CN113156096A

CN113156096A - 用于诊断冠状动脉粥样硬化性疾病的基于血液的生物标志物

Info

Publication number: CN113156096A
Application number: CN202110212393.2A
Authority: CN
Inventors: S·沃罗斯; B·O·布朗; I·B·玛瓦斯蒂
Original assignee: Global Genomics Group LLC
Current assignee: Global Genomics Group LLC
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2021-07-23
Also published as: EP3242588A1; EP3242588B1; IL253179A0; WO2016112337A1; EP3967217B1; EP3650852A1; ZA201705032B; EP3650852B1; HUE056203T2; HUE047951T2; TWI690707B; TW201802471A; US20190391131A1; TWI610079B; KR20170102983A; EP3967217A1; US20160202239A1; EP3242588A4; SG11201705444QA; US10254272B2

Abstract

本发明涉及用于诊断冠状动脉粥样硬化性疾病的基于血液的生物标志物。在一些方面，本发明涉及用于评估人类对象的具有冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或具有冠状动脉粥样硬化斑块的方法。在一些方面，本发明涉及用于诊断、分类、分析和治疗动脉粥样硬化性CAD和或冠状动脉粥样硬化斑块的方法和试剂盒。

Description

用于诊断冠状动脉粥样硬化性疾病的基于血液的生物标志物

本申请是中国专利申请201680014800.6的分案申请，原申请201680014800.6的申请日为2016年01月08日，其名称为“用于诊断冠状动脉粥样硬化性疾病的基于血液的生物标志物”。

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2015年1月9日提交的美国临时专利申请第62/101,445号的优先权，其全部内容在此引用以作参考。

技术领域

本发明涉及在患者中诊断冠状动脉粥样硬化性疾病(atherosclerotic coronaryartery disease，“ASCAD”)和/或检测冠状动脉粥样硬化斑块的非侵入式(non-invasive)方法，和更具体地涉及使用代谢组学的基于血液的生物标志物和其组合以识别具有动脉粥样硬化性CAD和/或具有冠状动脉粥样硬化斑块的患者的方法。

背景技术

在美国和世界范围内，心血管疾病(CVD)仍是发病率和死亡率的主要原因。基于American Heart Association(AHA)的2014Heart Disease and Stroke Update，8,360万美国成人具有至少一种CVD(>1/3流行率)。这些成人中，1,540万患有冠心病(CHD)，伴有以下健康状况不佳(breakdown)：心肌梗塞(MI)：760万，和心绞痛(AP)：780万。据估计至2030年，43.9％美国人口将具有某些形式的CVD。

CVD的潜在原因是冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)，所述冠状动脉粥样硬化性疾病开始于冠状动脉脉管系统中的动脉粥样硬化斑块的发展。就人类健康和社会成本而言，动脉粥样硬化具有无可非议的重要性。动脉粥样硬化导致冠状动脉疾病(CAD)和脑血管疾病，这两者都是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。动脉粥样硬化也导致是肢体缺损(limb-loss)的主要医学原因的外周动脉疾病。

动脉粥样硬化性CAD的发展和演进遵循两个不同路径，它们可从一个导致另一个，并导致两种不同的临床综合征。两大临床综合征之一是“运动性心绞痛(exertionalangina)”，也称为“稳定型心绞痛”或“稳定型CAD”。在这种情况下，逐渐生长的动脉粥样硬化斑块导致开始阻止血液流向心肌(心脏肌肉)的逐渐恶化的冠状动脉管腔狭窄或变窄。当管腔狭窄或变窄达到临界极限，约70％直径狭窄，在狭窄处存在显著的压力下降，并且心肌灌注(流向心脏肌肉的血液)受限，特别是在心肌氧需求增加时，例如在施力或情绪化状态时。当流向心脏肌肉的血液不能满足需求时，这种心肌氧的“供给-需求不匹配”导致心肌缺血。心肌缺血本身触发心脏中的疼痛受体，导致“心绞痛”的临床症状或胸痛。虽然该过程在施力或情绪化状态时通常导致胸痛，其通常不导致急性冠状动脉综合征，例如心源性猝死(SCD)、心肌梗塞(MI；心脏病发作)或非稳定型心绞痛(UA)。典型的治疗选择包括用β阻断剂或钙通道阻断剂进行医学介入(medical intervention)从而降低心率，并用药物如硝酸盐来改善血流。典型的介入方法目标是缓解狭窄，其通过在狭窄中经皮放置支架(经皮冠状动脉介入治疗；PCI)以打开狭窄，或在冠状动脉旁路移植(CABG)手术中使用动脉或静脉移植体绕过狭窄(变窄)区段。如以上指出的，该“运动性心绞痛”的病理生理学和临床过程的根本原因是冠状动脉动脉粥样硬化或动脉粥样硬化性CAD。

具有相应临床表现的第二大病理生理学路径称为“急性冠状动脉综合征”(ACS)，其包括心源性猝死(SCD)、心肌梗塞(MI)和非稳定型心绞痛(UA)。在这种情况下，冠状动脉中的动脉粥样硬化斑块(根本原因)可通过破裂或侵蚀而破坏。当冠状动脉粥样硬化斑块破坏，所述破坏触发血栓(凝块)在破坏区域的形成，所述血栓可部分或完全地堵塞整个冠状动脉，导致向心肌的血液供应突然中断(急性心肌缺血)。该病理生理学可体现在心源性猝死(SCD)、心肌梗塞(MI)或静息心绞痛。典型的治疗选项通常是介入选项，其中在侵入式操作(invasive procedure)中用支架覆盖急性破坏的斑块。正如“运动性心绞痛”的情况，急性冠状动脉综合征的根本原因是冠状动脉脉管系统中的动脉粥样硬化斑块。

因此，动脉粥样硬化斑块的发生和发展是动脉粥样硬化性CAD和CHD的临床表现的根本原因。因此，仍存在对检测动脉粥样硬化斑块和诊断动脉粥样硬化性CAD的改进诊断方法的需要。

发明内容

一方面，本公开提供了用于评估人类对象具有冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或具有冠状动脉粥样硬化斑块的非侵入式方法。ASCAD包括例如动脉粥样硬化。所述方法包括测量从对象获得的生物样品中一组分析物生物标志物中的各分析物的水平，其中该组分析物生物标志物选自由以下组成的组：

(i)一组生物标志物，其包括缬氨酰亮氨酸、谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮(1-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinone，acisoga)、尿酸盐(酯)、葡糖醛酸盐(酯)、岩藻糖、丁酰肉碱(C4)和甘露糖；

(ii)一组生物标志物，其包括N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、硫酸邻甲酚、苏糖酸盐(酯)和半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物；

(iii)一组生物标志物，其包括N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、甘氨酰苯丙氨酸、丝氨酰亮氨酸和岩藻糖；

(iv)一组生物标志物，其包括谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、缬氨酰亮氨酸、甘露糖、葡糖醛酸盐(酯)、尿酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)和12-HETE；

(v)一组生物标志物，其包括硫酸邻甲酚、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物、葡萄糖、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)和苏糖酸盐(酯)；

(vi)一组生物标志物，其包括N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、12-HETE和2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))；

(vii)一组生物标志物，其包括N-乙酰苏氨酸、巴豆酰甘氨酸(tigloylglycine)、甘油酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)和丙醇二酸盐(酯)(tartronate)(羟基丙二酸化)；

(viii)一组生物标志物，其包括N-乙酰甘氨酸和3-乙基苯基硫酸盐(酯)；

(viv)一组生物标志物，其包括血清素(5HT)、N-乙酰腐胺、亮氨酰亮氨酸、丙酰甘氨酸(C3)、胆酸盐(酯)、甘氨胆烯酸硫酸盐(酯)(glycocholenate sulfate)、天冬酰胺和3-乙基苯基硫酸盐(酯)；

(x)一组生物标志物，其包括N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、甘露糖、戊酰肉碱(C5)、1-亚油酰-GPE(18.2)、甘氨熊脱氧胆酸盐(酯)(glycoursodeoxycholate)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))和水杨酸盐(酯)；

(xi)一组生物标志物，其包括N-乙酰甘氨酸、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、3-乙基苯基硫酸盐(酯)和水杨酸盐(酯)；

(xii)一组生物标志物，其包括天冬酰胺、牛磺酸、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、1-油酰甘油(18:1)、胆固醇和2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、6-氧代哌啶-2-羧酸和丙酰甘氨酸(C3)，其中多种分析物生物标志物的水平(包括相对水平)或存在指示了具有ASCAD和/或存在冠状动脉粥样硬化斑块。任何上述组可进一步包括年龄和性别的分析。

另一方面，本公开提供包括通过质谱测量从人类对象获得的血液样品中多种代谢物各自的水平的方法，其中所述多种代谢物选自由以下组成的组：(i)缬氨酰亮氨酸、谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、尿酸盐(酯)、葡糖醛酸盐(酯)、岩藻糖、丁酰肉碱(C4)和甘露糖；(ii)N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、硫酸邻甲酚、苏糖酸盐(酯)和半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物；(iii)N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、甘氨酰苯丙氨酸、丝氨酰亮氨酸和岩藻糖；(iv)谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、缬氨酰亮氨酸、甘露糖、葡糖醛酸盐(酯)、尿酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)和12-HETE；(v)硫酸邻甲酚、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物、葡萄糖、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)和苏糖酸盐(酯)；(vi)N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、12-HETE和2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))；(vii)N-乙酰苏氨酸、巴豆酰甘氨酸、甘油酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)和丙醇二酸盐(酯)(羟基丙二酸化)；(viii)N-乙酰甘氨酸和3-乙基苯基硫酸盐(酯)；(viv)血清素(5HT)、N-乙酰腐胺、亮氨酰亮氨酸、丙酰甘氨酸(C3)、胆酸盐(酯)、甘氨胆烯酸硫酸盐(酯)、天冬酰胺和3-乙基苯基硫酸盐(酯)；(x)N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、甘露糖、戊酰肉碱(C5)、1-亚油酰-GPE(18.2)、甘氨熊脱氧胆酸盐(酯)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))和水杨酸盐(酯)；(xi)N-乙酰甘氨酸、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、3-乙基苯基硫酸盐(酯)、水杨酸盐(酯)；和(xii)天冬酰胺、牛磺酸、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、1-油酰甘油(18:1)、胆固醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、6-氧代哌啶-2-羧酸、和丙酰甘氨酸(C3)。

一方面，本公开提供一种用于评估人类对象具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括测量从对象获得的生物样品中一组分析物生物标志物中的各分析物的水平，其中该组分析物生物标志物选自由以下组成的组：

(xiii)一组生物标志物，其包括缬氨酰亮氨酸、异亮氨酰缬氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸、X-12212、葡糖醛酸盐(酯)和谷氨酸盐(酯)；

(xiv)一组生物标志物，其包括葡萄糖、γ-谷氨酰转移酶、尿酸、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、脂蛋白(a)团(lipoprotein(a)mass)、碱性磷酸酶、和载脂蛋白B；

(xv)一组生物标志物，其包括谷氨酸盐(酯)、X-16132、异亮氨酰丙氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、脂蛋白(a)团、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇(Small dense Low DensityLipoprotein Cholesterol)、X-12212、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ ID NO:1)、谷氨酰胺、亮氨酸、和苏氨酰亮氨酸；

(xv1)一组生物标志物，其包括CER22.1、HexCER18:1、TG15:0、SM16:0、CER20:0、DHC20:1、和CER18:0；

(xvii)一组生物标志物，其包括CER20:0、载脂蛋白B、SM16:0、脂蛋白(a)团、DHC20L1、碱性磷酸酶、和CER18:0；

(xviii)一组生物标志物，其包括谷氨酸盐(酯)、X-16132、异亮氨酰丙氨酸、脂蛋白(a)团、X-12212、和谷氨酰胺-亮氨酸；

(xix)一组生物标志物，其包括oleic2(油酸)、N-末端脑钠肽前体(N-terminalpro-brain natriuretic peptide)、脂蛋白(a)团、胰岛素、糖化血红蛋白A1C、西斯蒙滔托(cismontaotl)、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇、behenic2(山嵛酸)、脂联素、和γ-谷氨酰转移酶；

(xx)一组生物标志物，其包括异亮氨酰丙氨酸、葡糖醛酸盐(酯)、甘氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、甘露糖、X-21452、1-油酰甘油磷酸甘油(1-oleoylglycerophosphoglycerol)、X-21335、7-甲基黄嘌呤、X-12729、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、α-羟基异戊酰肉碱、2-氨基己二酸盐(酯)、X-18914、巴豆酰甘氨酸、和吡哆醛；

(xxi)一组生物标志物，其包括异亮氨酰丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、oleic2、X-21335、甲基黄嘌呤、氨基己二酸盐(酯)、甘露糖、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、花生四烯酰-GPE.20.4、和甘油三酯；

(xxii)一组生物标志物，其包括DHC18:0、DG18:1n9、总二酰甘油(totaldiacylglycerol)、TG20:3n9、CE20:4n6、CER18:1、DHC20:1、CE18:2n6、PL18:2n6、SM18:0、FA14:1n5、PL15:0、和CE16:0；

(xxiii)一组生物标志物，其包括糖化血红蛋白A1C、总二酰甘油、西斯蒙他托(cismontotl)、脂蛋白(a)团、TG20.3n9、oleic2、DHC18.1、N-末端脑钠肽前体、γ-谷氨酰转移酶、和CER18；

(xxiv)一组生物标志物，其包括异亮氨酰丙氨酸、甘氨酸、西斯蒙他托、脂蛋白(a)团、X-21452、异亮氨酰苯丙氨酸、糖化血红蛋白A1C、X-21335、X7-甲基黄嘌呤、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮和X-12729；其中多种分析物生物标志物的水平(包括相对水平)或存在指示了具有冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或存在冠状动脉粥样硬化斑块。

本发明的方面还提供一种用于评估人类对象具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的生物标志物组。“生物标志物组”意为两种以上的分子实体例如两种、三种、四种、五种或多于五种实体的集合或组合，所述实体在样品中表示与ASCAD或冠状动脉粥样硬化斑块相关。本文中描述的生物标志物组可用于诊断ASCAD或识别冠状动脉粥样硬化斑块的存在、向具有ASCAD或冠状动脉粥样硬化斑块的患者提供预后、向具有ASCAD或冠状动脉粥样硬化斑块的患者提供对药物治疗的响应性的预测、监测具有ASCAD或冠状动脉粥样硬化斑块的患者、治疗具有ASCAD或冠状动脉粥样硬化斑块的患者等。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述生物样品中的所述分析物的测量水平与一个或多个参考样品进行对比，所述参考表示匹配的(例如年龄、性别等)人类对象。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括，如果所述生物样品中的所述分析物的测量水平相对于所述参考样品中的所述分析物的量增加或减少，识别对象为具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块。

在一些实施方案中，所述方法包括指示医疗保健专业人员(例如，医师、医师助理、从业护士、护士和个案管理者(case manager))完成对识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象的非侵入式心血管评估。进一步的非侵入式心血管评估可确认对象是否具有或不具有冠状动脉粥样硬化性疾病或冠状动脉粥样硬化斑块。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括对识别为具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象进行非侵入式心血管评估从而确认对象是否具有冠状动脉粥样硬化性疾病或冠状动脉粥样硬化斑块。所述非侵入式心血管评估可为选自由以下组成的组的过程：心血管计算机断层扫描(cardiovascular computed tomography，CT)成像、运动负荷试验(exercise stress test)、药物负荷试验(pharmacologic stress test)、心肌灌注成像、负荷超声心动图(stress echocardiography)、和心血管磁共振成像。

在又一个实施方案中，所述方法进一步包括向识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象选择性施用包括有效量的治疗剂的组合物从而治疗对象，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：他汀、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物、Ω-3-脂肪酸化合物、胆汁酸螯合剂、PCSK9抑制剂、抗血小板剂、醛甾酮阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、β阻断剂、利尿剂、毛地黄、肼苯哒嗪(hydralazine)和硝酸盐、华法林(warfarin)和阿司匹林。

对于识别为具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象，所述方法可进一步包括为对象选择治疗计划。例如，所述方法可进一步包括为对象选择治疗计划，所述治疗计划包括选择性施用包括有效量的治疗剂的组合物，和/或进行非侵入式心血管评估，所述非侵入式心血管评估包括例如进行选自由以下组成的组的过程：心血管计算机断层扫描(CT)成像、运动负荷试验、药物负荷试验、心肌灌注成像、负荷超声心动图、和心血管磁共振成像。所述治疗计划可包括给对象开具治疗性生活方式改变的医嘱从而改善心血管健康。

在一些实施方案中，各分析物的水平使用质谱(MS)分析测量。所述MS分析方法可为液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)、色谱-质谱(GC-MS)、或核磁共振(NMR)。

在一些方面，本文公开的方法进一步包括选取识别为具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象进行治疗。在一些实施方案中，所述治疗包括向识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象选择性施用包括有效量的选自由以下组成的组的治疗剂的组合物：他汀、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物、Ω-3-脂肪酸化合物、胆汁酸螯合剂、PCSK9抑制剂、抗血小板剂、醛甾酮阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、β阻断剂、利尿剂、毛地黄、肼苯哒嗪和硝酸盐、华法林和阿司匹林，从而治疗对象。在一些实施方案中，所述治疗包括对识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象进行非侵入式心血管评估从而确认对象是否具有或不具有冠状动脉粥样硬化性疾病或冠状动脉粥样硬化斑块。在一些实施方案中，所述治疗计划包括开具治疗性生活方式改变的医嘱从而改善心血管健康。

