JP2009514975A - ヒトｂｎｐ免疫特異的抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド又はヒト脳ナトリウム利尿ペプチド断片に高い親和性で免疫特異的に結合する抗体、該抗体を産生し選択するための方法、該抗体を用いる、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド又はヒト脳ナトリウム利尿ペプチド断片に対する免疫アッセイ及び該抗体を含有する治療組成物に関する。

Description

本発明は、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド又はヒト脳ナトリウム利尿ペプチド断片に高い結合親和性で免疫特異的に結合する抗体、該抗体を産生し選択するための方法、該抗体を用いる、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド又はヒト脳ナトリウム利尿ペプチド断片に対する免疫アッセイ及び該抗体を含有する治療組成物に関する。
心房性ナトリウム利尿ペプチド（本明細書中で以後、「ＡＮＰ」と呼ぶ。）、脳ナトリウム利尿ペプチド（本明細書中で以後、「ＢＮＰ」と呼ぶ。）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（本明細書中で以後、「ＣＮＰ」と呼ぶ。）及びデンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ、マンバヘビ）ナトリウム利尿ペプチド（本明細書中で以後、「ＤＮＰ」と呼ぶ。）は、それぞれ、「ナトリウム利尿ペプチド」として知られているホルモンのファミリーのメンバーである。ＡＮＰ及びＢＮＰは、幅広い生物学的特性が共通しており、心臓ナトリウム利尿系に属する。ＡＮＰ及びＢＮＰの両者は心筋細胞由来であるが、一方、ＣＮＰは内皮細胞由来である。ＤＮＰは、ミドリマンバヘビの毒液から単離されたもので、ＡＮＰ、ＢＮＰ及びＣＮＰと構造的に類似性がある。
ＢＮＰの名称の由来は、それが最初にブタ脳から単離されたからであり、したがって「ＢＮＰ」は「脳ナトリウム利尿ペプチド」を表した。しかし、ＢＮＰは心臓ナトリウム利尿系に属するので、「脳」は、「Ｂ型」に変更された。したがって、「ＢＮＰ」は現在、「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」と呼ばれる。
ＡＮＰは、心房において心臓により分泌される。ＢＮＰは、冠状静脈洞を通じて心臓により、主に心室から分泌される。ＢＮＰは、１０８アミノ酸ポリペプチド前駆体として分泌される（Ｖａｌｌｉら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１３４（５）：４３７−４４４（１９９９年１１月）を参照）。ＢＮＰの成熟型は、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合により閉じられた１７アミノ酸環、９アミノ酸のアミノ末端テール及び６アミノ酸のカルボキシ末端テールを有する３２アミノ酸（１０８アミノ酸ポリペプチド前駆体のアミノ酸７７−１０８に相当する。）からなる。ＡＮＰ及びＣＮＰもまた、２個のシステイン残基間のジスルフィド結合により閉じられた１７アミノ酸の環を有する。この環の１７個のアミノ酸のうち１１個は、この３種類の分子間で保存されている。７アミノ酸環構造に加えて、ＡＮＰは、６アミノ酸のアミノ末端テール及び５アミノ酸のカルボキシ末端テールを有する。ＡＮＰは、ＡＮＰの主要な貯蔵型である１２６アミノ酸Ｐｒｏ−ＡＮＰ型として産生される。アミノ酸９８と９９との間のタンパク質分解性の切断後、成熟２８アミノ酸ペプチドＡＮＰが冠状静脈洞血漿において見られる（Ｙａｎｄｅｌ、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄ．、２３５：５６１−５７６（１９９４）参照）。
ＣＮＰは、脳及び脳脊髄液において見られ、中枢神経系において３種類のペプチドの中で最も主要なものである。ＣＮＰが心臓に存在するとしてもわずかである。Ｐｒｏ−ＣＮＰは、活性ペプチドである、ＣＮＰ−５３（アミノ酸５１から１０３）又はＣＮＰ−２２（アミノ酸８２から１０３）の何れかにプロセシングされる１０３アミノ酸ペプチドである。さらに、１７アミノ酸環構造、ＣＮＰ−２２は、５アミノ酸のアミノ末端テールを有し、カルボキシ末端テールがない。ＣＮＰ−５３は、アミノ末端部の３１アミノ酸の延長部分を除き、ＣＮＰ−２２と同一である。
既に述べたように、ＤＮＰはミドリマンバヘビの毒液から単離された。ＤＮＰの成熟型は３８アミノ酸からなる。ＤＮＰ様免疫反応性（ＤＮＰ−ＬＩ）がヒト血漿において報告されており、ＤＮＰ−ＬＩの血漿濃度は、うっ血性心不全の患者において上昇していることが分かっている（Ｃａｔａｌｉｏｔｔｉら、Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．、７６：１１１−１１１９（２００１）参照）。さらに、合成ＤＮＰの点滴により、血漿及び尿の環状グアノシン一リン酸の上昇に付随して、顕著なナトリウム利尿及び利尿が起こることも知られている。前述。
天然ヒトナトリウム利尿ペプチドに伴う問題の１つは、これらが血漿及び血清中で不安定なことである。具体的に、プロテアーゼなどの酵素はこれらのペプチドを切断する。例えば、プロテアーゼはアミノ酸鎖の様々な場所でＢＮＰ（天然及び合成）を切断する。例えば、プロテアーゼ切断は、アミノ酸２から３の間のＢＮＰのアミノ末端（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ、３１６：１２９−１３５（２００２））及びアミノ酸３０から３２の間のそのカルボキシ末端で起こることが知られている。さらに、ＢＮＰのエンドペプチダーゼ切断も本分野で知られている（Ｄａｖｉｄｓｏｎ及びＳｔｒｕｔｈｅｒｓ、Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、１２：３２９−３３６（１９９４））。
一般集団において、ヒトでの成熟型ＢＮＰ（即ち、３２アミノ酸分子（ＢＮＰの前駆体ポリペプチドのアミノ酸７７−１０８））（本明細書中で以後、「ｈＢＮＰ」と呼ぶ。）の測定は、うっ血性心不全、虚血性心疾患、心房細動及び腎機能障害などの心臓疾患を反映することが分かっている。実際に、心疾患において、急性心筋梗塞後及び無症候性又亜臨床心室機能障害の間、ヒト血漿中のＢＮＰレベルが上昇することが報告されている（Ｍｕｋｏｙａｍａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８７：１１４０２−１１４１２（１９９１）、Ｍｏｔｗａｎｉら、Ｌａｎｃｅｔ、３４１：１１０９−１１１３（１９９３）、Ｙｏｓｈｉｂａｙａｓｈｉら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２７：４３４（１９９２）参照）。うっ血性心不全、慢性腎機能不全及び重度の高血圧においてＡＮＰの循環レベルの上昇が見られる。ヒト血漿中でのＣＮＰの存在は、ＣＮＰ−２２としてのその有無の報告と今だ意見の分かれるところである。（Ｙａｎｄｅｌ、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄ．、２３５：５６１−５７６（１９９４）参照）。
リガンド結合アッセイは、特異的結合タンパク質と選択的に反応する、一般にリガンドと呼ばれる物質の濃度を測定するための分析技術である。特異的抗体と選択的に反応する抗原濃度を測定する免疫アッセイは、リガンド結合アッセイの類の例である。
血漿中のヒトナトリウム利尿ペプチド、特にｈＢＮＰ、を測定するための、免疫アッセイなどのリガンド結合アッセイは、当技術分野で周知であり、市販されている。これらの免疫アッセイでは、少なくとも１又は２種類の特異的抗体ならびに少なくとも１つのキャリブレーター及び、理想的には、少なくとも１つの対照を使用する必要がある。キャリブレーター及び対照に加えて、免疫アッセイの場合、少なくとも１つの試験試料を使用する必要がある。試験試料は、通常、血清、血漿、全血又はその他の体液由来の生物試料である（普通は、ヒト患者から）。試験試料中の少なくとも１種類のヒトナトリウム利尿ペプチドのレベルを免疫アッセイにおいて定量する。
例えば、米国特許第６，１６２，９０２号（本明細書中で以後、「９０２特許」と呼ぶ。）は、ｈＢＮＰのエピトープ１−１０、５−１３及び１５−２５に対して単一特異的に反応性がある単離抗体を開示する。より具体的には、この「９０２特許」は、２種類の単離モノクローナル抗体を記載している。第一のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２０４４）により産生され、ｈＢＮＰのエピトープ５−１３と単一特異的に反応性がある。第二のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株２０１．３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１２０４５）により産生され、ｈＢＮＰのエピトープ１−１０と単一特異的に反応性がある。この「９０２特許」はまた、生物試料中のｈＢＮＰの量を定量することを目的とする免疫アッセイにおける上記の抗体の使用も記載している。米国特許第６，６７７，１２４号（本明細書中で以後、「１２４特許」と呼ぶ。）は、ｈＢＮＰのＣ末端領域で見られるＬＹＳ−ＶＡＬ−ＬＥＵ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＨＩＳのアミノ酸配列を有するエピトープ（すなわちエピトープ２７−３２）に結合するモノクローナル抗体を開示する。より具体的には、この「１２４特許」は、ハイブリドーマ細胞株ＢＣ２０３（ＦＥＲＭ ＢＰ−３５１５）により産生されるモノクローナル抗体を記載している。この「１２４特許」はまた、このモノクローナル抗体を用いたｈＢＮＰに対する免疫アッセイも記載している。
ｈＢＮＰ免疫アッセイなどの免疫アッセイで使用される抗体の特異性及び感度が非常に重要であることが当技術分野で一般に知られている。１以上の抗体の特異性及び感度の両方を向上させるある方法は、抗体の、その目的とする標的（すなわち抗原）に対する結合親和性を向上させることである。目的とする標的に対する結合親和性が向上している抗体は、特異性及び感度が高くなっているはずである。それゆえ、高い結合親和性でヒトＢＮＰと特異的に結合し、したがってｈＢＮＰ免疫アッセイで使用される場合に高い特異性及び感度を示す新しい抗体が当技術分野で必要とされている。
ある態様において、本発明は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（この細胞株はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１２０４４を有する。）により産生される抗体と比較した場合、少なくとも約２倍高い平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）のアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する単離抗体に関する。より具体的には、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体と比較した場合、そのＫＤが、少なくとも約３倍改善、少なくとも約５倍改善、少なくとも約１０倍改善、少なくとも約１５倍改善、少なくとも約２０倍改善又は少なくとも約２５倍改善している。本発明の単離抗体は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片であり得る。
別の態様において、本発明は、約５．０ｘ１０４から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度（ｋａ）を有する、ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する単離抗体に関する。より具体的には、本発明の抗体は、約３．３ｘ１０４から約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１の間、約２．５ｘ１０４から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１の間又は約２．４ｘ１０４から約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度を有する。本発明の単離抗体は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片であり得る。さらに、この単離抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する。
別の態様において、本発明は、約１．０ｘ１０−３から約１．０ｘ１０−６・ｓ−１の間の解離速度（ｋｄ）を有する、ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する単離抗体に関する。より具体的には、本発明の抗体は、約１．０ｘ１０−３から約１．０ｘ１０−５・ｓ−１の間又は約１．０ｘ１０−３から約１．０ｘ１０−４・ｓ−の間の解離速度を有する。本発明の単離抗体は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片であり得る。さらに、この単離抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する。
別の態様において、本発明は、約２ｘ１０−１１Ｍから約１ｘ１０−１５Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）を有する、ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する単離抗体に関する。より具体的には、本発明の抗体は、約３．０ｘ１０−１１Ｍから約１．０ｘ１０−１４Ｍの間、約４．０ｘ１０−１１Ｍから約８．０ｘ１０−１３Ｍの間、又は約４．２ｘ１０−１１Ｍから約７．４ｘ１０−１３Ｍの間の平衡解離定数を有する。本発明の単離抗体は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片であり得る。さらに、この単離抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する。
さらに別の態様において、本発明は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６９８７を有するチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞株ＡＭ１に関する。
またさらに別の態様において、本発明は、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６９８７を有するＣＨＯ細胞株ＡＭ１から抽出されたＤＮＡから作製された抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明は、ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される、キメラ抗体又はそのｈＢＮＰ−エピトープ結合断片に関する（この細胞株はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６９８７を有する。）。
またさらなる態様において、本発明は、ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する単離抗体に関するが、この抗体は可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを有し、この可変重鎖ドメインは、重鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３を含有し、この可変軽鎖ドメインは、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含有し、
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１２）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ１は、プロリン及びアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ２は、イソロイシン及びチロシンからなる群から選択され；
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号８）のアミノ酸配列を有し；
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１３）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ３は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、スレオニン及びアルギニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ４は、グルタミン、チロシン、トリプトファン、アラニン及びフェニルアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ５は、セリン、グリシン、プロリン、アラニン及びアスパラギン酸からなる群から選択され；
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｓｅｒ（配列番号１４）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ６は、アスパラギン及びシステインからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ７は、ロイシン、グリシン及びアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ８は、グルタミン酸、トリプトファン及びプロリンからなる群から選択され；
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有し；
軽鎖ＣＤＲ１がＬｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２がＡｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する場合、重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）以外のアミノ酸配列を有するか、重鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有し、軽鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）を有する場合、軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）以外のアミノ酸配列を有するか、又は、重鎖ＣＤＲ２がＴｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１が、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する場合、軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）以外のアミノ酸配列を有する。
より具体的には、上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はアラニンであり得；
Ｘａａ２はチロシンであり得；
Ｘａａ３はセリンであり得；
Ｘａａ４はグルタミンであり得；
Ｘａａ５はセリンであり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はグルタミンであり得；
Ｘａａ４はフェニルアラニンであり得；
Ｘａａ５はアラニンであり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はチロシンであり得；
Ｘａａ４はアラニンであり得；
Ｘａａ５はセリンであり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はグルタミンであり得；
Ｘａａ４はトリプトファンであり得；
Ｘａａ５はグリシンであり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はスレオニンであり得；
Ｘａａ４はトリプトファンであり得；
Ｘａａ５はアスパラギン酸であり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はアルギニンであり得；
Ｘａａ４はトリプトファンであり得；
Ｘａａ５はプロリンであり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はアラニンであり得；
Ｘａａ４はチロシンであり得；
Ｘａａ５はグリシンであり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はアスパラギンであり得；
Ｘａａ４はトリプトファンであり得；
Ｘａａ５はプロリンであり得；
Ｘａａ６はアスパラギンであり得；
Ｘａａ７はロイシンであり得；
Ｘａａ８はグルタミン酸であり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はセリンであり得；
Ｘａａ４はグルタミンであり得；
Ｘａａ５はセリンであり得；
Ｘａａ６はシステインであり得；
Ｘａａ７はグリシンであり得；
Ｘａａ８はトリプトファンであり得るか；又は
上述の単離抗体において：
Ｘａａ１はプロリンであり得；
Ｘａａ２はイソロイシンであり得；
Ｘａａ３はセリンであり得；
Ｘａａ４はグルタミンであり得；
Ｘａａ５はセリンであり得；
Ｘａａ６はシステインであり得；
Ｘａａ７はアラニンであり得；
Ｘａａ８はプロリンであり得る。
上述の抗体は、約２．０ｘ１０−１１Ｍから約１．０ｘ１０−１５Ｍの間、約３．０ｘ１０−１１Ｍから約１．０ｘ１０−１４Ｍの間、約４．０ｘ１０−１１Ｍから約８．０ｘ１０−１３Ｍの間又は約４．２ｘ１０−１１Ｍから約７．４ｘ１０−１３Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。さらに、上述の抗体は、約５．０ｘ１０４から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１Ｍの間の会合速度（ｋａ）を有し得る。さらに、上述の抗体は、約１．０ｘ１０−３から１．０ｘ１０−６ｓ−１の間の解離速度（ｋｄ）を有し得る。さらに、本発明の上述の抗体は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片であり得る。最後に、上述の抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合し得る。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のための免疫アッセイに関し、この免疫アッセイは、本明細書で前に述べた本発明の抗体の何れか１種類を含む。より具体的には、この免疫アッセイは、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体を１種類のみ含み得る。さらに、この免疫アッセイは、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対するさらなる特異的結合パートナーをさらに含み得る。
別の態様において、本発明は、本明細書中で前に述べた本発明の抗体の何れかの治療的有効量と、医薬的に許容可能な担体又は賦形剤と、を含有する医薬組成物に関する。
図面の簡単な説明
図１は、高い結合親和性でヒトＢＮＰに免疫特異的に結合する抗体を同定し作製するために使用される段階を示すフローチャートである。
図２は、図４で示される１０６．３ １本鎖可変断片を含有するベクターｐＹＤ４１−４０に対するプラスミドマップである。
図３Ａ−３Ｅは、図２で示されるベクターのヌクレオチド配列である。
図４は、１０６．３ １本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）の略図である。
図５は、１０６．３ １本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）のアミノ酸配列を示す。実線を引いた配列は、可変重鎖配列（「ＶＨ」）を表し、二重線を引いた配列はリンカーを表し、点線を引いた配列は可変軽鎖配列（「ＶＬ」）を表す。斜字体及び太字は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す。
図６Ａ−６Ｂは、１０６．３ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を示す。
図７Ａ−７Ｂは、酵母発現全長１０６．３ １本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が環状ＢＮＰ（配列番号５）に結合することを示す。より具体的には、この図は、１０６．３ ｓｃＦｖ発現酵母を環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）（配列番号５）又は抗−Ｖ５とインキュベートし、次いで二次試薬ストレプトアビジンフィコエリスリン（ＳＡ：ＰＥ）（図７Ａ）及びヤギ抗マウス−フィコエリスリン（ＧＡＭ：ＰＥ）（図７Ｂ）とインキュベートしたことを示す。このフローサイトメトリーのヒストグラムは、抗−Ｖ５により検出した場合の１０６．３ ｓｃＦｖの全長発現及び１０６．３ ｓｃＦｖの環状ＢＮＰペプチド（１−３２）（配列番号５）への結合能を示す。ＰＥＡ単位（横座標）：１０２、１０３、１０４及び１０５。カウント単位（縦座標）：０、５０、１００、１５０（図７Ａ）；０、２５、５０、７５、１００、１２５（図７Ｂ）。
図８は、１０６．３ ｓｃＦｖオフ速度測定を示す。より具体的には、酵母発現１０６．３ ｓｃＦｖをビオチン化環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）（配列番号５）の飽和濃度とインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、非標識ＢＮＰ １−３２ｃ（配列番号５）の飽和濃度とインキュベートした。各時点で、細胞を氷上に移し、洗浄し、ＳＡ：ＰＥとインキュベートした。３０分後、細胞を再び洗浄し、フローサイトメーターで分析した。個々の時間点をフィットさせるために一次減衰式を使用した（ｍ１は、時間０での理論的最大平均蛍光単位（「ＭＦＵ」）であり、ｍ２はオフ速度（「ｋｏｆｆ」）であり、ｍ３は、自己蛍光によるバックグラウンドＭＦＵであり、時間ｘであるＭ０（ｘは、測定されている時間である。）は、測定が行われる時間ｘであった。ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆを用いて環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）に結合する１０６．３ ｓｃＦｖの半減期（ｔ１／２）を計算した。半減期の１．５倍は、１０６．３ ＣＤＲ変異誘発ライブラリを分類するために使用された時間であった。
