともにモノクローナル抗体である〔１２〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１４〕第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、〔１２〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１５〕第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、〔１３〕に記載のインスリン測定試薬。
〔１６〕少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔１７〕第２のモノクローナル抗体は、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、〔１３〕〜〔１６〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔１８〕第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔１９〕第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔２０〕第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
〔２１〕以下の性質を有ることを特徴する、モノクローナル抗体。
１）インスリンに結合する抗体が結合していないインスリンとは反応しない
２）インスリンに結合する抗体が結合したインスリンとは反応する
〔２２〕さらに、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しないという性質を有する〔２１〕に記載のモノクローナル抗体。
〔２３〕下記工程を含むモノクローナル抗体のスクリーニング方法。
１）インスリンと反応する抗体を選択する工程
２）１）で選択した抗体が結合していないインスリンとは反応せず、当該抗体が結合したインスリンと反応するモノクローナル抗体を選択する工程

本発明によれば、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けずに、感度の高い、正確なインスリン測定が可能となった。また、本発明によれば、β細胞からのインスリン分泌を正確に把握できることから、糖尿病の病態把握に用いることもでき、非常に有用である。

インスリンのアミノ酸配列を示す概念図である。図中（ａ）〜（ｅ）部分は本発明の抗体との反応性を検討した各種インスリンアナログ製剤とのアミノ酸配列の違いを示す部分である。図中の○の中のアルファベットはアミノ酸の1文字表記である。 インスリンリスプロ：（ａ）（ｂ）部分は「Ｐ−Ｋ」ではなく「Ｋ−Ｐ」を有する。インスリンアスパルト：（ａ）部分は「Ｐ」ではなく「Ｄ」を有する。 インスリングラルギン：（ｄ）部分は「Ｎ」ではなく「Ｇ」を有し、更に（ｃ）部分「Ｔ」に「ＲＲ」が付加されている。 インスリンデテミル：（ｃ）部分は「Ｔ」を有さず、更に（ｂ）部分「Ｋ」にミリスチン酸（C₁₄H₂₈O₂）が付加されている。インスリングルリジン：（ｂ）部分は「Ｋ」ではなく「Ｅ」を有し、更に（ｅ）部分は「Ｎ」ではなく「Ｋ」を有する。 インスリンと６６２２１抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。 インスリンと６６２２６抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。 プロインスリン及び各種インスリンアナログ製剤と６６２２１抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。（ａ）プロインスリン、（ｂ）インスリンリスプロ、（ｃ）インスリンアスパルト 同上。（ｄ）インスリングラルギン、（ｅ）インスリンデテミル プロインスリン及び各種インスリンアナログ製剤と６６２２６抗体の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。（ａ）プロインスリン、（ｂ）インスリンリスプロ、（ｃ）インスリンアスパルト 同上。（ｄ）インスリングラルギン、（ｅ）インスリンデテミル １次抗体として６６２２１抗体、２次抗体として６６２２６抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、各種インスリンアナログ製剤の反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。 １次抗体として６６２２６抗体、２次抗体として６６２２１抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、各種インスリンアナログ製剤の反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。 インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンと６６２２１抗体（ａ）及び６６２２６抗体（ｂ）の反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた試験結果を示す図である。 １次抗体として６６２２１抗体、２次抗体として６６２２６抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンの反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。 １次抗体として６６２２６抗体、２次抗体として６６２２１抗体を用いて、１次抗体をプレートに固相化しインスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンの反応性について調べたＥＬＩＳＡ法試験の結果を示す図である。

以下、本発明の代表的な態様である下記発明〔３〕を例として、発明を実施するための形態について説明する。発明〔３〕を詳説すると以下である。
『２種のモノクローナル抗体を用いるインスリン測定方法であって、
１）第１のモノクローナル抗体は、インスリンと反応する性質を有し、
２）第２のモノクローナル抗体は、第１のモノクローナル抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、インスリン測定方法。』

本発明のモノクローナル抗体には、第１のモノクローナル抗体と第２のモノクローナル抗体があり、インスリンの測定に際してはこれらを組み合わせて用いる。第１のモノクローナル抗体は、インスリンと反応するモノクローナル抗体であればいずれのモノクローナル抗体でもよく、抗体分子全体のほかに、抗体のＦａｂ’部分などインスリンと反応することができる、抗体の機能性断片であってもよい。
第２のモノクローナル抗体は、以下の１）と２）の性質を有するモノクローナル抗体であればいずれのモノクローナル抗体でもよい。
１）第１のモノクローナル抗体が結合していないインスリンとは反応しない
２）第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する
上記「第１のモノクローナル抗体が結合したインスリンとは反応する」場合の第２のモノクローナル抗体の反応部位（認識部位）は、第１のモノクローナル抗体が結合したことによって起きるインスリンの構造の変化を認識して、当該構造が変化したインスリンに反応するものが望ましい。ここで、「インスリンの構造の変化」とは、インスリン−抗体複合体の形成により、インスリン分子自体に独立して生じた構造の変化や、抗体が結合したインスリンにおいて抗体とインスリン分子が協働して構成する構造等をいう。