另一方面，本发明提供用于评估人类对象具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的试剂盒。所述试剂盒包括适用于测定试验样品中多种分析物的水平的试剂(例如，适用于测定本文公开的代谢组学生物标志物的水平的试剂)；任选地，一种或多种对照样品，其包括预定水平的相同分析物，其中试验样品中所述分析物的水平与对照样品中的水平的比较识别对象为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块；和本文描述的方法中使用所述试剂盒的说明。

本文使用的术语“生物样品”或“样品”指的是从对象获得或源自对象的样品。作为示例，所述样品可选自由以下组成的组：体液、血液、全血、血浆、血清、粘液分泌物、尿液或唾液。在一些实施方案中，所述样品是或包括血液样品。优选的用于检测生物标志物的生物源是血液样品、血清样品或血浆样品。

本文使用的术语“对象”指的是哺乳动物。因此对象指的是例如狗、猫、马、牛、猪、豚鼠、人类等。当所述对象是人类，所述对象可在本文中称为患者。所述对象可为有症状的(例如，所述对象显示出与动脉粥样硬化性CAD相关的症状，例如，胸痛、心绞痛、心绞痛等同症状、呼吸困难或运动性呼吸困难；和/或显示出与冠状动脉疾病相关的风险因素，例如，男性性别、高血压、血脂异常、糖尿病、女性绝经后状态、吸烟、或冠状动脉疾病的家族史)，或所述对象可为无症状的(例如，所述对象不显示与动脉粥样硬化性CAD相关的症状)。

本文使用的“获得”或“获取”可为本领域技术人员通过“直接”或“间接”手段拥有样品的任何手段。直接获取样品意为进行过程(例如，进行物理方法例如提取)从而获得样品。间接获取样品指的是从另一方或另一源接收样品(例如，直接取得样品的第三方实验室)。直接获取样品包括进行包括物理物质中的物理变化的过程，所述物理物质例如起始材料如血液，例如，此前从患者分离的血液。因此，获取用来意指从对象收集和/或移除样品。此外，“获取”还用来意指从此前拥有所述样品的另一方接收所述样品。

在一些实施方案中，所述参考样品取自不患有心血管疾病的至少一个个体。在另一些实施方案中，所述参考样品取自此前诊断为具有心血管疾病(例如，冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或冠状动脉粥样硬化斑块)的至少一个个体。在一些实施方案中，所述参考样品包括预定的、统计学上显著的参考分析物水平。

在一些实施方案中，所述测定步骤使用梯度提升(gradient boosting)算法进行。在一些实施方案中，所述测定步骤使用广义线性建模(generalized linear modeling)进行。

在又一个实施方案中，所述方法进一步包括调整所述对象的临床记录从而识别所述对象为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块。优选地，所述临床记录存储在计算机可读介质中。

以下提供本文描述的相关分析模型的总结：

a.自体的CAD(Native CAD)中的动脉粥样硬化-A^nCAD

i.禁食和非禁食组合中显著-

ii.禁食和非禁食中独立地显著-

iii.禁食中显著-

b.全部CAD(All CAD)(包括血管再形成(revascularization))中的动脉粥样硬化-A^aCAD

i.禁食和非禁食组合中显著-

ii.禁食和非禁食中独立地显著-

iii.禁食中显著-

c.自体的CAD中的50％狭窄

i.禁食和非禁食组合中显著-

ii.禁食和非禁食中独立地显著-

iii.禁食中显著-

d.全部CAD(包括血管再形成)中的50％狭窄

i.禁食和非禁食组合中显著-

ii.禁食和非禁食中独立地显著-

iii.禁食中显著的分析物-

本文使用的节标题仅用于组织目的，不应解释为以任何方式限制所描述的主题。当引入的参考中的术语的定义与本教导中提供的定义不同时，应以本教导中提供的定义为准。应理解，在本教导中讨论的度量例如温度、浓度和时间之前存在隐含的“约”，从而使轻度的和非实质的偏差在本文教导的范围内。在本申请中，除非另有说明，使用单数包括复数。另外，使用“包括(comprise、comprises、comprising)”、“含有(contain、contains、containing)”和“包括(include、includes、including)”不旨在限制性的。应理解，以上一般描述和以下详细描述仅是示例性和解释性的，并不限制本发明。本文使用的冠词“一个/种(a和an)”是指一个/种、或到大于一个/种(即至少一个/种)所述冠词的语法对象。作为示例，“一种元素”是指一种元素或多于一种元素。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可使用本领域公知的其它合适的方法和材料。所述材料、方法和实施方案仅是说明性的而不旨在限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考以其整体引用以作参考。在发生冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。

从以下具体实施方式和附图以及从权利要求中，本发明的其它特征和优点将是显而易见的。

附图说明

图1为示出临床组的Diamond Forrester评分的盒须图的图。

图2为示出Diamond Forrester评分和自体的CAD的ROC曲线(AUC＝0.5；阈值＝inf；敏感性＝0；特异性＝1；准确度＝0.57)的图。

图3为示出临床组的Morise评分的盒须图的图。

图4为示出自体的CAD的Morise评分的ROC曲线(AUC＝0.58；阈值＝20；敏感性＝0.04；特异性＝0.98；准确度＝0.58)的图。

图5为示出自体的CAD的临床模型的ROC曲线(AUC＝0.79；阈值＝0.5；敏感性＝0.49；特异性＝0.9；准确度＝0.73)的图。

图6为提供自体的CAD的临床模型的11个临床变量的部分依赖图表(PartialDependence Plots)的一系列图。

图7为示出自体的CAD的代谢组学模型的ROC曲线(AUC＝0.78；阈值＝0.39；敏感性＝0.82；特异性＝0.64；准确度＝0.72)的图。

图8为提供自体的CAD的代谢组学模型的6个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图9为提供自体的CAD的临床-代谢组学模型的10个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图10为示出自体的CAD的临床-代谢组学模型的ROC曲线(AUC＝0.82；阈值＝0.5；敏感性＝0.56；特异性＝0.88；准确度＝0.74)的图。

图11为提供自体的CAD的脂质组学模型的7个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图12为示出自体的CAD的脂质组学模型的ROC曲线(AUC＝0.74；阈值＝0.46；敏感性＝0.6；特异性＝0.79；准确度＝0.71)的图。

图13为提供自体的CAD的临床-脂质组学模型的7个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图14为示出自体的CAD的临床-脂质组学模型的ROC曲线(AUC＝0.76；阈值＝0.47；敏感性＝0.52；特异性＝0.84；准确度＝0.7)的图。

图15为提供自体的CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的6个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图16为示出自体的CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的ROC曲线(AUC＝0.78；阈值＝0.47；敏感性＝0.52；特异性＝0.89；准确度＝0.73)的图。

图17为示出Diamond Forrester评分和全部CAD的ROC曲线(AUC＝0.53；阈值＝0.51；敏感性＝0.39；特异性＝0.72；准确度＝0.55)的图。

图18为示出全部CAD的Morise评分的ROC曲线(AUC＝0.64；阈值＝12；敏感性＝0.73；特异性＝0.48；准确度＝0.61)的图。

图19为提供全部CAD的临床模型的11个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图20为示出全部CAD的临床模型的ROC曲线(AUC＝0.82；阈值＝0.49；敏感性＝0.76；特异性＝0.74；准确度＝0.75)的图。

图21为提供全部CAD的代谢组学模型的16个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图22为示出全部CAD的代谢组学模型的ROC曲线(AUC＝0.85；阈值＝0.48；敏感性＝0.9；特异性＝0.65；准确度＝0.78)的图。

图23为提供全部CAD的临床-代谢组学模型的12个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图24为示出全部CAD的临床-代谢组学模型的ROC曲线(AUC＝0.83；阈值＝0.56；敏感性＝0.69；特异性＝0.81；准确度＝0.75)的图。

图25为提供全部CAD的脂质组学模型的13个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图26为示出全部CAD的脂质组学模型的ROC曲线(AUC＝0.79；阈值＝0.48；敏感性＝0.82；特异性＝0.64；准确度＝0.73)的图。

图27为提供全部CAD的临床脂质组学的11个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图28为示出全部CAD的临床-脂质组学模型的ROC曲线(AUC＝0.8；阈值＝0.54；敏感性＝0.64；特异性＝0.84；准确度＝0.74)的图。

图29为提供全部CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的12个临床变量的部分依赖图表的一系列图。

图30为示出全部CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的ROC曲线(AUC＝0.82；阈值＝0.46；敏感性＝0.84；特异性＝0.63；准确度＝0.74)的图。

图31为描述了疑似具有动脉粥样硬化性CAD的患者的诊断算法的示意图。

图32为描述了用于评估对象具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的诊断算法的示意图。

图33为示出临床组的Diamond Forrester评分的盒须图的图。

图34为示出Diamond Forrester评分和A^nCAD的ROC曲线(AUC＝0.45；阈值＝0.00；敏感性＝1.00；特异性＝0.00；准确度＝0.62)的图。

图35为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.82；阈值＝0.45；敏感性＝0.85；特异性＝0.61；准确度＝0.76)的图。

图36为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.80；阈值＝0.45；敏感性＝0.85；特异性＝0.64；准确度＝0.77)的图。

图37为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.81；阈值＝0.48；敏感性＝0.87；特异性＝0.58；准确度＝0.76)的图。

图38为示出Diamond Forrester评分和A^aCAD的ROC曲线(AUC＝0.45；阈值＝0.00；敏感性＝1.00；特异性＝0.00；准确度＝0.64)的图。

图39为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.83；阈值＝0.40；敏感性＝0.93；特异性＝0.50；准确度＝0.78)的图。

图40为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.80.；阈值＝0.47；敏感性＝0.85；特异性＝0.63；准确度＝0.77)的图。

图41为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.82；阈值＝0.56；敏感性＝0.83；特异性＝0.64；准确度＝0.76)的图。

图42为示出Diamond Forrester评分和S^nCAD的ROC曲线(AUC＝0.45；阈值＝0.94；敏感性＝0.03；特异性＝1.00；准确度＝0.78)的图。

图43为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.73；阈值＝0.45；敏感性＝0.21；特异性＝0.96；准确度＝0.79)的图。

图44为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.76；阈值＝0.42；敏感性＝0.30；特异性＝0.96；准确度＝0.81)的图。

图45为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.67；阈值＝0.90；敏感性＝0.04；特异性＝1.0；准确度＝0.78)的图。

图46为示出Diamond Forrester评分和S^aCAD的ROC曲线(AUC＝0.45；阈值＝0.94；敏感性＝0.03；特异性＝1.00；准确度＝0.75)的图。

图47为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.78；阈值＝0.51；敏感性＝0.34；特异性＝0.94；准确度＝0.78)的图。

图48为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.78；阈值＝0.54；敏感性＝0.23；特异性＝0.97；准确度＝0.77)的图。

图49为示出代谢组学模型

的ROC曲线(AUC＝0.74；阈值＝0.74；敏感性＝0.22；特异性＝0.96；准确度＝0.77)的图。

具体实施方式

动脉粥样硬化斑块的发生和发展是动脉粥样硬化性CAD和CHD的临床表现的根本原因。动脉粥样硬化的第一步和“必要条件”，是致动脉粥样硬化的脂蛋白颗粒的保留，然后是代偿性、继发性炎症反应。单核细胞和巨噬细胞对冠状动脉壁的浸润形成进一步触发动脉粥样硬化进展的反馈回路。冠状动脉壁中的巨噬细胞启动致动脉粥样硬化的脂蛋白颗粒的吞噬作用，致动脉粥样硬化的脂质和脂蛋白的不受控摄取导致巨噬细胞的凋亡和坏死，产生富脂质坏死核心(LRNC)。LRNC的这种状态最易破裂和侵蚀。动脉粥样硬化过程的后续阶段涉及通过钙化和纤维化愈合。

由此可见，基于血液的生物标志物在两个层面提供对动脉粥样硬化过程的洞察。首先，基于血液的生物标志物可以评估导致动脉粥样硬化发展的致病因素；第二，基于血液的生物标志物可以评估动脉粥样硬化过程中初始步骤的后果和反应。

与以上概述的生物范例不同，动脉粥样硬化性CAD的临床诊断根据基于群体的概率驱动的临床风险分级来预测(图31)。

所述临床诊断算法取决于基于临床风险和症状的风险分级。无症状患者通过整体风险评分来评估，所述整体风险评分例如Framingham风险评分或新近开发并引入的集中风险评估(Pooled Risk Estimator)。这些整体风险评分尝试估计一段时间内发生心血管事件的概率，但不是为诊断动脉粥样硬化性CAD设计的。

基于其症状疑似患有动脉粥样硬化性CAD的有症状的患者的临床评估，由风险评分例如Diamond-Forrester算法驱动。基于胸痛的年龄、性别和临床属性，Diamond-Forrester系统将患者分成三类之一，从而提供阻塞性CAD(obstructive CAD)的预试验概率(低[<15％]、中等[15-85％]或高[>85％])。在具有低CAD预试验概率的患者中，不建议进一步评估。最大的患者组是具有中等CAD预试验概率的患者。在这组中，建议进行心肌灌注成像(MPI)研究，从而评估任何潜在的管腔狭窄的血液动力学结果。虽然研究中发表的敏感性和特异性约为80％和80％，但MPI的实际准确度远低于此，特异性通常低于30％(ThomasGS,等人A Blood-Based Gene Expression Test for Obstructive Coronary ArteryDisease Tested in Symptomatic Nondiabetic Patients Referred for MyocardialPerfusion Imaging The COMPASS Study.Circulation:Cardiovascular Genetics 2013；6(2):154-162.)。具有高CAD预试验概率的患者接受侵入性冠状动脉血管造影从而定义管腔狭窄的程度和范围，并适当地进一步接受经皮或外科血管再形成。

重要的是，在此范例中，没有一种诊断方法设计成诊断动脉粥样硬化性CAD的根本原因，即动脉粥样硬化斑块本身。然而，在使用特定表型分析工具检测动脉粥样硬化斑块本身的无偏差、无假设的发现研究(discovery study)的情况下，现可发现冠状动脉粥样硬化性疾病和动脉粥样硬化斑块本身的基于血液的生物标志物特征。

本文公开的基于血液的生物标志物允许检测动脉粥样硬化斑块本身，允许疾病的早期诊断，和提供显著改变下游诊断评估和治疗过程的机会。

本文识别的基于血液的生物标志物设计成通过直接检测动脉粥样硬化斑块来检测动脉粥样硬化性CAD，和校准为具有高阴性预测值。有动脉粥样硬化性CAD风险的无症状对象，或疑似具有动脉粥样硬化性CAD的有症状的患者是生物标志物试验的候选者。如果试验为阴性，其排除动脉粥样硬化性CAD的存在，并且无必要进一步试验。如果试验为阳性，其表示存在动脉粥样硬化斑块和存在动脉粥样硬化性CAD，患者可接受心血管CT或其他非侵入性心血管诊断试验从而确认结果。如果心血管CT或其他非侵入性心血管诊断试验检测到非阻塞性斑块和非阻塞性CAD，给所述患者开具药物治疗医嘱从而治疗导致斑块发展的因素，以阻止或逆转动脉粥样硬化性CAD的进一步进展。另一方面，如果心血管CT检查或其他非侵入性心血管诊断试验显示存在阻塞性动脉粥硬化斑块和阻塞性CAD，患者接受具有或不具有功能测试(functional testing)的侵入性冠状动脉血管造影，从而确定斑块是否导致血液动力学上显著的狭窄，并可适当地进行冠状动脉血管再形成。因此，在此范例中，血液生物标志物在确定患者管理方面起中心作用。值得注意的是，广泛公知美国所有侵入性冠状动脉造影中约39％显示无显著的冠状动脉疾病，另～20％具有非阻塞性CAD(Patel M,等人,Low Diagnostic Yield of Elective Coronary Angiography.N Engl JMed.2010Mar 11；362(10):886-95)。阴性或非阻塞性CT血管造影的比例甚至更高；因此，可排除动脉粥样硬化性CAD的存在的基于血液的生物标志物将避免非常大量的不必要的侵入性和CT冠状动脉血管造影，和其他非侵入性心血管诊断试验。

此前，在CVD的情况下已尝试了代谢组学方法，但未在动脉粥样硬化性CAD的情况下尝试。Cheng等人已识别与心血管疾病相关的支链氨基酸、其他疏水性氨基酸、色氨酸分解产物和核苷酸代谢物。(Cheng S,等人,Metabolite Profiling Identifies PathwaysAssociated With Metabolic Risk in Humans/Clinical Perspective.Circulation2012；125(18):2222-2231)。Bodi等人未评估动脉粥样硬化，而是使用心肌缺血作为结果变量从而识别代谢特征。(Bodi V,Sanchis J,Morales JM,Marrachelli VG,Nunez J,Forteza MJ等人Metabolomic Profile of Human Myocardial Ischemia by NuclearMagnetic Resonance Spectroscopy of Peripheral Blood Serum:A TranslationalStudy Based on Transient Coronary Occlusion Models.J Am Coll Cardiol 2012；59(18):1629-1641)