図９は、相補性決定領域の３アミノ酸位置（９ヌクレオチド）が無作為にライブラリごとに変異化されるように、どのように縮重オリゴヌクレオチドを設計するかを示す図表である。
図１０は、酵母相同組み換えを用いてどのように１０６．３ ｓｃＦｖライブラリを構築するかを示す図表である。より具体的には、ライブラリにおいて変異誘発されているヌクレオチドを除外するために、ギャップのあるベクターをＰＣＲで作製した。縮重１本鎖オリゴヌクレオチドを合成した。ギャップのあるベクター及び１本鎖縮重オリゴヌクレオチドをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）株ＥＢＹ１００へと形質転換した。トリプトファン欠乏グルコース培地中で形質転換クローンを選択した。
図１１は、ＣＤＲ変異誘発ライブラリから単離された１０６．３ ｓｃＦｖ変異体のオフ速度が改善したこと（すなわち前記変異体のｋｏｆｆが遅くなった。）を示す概略である。
図１２Ａ−Ｃは、ｓｃＦｖ １０６．３変異体の配列特性を示す。より具体的には、１０６．３変異体からプラスミドＤＮＡを単離し、ｓｃＦｖ遺伝子の配列決定を行った。
図１３は、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた、表面プラズモン共鳴による、選択した１０６．３改変ヒト−マウスキメラ抗体及びマウス１０６．３ｍＡｂの親和性測定を示す。
図１４Ａ−Ｈは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。
図１５は、実施例３で述べたような単一抗体アッセイ方式での抗体ＡＭ１のヒト環状ＢＮＰ１−３２への結合能を調べるための試験の結果を示す（Ｘ＝非標識ヒト環状ＢＮＰ １−３２のある一定濃度により生じたシグナル；Ａ＝非標識ヒト環状ＢＮＰ １−３２なしで生じたシグナル；Ｘ／Ａ＝これらの２つのシグナルの比）。
図１６は、実施例４で述べたように、抗体ＡＭ１及び融合物３を用いたストレプトアビジン微小粒子を使用した、抗ｈＢＮＰ抗体ペア評価を示す。基本的に、次のものを使用した：０．０５％固形のＭ２８０ ストレプトアビジン粒子、６５ｎｇ／ｍＬ共役物、１００μＬ試料体積及び２段階（１８／４）サンドイッチ方式。記号及び略語：菱型、抗ＢＮＰ（１０６．３ ＡＭ１）ＳＡ μＰ／抗ＢＮＰ（融合物３）ＣＰＳＰ；四角、抗ＢＮＰ（融合物３）ＳＡ μＰ／抗ＢＮＰ（１０６．３ ＡＭ１）ＣＰＳＰ）；ＲＬＵ、相対光単位。
図１７は、実施例４で述べたように、抗体ＡＭ１及び融合物３を用いた常磁性体微小粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓより。）を使用した、抗ｈＢＮＰ抗体ペア評価を示す。記号及び略語：菱型、抗ＢＮＰ（１０６．３ ＡＭ１）ＳＡ μＰ／抗ＢＮＰ（融合物３）ＣＰＳＰ；四角、抗ＢＮＰ（融合物３）ＳＡ μＰ／抗ＢＮＰ（１０６．３ＡＭ１）ＣＰＳＰ）；ＲＬＵ、相対光単位。
図１８は、様々なｈＢＮＰペプチド（約１８１ｎＭで使用）での抗体ＡＭ１（約０．０１μｇ／ｍＬで使用）の置換を示す。
図１９は、ＥＩＡを用いた抗体ＡＭ１のアラニンペプチドマッピングを示す。
図２０は、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた抗体ＡＭＩのアラニンペプチドマッピングを示す。様々なＢＮＰペプチドを含有するＢＮＰ複合体のｋｏｆｆの上昇（倍）を示す。
Ｉ．導入：本発明は、高い結合親和性でヒト脳ナトリウム利尿ペプチドに免疫特異的に結合する新規抗体に関する。本発明の抗体は、非常に感度の高い試薬であり、試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の定性的及び／又は定量的検出に有用である。別の実施形態において、本発明は、本発明の抗体を用いた免疫アッセイに関する。またさらなる実施形態において、本発明は、本発明の抗体を含有する治療組成物に関する。
定義
本明細書中で使用する場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全又は部分的ヒト化）、動物抗体（ある態様において、鳥類（例えばアヒル又はガチョウ）、別の態様において、サメ又はクジラ、さらに別の態様において、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）及び非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルなどのサル、チンパンジーなど）を含む哺乳動物）、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む。）及び上記の何れかの機能的に活性のあるエピトープ結合断片を指す。特に、抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある断片、すなわち抗原結合部位を含有する分子が含まれる。免疫グロブリン分子は、何れかのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。
本明細書中で使用する場合、「会合速度」、「ｋｏｎ」又は「ｋａ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用する場合、その標的抗原に対する抗体の結合強度（程度）又は下記により示されるようなｍＡｂと抗原との間の複合体形成速度を示す値を指す。
抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）→Ａｂ−Ａｇ
会合定数（ＫＡ）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（Ｓｗｅｄｅｎ）アッセイを使用することができる。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイを使用することもできる。
本明細書中で使用する場合、「解離速度」、「ｋｏｆｆ」又は「ｋｄ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用する場合、その標的抗原からの抗体の解離又は下記で示されるような遊離ｍＡｂ及び抗原への時間によるＡｂ−Ａｇ複合体の分離の強度（程度）を示す値を指す。
抗体（Ａｂ）＋抗原（Ａｇ）←Ａｂ−Ａｇ
解離定数（ＫＤ）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（Ｓｗｅｄｅｎ）アッセイを使用することができる。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ）アッセイを使用することもできる。
本明細書中で使用する場合、「エピトープ」という用語は、対象において抗原性又は免疫原性活性を有する、ポリペプチド又はタンパク質の部位又は断片を指す。免疫原性活性を有するエピトープは、動物において抗体反応を誘発する、ポリペプチド又はタンパク質の部位又は断片である。抗原活性を有するエピトープは、当業者にとって周知の何らかの方法により（例えば免疫アッセイにより）決定されるような、抗体が免疫特異的に結合する、ポリペプチド又はタンパク質の部位又は断片である。
本明細書中で使用する場合、「平衡解離定数」又は「ＫＤ」という用語は、本明細書中で交換可能に使用する場合、解離速度（ｋｏｆｆ）を会合速度（ｋｏｎ）で割ることにより得られる値を指す。抗原への抗体の結合親和性を表すために、会合速度、解離速度及び平衡解離定数が使用される。
本明細書中で使用する場合、「ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド」、「ヒトＢＮＰ」、「ｈＢＮＰ」、「ｈＢＮＰペプチド」、「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」又は「ｈＢＮＰポリペプチド」という用語は、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチドの１０８アミノ酸前駆体分子のアミノ酸７７−１０８に相当する、３２アミノ酸分子を指す。
本明細書中で使用する場合、「ｈＢＮＰ断片」又は「ｈＢＮＰペプチド断片」という用語は、本明細書中で使用する場合、１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７−１０８の少なくとも約５連続アミノ酸を含有するポリペプチドを指す。ある態様において、ｈＢＮＰ断片又はｈＢＮＰペプチド断片とは、１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７−１０８の少なくとも約１０連続アミノ酸残基；１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７−１０８の少なくとも約１５連続アミノ酸残基；１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７−１０８の少なくとも約２０連続アミノ酸残基；１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７−１０８の少なくとも約２５連続アミノ酸残基；又は１０８アミノ酸ＢＮＰ前駆体分子のアミノ酸７７−１０８の少なくとも約３０連続アミノ酸残基を含有するポリペプチドを指す。ｈＢＮＰ断片又はｈＢＮＰペプチド断片の例には、以下に限定されないが、ｈＢＮＰの、アミノ酸残基１−３１、１−３０、１−２９、１−２８、１−２７、１−２６、１−２５、１−２４、１−２３、１−２２、１−２１、１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６、１−１５、２−３２、２−３１、２−３０、２−２９、２−２８、２−２７、２−２６、２−２５、２−２４、２−２３、２−２２、２−２１、２−２０、２−１９、２−１８、２−１７、２−１６、２−１５、２−１４、２−１３、２−１２、２−１１、２−１０、２−９、２−８、２−７、３−３２、３−３１、３−３０、３−２９、３−２８、３−２７、３−２６、３−２５、３−２４、３−２３、３−３２、３−２１、３−２０、３−１９、３−１８、３−１７、３−１６、３−１５、３−１４、３−１３、３−１２、３−１１、３−１０、３−９、３−８、４−３２、４−３１、４−３０、４−２９、４−２８、４−２７、４−２６、４−２５、４−２４、４−２３、４−２２、４−２１、４−２０、４−１９、４−１８、４−１７、４−１６、４−１５、４−１４、４−１３、４−１２、４−１１、４−１０、４−９、５−３２、５−３１、５−３０、５−２９、５−２８、５−２７、５−２６、５−２５、５−２４、５−２３、５−２２、５−２１、５−２０、５−１９、５−１８、５−１７、５−１６、５−１５、５−１４、５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、６−３２、６−３１、６−３０、６−２９、６−２８、６−２７、６−２６、６−２５、６−２４、６−２３、６−２２、６−２１、６−２０、６−１９、６−１８、６−１７、６−１６、６−１５、６−１４、６−１３、６−１２、６−１１、７−３２、７−３１、７−３０、７−２９、７−２８、７−２７、７−２６、７−２５、７−２４、７−２３、７−２２、７−２１、７−２０、７−１９、７−１８、７−１７、７−１６、７−１５、７−１４、７−１３、７−１２、８−３２、８−３１、８−３０、８−２９、８−２８、８−２７、８−２６、８−２５、８−２４、８−２３、８−２２、８−２１、８−２０、８−１９、８−１８、８−１７、８−１６、８−１５、８−１４、８−１３、９−３２、９−３１、９−３０、９−２９、９−２８、９−２７、９−２６、９−２５、９−２４、９−２３、９−２２、９−２１、９−２０、９−１９、９−１８、９−１７、９−１６、９−１５、９−１４、１０−３２、１０−３１、１０−３０、１０−２９、１０−２８、１０−２７、１０−２６、１０−２５、１０−２４、１０−２３、１０−２２、１０−２１、１０−２０、１０−１９、１０−１８、１０−１７、１０−１６、１０−１５、１１−３２、１１−３１、１１−３０、１１−２９、１１−２８、１１−２７、１１−２６、１１−２５、１１−２４、１１−２３、１１−２２、１１−２１、１１−２０、１１−１９、１１−１８、１１−１７又は１１−１６を含有するアミノ酸配列が含まれる。
本明細書中で使用する場合、「ヒト化」抗体という用語は、免疫グロブリン変異体又はその断片を指し、この断片は、所定の抗原と結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域及び非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む。通常は、ヒト化抗体は、ヒトではない源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１、通常は２個の可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、好ましくは免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部（通常はヒト免疫グロブリンのもの）を含む。一般に、この抗体は、軽鎖ならびに、重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの何れかのクラス及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む何れかのアイソタイプからヒト化抗体を選択することができる。ヒト化抗体は、複数のクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当業者の範囲内である。
本明細書中で使用する場合、「ヒト脳ナトリウム利尿ペプチドに免疫特異的に結合する」、「ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する」、「ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド断片に免疫特異的に結合する」又は「ｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する」という語句及びこれらの語句に類似のものは、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に特異的に結合し、その他のペプチドに特異的に結合しない、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質及び抗体を指す。ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は抗体は、その他のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に結合し得るが、例えば免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ又は当技術分野で公知のその他のアッセイにより調べた場合に結合親和性がより低い。ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体又は抗体断片を、例えば、免疫アッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ又は当業者にとって公知のその他の技術により同定することができる。抗体は、以下に限定されないが、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を用いて調べたときに何らかの交差反応抗原に対する場合よりも高い結合親和性でｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に結合する場合、ｈＢＮＰペプチド又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する（抗体特異性に関する考察に対して、例えば、Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３３２−３３６頁（１９８９）を参照）。本発明のある態様において、標準的アッセイ条件下でＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより、特に実施例１に記載のＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより測定したときに、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対する平衡解離定数（ＫＤ）が少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍである場合、抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する。
本明細書中で使用する場合、核酸分子に関して「単離された」という用語は、その核酸分子の天然源に存在するその他の核酸分子から分離された核酸分子を指す。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組み換え技術により産生された場合、実質的にその他の細胞性物質又は培地不含であり得るか、又は、化学合成された場合、実質的に化学的前駆体又はその他の化学物質不含であり得る。ある態様において、核酸分子は単離されている。別の態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は単離されている。
本明細書中で使用する場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルター結合ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションとそれに続く約５０−６５℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を指す。「非常にストリンジェントな条件下」という用語は、約４５℃の６ｘＳＳＣ中でのフィルター結合核酸に対するハイブリダイゼーションとそれに続く約６８℃の０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄又は当業者にとって公知のその他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下を指す（例えば、Ａｕｓｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．Ｉ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、６．３．１−６．３．６及び２．１０．３頁参照）。
本明細書中で使用する場合、「対象」及び「患者」という用語は交換可能に使用する。本明細書中で使用する場合、「対象」という用語は、動物、ある態様において、鳥類（例えばアヒル又はガチョウ）、別の態様において、サメ又はクジラ、又はさらなる態様において、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウスなど）及び霊長類（例えば、カニクイザルなどのサル、チンパンジー及びヒト）を含む哺乳動物を指す。
本明細書中で使用する場合、「試験試料」という用語は、対象の、血清、血漿、全血、リンパ液、ＣＮＳ液、尿又はその他の体液由来の生物学的試料を指す。当業者にとって公知の通常の技術を用いて、試験試料を調製することができる。
本明細書中で使用する場合、「治療的有効量」又は「医薬的有効量」という用語は、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を達成するのに有効な抗体又は抗体部分の量を意味する。正確な用量は、当業者により確かめられ得る。当技術分野で知られているように、年齢、体重、性別、人種、食事、投与時間、薬物相互作用及び状態の重症度に基づく調整が必要であり得、当業者により通常の実験で確かめられ得る。治療的有効量はまた、治療上の有益な効果が抗体又は抗体断片の何らかの毒性又は有害な影響を上回るものである。「予防的有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。通常、疾患の前又は初期段階では、対象において予防的用量を使用するので、予防的有効量は治療的有効量より少ない。
ＩＩ．本発明の抗体
本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対して高い結合親和性を有する抗体を提供する。具体的に、ある態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１２０４４を有するハイブリドーマ細胞株１０６．３（本明細書中で「野生型」とも呼ぶ。）により産生される抗体と比較した場合、その平衡解離定数（ＫＤ）が少なくとも約２倍改善している抗体に関する。より具体的には、本発明の抗体は、ｈＢＮＰ又はそのｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合し、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（野生型）により産生される抗体と比較した場合、その平衡解離定数（ＫＤ）が、少なくとも約３倍改善、少なくとも約５倍改善、少なくとも約１０倍改善、少なくとも約１５倍改善、少なくとも約２０倍改善、少なくとも約２５倍改善、少なくとも約３０倍改善、少なくとも約３５倍改善、少なくとも約４０倍改善、少なくとも約４５倍改善、少なくとも約５０倍改善、少なくとも約５５倍改善、少なくとも約６０倍改善、少なくとも約７０倍改善又は少なくとも約約７５倍改善している。
別の態様において、本発明は、免疫特異的にｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に結合し、ｋｏｎ（又はｋａ）が、少なくとも約２．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、、少なくとも約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１であるか又はｋｏｎ（又はｋａ）が、約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１、約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、約２．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲である抗体に関する。
別の態様において、本発明の抗体は、少なくとも約２．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ（又はｋａ）でヒトＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に免疫特異的に結合するか、又は約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１、約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、約２．４ｘ１０−１１Ｍ−１ｓ−１から約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ（又はｋａ）を有する。
別の態様において、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＡＭ１（１０６．３ Ｌ１ Ｂ２４／Ｈ２２８８としても知られる。）により産生される抗体を提供する。この細胞株により産生される抗体は、少なくとも約２．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ（又はｋａ）でｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に結合するか又は約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１、約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、約２．４ｘ１０−１１Ｍ−１ｓ−１から約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ（又はｋａ）を有する。
本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対して高い結合親和性を有する抗体を提供する。より具体的には、ある態様において、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、ｋｏｆｆ（又はｋｄ）が少なくとも１．０ｘ１０−３ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−４ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−５ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−６ｓ−１であるか又はｋｏｆｆ（又はｋｄ）が１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−６ｓ−１、１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−５ｓ−１又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−４ｓ−１の範囲である抗体を提供する。
別の態様において、本発明の抗体は、少なくとも１．０ｘ１０−３ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−４ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−５ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ（又はｋｏｆｆ）でヒトＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に免疫特異的に結合するか又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−６ｓ−１、１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−５ｓ−１又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−４ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を有する。