また、本発明の測定方法はプロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けないことが望ましいため、少なくとも１種のモノクローナル抗体は、プロインスリン及びインスリン類似化合物と反応しないことが望ましい。インスリン類似化合物としては、具体的には、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル、インスリングルリジンなどのインスリンアナログ製剤などが挙げられる。
本発明の第２のモノクローナル抗体の一態様として、これらの化合物のいずれとも交差反応しない抗体が挙げられ、本抗体をインスリンの測定に用いた場合には、当該化合物が試料中に存在しても、インスリンを特異的に測定することができる。一方のモノクローナル抗体がこれらプロインスリン及びインスリン類似化合物と反応しない性質を有していれば、他方のモノクローナル抗体はこれらの類似化合物と反応するものでも、反応しないものでもいずれでもよい。

本明細書中、インスリンと「反応する」、インスリンを「認識する」、インスリンと「結合する」、インスリンと「交差反応性を示す」は、同義で用いられるが、これらの例示に限定されることはなく、最も広義に解釈する必要がある。抗体がインスリンなどの抗原（化合物）と「反応する」か否かの確認は、後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法、競合ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法などにより行うことができるほか、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）の原理を利用した方法（ＳＰＲ法）などにより行うことができる。ＳＰＲ法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）の名称で市販されている、装置、センサー、試薬類を使用して行うことができる。

本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、本発明の抗体がある化合物と実質的に反応しないことをいい、「実質的に反応しない」とは、例えば、上記ＳＰＲ法に基づき、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を使用し、本発明の抗体を固定化して測定を行った場合に、本発明の抗体の反応性の増強が認められないことをいう。詳細には、抗体と化合物との反応性が、コントロール（化合物非添加）の反応性と比べて有意な差がないことをいう。上記ＳＰＲ法以外の当業者に周知の方法・手段によっても「実質的に反応しない」ことを確認できるのはいうまでもない。

本発明の抗体によって抗原として認識されるインスリンは、インスリン分子の全体であってもよく、その一部であってもよい。

「第１のモノクローナル抗体」としては、具体的にはハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３３）が産生するモノクローナル抗体（６６２２１抗体）が挙げられ、「第２のモノクローナル抗体」としては、ハイブリドーマ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３４）が産生するモノクローナル抗体（６６２２６抗体）が挙げられる。

本発明の抗体は、抗原（免疫原）としてインスリンをリン酸緩衝生理食塩水などの溶媒に溶解し、この溶液を動物に投与して免疫することによりに容易に製造できる。必要に応じて前記溶液に適宜のアジュバントを添加した後、エマルジョンを用いて免疫を行ってもよい。アジュバントとしては、油中水型乳剤、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲルなどの汎用されるアジュバントのほか、生体成分由来のタンパク質やペプチド性物質などを用いてもよい。例えば、フロイントの不完全アジュバント又はフロイントの完全アジュバントなどを好適に用いることができる。アジュバントの投与経路、投与量、投与時期は特に限定されないが、抗原を免疫する動物において所望の免疫応答を増強できるように適宜選択することが望ましい。

免疫に用いる動物の種類も特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、例えばマウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどを用いることができ、より好ましくはマウスを用いることができる。動物の免疫は、一般的な手法に従って行えばよく、例えば、抗原の溶液、好ましくはアジュバントとの混合物を動物の皮下、皮内、静脈、又は腹腔内に注射することにより免疫を行うことができる。免疫応答は、一般的に免疫される動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用される動物に応じて適宜設定することが望ましい。抗原投与は最初の免疫後に何回か繰り返し行うことが好ましい。

モノクローナル抗体を得る場合、引き続き以下の操作が行われるが、それらの操作に限定されることはなく、モノクローナル抗体それ自体の製造方法については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８８）に記載の方法に準じて行うことができる。

最終免疫後、免疫した動物から抗体産生細胞である脾臓細胞あるいはリンパ節細胞を摘出し、高い増殖能を有するミエローマ細胞と細胞融合させることによりハイブリドーマを作製することができる。細胞融合には抗体産生能（質・量）が高い細胞を用いることが好ましく、またミエローマ細胞は融合する抗体産生細胞の由来する動物と適合性があることが好ましい。細胞融合は、当該分野で公知の方法に従って行うことができるが、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法などを採用することができる。得られたハイブリドーマは公知の方法に従って増殖させることができ、産生される抗体の性質を確認しつつ所望のハイブリドーマを選択することができる。ハイブリドーマのクローニングは、例えば限界希釈法や軟寒天法などの公知の方法により行うことが可能である。

第１のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択について説明する。
ハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮し、選択の段階で効率的に行うことができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により、インスリンに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。具体的には、まず、培養上清中のモノクローナル抗体を、固相化したインスリンと反応させ、次いで標識抗ＩｇＧ抗体を反応させる抗原固相化ＥＬＩＳＡ法により、インスリンに対し高い反応性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
このようにして選別されたハイブリドーマを大量培養することにより、所望の特性を有するモノクローナル抗体を製造することができる。大量培養の方法は特に限定されないが、例えば、ハイブリドーマを適宜の培地中で培養してモノクローナル抗体を培地中に産生させる方法や、哺乳動物の腹腔内にハイブリドーマを注射して増殖させ、腹水中に抗体を産生させる方法などを挙げることができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法などを適宜組み合わせて行うことができる。