术语“减少”、“减少的”、“降低的”、“降低”或“下调的”在本文中都是一般性地用于意为统计学上显著量的减少。然而，为避免疑惑，“降低的”、“降低”、“减少的”或“减少”意为与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或减少高达并包括100％(即与参考样品相比的不存在水平)，或与参考水平相比10-100％之间的任何减少、或至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的减少，或与参考水平相比在1.0倍和10倍或更高之间的任何减少。

术语“增加的”、“增加”或“上调的”在本文中都是一般性地用于意为统计学上显著量的增加；为避免任何疑惑，术语“增加的”或“增加”意为与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或增加高达并包括100％或与参考水平相比10-100％之间的任何增加、或至少约0.5倍、或至少约1.0倍、或至少约1.2倍、或至少约1.5倍、或至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或与参考水平相比在1.0倍和10倍或更高之间的任何增加。

本发明涉及基于本文中称为生物标志物或分析物生物标志物的特定分析物的水平或存在用于表征(例如，临床评估、诊断、分类、预测、分析)动脉粥样硬化性CAD和或冠状动脉粥样硬化斑块的方法。本文使用的水平指的是样品(例如，血浆或血清样品)或对象中分析物的量或浓度。同时，存在指的是样品中存在或不存在可检测分析物。因此，水平是量的连续指标，同时存在是分析物的二进制指标。在一些情况下，存在可使用在其上生物标志物存在、在其下生物标志物不存在的阈值水平来确定。

本文中描述的分析物生物标志物特别有用于以非侵入性方式表征(例如，评价或评估)对象具有动脉粥样硬化性CAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块。

本发明涉及用于表征动脉粥样硬化相关的代谢失调的多种生物标志物的发现。因此，在一些方面，本发明提供包括测量从对象获得的生物样品中选择的该组分析物生物标志物中各分析物的水平的方法，其中一组包括多种分析物生物标志物。在所述多种(至少2种)中的生物标志物或代谢物的数量可为2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、或20以上，例如，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100以上。

本文描述的方法用于识别对象是否具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块。换言之，本文描述的方法用于测定对象具有动脉粥样硬化性CAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的概率，所述方法依靠从对象获得的该组分析物生物标志物的相对量的差异，其中所述概率如本文描述使用梯度提升算法或广义线性模型测定。

此外，本文描述的方法用于诊断对象是否具有动脉粥样硬化性CAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块。本文使用的诊断包括诊断和辅助诊断。因此，其他诊断标准可与所述方法的结果结合评估以做出诊断。

根据一些实施方案，所述方法包括测定一组分析物生物标志物中的各(即全部)分析物的量(即测定水平、测量量或测量水平)。在一些实施方案中，任何以下组可进一步包括分析对象的年龄和/或性别。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：缬氨酰亮氨酸、谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、尿酸盐(酯)、葡糖醛酸盐(酯)、岩藻糖、丁酰肉碱(C4)、甘露糖。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中的以下分析物的水平：缬氨酰亮氨酸、谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、尿酸盐(酯)、葡糖醛酸盐(酯)、岩藻糖、丁酰肉碱(C4)、甘露糖。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、硫酸邻甲酚、苏糖酸盐(酯)、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、硫酸邻甲酚、苏糖酸盐(酯)、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、甘氨酰苯丙氨酸、丝氨酰亮氨酸、岩藻糖。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中的以下分析物的水平：N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、甘氨酰苯丙氨酸、丝氨酰亮氨酸、岩藻糖。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、缬氨酰亮氨酸、甘露糖、葡糖醛酸盐(酯)、尿酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、12-HETE。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、缬氨酰亮氨酸、甘露糖、葡糖醛酸盐(酯)、尿酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、12-HETE。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：硫酸邻甲酚、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物、葡萄糖、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)、苏糖酸盐(酯)。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：硫酸邻甲酚、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物、葡萄糖、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)、苏糖酸盐(酯)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、12-HETE、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、12-HETE、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰苏氨酸、巴豆酰甘氨酸、甘油酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)、丙醇二酸盐(酯)(羟基丙二酸化)。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：N-乙酰苏氨酸、巴豆酰甘氨酸、甘油酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)、丙醇二酸盐(酯)(羟基丙二酸化)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰甘氨酸、3-乙基苯基硫酸盐(酯)。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：N-乙酰甘氨酸、3-乙基苯基硫酸盐(酯)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：血清素(5HT)、N-乙酰腐胺、亮氨酰亮氨酸、丙酰甘氨酸(C3)、胆酸盐(酯)、甘氨胆烯酸硫酸盐(酯)、天冬酰胺、3-乙基苯基硫酸盐(酯)。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：血清素(5HT)、N-乙酰腐胺、亮氨酰亮氨酸、丙酰甘氨酸(C3)、胆酸盐(酯)、甘氨胆烯酸硫酸盐(酯)、天冬酰胺、3-乙基苯基硫酸盐(酯)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、甘露糖、戊酰肉碱(C5)、1-亚油酰-GPE(18.2)、甘氨熊脱氧胆酸盐(酯)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、甘露糖、戊酰肉碱(C5)、1-亚油酰-GPE(18.2)、甘氨熊脱氧胆酸盐(酯)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：N-乙酰甘氨酸、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、3-乙基苯基硫酸盐(酯)、水杨酸盐(酯)。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：N-乙酰甘氨酸、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、3-乙基苯基硫酸盐(酯)、水杨酸盐(酯)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：天冬酰胺、牛磺酸、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、1-油酰甘油(18:1)、胆固醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、6-氧代哌啶-2-羧酸、丙酰甘氨酸(C3)。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：天冬酰胺、牛磺酸、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、1-油酰甘油(18:1)、胆固醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、6-氧代哌啶-2-羧酸、丙酰甘氨酸(C3)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：缬氨酰亮氨酸、异亮氨酰缬氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸、X-12212、葡糖醛酸盐(酯)、和谷氨酸盐(酯)。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：缬氨酰亮氨酸、异亮氨酰缬氨酸、谷氨酰胺-亮氨酸、X-12212、葡糖醛酸盐(酯)、和谷氨酸盐(酯)。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：葡萄糖、γ-谷氨酰转移酶、尿酸、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、脂蛋白(a)团、碱性磷酸酶和载脂蛋白B。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：葡萄糖、γ-谷氨酰转移酶、尿酸、低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、脂蛋白(a)团、碱性磷酸酶和载脂蛋白B。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：谷氨酸盐(酯)、X-16132、异亮氨酰丙氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、脂蛋白(a)团、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇、X-12212、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ ID NO:1)、谷氨酰胺亮氨酸、和苏氨酰亮氨酸。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：谷氨酸盐(酯)、X-16132、异亮氨酰丙氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、脂蛋白(a)团、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇、X-12212、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ ID NO:1)、谷氨酰胺亮氨酸、和苏氨酰亮氨酸。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：CER22.1、HexCER18:1、TG15:0、SM16:0、CER20:0、DHC20:1、和CER18:0。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：CER22.1、HexCER18:1、TG15:0、SM16:0、CER20:0、DHC20:1、和CER18:0。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：CER20:0、载脂蛋白B、SM16:0、脂蛋白(a)团、DHC20L1、碱性磷酸酶、和CER18:0。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：CER20:0、载脂蛋白B、SM16:0、脂蛋白(a)团、DHC20L1、碱性磷酸酶、和CER18:0。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：谷氨酸盐(酯)、X-16132、异亮氨酰丙氨酸、脂蛋白(a)团、X-12212、和谷氨酰胺亮氨酸。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：谷氨酸盐(酯)、X-16132、异亮氨酰丙氨酸、脂蛋白(a)团、X-12212、和谷氨酰胺-亮氨酸。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：oleic2、N-末端脑钠肽前体、脂蛋白(a)团、胰岛素、糖化血红蛋白A1C、西斯蒙滔托、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇、behenic2、脂联素、和γ-谷氨酰转移酶。因此，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：oleic2、N-末端脑钠肽前体、脂蛋白(a)团、胰岛素、糖化血红蛋白A1C、西斯蒙滔托、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇、behenic2、脂联素、和γ-谷氨酰转移酶。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：异亮氨酰丙氨酸、葡糖醛酸盐(酯)、甘氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、甘露糖、X-21452、1-油酰甘油磷酸甘油、X-21335、7-甲基黄嘌呤、X-12729、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、α-羟基异戊酰肉碱、2-氨基己二酸盐(酯)、X-18914、巴豆酰甘氨酸、和吡哆醛。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：异亮氨酰丙氨酸、葡糖醛酸盐(酯)、甘氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、甘露糖、X-21452、1-油酰甘油磷酸甘油、X-21335、7-甲基黄嘌呤、X-12729、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、α-羟基异戊酰肉碱、2-氨基己二酸盐(酯)、X-18914、巴豆酰甘氨酸、和吡哆醛。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：异亮氨酰丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、oleic2、X-21335、甲基黄嘌呤、氨基己二酸盐(酯)、甘露糖、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、花生四烯酰-GPE.20.4、和甘油三酯。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：异亮氨酰丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酰苯丙氨酸、oleic2、X-21335、甲基黄嘌呤、氨基己二酸盐(酯)、甘露糖、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、花生四烯酰-GPE.20.4、和甘油三酯。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：DHC18:0、DG18:1n9、总二酰甘油、TG20:3n9、CE20:4n6、CER18:1、DHC20:1、CE18:2n6、PL18:2n6、SM18:0、FA14:1n5、PL15:0、和CE16:0。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：DHC18:0、DG18:1n9、总二酰甘油、TG20:3n9、CE20:4n6、CER18:1、DHC20:1、CE18:2n6、PL18:2n6、SM18:0、FA14:1n5、PL15:0、和CE16:0。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：糖化血红蛋白A1C、总二酰甘油、西斯蒙他托、脂蛋白(a)团、TG20.3n9、oleic2、DHC18.1、N-末端脑钠肽前体、γ-谷氨酰转移酶、和CER18。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：糖化血红蛋白A1C、总二酰甘油、西斯蒙他托、脂蛋白(a)团、TG20.3n9、oleic2、DHC18.1、N-末端脑钠肽前体、γ-谷氨酰转移酶、和CER18。

在一些实施方案中，所述分析物选自由以下组成的组：异亮氨酰丙氨酸、甘氨酸、西斯蒙他托、脂蛋白(a)团、X-21452、异亮氨酰苯丙氨酸、糖化血红蛋白A1C、X-21335、X7-甲基黄嘌呤、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮和X-12729。相应地，在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量样品中以下分析物的水平：异亮氨酰丙氨酸、甘氨酸、西斯蒙他托、脂蛋白(a)团、X-21452、异亮氨酰苯丙氨酸、糖化血红蛋白A1C、X-21335、X7-甲基黄嘌呤、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮和X-12729。

因此，在代表性的实施方案中，本公开提供了一种用于评估对象具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括(a)从人类对象获得血浆或血清样品；(b)从一组分析物生物标志物中测定各分析物的量；(c)将生物样品中所述分析物的相对量与对照样品中所述分析物的相对量对比；以及(d)如果生物样品中所述分析物的相对量相对于对照样品中所述分析物的量增加或减少，确定对象具有冠状动脉粥样硬化性疾病或冠状动脉粥样硬化斑块的概率。

一方面，本发明提供一种用于评估对象具有冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或具有冠状动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括测量从对象获得的生物样品中选择的该组分析物生物标志物中各分析物的水平。在一些实施方案中，所述方法测量一组分析物生物标志物中一种或多种分析物，其中该组分析物生物标志物选自由以下组成的组：

(i)缬氨酰亮氨酸、谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、尿酸盐(酯)、葡糖醛酸盐(酯)、岩藻糖、丁酰肉碱(C4)、甘露糖；

(ii)N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、硫酸邻甲酚、苏糖酸盐(酯)、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物；

(iii)N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、甘氨酰苯丙氨酸、丝氨酰亮氨酸、岩藻糖；

(iv)谷氨酸盐(酯)、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、缬氨酰亮氨酸、甘露糖、葡糖醛酸盐(酯)、尿酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、12-HETE；

(v)硫酸邻甲酚、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物、葡萄糖、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)、苏糖酸盐(酯)；

(vi)N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、12-HETE、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))；

(vii)N-乙酰苏氨酸、巴豆酰甘氨酸、甘油酸盐(酯)、戊酰肉碱(C5)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)、丙醇二酸盐(酯)(羟基丙二酸化)；

(viii)N-乙酰甘氨酸、3-乙基苯基硫酸盐(酯)；

(viv)血清素(5HT)、N-乙酰腐胺、亮氨酰亮氨酸、丙酰甘氨酸(C3)、胆酸盐(酯)、甘氨胆烯酸硫酸盐(酯)、天冬酰胺、3-乙基苯基硫酸盐(酯)；

(x)N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、甘露糖、戊酰肉碱(C5)、1-亚油酰-GPE(18.2)、甘氨熊脱氧胆酸盐(酯)、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、水杨酸盐(酯)；

(xi)N-乙酰甘氨酸、苏糖酸盐(酯)、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、3-乙基苯基硫酸盐(酯)、水杨酸盐(酯)；

(xii)天冬酰胺、牛磺酸、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、1-油酰甘油(18:1)、胆固醇、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、6-氧代哌啶-2-羧酸、丙酰甘氨酸(C3)。

在一些实施方案中，任何组的分析将对象的年龄和/或性别考虑在内。

一方面，本公开提供一种用于评估对象具有冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或具有冠状动脉粥样硬化斑块的方法，所述方法包括测量从对象获得的生物样品中选择的该组分析物生物标志物中各分析物的水平。在一些实施方案中，所述方法测量一组分析物生物标志物中一种或多种分析物的水平，其中该组分析物生物标志物选自由以下组成的组：

(xiii)linoleic2(亚油酸)、脂蛋白(a)胆固醇、载脂蛋白B、碱性磷酸酶、脂蛋白(a)团、MHDM2、B-谷甾醇、菜油甾醇、脂蛋白(a)团、γ-谷氨酰转移酶、palmleic2(棕榈油酸)、葡萄糖、胰岛素原、胆固醇、鱼油、高敏C反应蛋白、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇、尿酸、低密度脂蛋白胆固醇、胰岛素、甘油三酯、和维生素D；

(xiv)1-肉豆蔻酰甘油(14:0)、3-磷酸甘油酯(G3P)、丝氨酰亮氨酸、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)、甘氨酸、可可碱、1-油酰甘油(18:1)、甘氨酰色氨酸、苏糖酸盐(酯)、1-油酰甘油磷酸甘油、胍基琥珀酸盐(酯)、苏氨酰亮氨酸、1-油酰-GPC(18:1)、组氨酰苯丙氨酸、巴豆酰甘氨酸、1-硬脂酰甘油磷酸甘油、羟基丁酰肉碱、色氨酰苯丙氨酸、2-氨基辛酸盐(酯)、咪唑乳酸盐(酯)、尿酸盐(酯)、2-花生四烯酰-GPE(20:4)、咪唑丙酸盐(酯)、缬氨酰甘氨酸、2-二十二碳六烯酰甘油磷酸乙醇胺、吲哚丙酸盐(酯)、缬氨酰异亮氨酸、2-羟基丁酸盐(酯)(AHB)、异丁酰甘氨酸(C4)、缬氨酰亮氨酸、2’-脱氧尿苷、异亮氨酰丙氨酸、X-12212、3 7-二甲基尿酸盐(酯)、异亮氨酰甘氨酸、X-12472、3-乙基苯基硫酸盐(酯)、异亮氨酰异亮氨酸、X-12524、3-羟基-2-乙基丙酸盐(酯)、异亮氨酰亮氨酸、X-12544、3-甲基-2-氧代丁酸盐(酯)、异亮氨酰苯丙氨酸、X-12824、3-甲基戊二酰肉碱-1、异亮氨酰缬氨酸、X-14056、3-甲基黄嘌呤、亮氨酰甘氨酸、X-14291、4-羟基苯乙酸盐(酯)、亮氨酰丝氨酸、X-15245、7-甲基尿酸盐(酯)、甘露糖、X-16129、7-甲基黄嘌呤、甲基吡喃型葡萄糖苷(α+β)、X-16132、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、吲哚-3-乙酸甲酯、X-17178、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ IDNO:1)、N2 N2-二甲基鸟苷、X-21289、α-谷氨酰酪氨酸、N4-乙酰胞苷、X-21335、α-羟基异戊酰肉碱、N-乙酰丙氨酸、X-21365、α-酮丁酸盐(酯)、N-乙酰-β-丙氨酸、X-21452、α-酮戊二酸盐(酯)、N-乙酰腐胺、X-21626、天冬酰胺、N-乙酰苏氨酸、X-21662、肉碱、N-乙酰缬氨酸、黄嘌呤、1-肉豆蔻酰甘油(14:0)、3-磷酸甘油酯(G3P)、丝氨酰亮氨酸、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)、甘氨酸、可可碱、1-油酰甘油(18:1)、甘氨酰色氨酸、苏糖酸盐(酯)、1-油酰甘油磷酸甘油、胍基琥珀酸盐(酯)、苏氨酰亮氨酸、1-油酰-GPC(18:1)、组氨酰苯丙氨酸、巴豆酰甘氨酸、1-硬脂酰甘油磷酸甘油、羟基丁酰肉碱、色氨酰苯丙氨酸、2-氨基辛酸盐(酯)、咪唑、乳酸盐(酯)、和尿酸盐(酯)；

