TWI610079B

TWI610079B - 用於診斷冠狀動脈粥樣硬化症之以血液為主的生物標記

Info

Publication number: TWI610079B
Application number: TW105103174A
Authority: TW
Inventors: 席拉德佛羅斯; Szilard Voros; 貝得利Ｏ布朗恩; Bradley O. BROWN; 艾登Ｂ馬佛斯提; Idean B. MARVASTY
Original assignee: 全球基因組學集團股份有限公司; Global Genomics Group, LLC
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2016-02-01
Publication date: 2018-01-01
Also published as: HUE047951T2; ZA201705032B; CN107427221A; US20190391131A1; EP3242588A1; SG11201705444QA; US10254272B2; WO2016112337A1; CN107427221B; IL253179A0; CA2973116C; TW201802471A; TWI690707B; HUE056203T2; EP3650852A1; CA2973116A1; EP3242588A4; TW201725387A; EP3650852B1; MX2017008904A

Abstract

在一些態樣中，本發明係關於評估患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體之方法。在一些態樣中，本發明係關於可用於診斷、分類、型態分析及治療動脈粥樣硬化CAD及/或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之方法及套組。

Description

用於診斷冠狀動脈粥樣硬化症之以血液為主的生物標記

相關申請案的交叉參考

本申請案主張2015年1月9日申請之美國臨時專利申請案第62/101,445號之權利，該申請案之整體內容以引用的方式併入本文中。

本發明係關於用於在患者中診斷冠狀動脈粥樣硬化症(「ASCAD」)及/或檢測冠狀動脈粥樣硬化斑塊之非侵入性方法，且更具體而言係關於使用代謝體學以血液為主的生物標記及其組合以鑑別患有動脈粥樣硬化CAD及/或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者的方法。

在美國及全世界，心血管疾病(CVD)仍係發病率及死亡率之主要原因。基於美國心臟病協會(American Heart Association,AHA)之2014年心臟病及中風更新，83.6百萬美國成年人患有至少一種類型之CVD(>3/1盛行率)。在該等成年人中，15.4百萬人罹患冠心病(CHD)，其中具有以下分類：心肌梗塞(MI)：7.6百萬人且心絞痛(AP)：7.8百萬人。據估計到2030年，43.9%之美國人口將患有某種形式之CVD。

CVD之根本原因係冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)，其係開始於冠狀動脈血管中動脈粥樣硬化斑塊之發展。動脈粥樣硬化毫無疑問就人類健康及社會成本而言甚為重要。其造成冠狀動脈疾病(CAD)及腦血管疾病，二者均係全世界發病率及死亡率之主要原因。動脈粥樣硬化亦造成周圍動脈疾病，一種肢體損失之主要醫療原因。

動脈粥樣硬化CAD之發展及進展遵循兩種可自一者至另一者且導致兩種不同臨床症候群之不同途徑。該兩種寬臨床症候群中之一者係「勞作發作型心絞痛」，亦稱為「穩定型心絞痛」或「穩定型CAD」。在此背景下，逐漸生長之動脈粥樣硬化斑塊導致逐漸惡化之冠狀動脈管腔狹窄或變窄，開始阻礙血液流向心肌(心臟肌肉)。當管腔狹窄或變窄達到臨界限制(大約70%直徑狹窄率)時，狹窄上存在明顯壓降，且心肌灌注(血液流向心臟肌肉)受損，尤其在心肌氧需求增加期間(例如在運動或興奮狀態期間)。當流向心臟肌肉之血液再不能滿足需求時，此心肌氧「供給-需求失配」導致心肌缺血。心肌缺血自身觸發心臟中之痛覺感受器，此導致「心絞痛」或胸痛之臨床症狀。儘管此過程通常在運動或興奮狀態期間造成胸痛，但此通常不會導致急性冠狀動脈症候群，例如心因性猝死(SCD)、心肌梗塞(MI；心臟病發作)或不穩定性心絞痛(UA)。典型治療選項包括醫療介入以利用β阻斷劑或鈣通道阻斷劑減緩心率並利用諸如硝酸鹽等藥物改良血液流動。典型介入途徑旨在減輕狹窄，藉由以經皮方式在狹窄內部放置支架(經皮冠狀動脈介入治療；PCI)以打開變窄部分、或在冠狀動脈繞道移植(CABG)手術期間使用動脈或靜脈移植繞過狹窄(變窄)區段。如以上所指出，「勞作發作型心絞痛」之此病理生理學及臨床病程之根本原因係冠狀動脈動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化CAD。

病理生理學中具有相應臨床表現之第二寬途徑稱為「急性冠狀動脈症候群」(ACS)，其涵蓋心因性猝死(SCD)、心肌梗塞(MI)及不穩定性心絞痛(UA)。在此背景下，冠狀動脈中之動脈粥樣硬化斑塊(根本原因)可因破裂(rupture)或侵蝕而破裂(disrupte)。當冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂時，此在破裂區域上方引發血栓(凝塊)之形成，此可部分或完全堵塞整個冠狀動脈，導致至心肌之血液供應突然中斷(急性心肌缺血)。此病理生理學可體現在心因性猝死(SCD)、心肌梗塞(MI)或臥位型心絞痛中。典型治療選項係通常介入選項，其中在侵入性程序期間利用支架覆蓋嚴重破裂之斑塊。正如在「勞作發作型心絞痛」之情形中一樣，急性冠狀動脈症候群之根本原因係冠狀動脈血管中之動脈粥樣硬化斑塊。

因此，動脈粥樣硬化斑塊之起始及進展係動脈粥樣硬化CAD及CHD之臨床表現的根本原因。因此，業內仍需要用於檢測動脈粥樣硬化斑塊及診斷動脈粥樣硬化CAD之經改良診斷方法。

在一個態樣中，本發明提供評估患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體之非侵入性方法。ASCAD包括(例如)動脈粥樣硬化。該等方法包括量測在自個體獲得之生物樣品中一組分析物生物標記內之每一分析物之含量，其中該組分析物生物標記係選自由以下組成之群：(i)包含以下各項之一組生物標記：纈胺醯基白胺酸、麩胺酸鹽、埃西索加(acisoga)、尿酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、岩藻糖、丁醯基肉鹼(C4)及甘露糖；(ii)包含以下各項之一組生物標記：埃西索加、鄰甲酚.硫酸鹽、蘇糖酸鹽及半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物；(iii)包含以下各項之一組生物標記：N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、甘胺醯基苯丙胺酸、絲胺醯基白胺酸及岩藻糖；(iv)包含以下各項之一組生物標記：麩胺酸鹽、埃西索加、纈胺醯基白胺酸、甘露糖、葡萄糖醛酸鹽、尿酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)及 12.HETE；(v)包含以下各項之一組生物標記：鄰甲酚.硫酸鹽、埃西索加、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物、葡萄糖、1.十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)及蘇糖酸鹽；(vi)包含以下各項之一組生物標記：N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、甘胺醯基苯丙胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、12.HETE及2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)；(vii)包含以下各項之一組生物標記：N.乙醯基蘇胺酸、巴豆醯基甘胺酸(tigloylglycine)、甘油酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽及羥丙二酸鹽(羥基丙二酸鹽化)；(viii)包含以下各項之一組生物標記：N.乙醯基甘胺酸及3.乙基苯基硫酸鹽；(viv)包含以下各項之一組生物標記：血清素(5HT)、N.乙醯基腐胺、白胺醯基白胺酸、丙醯基甘胺酸(C3)、膽酸鹽、甘膽烯酸.硫酸鹽(glycocholenate.sulfate)、天冬醯胺及3.乙基苯基硫酸鹽；(x)包含以下各項之一組生物標記：埃西索加、甘露糖、戊醯基肉鹼(C5)、1.亞油醯基.GPE(18.2)、甘胺酸熊去氧膽酸鹽(glycoursodeoxycholate)、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)及柳酸鹽；(xi)包含以下各項之一組生物標記：N.乙醯基甘胺酸、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、3.乙基苯基硫酸鹽及柳酸鹽；(xii)包含以下各項之一組生物標記：天冬醯胺、牛磺酸、埃西索加、1.油醯基甘油(18：1)、膽固醇及2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、6.側氧基六氫吡啶.2.甲酸及丙醯基甘胺酸(C3)，其中該複數種生物標記之含量(包括相對含量)或出現指示患有ASCAD及/或存在冠狀動脈粥樣硬化斑塊。以上組中之任一者可進一步包括分析年齡及性別。

在另一態樣中，本發明提供包含藉由質譜量測自人類個體獲得之血液樣品中複數種代謝物中之每一者之含量的方法，其中該複數種代謝物係選自由以下組成之群：(i)纈胺醯基白胺酸、麩胺酸鹽、埃西索加、尿酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、岩藻糖、丁醯基肉鹼(C4)及甘露糖；(ii)埃西索加、鄰甲酚.硫酸鹽、蘇糖酸鹽及半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物；(iii)N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、甘胺醯基苯丙胺酸、絲胺醯基白胺酸及岩藻糖；(iv)麩胺酸鹽、埃西索加、纈胺醯基白胺酸、甘露糖、葡萄糖醛酸鹽、尿酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)及12.HETE；(v)鄰甲酚.硫酸鹽、埃西索加、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物、葡萄糖、1.十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)及蘇糖酸鹽；(vi)N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、甘胺醯基苯丙胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、12.HETE及2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)；(vii)N.乙醯基蘇胺酸、巴豆醯基甘胺酸、甘油酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽及羥丙二酸鹽(羥基丙二酸鹽化)；(viii)N.乙醯基甘胺酸及3.乙基苯基硫酸鹽；(viv)血清素(5HT)、N.乙醯基腐胺、白胺醯基白胺酸、丙醯基甘胺酸(C3)、膽酸鹽、甘膽烯酸.硫酸鹽、天冬醯胺及3.乙基苯基硫酸鹽；(x)埃西索加、甘露糖、戊醯基肉鹼(C5)、1.亞油醯基.GPE(18.2)、甘胺酸熊去氧膽酸鹽、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)及柳酸鹽；(xi)N.乙醯基甘胺酸、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、3.乙基苯基硫酸鹽、柳酸鹽；及(xii)天冬醯胺、牛磺酸、埃西索加、1.油醯基甘油(18：1)、膽固醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、6.側氧基六氫吡啶.2.甲酸及丙醯基甘胺酸(C3)。

在一個態樣中，本發明提供用於評估患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體的方法，其包含量測在自個體獲得之生物樣品中一組分析物生物標記內之每一分析物之含量，其中該組分析物生物標記係選自由以下組成之群：(xiii)包含以下各項之一組生物標記：纈胺醯基白胺酸、異白胺醯基纈胺酸、麩醯胺酸-白胺酸、X-12212、葡萄糖醛酸鹽及麩胺酸鹽；(xiv)包含以下各項之一組生物標記：葡萄糖、γ-麩胺醯基轉移酶、尿酸、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、脂蛋白(a)質量、鹼性磷酸酶及脂蛋白元B；(xv)包含以下各項之一組生物標記：麩胺酸鹽、X-16132、異白胺醯基丙胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、脂蛋白(a)質量、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、X-12212、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ ID NO：1)、麩醯胺酸、白胺酸及蘇胺醯基白胺酸；(xv1)包含以下各項之一組生物標記：CER22.1、HexCER18：1、TG15：0、SM16：0、CER20：0、DHC20：1及CER18：0；(xvii)包含以下各項之一組生物標記：CER20：0、脂蛋白元B、SM16：0、脂蛋白(a)質量、DHC20L1、鹼性磷酸酶及CER18：0；(xviii)包含以下各項之一組生物標記：麩胺酸鹽、X-16132、異白胺醯基丙胺酸、脂蛋白(a)質量、X-12212及麩醯胺酸-白胺酸；(xix)包含以下各項之一組生物標記：oleic2、N端腦鈉肽前體(N-terminal pro-brain natriuretic peptide)、脂蛋白(a)質量、胰島素、糖化血紅素A1C、cismontaotl、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、behenic2、脂聯素及γ-麩胺醯基轉移酶；(xx)包含以下各項之一組生物標記：異白胺醯基丙胺酸、葡萄糖醛酸鹽、甘胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、甘露糖、X-21452、1-油醯基甘油基磷酸甘油、X-21335、7-甲基黃嘌呤、X-12729、埃西索加、α-羥基異戊醯基肉鹼、2-胺基己二酸鹽、X-18914、巴豆醯基甘胺酸及吡哆醛；(xxi)包含以下各項之一組生物標記：異白胺醯基丙胺酸、甘胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、oleic2、X-21335、甲基黃嘌呤、胺基己二酸鹽、甘露糖、埃西索加、花生四烯醯基.GPE.20.4及甘油三酯；(xxii)包含以下各項之一組生物標記：DHC18：0、DG18：1n9、總二醯基甘油、TG20：3n9、CE20：4n6、CER18：1、DHC20：1、CE18：2n6、PL18：2n6、SM18：0、FA14：1n5、PL15：0及CE16：0；(xxiii)包含以下各項之一組生物標記：糖化血紅素A1C、總二醯基甘油、cismontotl、脂蛋白(a)質量、TG20.3n9、oleic2、DHC18.1、N端腦鈉肽前體、γ-麩胺醯基轉移酶及CER18；(xxiv)包含以下各項之一組生物標記：異白胺醯基丙胺酸、甘胺酸、cismontotl、脂蛋白(a)質量、X-21452、異白胺醯基苯丙胺酸、糖化血紅素A1C、X-21335、X7.甲基黃嘌呤、埃西索加及X-12729；其中該複數種生物標記之含量(包括相對含量)或出現指示患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或存在冠狀動脈粥樣硬化斑塊。

本發明態樣中亦提供可用於評估患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體之生物標記組。「一組生物標記」意指兩種或兩種以上分子實體(例如兩種、三種、四種、五種或五種實體)之集合或組合，其在樣品中之表示與ASCAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊相關。本文所述生物標記組可用於診斷ASCAD或鑑別冠狀動脈粥樣硬化斑塊之存在，為具有ASCAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者提供預後，為具有ASCAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者對醫療療法之反應提供預測，監測具有ASCAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者，治療具有ASCAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者等。

在一些實施例中，該等方法進一步包含實施生物樣品中分析物之所量測含量與一或多種參考樣品之間之比較，該等參考代表相匹配之(例如，年齡、性別等)人類個體。

在一些實施例中，該等方法進一步包括若生物樣品中分析物之所量測含量相對於參考樣品中分析物之量增加或降低，則將個體鑑別為具有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊。