また、第２のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、上記第１のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択の場合における固相化したインスリンを、第１のモノクローナル抗体と結合したインスリンに置き換えた選択方法（固相化した第１のモノクローナル抗体にインスリンを結合させ、第２のモノクローナル抗体候補とのサンドイッチ形成を確認する方法）や第２のモノクローナル抗体候補を固相化し、予め第１のモノクローナル抗体とインスリンをインキュベートして形成させたインスリン−抗体複合体抗体との反応を確認する選択方法、あるいはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてインスリンとの反応性を示さないものを選択する方法を適宜組み合わせて確認することにより得ることができる。

本発明の抗体としては、抗体分子全体のほかに抗原抗体反応活性を有する抗体の機能性断片を使用することも可能であり、前記のように動物への免疫工程を経て得られたもののほか、遺伝子組み換え技術を使用して得られるものや、キメラ抗体を用いることも可能である。抗体の機能性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’などが挙げられ、これらの機能性断片は前記のようにして得られる抗体をタンパク質分解酵素（例えば、ペプシンやパパインなど）で処理することにより製造できる。

また、本発明のモノクローナル抗体は、第１または第２のモノクローナル抗体のいずれか、あるいは両方を不溶性担体上に固定された固定（固相）化抗体として使用したり、後述する当業者に周知慣用の標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体はいずれも本発明の範囲に包含される。例えば、不溶性担体にモノクローナル抗体を物理的に吸着させ、あるいは化学的に結合（適当なスペーサーを介してもよい）させることにより固定化抗体を製造することができる。不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂などの高分子基材、ガラスなどの無機基材、セルロースやアガロースなどの多糖類基材などからなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、板状（例えば、マイクロプレートやメンブレン）、ビーズあるいは微粒子状（例えば、ラテックス粒子、金コロイド粒子）、筒状（例えば、試験管）など任意の形状を選択できる。

本発明の第２のモノクローナル抗体と結合可能な標識抗体、標識プロテインＡ又は，標識プロテインＧ等を用いることにより、試料中のインスリンを測定することができる。標識抗体を製造するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、又は放射性同位体、金コロイド粒子、着色ラテックスなどが挙げられる。標識物質と抗体との結合法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法などの方法を用いることができるが、固定化抗体や標識抗体の種類、及びそれらの製造方法は前記の例に限定されることはない。例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素を標識物質として用いる場合にはその酵素の特異的基質（酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰという）の場合には、例えばＯ−フェニレンジアミン（以下、ＯＰＤという）あるいは３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＡＬＰの場合には、ｐ−ニトロフェニル・ホスフェートなど）を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。

本明細書において、「不溶性担体」を「固相」、抗原や抗体を不溶性担体に物理的あるいは化学的に担持させることあるいは担持させた状態を「固定」、「固定化」、「固相化」、「感作」、「吸着」と表現することがある。また、「検出」又は「測定」という用語は、インスリンの存在の証明及び／又は定量などを含めて最も広義に解釈する必要があり、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。

本発明の抗体を用いる測定方法における検出対象の「試料」としては、主に生体（生物）由来の体液を挙げることができる。具体的には、血液（全血）、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、膵臓抽出液、涙液、耳漏又は前立腺液などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明により提供される測定用試薬（キット）の態様としては、インスリンの測定ができる試薬であれば、特に限定されるものではない。以下、代表的な標識イムノアッセイ法であるＥＬＩＳＡ法、イムノクロマトグラフ法と、代表的な粒子凝集イムノアッセイ法であるラテックス免疫凝集法（以下、ＬＴＩＡ法という）を例にそれぞれを説明する。

＜標識イムノアッセイ法：ＥＬＩＳＡ法＞
試料中に存在するインスリンを検出するための測定用試薬（キット）の態様として、以下の要素：
（ａ）第１のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）、及び
（ｂ）標識物質で標識された第２のモノクローナル抗体、
をあげることができる。

第１のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）は、試料中のインスリンを捕捉してインスリン−抗体複合体を形成する。標識物質で標識された第２のモノクローナル抗体は、当該インスリン−抗体複合体に反応してサンドイッチを形成し、標識物質に応じた方法により標識物質の量を測定することにより、試料中のインスリンを測定することができる。第１のモノクローナル抗体の固相への固定化の方法、第２のモノクローナル抗体の標識物質での標識の方法など、測定試薬（キット）を構成する上での具体的な方法は本明細書中に記載された方法のほか、当業者に周知の方法を制限なく使用することができる。この構成の場合、ホモジーニアスな測定系として構成することもできるが、ヘテロジーニアスな測定系として構成することが好ましい。

特に好適な態様として、発明〔１９〕（第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。

また、測定用試薬の感度や特異性を考慮して、
（ａ）標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体、及び
（ｂ）第２のモノクローナル抗体を固定化した固相（プレートなど）、
という上記とは逆の構成を採用することもできる。
この構成の場合、被検試料と標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体含有溶液を混合し、予めインスリン−抗体複合体を溶液中で形成させておき、第２のモノクローナル抗体を固定化した固相に添加することが好ましい。この構成においては、感度の向上などを意図して、発明〔１５〕（第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、発明〔１３〕に記載のインスリン測定試薬）のように標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体として、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体を使用することが好適に可能である。