(xv)CE16:1n7、DG16:0、DHC20:1、HexCER16:0、SM16:0、CE18:2n6、DG18:0、DHC24:0、HexCER18:1、SM20:1、CE20:4n6、DG18:1n9、DHC24:1、LacCER16:0、TG15:0、CER18:0、DG20:3n9、FA18:3n6、PL15:0、TG16:0、CER20:0、DHC18:0、FA20:3n6、PLdm16:0、总三酰甘油、CER22:1、DHC18:1、HexCER14:0、和PLdm18:1n9；

(xvi)糖化血红蛋白A1C、脂蛋白(a)团、nervonic2(神经酸)、B-谷甾醇、脂联素、甘油三酯、总Ω6(Ω6total)、behenic2、菜油甾醇、N-末端脑钠肽前体、oleic2、链甾醇、palmleic2、西斯蒙他托、γ-谷氨酰转移酶、胰岛素原、葡萄糖、小而致密的低密度脂蛋白胆固醇、transpalm2(反式棕榈油酸)、高密度脂蛋白胆固醇、尿酸、高密度脂蛋白级分3、胰岛素、维生素D、linoleic2、脂蛋白(a)胆固醇、和MHDM2；

(xvii)1-3-二甲基尿酸盐(酯)、3-磷酸甘油酯(G3P)、焦谷氨酰谷氨酰胺、1 7-二甲基尿酸盐(酯)、甘氨酸、焦谷氨酰甘氨酸、12-HETE、甘氨酰苯丙氨酸、丙酮酸盐(酯)、1-亚油酰-GPE(18:2)、甘氨酰色氨酸、S-腺苷高半胱氨酸(SAH)、1-甲基尿酸盐(酯)、胍基琥珀酸盐(酯)、水杨酸盐(酯)、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)、己酰肉碱(C6)、丝氨酰亮氨酸、1-油酰甘油(18:1)、组氨酰苯丙氨酸、琥珀酰肉碱(C4)、1-油酰甘油磷酸甘油、高水苏碱、苏糖酸盐(酯)、2-氨基己二酸盐(酯)、羟基丁酰肉碱、苏氨酰亮氨酸、2-氨基丁酸盐(酯)、咪唑丙酸盐(酯)、硫酸麝香草酚、2-氨基辛酸盐(酯)、吲哚丙酸盐(酯)、巴豆酰甘氨酸、2-花生四烯酰-GPE(20:4)、异丁酰甘氨酸(C4)、色氨酰甘氨酸、2-二十二碳六烯酰甘油磷酸乙醇胺、异亮氨酰丙氨酸、色氨酰苯丙氨酸、2-羟基丁酸盐(酯)(AHB)、异亮氨酰甘氨酸、酪氨酰谷氨酰胺、2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))、异亮氨酰异亮氨酸、尿酸盐(酯)、2-亚油酰-GPE(18:2)、异亮氨酰亮氨酸、戊酰肉碱(C5)、2’-脱氧尿苷、异亮氨酰苯丙氨酸、缬氨酰甘氨酸、3-乙基苯基硫酸盐(酯)、异戊酰甘氨酸、缬氨酰异亮氨酸、3-羟基异丁酸盐(酯)、犬尿氨酸、缬氨酰亮氨酸、3-甲基-2-氧代丁酸盐(酯)、亮氨酰天冬氨酸、缬氨酰缬氨酸、3-甲基戊二酰肉碱-1、亮氨酰甘氨酸、X-11429、3-甲基戊二酰肉碱-2、亮氨酰丝氨酸、X-11444、3-甲基黄嘌呤、赖氨酰亮氨酸、X-11787、4-羟基苯乙酸盐(酯)、甘露糖、X-11945、5α-雄甾烷-3β17β-二醇单硫酸盐(酯)2、甲基吡喃型葡萄糖苷(α+β)、X-12212、7-甲基尿酸盐(酯)、吲哚-3-乙酸甲酯、X-12472、7-甲基黄嘌呤、N2 N2-二甲基鸟苷、X-12729、乙酰肉碱(C2)、N4-乙酰胞苷、X-12824、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、N6-氨甲酰苏氨酰基腺苷、X-14056、ADSGEGDFXAEGGGVR、N-乙酰丙氨酸、X-15245、α-谷氨酰酪氨酸、N-乙酰甘氨酸、X-15492、α-羟基异戊酰肉碱、N-乙酰异亮氨酸、X-16129、α-酮丁酸盐(酯)、N-乙酰神经氨酸、X-16132、α-酮戊二酸盐(酯)、N-乙酰苏氨酸、X-17178、β-生育酚、N-乙酰缬氨酸、X-17690、丁酰肉碱(C4)、N-甲基脯氨酸、X-18914、肉碱、辛酰肉碱(C8)、X-18922、半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物、油酸乙醇酰胺、X-19438、胞苷、O-磺基-L-酪氨酸、X-21289、岩藻糖、苯丙氨酰天冬氨酸、X-21335、γ-谷氨酰异亮氨酸、脯氨酰苯丙氨酸、X-21365、γ-谷氨酰缬氨酸、丙酰肉碱(C3)、X-21367、葡萄糖、丙酰甘氨酸(C3)、X-21452、葡糖醛酸盐(酯)、假尿苷、X-21471、谷氨酸盐(酯)、吡哆醛、X-21626、谷氨酰胺-亮氨酸、吡哆酸盐(酯)、和黄嘌呤；和

(xviii)CE16:0、DG18:0、DHC18:1、DHC26:1、PL24:0、CE16:1n7、DG18:1n9、DHC20:0、FA14:1n5、SM18:0、CE18:1n9、DG20:0、DHC20:1、PL15:0、TG15:0、CE18:2n6、DG20:2n6、DHC22:1、PL18:2n6、TG20:3n9、CE20:4n6、DG20:3n9、DHC24:1、PL20:3n9、总二酰甘油、CER18:0、DHC18:0、DHC26:0、PL20:4n6、总三酰甘油、和CER18:1。

本文使用的术语“测定各分析物的量”指的是测定本文所指的样品包括的至少一种代谢物的至少一个特性特征(characteristic feature)。依照本发明的特性特征是表征代谢物的物理和/或化学性质(包括生物化学性质)的特征。这些性质包括例如分子量、粘度、密度、电荷、自旋、光学活性、元素组成、化学结构、与其他化合物反应的能力、在生物读出系统(biological read out system)中引发反应的能力(例如，诱导报告基因(reportergene))等。所述性质的值可以用作特性特征，并可通过本领域熟知的技术来测定。此外，所述特性特征可以是通过标准操作例如数学计算如乘法、除法、梯度提升、广义线性建模或对数微积分从代谢物的物理和/或化学性质的值得出的任何特征。更优选地，所述至少一个特征特征允许所述至少一种代谢物的测定和/或化学识别。

生物样品包括的分析物可以依照本发明定量地或定性地测定。对于定性测定，代谢物的存在或不存在通过合适的技术来测定。此外，定性测定可优选地包括测定代谢物的化学结构或组成。对于定量测定，测定生物样品中存在的一种(或多种)分析物的精确量或测定一种(或多种)分析物的相对量，优选地基于本文以上所指的为特性特征测定的值。在不可或不应测定代谢物的精确量的情况下可测定相对量。在所述情况下，可测定分析物存在的量是否相对于以第二量包括所述分析物的第二样品增加或减少。因此，定量分析一种(或多种)分析物也包括有时称为代谢物的半定量分析。

通常，所述分析物的水平通过测量体液(临床样品)例如血液、血清、血浆或尿液中的代谢物水平来测定。所述水平可通过例如质谱(MS)、ELISA、免疫分析、酶分析、分光光度测量、比色法、荧光测定、细菌分析、化合物分离技术、或测定分析物存在和/或量的其他公知技术来测定。

化合物分离技术得到样品包括的分析物的时间分辨性分离(time resolvedseparation)。可用的分离的合适技术包括例如所有色谱分离技术如液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、薄层色谱、尺寸排阻或亲和色谱。这些技术在本领域中是熟知的，并且可由本领域技术人员应用。在一些实施方案中，利用LC和/或GC色谱技术的方法包括例如气相色谱质谱(GC-MS)、液相色谱质谱(LC-MS)、液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)、直接输注质谱或傅立叶变换离子-回旋-共振质谱(FT-ICR-MS)、毛细管电泳质谱(CE-MS)、高效液相色谱联用质谱(liquid chromatography coupled mass spectrometry，HPLC-MS)、四极质谱、任何连续联合质谱例如MS-MS或MS-MS-MS、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、热解质谱(Py-MS)、离子迁移质谱或飞行时间质谱(TOF)。在一些实施方案中，LC-MS和/或GC-MS。作为质谱技术的替代或补充，以下技术可用于化合物测定：核磁共振(NMR)、磁共振成像(MRI)、傅立叶变换红外分析(FT-IR)、紫外(UV)光谱、折光指数(RI)、荧光检测、放射化学检测、电化学检测、光散射(LS)、色散型拉曼光谱或火焰离子化检测(FID)。这些技术是本领域技术人员熟知的，和可以毫不费力地应用。在一些实施方案中，本文公开的方法应任选地由自动化辅助。例如，样品处理或预处理可以通过机器人自动化。数据处理和比较可由合适的计算机程序和数据库辅助。本文描述的自动化允许在高通量方法中使用本发明的方法。

“测定”方法包括例如，将一种(或多种)临床样品送至商业实验室测量或使用商购可得的分析试剂盒。商购可得的分析试剂盒在本领域中公知。例如，Quest Diagnostics、Sigma Aldrich、CATACHEM Inc.、Eton Bioscience Inc.、和Bio Vision ResearchProducts是这种分析的示例供应商。示例试剂盒和供应商对技术人员是显而易见的。

在一些情况下，本文公开的方法涉及与参考比较水平或存在。所述参考可采取多种形式。在一些情况下，所述参考包括多种分析物(例如，多种分析物中的各分析物)的预定值。所述预定值可采取多种形式。其可为从已知具有动脉粥样硬化性CAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象(例如，有症状的对象)或者从已知不患有动脉粥样硬化性CAD或已知不患有冠状动脉粥样硬化斑块的对象(例如，无症状对象)获得的分析物的水平或存在。其可为从不具有冠状动脉疾病的既往病史的对象获得的分析物的水平或存在。其可为同一对象中，例如，在不同时间点的水平或存在。表示分析物的一个(或多个)水平的预定值在本文中称为预定水平。预定水平可为单一的临界值(cut-off value)，例如中位数或平均值。其可为临界值(或阈值)的范围，例如置信区间。其可根据比较组建立，例如当一个定义组中的风险比另一个定义组中的风险高或低一倍(例如，约2倍、4倍、8倍、16倍以上)时。其可为范围，例如，对象(例如，对照对象)的群体均等地(或不均等地)分成组，例如低风险组、中等风险组和高风险组，或分成四等分，最低四分位为具有最低风险的对象且最高四分位为具有最高风险的对象，或分成n等分(即n个规则分隔的间隔)，n等分中最低为具有最低风险的对象且n等分中最高为具有最高风险的对象。此外，所述参考可为计算参考，更优选包括待调查对象的个体群体的分析物的相对或绝对量的平均值或中位数。群体的所述个体的分析物的绝对或相对量可如本文他处指明地测定。如何计算合适的参考值，优选地，平均值或中位数，在本领域中是熟知的。前文所指的对象群体应包括多个对象，优选地，至少5、10、50、100、1,000个对象。应理解待通过本发明的方法诊断的对象和所述多个对象中的对象是同一物种。

和预定值相关的对象通常称为对照对象(或对照)。对照对象不具有动脉粥样硬化或动脉粥样硬化性CAD。在一些情况下可需要对照对象是有症状的对象，在另一些情况下可需要对照对象是无症状对象。因此，在一些情况下对象中分析物的水平大于或等于对照对象中所述分析物的水平指示临床状态(例如，指示CAD诊断)。在其他情况下对象中分析物的水平小于或等于对照对象中所述分析物的水平指示临床状态。更通常地，分析物的预定组的升高或降低的水平的组合指示临床状态。大于的量和小于的量通常是例如使用公开的方法便于将对象与对照对象区分的足够的量值。通常，足够将对象与对照对象区分的所述大于或所述小于是统计学上显著的大于或统计学上显著的小于。在对象中分析物的水平等于对照对象中的代谢物的水平指示临床状态的情况下，所述“等于”指的是约等于(例如，无统计学差异)。

所述预定值可取决于选择的对象(例如，人类对象)的特定群体。例如，明显健康的群体将比具有或可能具有动脉粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的对象的群体有不同的“正常”范围的代谢物。相应地，选择的预定值可涵盖对象(例如，人类对象)落入的类别(例如，健康、有风险、患病、年龄、性别等)。合适的范围和类别可由本领域普通技术人员在不超过常规的实验下选择。在一些情况下生物标志物的预定值是健康对象(人类对象)(例如，没有CAD的明显标志或症状的人类对象)群体的平均值。当然，所述预定值将取决于选择的特定分析物(生物标志物)，甚至取决于对象所处的群体的特性。在表征概率或风险时，可建立很多预定值。

在一些实施方案中，水平本身可为反映两个状态间水平的比较的相对水平。反映两个状态(例如，健康和患病)间比较的相对水平(例如，比率、差值、对数差、百分比变化等)可称为Δ值。在一些情况下，使用相对水平是有益的，因为在一定程度上，所述相对水平排除了测量相关的变化(例如，实验室人员、实验室、测量装置、试剂批次/制备、分析试剂盒等)。然而，本发明不限于此。

分析物水平和/或参考水平可以存储在合适的数据存储介质(例如数据库)中，因此也可用于未来的诊断。这也允许有效诊断疾病的流行率，因为(未来)一旦确认从中获得了相应参考样品的对象具有CAD或冠状动脉粥样硬化斑块，合适的参考结果可在数据库中识别。本文使用的“数据库”包括在合适的存储介质上收集的数据(例如，分析物和/或参考水平信息和/或患者信息)。此外，数据库可进一步包括数据库管理系统。数据库管理系统优选基于网络的、层次的(hierarchical)或面向对象的数据库管理系统。更优选地，数据库配置为分布式(联合式)系统，例如，客户端-服务器系统。更优选地，数据库构造为允许搜索算法将试验数据集与通过数据收集包括的数据集比较。具体地，通过使用这样的算法，可在数据库中搜索指示动态粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的相似或相同的数据集(例如，查询搜索)。因此，如果在数据收集中可识别相同或相似的数据集，所述试验数据集将与动脉粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块相关。因此，从数据收集获得的信息可用于诊断CAD或基于从对象获得的试验数据集。更优选地，数据收集包括由上述组中任一个所包括的所有分析物的特性值。

在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括调整对象的临床记录从而识别对象具有或不具有冠状动脉粥样硬化性疾病、或具有或不具有冠状动脉粥样硬化斑块。所述临床记录可存储于任何合适的数据存储介质(例如，计算机可读介质)。

本发明还可提供评估对象中分析物生物标志物的试剂盒。本发明的试剂盒可采取多种形式。通常，所述试剂盒包括适用于测定样品中多种分析物生物标志物(例如，本文公开的那些)的水平的试剂。任选地，所述试剂盒可含有一种或多种对照样品。通常，对象中生物标志物的水平和对照样品中生物标志物的水平的对比指示临床状态(例如，具有动脉粥样硬化性CAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的诊断或概率)。另外，在一些情况下，所述试剂盒包括提供参考(例如，预定值)的书面信息(标记)，其中对象中生物标志物水平与参考(预定值)的对比指示临床状态。在一些情况下，所述试剂盒包括用于与参考(例如，预测模型)比较生物标志物水平或存在的软件。通常所述软件以计算机可读格式例如光盘提供，但所述软件也可从互联网下载。然而，所述试剂盒不限于此，其他变化对本领域普通技术人员是显而易见的。

基于和CAD相关的某些分析物的存在或水平，本方法也可用于为对象选择治疗和/或确定治疗计划。在一些实施方案中，使用本文公开的方法，医疗保健提供者(例如，医师)识别对象具有或有风险具有动脉粥样硬化性CAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块，基于此认识，所述医疗保健提供者为所述对象确定合适的管理方案。在一些实施方案中，使用本文公开的方法，基于从对象获得的临床样品中的某些分析物的存在或水平，和/或基于从对象获得的临床样品的分类，医疗保健提供者(例如，医师)诊断对象具有动脉粥样硬化性CAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块。通过此诊断，所述医疗保健提供者为对象确定合适的治疗或治疗计划。在一些实施方案中，所述方法进一步包括向对象施用所述治疗。