在一些實施例中，該等方法包括指示健康照護專業人員(例如，醫師、醫師助理、護理師、護士及個案管理師)對鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者完成非侵入性心血管評估。進一步非侵入性心血管評估可證實該個體是否具有或不具有冠狀動脈粥樣硬化症或冠狀動脈粥樣硬化斑塊。

在一些實施例中，該等方法進一步包含對鑑別為患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體實施非侵入性心血管評估以證實該個體具有或不具有冠狀動脈粥樣硬化症或冠狀動脈粥樣硬化斑塊。非侵入性心血管評估可係選自由以下組成之群之程序：心血管電腦斷層攝影(CT)成像、運動壓力測試、藥理學壓力測試、心肌灌注成像、負荷心臟超音波圖及心血管磁共振成像。

在另一實施例中，該等方法進一步包含將包含有效量之治療劑之組合物選擇性投與給鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體以治療該個體，其中該治療劑選自由以下組成之群：史他汀(statin)、膽固醇吸收抑制劑、菸酸衍生物、ω-3-脂肪酸化合物、膽汁酸鉗合劑、PCSK9抑制劑、抗血小板劑、醛固酮阻斷劑、血管收縮肽轉化酶(ACE)抑制劑、血管收縮肽-受體阻斷劑(ARB)、β阻斷劑、利尿劑、毛地黃(digitalis)、肼苯噠嗪(hydralazine)及硝酸鹽、香豆素(warfarin)及阿斯匹林(aspirin)。

對於鑑別為患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體，該等方法可進一步包含針對個體選擇治療計劃。舉例而言，該等方法可進一步包含針對個體選擇治療計劃，其包含選擇性投與包含有效量之治療劑之組合物、及/或實施非侵入性心血管評估，其包含(例如)實施選自由以下組成之群之程序：心血管電腦斷層攝影(CT)成像、運動壓力測試、藥理學壓力測試、心肌灌注成像、負荷心臟超音波圖及心血管磁共振成像。治療計劃可包含為個體開立改變生活方式之治療處方以改良心血管健康。

在一些實施例中，每一分析物之含量係使用質譜(MS)分析來量測。MS分析方法可係液相層析-串聯質譜(UPLC-MS/MS)、層析-質譜(GC-MS)或核磁共振(NMR)。

在一些態樣中，本文所揭示之該等方法進一步包含選擇鑑別為患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體用於治療。在一些實施例中，該治療包含向鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體選擇性投與包含有效量之治療劑之組合物以治療該個體，該治療劑選自由以下組成之群：史他汀、膽固醇吸收抑制劑、菸酸衍生物、ω-3-脂肪酸化合物、膽汁酸鉗合劑、PCSK9抑制劑、抗血小板劑、醛固酮阻斷劑、血管收縮肽轉化酶(ACE)抑制劑、血管收縮肽-受體阻斷劑(ARB)、β阻斷劑、利尿劑、毛地黃、肼苯噠嗪及硝酸鹽、香豆素及阿斯匹林。在一些實施例中，該治療包含對鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者實施非侵入性心血管評估以證實該個體是否具有冠狀動脈粥樣硬化症或冠狀動脈粥樣硬化斑塊。在一些實施例中，該治療計劃包含開立改變生活方式之治療處方以改良心血管健康。

在另一態樣中，本發明提供用於評估患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體之套組。該等套組包括適於測定測試樣品中複數種分析物之含量的試劑(例如，適於測定本文所揭示代謝體學生物標記之含量的試劑)；視情況一或多種包含預定含量之相同分析物之對照樣品，其中測試樣品中分析物之含量與對照樣品中之含量之比較鑑別患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體；及該套組在本文所述方法中之使用說明書。

如本文所用術語「生物樣品」或「樣品」係指自個體獲得或源自個體之樣品。舉例而言，樣品可選自由以下組成之群：體液、血液、全血、血漿、血清、黏液分泌、尿液或唾液。在一些實施例中，樣品係包含血液樣品或包含血液樣品。用於檢測生物標記之較佳生物源係血液樣品、血清樣品或血漿樣品。

如本文所用，術語「個體」係指哺乳動物。因此，個體係指(例如)犬、貓、馬、牛、豬、豚鼠、人類及諸如此類。當個體係人類時，個體在本文中可稱為患者。個體可係有症狀的(例如，個體呈現與動脈粥樣硬化CAD相關聯之症狀，例如胸痛、心絞痛、心絞痛相等症狀、呼吸困難或運動性呼吸困難；及/或呈現與冠狀動脈疾病相關聯之風險因子，例如男性、高血壓、異常血脂症、糖尿病、女性之絕經後狀況、吸煙或冠狀動脈疾病之家族史)，或個體可係無症狀的(例如，個體不呈現與動脈粥樣硬化CAD相關聯之症狀)。

如本文所用，「獲得(obtain或obtaining)」可係藉由「直接」或「間接」方式藉此獲得樣品之任何方式。直接獲得樣品意指實施製程(例如，實施物理方法，例如提取)以獲得樣品。間接獲得樣品意指自另一方或來源(例如，直接獲得樣品之第三方實驗室)接收樣品。直接獲得樣品包括實施包括實體物質(例如，起始材料，例如血液，例如預先自患者分離之血液)中之物理變化之製程。因此，獲得用以指自個體收集及/或移除樣品。此外，「獲得」亦用於指其中一者自先前擁有樣品之另一者接收樣品。

在一些實施例中，參考樣品係自未罹患心血管疾病之至少一個個體獲得。在一些其他實施例中，參考樣品係自先前診斷患有心血管疾病(例如，冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或冠狀動脈粥樣硬化斑塊)之至少一個個體獲得。在一些實施例中，參考樣品包含預定、統計上顯著之參考分析物含量。

在一些實施例中，該測定步驟係使用實施梯度提升演算法。在一些實施例中，該測定步驟係使用實施廣義線性建模。

在另一實施例中，該等方法進一步包含修改個體之臨床記錄以鑑別患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體。較佳地，臨床記錄儲存於電腦可讀媒體中。

本文所述之相關分析模型之匯總提供於下文中：

a. 自體CAD中之動脈粥樣硬化-A ^nCAD

i. 禁食及未禁食組合中之顯著性-

ii. 禁食及未禁食中之獨立顯著性-

iii. 禁食中之顯著性-

b.所有CAD中之動脈粥樣硬化(包括血管重建)-A ^aCAD

i. 禁食及未禁食組合中之顯著性-

ii. 禁食及未禁食中之獨立顯著性-

iii. 禁食中之顯著性-

c. 自體CAD中之50%狹窄

i. 禁食及未禁食組合中之顯著性-

ii. 禁食及未禁食中之獨立顯著性-

iii. 禁食中之顯著性-

d.所有CAD中之50%狹窄(包括血管重建)

i. 禁食及未禁食組合中之顯著性-

ii. 禁食及未禁食中之獨立顯著性-

iii. 禁食中之分析物顯著性-

。

本文所用之各部分標題僅出於組織目的，而不能解釋為以任何方式限制所述標的物。當所併入參考文獻中之術語定義似乎不同於本發明教示中所提供之定義時，將以本發明教示中所提供之定義為准。應瞭解，在本發明教示中所討論之度量(例如，溫度、濃度及時間)之前存在暗含的「約」，使得輕微及非實質性偏差在本文本發明教示之範圍內。在本申請案中，除非另外明確說明，否則使用單數包括複數。同樣，使用「包含(comprise,comprises,comprising)」、「包含(contain,contains,containing)」、「包括(include,includes,including)」並不意欲限制。應理解，前述一般說明及以下詳細說明二者皆僅為例示性及解釋性且並不限制本發明。本文所用之冠詞「一(a及an)」係指該冠詞之文法受詞之一者或一者以上(亦即，係指至少一者)。舉例而言，「一個元件」意指一個元件或一個以上元件。

除非另有說明，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。本文闡述用於本發明中之方法及材料；亦可使用此項技術中已知之其他、適宜方法及材料。該等材料、方法及實例僅係說明性的且並非意欲加以限制。本文提及之所有公開案、專利申請案、專利、序列、資料庫及其他參考文獻皆以全文引用方式併入。倘若出現衝突，則以本說明書(包括定義)為准。

本發明之其他特徵及優點自下列實施方式及申請專利範圍將顯而易見。

圖1係展示臨床組之Diamond Forrester得分之盒鬚圖的圖表。

圖2係展示Diamond Forrester得分及自體CAD之ROC曲線的圖表(AUC=0.5；臨限值=inf；靈敏度=0；特異度=1；準確度=0.57)。

圖3係展示臨床組之Morise得分之盒鬚圖的圖表。

圖4係展示自體CAD之Morise得分的ROC曲線的圖表(AUC=0.58；臨限值=20；靈敏度=0.04；特異度=0.98；準確度=0.58)。

圖5係展示自體CAD之臨床模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.79；臨限值=0.5；靈敏度=0.49；特異度=0.9；準確度=0.73)。

圖6係提供自體CAD之臨床模型之十一個臨床變量的部分依賴圖之一系列圖表。

圖7係展示自體CAD之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.78；臨限值=0.39；靈敏度=0.82；特異度=0.64；準確度=0.72)。

圖8係提供自體CAD之代謝體學模型之六個臨床變量之部分依賴圖的一系列圖表。

圖9係提供自體CAD之臨床-代謝體學模型之十個臨床變量之部分依賴圖的一系列圖表。

圖10係展示自體CAD之臨床-代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.82；臨限值=0.5；靈敏度=0.56；特異度=0.88；準確度=0.74)。

圖11係提供自體CAD之脂類組學模型之七個臨床變量之部分依賴圖的一系列圖表。

圖12係展示自體CAD之脂類組學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.74；臨限值=0.46；靈敏度=0.6；特異度=0.79；準確度=0.71)。

圖13係提供自體CAD之臨床-脂類組學模型之部分依賴圖之七個臨床變量的一系列圖表。

圖14係展示自體CAD之臨床-脂類組學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.76；臨限值=0.47；靈敏度=0.52；特異度=0.84；準確度=0.7)。

圖15係提供自體CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型之部分依賴圖之六個臨床變量的一系列圖表。

圖16係展示自體CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.78；臨限值=0.47；靈敏度=0.52；特異度=0.89；準確度=0.73)。

圖17係展示Diamond Forrester得分及所有CAD之ROC曲線的圖表(AUC=0.53；臨限值=0.51；靈敏度=0.39；特異度=0.72；準確度=0.55)。

圖18係展示所有CAD之Morise得分之ROC曲線的圖表(AUC=0.64；臨限值=12；靈敏度=0.73；特異度=0.48；準確度=0.61)。

圖19係提供所有CAD之臨床模型之部分依賴圖之十一個臨床變量的一系列圖表。

圖20係展示所有CAD之臨床模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.82；臨限值=0.49；靈敏度=0.76；特異度=0.74；準確度=0.75)。

圖21係提供所有CAD之代謝體學模型之部分依賴圖之十六個臨床變量的一系列圖表。

圖22係展示所有CAD之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.85；臨限值=0.48；靈敏度=0.9；特異度=0.65；準確度=0.78)。

圖23係提供所有CAD之臨床-代謝體學模型之部分依賴圖之十二個臨床變量的一系列圖表。

圖24係展示所有CAD之臨床-代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.83；臨限值=0.56；靈敏度=0.69；特異度=0.81；準確度=0.75)。

圖25係提供所有CAD之脂類組學模型之部分依賴圖之十三個臨床變量的一系列圖表。

圖26係展示所有CAD之脂類組學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.79；臨限值=0.48；靈敏度=0.82；特異度=0.64；準確度=0.73)。

圖27係提供所有CAD之臨床脂類組學模型之部分依賴圖之十一個臨床變量的一系列圖表。

圖28係展示所有CAD之臨床-脂類組學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.8；臨限值=0.54；靈敏度=0.64；特異度=0.84；準確度=0.74)。

圖29係提供所有CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型之十二個臨床變量之部分依賴圖的一系列圖表。

圖30係展示所有CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.82；臨限值=0.46；靈敏度=0.84；特異度=0.63；準確度=0.74)。

圖31係闡述在懷疑患有動脈粥樣硬化CAD之患者中診斷演算法之示意圖。

圖32係闡述評估患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者的診斷演算法之示意圖。

圖33係展示臨床組之Diamond Forrester得分之盒鬚圖的圖表。

圖34係展示Diamond Forrester得分及A ^nCAD之ROC曲線的圖表(AUC=0.45；臨限值=0.00；靈敏度=1.00；特異度=0.00；準確度=0.62)。

圖35係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.82；臨限值=0.45；靈敏度=0.85；特異度=0.61；準確度=0.76)。

圖36係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.80；臨限值=0.45；靈敏度=0.85；特異度=0.64；準確度=0.77)。

圖37係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.81；臨限值=0.48；靈敏度=0.87；特異度=0.58；準確度=0.76)。

圖38係展示Diamond Forrester得分及A^aCAD之ROC曲線的圖表(AUC=0.45；臨限值=0.00；靈敏度=1.00；特異度=0.00；準確度=0.64)。

圖39係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.83；臨限值=0.40；靈敏度=0.93；特異度=0.50；準確度=0.78)。

圖40係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.80.；臨限值=0.47；靈敏度=0.85；特異度=0.63；準確度=0.77)。

圖41係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.82；臨限值=0.56；靈敏度=0.83；特異度=0.64；準確度=0.76)。

圖42係展示Diamond Forrester得分及S^nCAD之ROC曲線的圖表(AUC=0.45；臨限值=0.94；靈敏度=0.03；特異度=1.00；準確度=0.78)。

圖43係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.73；臨限值=0.45；靈敏度=0.21；特異度=0.96；準確度=0.79)。

圖44係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.76；臨限值=0.42；靈敏度=0.30；特異度=0.96；準確度=0.81)。

圖45係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.67；臨限值=0.90；靈敏度=0.04；特異度=1.0；準確度=0.78)。

圖46係展示Diamond Forrester得分及S ^aCAD之ROC曲線的圖表(AUC=0.45；臨限值=0.94；靈敏度=0.03；特異度=1.00；準確度=0.75)。

圖47係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.78；臨限值=0.51；靈敏度=0.34；特異度=0.94；準確度=0.78)。