別の態様において、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＡＭ１により産生される抗体を提供する。この細胞株により産生される抗体は、少なくとも１．０ｘ１０−３ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−４ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−５ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ（又はｋｄ）でｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に結合するか又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−６ｓ−１、１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−５ｓ−１又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−４ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を有する。
本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体を提供する。特に、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対して高い結合親和性を有する抗体を提供する。より具体的には、ある態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤを有するか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する抗体に関する。
別の態様において、本発明の抗体は、少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤでヒトＢＮＰのアミノ酸残基５から１３に免疫特異的に結合するか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲であるＫＤを有する。
別の態様において、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株ＡＭ１により産生される抗体を提供する。この細胞株により産生される抗体は、４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３ＭのＫＤでｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に結合する。
別の態様において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２０４４）により産生される抗体の誘導体又は変異体である。より具体的には、本発明の発明者らは、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体の誘導体又は変異体である抗体が、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対して高い結合親和性を示し得ることを発見した。より具体的には、本発明の抗体は、少なくとも約２．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、、少なくとも約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ（又はｋａ）を示すか又は約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１、約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、約２．４ｘ１０１１Ｍ−１ｓ−１から約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ（又はｋａ）を有し、少なくとも１．０ｘ１０−３ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−４ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−５ｓ−１、少なくとも１．０ｘ１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を有するか又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−６ｓ−１、１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−５ｓ−１又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−４ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を有し、少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤを有するか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する。本発明の誘導化又は変異抗体は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（本明細書中で「野生型」とも呼ぶ。）により産生される抗体のアミノ酸配列と比較した場合、重鎖相補性決定（「ＣＤＲ」）領域（例えば、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び／又は重鎖ＣＤＲ３）の少なくとも１つにおいて少なくとも１つの変異（欠失、付加及び／又は置換など）及び／又は、軽鎖ＣＤＲ領域（例えば、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び／又は軽鎖ＣＤＲ３）において少なくとも１つの変異（欠失、付加及び／又は置換など）を含む。さらに、本発明の抗体は、ＣＤＲ以外の抗体の一部又は一部分において（以下に限定されないが、抗体のフレームワーク領域など）１以上のその他の変異（欠失、付加及び／又は置換など）も含有し得る。このような誘導体を作製するための方法は当技術分野で周知であり、これには、部位特異的変異誘発及びＰＣＲによる変異誘発の使用が含まれる（以下で詳細に考察する。）。
より具体的には、別の態様において、本発明の抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、次の式のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む：
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１−Ｘａａａ２−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１２）
（式中、Ｘａａ１は、プロリン及びアラニンからなる群から選択され、Ｘａａ２は、イソロイシン及びチロシンからなる群から選択され、ただし、Ｘａａ１がプロリンである場合、Ｘａａ２はイソロイシンではない。）。
またさらなる態様において、本発明の抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む。別の態様において、本発明は、配列番号１５のアミノ酸配列と、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明の抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、次の式を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む：
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１３）
（式中、Ｘａａ３は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、スレオニン及びアルギニンからなる群から選択され、Ｘａａ４は、グルタミン、チロシン、トリプトファン、アラニン及びフェニルアラニンからなる群から選択され、Ｘａａ５は、セリン、グリシン、プロリン、アラニン及びアスパラギン酸からなる群から選択され、ただし、Ｘａａ４がグルタミンであり、Ｘａａ５がセリンである場合、Ｘａａ３はセリンではない。）。
またさらなる態様において、本抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を有する。別の態様において、本発明は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列と、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体に関する。
さらに別の態様において、本発明の抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、次の式を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を含む：
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−−Ｘａａ８−Ｓｅｒ（配列番号１４）
（式中、Ｘａａ６は、アスパラギン及びシステインからなる群から選択され、Ｘａａ７は、ロイシン、グリシン及びアラニンからなる群から選択され、Ｘａａ８は、グルタミン酸、トリプトファン及びプロリンからなる群から選択され、ただし、Ｘａａ７がロイシンであり、Ｘａａ８がグルタミン酸である場合、Ｘａａ６はアスパラギンではない。）。
またさらなる態様において、本抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、配列番号２３又は配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を有する。別の態様において、本発明は、配列番号２３又は配列番号２４のアミノ酸配列と、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体に関する。
またさらなる態様において、本発明の抗体は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、次のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖可変ＣＤＲ３を有する：
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１２）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ１は、プロリン及びアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ２は、イソロイシン及びチロシンからなる群から選択され；
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号８）のアミノ酸配列を有し；
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１３）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ３は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、スレオニン及びアルギニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ４は、グルタミン、チロシン、トリプトファン、アラニン及びフェニルアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ５は、セリン、グリシン、プロリン、アラニン及びアスパラギン酸からなる群から選択され；
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｓｅｒ（配列番号１４）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ６は、アスパラギン及びシステインからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ７は、ロイシン、グリシン及びアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ８は、グルタミン酸、トリプトファン及びプロリンからなる群から選択され；
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有し；
軽鎖ＣＤＲ１がＬｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２がＡｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する場合、重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）以外のアミノ酸配列を有するか、重鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有し、軽鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）を有する場合、軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）以外のアミノ酸配列を有するか、又は、重鎖ＣＤＲ２がＴｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１が、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する場合、軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）以外のアミノ酸配列を有する。
好ましくは、上述の式を有する抗体は、上述の式において、Ｘａａ１−Ｘａａ８は下記表２で示されるアミノ酸残基を有する、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含む。
Figure 2009514975
ＩＩＩ．核酸分子
本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する本発明の抗体をコードする、通常は単離された核酸分子を提供する。ある態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はそのｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに結合し、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（該細胞株はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１２０４４を有する。）により産生される抗体と比較した場合、その平衡解離定数（ＫＤ）が、少なくとも約２倍改善、少なくとも約３倍改善、少なくとも約５倍改善、少なくとも約１０倍改善、少なくとも約１５倍改善、少なくとも約２０倍改善、少なくとも約２５倍改善、少なくとも約３０倍改善、少なくとも約３５倍改善、少なくとも約４０倍改善、少なくとも約４５倍改善、少なくとも約５０倍改善、少なくとも約５５倍改善、少なくとも約６０倍改善、少なくとも約７０倍改善又は少なくとも約７５倍改善した抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明はまた、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３を含むエピトープに結合し、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（該細胞はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１２０４４を有する。）により産生される抗体と比較した場合、その平衡解離定数（ＫＤ）が、少なくとも約２倍改善、少なくとも約３倍改善、少なくとも約５倍改善、少なくとも約１０倍改善、少なくとも約１５倍改善、少なくとも約２０倍改善、少なくとも約２５倍改善、少なくとも約３０倍改善、少なくとも約３５倍改善、少なくとも約４０倍改善、少なくとも約４５倍改善、少なくとも約５０倍改善、少なくとも約５５倍改善、少なくとも約６０倍改善、少なくとも約７０倍改善又は少なくとも約７５倍改善した抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤを有するか又は、２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。本発明はまた、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合し、少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤを有するか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本単離核酸分子は、少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤでヒトＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に免疫特異的に結合するか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する抗体をコードする。本発明はまた、少なくとも２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤでｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に免疫特異的に結合するか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
さらに別の態様において、本発明は、４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３ＭのＫＤでｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する（該核酸分子は、ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体のヌクレオチド配列を含む。）。本発明はまた、４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３ＭのＫＤでｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３に免疫特異的に結合する抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子（該核酸分子は、ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体のヌクレオチド配列を含む。）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する（該抗体は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−１２０４４）により産生される抗体の誘導体又は変異体を含む。）。本明細書中で既に考察したように、本発明の発明者らは、高い結合親和性で、特異的に少なくとも約２．４ｘ１０４Ｍ−１Ｓ−１、、少なくとも約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ（又はｋａ）を示すか又は５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１、２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、２．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ（又はｋａ）を有し、少なくとも約１．０ｘ１０−３ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０−４ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０−５ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を有するか又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−６ｓ−１、１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−５ｓ−１又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−４ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を有し、少なくとも約２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも約７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも約８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１５Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１６ＭのＫＤを有するか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１６Ｍ、２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体の誘導体又は変異体である抗体が産生され得ることを発見した。本発明の誘導化又は変異抗体は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体のアミノ酸配列と比較した場合、重鎖相補性決定（「ＣＤＲ」）領域（例えば、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２又は重鎖ＣＤＲ３）の少なくとも１つにおいて少なくとも１つの変異（欠失、付加及び／又は置換など）、軽鎖ＣＤＲ領域（例えば、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２又は軽鎖ＣＤＲ３）において少なくとも１つの変異（欠失、付加及び／又は置換など）を含む。本発明の抗体をコードする核酸分子において変異（欠失、付加及び／又は置換など）を導入するために、結果としてアミノ酸置換を生じさせる、部位特異的変異誘発及びＰＣＲによる変異誘発を含む、当業者にとって公知の標準的技術を使用することができる。ある態様において、本誘導体は、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される元の抗体と比較して、１０アミノ酸未満の置換、５アミノ酸未満の置換、４アミノ酸未満の置換、３アミノ酸未満の置換又は２アミノ酸未満の置換を含む。ある態様において、本誘導体は、１以上の予想される不可欠ではないアミノ酸残基（即ち、抗体がｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合するために重大ではないアミノ酸残基）においてなされる保存的アミノ酸置換を有する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換されるものである。同様の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で明らかにされている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。あるいは、飽和変異誘発などによって、コード配列の全て又は一部に、変異を無作為に導入することができ、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対する結合親和性が向上した変異体を同定するために、得られた変異体を生物学的活性についてスクリーニングすることができる。変異誘発後、コードされる抗体を発現させ、抗体の活性を調べることができる。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、次の式のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を有する：
Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ-Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１２）
（式中、Ｘａａ１は、プロリン及びアラニンからなる群から選択され、Ｘａａ２は、イソロイシン及びチロシンからなる群から選択され、ただし、Ｘａａ１がプロリンである場合、Ｘａａ２はイソロイシンではない。）。本発明はまた、上述の式のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を有する抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む（あるいは、からなる）。本発明はまた、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２を含む抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、次の式を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を有する：
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１３）
（式中、Ｘａａ３は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、スレオニン及びアルギニンからなる群から選択され、Ｘａａ４は、グルタミン、チロシン、トリプトファン、アラニン及びフェニルアラニンからなる群から選択され、Ｘａａ５は、セリン、グリシン、プロリン、アラニン及びアスパラギン酸からなる群から選択され、ただし、Ｘａａ４がグルタミンであり、Ｘａａ５がセリンである場合、Ｘａａ３はセリンではない。）。本発明はまた、上述の式のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を有する抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む（あるいは、からなる）。本発明はまた、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１を含む抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、次の式を有するアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を有する：
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｓｅｒ（配列番号１４）