在一些实施方案中，本发明涉及识别使用特定药剂、制剂和/或给药方式可能成功治疗的对象。其他实施方案包括使用本发明的代谢组学分析方法评估药物的效力。在一些实施方案中，所述代谢组学分析方法用于识别使用特定药物或治疗方案可能成功治疗的对象。例如，在药物或治疗的研究(例如临床研究)中，具有CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的对象可对所述药物或治疗反应良好，而其他可能不能。治疗效果的不同与很多变量有关，例如对象之间的基因变异。在一些实施方案中，基于本文公开的代谢组学分析方法，将群体中的对象分层。在一些实施方案中，基于各种流行病学和/或临床因素(例如，对具体治疗的反应)进一步评估所得层次。在一些实施方案中，基于代谢分析识别的层次反映了对某些治疗可预测地反应(例如，具有预定反应)的对象亚群。在进一步的实施方案中，样品从已施用所试验的药物并对治疗具有预定反应的对象获得。在一些情况下，可从这些样品的全部或部分分析物中建立参考，从而例如提供参考代谢分析。待测样品然后可对照参考评估(例如，使用预测模型)，并根据治疗是否成功或不成功来分类。试验治疗(例如，化合物、药物和生活方式的变化)的公司和/或个人可以辨别关于治疗对其更加有用的CAD类型或亚型的更精确的信息。该信息还有助于医疗保健提供者确定给对象的最佳治疗计划。

在一些实施方案中，动脉粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的治疗是向对象施用包括有效量的治疗剂的组合物和/或指导对象采取至少一种治疗性生活方式改变(例如，饮食或运动的改变)。适合治疗CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的治疗性化合物是本领域熟知的且本文公开了一些。非限制性的实例包括他汀、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物、Ω-3-脂肪酸化合物、胆汁酸螯合剂、PCSK9拮抗剂、抗血小板剂和阿司匹林。改善心血管健康的合适的生活方式改变在本领域也是熟知的。非限制性的实例包括增加身体活动、限制热量摄取、规划营养饮食和减轻体重。然而，本发明不限于此，其他合适的治疗对本领域普通技术人员是显而易见的。

当施用治疗剂或其他治疗，其是以治疗CAD或降低未来CAD或CAD事件的概率(或风险)的有效量施用的。有效量是足以提供医学上需要的结果的治疗剂的剂量。有效量随所治疗的特定病症、治疗对象的年龄和身体状况、病症的严重性、治疗的持续时间、并发治疗(如果存在)的性质、具体给药路径等在医疗保健从业者的知识和专业技术的范围内的因素变化。例如，有效量可取决于对象具有指示动脉粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的某些分析物(例如，本文所述分析物)的异常水平的程度。应理解，本发明的治疗剂用于治疗和/或预防动脉粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块。因此，在一些情况下，所述治疗剂可预防性地用于有风险发展动脉粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的人类对象。因此，在一些情况下，有效量是可降低其风险、减缓或可能完全预防动脉粥样硬化性CAD或冠状动脉粥样硬化斑块的发展的量。应认识到，当所述治疗剂用于急性情况时，所述治疗剂用于预防通常来自这种不良事件的一种或多种医学上不期望的结果。选择合适治疗和其合适剂量的方法对本领域普通技术人员是显而易见的。

本发明进一步提供将分析结果或诊断或其两者传达给例如技术人员、医师或患者。在一些实施方案中，计算机用于将分析结果或诊断或其两者传达给相关方例如医师和其患者。在一些情况下，所述方法进一步包括提供将患者状态(即具有或不具有ASCAD或存在或不存在冠状动脉粥样硬化斑块)以报告来传达。因此，在一些情况下，本发明方法(subject methods)可进一步包括生成或输出提供本发明方法的结果的报告的步骤，所述报告可以以电子媒体的形式(例如，在计算机显示器上的电子显示)、或以有形媒体的形式(例如，打印在纸上或其他有形媒体上的报告)提供。可提供任何形式的报告，例如本领域内所公知的。在本发明的一些实施方案中，在获得基于在表30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50中的任何生物标志物在试验对象中存在或不存在的诊断后，将该诊断尽快传达给所述对象。所述诊断可以由对象的治疗医师传达给所述对象。可选地，所述诊断可通过电子邮件发送给试验对象，或通过电话传达给所述对象。所述诊断可以以报告的形式发送给试验对象。可使用计算机通过电子邮件或电话来传达所述诊断。在一些实施方案中，含有诊断性试验结果的消息可使用电信领域技术人员熟悉的计算机硬件和软件的组合自动生成和传递给对象。

本文描述的“报告”是包括提供涉及诊断评价、预后评价、治疗评价、监测评价等的关注的信息及其结果的报告元素的电子或有形文件。本发明报告可完全或部分电子生成。本发明报告至少包括对象评价，例如，对象是否有高概率地具有ASCAD或具有冠状动脉粥样硬化斑块的诊断；或预后评价，例如，预测患者对治疗的反应性；和/或应遵循的建议疗程。本发明报告可进一步包括以下一项或多项：1)关于试验设施的信息；2)服务提供者信息；3)对象数据；4)样品数据；5)评价报告，其可包括各种信息，包括：a)试验数据，其中试验数据可包括i)一种或多种生物标志物的生物标志物水平；和/或ii)本文描述的一个或多个生物标志物组的生物标志物特征。

所述报告可包括关于试验设施的信息，所述信息有关在其中采集样品和/或进行数据生成的医院、诊所或实验室。该信息可包括一种或多种细节，涉及例如试验设施的名称和位置、进行检测和/或录入输入数据的实验室技术人员的身份、该监测进行和/或分析的日期和时间、样品和/或结果数据保存的位置、分析中使用的试剂(例如试剂盒等)的批号等。有该信息的报告字段通常可用使用者提供的信息填充。

所述报告可包括关于服务提供者的信息，所述服务提供者可位于使用者所处的医疗保健机构的外部、或在所述医疗保健机构内。所述信息的实例可包括服务提供者的名称和位置、审查者的名称，必要和需要时包括进行样品采集和/或数据生成的个体名称。有所述信息的报告字段通常可用使用者输入的数据填充，所述使用者输入的数据可选自预脚本化(pre-scripted)的选项(例如，使用下拉菜单)。所述报告中其他服务提供者信息可包括关于结果和/或关于解释性报告的技术信息的联系信息。

所述报告可包括对象数据部分，所述对象数据部分包括对象医疗历史和管理性对象数据(即，对诊断、预后或治疗评价非必需的数据)例如识别对象的信息(例如，姓名、对象出生日期(DOB)、性别、邮寄和/或居住地址、病历号(MRN)、在医疗保健机构的房间和/或床号、保险信息等)、对象医师或下达敏感性预测指示的其他医疗专业人员的姓名，和如果与指示医师(ordering physician)不同的负责对象护理的医务人员(staff physician)的姓名(例如初级保健医师)。

所述报告可包括样品数据部分，所述样品数据部分可提供关于分析的生物样品的信息，例如从对象获得的生物样品源(例如，血液如全血、分级的血液、血浆、血清等)、样品如何处理(例如存储温度、制备步骤)和收集的日期和时间。有所述信息的报告字段通常可用使用者输入的数据填充，有些由使用者输入的数据可以以预脚本化的选项提供(例如，使用下拉菜单)。

也容易理解，所述报告可包括其他元素或改进的元素。例如，在电子部分，所述报告可包含指向提供关于所述报告的选择的元素的更多具体信息的内部或外部数据库的超链接。例如，所述报告的患者数据元素可包括指向电子患者记录或访问该患者记录的地址的超链接，所述患者记录保存在机密数据库中。该后一实施方案可在医院内系统或诊所内环境中有吸引力。以电子格式时，报告记录在例如计算机存储器、zip驱动器、CD、DVD、闪存驱动器等中的合适的物理介质上，例如计算机可读介质。

容易理解所述报告可包括全部或一些以上元素，前提条件是所述报告通常至少包括足以提供使用者要求的分析(例如，诊断、预后或对疗法反应的预测)的元素。

本文描述的方法可用于在临床试验中从患者收集的样品和与患者结果结合使用的试验结果从而确定患者的亚组(subgroup)是否比全组或其他亚组更可能或更小可能对新药物显示反应。另外，所述方法可用于从临床数据中识别可从治疗中获益的患者子集。此外，如果试验结果显示患者对医学治疗反应的较高概率，更可能将患者包括在临床试验中，如果试验结果显示患者对医学治疗反应的较低概率，更小可能将患者包括在临床试验中。

本文描述的方法可单独使用或与本领域公知的用于患者分层的其他临床方法组合使用从而提供诊断、预后或对疗法的反应的预测。例如，可将用于诊断ASCAD的本领域公知的临床参数引入普通技术人员的分析从而使用本发明方法得到卵巢癌评价。

实施例

本发明进一步在以下实施例中描述，所述实施例不限制在权利要求中描述的本发明的范围。

Genetic Loci and the Burden of Atherosclerotic Lesions研究(GLOBAL；NCT01738828)是一项国际多中心前瞻性研究，其招募接受冠状动脉CT血管造影的7526个患者(其中约一半是动脉粥样硬化性CAD病例；另一半无动脉粥样硬化性CAD)，用于在总共48个临床地点评价疑似冠状动脉疾病(CAD)。此前的CAD基因和基因组研究已使用CAD或MI(心肌梗塞)的患者历史或侵入性冠状动脉血管造影从而确定病例/对照状态。在GLOBAL研究中，利用心血管CT，包括也称为冠状动脉钙(CAC)评分的非造影增强(non-contrast-enhanced)冠状动脉计算机断层扫描(CT)，其次包括造影增强CT造影(CTA)。该成像技术用于检测冠状动脉斑块的敏感性增加已显示允许将对照重分类为病例(主办者(sponsor)自己的数据)。

以下实施例描述了由总共26个临床地点的1096个患者的代谢组学数据组成的试点(pilot)GLOBAL的数据的统计分析。748个患者的子集组成了发现集(Discovery Set)；另348个参与者组成了验证集(Validation Set)。GLOBAL试点发现组的目标是在使用先进的基于心脏CT的成像进行表型分析的患者中评价动脉粥样硬化的强生物标志物相关的初步检测。

提供CTA用于可能的CAD的评价的患者识别为潜在的研究候选人，并根据研究的纳入和排除标准筛选资格。评价对象的心血管疾病风险因素，包括性别、年龄、高血压、高脂血症、糖尿病和吸烟，以及一些其他条件，对象签署了合适的制度审查委员会(InstitutionalReview Board)批准的知情同意书。一般纳入标准如下：(1)年龄18-90；(2)白人和非西班牙裔或非拉丁裔；和(3)接受冠状动脉CT血管造影从而评估CAD的存在。一般排除标准如下：(1)在之前30天内使用免疫抑制或免疫调节治疗，包括任何剂量的系统性皮质类固醇(除非在24小时内用于CT扫描的造影剂给药之前施用类固醇作为前药(pre-medication))；(2)之前一年内化疗；(3)之前2个月内大手术；(4)之前2个月内输血或血液制品；(5)依照医护的制度标准禁止冠状动脉CT血管造影的对象；(6)此前有冠状动脉血管再形成(经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植(CABG))的对象；(7)过去3个月内发生心房纤维性颤动/心房扑动或经常性心律不齐或心率快的对象；(8)有起搏器或植入式心率转变器-除颤器植入物的对象；(9)活动性充血性心力衰竭或存在已知非缺血性心肌病；和(10)已知动脉粥样硬化、脂质或脂蛋白代谢遗传疾病。对象必须符合参加研究的全部所述一般纳入标准。如果符合任何所述一般排除标准，将对象从研究中排除。

各患者通过应用以下方法按照生物标志物表征：全基因组测序(WGS)、全基因组甲基化(WGM)、基于全血的转录组测序(WTS)、无偏蛋白组学(unbiased proteomics)、无偏代谢组学、无偏脂质组学和脂蛋白蛋白组学。此外，测量了更多常规生物标志物。

样品制备：代谢组学：

样品储存在–70℃直至处理。如前述进行样品制备。(Evans AM,等人,Integrated,nontargeted ultrahigh performance liquid chromatography/electrosprayionization tandem mass spectrometry platform for the identification andrelative quantification of the small-molecule complement of biologicalsystems.Anal Chem 2009；81(16):6656-6667)简言之，在提取过程的第一步前，为了质量控制目的加入回收标准(recovery standard)。为除去蛋白质、解离结合于蛋白质或陷入沉淀的蛋白质基质中的小分子、并为了回收化学上不同的代谢物，蛋白质在剧烈振荡2分钟下(Glen Mills Genogrinder 2000)用甲醇沉淀然后离心。所得提取物分为四部分：一部分用于通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS；正离子模式)分析，一部分用于通过UPLC-MS/MS(负离子模式)分析，一部分用于通过气相色谱-质谱(GC-MS)分析，一部分样品保留备份。与实验样品一致地分析三种类型的对照：从人类血浆池(由Metabolon，Inc.充分表征)中产生的样品作为整个数据集的技术性重复试验；提取的水样品作为过程空白样品；添加进每个分析样品中的标准样品混合物允许仪器性能监测。通过计算在进样至质谱仪前加入每个样品的标准样品的中位数相对标准偏差(RSD)来确定仪器可变性(variability)(中位数RSD＝5％；n＝30个标准样品)。通过计算存在于100％的合并的(pooled)人类血浆样品中的全部内源性代谢物(即非仪器标准样品)的中位数RSD来确定整体过程可变性(中位数RSD＝11％；n＝610个代谢物)。实验样品和对照在平台运行中随机化。

质谱分析。非靶向MS分析在Metabolon,Inc进行。提取物进行GC-MS或UPLC-MS/MS⁷。将色谱标准化，方法一经验证，不进行进一步修改。作为部分Metabolon一般操作，在试验开始时全部柱购自单一生产商批号。全部溶剂同样以完成全部相关试验的足够量大批量购自单一生产商批号。对于各样品，根据平台，真空干燥的样品溶解于含有固定浓度的8个以上的进样标准样品的进样溶剂中。内部标准样品用于确保进样和色谱一致性。每天调节和校准仪器的质量分辨率和质量准确度。UPLC-MS/MS平台利用有Waters UPLC BEH C18-2.1×100mm,1.7μm柱的Waters Acquity UPLC和与加热电喷雾电离(HESI-II)源相连的Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精确质谱仪和在35,000质量分辨率下运行的Orbitrap质量分析仪。将样品提取物干燥然后在酸性或碱性LC相容性溶剂中重构，各酸性或碱性LC相容性溶剂含有固定浓度的8个以上的进样标准样品从而确保进样和色谱一致性。在两次独立进样中使用单独的专用柱，使用酸性、正离子优化条件分析一个等分部分，使用碱性、负离子优化条件分析另一个等分部分。在酸性条件下重构的提取物用含有0.1％甲酸的水和甲醇梯度洗脱，而碱性提取物也用含有6.5mM碳酸氢铵的水/甲醇洗脱。MS分析使用动态排除在MS和数据相关的MS2扫描之间交替，扫描范围为80-1000m/z。

指定由GC-MS分析的样品在真空脱水下干燥至少18小时，然后使用双三甲基-甲硅烷基三氟乙酰胺在干燥氮气下衍生化。在5％苯基二甲基硅酮柱上用氦气作为载气(carrier gas)并在17分钟内从60℃升温至340℃来分离衍生化的样品。全部样品在以电子碰撞电离和50-750原子质量单位扫描范围在单位质量分辨能力下运行的Thermo-FinniganTrace DSQ MS上分析。

化合物识别、量化和数据校正(Data Curation)。通过将自动比较试验样品的离子特征与包括保留时间、分子量(m/z)、优选加合物和源内片段(in-source fragments)以及相关MS谱图等的化学标准条目的参考库比较而识别代谢物，并使用Metabolon开发的软件通过质量控制目测检查来校正。(DeHaven CD,等人,Organization of GC/MS and LC/MSmetabolomics data into chemical libraries.J Cheminform 2010；2(1):9)已知的化学实体的识别基于与纯化的标准样品的代谢组学库条目进行比较。已获得超过2,500种商购可得的纯化标准化合物并登记在LIMS中从而分配至LC/MS和GC/MS平台来确定其可检测的特征。已为结构未命名的依靠其重复性质(色谱的和质谱的)识别的生化物质创建另外250个质谱条目。这些化合物有可能通过未来获取匹配的纯化标准样品或通过经典结构分析识别。峰使用曲线下的面积量化。将各样品中各代谢物的原始面积计数标准化从而校正由仪器日间调谐差异导致的各运行日的中值的变化，因此，将每次运行的中值设置为1.0。这样保留了样品间的变化，但允许广泛不同的原始峰面积的代谢物在类似的图形尺度上进行比较。缺失值用标准化后观察到的最小值归算。

样品制备：脂质组学

Lipomic组。通过Folch等人的方法，使用氯仿：甲醇(2:1v/v)在可信内部标准样品的存在下提取脂质。为分离中性脂类[FFA、TAG、DAG、CE]，使用由石油醚/二乙醚/乙酸(80:20:1)组成的溶剂系统。使用Agilent Technologies 1100Series LC分离各提取物中的单独的磷脂类[PC、PE]。各脂类在密封小瓶中的1％硫酸的甲醇溶液中在氮气气氛下在100℃进行45分钟酯交换。将所得脂肪酸甲酯从混合物中用含有0.05％丁基化羟基甲苯的己烷提取，并在氮气下密封己烷提取物来为GC准备。通过装有30m DB 88毛细管柱(Agilent Technologies)和火焰离子化检测器的毛细管GC(Agilent Technologies6890Series GC)分离和量化脂肪酸甲酯。