圖48係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.78；臨限值=0.54；靈敏度=0.23；特異度=0.97；準確度=0.77)。

圖49係展示

之代謝體學模型之ROC曲線的圖表(AUC=0.74；臨限值=0.74；靈敏度=0.22；特異度=0.96；準確度=0.77)。

動脈粥樣硬化斑塊之起始及進展係動脈粥樣硬化CAD及CHD之臨床表現的根本原因。動脈粥樣硬化之第一步驟及「必要條件」係致動脈粥樣化脂蛋白粒子之滯留，其隨後係補償性、繼發性發炎反應。冠狀動脈壁被單核球及巨噬細胞浸潤產生反饋迴路，其進一步觸發動脈粥樣硬化之進展。冠狀動脈壁中之巨噬細胞啟動致動脈粥樣化脂蛋白粒子之吞噬作用且致動脈粥樣化脂質及脂蛋白之不受控攝取導致巨噬細胞之細胞凋亡及壞死，此產生富脂質壞死核(LRNC)。正是此種狀態之LRNC最易於破裂及侵蝕。動脈粥樣硬化過程之隨後階段涉及藉助鈣化及纖維化修復。

由此斷定以血液為主的生物標記在兩個層面提供對動脈粥樣硬化過程之洞察。首先，以血液為主的生物標記可評估導致動脈粥樣硬化發展之起因；且其次，以血液為主的生物標記可評估結果及對動脈粥樣硬化過程中之初始步驟之反應。

與上文所概述之生物範式相比，動脈粥樣硬化CAD之臨床診斷係基於以群體為基礎之機率驅動之臨床風險分層(圖31)。

臨床診斷演算法取決於臨床風險分層及基於症狀之風險分層。無症狀患者係藉助總體風險得分(例如夫拉明罕風險得分(Framingham Risk Score)或最近開發及介紹之匯總風險估計式(Pooled Risk Estimator))評估。該等總體風險得分試圖估計在一段時期內心血管事件發生之機率，但並非經設計用以診斷動脈粥樣硬化CAD。

彼等基於其症狀懷疑患有動脈粥樣硬化CAD之有症狀患者之臨床評估係由風險得分(例如Diamond-Forrester演算法)驅動。Diamond-Forrester系統基於年齡、性別及胸痛之臨床特徵將患者分至三個類別中之一者以提供阻塞性CAD之前測可能性(低[<15%]，中等[15-85%]或高[>85%])。在具有CAD之低前測可能性之患者中，不建議進行進一步評估。最大之患者群係彼等具有CAD之中等前測可能性者。在此群中，建議實施心肌灌注成像(MPI)研究以評估任何潛在管腔狹窄之血液動力學結果。儘管在該等研究中公佈之靈敏度及特異度係約80%及80%，但MPI之實際準確度遠低於此，其中特異度通常在30%以下(Thomas GS等人，A Blood-Based Gene Expression Test for Obstructive Coronary Artery Disease Tested in Symptomatic Nondiabetic Patients Referred for Myocardial Perfusion Imaging The COMPASS Study.Circulation：Cardiovascular Genetics 2013；6(2)：154-162.)。具有CAD之高前測可能性之患者接受侵入性冠狀動脈造影術以界定管腔狹窄之程度及範圍，且若適當進一步接受經皮或手術血管重建。

重要的是，在此範式中，尚沒有一種診斷方法經設計以診斷動脈粥樣硬化CAD、動脈粥樣硬化斑塊自身之根本原因。然而，在使用特定表現型工具用於檢測動脈粥樣硬化斑塊自身之無偏差、無假設發現研究的情形中，現在可以發現冠狀動脈粥樣硬化症及動脈粥樣硬化斑塊本身之以血液為主的生物標記特徵。

本文所揭示之以血液為主的生物標記允許檢測動脈粥樣硬化斑塊本身且允許疾病之早期診斷並提供顯著改變下游診斷評估及治療過程之機會。

本文所鑑別之以血液為主的生物標記經設計以藉由直接檢測動脈粥樣硬化斑塊來檢測動脈粥樣硬化CAD且經校準以具有高陰性預測值。處於動脈粥樣硬化CAD風險中之無症狀個體或懷疑患有動脈粥樣硬化CAD之有症狀患者係生物標記測試之候選者。若測試為陰性，則此排除動脈粥樣硬化CAD之存在，且不必進行進一步測試。若測試為陽性，則此指示存在動脈粥樣硬化斑塊且存在動脈粥樣硬化CAD，且患者可進行心血管CT或其他非侵入性心血管診斷測試以證實結果。若心血管CT或其他非侵入性心血管診斷測試檢測到非阻塞性斑塊及非阻塞性CAD，則患者被開處醫學療法以治療導致斑塊發展之因素，以阻止或逆轉動脈粥樣硬化CAD之進一步進展。另一方面，若心血管CT檢查或其他非侵入性心血管診斷測試顯示存在阻塞性動脈粥樣硬化斑塊及阻塞性CAD，則患者在有或沒有功能測試之情形下進行侵入性冠狀動脈造影術，以確定斑塊是否造成血液動力學上顯著之狹窄，且若適當可實施冠狀動脈血管重建術。因此，在此範式中，以血液為主的生物標記在確定患者管理中起重要作用。應注意，眾所周知在美國所有侵入性冠狀動脈造影之大約39%顯示無顯著冠狀動脈疾病，且另外約20%具有非阻塞性CAD(Patel M等人，Low Diagnostic Yield of Elective Coronary Angiography.N Engl J Med.2010年3月11日；362(10)：886-95)。陰性或非阻塞性CT血管造影之比例甚至更高；因此，可排除動脈粥樣硬化CAD之存在之以血液為主的生物標記將避免極大量之不必要侵入性及CT冠狀動脈造影及其他非侵入性心血管診斷測試。

此前，代謝體學方法已在CVD之情形中進行嘗試，但未在動脈粥樣硬化CAD之情形中嘗試。Cheng等人已鑑別出與心血管疾病相關聯之具支鏈胺基酸、其他疏水胺基酸、色胺酸分解產物及核苷酸代謝物。(Cheng S等人，Metabolite Profiling Identifies Pathways Associated With Metabolic Risk in Humans/Clinical Perspective.Circulation 2012；125(18)：2222-2231)。並非評估動脈粥樣硬化，Bodi等人已使用心肌缺血作為結果變量來鑑別代謝特徵。(Bodi V、 Sanchis J、Morales JM、Marrachelli VG、Nunez J、Forteza MJ等人，Metabolomic Profile of Human Myocardial Ischemia by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Peripheral Blood Serum：A Translational Study Based on Transient Coronary Occlusion Models.J Am Coll Cardiol 2012；59(18)：1629-1641)。

術語「降低(decrease，降低)」、「減少(reduced,reduction)」或「下調」所有在本文中均通常用以指降低統計顯著量。然而，為避免疑問，「減少(reduced,reduction)」、「降低(decreased,decrease)」意指與參考含量相比降低至少10%，例如降低至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%或高達且包括100%降低(即，與參考樣品相比不存在)，或與參考含量相比介於10%至100%之間之任何降低、或至少約0.5倍、或至少約1.0倍、或至少約1.2倍、或至少約1.5倍、或至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍降低、或與參考含量相比介於1.0倍與10倍之間或更高之任何降低。

術語「增加(increased,increase)」或「上調」所有在本文中均通常用以指增加統計顯著量；為避免任何疑問，術語「增加(increased,increase)」意指與參考含量相比至少10%之增加，例如至少約20%、或至少約30%、或至少約40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%或高達且包括100%增加、或與參考含量相比介於10%與100%之間之增加、或至少約0.5倍、或至少約1.0倍、或至少約1.2倍、或至少約1.5倍、或至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍或至少約10倍增加、或與參考含量相比介於1.0倍與10倍之間或更高之任何增加。

本發明係關於基於某些分析物(在本文中稱為生物標記或分析物生物標記)之含量或發生可用於表徵(例如，臨床評估、診斷、分類、預測、型態分析)動脈粥樣硬化CAD及/或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之方法。如本文所用，含量係指分析物在樣品(例如，血漿或血清樣品)或個體中之量或濃度。而，發生係指在樣品中存在或不存在可檢測分析物。因此，含量係量之連續指標，而發生係分析物之二元指標。在一些情形中，發生可使用臨限值確定，高於其存在生物標記且低於其不存在生物標記。

本文所述之分析物生物標記尤其可以非侵入性方式用於表徵(例如，評估或評估)患有動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體。

本發明係關於可用於表徵動脈粥樣硬化相關代謝失調之複數種生物標記之發現。因此，在一些態樣中，本發明提供包含量測自個體獲得之生物樣品中一組所選分析物生物標記內之每一分析物之含量之方法，其中一組包含複數種分析物生物標記。複數種(至少兩種)之生物標記或代謝物之數量可為2或以上、3或以上、4或以上、5或以上、6或以上、7或以上、8或以上、9或以上、10或以上、11或以上、12或以上、13或以上、14或以上、15或以上、16或以上、17或以上、18或以上、19或以上或20或以上，例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或以上。

本文所述之方法可用於鑑別個體是否患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊。換言之，本文所述之方法可用於測定個體患有動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之機率，該等方法依賴於自個體獲得之分析物生物標記組之相對量中之差異，其中機率係使用本文所述之梯度提升演算法或廣義線性模型測定。

此外，本文所述之方法可用於診斷個體是否患有動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊。如本文所用，診斷包括診斷及輔助診斷二者。因此，其他診斷準則可與方法之結果聯合評估以作出診斷。

根據一些實施例，方法包含測定一組分析物生物標記內每一(即，所有)分析物之量(即，測定含量、量測量或量測含量)。在一些實施例中，下文組中之任一者可進一步包括個體之年齡及/或性別之分析。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：纈胺醯基白胺酸、麩胺酸鹽、埃西索加、尿酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、岩藻糖、丁醯基肉鹼(C4)、甘露糖。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：纈胺醯基白胺酸、麩胺酸鹽、埃西索加、尿酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、岩藻糖、丁醯基肉鹼(C4)、甘露糖。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：埃西索加、鄰甲酚.硫酸鹽、蘇糖酸鹽、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：埃西索加、鄰甲酚.硫酸鹽、蘇糖酸鹽、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、甘胺醯基苯丙胺酸、絲胺醯基白胺酸、岩藻糖。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、甘胺醯基苯丙胺酸、絲胺醯基白胺酸、岩藻糖。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：麩胺酸鹽、埃西索加、纈胺醯基白胺酸、甘露糖、葡萄糖醛酸鹽、尿酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、12.HETE。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：麩胺酸鹽、埃西索加、纈胺醯基白胺酸、甘露糖、葡萄糖醛酸鹽、尿酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、12.HETE。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：鄰甲酚.硫酸鹽、埃西索加、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物、葡萄糖、1.十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)、蘇糖酸鹽。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：鄰甲酚.硫酸鹽、埃西索加、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物、葡萄糖、1.十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)、蘇糖酸鹽。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、甘胺醯基苯丙胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、12.HETE、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、甘胺醯基苯丙胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、12.HETE、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：N.乙醯基蘇胺酸、巴豆醯基甘胺酸、甘油酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽、羥丙二酸鹽(羥基丙二酸鹽化)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：N.乙醯基蘇胺酸、巴豆醯基甘胺酸、甘油酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽、羥丙二酸鹽(羥基丙二酸鹽化)。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：N.乙醯基甘胺酸、3.乙基苯基硫酸鹽。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：N.乙醯基甘胺酸、3.乙基苯基硫酸鹽。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：血清素(5HT)、N.乙醯基腐胺、白胺醯基白胺酸、丙醯基甘胺酸(C3)、膽酸鹽、甘膽烯酸.硫酸鹽、天冬醯胺、3.乙基苯基硫酸鹽。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：血清素(5HT)、N.乙醯基腐胺、白胺醯基白胺酸、丙醯基甘胺酸(C3)、膽酸鹽、甘膽烯酸.硫酸鹽、天冬醯胺、3.乙基苯基硫酸鹽。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：埃西索加、甘露糖、戊醯基肉鹼(C5)、1.亞油醯基.GPE(18.2)、甘胺酸熊去氧膽酸鹽、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：埃西索加、甘露糖、戊醯基肉鹼(C5)、1.亞油醯基.GPE(18.2)、甘胺酸熊去氧膽酸鹽、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：N.乙醯基甘胺酸、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、3.乙基苯基硫酸鹽、柳酸鹽。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：N.乙醯基甘胺酸、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、3.乙基苯基硫酸鹽、柳酸鹽。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：天冬醯胺、牛磺酸、埃西索加、1.油醯基甘油(18：1)、膽固醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、6.側氧基六氫吡啶.2.甲酸、丙醯基甘胺酸(C3)。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：天冬醯胺、牛磺酸、埃西索加、1.油醯基甘油(18：1)、膽固醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、6.側氧基六氫吡啶.2.甲酸、丙醯基甘胺酸(C3)。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：纈胺醯基白胺酸、異白胺醯基纈胺酸、麩醯胺酸-白胺酸、X-12212、葡萄糖醛酸鹽及麩胺酸鹽。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：纈胺醯基白胺酸、異白胺醯基纈胺酸、麩醯胺酸-白胺酸、X-12212、葡萄糖醛酸鹽及麩胺酸鹽。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：葡萄糖、γ-麩胺醯基轉移酶、尿酸、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、脂蛋白(a)質量、鹼性磷酸酶及脂蛋白元B。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：葡萄糖、γ-麩胺醯基轉移酶、尿酸、低密度脂蛋白膽固醇、甘油三酯、脂蛋白(a)質量、鹼性磷酸酶及脂蛋白元B。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：麩胺酸鹽、X-16132、異白胺醯基丙胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、脂蛋白(a)質量、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、X-12212、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ ID NO：1)、麩醯胺酸.白胺酸及蘇胺醯基白胺酸。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：麩胺酸鹽、X-16132、異白胺醯基丙胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、脂蛋白(a)質量、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、X-12212、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ ID NO：1)、麩醯胺酸-白胺酸及蘇胺醯基白胺酸。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：CER22.1、HexCER18：1、TG15：0、SM16：0、CER20：0、DHC20：1及 CER18：0。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：CER22.1、HexCER18：1、TG15：0、SM16：0、CER20：0、DHC20：1及CER18：0。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：CER20：0、脂蛋白元B、SM16：0、脂蛋白(a)質量、DHC20L1、鹼性磷酸酶及CER18：0。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：CER20：0、脂蛋白元B、SM16：0、脂蛋白(a)質量、DHC20L1、鹼性磷酸酶及CER18：0。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：麩胺酸鹽、X-16132、異白胺醯基丙胺酸、脂蛋白(a)質量、X-12212及麩醯胺酸-白胺酸。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：麩胺酸鹽、X-16132、異白胺醯基丙胺酸、脂蛋白(a)質量、X-12212及麩醯胺酸-白胺酸。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：oleic2、N端腦鈉肽前體、脂蛋白(a)質量、胰島素、糖化血紅素A1C、cismontaotl、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、behenic2、脂聯素及γ-麩胺醯基轉移酶。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：oleic2、N端腦鈉肽前體、脂蛋白(a)質量、胰島素、糖化血紅素A1C、cismontaotl、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、behenic2、脂聯素及γ-麩胺醯基轉移酶。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：異白胺醯基丙胺酸、葡萄糖醛酸鹽、甘胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、甘露糖、X-21452、1-油醯基甘油基磷酸甘油、X-21335、7-甲基黃嘌呤、X-12729、埃西索加、α-羥基異戊醯基肉鹼、2-胺基己二酸鹽、X-18914、巴豆醯基甘胺酸及吡哆醛。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：異白胺醯基丙胺酸、葡萄糖醛酸鹽、甘胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、甘露糖、X-21452、1-油醯基甘油基磷酸甘油、X-21335、7-甲基黃嘌呤、X-12729、埃西索加、α-羥基異戊醯基肉鹼、2-胺基己二酸鹽、X-18914、巴豆醯基甘胺酸及吡哆醛。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：異白胺醯基丙胺酸、甘胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、oleic2、X-21335、甲基黃嘌呤、胺基己二酸鹽、甘露糖、埃西索加、花生四烯醯基.GPE.20.4及甘油三酯。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：異白胺醯基丙胺酸、甘胺酸、異白胺醯基苯丙胺酸、oleic2、X-21335、甲基黃嘌呤、胺基己二酸鹽、甘露糖、埃西索加、花生四烯醯基.GPE.20.4及甘油三酯。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：DHC18：0、DG18：1n9、總二醯基甘油、TG20：3n9、CE20：4n6、CER18：1、DHC20：1、CE18：2n6、PL18：2n6、SM18：0、FA14：1n5、PL15：0及CE16：0。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：DHC18：0、DG18：1n9、總二醯基甘油、TG20：3n9、CE20：4n6、CER18：1、DHC20：1、CE18：2n6、PL18：2n6、SM18：0、FA14：1n5、PL15：0及CE16：0。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：糖化血紅素A1C、總二醯基甘油、cismontotl、脂蛋白(a)質量、TG20.3n9、oleic2、DHC18.1、N端腦鈉肽前體、γ-麩胺醯基轉移酶及CER18。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：糖化血紅素A1C、總二醯基甘油、cismontotl、脂蛋白(a)質量、TG20.3n9、oleic2、DHC18.1、N端腦鈉肽前體、γ-麩胺醯基轉移酶及CER18。