（式中、Ｘａａ６は、アスパラギン及びシステインからなる群から選択され、Ｘａａ７は、ロイシン、グリシン及びアラニンからなる群から選択され、Ｘａａ８は、グルタミン酸、トリプトファン及びプロリンからなる群から選択され、ただし、Ｘａａ７がロイシンであり、Ｘａａ８がグルタミン酸である場合、Ｘａａ６はアスパラギンではない。）。本発明はまた、上述の式のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を有する抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、配列番号２３又は配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を含む（あるいは、からなる）。本発明はまた、配列番号２３又は配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２を含む抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３又は配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２又はこれらのアミノ酸配列の何れかの組み合わせを含む（あるいは、これらからなる）。本発明は、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３又は配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２又はこれらのアミノ酸配列の何れかの組み合わせを含む抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体をコードする単離核酸分子を提供する。該抗体は、次のアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖可変ＣＤＲ３を有する：
（ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し；
（ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１２）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ１は、プロリン及びアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ２は、イソロイシン及びチロシンからなる群から選択され；
（ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号８）のアミノ酸配列を有し；
（ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１３）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ３は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、スレオニン及びアルギニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ４は、グルタミン、チロシン、トリプトファン、アラニン及びフェニルアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ５は、セリン、グリシン、プロリン、アラニン及びアスパラギン酸からなる群から選択され；
（ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｓｅｒ（配列番号１４）の式を有するアミノ酸配列を有し；
式中、Ｘａａ６は、アスパラギン及びシステインからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ７は、ロイシン、グリシン及びアラニンからなる群から選択され；
式中、Ｘａａ８は、グルタミン酸、トリプトファン及びプロリンからなる群から選択され；
（ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有し；
軽鎖ＣＤＲ１がＬｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２がＡｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する場合、重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）以外のアミノ酸配列を有するか、重鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有し、軽鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）を有する場合、軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）以外のアミノ酸配列を有するか、又は、重鎖ＣＤＲ２がＴｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１が、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する場合、軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）以外のアミノ酸配列を有する。本発明はまた、上述の式に従うアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１領域、重鎖ＣＤＲ２領域、重鎖ＣＤＲ３領域、軽鎖ＣＤＲ１領域、軽鎖ＣＤＲ２領域及び軽鎖ＣＤＲ３領域を有する抗体をコードする本明細書中に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
さらに別の態様において、本発明は、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体（該抗体はＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される。）をコードする単離核酸分子を提供する。本発明はまた、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する抗体（該抗体はＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される。）をコードする核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供する。
ＩＶ．本発明の抗体を調製するための方法
当業者にとって公知の通常の技術を用いて本発明の抗体を調製することができる。
ある態様において、宿主細胞における免疫グロブリン軽及び重鎖遺伝子の組み換え発現により、本発明の抗体を調製することができる。抗体を組み換え発現させるために、軽及び重鎖が宿主細胞で発現され、好ましくは宿主細胞が培養されている培地中に分泌され、その培地から本抗体を回収できるように、本抗体の免疫グロブリン軽及び重鎖をコードする核酸分子を担う１以上の組み換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ａｕｓｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）及び米国特許第４，８１６，３９７号（Ｂｏｓｓら）などに記載のように、抗体重及び軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組み換え発現ベクターに組み込み、このベクターを宿主細胞に導入するために、標準的組み換え核酸（ＤＮＡ）法を使用する。
本発明の抗体を発現させるために、軽及び重鎖領域をコードする核酸分子を最初に得る。例えばＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体を含む、本発明の抗体を生成させるために、モノクローナル抗体１０６．３を発現するハイブリドーマ細胞株からこれらの核酸分子を得て、当技術分野で周知である手段（部位特異的変異誘発など）により改変することができる。モノクローナル抗体１０６．３を発現するハイブリドーマ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０に寄託し、登録番号ＨＢ−１２０４４が与えられた。モノクローナル抗体１０６．３の核酸配列は、図３Ａ−３Ｅ及び配列番号１で示す。
例えば、１０６．３可変重鎖（ＶＨ）及び可変（ＶＬ）核酸断片を得たら、本明細書中で開示するＡＭ１又はＡＭ１関連アミノ酸配列をコードするように、これらの配列又は、相補性決定（「ＣＤＲ」）領域などのこれらの配列内の特定の領域に対して、変異誘発を行うことができる。異なるＡＭ１又はＡＭ１関連配列におけるアミノ酸残基を同定するために、１０６．３ＶＨ及びＶＬ ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列をＡＭ１又はＡＭ１関連ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と比較する。どのヌクレオチドの変更を行うべきであるかを調べるために、遺伝子コードを用いて、変異配列がＡＭ１又はＡＭ１関連アミノ酸配列をコードするように、モノクローナル抗体１０６．３の適切なヌクレオチドに対して変異誘導を行う。ＰＣＲによる変異誘発（この方法では、ＰＣＲ産物が変異を含有するように、変異ヌクレオチドをＰＣＲプライマー組み込む。）又は部位特異的変異誘発などの標準的方法により、抗体１０６．３配列の変異誘発を行うことができる。
あるいは、別の態様において、当業者にとって公知の通常の技術を用いて、化学合成装置においてＶＨ及びＶＬ鎖をコードする核酸分子を合成することができる。例えば、当技術分野で公知の通常の技術を用いて、セクションＩＩＩに記載の核酸分子からのＶＨ及びＶＬ鎖を化学合成することができる。支持体に付着させた３’末端塩基から開始して、段階的にヌクレオチドをカップリングさせる。最も５’側のヌクレオチドを付加した後、そのヌクレオチドを固体支持体から切断し、脱塩により精製して、その後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製する（Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ、ｗｗｗ．ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）。
（上述のような、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の、増幅及び変異誘発により）ＡＭ１又はＡＭ１関連ＶＨ及びＶＬセグメントをコードする核酸断片を得たら、例えば、可変領域遺伝子を抗体に変換するために（以下に限定されないが、全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子へ、又はｓｃＦｖ遺伝子へ、など）、これらの核酸断片をさらに標準的組み換えＤＮＡ技術により操作することができる。これらの操作において、別のタンパク質（抗体定常領域又はフレキシブルなリンカーなど）をコードする別の核酸断片に、ＶＬ−又はＶＨコード核酸断片を操作可能に連結する。「操作可能に連結」という用語は、この関連で使用する場合、２個の核酸断片によりコードされるアミノ酸配列の読み枠がずれないようにこの２個の核酸断片がつながれることを意味するものとする。
代替的な方法において、野生型ＣＤＲ領域（モノクローナル抗体１０６．３のものなど）を用いてｓｃＦｖ遺伝子を構築し、次いで当技術分野で公知の技術を用いて変異誘発を行い得る。
重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別の核酸分子へＶＨコード核酸分子を操作可能に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離核酸分子を全長重鎖遺伝子へと変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）参照）。別の態様において、本発明は、以下に限定されないがヒト重鎖定常領域の全ての既知のアロタイプを含む全ての既知のヒト重鎖定常領域をさらに包含する。標準的ＰＣＲ増幅により、これらの領域を包含する核酸断片を得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得る。
軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別の核酸分子にＶＬコード核酸分子を操作可能に連結することにより、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと、ＶＬ領域をコードする単離核酸分子を変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知である（例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）参照）。本発明は、以下に限定されないがヒト軽鎖定常領域の全ての既知のアロタイプを含む全ての既知のヒト軽鎖定常領域を包含する。標準的ＰＣＲ増幅により、これらの領域を包含する核酸断片を得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。
特定の重又は軽鎖領域内のフレームワーク（ＦＲ）及びＣＤＲ領域の具体的な表示は、このような領域を区別するために使用する、慣習又は付番システムにより変化し得ることを理解されたい（例えばＣｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｓｏｆｔｗａｒｅ、これらは全て、当業者にとって公知である。）。本発明の目的のために、Ｋａｂａｔ付番システムを使用する。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、フレキシブルリンカー（アミノ酸配列ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号４）によりコードされるリンカーなど）をコードする別の断片にＶＨ及びＶＬコード核酸断片を操作可能に連結する。本発明で使用できるその他のリンカー配列の例は、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２−５５４（１９９０）で見出すことができる。
本発明の抗体又は抗体部分を発現させるために、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に操作可能に連結されるように、上述のように得られた部分又は全長軽及び重鎖をコードする核酸分子を発現ベクターに挿入する。この関連において、「操作可能に連結」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するというそれらの意図する機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味するものとする。使用する発現宿主細胞と適合するように、発現ベクター及び発現調節配列を選択する。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子を別個のベクターに挿入できるか、又は、より一般的には、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。標準的方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクターの相補的制限部位のライゲーション又は制限部位がない場合は平滑末端ライゲーション）により、発現ベクターに抗体遺伝子を挿入する。
軽又は重鎖配列の挿入前に、発現ベクターが既に抗体定常領域配列を有し得る。例えば、ＶＨ及びＶＬ配列を全長抗体遺伝子に変換するためのあるアプローチは、ベクター内でＶＨセグメントがＣＨ「セグメント」に機能可能に連結され、ベクター内でＶＬセグメントがＣＬセグメントに機能可能に連結されるように、重鎖定常及び軽鎖定常領域をそれぞれ既にコードする発現ベクターにそれらを挿入することである。さらに又はあるいは、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端に読み枠どおりに連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シングルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、免疫グロブリンではないタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を担い得る。「制御配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を調節するその他の発現調節エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような制御配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。当業者にとって当然のことながら、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得る。哺乳動物宿主細胞発現に対する好ましい制御配列には、サイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）由来（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）由来（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス由来（アデノウイルス主要後期プロモーター（「ＡｄＭＬＰ」など）及びポリオーマ由来のプロモーター及び／又はエンハンサーなど、哺乳動物細胞での高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメントが含まれる。ウイルス制御エレメントの詳細及びその配列に関して、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子など、さらなる配列を担い得る。選択可能マーカー遺伝子により、ベクターが導入されている宿主細胞の選択が容易になる（例えば、全てＡｘｅｌらによる、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号及び同第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、通常、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において、例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子には、メトトレキセート選択／増幅を用いてｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するためのジヒドロ葉酸還元酵素（「ＤＨＦＲ」）遺伝子及びＧ４１８選択のためのネオマイシン（「ｎｅｏ」）遺伝子が含まれる。
軽及び重鎖の発現の場合、標準的技術により、重及び軽鎖をコードする発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど、原核又は真核宿主細胞への外来ＤＮＡの導入のために一般的に使用される多岐にわたる技術を包含するものとする。本発明の抗体を原核又は真核宿主細胞の何れかで発現させることは理論的に可能ではあるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞よりも、正しく折りたたまれ、免疫学的に活性のある抗体をアセンブルし分泌させるのによりふさわしいので、真核細胞で、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞で、抗体を発現させることが最も好ましい。抗体遺伝子の原核発現は、活性抗体の高収率の産生には無効であることが報告されている（Ｂｏｓｓ、Ｍ．Ａ．及びＷｏｏｄ、Ｃ．Ｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６：１２−１３（１９８５）参照）。
本発明の組み換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞（例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ及びＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１（１９８２）に記載のものなどの、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０（１９８０）に記載の、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞及びＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞で抗体を発現させるのに十分な時間、より好ましくは宿主細胞を増殖させている培地に抗体が分泌されるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより抗体が産生される。標準的タンパク質精製法を用いて、培地から抗体を回収することができる。
Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片s又はｓｃＦｖ分子などのインタクトな抗体の一部を産生させるために宿主細胞を使用することもできる。上述の手順における変法が本発明の範囲内であることは理解されよう。例えば、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖の何れか（両方ではない。）をコードする核酸分子を宿主細胞にトランスフェクトすることが望まれ得る。ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片への結合に不必要な軽及び重鎖の何れか又は両方をコードする核酸分子のいくつか又は全てを除去するために、組み換えＤＮＡ技術を使用することもできる。このような短縮核酸分子から発現される分子も本発明の抗体に包含される。
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組み換え発現のための好ましい系において、リン酸カルシウム介在トランスフェクションにより、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組み換え発現ベクターをｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組み換え発現ベクター内で、遺伝子の高レベル転写を導くために、抗体重及び軽鎖遺伝子をＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター制御エレメントにそれぞれ操作可能に連結する。組み換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も担い、これにより、このベクターによりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択が可能になる。トランスフェクトベクターからＤＨＦＲ遺伝子を得たＣＨＯ細胞を得るために、ヒポキサンチン及びチミジン不含の培地中で細胞を培養した。最大量の抗体を発現したクローンを同定するために、抗原特異的スクリーニング法を使用した。これらの個々のクローンを増殖させ、通常的に再スクリーニングした。最大量を産生するクローンはＡＭ１であった。抗体重及び軽鎖を発現させるために、選択した形質転換宿主細胞を培養し、培地からインタクトな抗体を回収する。組み換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技術を使用する。
前述のことを考慮して、本発明の別の態様は、本発明の抗体及び抗体部分の組み換え発現に使用できる、核酸、ベクター及び宿主細胞組成物に関する。ＡＭ１及びその変異体の重鎖ＣＤＲ２領域をコードするアミノ酸配列を配列番号１５で示す。ＡＭ１軽鎖ＣＤＲ１領域をコードするアミノ酸配列を配列番号２２で示す。ＡＭ１の重鎖ＣＤＲ２領域をコードする核酸分子を配列番号８１で示す。ＡＭ１の軽鎖ＣＤＲ１領域をコードする核酸分子を配列番号８２で示す。
Ｖ．組み換え抗体の選択
本明細書中で開示される、ＡＭ１又はＡＭ１関連抗体を含む本発明の抗体は、コンビナトリアル抗体ライブラリのスクリーニングにより単離することができる。好ましくは、コンビナトリアル抗体ライブラリは、組み換えコンビナトリアルライブラリ、好ましくは、キメラの、ヒト化又はヒトＶＬ及びＶＨ ＣＤＮＡを用いて作製された、ｓｃＦｖ酵母ディスプレイライブラリである。このようなライブラリの作製及びスクリーニングのための方法は当技術分野で公知である。酵母ディスプレイライブラリを作製するための市販のベクターに加えて（ｐＹＤ１ベクター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａなど）、抗体ディスプレイライブラリの作製及びスクリーニングに特に受け入れやすい方法及び試薬の例は、例えば、Ｂｏｒｄｅｒ Ｅ．Ｔ．及びＷｉｔｔｒｕｐ Ｋ．Ｄ．、Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、３２８：４３０−４４（２０００）及びＢｏｒｄｅｒ Ｅ．Ｔ．及びＷｉｔｔｒｕｐ Ｋ．Ｄ．、Ｙｅａｓｔ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５（６）：５５３−７（１９９７年６月）で見出すことができる。
好ましい実施形態において、本明細書中のセクションＩＩに記載の抗体の何れかなどの、高い結合親和性の抗体を単離するために、酵母（好ましくはＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表面でｓｃＦｖとして発現されるヒト重及び軽鎖配列を生成させるため、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合することが知られている抗体（例えばモノクローナル抗体１０６．３など）を最初に使用する。これらの抗体の解離速度（すなわち、ｋｏｆｆ又はｋｄ）を調べるために、これらの抗体（モノクローナル抗体１０６．３など）ｓｃＦｖを分析する。次に、好ましくはビオチン化環状ｈＢＮＰ（１−３２ｃ）を用いて、このようなコンストラクトをスクリーニングする。次いで、平均蛍光単位（「ＭＦＵ」）として、時間（秒）に対して解離速度データをプロットすることができる。データをフィットさせるために、一次減衰式を使用することができる。使用できるこのような式の例は以下の式である：
ｙ＝ｍｌ＊ｅｘｐ（−ｍ２＊Ｍ０）＋ｍ３
（式中、ｍ１は時間０での最大蛍光（＊＝時間及びｅｘｐ＝指数）；ｍ２はオフ速度（オフ速度を決定するための式は当業者にとって周知である。）；Ｍ０は時間ｘ（ｘは測定している時間）であり；ｍ３は系から生じているバックグラウンドである。
変異誘発ライブラリからオフ速度が改善した本発明の抗体を同定するために、解離速度データを使用することができる。