特に好適な態様として、発明〔２０〕（第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。

＜標識イムノアッセイ法：イムノクロマトグラフ法＞
一般的なイムノクロマトグラフ法では、メンブレンなどのシート状の固相支持体上、長さ方向に対して、端から順番に「１．被検試料供給部位」、「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」、「３．標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体とインスリンの複合体を捕捉するための第２のモノクローナル抗体を固定化した捕捉試薬部位」を被検試料溶液が毛細管現象により連続的に移動するよう構成されている。
具体的には、まず、インスリンを含む被検試料を被検試料供給部位に所定量添加すると、試料が固相支持体を展開移動する過程で標識試薬部位に侵入し、インスリンが標識試薬（第１のモノクローナル抗体を含む）と結合しインスリン−標識試薬の複合体が形成される。インスリン−標識試薬複合体はそのままメンブレン上を展開移動し、メンブレン上の第２のモノクローナル抗体を含む捕捉試薬部位に侵入すると、固相支持体上に固定化された捕捉試薬に捕捉され、捕捉試薬（第２のモノクローナル抗体）−インスリン−標識試薬（第１のモノクローナル抗体）の複合体が捕捉試薬位置に形成される。そして、標識試薬を任意の方法（可視可能な金コロイド粒子の場合はその凝集像、酵素の場合は基質を添加することによる発色反応）で検出することで、被分析物質の存在を判定することができる。
なお、理解を容易にするため、「１．被検試料供給部位」と「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」を、独立して被検試料の移動方向順に記載したが、上から「１」、「２」の順で積み上げられた構造など、当業者に周知の態様・構成が採用されうることを当業者は当然に理解することができる。

イムノクロマトグラフ法においては、被検試料が「２．第１のモノクローナル抗体を含む標識試薬（第１のモノクローナル抗体は金コロイド粒子などの標識物質で標識されている）を、メンブレン上において展開可能に保持した標識試薬部位」を通過する時点で、インスリン−抗体複合体が形成させるので、前記ＥＬＩＳＡ法と同様に感度の向上などを意図して、発明〔１５〕（第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、発明〔１３〕に記載のインスリン測定試薬）のように標識物質で標識された第１のモノクローナル抗体として、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体を使用することが好適に可能である。

イムノクロマトグラフ法の測定試薬の特に好適な態様として、発明〔２０〕（第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、イムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。

＜粒子凝集イムノアッセイ法：ＬＴＩＡ法＞
試料中に存在するインスリンを検出するための測定用試薬（キット）のＡ〜Ｄの４態様として、それぞれ少なくとも以下の要素：
Ａ．（ａ）第１のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子及び（ｂ）第２のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子
Ｂ．（ａ）第１のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子及び（ｂ）第２のモノクローナル抗体
Ｃ．（ａ）第１のモノクローナル抗体及び（ｂ）第２のモノクローナル抗体を固定化したラテックス粒子
Ｄ．（ａ）第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体の両抗体を固定化したラテックス粒子
をあげることができる。

これらの測定用試薬（キット）はＬＴＩＡ法に好適に使用できる。Ａ〜Ｄに使用されるラテックス粒子は、感度向上などの所望の性能を得るため、粒子径や種類を適宜選択することができる。ラテックス粒子としては、抗原あるいは抗体の担持に適したものであれば良い。例えば、ポリスチレン、スチレン−スルホン酸（塩）共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリルニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の形状は特に限定されないが、その平均粒子径は、ラテックス粒子表面の抗体又は抗原と測定対象物との凝集反応の結果生じる凝集体が、肉眼又は光学的に検出できるに十分な大きさを有することが好ましい。好ましい平均粒子径としては０．０２〜１．６μｍであり、特に０．０３〜０．５μｍが好ましい。また、金属コロイド、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子をラテックス粒子に代えて使用することもできる。

例えば、臨床検査で使用されるＬＴＩＡ法の試薬は、通常、第一試液、第二試液の形態で提供され、順次被検試料と混合して使用される。上記Ａ〜Ｄの各態様における、（ａ）、（ｂ）は、その両方又は一方を、第一試液あるいは第二試液に含有させることができる。これらの含有のさせかたは、臨床検査における測定機器の仕様や測定試薬の設計（性能や使い易さなど）を考慮し、適宜選択しうる。一般にはＡの態様の（ａ），（ｂ）の両方を第二試液に含有させることが好適であるが、Ａの態様の（ａ）を第一試液、（ｂ）を第二試液に含有させることなども好適に使用しうる。

特に好適な態様として、発明〔１８〕（第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する発明〔１３〕，〔１５〕，〔１６〕，〔１７〕のいずれかに記載のインスリン測定試薬）をあげることができる。

以上、本発明の代表的な態様である発明〔３〕を例として、本発明を実施するための形態を説明したが、「インスリン−抗体複合体」に対する抗体を使用することを限度として、例えば発明〔４〕のように、第１の抗体にポリクローナル抗体を使用することや、発明〔５〕のように、第１の抗体に、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体を使用することなど、本発明が種々の態様をとりうることを当業者は当然に理解することができる。

以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

〔試験例１〕本発明のモノクローナル抗体の製造方法
１．免疫用抗原の調製
ヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）をコンプリートフロインドアジュバント（Ｗａｋｏ社製）と１：１で混合後、連結シリンジを用いてエマルジョンを作製し、免疫用抗原とした。

２．ハイブリドーマの作製
上記、免疫用抗原を雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの背部皮下に注入した（１匹当たり２０〜５０μｇ）。この操作（免疫）を１週間毎に２回繰り返した。免疫開始３週間後、試験採血にて高い抗体価が確認されたマウスから脾臓を摘出し、５０％−ＰＥＧ１４５０（シグマ社製）を用いた常法により細胞融合を行った。ミエローマ細胞はＳＰ２／Ｏを用いた。得られた融合細胞は、脾臓細胞として２．５×１０⁶個／ｍＬになるようにＨＡＴ、１５％ウシ胎児血清及び１０％のＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、９６穴培養プレートに０．２ｍＬずつ分注した。これを５％ＣＯ₂インキュベーター中で３７℃にて培養した。