在一些實施例中，該等分析物係選自由以下組成之群：異白胺醯基丙胺酸、甘胺酸、cismontotl、脂蛋白(a)質量、X-21452、異白胺醯基苯丙胺酸、糖化血紅素A1C、X-21335、X7.甲基黃嘌呤、埃西索加及X-12729。因此，在一些實施例中，本文所揭示之方法包含量測樣品中以下分析物之含量：異白胺醯基丙胺酸、甘胺酸、cismontotl、脂蛋白(a)質量、X-21452、異白胺醯基苯丙胺酸、糖化血紅素A1C、X-21335、X7.甲基黃嘌呤、埃西索加及X-12729。

因此，在代表性實施例中，本發明提供在個體中評估患有ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體的方法，該方法包含(a)自人類個體獲得血漿或血清樣品；(b)測定來自一組分析物生物標記之每一分析物之量；(c)將生物樣品中分析物之相對量與對照樣品中分析物之相對量比較；及(d)若生物樣品中分析物之相對量相對於對照樣品中分析物之量增加或降低，則測定個體具有冠狀動脈粥樣硬化症或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之機率。

在一個態樣中，本發明提供在個體中評估患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體的方法，該方法包含量測自個體獲得之生物樣品中一組所選分析物生物標記內每一分析物之含量。在一些實施例中，該方法量測來自一組分析物生物標記之一或多種分析物之含量，其中該組分析物生物標記係選自由以下組成之群：(i)纈胺醯基白胺酸、麩胺酸鹽、埃西索加、尿酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、岩藻糖、丁醯基肉鹼(C4)、甘露糖；(ii)埃西索加、鄰甲酚.硫酸鹽、蘇糖酸鹽、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物；(iii)N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、甘胺醯基苯丙胺酸、絲胺醯基白胺酸、岩藻糖； (iv)麩胺酸鹽、埃西索加、纈胺醯基白胺酸、甘露糖、葡萄糖醛酸鹽、尿酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、12.HETE；(v)鄰甲酚.硫酸鹽、埃西索加、半胱胺酸.麩胱甘肽.二硫化物、葡萄糖、1.十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)、蘇糖酸鹽；(vi)N.乙醯基苯丙胺酸、N.乙醯基白胺酸、甘胺醯基苯丙胺酸、纈胺醯基白胺酸、木糖醇、12.HETE、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)；(vii)N.乙醯基蘇胺酸、巴豆醯基甘胺酸、甘油酸鹽、戊醯基肉鹼(C5)、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽、羥丙二酸鹽(羥基丙二酸鹽化)；(viii)N.乙醯基甘胺酸、3.乙基苯基硫酸鹽；(viv)血清素(5HT)、N.乙醯基腐胺、白胺醯基白胺酸、丙醯基甘胺酸(C3)、膽酸鹽、甘膽烯酸.硫酸鹽、天冬醯胺、3.乙基苯基硫酸鹽；(x)埃西索加、甘露糖、戊醯基肉鹼(C5)、1.亞油醯基.GPE(18.2)、甘胺酸熊去氧膽酸鹽、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、柳酸鹽；(xi)N.乙醯基甘胺酸、蘇糖酸鹽、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、3.乙基苯基硫酸鹽、柳酸鹽；(xii)天冬醯胺、牛磺酸、埃西索加、1.油醯基甘油(18：1)、膽固醇、2.羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、6.側氧基六氫吡啶.2.甲酸、丙醯基甘胺酸(C3)。

在一些實施例中，任一組之分析慮及個體之年齡及/或性別。

在一個態樣中，本發明提供在個體中評估患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體的方法，該方法包含量測自個體獲得之生物樣品中一組所選分析物生物標記內每一分析物之含量。在一些實施例中，該方法量測來自一組分析物生物標記之一或多種分析物之含量，，其中該組分析物生物標記選自由以下組成之群：(xiii)linoleic2、脂蛋白(a)膽固醇、脂蛋白元B、鹼性磷酸酶、脂蛋白(a)質量、MHDM2、B.植固醇、菜油固醇、脂蛋白(a)質量、γ-麩胺醯基轉移酶、palmleic2、葡萄糖、胰島素原、膽固醇、魚油、高敏C反應蛋白、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、尿酸、低密度脂蛋白膽固醇、胰島素、甘油三酯及維生素D；(xiv)1-肉豆蔻醯基甘油(14：0)、甘油3-磷酸酯(G3P)、絲胺醯基白胺酸、1-十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)、甘胺酸、可可鹼、1-油醯基甘油(18：1)、甘胺醯基色胺酸、蘇糖酸鹽、1-油醯基甘油基磷酸甘油、胍琥珀酸鹽、蘇胺醯基白胺酸、1-油醯基-GPC(18：1)、組胺醯基苯丙胺酸、巴豆醯基甘胺酸、1-硬脂醯基甘油基磷酸甘油、羥基丁醯基肉鹼、色胺醯基苯丙胺酸、2-胺基辛酸鹽、咪唑乳酸鹽、尿酸鹽、2-花生四烯醯基-GPE(20：4)、咪唑丙酸鹽、纈胺醯基甘胺酸、2-二十二碳六烯醯基甘油磷酸乙醇胺、吲哚丙酸鹽、纈胺醯基異白胺酸、2-羥基丁酸鹽(AHB)、異丁醯基甘胺酸(C4)、纈胺醯基白胺酸、2'-去氧尿苷、異白胺醯基丙胺酸、X-12212、3 7-二甲基尿酸鹽、異白胺醯基甘胺酸、X-12472、3-乙基苯基硫酸鹽、異白胺醯基異白胺酸、X-12524、丙酸3-羥基-2-乙酯、異白胺醯基白胺酸、X-12544、3-甲基-2-側氧基丁酸鹽、異白胺醯基苯丙胺酸、X-12824、3-甲基戊二醯基肉鹼-1、異白胺醯基纈胺酸、X-14056、3-甲基黃嘌呤、白胺醯基甘胺酸、X-14291、4-羥基苯基乙酸鹽、白胺醯基絲胺酸、X-15245、7-甲基尿酸鹽、甘露糖、X-16129、7-甲基黃嘌呤、甲基哌喃糖苷(α+β)、X-16132、埃西索加、甲基吲哚-3-乙酸鹽、X-17178、ADSGEGDFXAEGGGVR(SEQ ID NO：1)、N2_,N2-二甲基鳥苷、X- 21289、α-麩胺醯基酪胺酸、N4-乙醯基胞苷、X-21335、α-羥基異戊醯基肉鹼、N-乙醯基丙胺酸、X-21365、α-酮基丁酸鹽、N-乙醯基-β-丙胺酸、X-21452、α-酮基戊二酸鹽、N-乙醯基腐胺、X-21626、天冬醯胺、N-乙醯基蘇胺酸、X-21662、肉鹼、N-乙醯基纈胺酸、黃嘌呤、1-肉豆蔻醯基甘油(14：0)、甘油3-磷酸酯(G3P)、絲胺醯基白胺酸、1-十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)、甘胺酸、可可鹼、1-油醯基甘油(18：1)、甘胺醯基色胺酸、蘇糖酸鹽、1-油醯基甘油基磷酸甘油、胍琥珀酸鹽、蘇胺醯基白胺酸、1-油醯基-GPC(18：1)、組胺醯基苯丙胺酸、巴豆醯基甘胺酸、1-硬脂醯基甘油基磷酸甘油、羥基丁醯基肉鹼、色胺醯基苯丙胺酸、2-胺基辛酸鹽、咪唑、乳酸鹽及尿酸鹽；(xv)CE16：1n7、DG16：0、DHC20：1、HexCER16：0、SM16：0、CE18：2n6、DG18：0、DHC24：0、HexCER18：1、SM20：1、CE20：4n6、DG18：1n9、DHC24：1、LacCER16：0、TG15：0、CER18：0、DG20：3n9、FA18：3n6、PL15：0、TG16：0、CER20：0、DHC18：0、FA20：3n6、PLdm16：0、總三酸甘油酯、CER22：1、DHC18：1、HexCER14：0及PLdm18：1n9；(xvi)糖化血紅素A1C、脂蛋白(a)質量、nervonic2、B.植固醇、脂聯素、甘油三酯、ω6總、behenic2、菜油固醇、N端腦鈉肽前體、oleic2、鏈固醇、palmleic2、cismontotl、γ-麩胺醯基轉移酶、胰島素原、葡萄糖、小而密的低密度脂蛋白膽固醇、transpalm2、高密度脂蛋白膽固醇、尿酸、高密度脂蛋白組份3、胰島素、維生素D、linoleic2、脂蛋白(a)膽固醇及MHDM2；(xvii)1-3-二甲基尿酸鹽、甘油3-磷酸酯(G3P)、焦麩胺醯基麩醯胺酸、1 7-二甲基尿酸鹽、甘胺酸、焦麩胺醯基甘胺酸、12-HETE、甘胺醯基苯丙胺酸、丙酮酸鹽、1-亞油醯基-GPE(18：2)、甘胺醯基色胺酸、S-腺苷基高半胱胺酸(SAH)、1-甲基尿酸鹽、胍琥珀酸鹽、柳酸鹽、1-十九碳烷醯基甘油磷酸膽鹼(19：0)、己醯基肉鹼(C6)、絲胺醯基白胺酸、1-油醯基甘油(18：1)、組胺醯基苯丙胺酸、琥珀醯基肉鹼(C4)、1-油醯基甘油基磷酸甘油、高水蘇鹼(homostachydrine)、蘇糖酸鹽、2-胺基己二酸鹽、羥基丁醯基肉鹼、蘇胺醯基白胺酸、2-胺基丁酸鹽、咪唑丙酸鹽、百里酚硫酸鹽(thymol sulfate)、2-胺基辛酸鹽、吲哚丙酸鹽、巴豆醯基甘胺酸、2-花生四烯醯基-GPE(20：4)、異丁醯基甘胺酸(C4)、色胺醯基甘胺酸、2-二十二碳六烯醯基甘油磷酸乙醇胺、異白胺醯基丙胺酸、色胺醯基苯丙胺酸、2-羥基丁酸鹽(AHB)、異白胺醯基甘胺酸、酪胺醯基麩醯胺酸、2-羥基馬尿酸鹽(柳基尿酸鹽)、異白胺醯基異白胺酸、尿酸鹽、2-亞油醯基-GPE(18：2)、異白胺醯基白胺酸、戊醯基肉鹼(C5)、2'-去氧尿苷、異白胺醯基苯丙胺酸、纈胺醯基甘胺酸、3-乙基苯基硫酸鹽、異戊醯基甘胺酸、纈胺醯基異白胺酸、3-羥基異丁酸鹽、犬尿胺酸、纈胺醯基白胺酸、3-甲基-2-側氧基丁酸鹽、白胺醯基天冬胺酸鹽、纈胺醯基纈胺酸、3-甲基戊二醯基肉鹼-1、白胺醯基甘胺酸、X-11429、3-甲基戊二醯基肉鹼-2、白胺醯基絲胺酸、X-11444、3-甲基黃嘌呤、離胺醯基白胺酸、X-11787、4-羥基苯基乙酸鹽、甘露糖、X-11945、5α-雄固烷基-3β 17β-二醇單硫酸酯2、甲基哌喃糖苷(α+β)、X-12212、7-甲基尿酸鹽、甲基吲哚-3-乙酸鹽、X-12472、7-甲基黃嘌呤、N2 N2-二甲基鳥苷、X-12729、乙醯基肉鹼(C2)、N4-乙醯基胞苷、X-12824、埃西索加、N6-胺甲醯基蘇胺醯基腺苷、X-14056、ADSGEGDFXAEGGGVR、N-乙醯基丙胺酸、X-15245、α-麩胺醯基酪胺酸、N-乙醯基甘胺酸、X-15492、α-羥基異戊醯基肉鹼、N-乙醯基異白胺酸、X-16129、α-酮基丁酸鹽、N-乙醯基神經胺糖酸、X-16132、α-酮基戊二酸鹽、N-乙醯基蘇胺酸、X-17178、β-生育酚、N- 乙醯基纈胺酸、X-17690、丁醯基肉鹼(C4)、N-甲基脯胺酸、X-18914、肉鹼、辛醯基肉鹼(C8)、X-18922、半胱胺酸-麩胱甘肽二硫化物、油酸乙醇醯胺、X-19438、胞苷、O-磺基-L-酪胺酸、X-21289、岩藻糖、苯基丙胺醯基天冬胺酸鹽、X-21335、γ-麩胺醯基異白胺酸、脯胺醯基苯丙胺酸、X-21365、γ-麩胺醯基纈胺酸、丙醯基肉鹼(C3)、X-21367、葡萄糖、丙醯基甘胺酸(C3)、X-21452、葡萄糖醛酸鹽、假尿苷、X-21471、麩胺酸鹽、吡哆醛、X-21626、麩醯胺酸-白胺酸、吡哆酸鹽及黃嘌呤；及(xvii)CE16：0、DG18：0、DHC18：1、DHC26：1、PL24：0、CE16：1n7、DG18：1n9、DHC20：0、FA14：1n5、SM18：0、CE18：1n9、DG20：0、DHC20：1、PL15：0、TG15：0、CE18：2n6、DG20：2n6、DHC22：1、PL18：2n6、TG20：3n9、CE20：4n6、DG20：3n9、DHC24：1、PL20：3n9、總二醯基甘油、CER18：0、DHC18：0、DHC26：0、PL20：4n6、總三酸甘油酯及CER18：1。