ＣＤＲ変異誘発ライブラリを作製するために、続く重及び軽鎖可変領域の変異誘発に対して、解離速度が改善したこれらのｓｃＦｖコンストラクトを選択する。
結合親和性をさらに向上させるために、天然の免疫反応中の抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞変異プロセスと同様のプロセスにおいて、好ましいＶＨ／ＶＬペアのＶＨ及びＶＬセグメントに対して、好ましくは、ＶＨのＣＤＲ２領域内、ＶＬのＣＤＲ１領域内及び／又はＣＤＲ２領域内で、無作為に変異誘発を行うことができる。標的とされるＣＤＲ内で３個のアミノ酸をコードする縮重一本鎖オリゴヌクレオチドで各ＣＤＲの一部を置換することにより、このインビボ親和性変異を行うことができる。酵母での相同組み換えにより、新しい無作為配列による各ＣＤＲの一部の置換（最大８０００の可能性）を行うことができる（例えば実施例１参照）。ｓｃＦｖに関連してｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片への結合についてこれらの無作為変異ＶＨ及びＶＬセグメントを分析することができ；次に、蛍光が強まっており、（ａ）ｈＢＮＰ又はそのｈＢＮＰ断片のアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに結合し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１２０４４を有するハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体と比較した場合、その平衡解離定数（ＫＤ）が、少なくとも約２倍改善、少なくとも約３倍改善、少なくとも約５倍改善、少なくとも約１０倍改善、少なくとも約１５倍改善、少なくとも約２０倍改善、少なくとも約２５倍改善、少なくとも約３０倍改善、少なくとも約３５倍改善、少なくとも約４０倍改善、少なくとも約４５倍改善、少なくとも約５０倍改善、少なくとも約５５倍改善、少なくとも約６０倍改善、少なくとも約７０倍改善又は少なくとも約７５倍改善しているか、（ｂ）少なくとも約２．４ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎ（又はｋａ）を示すか又は５．０ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１、３．３ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１、２．５ｘ１０４Ｍ−１ｓ−１から１．２５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１、２．４ｘ１０−１１Ｍ−１ｓ−１から１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ（又はｋａ）を有するか、（ｃ）少なくとも約１．０ｘ１０−３ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０−４ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０−５ｓ−１、少なくとも約１．０ｘ１０−６ｓ−１のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を示すか又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−６ｓ−１、１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−５ｓ−１又は１．０ｘ１０−３ｓ−１から１．０ｘ１０−４ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ（又はｋｄ）を有するか、又は（ｄ）少なくとも約２．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約３．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約４．０ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約４．２ｘ１０−１１Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１２Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも約７．４ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも約８．０ｘ１０−１３Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１４Ｍ、少なくとも約１．０ｘ１０−１５ＭのＫＤを示すか又は２．０ｘ１０−１１Ｍから１．０ｘ１０−１５Ｍ、３．０ｘ１０−１１Ｍから１ｘ１０−１４Ｍ、４．０ｘ１０−１１Ｍから８．０ｘ１０−１３Ｍ又は４．２ｘ１０−１１Ｍから７．４ｘ１０−１３Ｍの範囲のＫＤを有する、ｓｃＦｖを単離し、配列決定によりＣＤＲ変異を同定することができる。
組み換えｓｃＦｖディスプレイライブラリのスクリーニング後、所望の特性を有するクローンを変換のために選択する。選択した抗体をコードする核酸分子をディスプレイパッケージから（例えば酵母発現ベクターから）回収し、標準的な組み換えＤＮＡ技術により、その他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。必要に応じて、本発明のその他の抗体形態を作製するために、核酸をさらに操作することができる（例えば、さらなる定常領域などのさらなる免疫グロブリンドメインをコードする核酸に連結する。）。上記セクションＩＶで詳述したように、コンビナトリアルライブラリのスクリーニングにより単離された組み換えヒト抗体を発現させるために、抗体をコードするＤＮＡを組み換え発現ベクターにクローニングし、哺乳動物宿主細胞に導入する。
ＶＩ．免疫アッセイ
別の態様において、本発明は、試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の定性及び／又は定量的検出のために使用することができる免疫アッセイに関する。当技術分野で公知である何らかの方式を用いて（以下に限定されないが、サンドイッチ方式、競合阻害方式（フォワード又はリバース競合阻害アッセイの両方を含む。）又は蛍光偏向方式など）、本発明の免疫アッセイを行うことができる。
試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の定性検出のための免疫アッセイにおいて、抗体−ｈＢＮＰ免疫複合体を形成させるために、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を含有する疑いがあるか又は含有することが知られている少なくとも１つの試験試料に、ｈＢＮＰ又はそのｈＢＮＰ断片のある一定のエピトープに結合する少なくとも１つの抗体を接触させる。少なくとも１つの試験試料中でこのような抗体−ｈＢＮＰ免疫複合体を形成させるためのこのような免疫アッセイにおいて、本明細書中のセクションＩＩに記載の抗体を使用することができる。次に、当業者にとって公知の通常の技術を用いて、これらの免疫複合体を検出することができる。例えば、抗体−ｈＢＮＰ複合体の有無を検出するための検出可能な標識を用いて本発明の抗体を標識することができる。
あるいは、検出可能な標識で試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を標識し、当業者にとって公知の通常の技術を用いて、得られた抗体−ｈＢＮＰ免疫複合体を検出することができる。検出可能な標識及び抗体へのそれらの結合を以下で詳細に述べる。
あるいは、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に結合し、検出可能な標識を含有する二次抗体を試験試料に添加し、抗体−ｈＢＮＰ複合体の存在を検出するために使用することができる。当技術分野で公知である何れかの検出可能な標識を使用することができる。検出可能な標識及び抗体へのそれらの結合を以下で詳細に述べる。
サンドイッチ型の方式などのＢＮＰの定量検出のための免疫アッセイにおいて、試験試料中でｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を分離し、定量するために、少なくとも２種類の抗体を利用する。より具体的には、これら少なくとも２種類の抗体は、免疫複合体を形成するｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片のある一定のエピトープに結合する（これは「サンドイッチ」と呼ばれる。）。一般に、試験試料中でｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を捕捉するために、１以上の抗体を使用することができ（これらの抗体は「捕捉」抗体と呼ばれることが多い。）、検出可能な（すなわち定量可能な）標識をサンドイッチに結合させるために、１以上の抗体を使用する（これらの抗体は「検出」抗体と呼ばれることが多い。）。サンドイッチアッセイでは、その個々のエピトープに対するアッセイにおいて、何らかのその他の抗体の結合によってそれらのエピトープに結合する両抗体を減少させないことが好ましい。言い換えると、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を含有する疑いのある試験試料と接触させる１以上の第一の抗体が、第二又は次の抗体により認識されるエピトープの全て又は一部と結合せず、それにより１以上の第二の検出抗体がｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に結合する能力を妨害しないよう、抗体を選択すべきである。
本発明者らは、本発明の抗体を用いて優れたサンドイッチ免疫アッセイを行うことができることを発見した。より具体的には、該免疫アッセイにおいて、第一の抗体として本発明の抗体を使用することができる。好ましくは、本発明の抗体は、約４．２ｘ１０−１１Ｍから約７．４ｘ１０−１３Ｍの間のＫＤで、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含有するエピトープに免疫特異的に結合する。本発明の抗体に加えて、該免疫アッセイは、ｈＢＮＰのアミノ酸２７−３２の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するエピトープに免疫特異的に結合する、二次抗体、好ましくはモノクローナル抗体、を含む。ｈＢＮＰのアミノ酸２７−３２を含有するアミノ酸配列を有するエピトープに免疫特異的に結合するモノクローナル抗体の例は、ハイブリドーマ細胞株ＢＣ２０３により産生されるモノクローナル抗体である。
好ましい実施形態において、少なくとも１種類の第一の捕捉抗体及び少なくとも１種類の第二の検出抗体と、同時に又は連続して、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を含有する疑いのある試験試料を接触させることができる。サンドイッチアッセイ方式において、第一の抗体−ｈＢＮＰ複合体の形成が可能な条件下で、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を含有する疑いのある試験試料を、特定のエピトープに特異的に結合する少なくとも１種類の第一の捕捉抗体と最初に接触させる。複数の捕捉抗体を使用する場合、第一の多重捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体が形成される。サンドイッチアッセイにおいて、抗体、好ましくは、少なくとも１種類の捕捉抗体、を試験試料中で予想されるｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の最大量のモル濃度過剰量で使用する。例えば、微小粒子被覆緩衝液１ｍＬにつき、抗体 約５μｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬを使用することができる。
場合によっては、少なくとも１種類の第一の捕捉抗体と試験試料を接触させる前に、試験試料から第一の抗体−ＢＮＰ複合体の分離を容易にする固体支持体に少なくとも１種類の第一の捕捉抗体を結合させることができる。以下に限定されないが、ウェル、試験管又はビーズの形態のポリマー性物質から作られた固体支持体を含む、当技術分野で公知である何れかの固体支持体を使用することができる。吸着により、化学カップリング剤を用いた共有結合により、又は当技術分野で公知であるその他の手段により、抗体（又は複数の抗体）を固体支持体に結合させることができるが、ただし、このような結合は、抗体のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片への結合能を妨害しない。さらに、必要に応じて、抗体の様々な官能基との反応性を与えるために、固体支持体を誘導体化することができる。このような誘導体化には、以下に限定されないが、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの、ある種のカップリング剤の使用が必要である。
ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片を含有する疑いのある試験試料を少なくとも１種類の第一の捕捉抗体と接触させた後、第一の捕捉抗体（又は多重抗体）−ｈＢＮＰ複合体の形成を可能にするために、試験試料をインキュベートする。約２℃から約４５℃の温度で、約４．５から約１０．０のｐＨで、少なくとも約１分間から約１８時間、好ましくは約２−６分間、最も好ましくは約３−４分間、インキュベートを行うことができる。
第一／多重捕捉抗体−ｈＢＮＰ複合体の形成後、次に、少なくとも１種類の第二の検出抗体とこの複合体を接触させる（第一／多重抗体−ｈＢＮＰ−第二抗体複合体の形成が可能な条件下）。第一の抗体−ｈＢＮＰ複合体を複数の検出抗体と接触させる場合、第一／多重捕捉抗体−ｈＢＮＰ−多重抗体検出複合体が形成される。第一の抗体と同様に、少なくとも第二の（及び続く）抗体を第一の抗体−ｈＢＮＰ複合体と接触させる場合、第一／多重抗体−ｈＢＮＰ−第二／多重抗体複合体の形成のために、上述のものと同様の条件下でのインキュベート時間が必要である。好ましくは、少なくとも１つの第二の抗体は、検出可能な標識を含有する。第一／多重抗体−ｈＢＮＰ−第二／多重抗体複合体の形成前、これと同時又はこの後に、少なくとも１種類の第二の抗体に検出可能な標識を結合させることができる。当技術分野で公知である何らかの検出可能な標識を使用することができる。例えば、検出可能な標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなどの放射性標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素標識、アクリジニウムエステル、ルミナール、イソルミノール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステルなどの化学発光標識、フルオレセイン（５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（硫化亜鉛キャップ付きカドミウムセレニド）などの蛍光標識、温度による標識又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応標識であり得る。標識、標識手段及び標識の検出に対する導入は、Ｐｏｌａｋ及びＶａｎ Ｎｏｏｒｄｅｎ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９９７）及びＨａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）（これは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎにより出版されているハンドブック兼カタログである。）において見出される。
直接又はカップリング剤を介しての何れかで、検出可能な標識を抗体に結合させることができる。使用できるカップリング剤の例は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販されているＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩）である。使用できるその他のカップリング剤は当技術分野で公知である。検出可能な標識を抗体に結合させるための方法は当技術分野で公知である。さらに、検出可能な標識を抗体にカップリングさせるのを容易にする末端基を既に含有する多くの検出可能な標識を購入又は合成することができる（例えば、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミドなど、あるいはＣＰＳＰ−アクリジニウムエステル又はＮ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミドとして知られているか、あるいはＳＰＳＰ−アクリジニウムエステルとして知られている。）。
標識の定量前に、第一の抗体／多重−ｈＢＮＰ−第二／多重抗体複合体を試験試料の残りの部分から分離することができる（分離しなければならないということではない。）。例えば、少なくとも第一の捕捉抗体がウェル又はビーズなどの固体支持体に結合している場合、固体支持体と（試験試料からの）液体を引き離すことにより分離を行うことができる。あるいは、少なくとも第一の捕捉抗体が固体支持体に結合している場合、第一（多重）抗体−ｈＢＮＰ−第二（多重）抗体複合体を形成させるために、第一の捕捉抗体をｈＢＮＰ含有試料及び少なくとも１種類の第二の検出抗体と同時に接触させ、次いで固体支持体と液体（試験試料）を引き離し得る。少なくとも一次捕捉抗体が固体支持体に結合していない場合、標識量の定量のために、第一の抗体／多重−ｈＢＮＰ−第二／多重抗体複合体を試験試料から除去する必要はない。
標識された第一の抗体−ｈＢＮＰ−第二の抗体複合体の形成後、当技術分野で公知の技術を用いて複合体中の標識の量を定量する。例えば、酵素標識を使用する場合、発色などの定量可能な反応を起こす標識に対する基質と標識化複合体を反応させる。標識が放射性標識である場合、シンチレーションカウンターを用いて標識を定量する。標識が蛍光標識である場合、ある色の光（「励起波長」として知られている。）で標識を刺激し、刺激に対して反応して標識により発光される別の色（「発光波長」として知られている。）で検出することにより標識を定量する。標識が化学発光標識である場合、視覚的に、又は照度計、ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを用いて、発光される光を検出して標識を定量する。複合体中の標識の量を定量したら、既知の濃度のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の連続希釈液を用いて作成された標準曲線を使用して、試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の濃度を調べる。ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の連続希釈液を用いること以外に、重量測定法、マススペクトロメトリー及び当技術分野で公知のその他の技術により、標準曲線を作成することができる。
フォワード競合方式において、ｈＢＮＰ抗体（本発明の抗体など）への結合に対して試験試料中でｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片と競合させるために、既知の濃度の、標識したｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体の一定分量を使用する。ｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片及びそのｈＢＮＰ類似体のペプチド及び、ｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片及びそのｈＢＮＰ類似体のペプチドを作製する方法は、当技術分野で公知である（例えば米国特許第６，１６２，９０２号参照）。さらに、本明細書中の実施例に記載のように、前記競合方式において、環状ｈＢＮＰ（１−３２）を使用することもできる。
フォワード競合アッセイにおいて、固定化抗体（本発明の抗体など）を連続的又は同時の何れかで、試験試料及び標識化ｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体と接触させることができる。サンドイッチアッセイ方式に関連して、上記で述べた検出可能な標識を含む、当業者にとって公知の何れかの検出可能な標識で、ｈＢＮＰペプチド、ｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体を標識することができる。このアッセイにおいて、本明細書中で既に述べた技術を用いて固体支持体に本発明の抗体を固定化することができる。あるいは、微小粒子などの固体支持体に固定化されている抗種（ａｎｔｉｓｐｅｃｉｅｓ）抗体などの抗体に本発明の抗体をカップリングさせることができる（実施例３参照）。
サンドイッチアッセイ方式に関連して上述したものと同様の条件下で、標識化ｈＢＮＰペプチド、ｈＢＮＰ断片又はｈＢＮＰ類似体、試験試料及び抗体をインキュベートする。次に、抗体−ｈＢＮＰ複合体の２種類の異なる種を生成させる。具体的に、生成した抗体−ｈＢＮＰ複合体の１つは検出可能な標識を含有し、一方、他方の抗体−ｈＢＮＰ複合体は検出可能な標識を含有しない。検出可能な標識の定量前に、抗体−ｈＢＮＰ複合体を試験試料の残りの部分から分離することができる（分離しなければならないということではない。）。抗体−ｈＢＮＰ複合体が試料の残りの部分から分離されているか否かにかかわらず、次に抗体−ｈＢＮＰ複合体中の検出可能な標識の量を定量する。次いで、抗体−ｈＢＮＰ複合体中の検出可能な標識の量を標準曲線に対して比較することにより、試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の濃度を調べることができる。既知の濃度のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の連続希釈液を用いて、マススペクトロメトリー、重量測定法、及び当技術分野で公知のその他の技術により、標準曲線を作成することができる。
サンドイッチアッセイ方式に関連して上記で述べた固体支持体などの固体支持体に抗体を結合させることにより、試験試料から抗体−ｈＢＮＰ複合体を分離し、次いで、固体支持体と試験試料の残りを引き離すことができる。
抗体との結合に対して試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片との競合のために使用される標識化ｈＢＮＰ（又はｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体）は、インタクトなｈＢＮＰ１−３２、その何らかのｈＢＮＰ断片（ただし、該ｈＢＮＰ断片は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有（含む、及びその間を意味する。）する少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。）又は何らかのｈＢＮＰ類似体であり得る（ただし、該ｈＢＮＰペプチド、ｈＢＮＰ断片又はｈＢＮＰ類似体は、抗体により認識されるエピトープに対応するアミノ酸配列を含有する。）。好ましくは、使用される抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個（３）のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合する（本発明の抗体、具体的にはＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体など）か又はｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有する（含む及びその間を意味する。）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。標識し本発明で使用することができるｈＢＮＰ断片の例には、以下に限定されないが、ｈＢＮＰのアミノ酸１−３１、１−３０、１−２９、１−２８、１−２７、１−２６、１−２５、１−２４、１−２３、１−２２、１−２１、１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６、１−１５、２−３２、２−３１、２−３０、２−２９、２−２８、２−２７、２−２６、２−２５、２−２４、２−２３、２−２２、２−２１、２−２０、２−１９、２−１８、２−１７、２−１６、２−１５、２−１４、２−１３、２−１２、２−１１、２−１０、２−９、２−８、２−７、３−３２、３−３１、３−３０、３−２９、３−２８、３−２７、３−２６、３−２５、３−２４、３−２３、３−３２、３−２１、３−２０、３−１９、３−１８、３−１７、３−１６、３−１５、３−１４、３−１３、３−１２、３−１１、３−１０、３−９、３−８、４−３２、４−３１、４−３０、４−２９、４−２８、４−２７、４−２６、４−２５、４−２４、４−２３、４−２２、４−２１、４−２０、４−１９、４−１８、４−１７、４−１６、４−１５、４−１４、４−１３、４−１２、４−１１、４−１０、４−９、５−３２、５−３１、５−３０、５−２９、５−２８、５−２７、５−２６、５−２５、５−２４、５−２３、５−２２、５−２１、５−２０、５−１９、５−１８、５−１７、５−１６、５−１５、５−１４、５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、６−３２、６−３１、６−３０、６−２９、６−２８、６−２７、６−２６、６−２５、６−２４、６−２３、６−２２、６−２１、６−２０、６−１９、６−１８、６−１７、６−１６、６−１５、６−１４、６−１３、６−１２、６−１１、７−３２、７−３１、７−３０、７−２９、７−２８、７−２７、７−２６、７−２５、７−２４、７−２３、７−２２、７−２１、７−２０、７−１９、７−１８、７−１７、７−１６、７−１５、７−１４、７−１３、７−１２、８−３２、８−３１、８−３０、８−２９、８−２８、８−２７、８−２６、８−２５、８−２４、８−２３、８−２２、８−２１、８−２０、８−１９、８−１８、８−１７、８−１６、８−１５、８−１４、８−１３、９−３２、９−３１、９−３０、９−２９、９−２８、９−２７、９−２６、９−２５、９−２４、９−２３、９−２２、９−２１、９−２０、９−１９、９−１８、９−１７、９−１６、９−１５、９−１４、１０−３２、１０−３１、１０−３０、１０−２９、１０−２８、１０−２７、１０−２６、１０−２５、１０−２４、１０−２３、１０−２２、１０−２１、１０−２０、１０−１９、１０−１８、１０−１７、１０−１６、１０−１５、１１−３２、１１−３１、１１−３０、１１−２９、１１−２８、１１−２７、１１−２６、１１−２５、１１−２４、１１−２３、１１−２２、１１−２１、１１−２０、１１−１９、１１−１８、１１−１７又は１１−１６を含有するアミノ酸配列を有するペプチド断片が含まれる。