神经酰胺组。将氘标记的内部标准样品加入样品中，并将混合物在甲醇中溶解然后碰撞提取(crash extraction)。通过加入KCL的水溶液形成双层，移除有机层并在氮气下浓缩。将提取物旋转、过滤并分为2个进样-一个用于神经酰胺一个用于鞘氨醇。所述提取物进样至与Agilent 1290Infinity LC和ABI 4000QTRAP相连的Agilent C8柱。所述分析物通过正离子电喷雾离子化，质谱仪在串联MS模式下运行。各鞘氨醇的绝对浓度通过将峰与相关内部标准样品的峰比较来确定。

质谱分析。非靶向MS分析在Metabolon,Inc进行。提取物进行GC-MS或UPLC-MS/MS⁷。将色谱标准化，方法一经验证，不进行进一步修改。作为部分Metabolon一般操作，在试验开始时全部柱购自单一生产商批号。全部溶剂同样以完成全部相关试验的足够量大批量购自单一生产商批号。对于各样品，根据平台，真空干燥的样品溶解于含有固定浓度的8个以上的进样标准样品的进样溶剂中。内部标准样品用于确保进样和色谱一致性。每天调节和校准仪器的质量分辨率和质量准确度。UPLC-MS/MS平台利用具有Waters UPLC BEH C18-2.1×100mm,1.7μm柱的Waters Acquity UPLC和与加热电喷雾电离(HESI-II)源相连的Thermo Scientific Q-Exactive高分辨率/精确质谱仪和在35,000质量分辨率下运行的Orbitrap质量分析仪。将样品提取物干燥然后在酸性或碱性LC相容性溶剂中重构，各酸性或碱性LC相容性溶剂含有固定浓度的8个以上的进样标准样品从而确保进样和色谱一致性。在两次独立进样中使用单独的专用柱，使用酸性、正离子优化条件分析一个等分部分，使用碱性、负离子优化条件分析另一个等分部分。在酸性条件下重构的提取物用含有0.1％甲酸的水和甲醇梯度洗脱，而碱性提取物也用含有6.5mM碳酸氢铵的水/甲醇洗脱。MS分析使用动态排除在MS和数据相关的MS2扫描之间交替，扫描范围为80-1000m/z。

指定由GC-MS分析的所述样品在真空脱水下干燥至少18小时，然后使用双三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺在干燥氮气下衍生化。在5％苯基二甲基硅酮柱上用氦气作为载气并在17分钟内从60℃升温至340℃来分离衍生化的样品。全部样品在以电子碰撞电离和50-750原子质量单位扫描范围在单位质量分辨能力下运行的Thermo-Finnigan Trace DSQ MS上分析。

化合物识别、量化和数据校正。通过将自动比较试验样品的离子特征与包括保留时间、分子量(m/z)、优选加合物和源内片段以及相关MS谱图等的化学标准条目的参考库比较而识别代谢物，并使用Metabolon开发的软件通过质量控制目测检查来校正。(DeHaven等人)已知的化学实体的识别基于与纯化的标准样品的代谢组学库条目进行比较。已获得超过2,500种商购可得的纯化标准化合物并登记在LIMS中从而分配至LC/MS和GC/MS平台来确定其可检测的特征。已为结构未命名的依靠其重复性质(色谱的和质谱的)识别的生化物质创建另外250个质谱条目。这些化合物有可能通过未来获取匹配的纯化标准样品或通过经典结构分析识别。峰使用曲线下的面积量化。将各样品中各代谢物的原始面积计数标准化从而校正由仪器日间调谐差异导致的各运行日的中值的变化，因此，将每次运行的中值设置为1.0。这样保留了样品间的变化，但允许广泛不同的原始峰面积的代谢物在类似的图形尺度上进行比较。缺失值用标准化后观察到的最小值归算。

实施例1.发现

分析群体

“完整分析集(Full Analysis Set)”(“FAS”)由具有临床数据和基于CT指定的血管再形成CAD病例、自体的CAD病例或对照的试点研究患者组成(对于FAS组N＝336)。

“自体的CAD集”是具有CT确定的自体的CAD的FAS的子集，“自体的CAD集”具有分析物(代谢组学和脂质组学)数据(对于自体的CAD集N＝120)。“自体的CAD集”是不具有此前血管再形成过程例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植(CABG)的对象。

“血管再形成CAD集(Revasc CAD Set)”是经历此前血管再形成过程例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植(CABG)并具有分析物数据的FAS的子集。

“全部CAD集”是自体的CAD集和血管再形成CAD集的并集。

“对照集”是具有零钙评分并在CT数据检查后指定为对照、并具有分析物数据的FAS的子集。(对于对照集加自体的CAD集N＝279)。基于无造影CT(non-contrast CT)和造影增强CT数据的组合检查，这些对象不具有可辨别的动脉粥样硬化性CAD。

注意到在设计上，研究中代表的唯一种族群体是白人。因此，未定义基于种族的亚群。数据未分为训练组和验证组。

I:GLOBAL试点研究

A.研究终点

对于GLOBAL试点发现组，在分析中存在两个主要终点：(1)自体的CAD；和(2)全部CAD(自体的或血管再形成)。全部分析应用于两个主要终点。

B.统计假设

在代谢物或脂质和终点之间的无相关性的零假设(null hypothesis)针对存在相关性的双侧替代物(two-sided alternative)来试验。

C.多重比较和多重性

计算了假发现率(FDR)q值(Benjamini和Hochberg，1995)。FDR q<0.05的相关性认为是初步相关的。在一些情况下，也报告原始p<0.05的试验结果。

D.缺失数据

终点数据不归算。排除有多于5％缺失数据的潜在协变量。有少于5％缺失数据的潜在协变量归算为平均值。

有多于10％缺失数据的代谢物排除在主要分析之外。有少于10％缺失的代谢物和脂质的缺失值归算为标准化后的观察的最小值。

E.协变量

12个潜在协变量称为“临床变量”：年龄；性别；体重指数(BMI)；II型糖尿病；目前吸烟者；禁食；他汀使用；烟酸使用；贝特类药物(Fibrate)使用；依泽替米贝(Ezetimibe)使用；鱼油使用；和胆酸螯合剂(Bile acid sequestrant)使用。

表1中列出的另一组77个潜在协变量称为“常规基于血液的生物标志物变量”。

表1:

如下所述，这些变量的选择的子集用作协变量调整的相关性分析(covariate-adjusted association analysis)中的协变量和/或用作预测建模分析(predictionmodeling analyses)的输入。

F.亚组分析

第一主要终点使用FAS的子集处理。具体地将自体的CAD集与对照集比较。大部分次要分析仅涉及自体的CAD集。在分析CT引起的次要终点时考虑其他亚组。

II.人口统计和基线特征

将试点研究中的患者的基线和人口统计特征制表。连续变量由平均值和标准误差总结；二进制变量由计数和百分比总结。

表2通过临床组(血管再形成CAD对自体的CAD对对照)示出一般患者特征。进行了Kruskall-Wallis试验从而研究连续测量的均一性；对二进制测量进行了Pearson卡方(chi-squared)试验；报告了未调整的p-值。

表3通过主要终点，具体地，自体的CAD对对照和全部CAD对对照，示出一般患者特征。进行了Mann-Whitney试验从而研究连续测量的均一性；对二进制测量进行了Pearson卡方试验；报告了未调整的p-值。

表2:

表3:

III.代谢物和复合脂质的探索性数据分析

样品制备和质谱分析由Metabolon,Inc进行。原始数据包含测量336个试点研究参与者的总共1088种分析物。2个试点研究参与者没有数据。

1088种分析物中，705种代谢物和183种复合脂质(共888种)的缺失数据少于10％。全部336个患者的缺失数据少于10％。因此统计分析应用于888种分析物和336个患者。“血管再形成CAD集”中存在57个患者，“自体的CAD集”中存在120个患者，和“对照组”中存在159个患者。

数据在接收前标准化。应用对数(以2为底)变换并创建直方图从而通过分析物示出表达的分布(数据未显示)。

代谢组学和脂质组学数据在单个批次中产生，所以未应用批次修正，然而，进行了主成分分析(PCA)，从而寻找任何位点效应(site effect)的证据。将变量中心化(centered)并调整为单位变量。发明人评估了位点效应的存在与否，并得出结论为从不同位点获得的数据不存在系统差异。

IV.代谢物和复合脂质的单变量分析

A.方法

使用Mann-Whitney试验对全部主要和次要终点进行了单变量相关性分析，并应用了FDR修正。生成列表示出全部分析物的p-值和q-值。

q<0.05的任何分析物认为是初步相关的。对各分析物，生成盒须图从而通过临床组示出表达的分布。生成热图(heat-map)从而示出各终点的初步代谢物相关性：在y-轴，患者通过终点值分组，在x-轴，树状图示出q<0.05的代谢物的聚类。相似地，生成热图从而示出各终点的初步复合脂质相关性。

B.结果

表4示出自体的CAD对对照的主要终点的q<0.05的代谢物的详情；表5示出q<0.05的复合脂质的详情。

表6示出全部CAD对对照的主要终点的q<0.05的代谢物的详情；表7示出q<0.05的复合脂质的详情。

表4:

表5:

分析物	生化物质	子路径	P-值	q-值
					594	CER18:0	鞘脂类代谢	9.57E-05	0.0207
581	SM16:0	鞘磷脂	0.0004	0.0437

表6:

表7:

分析物	生化物质	子路径	P-值	q-值
					662	CE18:2n6	胆固醇酯	3.01E-05	0.0037
561	PL18:2n6	磷脂	0.0002	0.0110
					666	CE20:4n6	胆固醇酯	0.0005	0.0154
485	总二酰甘油	二酰甘油	0.0005	0.0157
					619	DHC24:1	鞘脂类代谢	0.0006	0.0160
517	TG15:0	三酰甘油	0.0007	0.0171
					496	DG18:1n9	二酰甘油	0.0007	0.0173
615	DHC20:1	鞘脂类代谢	0.0008	0.0178
					582	SM18:0	鞘磷脂	0.0010	0.0190
594	CER18:0	鞘脂类代谢	0.0013	0.0208
					515	总三酰甘油	三酰甘油	0.0019	0.0250
547	PL15:0	磷脂	0.0049	0.0473
					489	DG18:0	二酰甘油	0.0050	0.0480

V.主要终点的预测建模

A.方法

梯度提升是确定使损失函数期望极小化的回归函数的方法。(Friedman JH.,Greedy function approximation:a gradient boosting machine.Ann Statist 29(5):1189-1232(2001)；Friedman JH.,Stochastic gradient boosting.Comput Stat DataAnal 38(4):367-378(2002))。梯度提升是迭代方法，其中计算损失函数的负梯度，拟合回归模型，选择梯度下降的步长(step size)，和更新回归函数。梯度借助利用协变量信息的回归树的方法来近似，在每次迭代梯度决定了函数需要移动的方向，从而提高对数据的拟合。

为发现目的，应用了两轮梯度提升，从而分别选择高预测性的代谢物和脂质：(1)代谢组学模型：仅代谢组学数据；和(2)脂质组学：仅脂质组学数据。

应用了另四轮梯度提升，从而量化不同水平的模型复杂度的相对益处：(3)临床模型：临床变量，加常规基于血液的生物标志物变量；(4)临床-代谢组学模型：临床变量，常规基于血液的生物标志物变量，加代谢组学数据；(5)临床-脂质组学模型：临床变量，常规基于血液的生物标志物变量，加脂质组学数据；和(6)临床-代谢组学-脂质组学模型：临床变量，常规基于血液的生物标志物变量，加代谢组学和脂质组学。

为简化搜索空间，过滤变量从而仅包括对感兴趣的终点而言显示名义单变量相关(nominal univariate association)的那些(原始p<0.05)。由于主要终点的二进制性质，损失函数假设为伯努利(Bernoulli)。引入学习率(λ)来衰减拟用的移动，并防止过拟合。由T给出的最佳迭代次数通过5倍交叉验证来确定。在每个终端节点的最小观测数为10。允许双向相互作用。进行观测半数的不放回随机二次抽样(random sub-sampling withoutreplacement)从而实现梯度估计的方差减小。

根据迭代/树的最佳轮数，由损失(误差)的交叉验证(CV)估计总结导出的模型的估计性能。将选择的变量，及其将其估计的相对影响列表。生成显示最大影响的变量的部分依赖图表。

以此方式，对各主要终点导出6个预测模型，使用相同数据得到模型性能的初步估计。

使用这6个模型为各患者生成概率预测。对于各个模型，计算预测概率阈值范围的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。生成受试者工作特性(ReceiverOperating Characteristic，ROC)曲线从而将敏感性作为(1-特异性)的函数作图。最佳分类阈值在准确度的基础上确定，定义为正确预测的比例。此外，估计了曲线下的面积(AUC)。

校准性能以图表方式评价：生成示意图从而示出CAD对预测风险的比率。进行了Hosmer-Lemeshow C-检验。

将基于模型的预测的性能与通过Diamond-Forrester评分和Morise评分得到的概率预测的性能比较。(Diamond GA,Forrester JS.Analysis of probability as an aidin the clinical diagnosis of coronary-artery disease.N Engl J Med.1979 Jun14；300(24):1350-8；Morise AP,Jalisis F.Evaluation of pretest and exercise testscores to assess all-cause mortality in unselected patients presenting forexercise testing with symptoms of suspected coronary artery disease.J Am CollCardiol.2003Sep 3；42(5):842-50)。

自体的CAD的详细结果

结果示出Diamond-Forrester评分提供了GLOBAL表型的不良预测(图1)。预测自体的CAD的AUC和准确度的估计表明性能不好于向全部患者分配0.57的相等的疾病概率。(图2)全部CAD得到了一些适度的改进，但性能保持较弱。(图17)

对预测自体的CAD，Morise评分也表现不佳，但对预测全部CAD较好。(图3和图4)对于后者，得到了0.61的准确度，其与通过向全部患者分配相等的疾病概率得到的0.53的最小准确度相比有利。(图18)

临床模型

测量的888种分析物(705种代谢物和183种复合脂质)中，28个临床变量显示出对自体的CAD的名义单变量相关(原始p<0.05)(表8)。表9提供了全部CAD的28个临床变量的过滤列表。

表8:

年龄	linoleic2	Log.Lp.a..C..mg.dL.	男性
				Apo.B	Log.ALP	Log.Lp.a..团	MHDM2
B-谷甾醇	Log.菜油甾醇	Log.Lp.a..P..nmol.L.	SMKCURR
				BMI	Log.GGT	Log.palmleic2	他汀
禁食	Log.葡萄糖	Log.胰岛素原	总.胆固醇
				鱼油	Log.hsCRP	Log.sdLDL.C	尿酸
LDL.C	Log.胰岛素	Log.Trig	Vit.D..ng.mL.