如本文所用，術語「測定每一分析物之量」係指測定本文所提及樣品中所包含之至少一種代謝物之至少一種特性特徵。根據本發明之特性特徵係表徵代謝物之物理及/或化學性質(包括生物化學性質)之特徵。該等性質包括(例如)分子量、黏度、密度、電荷、自旋、光學活性、元素組成、化學結構、與其他化合物反應之能力、在生物讀出系統中引發反應之能力(例如，誘導報導基因)及諸如此類。該等性質之值可作為特性特徵且可藉由此項技術中熟知之技術測定。此外，特性特徵可係藉由標準操作(例如數學計算，例如乘法、除法、梯度提升、廣義線性建模或對數計算)衍生自代謝物之物理及/或化學性質之值之任一特徵。最佳地，該至少一種特性特徵允許確定及/或化學鑑別該至少一種代謝物。

生物樣品所包含之分析物可根據本發明定量或定性地測定。對於定性測定，代謝物之存在或不存在將由適宜技術測定。此外，定性測定較佳可包括測定代謝物之化學結構或組成。對於定量測定，將較佳地基於用於確定本文上文所提及特性特徵之值來測定生物樣品中所存在分析物之精確量或將測定分析物之相對量。在不能或不應測定代謝物之精確量之情形中，可測定相對量。在該情形中，可測定分析物存在之量關於以第二量包含該(等)分析物之第二樣品而言增加還是降低。因此，定量分析分析物亦包括有時稱為代謝物之半定量分析者。

通常，分析物含量係藉由量測體液(臨床樣品)(例如，血液、血清、血漿或尿液)中之代謝物含量來測定。含量可藉由(例如)以下測定：質譜(MS)、ELISA、免疫分析、酶分析、分光光度法、比色法、螢光法、細菌分析、化合物分離技術或其他已知測定分析物之存在及/或數量之技術。

化合物分離技術產生樣品所包含分析物之時間解析分離。適用於所用分離之技術包括(例如)所有層析分離技術，例如液相層析(LC)、高效液相層析(HPLC)、氣相層析(GC)、薄層層析、大小排除或親和力層析。該等技術已為此項技術熟知且由熟習此項技術者應用。在一些實施例中，該等方法利用LC及/或GC層析技術，包括(例如)氣相層析質譜(GC-MS)、液相層析質譜(LC-MS)、液相層析-串聯質譜(UPLC-MS/MS)、直接注入質譜或傅立葉(Fourier)變換離子-回旋-共振質譜(FT-ICR-MS)、毛細管電泳質譜(CE-MS)、高效液相層析耦聯質譜(HPLC-MS)、四極質譜、任何順序耦合質譜(例如，MS-MS或MS-MS-MS)、感應耦合電漿質譜(ICP-MS)、熱解質譜(Py-MS)、離子移動率質譜或飛行時間質譜(TOF)。在一些實施例中，LC-MS及/或GC-MS。作為質譜技術之替代或除質譜技術以外，可使用以下技術用於化合物測定：核磁共振(NMR)、核磁共振成像(MRI)、傅立葉轉變紅外分析(FT-IR)、紫外線(UV)光譜、折射率(RI)、螢光檢測、放射化學檢測、電化學檢測、光散射(LS)、色散型拉曼光譜或火焰離子化檢測(FID)。該等技術已為熟習此項技術者熟知且可不費周折地應用。在一些實施例中，將視情況藉由自動化來輔助本文所揭示之方法。舉例而言，可由機器人來自動化樣品處理或預處理。可藉由適宜電腦程式及資料庫來輔助資料處理及比較。本文所述之自動化允許在高通量方法中使用本發明方法。

「測定」方法包括(例如)將臨床樣品發送至商業實驗室用於量測或使用市售分析套組。市售分析套組已為業內已知。舉例而言，Quest Diagnostics、Sigma Aldrich、CATACHEM公司、Eton Bioscience公司及Bio Vision Research Products係該等分析之實例性供應商。實例性套組及供應商對熟習此項技術者將顯而易見。

在一些情形中，本文所述之方法涉及將含量或存在於參考相比較。參考可採用各種形式。在一些情形中，參考包含複數種分析物之預定值(例如，複數種分析物中之每一者)。預定值可採用各種形式。其可係分析物之含量或存在，該分析物係自已知患有動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體(例如，有症狀個體)獲得、或自已知未罹患動脈粥樣硬化CAD或已知不具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體(例如，無症狀個體)獲得。其可係自沒有冠狀動脈疾病既往病史之個體獲得之分析物之含量或存在。其可係同一個體(例如)在不同時間點之含量或存在。代表分析物之含量的預定值在本文中係指預定含量。預定含量可係單一截止值，例如中值或平均值。其可係截止值(或臨限值)之範圍，例如信賴區間。其可基於比較群組建立，例如其中一個所定義群組中之風險比另一所定義群組中之風險高或低1倍(例如，大約2倍、4倍、8倍、16倍或以上)。其可係範圍，例如個體群體(例如，對照個體)均等地(或不均等地)分成若干群組(例如低風險群組、中等風險群組及高風險群組)或分成四分位，最低四分位係具有最低風險之個體且最高四分位係具有最高風險之個體，或分成n個分位數(即，n個規則間隔開之間隔)，n個四分數中之最低者係具有最低風險之個體且n個分位數中之最高者係具有最高風險之個體。此外，參考可係個體群體(包含所研究個體)之分析物之相對或絕對量的計算參考、最佳地平均值或中值。該群體之該等個體之分析物的相對或絕對量可如本文其他地方所指明來測定。如何計算適宜參考值、較佳地平均值或中值已為此項技術熟知。先前所提及之個體群體應包含複數個個體、較佳至少5、10、50、100、1,000個個體。應理解，欲藉由本發明方法診斷之個體及該複數個個體中之個體係相同物種。

與預定值相關聯之個體通常稱為對照個體(或對照)。對照個體不具有動脈粥樣硬化或動脈粥樣硬化CAD。在一些情形中，可期望對照個體係有症狀個體，且在其他情形中，可期望對照個體係無症狀個體。因此，在一些情形中，個體中分析物之含量大於或等於對照個體中分析物之含量指示臨床狀態(例如，指示CAD診斷)。在其他情形中，個體中分析物之含量小於或等於對照個體中分析物之含量指示臨床狀態。更一般而言，預定義分析物群組之升高及降低含量之組合指示臨床狀態。更大之量及更小之量通常具有足夠量值以(例如)促進使用所揭示方法來區分個體與對照個體。通常，大於或小於足以區分個體與對照個體係統計學上顯著大於或統計學上顯著小於。在其中個體中之分析物之含量等於中對照個體之代謝物之含量指示臨床狀態之情形中，「等於」係指大約相等(例如，沒有統計上的差異)。

預定值可取決於所選個體(例如，人類個體)之具體群體。舉例而言，明顯健康之群體將具有不同於具有或可能具有動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體群體之代謝物「正常」範圍。因此，所選預定值可慮及個體(例如，人類個體)所屬之類別(例如，健康、有風險、患病、年齡、性別等)。適當範圍及類別可由彼等熟習此項技術者僅僅利用例行試驗來選擇。在一些情形中，生物標記之預定值係健康個體(人類個體)(例如，不具有CAD之明顯跡象及症狀之人類個體)之群體的平均值。當然，預定值將取決於所選具體分析物(生物標記)且甚至取決於個體所屬群體之特徵。在表徵可能性或風險中，可建立若干預定值。

在一些實施例中，含量自身可係反映兩種狀態間之含量的比較之相對含量。反映兩種狀態(例如，健康及患病)間之含量的比較(例如，比率、差異、對數差、變化百分比等)之相對含量可稱為δ值。相對含量之使用在一些情形中係有益的，此乃因在一定程度上其排除量測相關變化(例如，實驗室人員、實驗室、量測裝置、試劑批號/製劑、分析套組等)。然而，本發明不限於此。

分析物含量及/或參考含量可儲存於適宜資料儲存媒體(例如，資料庫)中且因此亦可用於未來診斷。此亦允許有效診斷疾病之盛行率，此乃因一旦經證實(在未來)自其獲得相應參考樣品之個體確實具有CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊，即可在資料庫中鑑別適宜參考結果。如本文所用，「資料庫」包含收集於適宜儲存媒體上之資料(例如，分析物及/或參考含量資訊及/或患者資訊)。此外，資料庫可進一步包含資料庫管理系統。資料庫管理系統較佳係基於網路之階層式或物件導向資料庫管理系統。更佳地，資料庫將作為分散式(聯邦)系統(例如，客戶端-伺服器-系統)來執行。更佳地，資料庫之結構係允許搜尋演算法，以將測試資料集與由資料收集所包含之資料集相比較。特定地，基於使用此一演算法，可針對指示動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之類似或相同資料集對資料庫進行搜尋(例如查詢搜尋)。因此，若在資料收集中可鑑別相同或類似資料集，則測試資料集將與動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊相關聯。因此，自資料收集獲得之資訊可用於診斷CAD或基於自個體獲得之測試資料集。更佳地，資料收集包含以上所列舉群組中之任一者所包含之所有分析物的特徵值。

在一些實施例中，本文所揭示之方法進一步包含修改個體之臨床記錄以鑑別個體患有或不患有動脈粥樣硬化冠狀動脈疾病、或具有或不具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊。臨床記錄可儲存在任何適宜資料儲存媒體(例如，電腦可讀媒體)中。

本發明亦提供用於評估個體中之分析物生物標記之套組。本發明之套組可採取各種形式。通常，套組將包括適於測定樣品中複數種分析物生物標記(例如，彼等本文所揭示者)之試劑。視情況，套組可含有一或多種對照樣品。通常，個體中生物標記之含量與對照樣品中生物標記之含量間之比較指示臨床狀態(例如，患有動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之診斷或可能性)。同樣，在一些情形中，套組將包括提供參考(例如，預定值)之書面資訊(標記(indicia))，其中個體與參考(預定值)中生物標記之量間的比較指示臨床狀態。在一些情形中，套組包含可用於將生物標記含量或存在與參考比較之軟體(例如，預測模型)。通常，軟體將以電腦可讀格式(例如光碟)提供，但其亦可用於經由網際網路下載。然而，套組並不限於此且其他變化對熟習此項技術者將顯而易見。

本發明亦可基於與CAD相關之某些分析物之出現或含量用於針對個體選擇治療及/或確定治療計劃。在一些實施例中，使用本文所揭示之方法，健康照護提供者(例如，醫師)鑑別個體是否患有動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊或具有患動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之風險，且基於此鑑別，健康照護提供者確定針對個體之充分管理計劃。在一些實施例中，使用本文所揭示之方法，健康照護提供者(例如，醫師)基於自個體獲得之臨床樣品中某些分析物之出現或含量及/或基於自個體獲得之臨床樣品之類別診斷個體患有動脈粥樣硬化CAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊。借助此診斷，健康照護提供者確定針對個體之充分治療或治療計劃。在一些實施例中，該等方法進一步包括將治療投與個體。

在一些實施例中，本發明係關於鑑別可能利用具體藥物劑量、調配物及/或投與模式成功治療之個體。其他實施例包括使用本發明之代謝體學型態分析方法評估藥物之效能。在一些實施例中，代謝體學型態分析方法可用於鑑別可能利用具體藥物或治療方案成功治療之個體。舉例而言，在藥物或治療之研究(例如，臨床研究)期間，具有CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體可對該藥物或治療反應良好，且其他可不反應。治療效能中之不一致與許多變量相關聯，例如個體中之遺傳變異。在一些實施例中，基於本文所揭示之代謝體學型態分析方法對群體中之個體進行分層。在一些實施例中，所得層進一步基於各種流行病學及/或臨床因子(例如，對特定治療之反應)進行評估。在一些實施例中，基於代謝輪廓鑑別之層反映可預見地對某些治療反應(例如，具有預定反應)之個體的子群體。在其他實施例中，樣品係自已經歷所測試藥物及對治療具有預定反應之個體獲得。在一些情形中，參考可自來自該等樣品之所有或一部分分析物建立以(例如)提供參考代謝輪廓。然後可針對參考評估(例如，使用預測模型)所測試樣品並基於治療成功還是不成功進行分類。測試治療(例如，化合物、藥物及生活方式改變)之公司及/或個人可辨別關於治療最有用之CAD之類型或亞型之更精確資訊。此資訊亦幫助健康護理提供者確定針對個體之最佳治療計劃。