リバース競合アッセイにおいて、固定化ｈＢＮＰペプチド、ｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体を連続的又は同時の何れかで、試験試料及び少なくとも１つの標識化抗体と接触させることができる。好ましくは、この抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ又はｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有する（含む及びその間を意味する。）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の例は、ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体である。サンドイッチアッセイ方式に関連して上記で述べた検出可能な標識を含む、当業者にとって公知の何れかの検出可能な標識によりこの抗体を標識することができる。
ｈＢＮＰペプチド、ｈＢＮＰ断片又はｈＢＮＰ類似体をサンドイッチアッセイ方式に関連して上記で述べた固体支持体などの固体支持体に結合させることができる。好ましくは、このｈＢＮＰペプチド断片は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有するアミノ酸配列を有する。
サンドイッチアッセイ方式に関連して上記で述べたものと同様の条件下で、固定化ｈＢＮＰペプチド、ｈＢＮＰペプチド断片又はそのｈＢＮＰ類似体、試験試料及び少なくとも１つの標識化抗体をインキュベートする。次に、２種類の異なる種のｈＢＮＰ−抗体複合体を生成させる。具体的に、生成させたｈＢＮＰ−抗体複合体の１つは固定化され、検出可能な標識を含有し、一方、他方のｈＢＮＰ−抗体複合体は固定化されておらず、検出可能な標識を含有する。洗浄など、当技術分野で公知の技術により、非固定化ｈＢＮＰ−抗体複合体及び試験試料の残りの部分を固定化ｈＢＮＰ−抗体複合体から除去する。非固定化ｈＢＮＰ抗体複合体を除去したら、次に、固定化ｈＢＮＰ−抗体複合体中の検出可能な標識の量を定量する。次に、ｈＢＮＰ−複合体中の検出可能な標識の量を標準曲線と比較することにより、試験試料中のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の濃度を調べることができる。既知の濃度のｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片の連続希釈液を用いて、マススペクトロメトリー、重量測定法によって、及び当技術分野で公知のその他の技術によって、標準曲線を作成することができる。
蛍光偏光アッセイにおいて、ある実施形態で、非標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体を形成させるために、ｈＢＮＰ又はそのｈＢＮＰ断片を含有する疑いのある非標識化試験試料と抗体又は機能的に活性のあるその断片を最初に接触させる。次に、非標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体を蛍光標識したｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体に接触させる。標識化ｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片又はｈＢＮＰ類似体は、抗体又は機能的に活性のあるその断片への結合に対して、試験試料の何れかの非標識化ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片と競合する。形成された標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体の量を調べ、標準曲線を使用して、試験試料中のｈＢＮＰの量を調べる。
好ましくは、蛍光偏光アッセイで使用する抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ又はＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有する（含む及びその間を意味する。）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の例はＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生されるモノクローナル抗体である。
好ましくは、ｈＢＮＰペプチド断片は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有するアミノ酸配列を有する。サンドイッチアッセイ方式に関連して上記で述べたものと同様の条件下で、抗体、標識化ｈＢＮＰペプチド、ｈＢＮＰペプチド断片又はそのｈＢＮＰ類似体及び試験試料及び少なくとも１つの標識化抗体をインキュベートする。
あるいは、別の実施形態において、標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体及び非標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体の両方を形成させるために、蛍光標識化ｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体と、ｈＢＮＰ又はそのｈＢＮＰ断片を含有する疑いのある非標識化試験試料と、抗体又は機能的に活性のあるその断片と、を同時に接触させる。形成された標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体の量を調べ、標準曲線を使用して試験試料中のｈＢＮＰの量を調べる。この免疫アッセイで使用する抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ又はｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有する（含む及びその間を意味する。）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の例は、ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生されるモノクローナル抗体である。さらに、ｈＢＮＰペプチド断片は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有するアミノ酸配列を有する。
あるいは、さらに別の実施形態において、標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体を形成させるために、抗体（ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体などの本発明の抗体など）又は機能的に活性のあるその断片を蛍光標識化ｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片又はそのｈＢＮＰ類似体と最初に接触させる。次に、ｈＢＮＰ又はそのｈＢＮＰ断片を含有する疑いのある非標識化試験試料と標識化ＢＮＰ−抗体複合体を接触させる。抗体又は機能的に活性のあるその断片への結合に対して、試験試料中の何らかの非標識化ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片が標識化ｈＢＮＰ、ｈＢＮＰ断片又はｈＢＮＰ類似体と競合する。形成された標識化ｈＢＮＰ−抗体複合体の量を調べ、標準曲線を使用して試験試料中のｈＢＮＰの量を調べる。この免疫アッセイで使用する抗体は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するエピトープ又はｈＢＮＰのアミノ酸１３−２０、１３−１９、１３−１８、１３−１７、１３−１６、１４−２０、１４−１９、１４−１８、１４−１７、１４−１６、１５−２０、１５−１９、１５−１８、１６−２０、１６−１９、１７−２４、１７−２３、１７−２２、１７−２１、１７−２０、１７−１９、１８−２４、１８−２３、１８−２２、１８−２１、１８−２０、１９−２４、１９−２３、１９−２２又は１９−２１を含有する（含む及びその間を意味する。）アミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する。ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３の少なくとも３個の（３）アミノ酸を含有するアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体の例は、ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生されるモノクローナル抗体である。さらに、ｈＢＮＰペプチド断片は、ｈＢＮＰのアミノ酸５−１３、５−１２、５−１１、５−１０、５−９、５−８、５−７、６−１３、６−１２、６−１１、６−１０、６−９、６−８、７−１３、７−１３、７−１１、７−１０、７−９、８−１３、８−１２、８−１１、８−１０、９−１３、９−１２、９−１１、１０−１３、１０−１２又は１１−１３を含有するアミノ酸配列を有する。
ＶＩＩ．医薬組成物及び医薬投与
本発明の抗体は、対象への投与に適切な医薬組成物中に配合することができる。通常、医薬組成物は、本発明の抗体の治療的又は予防的有効量を、医薬的に許容可能な担体又は賦形剤と共に含む。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容可能な担体」又は「医薬的に許容可能な賦形剤」は、生理学的に適合する何らか又は全ての、溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤の例には、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せの１以上が含まれる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。抗体又は抗体部分の貯蔵期間又は有効性を高める、湿潤化剤又は乳化剤、保存料又は緩衝剤などの湿潤化物質又は少量の補助物質などの医薬的に許容可能な物質も含まれ得る。場合によっては、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はこれらの塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を含み得る。賦形剤に加えて、本医薬組成物は、血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝剤、結合剤、甘味料及び他の香味料、着色料及びポリエチレングリコールの１以上を含み得る。
本発明の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体の剤形、例えば溶液（例えば、注射用及び点滴用溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム及び座薬などが含まれ得る。好ましい剤形は、意図する投与方法及び治療用途に依存する。通常の好ましい組成物は、注射用又は点滴用溶液、例えば他の抗体によるヒトの受動免疫法のために使用されるものと類似の組成物などである。好ましい投与方法は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、抗体は静脈内点滴又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において、抗体又は抗体断片は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。
治療用組成物は、通常、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム又はその他の高い薬剤濃度に適した秩序構造として処方することができる。滅菌注射用溶液は、活性化合物（すなわち抗体又は抗体断片）を、必要な量で、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した成分の１つ又は組合せと共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散剤は、基本的な分散媒及び上記で列挙したものからの必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に何らかのさらなる所望の成分を加えた粉末を、予めろ過滅菌したこれらの溶液から得る、真空乾燥及び凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散剤の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び、界面活性剤を使用することにより、維持することができる。組成物中に吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことにより、注射用組成物を持続的に吸収させるようにすることができる。
本発明の抗体は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができるが、多くの治療用途に対して、好ましい投与の経路／方法は、静脈内注射又は点滴である。当業者にとって当然のことながら、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に依存して変化する。ある実施形態において、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル型送達系を含む制御放出製剤など、化合物を急速な放出から保護する担体を用いて活性化合物を調製し得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような処方物の調製のための多くの方法が特許取得されているか、又は当業者に一般に知られている。（例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８参照）。
ある実施形態において、例えば不活性希釈剤又は同化可能な可食担体と共に、本発明の抗体を経口投与し得る。硬殻又は軟殻のゼラチンカプセル、圧縮錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどに、この化合物（及び必要に応じてその他の成分）を封入し得る。本発明の抗体又は抗体断片を非経口投与以外によって投与するために、この化合物をその不活性化を防止する物質で被覆するか、又はこれらと一緒に投与することが必要であり得る。
補助的な有効物質を組成物中に配合することもできる。ある実施形態において、抗体又は抗体部分を、１以上のさらなる治療剤と一緒に処方、及び／又は一緒に投与する。このような併用治療は、有利に、投与される治療剤のより少ない投与量を使用して、それ故に単剤療法に伴う毒性又は合併症の恐れを避け得るか、あるいは相乗的に又は相加的に治療効果を高め得る。
投与レジメンは、最適の所望の反応が得られるように調節することができる（例えば、治療反応又は予防反応）。例えば、１回のボーラス投与を行うか、数回に分けて時間をかけて投与するか又は投与量を治療状況の緊急性によって指示される通りに比例的に減量又は増量させ得る。投与の容易さ及び投与量の均一性のためには非経口の組成物を投与単位形態で処方することが特に有利である。本明細書で使用する場合、投与単位形態は、試験する哺乳動物対象に対する単位投与として適切な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の予め定められた量を含有する。本発明の投与単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の特有の特徴及び達成しようとする特定の治療又は予防効果及び（ｂ）個体における感受性の治療のためにこのような活性化合物を化合する技術に固有の制約により決定され、これらに直接依存する。
本発明の抗体又は抗体部分の治療的又は予防的有効量に対する例となる限定的ではない範囲は、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５−１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、軽減しようとする症状のタイプ及び重症度によって変化し得ることに注意されたい。さらに、いかなる特定の対象に対しても、個体の必要性及び組成物を投与し投与を監督する者の専門的な判断に従って、投与期間にわたって、具体的な投与レジメンを調整すべきこと、及び本明細書で示した投与量範囲は単なる例であり、特許請求する組成物の範囲又は実施を制限するものではないことを理解されたい。
ここで、実施例により、限定的ではなく、本発明の例を与える。
免疫グロブリン遺伝子の同定
サブクローニングされた抗ＢＮＰ１０６．３ハイブリドーマ細胞（ハイブリドーマ細胞株１０６．３（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１２０４４）は米国特許第６，１６２，９０２号に記載されている。）からメッセンジャーＲＮＡを単離した。キットに含まれる免疫グロブリン遺伝子特異的プライマーとともにＮｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧＡＡの関連会社、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、カタログ番号６９８３１−３）から購入したマウスＩｇプライマーセットキットを用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応で１０６．３ｍＲＮＡを利用した。得られたＰＣＲ産物の配列決定を行い、このように、免疫グロブリン可変重及び可変軽鎖遺伝子を同定した（図３Ａ−３Ｅ及び配列番号１参照）。
ｐＹＤ４１ベクターへの１０６．３可変領域遺伝子のクローニング
酵母ディスプレイ系を使用して、酵母タンパク質ＡＧＡ２への融合物として、酵母表面上で、非変異抗ＢＮＰタンパク質（本明細書中で後述）及び抗ＢＮＰタンパク質のライブラリを発現させた。ｐＹＤと呼ばれる酵母ディスプレイベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、酵母接合因子であるＡＧＡ２遺伝子のＣ末端での抗ＢＮＰ遺伝子のクローニングを可能にするので、これを使用した（Ｂｏｄｅｒ及びＷｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５：５５３−５５７（１９９７年６月）参照）。ｐＹＤベクターのその他の重要な特性には、挿入された抗ＢＮＰ遺伝子のＣ末端における、ガラクトース誘導性プロモーター及びエピトープタグ、Ｖ５が含まれる（図２及び図６Ａ−６Ｂ参照）。
酵母ディスプレイプラットフォームは、１本鎖可変断片として知られる抗体方式を利用する。ｓｃＦｖ方式において、フレキシブルリンカーを介して可変重鎖ドメインを可変軽鎖ドメインに連結する（可変重鎖ドメイン−リンカーＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号４）−可変軽鎖ドメイン）。
ＰＣＲ単一オーバーラップ伸長（ｓｉｎｇｌｅ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、ＳＯＥ）を使用して、１０６．３ｓｃＦｖコンストラクトに対して可変重鎖遺伝子（ＶＨ）及び可変軽鎖遺伝子（ＶＬ）を連結した（例えば、図４、６Ａ−６Ｂ及び配列番号２参照）。ベクター制限部位ＳｆｉＩ及びＮｏｔＩを用いて、酵母ディスプレイベクターｐＹＤ４１に、１０６．３ｓｃＦｖＤＮＡをクローニングした。ｐＹＤ４１−１０６．３ｓｃＦｖベクターをＤＨ５α Ｅ．コリに形質転換した。次に、このＥ．コリからプラスミドＤＮＡを単離し、１０６．３ｓｃＦｖインサートの配列決定を行い、ｓｃＦｖが読み枠どおりにＡＧＡ２タンパク質とともにクローニングされていることを確認した。
酵母ディスプレイベクターｐＹＤ４１へのｓｃＦｖに対するクローニング部位は、次の遺伝子を含むＯＲＦにある：ＡＧＡ２−連結リンカー４１−Ｘｐｒｅｓｓエピトープタグ−１０６．３可変重鎖−リンカー４０−１０６．３可変軽鎖−Ｖ５エピトープタグ−６個のＨｉｓ。さらに、酵母株ＥＢＹ１００はトリプトファン栄養要求性株であり、ｐＹＤ４１ベクターは、系の選択可能マーカーとしてトリプトファンをコードする。
サッカロミセスセレビシエ（酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＥＢＹ１００への形質転換
Ｇｉｅｔｚ及びＳｃｈｉｅｓｔｌ法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ及びＧｉｅｔｚ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６（５−６）：３３９−４６（１９８９年１２月）参照）を用いて、酵母ディスプレイプラスミド、ｐＹＤ４１−１０６．３ｓｃＦｖをＳ．セレビシエ ＥＢＹ１００へと形質転換した。形質転換反応液の希釈液を選択用グルコースプレート（２％グルコース（０．６７％酵母窒素塩基、０．１０５％ＨＳＭ−ｔｒｐ−ｕｒａ、１．８％細菌用寒天、１８．２％ソルビトール、０．８６％ＮａＨ２ＰＯ４ Ｈ２Ｏ、１．０２％Ｎａ２ＨＰＯ４ ７Ｈ２Ｏ））にプレーティングし、３０℃にて４８−７２時間インキュベートした。選択用グルコース培地に個々のコロニーを播種し、３０℃にて１６−２０時間、振盪しながら増殖させた。細胞／ｍＬの０．５ＯＤ６００（１ｅ７個の細胞／０．５ＯＤ／ｍＬ）を選択用ガラクトース培地に移すことにより、コロニーにおいてタンパク質発現を誘導した。２０℃にて１６−２４時間コロニーを振盪し、次いで、環状ＢＮＰ（「１−３２ｃ」と呼ぶ。）（配列番号５）及び抗−Ｖ５への結合について、ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーターにより分析した。フローサイトメトリーアッセイのために、ビオチン化：環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）（配列番号５）又は抗−Ｖ５抗体とともに１０６．３ｓｃＦｖを発現する酵母細胞をインキュベートし、次いで、ストレプトアビジン：フィコエリスリン（ＳＡ：ＰＥ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）又はヤギ抗マウス免疫グロブリン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒａ６３３（ＧＡＭ：６３３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（これはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの関連会社である。））とインキュベートした。図７Ａ−７Ｂで示すフローサイトメトリーのヒストグラムは、１０６．３ｓｃＦｖ（抗−Ｖ５結合）の全長表面発現及び１０６．３ｓｃＦｖの環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）（配列番号５）への結合を示す。
酵母における、１０６．３ｓｃＦｖ及び１０６．３変異体に対するオフ速度分析
室温にて３０−６０分間、ビオチン化環状ＢＮＰ１−３２ｃ（〜０．３μＭ）（配列番号５）１００倍モル過剰濃度及び抗−Ｖ５抗体（２．５μｇ／ｍＬ）と０．０５ＯＤ酵母（１ｘ１０６個の細胞）をインキュベートすることにより、酵母における１０６．３ｓｃＦｖ及び１０６．３変異体のオフ速度測定を行った。次に、１％ウシ血清アルブミンとともにリン酸緩衝生理食塩水を含有するブロッキング緩衝液（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で細胞を２回洗浄し、様々な時間（０、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４．２５時間、２５．５時間、５０時間、７５時間及び１４４時間）、１００倍モル過剰濃度の非標識環状ＢＮＰ １−３２ｃ（配列番号５）とともに室温にてインキュベートした（図８参照）。各時点で、酵母細胞を氷に移し、反応を停止させた。次に、ＰＢＳ／ＢＳＡで細胞を２回洗浄し、二次染色試薬中で懸濁した（具体的に言うと、ＳＡ：ＰＥ及びＧＡＭ：６３３。）。氷上で３０分間、細胞をインキュベートし、２回洗浄し、次にＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーターで分析した。図８は、時間（秒）に対して平均蛍光単位（「ＭＦＵ」）としてプロットしたオフ速度データを示す。データをフィットさせるために一次減衰式を使用した。図８で示されるこの式中のオフ速度ｍ２は８．４−５秒−１にフィットし、Ｒ値は０．９９９３であった。１０６．３ ｓｃＦｖ半減期（ｔ１／２）は１３７分（ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋｏｆｆ）であった。
変異誘発ライブラリからオフ速度が改善した１０６．３変異体を同定するために、オフ速度選別ストラテジーを用いた。したがって、変異誘発ライブラリを選別するのに適切な時間を定めるために、１０６．３ ｓｃＦｖ、非変異又は野生型（「ｗｔ」）、半減期を使用した。非標識環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）（配列番号５）の添加からおよそ３時間後、ｗｔ １０６．３ ｓｃＦｖに対して述べた同じアッセイ条件を用いて、１０６．３変異誘発ライブラリを選別した。
１０６．３ＣＤＲ特異的ライブラリ（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌｉｂｒａｒｙ）の作製
抗体１０６．３の３種類の重鎖及び３種類の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のループは主要な抗原接触部位なので、抗体１０６．３の３種類の重鎖及び３種類の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に対して変異誘発を行った（例えば、図３−６及び配列番号６−１１参照）。Ｋａｂａｔ命名法を用いて、ＣＤＲループ長及び付番を定めた。個々のライブラリは、１つのライブラリ中、ＣＤＲの３ヶ所のアミノ酸位置が無作為に変異誘発され、変異誘発枠は１ライブラリにつき１アミノ酸シフトしていた（図９参照）。個々のライブラリに対するライブラリ多様性は、ＣＤＲ位置ごとにサンプリングしたアミノ酸ごとに全部で２０３又は８，０００個の変異体となると予想される。１０６．３ｓｃＦｖに対して、全部で５４個のライブラリ（２９個の可変重鎖び２５個の可変軽鎖ライブラリ）を作製した。