３．第１のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合７日後に１次スクリーニングとして、培養上清を用いて後述する抗原固相化ＥＬＩＳＡ法を行い、インスリンに対し高い反応性を示したｗｅｌｌを１次陽性ｗｅｌｌとして選別した。該１次陽性ｗｅｌｌ中の細胞は、２４穴プレートにおいて継代した。継代２日後、２次スクリーニングとして、培養上清を用いて後述する競合ＥＬＩＳＡ法を行い、インスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを２次陽性ｗｅｌｌとして選択した。
３−１．抗原固相化ＥＬＩＳＡ用プレートの作製
１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２；以下、ＰＢＳという）で１μｇ／ｍＬの濃度に調製したインスリンをスクリーニング用抗原として、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．１％プロクリン３００（ＳＵＰＥＬＣＯ社製）を含むＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳＴという）４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴ（以下、ＢＳＡ-ＰＢＳＴという）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。該ＥＬＩＳＡ用プレートは、ＰＢＳＴで３回洗浄後、各試薬を添加して実施例記載の各ＥＬＩＳＡ法試験に用いた。
３−２．抗原固相化ＥＬＩＳＡ法
（i）抗原固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、ＢＳＡ−ＰＢＳＴにより段階希釈した各マウス抗血清、あるいは融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（ii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ−Ｇｔ Ｆ（ａｂ’）₂−Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ’ｓ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ社製 ＡＭＩ４４０４）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iii）ＰＢＳＴで３回洗浄後、０．０２％過酸化水素水を含む０．２Ｍクエン酸緩衝液（以下、基質溶解液という）にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で1時間静置した。
（iv）１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１．５Ｎ硫酸（以下、反応停止液という）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
３−３．競合ＥＬＩＳＡ法
（i）抗原固相化したＥＬＩＳＡ用プレートにヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで各０μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬに希釈した溶液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。
（ii）次いで、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで各５倍、２５倍に希釈した融合細胞の培養上清あるいはその原液を２５μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iii）以降の操作は、前記３−２．抗原固相化ＥＬＩＳＡ法の工程（ii）〜（iv）と同様に行った。

４．第２のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
細胞融合７日後に、培養上清を用いて後述のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行い、後述のクローニング及びモノクローナル抗体採取にて、予め採取したＦ（ａｂ’）₂処理化した第１のモノクローナル抗体と結合させたインスリンに対し高い反応性を示すｗｅｌｌを選択した。
４−１．サンドイッチＥＬＩＳＡ法
（i）Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ（登録商標） Ｆ（ａｂ’）₂ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製 Ｐｒｏｄ＃４４８８８）を使用して第１のモノクローナル抗体（ここでは６６２２１抗体）をＦ（ａｂ’）₂処理化した。
（ii）ＰＢＳ溶液に２μｇ／ｍＬの濃度に調製したＦ（ａｂ’）₂処理化済み第１のモノクローナル抗体を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６穴プレートに固相化し、４℃で一晩静置した。ＰＢＳＴ４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ＢＳＡ-ＰＢＳＴを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。
（iii）ＥＬＩＳＡ用プレートに、ヒトインスリン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで０．５μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iv）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで段階希釈した融合細胞の培養上清を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（v）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ＨＲＰ−Ｇｔ−Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−Ｆｃ（ＢＥＴＨＹＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製 Ａ９０―１３１Ｐ）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで１００００倍希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
(vi)ＰＢＳＴで３回洗浄後、基質溶解液にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で1時間静置した。
（vii）反応停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。
５．クローニング及びモノクローナル抗体採取
上記３．及び４．のスクリーニングで選択したハイブリドーマを限界希釈法にてクローニングし、それぞれハイブリドーマ６６２２１、６６２２６を得た。次いで各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を採取するため、２週間前にプリスタン０．５ｍＬを腹腔内に注射しておいた１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ハイブリドーマを細胞数０．５×１０⁶個の量で腹腔内に投与した。１４日後に腹水を採取し、遠心処理して上清を得た。上清を等量の吸着用緩衝液（３ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１．５ｍｏｌ／Ｌ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ８．５）と混和後、ろ過した。該ろ液を、吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＡセファロースカラムに通し、ろ液中の抗体をカラムに吸着させた後、０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。該溶出液を、１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で中和後、ＰＢＳで透析を行い、抗体を採取した。
以下、６６２２１抗体、６６２２６抗体としてそれぞれ試験に用いた。

６６２２１抗体及び６６２２６抗体を産生するハイブリドーマは、出願人によって独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００９年４月８日に寄託手続がされ、受託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−２１８００、ＦＥＲＭ Ｐ−２１８０１）が付与され、その後２０１０年２月１７日に原寄託に基づくブタペスト条約に基づく寄託へ移管され、受託番号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３３、ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３４）が付与されている。