对自体的CAD显示出名义单变量相关(原始p<0.05)的28个临床变量中，一组10个临床变量对CAD的概率是预测性的。表9提供了自体的CAD的临床模型的11个临床变量的相对影响。图5提供了自体的CAD的临床模型的ROC曲线。图6提供了自体的CAD的临床模型的11个临床变量的部分依赖图表。

表9:

变量	相对影响	改变的方向
			Log.Lp.a..P..nmol.L.	19.09	升高
Apo.B	15.25	升高
			他汀	13.52	升高
Log.ALP	10.50	升高
			Log.Lp.a..团	7.93	升高
Log.Trig	6.71	升高
			LDL.C	6.55	升高
尿酸	6.19	升高
			Log.GGT	5.50	升高
Log.葡萄糖	4.63	升高
			SMKCURR	4.13	升高

代谢组学模型

在测量的888种分析物中，105个临床变量显示出对自体的CAD的名义单变量相关(原始p<0.05)。表10提供了自体的CAD的105个代谢组学变量的过滤列表。

表10:

显示出自体的CAD的名义单变量相关的105个临床变量中，一组6个代谢组学变量对CAD的概率是预测性的。表11提供了自体的CAD的代谢组学模型的6个临床变量的相对影响。图7提供了自体的CAD的代谢组学模型的ROC曲线。图8提供了自体的CAD的代谢组学模型的6个临床变量的部分依赖图表。

表11:

变量	相对影响	改变的方向
			谷氨酸盐(酯)	23.34	升高
葡糖醛酸盐(酯)	19.02	升高
			`X-12212`	15.63	降低
`谷氨酰胺-亮氨酸`	15.12	降低
			异亮氨酰缬氨酸	14.46	降低
缬氨酰亮氨酸	12.43	降低

临床-代谢组学模型

对于临床-代谢组学模型，一组10个临床变量对CAD的概率是预测性的。表12提供了自体的CAD的临床-代谢组学模型的10个临床变量的相对影响。图9提供了自体的CAD的临床-代谢组学模型的10个临床变量的部分依赖图表。图10提供了自体的CAD的临床-代谢组学模型的ROC曲线。

表12:

脂质组学

评估的138种脂质中，29种显示了对自体的CAD的名义单变量相关(原始p<0.05)。表13提供了自体的CAD的29个脂质组学变量的过滤列表。

表13:

CE16:1n7	DG16:0	DHC20:1	HexCER16:0	SM16:0
					CE18:2n6	DG18:0	DHC24:0	HexCER18:1	SM20:1
CE20:4n6	DG18:1n9	DHC24:1	LacCER16:0	TG15:0
					CER18:0	DG20:3n9	FA18:3n6	PL15:0	TG16:0
CER20:0	DHC18:0	FA20:3n6	PLdm16:0	总三酰甘油
					CER22:1	DHC18:1	HexCER14:0	PLdm18:1n9

对于脂质组学，一组7个变量对CAD的概率是预测性的。表14提供了自体的CAD的脂质组学模型的7个脂质组学变量的相对影响。图11提供了自体的CAD的脂质组学模型的7个临床变量的部分依赖图表。图12提供了自体的CAD的脂质组学模型的ROC曲线。

表14:

变量	相对影响	改变的方向
			CER18:0	29.10	升高
DHC20:1	17.10	升高
			CER20:0	12.54	升高
SM16:0	12.25	降低
			TG15:0	10.54	降低
HexCER18:1	10.31	升高
			CER22:1	8.15	升高

临床-脂质组学模型

在临床-脂质组学模型中，一组7个临床变量对CAD的概率是预测性的。表15提供了自体的CAD的临床-脂质组学的7个临床变量的相对影响。图13提供了自体的CAD的临床-脂质组学的7个临床变量的部分依赖图表。图14提供了自体的CAD的临床-脂质组学模型的ROC曲线。

表15:

变量	相对影响	改变的方向
			CER18.0	25.81	升高
Log.ALP	14.97	升高
			DHC20.1	14.88	升高
Log.Lp.a..P..nmol.L.	12.85	升高
			SM16.0	10.61	降低
Apo.B	10.49	升高
			CER20.0	10.40	升高

临床-代谢组学-脂质组学模型

在临床-代谢组学-脂质组学模型中，一组6个临床变量对CAD的概率是预测性的。表16提供了自体的CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的这6个变量的相对影响。图15提供了自体的CAD的临床-代谢组学的-脂质组学的6个临床变量的部分依赖图表。图16提供了自体的CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的ROC曲线。

表16:

变量	相对影响	改变的方向
			谷氨酸盐(酯)	20.76	升高
X-16132	18.63	升高
			异亮氨酰丙氨酸	18.08	降低
Log.Lp.a..团	14.83	升高
			X-12212	13.98	降低
谷氨酰胺.亮氨酸	13.71	降低

全部CAD的详细结果

临床模型

35个临床变量显示出对自体的CAD的名义单变量相关(原始p<0.05)(表17)。表17提供了全部CAD的35个临床变量的过滤列表。

表17:

显示出对全部CAD的名义单变量相关(原始p<0.05)的35个临床变量中，一组11个临床变量对CAD的概率是预测性的。表18提供了全部CAD的临床模型的11个临床变量的相对影响。图19提供了全部自体的CAD的临床模型的11个临床变量的部分依赖图表。图20提供了全部CAD的临床模型的ROC曲线。

表18:

变量	相对影响	改变的方向
			oleic2	12.78	升高
Log.NT.ProBNP	12.00	升高
			Log.Lp.a..团	11.62	升高
Log.胰岛素	10.00	升高
			Log.A1C	9.97	升高
西斯蒙他托	8.93	升高
			他汀	8.54	升高
Log.sdLDL.C	8.21	升高
			behenic2	6.23	升高
Log.脂联素	6.11	降低
			Log.GGT	5.61	升高

代谢组学模型

如表19示出的，为对全部CAD的名义单变量相关(原始p<0.05)的138个代谢组学变量的过滤列表。

表19:

显示出对全部CAD的名义单变量相关的138个临床变量中，一组16个代谢组学变量对CAD的概率是预测性的。表20提供了自体的CAD的代谢组学模型的16个临床变量的相对影响。图21提供了全部CAD的代谢组学模型的16个临床变量的部分依赖图表。图22提供了全部CAD的代谢组学模型的ROC曲线。

表20:

变量	相对影响	改变的方向
			异亮氨酰丙氨酸	9.75	降低
葡糖醛酸盐(酯)	8.31	升高
			甘氨酸	8.11	降低
异亮氨酰苯丙氨酸	7.69	降低
			甘露糖	7.65	升高
`X-21452`	6.93	降低
			`1-油酰甘油磷酸甘油`	6.50	升高
`X-21335`	5.94	升高
			`7-甲基黄嘌呤`	5.77	升高
`X-12729`	5.46	降低
			N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	5.46	升高
`α-羟基异戊酰肉碱`	5.11	升高
			`2-氨基己二酸盐(酯)`	4.80	升高
`X-18914`	4.78	降低
			巴豆酰甘氨酸	4.16	降低
吡哆醛	3.56	降低

临床-代谢组学模型

在全部CAD的临床-代谢组学模型中，一组12个临床变量对CAD的概率是预测性的。表21提供了全部CAD的临床-代谢组学模型的12个临床变量的相对影响，图23提供了全部CAD的临床-代谢组学模型的12个临床变量的部分依赖图表。图24提供了全部CAD的临床-代谢组学模型的ROC曲线。

表21:

变量	相对影响	改变的方向
			异亮氨酰丙氨酸	12.92	降低
甘氨酸	10.75	降低
			异亮氨酰苯丙氨酸	10.15	降低
oleic2	9.55	升高
			X-21335	8.22	升高
X3.甲基黄嘌呤	7.97	升高
			X2.氨基己二酸盐(酯)	7.76	升高
甘露糖	7.28	升高
			N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	6.73	升高
X2.花生四烯酰.GPE...20.4..	6.51	升高
			Log.Lp.a..P..nmol.L.	6.16	升高
Log.Trig	6.01	升高

脂质组学模型

31个脂质组学变量显示出对全部CAD的名义单变量相关(原始p<0.05)。表22提供了全部CAD的29个脂质组学变量的过滤列表。

表22:

CE16:0	DG18:0	DHC18:1	DHC26:1	PL24:0
					CE16:1n7	DG18:1n9	DHC20:0	FA14:1n5	SM18:0
CE18:1n9	DG20:0	DHC20:1	PL15:0	TG15:0
					CE18:2n6	DG20:2n6	DHC22:1	PL18:2n6	TG20:3n9
CE20:4n6	DG20:3n9	DHC24:1	PL20:3n9	总二酰甘油
					CER18:0	DHC18:0	DHC26:0	PL20:4n6	总三酰甘油
CER18:1

一组13个变量对CAD的概率是预测性的。表23提供了全部CAD的脂质组学的13个脂质组学变量的相对影响。图25提供了全部CAD的脂质组学的13个临床变量的部分依赖图表。图26提供了全部CAD的脂质组学的ROC曲线。

表23:

临床-脂质组学模型

在全部CAD的临床-脂质组学模型中，一组11个临床变量对CAD的概率是预测性的。表24提供了全部CAD的临床-脂质组学的11个临床变量的相对影响。图27提供了全部CAD的临床-脂质组学的11个临床变量的部分依赖图表。图28提供了全部CAD的临床-脂质组学模型的ROC曲线。

表24:全部CAD的临床-脂质组学模型的相对影响

临床-代谢组学-脂质组学模型

在全部CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型中，一组12个临床变量对CAD的概率是预测性的。表25提供了全部CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的12个变量的相对影响。图29提供了全部CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的12个临床变量的部分依赖图表。图30提供了自体的CAD的临床-代谢组学-脂质组学模型的ROC曲线。

表25:

所有本文描述的实施例中，一些分析物的编号识别为“X-”化合物。这几个X-化合物在表26中进一步详细描述。

表26:

对于表26，数据是以下格式：名称；lib_id；comp_id；quant_mass；rt；未命名代谢物的试定细节(如有的话)；和谱。谱数据格式(x:y)表示离子的质量(m/z＝x)和相对峰强度(y)。谱中的各离子由空格分开。

方法：次要终点的单变量分析

实施例2.发现和验证

分析群体

“发现-完整分析集”(“发现FAS”)由具有临床数据和基于CT指定的血管再形成CAD病例、自体的CAD病例或对照的试点研究患者组成(对于发现-FAS组，N＝748)。

“发现-自体的CAD集”是具有CT确定的自体的CAD的发现-FAS的子集，“发现-自体的CAD集”具有分析物(代谢组学)数据(对于发现-自体的CAD集N＝366)。“发现-自体的CAD集”是不具有此前血管再形成过程例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植(CABG)的对象。

“发现-血管再形成CAD集”是经历此前血管再形成过程例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植(CABG)并具有分析物数据的发现-FAS的子集(N＝44)。

“发现-全部CAD集”是发现-自体的CAD集和发现-血管再形成CAD集的并集(N＝410)。

“发现-对照集”是具有零钙评分并在CT数据检查后指定为对照、并具有分析物数据的发现-FAS的子集。(对于发现-对照集N＝338)。

“验证-完整分析集”(“验证-FAS”)由具有临床数据和基于CT指定的血管再形成CAD病例、自体的CAD病例或对照的试点研究患者组成(对于验证-FAS组，N＝348)。

“验证-自体的CAD集”是具有CT确定的自体的CAD的验证-FAS的子集，“验证-自体的CAD集”具有分析物(代谢组学)数据(对于验证-自体的CAD集N＝207)。“验证-自体的CAD集”是不具有此前血管再形成过程例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植(CABG)的对象。

“验证-血管再形成CAD集”是经历此前血管再形成过程例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)或冠状动脉旁路移植(CABG)并具有分析物数据的验证-FAS的子集(N＝15)。

“验证-全部CAD集”是验证-自体的CAD集和验证-发现血管再形成CAD集的并集(N＝222)。

“验证-对照组”是具有零钙评分并在CT数据检查后指定为对照、并具有分析物数据的验证-FAS的子集。(对于验证-对照集N＝126)。

注意到，在设计上，在研究中代表的唯一种族群体是白人。因此，未定义基于种族的亚群。

A.研究终点

对于GLOBAL试点发现组，在分析中存在4个主要终点：(1)自体的CAD；(2)全部CAD(自体的或血管再形成)；(3)无血管再形成的50％狭窄；(4)50％狭窄或血管再形成。全部分析应用于全部主要终点。

B.统计假设

在代谢物或脂质和终点之间的无相关性的零假设针对存在相关性的双侧替代物来试验。

C.多重比较和多重性

计算假发现率(FDR)q值(Benjamini和Hochberg，1995)。FDR q<0.05的相关性认为是初步相关的。在一些情况下，也报告原始p<0.05的试验结果。

D.缺失数据

E.亚组分析

使用FAS的子集处理第一和第三主要终点。具体地自体的CAD集和对照集认为是排除血管再形成CAD集。为了发现的目的，在参与者禁食状态的基础上创建了其他子集，其中如果患者8个小时以上未进食，分类为禁食。或已知未进食或具有未知禁食状态的其余患者，分类为“非禁食”。

I.人口统计和基线特征

表27通过临床组(血管再形成CAD对自体的CAD对对照)示出发现集的一般患者特征。进行Kruskall-Wallis检验从而研究连续测量的均一性；对Pearson卡方检验进行二进制测量；报告了未调整的p-值。

表28通过临床组(血管再形成CAD对自体的CAD对对照)示出验证集的一般患者特征。进行Kruskall-Wallis检验从而研究连续测量的均一性；对Pearson卡方检验进行二进制测量；报告了未调整的p-值。

表27:

表28:

II.代谢物的探索性数据分析

样品制备和质谱分析由Metabolon,Inc进行。原始数据包含测量1096个试点研究参与者的总共1088种分析物。

1088种分析物(包括未命名的代谢物和复合脂质)中，481种命名的代谢物的缺失数据少于10％。对于这些代谢物，全部1096个患者的缺失数据少于10％。因此统计分析应用于481种分析物和1096个患者。将数据在接收前标准化。应用对数(以2为底)变换并创建直方图从而通过分析物示出表达的分布(数据未显示)。

代谢组学数据在多个批次中产生；然而，主成分分析(PCA)未示出任何系统性位点效应的证据。

III.主要终点的预测建模

方法。发现-FAS集中的患者根据其是否禁食至少8小时来分类。由此标准，共377个参与者禁食和371个参与者非禁食。对4个主要终点，进行了调整年龄和性别的相关性试验，以如下3种方式定义了名义相关：

1禁食和非禁食组合中显著

2禁食和非禁食中独立地显著

3仅禁食中显著

要强调的是，在此阶段，“显著”适用于原始、未调整的p<0.05的任何相关。

以此方式，12种情况考虑如下：

a)自体的CAD中的动脉粥样硬化-A^nCAD

c.禁食和非禁食组合中显著-

c.禁食和非禁食中独立地显著-

c.禁食中显著-

b)全部CAD(包括血管再形成)中的动脉粥样硬化-A^aCAD

c.禁食和非禁食组合中显著-

c.禁食和非禁食中独立地显著-

c.禁食中显著-

c)自体的CAD中的50％狭窄-S^nCAD

c.禁食和非禁食组合中显著-

c.禁食和非禁食中独立地显著-

c.禁食中显著-

d)全部CAD(包括血管再形成)中的50％狭窄-S^aCAD

c.禁食和非禁食组合中显著-

c.禁食和非禁食中独立地显著-

c.禁食中显著的分析物-

当多于9个变量具有p<0.05时，将年龄和性别加入变量，应用梯度提升(参见以下)选择9个预测子(predictors)。

通过如下的线性(逻辑)回归获得12个预测模型。当少于9个变量具有p<0.05时，将年龄和性别加入变量，拟合整个模型。否则，将通过梯度提升变量选择的9个变量在广义线性(逻辑)模型中与年龄和性别组合。

梯度提升是确定使损失函数期望极小化的回归函数的方法。(Freidman JH(2001)和Friedman JH(2002))。梯度提升是迭代方法，其中计算损失函数的负梯度，拟合回归模型，选择梯度下降的步长，和更新回归函数。梯度借助利用协变量信息的回归树的方法来近似，在每次迭代梯度决定了函数需要移动的方向，从而提高对数据的拟合。

由于主要终点的二进制性质，损失函数假设为伯努利。引入学习率(λ)来衰减拟用的移动，并防止过拟合。由T给出的最佳迭代次数通过5倍交叉验证来确定。在每个终端节点的最小观测数为10。允许双向相互作用。进行观测半数的不放回随机二次抽样从而达到梯度估计中的方差减小。

为目前的目的，对各情况运行50轮梯度提升，取较经常示出最高估计相对影响的9个变量进行广义线性建模。

12个模型用于为验证-FAS中的各患者生成概率预测。对于各模型，计算了预测概率阈值范围的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)。生成受试者工作特性(ROC)曲线从而将敏感性作为(1-特异性)的函数作图。最佳分类阈值在准确度的基础上确定，定义为正确预测的比例。此外，估计了曲线下的面积(AUC)和准确度(表27、28、29、30各自针对4个主要终点)。

将基于模型的预测的性能与通过Diamond-Forrester评分得到的概率预测的性能比较。(Diamond和Forrester(1979))。

自体的CAD的详细结果

结果示出Diamond-Forrester评分提供了GLOBAL表型的不良预测(图34、38、42、46)。预测自体的CAD的AUC和准确度的估计表明性能不好于向全部患者分配疾病的“风险(at risk)”，借此自体的CAD的验证集(验证-自体的CAD加验证-对照)的62％的预测是正确的，全部CAD的验证集(验证-自体的CAD加验证-血管再形成CAD加验证-对照)的64％的预测是正确的。

代谢组学模型

I.自体的CAD中的动脉粥样硬化-A^nCAD

a.禁食和非禁食组合中显著-

i.测量的481种分析物中，83个代谢组学的变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表29提供了

的83个代谢组学变量的列表。

表29:

在显示出对

的名义单变量相关的83个代谢组学变量中，一组8个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，8个代谢组学变量与年龄和性别组合。表30提供了代谢组学模型

的8个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图35提供了代谢组学模型

的ROC曲线。表53提供了预测的概率阈值范围的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)；估计了曲线下的面积(AUC)和准确度。

表30:

^§术语“存在”表示在预测模型中涵盖了男性性别，且“相对影响”表示男性性别与结果的相关(即，ASCAD或存在冠状动脉粥样硬化斑块)。

b.禁食和非禁食中独立地显著-

i.测量的481种分析物中，4个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表31提供了

的4个代谢组学变量的列表。

表31:

N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	硫酸邻甲酚	半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物
			苏糖酸盐(酯)	--	--

在显示出对

的名义单变量相关的4个代谢组学变量中，一组全部4个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，4个代谢组学变量与年龄和性别组合。表32提供了代谢组学模型

的4个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图36提供了代谢组学模型

表32:

变量	相对影响	改变的方向
			N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	40.74	升高
年龄	20.77	升高
			半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物	18.87	降低
苏糖酸盐(酯)	12.67	降低
			硫酸邻甲酚	4.49	升高
男性性别	2.45	存在

c.禁食中显著-

i.测量的481个分析物中，34个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表33提供了

的34个代谢组学变量的列表。

表33:

在显示出对

的名义单变量相关的34个代谢组学变量中，一组8个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，8个代谢组学变量与年龄和性别组合。表34提供了代谢组学模型

的8个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图37提供了代谢组学模型

表34:

II.全部CAD(包括血管再形成)中的动脉粥样硬化-A^aCAD

a.禁食和非禁食组合中显著-

i.测量的481种分析物中，92个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表35提供了

的92个代谢组学变量的过滤列表。

表35:

在显示出对

的名义单变量相关的92个代谢组学变量中；一组8个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，8个代谢组学变量与年龄和性别组合。表36提供了代谢组学模型

的8个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图39提供了代谢组学模型

的ROC曲线。表54提供了预测的概率阈值范围的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)；估计了曲线下的面积(AUC)和准确度。

表36:

变量	相对影响	改变的方向
			缬氨酰亮氨酸	26.79	降低
N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	16.87	升高
			谷氨酸盐(酯)	13.93	升高
尿酸盐(酯)	9.74	升高
			葡糖醛酸盐(酯)	8.74	升高
甘露糖	7.13	升高
			年龄	6.24	升高
12-HETE	5.03	降低
			戊酰肉碱(C5)	4.81	升高
男性性别	0.72	存在

b.禁食和非禁食中独立地显著-

i.测量的481种分析物中，6个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表37提供了

的6个代谢组学变量的列表。

表37:

苏糖酸盐(酯)	苏糖酸盐(酯)	半胱氨酸-谷胱甘肽二硫化物
			硫酸邻甲酚	1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)	葡萄糖

在显示出对

的名义单变量相关的6个代谢组学变量中；一组全部6个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，6个代谢组学变量与年龄和性别组合。表38提供了代谢组学模型

的6个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图40提供了代谢组学模型

表38:

变量	相对影响	改变的方向
			N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	39.32	升高
年龄	17.31	升高
			1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)	12.00	降低
半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物	10.91	降低
			苏糖酸盐(酯)	10.71	降低
葡萄糖	6.64	升高
			男性性别	2.06	存在
硫酸邻甲酚	1.05	升高

c.禁食中显著-

i.测量的481种分析物中，48个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表39提供了

的48个代谢组学变量的列表。

表39:

在显示出对

名义单变量相关的48个代谢组学变量中；一组7个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，7个代谢组学变量与年龄和性别组合。表40提供了代谢组学模型

的7个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图41提供了代谢组学模型

表40:

变量	相对影响	改变的方向
			年龄	21.21	升高
缬氨酰亮氨酸	20.76	降低
			N-乙酰苯丙氨酸	18.59	升高
2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))	12.20	升高
			N-乙酰亮氨酸	6.10	升高
12-HETE	5.96	降低
			木糖醇	5.40	升高
甘氨酰苯丙氨酸	5.39	降低
			男性性别	4.40	存在

III.自体的CAD中的50％狭窄-S^nCAD

a.禁食和非禁食组合中显著-

i.测量的481种分析物中，49个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表41提供了

的49个代谢组学变量的列表。

表41:

在显示出对

名义单变量相关的49个代谢组学变量中；一组8个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，8个代谢组学变量与年龄和性别组合。表42提供了代谢组学模型

的8个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图43提供了代谢组学模型

的ROC曲线。表55提供了预测的概率阈值范围的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)；估计了曲线下的面积(AUC)和准确度。

表42:

变量	相对影响	改变的方向
			年龄	37.04	升高
戊酰肉碱(C5)	14.32	升高
			N-乙酰苏氨酸	10.39	升高
巴豆酰甘氨酸	8.72	降低
			2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))	7.06	升高
甘油酸盐(酯)	6.42	降低
			水杨酸盐(酯)	5.67	降低
苏糖酸盐(酯)	5.58	降低
			丙醇二酸盐(酯)(羟基丙二酸化)；	4.25	升高
男性性别	0.55	存在

b.禁食和非禁食中独立地显著-

i.测量的481种分析物中，2个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表43提供了

的2个代谢组学变量的列表。

表43:

N-乙酰甘氨酸

3-乙基苯基硫酸盐(酯)

--

在显示出对

的名义单变量相关的2个代谢组学变量中；一组2个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，2个代谢组学变量与年龄和性别组合。表44提供了代谢组学模型

的2个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图44提供了代谢组学模型

表44:

c.禁食中显著-

i.测量的481种分析物中，28个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表45提供了

的28个代谢组学变量的过滤列表。

表45:

亮氨酰亮氨酸	缬氨酰异亮氨酸	7-甲基鸟嘌呤
			天冬酰胺	甘氨胆烯酸硫酸盐(酯)*	环(leu-pro)
甘油酸盐(酯)	阿拉伯糖醇	甲硫氨酸
			苏糖醇	N-乙酰甘氨酸	丙酰甘氨酸(C3)
胆酸盐(酯)	血清素(5HT)	丝氨酸
			N-辛酰甘氨酸	木糖	2-油酰-GPE(18:1)
木糖酸盐(酯)	N-乙酰腐胺	巴豆酰甘氨酸
			异丁酰甘氨酸(C4)	阿拉伯糖酸盐(酯)	3-乙基苯基硫酸盐(酯)
异戊酰甘氨酸	赖氨酸	--
			延胡索酸盐(酯)	N-(2-呋喃甲酰)甘氨酸	--

在显示出对

的名义单变量相关的28个代谢组学变量中；一组8个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，8个代谢组学变量与年龄和性别组合。表46提供了代谢组学模型

的8个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图45提供了代谢组学模型

表46:

IV.全部CAD(包括血管再形成)中的50％狭窄-S^aCAD

a.禁食和非禁食组合中显著-

i.测量的481种分析物，72个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表47提供了

的72个代谢组学变量的列表。

表47:

在显示出对

的名义单变量相关的72个代谢组学变量中；一组8个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，8个代谢组学变量与年龄和性别组合。表48提供了代谢组学模型

的8个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图47提供了代谢组学模型

表48:

变量	相对影响	改变的方向
			年龄	18.38	升高
甘氨熊脱氧胆酸盐(酯)	16.52	降低
			N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	12.81	升高
2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))	10.33	升高
			1-亚油酰-GPE(18:2)	10.26	降低
戊酰肉碱(C5),	8.91	升高
			苏糖酸盐(酯)	7.13	降低
甘露糖	7.12	升高
			水杨酸盐(酯)	7.02	升高
男性性别	1.52	存在

b.禁食和非禁食中独立地显著-

i.测量的481个分析物中，5个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表49提供了

的5个代谢组学变量的过滤列表。

表49:

N-乙酰甘氨酸	苏糖酸盐(酯)	水杨酸盐(酯)
			2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))	3-乙基苯基硫酸盐(酯)	--

在显示出对

的名义单变量相关的5个代谢组学变量中；一组全部5个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，5个代谢组学变量与年龄和性别组合。表50提供了代谢组学模型

的5个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图48提供了代谢组学模型

的ROC曲线。表56提供了预测的概率阈值范围的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)；估计了曲线下的面积(AUC)和准确度。

表50:

变量	相对影响	改变的方向
			年龄	40.82	升高
2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))	19.56	升高
			苏糖酸盐(酯)	14.84	降低
水杨酸盐(酯)	12.23	升高
			男性性别	7.00	存在
N-乙酰甘氨酸	3.13	降低
			3-乙基苯基硫酸盐(酯)	2.42	升高

c.禁食中显著的分析物-

i.测量的481种分析物中，40个代谢组学变量显示出对

的名义单变量相关(原始p<0.05)。表51提供了

的40个代谢组学变量的过滤列表。

表51:

在显示出对

的名义单变量相关的40个代谢组学变量中；一组8个代谢组学变量选择为最佳预测子；在CAD的预测模型中，8个代谢组学变量与年龄和性别组合。表52提供了代谢组学模型

的8个代谢组学变量与年龄和性别组合的相对影响。图49提供了代谢组学模型

表52:

变量	相对影响	改变的方向
			年龄	15.37	升高
胆固醇	15.19	降低
			1-油酰甘油(18:1)	15.12	升高
N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮	14.01	升高
			2-羟基马尿酸盐(酯)(水杨基尿酸盐(酯))	9.47	升高
天冬酰胺	8.18	升高
			牛磺酸	7.93	降低
6-氧代哌啶-2-羧酸	7.50	升高
			丙酰甘氨酸(C3)	6.66	降低
男性性别	0.56	存在

对于以下各模型，计算了预测概率阈值范围的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)(表53、54、55、56)。生成受试者工作特性(ROC)曲线从而将敏感性作为(1-特异性)的函数作图。最佳分类阈值在准确度的基础上确定，定义为正确预测的比例。此外，估计了曲线下的面积(AUC)和准确度(表53、54、55、56各自针对自体的CAD、全部CAD、自体的CAD中的50％狭窄和全部CAD中的50％狭窄)。各模型的第一行表示最大准确度阈值的性能、敏感性和特异性之间的最佳平衡。具有第二行的那些模型针对高阴性预测值(NPV)优化。

表53:

DF＝Diamond-Forrester

表54:

DF＝Diamond-Forrester

表55:

DF＝Diamond-Forrester

表56:

DF＝Diamond-Forrester

其他实施方案

应理解，尽管本发明已经结合其详细说明进行了描述，但前文的描述旨在说明而不是限制由所附权利要求的范围限定的本发明的范围。其他方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。

Claims

1.分析物生物标志物在制备用于评估人类对象具有冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或患有冠状动脉粥样硬化斑块的方法中的试剂中的用途，所述方法包括：

测量从对象获得的生物样品中一组分析物生物标志物中的各分析物的水平，其中该组分析物生物标志物选自由以下组成的组：

(ii)一组生物标志物，其包括N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、硫酸邻甲酚、苏糖酸盐或苏糖酸酯和半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物；

(iii)一组生物标志物，其包括N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、2-羟基马尿酸盐或2-羟基马尿酸酯、甘氨酰苯丙氨酸、丝氨酰亮氨酸和岩藻糖；

(iv)一组生物标志物，其包括谷氨酸盐或谷氨酸酯、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、缬氨酰亮氨酸、甘露糖、葡糖醛酸盐或葡糖醛酸酯、尿酸盐或尿酸酯、戊酰肉碱(C5)和12-HETE；

(v)一组生物标志物，其包括硫酸邻甲酚、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、半胱氨酸-谷胱甘肽-二硫化物、葡萄糖、1-十九酰甘油磷酸胆碱(19:0)和苏糖酸盐或苏糖酸酯；

(vi)一组生物标志物，其包括N-乙酰苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、甘氨酰苯丙氨酸、缬氨酰亮氨酸、木糖醇、12-HETE和2-羟基马尿酸盐或2-羟基马尿酸酯；

(vii)一组生物标志物，其包括N-乙酰苏氨酸、巴豆酰甘氨酸、甘油酸盐或甘油酸酯、戊酰肉碱(C5)、苏糖酸盐或苏糖酸酯、2-羟基马尿酸盐或2-羟基马尿酸酯、水杨酸盐或水杨酸酯和羟基丙二酸化丙醇二酸盐；

(viii)一组生物标志物，其包括N-乙酰甘氨酸和3-乙基苯基硫酸盐或3-乙基苯基硫酸酯；

(viv)一组生物标志物，其包括血清素(5HT)、N-乙酰腐胺、亮氨酰亮氨酸、丙酰甘氨酸(C3)、胆酸盐或胆酸酯、甘氨胆烯酸硫酸盐或甘氨胆烯酸硫酸酯、天冬酰胺和3-乙基苯基硫酸盐或3-乙基苯基硫酸酯；

(x)一组生物标志物，其包括N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、甘露糖、戊酰肉碱(C5)、1-亚油酰-GPE(18:2)、甘氨熊脱氧胆酸盐或甘氨熊脱氧胆酸酯、苏糖酸盐或苏糖酸酯、2-羟基马尿酸盐或2-羟基马尿酸酯和水杨酸盐或水杨酸酯；

(xi)一组生物标志物，其包括N-乙酰甘氨酸、苏糖酸盐或水杨酸酯、2-羟基马尿酸盐或2-羟基马尿酸酯、3-乙基苯基硫酸盐或3-乙基苯基硫酸酯和水杨酸盐或水杨酸酯；

(xii)一组生物标志物，其包括天冬酰胺、牛磺酸、N-(3-乙酰氨基丙基)-2-吡咯烷酮、1-油酰甘油(18:1)、胆固醇、2-羟基马尿酸盐或2-羟基马尿酸盐酯、6-氧代哌啶-2-羧酸和丙酰甘氨酸(C3)；

将所述生物样品中的所述该组分析物生物标志物的测量水平与一个或多个参考样品比较，其中所述参考表示匹配的人类对象；和

如果相对于所述参考样品中的所述该组分析物生物标志物的量，所述生物样品中的所述该组分析物生物标志物的测量水平升高或降低，识别所述对象为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块。

2.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括指示医疗保健专业人员完成对识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象的非侵入式心血管评估从而确认所述对象具有或不具有冠状动脉粥样硬化性疾病或冠状动脉粥样硬化斑块。

3.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括对识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象进行非侵入式心血管评估从而确认所述对象具有或不具有冠状动脉粥样硬化性疾病或冠状动脉粥样硬化斑块。

4.根据权利要求2所述的用途，其中进行非侵入式心血管评估包括进行选自由以下组成的组的过程：心血管计算机断层扫描(CT)成像、运动负荷试验、药物负荷试验、心肌灌注成像、负荷超声心动图和心血管磁共振成像。

5.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括向识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象选择性施用包括有效量的选自由以下组成的组的治疗剂的组合物：他汀、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物、Ω-3-脂肪酸化合物、胆汁酸螯合剂、抗血小板剂、醛甾酮阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、β阻断剂、利尿剂、毛地黄、肼苯哒嗪和硝酸盐、华法林和阿司匹林，从而治疗所述对象。

6.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括给识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象选择治疗计划从而治疗所述对象。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗计划包括选择性施用包括施用有效量的选自由以下组成的组的治疗剂的组合物：他汀、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物、Ω-3-脂肪酸化合物、胆汁酸螯合剂、抗血小板剂、醛甾酮阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、β阻断剂、利尿剂、毛地黄、肼苯哒嗪和硝酸盐、华法林和阿司匹林。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述水平使用质谱(MS)分析测量。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述质谱分析包括液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)或气相色谱-质谱(GC-MS)。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述ASCAD包括动脉粥样硬化。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品为血液样品、血清样品或血浆样品。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述对象呈现ASCAD的症状，包括胸痛、心绞痛、心绞痛等同症状、呼吸困难或运动性呼吸困难。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述对象呈现与冠状动脉疾病相关的选自由以下组成的组的风险因素：男性性别、高血压、血脂异常、糖尿病和冠状动脉疾病的家族史。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述对象不具有冠状动脉疾病的既往病史。

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述参考样品从未患有心血管疾病的至少一个个体获得。

16.根据权利要求1所述的用途，其中所述参考样品包括预定的、统计学上显著的参考分析物水平。

17.根据权利要求1所述的用途，其中测定步骤使用多变量方法进行，所述多变量方法为梯度提升算法、决策树模型中的一种，或通过其他广义线性回归分析进行。

18.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括调整所述对象的临床记录从而识别所述对象为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述临床记录存储在计算机可读介质中。

20.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括选择识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象用于治疗，其中所述治疗包括向识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象选择性施用包括有效量的选自由以下组成的组的治疗剂的组合物：他汀、胆固醇吸收抑制剂、烟酸衍生物、Ω-3-脂肪酸化合物、胆汁酸螯合剂、抗血小板剂、醛甾酮阻断剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素受体阻断剂(ARB)、β阻断剂、利尿剂、毛地黄、肼苯哒嗪和硝酸盐、华法林和阿司匹林，从而治疗所述对象。

21.根据权利要求1所述的用途，其进一步包括选择识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象用于治疗，其中所述治疗包括对识别为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块的对象进行非侵入式心血管评估，从而确认所述对象具有或不具有冠状动脉粥样硬化性疾病或冠状动脉粥样硬化斑块。

22.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗计划包括开具治疗性生活方式改变的医嘱。

23.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗计划包括进行非侵入式心血管评估，所述非侵入式心血管评估包括进行选自由以下组成的组的过程：心血管计算机断层扫描(CT)成像、运动负荷试验、药物负荷试验、心肌灌注成像、负荷超声心动图和心血管磁共振成像。

24.根据权利要求1所述的用途，其中比较的步骤包括分析所述对象的年龄和/或性别。

25.一种用于评估人类对象具有冠状动脉粥样硬化性疾病(ASCAD)或具有冠状动脉粥样硬化斑块的试剂盒，所述试剂盒包括：

适用于测定试验样品中的多种分析物的水平的试剂，其中所述多种分析物包括：

任选地一种或多种对照样品，其包括预定水平的相同分析物，其中所述试验样品中的所述分析物的水平和所述对照样品中的水平的比较识别对象为具有冠状动脉粥样硬化性疾病或具有冠状动脉粥样硬化斑块；和

用于在根据权利要求1的用途中使用所述试剂盒的说明。