ギャップのある線状化ｐＹＤ４１−１０６．３ベクター及び１本鎖オリゴヌクレオチドを化学的にコンピテントなＥＢＹ１００酵母と組み合わせることにより、ライブラリを作製した（図１０参照）。ギャップのあるｐＹＤ４１ベクターは、ライブラリ構築において１本鎖縮重オリゴヌクレオチドで置換されている各ＣＤＲの特異的な領域を欠失させるＰＣＲにより作製されたベクターである。縮重１本鎖オリゴヌクレオチドは、９０−１０５ヌクレオチド長であり、９個の縮重ヌクレオチド枠のそれぞれにおいてｐＹＤ４１−１０６．３ ｓｃＦｖベクターに対して３９−４３ヌクレオチドのホモロジーを有する。全部で５４個の各ライブラリに対するオリゴヌクレオチドを合成した（図１４Ａ−Ｈ及び配列番号２５−７８参照）。ギャップのあるベクター（１μｇ）及び縮重オリゴヌクレオチド（１６μｇ）をＥＢＹ１００酵母（３ｅ８個の細胞）と組み合わせ、Ｇｉｅｔｚ及びＳｃｈｉｅｓｔｌライブラリ形質転換プロトコール（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ及びＧｉｅｔｚ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６（５−６）：３３９−４６（１９８９年１２月））を用いて形質転換を行った。ヌクレオチド重複及び酵母の内在ギャップ修復の機構により促進される相同組み換えのために、形質転換中に縮重オリゴヌクレオチド及びｐＹＤ４１−１０６．３ｓｃＦｖギャップベクターが環状になる。３０℃にて４８−７２時間、選択用グルコース培地中でライブラリを増殖させ、ライブラリ分類のためのタンパク質発現誘導前に再び選択用グルコース培地に入れた。
１０６．３変異誘発ＣＤＲライブラリ
オフ速度分類ストラテジーに基づき１０６．３ライブラリを分類した。１０６．３ＣＤＲ変異誘発ライブラリをガラクトース発現培地中で２０℃にて１８−２４時間誘導した。室温にて、ＰＢＳ／ＢＳＡで１０６．３変異誘発ライブラリを洗浄し、ビオチン化環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）（配列番号５）及び抗−Ｖ５抗体とともにインキュベートし、２回洗浄し、非標識環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）（配列番号５）とともにインキュベートした。３時間後、変異誘発ライブラリを２回洗浄し、ＳＡ−ＰＥ（１：２００希釈）及びＧＡＭ−６３３（１：２００希釈）とともに３０分間氷上でインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、分析し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａで分類した。全長ＢＮＰ結合クローンを分類するために、ゲートセットを用いて、３時間において、非変異１０６．３結合に基づきソートゲートを設定した。各ソートが、ＢＮＰ結合集団の上位０．１−０．５％を回収した。分類した細胞を選択用グルコース培地中で増殖させ、３０℃にて１８−２４時間増殖させた。ソート１細胞を誘導し、さらに１又は２回、分類を繰り返した。
最後の分類後、分類した細胞を選択用グルコースプレートにプレーティングし、３０℃に７２時間置いた。３種類のライブラリがｗｔ１０６．３ ｓｃＦｖと比較して改善を示した：重鎖ライブラリＨ２８、軽鎖ライブラリＬ１（１−５プール）及びＬ２（１−５プール）。これらのライブラリからの個々の酵母コロニーを選択用グルコース培地に接種し、凍結保存し、選択用ガラクトース培地中で誘導した。次に、個々のコロニーの特徴を調べ、オフ速度アッセイで順位付けした。
選択した１０６．３変異体の分析
ｗｔ１０６．３ ｓｃＦｖに対して上記で述べたオフ速度アッセイにおいて、選択したクローンの特徴を最初に調べた。図１１は、評価を行った各改善１０６．３ ｓｃＦｖ変異体に対する一次減衰曲線から決定したオフ速度値を示す。全体的に、クローンのオフ速度は１０６．３ ｓｃＦｖ ｗｔクローンの２倍を超えて改善した。所望の最も遅いオフ速度を有するクローンは１０６．３ Ｌ１ Ｂ２４ ｓｃＦｖであり、そのオフ速度は６．７ｘ１０−６秒−１であった。
アミノ酸変異が発現されていることを調べるために、選択した１０６．３ ｓｃＦｖ変異体の配列を調べた。最初に、酵母ミニプレップキット（カタログ番号Ｄ２００１、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを酵母懸濁培養液から単離した。配列決定グレードのプラスミドＤＮＡを得るために、酵母ミニプレップキットからのプラスミドをＤＨ５αＥ．コリに形質転換し、次いでＥ．コリミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて培養液から精製した。次いで、ｐＹＤ４１ベクター特異的プライマー（ｐＹＤ４１フォワード−ＴＡＧＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣ（配列番号７９）及びｐＹＤ４１リバース−ＣＧＴＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＧＡＧ（配列番号８０））を用いて、純粋なプラスミドＤＮＡの配列決定を行った。１０６．３ ｓｃＦｖ変異体に対するヌクレオチド及びアミノ酸配列データを図１２Ａ−Ｃで示す。位置番号は、個々のＣＤＲにおけるアミノ酸位置を指す（Ｈ２ Ｐｏｓ８はＣＤＲ Ｈ２の８番目のアミノ酸である。）。
ＣＤＲ Ｌ１に対する配列データから、トリプトファン又は、チロシンもしくはフェニルアラニンなどのその他の大きな疎水性アミノ酸に対して位置４において強い優先傾向が示される。位置４の大きなアミノ酸残基は、１０６．３ ｓｃＦｖに対するオフ速度の実質的な改善に重要であり得る。環状ＢＮＰ（１−３２ｃ）ペプチド（配列番号５）は、この大きなアミノ酸により捕捉されるようになり得、したがって、オフ速度が遅くなる。Ｌ２変異は両者とも、位置４にシステインを含有する。
一時的又は安定発現系における１０６．３キメラ抗体のクローニング及び可溶性発現
ｐＢＯＳ（Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）と呼ばれる一時的発現ベクター系への１０６．３可変ドメインのクローニングを通じて、選択した１０６．３変異体をキメラマウス−ヒトＩｇＧ１／ヒトカッパ抗体に変換した。より具体的には、ＰＣＲを用いて、別個のｐＢＯＳベクターへのクローニングのための制限部位のある可変重鎖遺伝子及び可変軽鎖遺伝子を増幅した（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ及びＮａｇａｔａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｅｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：５３２２、（１９９０））。消化済み／脱リン酸化ベクターに可変重鎖遺伝子及び可変軽鎖遺伝子をライゲーションし、ＤＨ５αＥ．コリに形質転換した。Ｅ．コリからプラスミドＤＮＡを精製し、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はエレクトロポレーションを用いてＣＯＳ−７細胞及び２９３Ｈ細胞にトランスフェクトした。次の１０６．３変異体：ｗｔキメラ、Ｌ１ Ｂ２４キメラ、Ｌ１ １６キメラ、Ｌ１ Ｂ２４／Ｈ２ ２８８キメラ及びＬ１１６／Ｈ２ ２８８キメラに対して一時的抗体を発現させた。
ｐＢＯＳ−１０６．３重鎖及び軽鎖ベクターを用いて、２段階のクローニング手順で安定なＣＨＯ細胞株プラスミドを作製した。最初に、制限酵素ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩを用いて、ｐＢＶ及びｐＪＶプラスミド（Ａｂｂｏｔｔ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）において、ヒト定常遺伝子に対する読み枠どおりに、可変重鎖遺伝子及び可変軽鎖遺伝子をそれぞれライゲーションした。ライゲーション反応物をＤＨ５αＥ．コリに形質転換し、続いて、プラスミドＤＮＡを個々のコロニーから単離した。クローニング部位で、ｐＢＶ−１０６．３ マウス可変重鎖−ヒトＩｇＧ１及びｐＪＶ−１０６．３ マウス可変軽鎖−ヒトカッパの配列決定を行った。
第二のクローニング段階には、重鎖ＩｇＧ１遺伝子及び軽鎖カッパ遺伝子を１つの安定な細胞株ベクターに連結することが含まれた。ｐＢＶ−１０６．３及びｐＪＶ−１０６．３ベクターをＡｓｃＩ／ＰａｃＩで消化した。ＶＬ−ヒトカッパ定常及びＶＨ−ヒトＩｇＧ１定常ＤＮＡ断片をゲルで精製し、ライゲーションして、ｐＢＪ−１０６．３と呼ばれる安定な細胞株ベクターを作製した。リン酸カルシウムプロトコールを用いて、ｐＢＪ−１０６．３重鎖／軽鎖キメラプラスミドをＣＨＯ細胞に形質転換した。最初の形質転換から安定な細胞株をサブクローニングした。クローンＡＭ１に対して安定なＣＨＯ細胞株を開発し（「ＢＮＰ１０６．３ｓｃ１２８ａｍ１ＣＨＯ１１６２−２３６」及び「１０６．３ Ｌ１ Ｂ２４／Ｈ２ ２８８キメラ」とも呼ばれる。）、本明細書中の実施例２で述べるようにＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託した。
改変キメラ１０６．３変異体のＢＩＡｃｏｒｅによる特性の決定
アミンカップリング（アミノカップリングは当技術分野で周知である。例えば、Ｎｏｒｄｉｎ、Ｈら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４０：３５９−３６８（２００５Ｊ）を参照）によってヤギ抗ヒトＦｃ（ＧＡＨＦｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（抗種抗体）を前もって調整したＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化することにより、高密度ヤギ抗ヒトＦｃ（ＧＡＨＦｃ）抗体表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを準備した。２０μＬ／分で０．４Ｍ ＥＤＣと０．１ ＮＨＳとの１：１混合液を８分間注入して、カルボキシメチル−デキストランバイオセンサーを活性化する。１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中のＧＡＨＦｃを１０分間の注入により活性化表面にカップリングさせる。次に、１ＭエタノールアミンｐＨ８．５で８分間この表面を不活性化し、次いでＧＡＨＦｃをさらに１０分間注入する。この後、１００μＬ／分の流速での１００ｍＭ Ｈ３ＰＯ４の２０秒間の注入を１０回行ってバイオセンサーの調整を行う。ＧＡＨＦｃの、〜１０．５ ＩｃＲＵ、共鳴単位を各フローセル中にてバイオセンサーにカップリングさせる。
１２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ及び１２ｍｇ／ｍＬカルボキシメチルデキストランナトリウム塩）を添加したＳＰＲランニング緩衝液（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）（脱気／真空ろ過ＨＢＳ−ＥＰ（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ））で、精製した抗ＢＮＰキメラ抗体（「ｃＡｂ」）：（１）ＣＨＯ細胞からの安定な１０６．３ＡＭ１（上記及び実施例２に記載）及び（２）ＣＯＳ細胞からの一時的抗ＢＮＰ ＷＴ／ＷＴを精製抗体の１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈する。ｄＨ２Ｏ中の１００μＭのＢＮＰの凍結（−８０℃）一定分量をＳＰＲランニング緩衝液に入れて１００ｐＭの濃度に希釈する。
２５℃にて、１０μＬ／分で各抗ＢＮＰ ｃＡｂ ３０μＬを個々のＳＰＲフローセル上に注入し、１個のフローセルを参照対照としてブランクにしておく。各ｃＡｂをバイオセンサー上に添加後、４５分間、ＳＰＲランニング緩衝液で１００μＬ／分の流速で全フローセルを平衡化し、その後、ランニング緩衝液のボトルを〜１６時間、１００ｐＭ ＢＮＰの試料溶液に置き換える（シリンジ充填の間で）。次に、試料溶液をさらに〜７時間、ＳＰＲランニング緩衝液に戻し換える。次いで、１００μＬ／分の流速での１００ｍＭリン酸の３３秒パルス３回で表面を再生する。〜２３時間、抗ＢＮＰ ｃＡｂを添加したセンサー全体にＳＰＲランニング緩衝液を流すことによりブランク稼動を行う。
データを二重参照補正し（参照データを差し引き、次いでブランク緩衝液データを差し引くことにより、１００ｐＭ ＢＮＰ試料データを補正した。）、マストランスポート及びＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．２）でのリニアドリフトを考慮して、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ｂｉｎｄｉｎｇモデル（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、編集１９９９年１１月（バージョンＡＤ）Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９７−１９９９、ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）にフィットさせた。
ＢＩＡｃｏｒｅ ＳＰＲを用いて、野生型１０６．３ｃＡｂの平衡解離定数（ＫＤ）を求めたところ、１.９ｘ１０−１１Ｍとなり、結合速度は７．８ｘ１０６Ｍ−１秒−１、オフ速度は１．５ｘ１０−４秒−１であった。１０６．３ＡＭ１ ｃＡｂの平衡解離定数（ＫＤ）を求めたところ、１．９x１０−１２Ｍとなり、結合速度は１．３ｘ１０７Ｍ−１秒−１、オフ速度は２．４ｘ１０−５秒−１であった。溶液相測定においてＫＤ値を求めるＳａｐｉｄｙｎｅのＫｉｎＥｘＡ装置を用いて（Ｓａｐｉｄｙｎｅ、Ｂｏｉｓｅ、ＩＤ）、１０６．３及び１０６．３ＡＭ１の両者に対して、それぞれ１．７ｘ１０−１２Ｍ及び９．３ｘ１０−１２Ｍという同様のＫＤ値が得られた。
改変キメラ１０６．３変異体の特異性
抗ＢＮＰ１０６．３ＡＭ１ ＢＮＰ短縮型ＢＮＰペプチド置換ＥＩＡ
置換マイクロタイターＣＩＡにおいて、１０６．３ＡＭ１ｍＡｂの、ｈＢＮＰ短縮型、すなわちｈＢＮＰ１−２６及びｈＢＮＰ５−１３への結合能を求めた（図１８参照）。ブロッキングした抗種被覆プレートをｍＡｂとともに１時間インキュベートし、洗浄した。連続希釈した遊離、非共役ｈＢＮＰ １−２６（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）、ｈＢＮＰ ５−１３（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ．）、ｈＢＮＰ １−３２（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、大阪、日本）ペプチド又は０ペプチド対照を１時間、ＡＭ１ ｍＡｂと反応させた。プレートを洗浄し、アクリジニル化ｈＢＮＰ（１−３２環状）共役物（Ａｂｂｏｔｔ ＡＤＤ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を添加した。プレートをもう一度インキュベートし、洗浄した。Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ Ｊｅｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）において、連続的に積層されたプレトリガー／トリガーコンビネーション（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）として生じた化学発光シグナルから、相対発光単位（ＲＬＵ）を得た。マイクロタイターアッセイにおいて、＞８５％シグナル置換により示されるように、抗ＢＮＰ１０６．３ＡＭ１ ｍＡｂが、遊離ｈＢＮＰ断片アミノ酸１−２６及びアミノ酸５−１３に対して反応性があることが分かった。
改変キメラ１０６．３変異体の精密エピトープマッピング
抗ＢＮＰ１０６．ｓｃ１２８ Ｌ１ Ｂ２４ Ｈ２ ２８８ＡＭ１アラニンペプチドマッピングＥＩＡ
環状ｈＢＮＰ １−３２ アラニン置換ペプチドパネルによるアラニン変異誘発スクリーニング手順を用いて、１０６．３ＡＭ１ ｍＡｂの結合部位を同定した。ｈＢＮＰペプチドの単一アミノ酸をアラニンアミノ酸と置換した（位置１０及び２６を除く。）。標識化ｈＢＮＰ １−３２ペプチドに対して、非標識アラニン置換ペプチドとの結合能について、１０６．３ＡＭ１ ｍＡｂを評価した。抗種抗体で被覆した固相において一定濃度のｍＡｂをインキュベートし、次いで、非結合試料を洗い流す。結合した抗体を２９００ｎＭの非標識ペプチドと反応させる。インキュベート後、洗浄して非結合遊離ペプチドを除去する。次に、２．９ｎＭのビオチン化ｈＢＮＰ １−３２環状ペプチド（Ａｂｂｏｔｔ ＧＰＲＤ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を抗ＢＮＰ １０６．３ＡＭ１ ｍＡｂの何れかの非結合部位と反応させる。非結合ペプチドを洗い流し、その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加する。ＯＰＤ基質システム（Ａｂｂｏｔｔ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）を発色に使用し、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ ＭＡＰ ＥＩＡワークステーション（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、Ａｌａｂａｍａ）においてシグナルを読み取った。
１０６．３ＡＭ１ ｍＡｂの精密エピトープマッピングプロファイルを調べるためのツールとして、このシグナル置換ＥＩＡアッセイを使用した。遊離ペプチド濃度は、阻害を確実に生じさせるために、標識ペプチドの濃度を２−ｌｏｇ上回るものであった。図１９の棒グラフは、標識ペプチドに対する遊離ペプチドのＡＭ１抗体結合シグナルの、結合／非結合（Ｂ／Ｂ０）比を示す。アミノ酸残基がｈＢＮＰへのＡＭ１ ｍＡｂ結合に重要である場合、シグナル置換がない方向への偏向が検出される。この例において、Ｂ／Ｂｏ比が＞０．４となる場合、特定のアミノ酸がＭＡｂ結合に重要であると考えられる。１０６．３ＡＭ１ ｍＡｂ機能的エピトープが、下記配列において太字で示される、Ｖ５、Ｑ６、Ｇ７、Ｇ９、Ｆ１１及びＲ１３として同定される。
Figure 2009514975
ＢＩＡｃｏｒｅでの抗ＢＮＰ１０６．ｓｃ１２８ Ｌ１ Ｂ２４ Ｈ２ ２８８ＡＭ１アラニンペプチドマッピング
上述のようなアミンカップリングによって、前もって調整したＢＩＡｃｏｒｅ ＣＭ５チップ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にヤギ抗ヒトＦｃ（ＧＡＨＦｃ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）（抗種抗体）を固定化することにより、高密度ヤギ抗ヒトＦｃ（ＧＡＨＦｃ）抗体表面プラズマ共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを準備した。
個々のＳＰＲフローセル上に（１つのフローセルを参照対照としてブランクのままにしておく。）、２５℃にて、抗ＢＮＰ ＡＭ１ ｃＡｂ ６０μＬを１０μＬ／分で注入する。各ｃＡｂをバイオセンサー上に添加した後、１０分間、ＳＰＲランニング緩衝液で１００μＬ／分の流速で全フローセルを平衡化する。１０ｎＭの、ＢＮＰペプチド又はＢＮＰ単アラニン置換ペプチド（１０及び２６を除く各位置でアラニンを置換）２００μＬを１００μＬ／分でＡＭ１表面上に流した。解離を引き起こし、１８００秒間監視した。次にこの表面を本明細書中で既に述べたように再生する。
データを二重参照補正し（参照データを差し引き、次いでブランク緩衝液データを差し引くことにより、試料データを補正した。）、センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）の解離相からオフ速度を求めた。この結果から、アミノ酸Ｖ５、Ｑ６、Ｇ７、Ｇ９、Ｆ１１及びＲ１３が抗ＢＮＰ ＡＭ１／ＷＴ ＢＮＰ複合体の安定性に重要であることが示される。これらの残基を個々にアラニンに変異させた場合、オフ速度が少なくとも1桁向上する。このことから、上述のＥＩＡの知見と一致して、ＢＮＰに対するエピトープに結合する抗ＢＮＰ ＡＭ１ ｃＡｂが次のＢＮＰ残基、Ｖ５、Ｑ６、Ｇ７、Ｇ９、Ｆ１１及びＲ１３を含有することが示唆される（図２０参照）。
ＡＴＣＣ寄託情報
ＢＮＰ１０６．３ｓｃ１２８ａｍ１ＣＨＯ１１６２−２３６に対するチャイニーズハムスター卵巣細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（本明細書中で以後、「Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．」と呼ぶ。）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９に２００５年９月２０日に寄託し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６９８７が割り当てられた。
単一抗体方式を用いた競合的免疫アッセイ
上記実施例１及び２に記載のＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体（「抗体ＡＭ１」）を精製し、試験して、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ、この装置は、米国特許第５，４６８，６４６号に記載されている。）において単一抗体方式で、この抗体の、ヒト環状ＢＮＰ１−３２との結合能を調べた。この単一抗体方式は、試験反応で検体特異的抗体を１種類のみ使用することを包含する。
常磁性体微小粒子（本明細書中で、以後、「微小粒子」と呼ぶ。Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＭＡ）を洗浄し、次いで連続希釈したヤギ抗ヒト抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）と反応させた。米国特許第６，１６２，９０２号に記載の技術を用いてヤギ抗ヒト抗体で常磁性体微小粒子を被覆した。具体的には、ＥＤＡＣカップリングを使用した（ＥＤＡＣは、通常、一級アミンとのアミド結合に対してカルボキシル活性化剤として使用される。さらに、これはリン酸基と反応する。これは、ペプチド合成、核酸へのタンパク質の架橋及び免疫複合体の調製において使用される。ＥＤＡＣに対する化学式は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩である。ＥＤＡＣは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．から市販されている。）。インキュベート後、微小粒子を洗浄し、ＢＳＡで被覆した。次に、これらのヤギ抗ヒト被覆微小粒子を連続希釈抗体ＡＭ１と反応させ、インキュベートし、洗浄した。
次に、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で、ヒト環状ＢＮＰ１−３２への反応性について、これらの被覆微小粒子を試験した。ヒト環状ＢＮＰ１−３２を含有する一定分量を反応容器の中の微小粒子と同じウェルに入れ、反応混合物を形成させた。およそ１８分間、この反応混合物をインキュベートした。インキュベート後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで微小粒子を洗浄し、捕捉されなかったヒト環状ＢＮＰ １-３２を除去した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ ＤｉｌｕｅｎｔはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販されている。次に、アクリジニウムと連結されたヒト環状ＢＮＰ１−３２（本明細書中で以後「トレーサー」と呼ぶ。）を反応容器に分注し、約４分間、微小粒子と反応させ、その後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ Ｄｉｌｕｅｎｔでこの微小粒子を洗浄し、未結合物質を除去した。トレーサーを約５−２５ｎｇ／ｍＬに希釈した。この反応容器に過酸化水素溶液、次いで水酸化ナトリウムを添加し、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置の化学発光微小粒子免疫アッセイ（ＣＭＩＡ）光学アセンブリーにより、化学発光シグナルを測定した。図１５で示されるように、このアッセイ方式において、抗体ＡＭ１は、濃度依存的に、非標識ヒト環状ＢＮＰ １−３２への反応性を示した。
ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される抗体を用いたサンドイッチアッセイ
改変ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）−ｈＢＮＰアッセイ（本明細書中で以後、「Ａｒｃ−ＢＮＰ」と呼ぶ。）のために、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）３−６３１−４３６で常磁性体粒子を被覆した。このｍＡｂは、ｈＢＮＰペプチドのアミノ酸１３−１８を含有するアミノ酸配列と結合する。（ハイブリドーマ細胞株 ３−６３１−４３６により産生されるモノクローナル抗体は、米国特許出願第１１／１３５，０５０号、２００５年５月２５日出願、に記載されている。その内容を参照により本明細書中に組み込む。ハイブリドーマ細胞株３−６３１−４３６により産生されるモノクローナル抗体はまた、交換可能に、本明細書中で、「モノクローナル抗体３−６３１−４３６」及び「融合物３」とも呼ばれる。さらに、マウスハイブリドーマ細胞株 ３−６３１−４３６を２００４年１２月２１日にＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託し、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６４７６が割り当てられた。）。米国特許第６，１６２，９０２号に記載の技術を用いて、モノクローナル抗体３−６３１−４３６で常磁性体粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＭＡ）を被覆した。具体的には、ＥＤＡＣカップリングを使用した（ＥＤＡＣは、通常、一級アミンとのアミド結合に対してカルボキシル活性化剤として使用される。さらに、これはリン酸基と反応する。これは、ペプチド合成、核酸へのタンパク質の架橋及び免疫複合体の調製において使用される。ＥＤＡＣに対する化学式は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、塩酸塩である。ＥＤＡＣは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．から市販されている。）。粒子を洗浄し、ＢＳＡで被覆した。これらの粒子を使用して、検体との最初（第１回目）のインキュベート中、本アッセイにおいてＢＮＰペプチドを捕捉した。