〔試験例２〕本発明のモノクローナル抗体のプロインスリン及びインスリン類似化合物との交差反応性
６６２２１抗体及び６６２２６抗体のプロインスリン及びインスリン類似化合物との交差反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いて試験を行った。インスリン類似化合物としては、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミルなどのインスリンアナログ製剤を用いた。
１．試薬及び器具
１−１．モノクローナル抗体
（i）６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
（ii）６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
１−２．アナライト
（i）リコンビナントヒトインスリン：Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製 ３０−ＡＩ５１
(ii)プロインスリン：ＩＲＲ社製 Ｐｒｏｉｎｓｕｌｉｎ， Ｈｕｍａｎ， ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＮＩＢＳＣ ｃｏｄｅ： ８４／６１１
（iii）インスリンアナログ製剤
（１）インスリンリスプロ１００単位／ｍＬ：日本イーライリリー社製、
（２）インスリンアスパルト１００単位／ｍＬ：ノボノルディスクファーマ社製
（３）インスリングラルギン１００単位／ｍＬ：サノフィ・アベンティス社製
（４）インスリンデテミル１００単位／ｍＬ：ノボノルディスクファーマ社製
１−３．Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器及び専用試薬類一式（Ｂｉａｃｏｒｅ社製：現ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、次の（i）〜（viii）はＢｉａｃｏｒｅ社製当時の製品及びカタログＮｏ．であるが、現在はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より入手可能である。）
（i）Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） Ｔ１００：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＪＪ−１０３７−０２
（ii）Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＢＲ−１００５−３０
（iii）Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＢＲ−１０００−５０
（iv）Ａｃｅｔａｔｅ ５．０：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＢＲ−１００３−５１
（v）α−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＢＲ−１００５−１４
（vi）Ｇｌｙｃｉｎｅ １．５：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＢＲ−１００３−５４
（vii）Ｇｌｙｃｉｎｅ ２．０：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＢＲ−１００３−５５
（viii）ＨＢＳ−ＥＰ＋ １０×（ランニングバッファー）：Ｂｉａｃｏｒｅ社製 ＢＲ−１００６−６９（使用時、ＮａＯＨでｐＨ８．５に調製後、精製水にて１０倍希釈して用いる。）

２．試験方法
Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐに固定化したα−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓに６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体をキャプチャーさせ、アナライトとしてインスリン、プロインスリン、各種インスリンアナログ製剤を添加することでそれぞれの反応性を評価した。具体的な操作手順は以下のとおりである。
（i）Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５にα−Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓを固定化した（付属の取扱説明書に従った）。
（ii）ＨＢＳ−ＥＰ＋ （ｐＨ８．５）で６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体を５μｇ／ｍＬとなるよう希釈し、流速３０μＬ／ｍｉｎで３００秒間添加した。
（iii）ＨＢＳ−ＥＰ＋ （ｐＨ８．５）で各種抗原を１０ｎｇ／ｍＬに希釈し、０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬの２濃度につき各１２０秒間添加した。またその際にフリーランニングによる解離時間を１２０秒間と設定した。
（iv）Ｇｌｙｃｉｎｅ １．５とＧｌｙｃｉｎｅ ２．０を１：１で混合して再生溶液とし、再生処理を１８０秒間行った。

３．結果
３−１．インスリンとの反応結果
６６２２１抗体及び６６２２６抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてインスリンとの反応性を確認した。結果を図２及び図３に示す。インスリン濃度１０ｎｇ／ｍＬにおいて、６６２２１抗体では８．５ＲＵの反応性が認められた（図２）。一方、６６２２６抗体では全く反応性が認められなかった（図３）。なお、縦軸「ＲＵ」とはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）測定系における独自の単位を示しており、センサー表面上での反応による質量変化を表している。

３−２．プロインスリン及びインスリンアナログ製剤との反応結果
６６２２１抗体及び６６２２６抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてプロインスリンあるいは各種インスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）との反応性を確認した。結果を図４−１、図４−２、図５−１及び図５−２に示す。抗原濃度１０ｎｇ／ｍＬにおいて、６６２２１抗体ではいずれも５．５〜１３ＲＵのレスポンスが認められた。一方、６６２２６抗体では全く反応性が認められなかった。

〔実施例１〕本発明のモノクローナル抗体の組み合わせによるインスリンの測定１＜ＬＴＩＡ法＞
１．ラテックス粒子の作製
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器 （容量２Ｌ） に、蒸留水１１００ｇ、スチレン２００ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．２ｇ、及び、蒸留水５０ｇに過硫酸カリウム１．５ｇを溶解した水溶液を仕込み、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃で攪拌しながら４８時間重合した。
重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。得られたラテックス粒子の粒子径を透過型電子顕微鏡装置 （日本電子社製、「ＪＥＭ−１０１０型」） を用いて１００００倍の倍率でラテックス粒子を撮影し、最低１００個以上の粒子について画像解析することにより平均粒子径を測定した。得られた平均粒子径は０．３μｍであった。

２．抗インスリン抗体感作ラテックス粒子の調製
２−１．６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
平均粒子径０．３μｍの１．０％ラテックス溶液（５ｍＭ トリス緩衝液（以下、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌという）（ｐＨ８．５）に、等量の５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で０．６０ｍｇ／ｍＬに希釈した６６２２１抗体溶液を添加して４℃２時間攪拌した。その後、等量の０．５％ＢＳＡ含有５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を添加して４℃１時間攪拌した。次に、これを遠心して上清を除去後、沈殿を５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で再懸濁し、６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。
２−２．６６２２６抗体感作ラテックス粒子溶液の作製
平均粒子径０．３μｍのラテックスを用いて上記と同じ方法により６６２２６抗体感作ラテックス粒子溶液を作製した。