在一些實施例中，用於動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之治療係向個體投與包含治療有效量之治療劑及/或指示個體採取至少一種治療性生活方式改變(例如，改變飲食或運動)。適於治療CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之治療性化合物已為此項技術熟知且一些揭示於本文中。非限制性實例包括史他汀類、膽固醇吸收抑制劑、菸酸衍生物、ω-3-脂肪酸化合物、膽汁酸鉗合劑、PCSK9拮抗劑、抗血小板劑及阿斯匹林。用以改良心血管健康之適當生活方式改變已為此項技術熟知。非限制性實例包括增加體育活動、限制熱能攝入、營養膳食計劃及減重。然而，本發明並不受限於此且其他治療對熟習此項技術者將顯而易見。

當投與治療劑或其他治療時，以有效治療CAD或降低未來CAD或CAD事件之可能性(或風險)之量投與。有效量係治療劑足以提供醫學上期望結果之劑量。有效量將隨所治療之具體病況、所治療個體之年齡及身體狀況、病況之嚴重性、治療之持續時間、並行療法(若有)之性質、特定投與途徑及在健康照護人員之知識及專業知識內之類似因素而變。舉例而言，有效量可取決於個體具有指示動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之某些分析物(例如，本文所述之分析物)之異常含量到何種程度。應瞭解，本發明之治療劑用於治療及/或預防動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊。因此，在一些情形中，其可預防性地用於處於發展動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體中。因此，在一些情形中，有效量係可降低發展動脈粥樣硬化CAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之風險、減慢或可能完全阻止其發展之量。應認識到，當治療劑用於嚴重情形時，其用於防止一或多種通常自該等不良事件產生之醫學上不期望之結果。選擇適宜治療及其適當劑量之方法對於熟習此項技術者將顯而易見。

本發明進一步提供分析結果或診斷或二者至(例如)專門人員、醫師或患者之傳達。在某些實施例中，將使用電腦以將分析結果或診斷或二者傳達至利害關係人(例如醫師及其患者)。在一些情形中，方法進一步包含提供患者狀態(即患有或不患有ASCAD或存在或不存在冠狀動脈粥樣硬化斑塊)作為報告進行傳達。因此，在一些情形中，目標方法可進一步包括生成或輸出提供目標方法之結果之報告的步驟，該報告可以電子媒體之形式(例如，電腦監視器上之電子顯示器)或以有形媒體之形式(例如，列印於紙或其他有形媒體上之報告)提供。可提供任何形式之報告，例如，如此項技術中已知者。在本發明之一些實施例中，基於測試個體中存在或不存在表30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50之任何生物標記之診斷在獲得診斷後儘可能快的傳達至個體。診斷可由個體之治療醫師傳達至該個體。或者，診斷可藉由電子郵件發送至測試個體或藉由電話傳達至個體。診斷可以報告之形式發送至測試個體。電腦可用於藉由電子郵件或電話傳達診斷。在某些實施例中，可生成含有診斷測試結果之信息並使用熟習電信技術者所熟悉之電腦硬體及軟體之組合自動遞送至個體。

如本文所述，「報告」係電子或有形文件，其包括提供關於診斷評估、預後評估、治療評估、監測評估等及其結果之感興趣資訊之報告元素。個體報告可完全或部分地以電子形式生成。個體報告包括至少個體評估，例如關於個體是否具有患ASCAD或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之高可能性之診斷診斷；或預後評估，例如患者對療法之反應性的預測；及/或建議應遵循之療程。個體報告可進一步包括以下中之一或多者：1)關於測試設備之資訊；2)服務提供者資訊；3)個體資料；4)樣品資料；5)評估報告，其可包括各種資訊，包括：a)測試資料，該測試資料可包括i)一或多種生物標記之生物標記含量；及/或ii)一或多組本文所述生物標記之生物標記特徵。

報告可包括關於測試設備之資訊，該資訊與實施樣品搜集及/或資料產生之醫院、診療所或實驗室相關。此資訊可包括關於(例如)以下之一或多個細節：測試設備之名稱及位置、實施分析及/或錄入輸入資料之實驗室技術員的身份、實施及/或分析該分析之日期及時間、樣品及/或結果資料儲存之位置、分析中所用試劑(例如，套組等) 之批號及諸如此類。具有此資訊之報告欄通常可使用由使用者所提供之資訊填入。

報告可包括關於服務提供者之資訊，該服務提供者可位於使用者所處健康照護機構外部或在該健康照護機構內。該資訊之實例可包括服務提供者之名稱及位置、審查者之名稱及若需要或期望實施樣品搜集及/或資料產生之個體的名稱。具有此資訊之報告欄通常可使用由使用者所提供之資料填入，其可自預設選項(例如，使用下拉式選項單)中選擇。報告中之其他服務提供者資訊可包括用於關於結果及/或關於解釋性報告之技術資訊的聯絡資訊。

報告可包括個體資料部分，包括個體病歷以及管理個體資料(亦即，對診斷、預後或治療評估而言並非必需之資料)，例如關於鑑別個體之資訊(例如，姓名、個體出生日期(DOB)、性別、郵件及/或居住地址、病歷編號(MRN)、健康照護機構中之房間及/或床編號、保險資訊及諸如此類)、開立易感性預測之個體之醫師或其他健康專業人員的姓名及(若不同於開單醫師)負責個體照護之主治醫師(例如，主要照護醫師)之姓名。

報告可包括樣品資料部分，其可提供關於所分析生物樣品之資訊，例如自個體獲得之生物樣品之來源(例如血液，例如全血、經分離血液、血漿、血清等)、樣品如何處置(例如儲存溫度、準備方案)及收集之日期及時間。具有此資訊之報告欄通常可使用由使用者錄入之資料填入，其一些可作為預設選項(例如，使用下拉式選項單)提供。

亦應易於理解，該等報告可包括額外元素或經修改元素。舉例而言，在電子報告之情況中，該報告可含有指向內部或外部資料庫之超鏈接，該等資料庫提供關於報告之所選元素之更詳細資訊。舉例而言，報告之患者資料元素可包括至電子患者記錄之超鏈接、或用於存取此一患者記錄之網站，該患者記錄係維持在機密資料庫中。此後一實施例可係院內系統或診療所內設置感興趣的。當報告呈電子格式時，報告記錄於適宜實體媒體上，例如電腦可讀媒體，例如在電腦記憶體、壓縮磁碟、CD、DVD、快閃驅動器等中。

將易於理解，報告可包括所有或一些以上元素，前提條件係該報告通常包括至少足以提供使用者所請求之分析(例如，診斷、預後或對療法之反應性的預測)之元素。

本文所述之方法可在臨床試驗中用於自患者收集之樣品且測試結果與患者結果聯合使用以確定可能對新藥顯示比整個群或其他子群更多或更少反應之患者子群。此外，該等方法可用於自臨床資料鑑別可受益於療法之患者子集。另外，若測試結果指示患者將對醫學治療有反應之可能性較高，則患者能更有可能包括於臨床試驗中，且若測試結果指示患者將對醫學治療有反應之可能性較低，則患者較不可能包括於臨床試驗中。

本文所述之方法可單獨或與此項技術中已知用於患者分層之其他臨床方法組合使用以提供診斷、預後或對療法之反應性的預測。舉例而言，業內已知用於診斷ASCAD之臨床參數可併入熟習此項技術者之分析中以利用目標方法達成卵巢癌評估。

實例

在以下實例中進一步闡述本發明，該等實例並不限制申請專利範圍中所述之本發明範圍。

動脈粥樣硬化病灶之基因座及負擔研究(GLOBAL；NCT01738828)係國際多中心、前瞻性研究，其入選7526名患者(其大約一半係動脈粥樣硬化CAD病例；另一半沒有動脈粥樣硬化CAD)，該等患者接受冠狀動脈CT血管造影，用於在總共48個臨床場所評估疑似冠狀動脈疾病(CAD)。CAD之先前基因及基因體研究已用過CAD或MI(心肌梗塞)之患者病史或侵入性冠狀動脈造影術以確定病例/控制狀態。在GLOBAL研究中，利用心血管CT，包括非對比劑增強之冠狀動脈電腦斷層攝影(CT)(亦稱為冠狀動脈鈣(CAC)評分)及其次對比劑增強之CT血管造影(CTA)。增加用於檢測冠狀動脈斑塊之此成像技術之靈敏度已顯示允許對照作為病歷(發起者之資料)進行重新分類。

以下實例闡述由來自總共26個臨床場所之1096名患者之代謝體學資料組成之先導性GLOBAL資料的統計分析。748名患者之子集組成發現集；其他348參與者組成驗證集。GLOBAL先導性發現隊列之目的係在使用基於先進心臟CT之成像進行表型分析之患者中評估動脈粥樣硬化之強生物標記關聯之初步檢測。

將呈遞用於CTA供評估可能的CAD之患者鑑別為潛在研究候選者並根據研究納入及排除準則篩選合格性。評估個體之心血管疾病風險因子(包括性別、年齡、高血壓、高脂血症、糖尿病及吸煙)以及許多其他條件，並簽署適當的機構審查委員會批准之知情同意書。一般納入準則係如下：(1)年齡18-90；(2)白人及非西班牙或非拉丁美洲裔；及(3)接受冠狀動脈CT血管造影以評估CAD之存在。一般排除準則係如下：(1)在之前30天使用免疫阻抑或免疫調節療法，包括任何劑量之全身性皮質類固醇(除非類固醇係在投與對比劑用於CT掃描之前在24小時內作為前處置藥物(pre-medication)投與)；(2)上一年度中之化學療法；(3)在之前2個月中有大手術；(4)在之前2個月中有血液或血液產品輸入；(5)根據機構照護標準，其冠狀動脈CT血管造影係禁忌之個體；(6)具有先前冠狀動脈血管重建(經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈繞道移植(CABG))之個體；(7)在過去3個月內發生心房震顫/撲動或頻率不規則或快速心律之個體；(8)具有節律調節器或植入式心臟整流-除顫器植入之患者；(9)急性鬱血性心力衰竭或存在已知非缺血性心肌病；及(10)動脈粥樣硬化、脂質或脂蛋白代謝之已知遺傳病症。個體必須符合入選研究中之所有一般納入準則。若符合一般排除準則中之任一者，則個體將自研究排除。

每一患者係藉由應用以下方法來在生物標記方面進行表徵：全基因體定序(WGS)、全基因體甲基化(WGM)、基於全血之轉錄組定序(WTS)、無偏性蛋白質體學、無偏性代謝體學、無偏性脂類組學及脂蛋白蛋白質體學。另外，量測更習用生物標記。

樣品製備：代謝體學：

將樣品儲存在-70℃下直至處理為止。樣品製備係如先前所述實施。(Evans AM等人，Integrated,nontargeted ultrahigh performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry platform for the identification and relative quantification of the small-molecule complement of biological systems.Anal Chem 2009；81(16)：6656-6667)簡言之，在第一步驟之前在提取製程中添加回收標準物用於品質控制目的。為移除蛋白質、分離結合至蛋白質或陷獲於經沈澱蛋白質基質中之小分子並回收化學上不同之代謝物，利用甲醇在劇烈攪拌下2min(Glen Mills Genogrinder 2000)以使蛋白質沈澱，隨後離心。將所得提取物分成四個部分：一者用於藉由超高效液相層析-串聯質譜(UPLC-MS/MS；正離子模式)進行分析，一者藉由UPLC-MS/MS(負離子模式)進行分析，一者藉由氣相層析-質譜(GC-MS)進行分析，且保留一份樣品用於備用。分析三種類型之對照以與試驗樣品相一致：自人類血漿彙集物(由Metabolon公司廣泛表徵)產生且充當貫穿資料集之技術重複之樣品；充當製程空白之經提取水樣品；及摻加於每一經分析樣品中以允許儀器性能監測之標準物混合物。儀器可變性係藉由計算在注入質譜儀中之前添加至每一樣品之標準物之平均相對標准偏差(RSD)(平均RSD=5%；n=30份標準物)來測定。總體製程可變性係藉由計算100%經彙集人類血漿樣品中存在之所有內源性代謝物(即，非儀器標準物)之平均RSD(平均RSD=11%；n=610份代謝物)來測定。試驗樣品及對照係跨越平臺隨機運行。

質譜分析. 在Metabolon公司處實施非標的物MS分析。提取物經受GC-MS或UPLC-MS/MS⁷。層析經標準化，且一旦方法經驗證，即不能作其他改變。作為Metabolon之一般實踐之一部分，所有管柱均在試驗開始時購自單一製造商批號。所有溶劑同樣地成批地以足以完成所有相關試驗之量購自單一製造商批號。對於每一樣品，將真空乾燥之樣品溶解於以固定濃度含有八種或八種以上注射標準物之注射溶劑中，此取決於平臺。使用內標準品以確保注射及層析一致性。儀器經調諧並每天針對質量解析度及質量準確度進行校準。UPLC-MS/MS平臺利用具有Waters UPLC BEH C18-2.1×100mm,1.7μm管柱之Waters Acquity UPLC及Thermo Scientific Q-Exactive高解析度/精確度質譜儀，其與加熱電噴霧離子化(HESI-II)源及以35,000質量解析度操作之Orbitrap質量分析器介接。將樣品提取物乾燥，然後在酸性或鹼性LC-相容溶劑中重構，其每一者以固定濃度含有八種或八種以上注射標準物以確保注射及層析一致性。一份等份樣品使用酸性、正離子最佳化條件進行分析，且其他使用鹼性、負離子最佳化條件進行分析，其在兩次獨立注射中使用單獨的專用管柱進行。在酸性條件中重構之提取物使用水及含0.1%甲酸之甲醇進行梯度溶析，而亦使用水/甲醇之鹼性提取物含有6.5mM碳酸氫銨。MS分析係使用動態排除在MS與資料依賴性MS2掃描之間交替進行，且掃描範圍係80-1000m/z。

將預定藉由GC-MS進行分析之樣品在真空乾燥下乾燥最少18小時，然後在乾燥氮下使用雙三甲基-矽基三氟乙醯胺進行衍生化。在5%苯基二甲基聚矽氧管柱上利用氦作為載劑氣體及在17-min時期內 60℃至340℃之溫度斜坡分離經衍生化樣品。所有樣品均在以單位質量解析度操作且具有電子衝擊電離及50-750原子質量單位掃描範圍之Thermo-Finnigan Trace DSQ MS上進行分析。