あるいは、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてモノクローナル抗体 ３−６３１−４３６をビオチン化し、ストレプトアビジン−被覆スーパー常磁性体 Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＬＬＣ、Ｂｒｏｗｎ Ｄｅｅｒ、ＷＩ）上で捕捉した。検体との最初（第１回目）のインキュベート中、このアッセイにおいてＢＮＰペプチド捕捉するためにも、これらの粒子を使用した。
抗体ＡＭ１（実施例１及び２参照）をアクリジニウム（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ．）に連合させ、粒子結合ｈＢＮＰペプチドを検出するために第二（２回目）のインキュベート中、このアッセイにおいて使用した。活性化アクリジニウム−カルボキサミドエステルとの抗体ＡＭ１の反応により、連合が起こった。
上述のものに対するコンプリメンタルな（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）改変Ａｒｃ−ＢＮＰアッセイにおいて、ＥＤＡＣ化学を利用して抗体ＡＭ１で常磁性体粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＭＡ）を被覆することにより、又は抗体ＡＭ１をビオチン化し、ストレプトアビジン被覆スーパー常磁性体Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）上で捕捉することにより、捕捉粒子を調製した。この手順は、モノクローナル抗体３−６３１−４３６粒子の調製に対する上述のものと同一であった。これらの粒子を使用して、検体との最初（第１回目）のインキュベート中、このアッセイにおいてＢＮＰペプチドの捕捉も行った。抗体ＡＭＩをアクリジニウムに連合させた場合と同じ方法でモノクローナル抗体３−６３１−４３６をアクリジニウムに連合させ、粒子結合ｈＢＮＰペプチドを検出するための２回目のインキュベート中、このアッセイにおいて使用した。
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置（この装置は米国特許第５，４６８，６４６号に記載されている。）においてＢＮＰ免疫アッセイを行った。
キャリブレーター溶液を含有する一定分量を反応容器の微小粒子と同じウェルに入れ、反応混合物を形成させた。キャリブレーター溶液はｈＢＮＰ全長ペプチドを含有した。サンプリングプローブにより、Ｔｒｉｓ／ＢＳＡ希釈液中の捕捉抗体で被覆された微小粒子をサンプリングセンターの反応容器の適切なウェルにピペットで取った。約３７℃の温度でおよそ４分間（ストレプトアビジンに基づく粒子の場合１８分間）、この反応混合物をインキュベートした。インキュベート後、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで反応混合物を洗浄し、捕捉されなかったキャリブレーターを除去した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ ＤｉｌｕｅｎｔはＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓから市販されている。
約５０−１００ｎｇ／ｍＬのｍＡｂ−アクリジニウム−連合体を反応容器に分注し、約３７℃の温度でおよそ４分間インキュベートした。インキュベート後、反応容器をＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｌｉｎｅ Ｄｉｌｕｅｎｔで洗浄し、未結合物質を除去した。
過酸化水素溶液、次いで水酸化ナトリウム溶液を反応容器に添加し、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）装置の化学発光微小粒子免疫アッセイ（ＣＭＩＡ）光学アセンブリーにより、化学発光シグナルを測定した。
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムは、通常は相対光単位（本明細書中で以後、「ｒｌｕ’ｓ」）で測定されるアクリジニウムシグナルを測定する。測定は３回行った。下記表１及び図１６及び１７で示される結果は、３回の値の平均を示す。具体的に、表Ｂ及び図１６及び１７の結果は、ｐｇ／ｍＬ ＢＮＰキャリブレーターで示す。
Figure 2009514975
さらに、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片及び抗ｈＢＮＰ治療薬の治療用量の投与を受けている患者を監視するためにこの免疫アッセイを使用することができる。
当業者にとって当然のことながら、本発明は、目的を達成し、言及した結果及び長所ならびに本発明において固有の結果及び長所を得るためによく適応する。本明細書中に記載の、分子複合体及び方法、手順、治療、分子、具体的な化合物は、現在、好ましい実施形態の代表であり、典型であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者にとって当然のことながら、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書中で開示する本発明に対して様々な置換及び変更がなされ得る。
本明細書で言及する全特許及び刊行物は、本発明が属する分野において当業者のレベルを示すものである。全特許及び刊行物は、各個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるように、同じ程度に参照により本明細書に組込まれる。
本明細書中で具体的に開示されない何らかの要素、制限なく、本明細書中に具体的に記載の本発明を適切に実施し得る。したがって、例えば、本明細書中のいかなる場合も、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は何れも、他の２つの用語の何れかで置き換え得る。使用されている用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定の用語として使用されず、かかる用語及び表現の使用は示され記載されている特性又はその一部の何らかの同等物を排除するものではなく、特許請求される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることを認識されたい。このように、好ましい実施形態及び任意の特性により本発明を具体的に開示してきたが、本明細書中で開示する概念の、変更及び変化が当業者にとってなされ得、かかる変更及び変化が、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内にあるとみなされることを理解されたい。
図１は、高い結合親和性でヒトＢＮＰに免疫特異的に結合する抗体を同定し作製するために使用される段階を示すフローチャートを示す。 図２は、図４で示される１０６．３ １本鎖可変断片を含有するベクターｐＹＤ４１−４０に対するプラスミドマップを示す。 図３Ａは、図２で示されるベクターのヌクレオチド配列を示す。 図３Ｂは、図２で示されるベクターのヌクレオチド配列を示す。 図３Ｃは、図２で示されるベクターのヌクレオチド配列を示す。 図３Ｄは、図２で示されるベクターのヌクレオチド配列を示す。 図３Ｅは、図２で示されるベクターのヌクレオチド配列を示す。 図４は、１０６．３ １本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）の略図を示す。 図５は、１０６．３ １本鎖可変断片（「ｓｃＦｖ」）のアミノ酸配列を示す。 図６Ａは、１０６．３ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を示す。 図６Ｂは、１０６．３ ｓｃＦｖのヌクレオチド配列を示す。 図７Ａは、酵母発現全長１０６．３ １本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が環状ＢＮＰ（配列番号５）に結合することを示す。 図７Ｂは、酵母発現全長１０６．３ １本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が環状ＢＮＰ（配列番号５）に結合することを示す。 図８は、１０６．３ ｓｃＦｖオフ速度測定を示す。 図９は、相補性決定領域の３アミノ酸位置（９ヌクレオチド）が無作為にライブラリごとに変異化されるように、どのように縮重オリゴヌクレオチドを設計するかを示す。 図１０は、酵母相同組み換えを用いてどのように１０６．３ ｓｃＦｖライブラリを構築するかを示す。 図１１は、ＣＤＲ変異誘発ライブラリから単離された１０６．３ ｓｃＦｖ変異体のオフ速度が改善したこと（すなわち前記変異体のｋｏｆｆが遅くなった。）を示す。 図１２Ａは、ｓｃＦｖ １０６．３変異体の配列特性を示す。 図１２Ｂは、ｓｃＦｖ １０６．３変異体の配列特性を示す。 図１２Ｃは、ｓｃＦｖ １０６．３変異体の配列特性を示す。 図１３は、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた、表面プラズモン共鳴による、選択した１０６．３改変ヒト−マウスキメラ抗体及びマウス１０６．３ｍＡｂの親和性測定を示す。 図１４Ａは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１４Ｂは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１４Ｃは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１４Ｄは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１４Ｅは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１４Ｆは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１４Ｇは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１４Ｈは、実施例１で述べたギャップのあるｐＹＤ４１ベクターを作製するために使用した（５４）オリゴヌクレオチドを示す。 図１５は、実施例３で述べたような単一抗体アッセイ方式での抗体ＡＭ１のヒト環状ＢＮＰ１−３２への結合能を調べるための試験の結果を示す。 図１６は、実施例４で述べたように、抗体ＡＭ１及び融合物３を用いたストレプトアビジン微小粒子を使用した、抗ｈＢＮＰ抗体ペア評価を示す。 図１７は、実施例４で述べたように、抗体ＡＭ１及び融合物３を用いた常磁性体微小粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｓより。）を使用した、抗ｈＢＮＰ抗体ペア評価を示す。 図１８は、様々なｈＢＮＰペプチド（約１８１ｎＭで使用）での抗体ＡＭ１（約０．０１μｇ／ｍＬで使用）の置換を示す。 図１９は、ＥＩＡを用いた抗体ＡＭ１のアラニンペプチドマッピングを示す。 図２０は、ＢＩＡｃｏｒｅを用いた抗体ＡＭＩのアラニンペプチドマッピングを示す。様々なＢＮＰペプチドを含有するＢＮＰ複合体のｋｏｆｆの上昇（倍）を示す。

Claims (50)

  1. ハイブリドーマ細胞株１０６．３（該細胞株はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＨＢ−１２０４４を有する。）により産生される抗体と比較した場合、その平衡解離定数（ＫＤ）が少なくとも約２倍改善している、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド（「ｈＢＮＰ」）のアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する単離抗体。
  2. 単離抗体が、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体と比較した場合、そのＫＤにおいて少なくとも約５倍の改善を示す、請求項１に記載の抗体。
  3. 単離抗体が、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体と比較した場合、そのＫＤにおいて少なくとも約１０倍の改善を示す、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
  4. 単離抗体が、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体と比較した場合、そのＫＤにおいて少なくとも約１５倍の改善を示す、請求項１から請求項３の何れかに記載の抗体。
  5. 単離抗体が、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体と比較した場合、そのＫＤにおいて少なくとも約２０倍の改善を示す、請求項１から請求項４の何れかに記載の抗体。
  6. 単離抗体が、ハイブリドーマ細胞株１０６．３により産生される抗体と比較した場合、そのＫＤにおいて少なくとも約２５倍の改善を示す、請求項１から請求項５の何れかに記載の抗体。
  7. モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片である、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の抗体。
  8. ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する単離抗体（該抗体は、約５．０ｘ１０４から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度（ｋａ）を有する。）。
  9. 約３．３ｘ１０４から約１．０ｘ１０９Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度を有する、請求項８に記載の抗体。
  10. 約２．５ｘ１０４から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度を有する、請求項８又は請求項９に記載の抗体。
  11. 約２．４ｘ１０４から約１．３５ｘ１０７Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度を有する、請求項８から請求項１０の何れかに記載の抗体。
  12. モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片である、請求項８から請求項１１の何れか一項に記載の抗体。
  13. ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する、請求項８から請求項１２の何れか一項に記載の抗体。
  14. 約１．０ｘ１０−３から約１．０ｘ１０−６・ｓ−１の間の解離速度（ｋｄ）を有する、免疫特異的にｈＢＮＰに結合する単離抗体。
  15. 約１．０ｘ１０−３から約１．０ｘ１０−５・ｓ−１の間の解離速度を有する、請求項１４に記載の抗体。
  16. 約１．０ｘ１０−３から約１．０ｘ１０−４・ｓ−１の間の解離速度を有する、請求項１４又は請求項１５に記載の抗体。
  17. モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片である、請求項１４から請求項１６の何れか一項に記載の抗体。
  18. ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する、請求項１４から請求項１７の何れか一項に記載の抗体。
  19. 約２ｘ１０−１１Ｍから約１ｘ１０−１５Ｍの間の平衡解離定数（ＫＤ）を有する、ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する単離抗体。
  20. 約３．０ｘ１０−１１Ｍから約１．０ｘ１０−１４Ｍの間の平衡解離定数を有する、請求項１９に記載の抗体。
  21. 約４．０ｘ１０−１１Ｍから約８．０ｘ１０−１３Ｍの間の平衡解離定数を有する、請求項１９又は請求項２０に記載の抗体。
  22. 約４．２ｘ１０−１１Ｍから約７．４ｘ１０−１３Ｍの間の平衡解離定数を有する、請求項１９から請求項２１の何れか一項に記載の抗体。
  23. モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片である、請求項１９から請求項２２の何れか一項に記載の抗体。
  24. ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する、請求項１９から請求項２３の何れか一項に記載の抗体。
  25. Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６９８７を有する、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞株ＡＭ１。
  26. Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６９８７を有するＣＨＯ細胞株ＡＭ１から抽出されたＤＮＡから作製された抗体。
  27. ＣＨＯ細胞株ＡＭ１により産生される、キメラ抗体又はそのｈＢＮＰ−エピトープ結合断片（該細胞株はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＰＴＡ−６９８７を有する。）。
  28. ｈＢＮＰに免疫特異的に結合する単離抗体（該抗体は、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを有し、可変重鎖ドメインは、重鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３を含有し、可変軽鎖ドメインは、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含有し、
    （ａ）重鎖ＣＤＲ１は、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ（配列番号６）のアミノ酸配列を有し；
    （ｂ）重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号１２）の式を有するアミノ酸配列を有し；
    式中、Ｘａａ１は、プロリン及びアラニンからなる群から選択され；
    式中、Ｘａａ２は、イソロイシン及びチロシンからなる群から選択され；
    （ｃ）重鎖ＣＤＲ３は、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（配列番号８）のアミノ酸配列を有し；
    （ｄ）軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号１３）の式を有するアミノ酸配列を有し；
    式中、Ｘａａ３は、セリン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、スレオニン及びアルギニンからなる群から選択され；
    式中、Ｘａａ４は、グルタミン、チロシン、トリプトファン、アラニン及びフェニルアラニンからなる群から選択され；
    式中、Ｘａａ５は、セリン、グリシン、プロリン、アラニン及びアスパラギン酸からなる群から選択され；
    （ｅ）軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｓｅｒ（配列番号１４）の式を有するアミノ酸配列を有し；
    式中、Ｘａａ６は、アスパラギン及びシステインからなる群から選択され；
    式中、Ｘａａ７は、ロイシン、グリシン及びアラニンからなる群から選択され；
    式中、Ｘａａ８は、グルタミン酸、トリプトファン及びプロリンからなる群から選択され；
    （ｆ）軽鎖ＣＤＲ３は、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（配列番号１１）のアミノ酸配列を有し；
    軽鎖ＣＤＲ１がＬｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ２がＡｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）のアミノ酸配列を有する場合、重鎖ＣＤＲ２は、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）以外のアミノ酸配列を有するか、重鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）を有し、軽鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）を有する場合、軽鎖ＣＤＲ１は、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）以外のアミノ酸配列を有するか、又は、重鎖ＣＤＲ２がＴｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号７）のアミノ酸配列を有し、軽鎖ＣＤＲ１が、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ（配列番号９）のアミノ酸配列を有する場合、軽鎖ＣＤＲ２は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１０）以外のアミノ酸配列を有する。）。
  29. Ｘａａ１がアラニンであり、
    Ｘａａ２がチロシンであり、
    Ｘａａ３がセリンであり、
    Ｘａａ４がグルタミンであり、
    Ｘａａ５がセリンであり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  30. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がグルタミンであり、
    Ｘａａ４がフェニルアラニンであり、
    Ｘａａ５がアラニンであり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  31. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がチロシンであり、
    Ｘａａ４がアラニンであり、
    Ｘａａ５がセリンであり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  32. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がグルタミンであり、
    Ｘａａ４がトリプトファンであり、
    Ｘａａ５がグリシンであり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  33. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がスレオニンであり、
    Ｘａａ４がトリプトファンであり、
    Ｘａａ５がアスパラギン酸であり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  34. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がアルギニンであり、
    Ｘａａ４がトリプトファンであり、
    Ｘａａ５がプロリンであり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  35. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がアラニンであり、
    Ｘａａ４がチロシンであり、
    Ｘａａ５がグリシンであり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  36. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がアスパラギンであり、
    Ｘａａ４がトリプトファンであり、
    Ｘａａ５がプロリンであり、
    Ｘａａ６がアスパラギンであり、
    Ｘａａ７がロイシンであり、
    Ｘａａ８がグルタミン酸である、請求項２８に記載の抗体。
  37. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がセリンであり、
    Ｘａａ４がグルタミンであり、
    Ｘａａ５がセリンであり、
    Ｘａａ６がシステインであり、
    Ｘａａ７がグリシンであり、
    Ｘａａ８がトリプトファンである、請求項２８に記載の抗体。
  38. Ｘａａ１がプロリンであり、
    Ｘａａ２がイソロイシンであり、
    Ｘａａ３がセリンであり、
    Ｘａａ４がグルタミンであり、
    Ｘａａ５がセリンであり、
    Ｘａａ６がシステインであり、
    Ｘａａ７がアラニンであり、
    Ｘａａ８がプロリンである、請求項２８に記載の抗体。
  39. 約２．０ｘ１０−１１Ｍから約１．０ｘ１０−１５Ｍの間の平衡解離定数を有する、請求項２６から請求項３８の何れか一項に記載の抗体。
  40. 約３．０ｘ１０−１１Ｍから約１．０ｘ１０−１４Ｍの間の平衡解離定数を有する、請求項２６から請求項３９の何れか一項に記載の抗体。
  41. 約４．０ｘ１０−１１Ｍから約８．０ｘ１０−１３Ｍの間の平衡解離定数を有する、請求項２６から請求項４０の何れか一項に記載の抗体。
  42. 約４．２ｘ１０−１１Ｍから約７．４ｘ１０−１３Ｍの間の平衡解離定数を有する、請求項２６から請求項４１の何れか一項に記載の抗体。
  43. 約５．０ｘ１０４から約１．０ｘ１０８Ｍ−１ｓ−１の間の会合速度（ｋａ）をさらに含む、請求項２６から請求項４２の何れか一項に記載の抗体。
  44. 約１．０ｘ１０−３から約１．０ｘ１０−６ｓ−１の間の解離速度（ｋｄ）をさらに含む、請求項２６から請求項４３の何れか一項に記載の抗体。
  45. モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分的ヒト化抗体、動物抗体、組み換え抗体、キメラ抗体、１本鎖Ｆｖ、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ、抗イディオタイプ抗体又は機能的に活性のあるそのエピトープ結合断片である、請求項２６から請求項４４の何れか一項に記載の抗体。
  46. ｈＢＮＰのアミノ酸残基５から１３を含有するエピトープに免疫特異的に結合する、請求項２６から請求項４５の何れか一項に記載の抗体。
  47. 請求項１から請求項２４及び請求項２５から請求項４６の何れか一項に記載の抗体を含む、ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対する免疫アッセイ。
  48. ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に免疫特異的に結合する１種類の抗体を含む、請求項４７に記載の免疫アッセイ。
  49. ｈＢＮＰ又はｈＢＮＰ断片に対するさらなる特異的結合パートナーをさらに含む、請求項４７又は請求項４８に記載の免疫アッセイ。
  50. 請求項１から請求項２４及び請求項２５から請求項５０の何れか一項に記載の抗体の治療的有効量を含む、医薬組成物。
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