３．試薬の調製
３−１．第一試薬の調製
５００ｍＭの塩化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を調製し第一試薬とした。
３−２．第二試薬の調製
６６２２１抗体感作ラテックス粒子溶液及び６６２２６抗体感作ラテックス粒子溶液を等量混合し、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で波長６００ｎｍでの吸光度が５．０Ａｂｓとなるように希釈して第二試薬とした。

４．測定方法
第一試薬と第二試薬を組合せ、日立７１７０形自動分析装置を用いてインスリン濃度依存的な粒子凝集塊の形成を確認した。具体的には、濃度０μＵ／ｍＬ、５μＵ／ｍＬ、２５μＵ／ｍＬ、５０μＵ／ｍＬ、１００μＵ／ｍＬ、２００μＵ／ｍＬのインスリン溶液１０μＬに、第一試薬１５０μＬを加えて３７℃で５分間加温後、第二試薬５０μＬを加えて攪拌した。その後５分間の凝集形成に伴う吸光度変化を、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて測定した。

５．測定結果
表１よりインスリン濃度依存的に感度が上昇し定量が可能であることが確認された。

〔実施例２〕本発明のモノクローナル抗体の組み合わせによるインスリンの測定２＜ＥＬＩＳＡ法＞
６６２２１抗体及び６６２２６抗体をそれぞれ固相化し、２次抗体としてそれぞれ別の抗体を組み合わせてインスリン、プロインスリン及びインスリン類似化合物の反応性についてＥＬＩＳＡ法を用いて試験を行った。
１．使用した抗体及び抗原種
（１）モノクローナル抗体
６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
（２）抗原種
インスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）は、試験例２と同じものを用いた。

２．ＥＬＩＳＡ測定方法
（i）ＰＢＳに６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体を２μｇ／ｍＬに希釈した溶液を９６穴プレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ固相化し、室温で２時間静置した。
（ii）ＰＢＳＴ４００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行い、ＥＬＩＳＡ用プレートを作製した。
（iii）ＥＬＩＳＡ用プレートに、ヒトインスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤をＢＳＡ−ＰＢＳＴで各０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（iv）ＰＢＳＴで３回洗浄後、ビオチン標識化した６６２２１抗体あるいは６６２２６抗体をＢＳＡ−ＰＢＳＴで１μｇ／ｍＬに希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（v）ＰＢＳＴで３回洗浄後、Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｕｒｅ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＨＲＰ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＰＩＥＲＣＥ社製 Ｐｒｏｄ＃２１１２６）をＢＳＡ−ＰＢＳＴで５０００倍に希釈した溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で１時間静置した。
（vi）ＰＢＳＴで３回洗浄後、基質溶解液にＯＰＤ（東京化成工業社製）を２ｍｇ／ｍＬにて溶解し、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加して室温で1時間静置した。
（vii）反応停止液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、タイターテック（登録商標）マルチスキャンプラスＭＫII（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。

３．結果
３−１．６６２２１抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表２及び図６に示す。
６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、インスリンでは濃度依存的な吸光度の上昇が認められたものの、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）では濃度依存的な吸光度の上昇がまったく認められなかった。

３−２．６６２２６抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表３及び図７に示す。
６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合、インスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルギン、インスリンデテミル）のいずれに対しても濃度依存的な吸光度の上昇が全く認められなかった。

４．考察
前記結果より、６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤とは交差反応性を示さないことから、それらの影響を受けずにインスリンのみを定量できることがわかる。また、６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合には、インスリンを測定できなかったことから、６６２２６抗体は、インスリンとは反応性を示さず、６６２２１抗体が結合したインスリンと反応することがわかる。一方、前記試験例２のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いた本発明のモノクローナル抗体の交差反応性試験結果では、６６２２１抗体は、インスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤のいずれとも反応するものの、６６２２６抗体では、それらいずれとも反応しなかった。
これらのことから、本測定系の反応機序としては、６６２２１抗体が先にインスリンに結合することで、インスリンに何らかの構造変化が起こり、６６２２６抗体は当該構造変化部位を特異的に認識することでサンドイッチが成立するものと考えられる。

〔試験例３〕本発明のモノクローナル抗体のインスリン類似化合物との交差反応性
６６２２１抗体及び６６２２６抗体のインスリン類似化合物との交差反応性についてＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いて試験を行った。インスリン類似化合物として、インスリンアナログ製剤であるインスリングルリジンを用いた。
１．試薬及び器具
１−１．モノクローナル抗体
（i）６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
（ii）６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
１−２．アナライト
インスリンアナログ製剤
（i）インスリングルリジン １００単位／ｍＬ：サノフィ・アベンティス社製
１−３．Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器及び専用試薬類一式
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器及び専用試薬類一式は、試験例２と同じものを用いた。

２．試験方法
アナライトとしてインスリンアナログ製剤であるインスリングルリジンを用いた以外は試験例２に記載の方法と同様に行った。

３．結果
３−１．インスリンアナログ製剤との反応結果
６６２２１抗体及び６６２２６抗体について、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００を用いてインスリンアナログ製剤・インスリングルリジンとの反応性を確認した。結果を図８に示す。６６２２１抗体及び６６２２６抗体のいずれも全く反応性が認められなかった。なお、縦軸「ＲＵ」とはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）測定系における独自の単位を示しており、センサー表面上での反応による質量変化を表している。