化合物鑑別、量化及資料庋用(Data Curation). 代謝物係藉由自動化比較試驗樣品與化學標準條目之參考文庫(包括滯留時間、分子量(m/z)、較佳加合物、及源內片段(in-source fragment)以及相關聯MS譜)中之離子特徵來鑑別並藉由目視檢查來庋用以使用Metabolon開發之軟體用於品質控制。(DeHaven CD等人，Organization of GC/MS and LC/MS metabolomics data into chemical libraries.J Cheminform 2010；2(1)：9)已知化學實體之鑑別係基於對經純化標準物之代謝體學文庫條目之比較。已獲得超過2,500種市售純化標準化合物並登記於LIMS中用於分配給LC/MS及GC/MS平臺二者用於測定其可檢測特徵。已針對借助其週期性性質(層析及質譜二者)鑑別之結構未指定之生物化學品創建額外250條質譜條目。該等化合物有可能藉由未來相匹配純化標準物之獲得或藉由古典結構分析來鑑別。使用曲線下面積量化峰。將每一樣品中每一代謝物之原始面積計數正規化以藉由每一運行日之中值校正由儀器日間調諧差異產生之變化，因此對於每一運行將中值設定為1.0。此保存樣品之間之變化，但允許迥然不同之原始峰面積之代謝物以相似製圖標度進行比較。正規化後利用所觀察之最小值設算遺漏值。

樣品製備：脂類組學

TrueMass®脂質組(TrueMass® Lipomic Panel). 在真實內標準品之存在下藉由Folch等人之方法使用氯仿：甲醇(2：1 v/v)提取脂質。為分離中性脂質類[FFA、TAG、DAG、CE]，採用由石油醚/二乙醚/乙酸(80：20：1)組成之溶劑系統。每一提取物內之個別磷脂類[PC、PE]係使用Agilent Technologies 1100系列LC分離。每一脂質類在100℃下在氮氣氛下在密封小瓶中在存於甲醇中之1%硫酸中轉酯化45分鐘。利用含有0.05%丁基化羥基甲苯之己烷自混合物萃取所得脂肪酸甲酯並藉由在氮下密封己烷萃取物來準備用於GC。分離脂肪酸甲酯並藉由配備有30m DB 88毛細管柱(Agilent Technologies)及火焰離子化檢測器之毛細管GC(Agilent Technologies 6890系列GC)量化。

TrueMass®神經醯胺組(TrueMass® Ceramides Panel). 將氘標記之內標準品添加至樣品並將混合物溶於甲醇中，隨後崩潰萃取(crash extraction)。利用添加存於水中之KCl形成雙層，並移除有機層並在氮下濃縮。將萃取物旋轉，過濾並分成2份注射液，一份用於神經醯胺，且一份用於神經鞘胺醇。將萃取物注射於連接至Agilent 1290 Infinity LC及ABI 4000 QTRAP之Agilent C8管柱上。分析物係經由正電噴射電離且質譜儀係以串聯MS模式操作。藉由將峰與相關內標準品之峰相比較測定每一神經鞘酯之絕對濃度。

將預定藉由GC-MS進行分析之樣品在真空乾燥下乾燥最少18小時，然後在乾燥氮下使用雙三甲基-矽基三氟乙醯胺進行衍生化。在5%苯基二甲基聚矽氧管柱上利用氦作為載劑氣體及在17-min時期內60℃至340℃之溫度斜坡分離經衍生化樣品。所有樣品均在以單位質量解析度操作且具有電子衝擊電離及50-750原子質量單位掃描範圍之Thermo-Finnigan Trace DSQ MS上進行分析。

化合物鑑別、量化及資料庋用. 代謝物係藉由自動化比較試驗樣品與化學標準條目之參考文庫(包括滯留時間、分子量(m/z)、較佳加合物、及源內片段以及相關聯MS譜)中之離子特徵來鑑別並藉由目視檢查來庋用以使用Metabolon開發之軟體用於品質控制。(DeHaven等人)已知化學實體之鑑別係基於對經純化標準物之代謝體學文庫條目之比較。已獲得超過2,500種市售純化標準化合物並登記於LIMS中用於分配給LC/MS及GC/MS平臺二者用於測定其可檢測特徵。已針對借助其週期性性質(層析及質譜二者)鑑別之結構未指定之生物化學品創建額外250條質譜條目。該等化合物有可能藉由未來相匹配純化標準物之獲得或藉由古典結構分析來鑑別。使用曲線下面積量化峰。將每一樣品中每一代謝物之原始面積計數正規化以藉由每一運行日之中值校正由儀器日間調諧差異產生之變化，因此對於每一運行將中值設定為1.0。此保存樣品之間之變化，但允許迥然不同之原始峰面積之代謝物以相似製圖標度進行比較。正規化後利用所觀察之最小值設算遺漏值。

實例1. 發現 分析群體

「全分析集」(「FAS」)係由具有臨床資料及血管重建CAD病例、自體CAD病例或對照之基於CT之名稱的先導性研究患者組成(對於FAS群組，N=336)。

「自體CAD集」係具有自體CAD(如藉由CT所驗證)且具有分析物(代謝體學及脂類組學)資料之FAS的子集(對於自體CAD集，N=120)。該等係過去沒有血管重建程序(例如，經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈繞道移植(CABG))之個體。

「Revasc CAD集」係過去曾接受血管重建(例如經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈繞道移植(CABG))且具有分析物資料之FAS之子集。

「全CAD集」係自體CAD集及Revasc CAD集之聯集。

「對照集」係鈣得分為零且在檢查CT資料之後指定為對照且具有分析物資料之FAS的子集。(對照集加自體CAD集，N=279)。該等個體基於非對比劑CT及對比劑增強之CT資料之組合檢查不具有可辨別之動脈粥樣硬化CAD。

應注意，藉由設計，研究中所代表之唯一種族群係白人。因此，並未界定基於種族之子群體。資料並未分成訓練及驗證集。

I：GLOBAL先導性研究 A. 研究終點

對於GLOBAL先導性發現隊列，分析中存在兩個主要終點：(1)自體CAD；及(2)所有CAD(自體或血管重建)。所有分析均適用於兩個主要終點。

B. 統計假設

代謝物或脂質與終點之間無關聯性之虛無假設係針對存在關聯性之雙側替換來測試。

C. 多重比較及多重性

計算錯誤發現率(FDR)q-值(Benjamini及Hochberg,1995)。具有FDR q<0.05之關聯視為初步關聯。在一些情形中，亦報告原始p<0.05之測試結果。

D. 遺漏數據

不設算終點數據。排除具有大於5%遺漏數據之潛在共變量。將具有小於5%遺漏數據之潛在共變量設算為平均值。

自主要分析排除具有大於10%遺漏數據之代謝物。在正規化後將具有小於10%遺漏之代謝物及脂質的遺漏值設算為所觀察到之最小值。

E. 共變量

12個潛在共變量被稱為「臨床變量」：年齡；性別；身體質量指數(BMI)；II型糖尿病；當前吸煙者；禁食；史他汀使用；菸酸使用；纖維酸使用；依折麥布使用；魚油使用；及膽汁酸鉗合劑使用。

表1中所列舉之77種潛在共變量之其他集被稱為「習用以血液為主的生物標記變量」。

如下文所述，所選子集之該等變量在共變量調整之關聯分析中用作共變量及/或作為輸入用於預測建模分析。

F. 子群之分析

第一主要終點係使用FAS之子集定址。特定而言，自體CAD集與對照集相比較。大多數二次分析僅涉及自體CAD集。在分析由CT引起之次要終點期間考慮額外子群。

II. 人口及基線特徵

將先導性研究中之患者的基線及人口特徵進行製表。藉由平均值及標準誤差總結連續變量；藉由計數及百分比總結二元變量。

表2藉由臨床組顯示一般患者特徵(Revasc CAD對自體CAD對對照)。實施Kruskall-Wallis測試以探究連續量測之均質性；針對二元量測實施皮爾遜卡方測試(Pearson's chi-squared test)；報告未調整p值。

表3藉由主要終點顯示一般患者特徵、特定地自體CAD對對照、及所有CAD對對照。實施Mann-Whitney測試以探究連續量測之均質性；針對二元量測實施皮爾遜卡方測試；報告未調整p值。

III.針對代謝物及複合脂質之探索性資料分析

樣品製備及質譜分析係Metabolon公司實施。原始資料含有總共1088個分析物，其係針對336名先導性研究參與者進行量測。兩個先導性研究參與者沒有資料。

在1088種分析物中，705種代謝物及183種複合脂質(總計888)具有小於10%遺漏數據。所有336名患者具有小於10%遺漏數據。因此，統計分析係應用於888種分析物及336名患者。「Revasc CAD集」中有57名患者，「自體CAD集」中有120名患者且「對照集」中有159名患者。

資料在接收之前經正規化。實施對數(底數2)變換並產生直方圖以藉由分析物顯示表達之分佈(資料未顯示)。

代謝體學及脂類組學資料係在單一批處理中生成，因此不應用批處理校正，然而，實施主成份分析(principal components analysis,PCA)以尋找任何場所效應之證據。以變量為中心並按比例縮放至單位變異數。發明者評估場所效應之存在或不存在且得出結論：在自不同場所獲得自資料中不存在系統差異。

IV.代謝物及複合脂質之單變量分析 A. 方法

使用Mann-Whitney測試對所有主要及次要終點實施單變量關聯分析，並應用FDR校正。產生顯示所有分析物之p值及q值之列表。

具有q<0.05之任何分析物視為初步關聯。對於每一者，產生盒鬚圖以顯示臨床組之表達分佈。產生熱圖以顯示針對每一終點之初步代謝物關聯：在y-軸上，藉由終點值對患者進行分組，在x-軸上，系統樹圖顯示具有q<0.05之代謝物的群集。類似地，產生熱圖以顯示針對每一終點之初步複合脂質關聯。

B. 結果

表4顯示對於自體CAD對對照之主要終點具有q<0.05之代謝物的細節；表5顯示具有q<0.05之複合脂質的細節。

表6顯示對於所有CAD對對照之主要終點具有q<0.05之代謝物的細節；表7顯示具有q<0.05之複合脂質的細節。

V. 主要終點之預測建模 A. 方法

梯度提升係一種用於確定最小化損失函數之期望值的迴歸函數的途徑。(Friedman JH.,Greedy function approximation：a gradient boosting machine.Ann Statist 29(5)：1189-1232(2001)；Friedman JH.,Stochastic gradient boosting.Comput Stat Data Anal 38(4)：367-378(2002))。其係一種迭代法，其中計算損失函數之負梯度，對迴歸模型進行擬合，選擇梯度下降步長，並更新迴歸函數。梯度係藉助迴歸樹接近，其利用共變量資訊，且在每次迭代時，梯度決定其中函數需要移動之方向，以改良對資料之擬合。

出於發現目的，實施兩輪梯度提升，以分別選擇最高度預測之代謝物及脂質：(1)代謝體學模型：僅代謝體學資料；及(2)脂類組學模型：僅脂類組學資料。

實施另外四輪梯度提升以量化不同等級之模型複雜度的相對益處：(3)臨床模型：臨床變量加習用以血液為主的生物標記變量；(4)臨床-代謝體學模型：臨床變量、習用以血液為主的生物標記變量加代謝體學資料；(5)臨床-脂類組學模型：臨床變量、習用以血液為主的生物標記變量加脂類組學資料；及(6)臨床-代謝體學-脂類組學模 型：臨床變量、習用以血液為主的生物標記變量加代謝體學及脂類組學。

為簡化搜尋空間，對變量進行過濾以僅包括對於所關注終點展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)者。由於主要終點之二元性質，將損失函數假定為Bernoulli。引入學習率(λ)以抑制建議移動並保護免於過擬合。最佳迭代次數(由T給出)係由5折交叉驗證確定。每一終端節點中之最少觀察次數係10。允許雙向相互作用。對一半的觀察值實施不歸還隨機子取樣以達成梯度估計中之變異數縮減。

衍生模型之估計特性係基於最佳迭代次數/樹由損失(錯誤)之交叉驗證(CV)估計概括。將所選變量及其估計相對影響進行製表。針對展現最高影響之變量生成部分依賴圖。

以此方式，針對每一主要終點衍生出六個預測模型，且使用相同資料獲得模型-性能之初步估計。

使用該六個模型以產生每一患者之機率預測。對於每一模型，在預測機率臨限值之範圍內計算靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)及陰性預測值(NPV)。產生接受者操作特徵(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲線以將靈敏度繪製為(1-特異度)之函數。基於準確度(其定義為正確預測之比例)確定最佳分類臨限值。另外，估計曲線下面積(Area Under the Curve,AUC)。

以圖表方式評估校準性能：製作圖示，以顯示CAD率相對於預測風險。實施Hosmer-Lemeshow C測試。

將基於模型之預測的性能與藉由Diamond-Forrester評分及Morise評分獲得之機率預測的性能相比較。(Diamond GA、Forrester JS.Analysis of probability as an aid in the clinical diagnosis of coronary-artery disease.N Engl J Med.1979年6月14日；300(24)：1350-8；Morise AP、Jalisis F.Evaluation of pretest and exercise test scores to assess all-cause mortality in unselected patients presenting for exercise testing with symptoms of suspected coronary artery disease.J Am Coll Cardiol.2003年9月3日；42(5)：842-50)。

自體CAD之詳細結果

結果顯示Diamond-Forrester得分提供的GLOBAL表型預測較差(圖1)。AUC之估計及自體CAD之預測準確度指示，該性能幾乎等於為所有患者指派0.57之相等患病機率。(圖2)所有CAD皆獲得性能之一些適度改良，但性能依然較弱。(圖17)

Morise得分對於預測自體CAD而言亦執行較差，但對於所有CAD之預測較佳。(圖3及4)對於後者，獲得0.61之準確度，其比藉由為所有患者指派疾病之同等機率所獲得之0.53之最小準確度更有利。(圖18)

臨床模型

在所量測之888種分析物(705種代謝物及183種複合脂質)中，28個臨床變量對於自體CAD展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)(表8)。表9提供針對所有CAD之28個臨床變量的經過濾列表。