〔実施例３〕本発明のモノクローナル抗体の組み合わせによるインスリンの測定３＜ＥＬＩＳＡ法＞
６６２２１抗体及び６６２２６抗体をそれぞれ固相化し、２次抗体としてそれぞれ別の抗体を組み合わせてインスリン、プロインスリン及びインスリン類似化合物の反応性についてＥＬＩＳＡ法を用いて試験を行った。
１．使用した抗体及び抗原種
（１）モノクローナル抗体
６６２２１抗体：２．３０ｍｇ／ｍＬ
６６２２６抗体：３．９９ｍｇ／ｍＬ
（２）抗原種
インスリン、プロインスリン、インスリンアナログ製剤（インスリングルリジン）。

２．ＥＬＩＳＡ測定方法
インスリンアナログ製剤としてインスリングルリジンを用いた以外は、すべて実施例２と同様の方法で行った。

３．結果
３−１．６６２２１抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表４及び図９に示す。
実施例２と同様、６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、インスリンでは濃度依存的な吸光度の上昇が認められたものの、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリングルリジン）では濃度依存的な吸光度の上昇がまったく認められなかった。

３−２．６６２２６抗体固相化プレート測定結果
試験結果を表５及び図１０に示す。
実施例２と同様、６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合、インスリン、プロインスリン及びインスリンアナログ製剤（インスリングルリジン）のいずれに対しても濃度依存的な吸光度の上昇が全く認められなかった。

４．考察
前記結果より、６６２２１抗体を１次抗体、６６２２６抗体を２次抗体とした場合、６６２２６抗体を１次抗体、６６２２１抗体を２次抗体とした場合のいずれも、インスリンアナログ製剤・インスリングルリジンとは交差反応性を示さないことがわかった。

本発明のモノクローナル抗体によれば、プロインスリン及びインスリン類似化合物の影響を受けずに、感度の高い、正確なインスリン測定が可能となった。また、本発明によれば、β細胞からのインスリン分泌を正確に把握できることから、糖尿病の病態把握に用いることもでき、非常に有用である。

（１）ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３３
（２）ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３４

[寄託生物材料への言及]
（１）６６２２１抗体を産生するハイブリドーマ６６２２１
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３３
（２）６６２２６抗体を産生するハイブリドーマ６６２２６
イ 当該生物材料を寄託した寄託機関の名称及び住所
独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）
ロ イの寄託機関に生物材料を寄託した日付
平成２１年４月８日（２００９年４月８日）（原寄託日）
平成２２年２月１７日（２０１０年２月１７日）（原寄託によりブタペスト条約に基づく寄託への移管日）
ハ イの寄託機関が寄託について付した受託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３４

Claims (19)

1. ２種の抗体を用いるインスリン測定方法であって、
   １）第１の抗体は、インスリンと反応する性質を有し、
   ２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
   インスリン測定方法。
2. 第１の抗体及び第２の抗体が、ともにモノクローナル抗体である請求項１に記載のインスリン測定方法。
3. 第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載のインスリン測定方法。
4. 第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、請求項２に記載のインスリン測定方法。
5. 少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項２〜４のいずれかに記載のインスリン測定方法。
6. 第２のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項２〜５のいずれかに記載のインスリン測定方法。
7. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する請求項２，４，５，６のいずれかに記載のインスリン測定方法。
8. 第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する請求項２，４，５，６のいずれかに記載のインスリン測定方法。
9. 第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識しており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する請求項２，４，５，６のいずれかに記載のインスリン測定方法。
10. ２種の抗体を含むインスリン測定試薬であって、
    １）第１の抗体はインスリンと反応する性質を有し、
    ２）第２の抗体は、第１の抗体が結合していないインスリンとは反応しないが、第１の抗体が結合したインスリンとは反応する性質を有する、
    インスリン測定試薬。
11. 第１の抗体及び第２の抗体がともにモノクローナル抗体である請求項１０に記載のインスリン測定試薬。
12. 第１の抗体がポリクローナル抗体であり、第２の抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載のインスリン測定試薬。
13. 第１のモノクローナル抗体が、互いに認識部位が異なる２以上のモノクローナル抗体である、請求項１１に記載のインスリン測定試薬。
14. 少なくとも１種のモノクローナル抗体が、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項１１〜１３のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
15. 第２のモノクローナル抗体は、プロインスリン、インスリン類似化合物のいずれとも反応しない抗体である、請求項１１〜１４のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
16. 第１のモノクローナル抗体及び第２のモノクローナル抗体が、ラテックスにそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫凝集法によりインスリンを測定する請求項１１，１３，１４，１５のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
17. 第１のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、第２のモノクローナル抗体は標識物質で標識されている、ＥＬＩＳＡ法によりインスリンを測定する請求項１１，１３，１４，１５のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
18. 第１のモノクローナル抗体は標識物質で標識しており、第２のモノクローナル抗体は固相に固定化されている、ＥＬＩＳＡ法又はイムノクロマトグラフ法によりインスリンを測定する請求項１１，１３，１４，１５のいずれかに記載のインスリン測定試薬。
19. 下記工程を含むモノクローナル抗体のスクリーニング方法。
    １）インスリンと反応する抗体を選択する工程
    ２）１）で選択した抗体が結合していないインスリンとは反応せず、当該抗体が結合したインスリンと反応するモノクローナル抗体を選択する工程