在針對自體CAD展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)之28個臨床變量中，一組十個臨床變量可預測CAD之機率。表9提供對於自體CAD之臨床模型該十一個臨床變量之相對影響。圖5提供自體CAD之臨床模型的ROC曲線。圖6提供針對自體CAD之臨床模型之該十一個臨床變量的部分依賴圖。

代謝體學模型

在所量測之888種分析物中，105個臨床變量對於自體CAD展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表10提供針對自體CAD之105個代謝體學變量的經過濾列表。

在針對自體CAD展現名義上單變量關聯之105個臨床變量中，一組六個代謝體學變量可預測CAD之機率。表11提供對於自體CAD之代謝體學模型該六個臨床變量之相對影響。圖7提供自體CAD之代謝體學模型的ROC曲線。圖8提供針對自體CAD之代謝體學模型之該六個臨床變量的部分依賴圖。

臨床-代謝體學模型

對於臨床-代謝體學模型，一組十個臨床變量可預測CAD之機率。表12提供對於自體CAD之臨床-代謝體學模型該十個臨床變量之相對影響。圖9提供針對自體CAD之臨床-臨床模型之該十個臨床變量的部分依賴圖。圖10提供自體CAD之臨床-臨床模型的ROC曲線。

脂類組學模型

在138種所評估脂質中，29種對於自體CAD展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表13提供對於自體CAD之29個脂類組學變量的經過濾列表。

對於脂類組學模型，一組七個變量可預測CAD之機率。表14提供對於自體CAD之脂類組學模型該七個脂類組學變量之相對影響。圖11提供針對自體CAD之脂類組學模型之七個臨床變量的部分依賴圖。圖12提供自體CAD之脂類組學模型的ROC曲線。

臨床-脂類組學模型

一組七個臨床變量可在臨床-脂類組學模型中預測CAD之機率。表15提供對於自體CAD之臨床-脂類組學模型該七個臨床變量之相對影響。圖13提供針對自體CAD之臨床-脂類組學模型之七個臨床變量的部分依賴圖。圖14提供自體CAD之臨床-脂類組學模型的ROC曲線。

臨床-代謝體學-脂類組學模型

一組六個臨床變量可在臨床-代謝體學-脂類組學模型可預測CAD之機率。表16提供針對自體CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型該六個變量的相對影響。圖15提供針對自體CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型之六個臨床變量的部分依賴圖。圖16提供自體CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型的ROC曲線。

所有CAD之詳細結果 臨床模型

35個臨床變量對於自體CAD展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)(表17)。表17提供針對所有CAD之35個臨床變量的經過濾列表。

在針對所有CAD展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)之35個臨床變量中，一組十一個臨床變量可預測CAD之機率。表18提供對於所有CAD之臨床模型該十一個臨床變量之相對影響。圖19提供針對所有CAD之臨床模型該十一個臨床變量之部分依賴圖。圖20提供所有CAD之臨床模型的ROC曲線。

代謝體學模型

如表19中所示，138個代謝體學變量之經過濾列表對於所有CAD而言名義上單變量關聯(原始p<0.05)。

在針對所有CAD展現名義上單變量關聯之138個臨床變量中，一組十六個代謝體學變量可預測CAD之機率。表20提供對於自體CAD之代謝體學模型該十六個臨床變量之相對影響。圖21提供針對所有CAD之代謝體學模型十六個臨床變量之部分依賴圖。圖22提供所有CAD之代謝體學模型的ROC曲線。

臨床-代謝體學模型

一組十二個臨床變量可在所有CAD之臨床-代謝體學模型中預測CAD之機率。表21提供對於所有CAD之臨床-代謝體學模型該十二個臨床變量之相對影響且圖23提供對於所有CAD之臨床-代謝體學模型該十二個臨床變量的部分依賴圖。圖24提供所有CAD之臨床-代謝體學模型的ROC曲線。

表21：

脂類組學模型

31個脂類組學變量對於所有CAD展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表22提供所有CAD之29個脂類組學變量的經過濾列表。

一組十三個變量可預測CAD之機率。表23提供對於所有CAD之脂類組學模型該十三個脂類組學變量之相對影響。圖25提供所有CAD之脂類組學模型之十三個臨床變量的部分依賴圖。圖26提供所有CAD之脂類組學模型的ROC曲線。

表23：

臨床-脂類組學模型

一組十一個臨床變量可在所有CAD之臨床-脂類組學模型中預測CAD之機率。表24提供針對所有CAD之臨床-脂類組學模型該十一個臨床變量之相對影響。圖27提供所有CAD之臨床-脂類組學模型之十一個臨床變量的部分依賴圖。圖28提供所有CAD之臨床-脂類組學模型的ROC曲線。

臨床-代謝體學-脂類組學模型

一組十二個臨床變量可在所有CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型中預測CAD之機率。表25提供對於所有CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型該十二個變量之相對影響。圖29提供所有CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型之十二個臨床變量的部分依賴圖。圖30提供自體CAD之臨床-代謝體學-脂類組學模型的ROC曲線。

貫穿本文所述之實例，將許多分析物鑑別為「X-」化合物。若干X-化合物進一步詳細闡述於表26中。

對於表26，資料係呈如下格式：名稱；lib_id；comp_id；quant_mass；rt；未命名代謝物之暫定細節(若有)；及光譜。光譜資料格式(x：y)指示離子之質量(m/z=x)及相對峰強度(y)。光譜中之每一離子均由空格分開。

VIII. 方法：次要終點之單變量分析 實例2. 發現及驗證 分析群體

「發現-全分析集」(「發現FAS」)係由具有臨床資料及血管重建CAD病例、自體CAD病例或對照之基於CT之名稱的先導性研究患者組成(對於發現-FAS群組，N=748)。

「發現-自體CAD集」係具有自體CAD(如藉由CT所驗證)且具有分析物(代謝體學)資料之發現-FAS的子集(對於發現-自體CAD集，N=366)。該等係過去沒有血管重建程序(例如，經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈繞道移植(CABG))之個體。

「發現-Revasc CAD集」係已經歷先前血管重建(例如經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈繞道移植(CABG))且具有分析物資料之發現-FAS之子集(N=44)。

「發現-全CAD集」係發現-自體CAD集與發現-Revasc CAD集之聯集(N=410)。

「發現-對照集」係鈣得分為零且在檢查CT資料之後指定為對照且具有分析物資料之發現-FAS的子集。(對於發現-對照集，N=338。)

「驗證-全分析集」(「驗證-FAS」)係由具有臨床資料及血管重建CAD病例、自體CAD病例或對照之基於CT之名稱的先導性研究患者組成(對於驗證-FAS群組，N=348)。

「驗證-自體CAD集」係具有自體CAD(如藉由CT所驗證)且具有分析物(代謝體學)資料之驗證-FAS的子集(對於驗證-自體CAD集，N=207)。該等係過去沒有血管重建程序(例如，經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈繞道移植(CABG))之個體。

「驗證-Revasc CAD集」係已經歷先前血管重建(例如經皮冠狀動脈介入治療(PCI)或冠狀動脈繞道移植(CABG))且具有分析物資料之驗證-FAS之子集(N=15)。

「驗證-全CAD集」係驗證-自體CAD集與驗證-Revasc CAD集之聯集(N=222)。

「驗證-對照集」係鈣得分為零且在檢查CT資料之後指定為對照且具有分析物資料之驗證-FAS的子集。(對於驗證-對照集，N=126)

應注意，藉由設計，研究中所代表之唯一種族群係白人。因此，並未界定基於種族之子群體。

A. 研究終點

對於GLOBAL先導性發現隊列，分析中存在四個主要終點：(1)自體CAD；(2)所有CAD(自體或血管重建)；(3)50%狹窄，無血管重建；(4)50%狹窄或血管重建。所有分析均適用於所有主要終點。

B. 統計假設

C. 多重比較及多重性

D. 遺漏數據

不設算終點資料。排除具有大於5%遺漏數據之潛在共變量。將具有小於5%遺漏數據之潛在共變量設算為平均值。

E. 子群之分析

第一及第三主要終點係使用FAS之子集定址。特定地，自體CAD集及對照集被視為排除Revasc.CAD集。出於發現之目的，基於參與者之禁食狀態產生其他子集，其中若患者8小時或8小時以上未進食，則將其歸類為禁食。已知未禁食或具有未知禁食狀態之剩餘者歸類為「非-禁食」。

I. 人口及基線特徵

表27藉由臨床組顯示發現集之一般患者特徵(Revasc CAD對自體CAD對對照)。實施Kruskall-Wallis測試以探究連續量測之均質性；針對二元量測實施皮爾遜卡方測試；報告未調整p值。

表28藉由臨床組顯示驗證集之一般患者特徵(Revasc CAD對自體 CAD對對照)。實施Kruskall-Wallis測試以探究連續量測之均質性；針對二元量測實施皮爾遜卡方測試；報告未調整p值。

II. 代謝物之探索性資料分析

樣品製備及質譜分析係Metabolon公司實施。原始資料含有總共1088個分析物，其係針對1096名先導性研究參與者進行量測。

在1088種分析物(包括未命名代謝物及複合脂質)中，481種經命名代謝物具有小於10%遺漏數據。所有1096名患者對於該等代謝物具有小於10%遺漏數據。因此，統計分析係應用於481種分析物及1096名患者。資料在接收之前經正規化。實施對數(底數2)變換並產生直方圖以藉由分析物顯示表達之分佈(資料未顯示)。

代謝體學資料係在多個批處理中產生；然而，主成份分析(PCA)顯示無任何系統場所效應之證據。

III. 主要終點之預測建模

方法. 發現-FAS集中之患者根據其是否已禁食至少8小時來歸類。藉由此準則，總計377名參與者經禁食且371名非禁食。針對四個主要終點實施關聯測試(針對年齡及性別進行調整)，且名義上關聯係以三種方式如下定義：

1 在禁食及非禁食組合中之重要性

2 獨立地在禁食及非禁食中之顯著性

3 在僅禁食中之顯著性

應強調，在此階段，「重要性」與具有原始、未經調整p<0.05之任何關聯相關。

以此方式，12種方案係考慮如下：

a)自體CAD中之動脈粥樣硬化-A ^nCAD

c.禁食及未禁食組合中之顯著性-

c.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

c.禁食中之顯著性-

b)所有CAD中之動脈粥樣硬化(包括血管重建)-A ^aCAD

c.禁食及未禁食組合中之顯著性-

c.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

c.禁食中之顯著性-

c)在自體CAD中50%狹窄-S ^nCAD

c.禁食及未禁食組合中之顯著性-

c.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

c.禁食中之顯著性-

d)所有CAD中之50%狹窄(包括血管重建)-S ^aCAD

c.禁食及未禁食組合中之顯著性-

c.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

c.在禁食中之分析物顯著性-

當多於9個變量具有p<0.05時，則將年齡及性別添加至該等變量，並應用梯度提升(參見下文)以選擇9種預測因子。

12個預測模型係如下藉由廣義線性(邏輯斯諦(logistic))回歸獲得。當少於9個變量具有p<0.05時，將年齡及性別添加至該等變量，並對全模型進行擬合。否則，將藉由梯度提升變量選擇之9個變量與年齡及性別在廣義線性(邏輯斯諦)模型中組合。

梯度提升係一種用於確定最小化損失函數之期望值的迴歸函數的途徑。(Freidman JH(2001)及Friedman JH(2002))其係一種迭代法，其中計算損失函數之負梯度，對迴歸模型進行擬合，選擇梯度下降步長，並更新迴歸函數。梯度係藉助迴歸樹接近，其利用共變量資訊，且在每次迭代時，梯度決定其中函數需要移動之方向，以改良對資料之擬合。

由於主要終點之二元性質，將損失函數假定為Bernoulli。引入學習率(λ)以抑制建議移動並保護免於過擬合。最佳迭代次數(由T給出)係由5折交叉驗證確定。每一終端節點中之最少觀察次數係10。允許雙向相互作用。對一半的觀察值實施不歸還隨機子取樣以達成梯度估計中之變異數縮減。

出於當前目的，針對每一方案運行50輪梯度提升，且最常顯示最高估計相對影響之9個變量進行廣義線性建模。

使用該12個模型以產生驗證-FAS中之每一患者的機率預測。對於每一模型，在預測機率臨限值之範圍內計算靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)及陰性預測值(NPV)。產生接受者操作特徵(ROC)曲線以將靈敏度繪製為(1-特異度)之函數。基於準確度(其定義為正確預測之比例)確定最佳分類臨限值。另外，估計曲線下面積(AUC)及準確度(表27、28、29、30分別用於四個主要終點)。

將基於模型之預測的性能與藉由Diamond-Forrester評分獲得之機率預測的性能相比較。(Diamond及Forrester(1979))。

自體CAD之詳細結果

結果顯示Diamond-Forrester得分提供差的GLOBAL表型預測(圖34、38、42、46)。自體CAD之AUC及預測之準確度的估計指示，性能幾乎等於將所有患者指派為處於疾病之「風險」中，其中自體CAD之驗證集(驗證-自體CAD加驗證-對照)中62%之預測係正確的，且所有CAD之驗證集(驗證-自體CAD加驗證-Revasc.CAD加驗證-對照)中64%之預測係正確的。

代謝體學模型

I. 自體CAD中之動脈粥樣硬化-A ^nCAD

a.禁食及未禁食組合中之顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，83個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表29提供

之83個代謝體學變量的列表。

表29：

在對於

展現名義上單變量關聯之83個代謝體學變量中，將一組八個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表30提供對於

之代謝體學模型而言八個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖35提供

之代謝體學模型的ROC曲線。表53提供在經預測機率臨限值之範圍內之靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)及陰性預測值(NPV)；估計曲線下面積(AUC)及準確度。

§術語「存在」傳達了在預測模型中慮及男性，其中「相對影響」指示男性與結果(即，ASCAD或冠狀動脈粥樣硬化斑塊之存在)之關聯。

b.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，4個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表31提供針對

之4個代謝體學變量的列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之4個代謝體學變量中；將一組所有四個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表32提供對於

之代謝體學模型而言該四個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖36提供

c.禁食中之顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，34個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表33提供針對

之34個代謝體學變量的列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之34個代謝體學變量中，將一組八個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表34提供對於

之代謝體學模型而言八個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖37提供

II. 所有CAD中之動脈粥樣硬化(inc revasc)-A ^aCAD

a.禁食及未禁食組合中之顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，92個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表41提供針對

之92個代謝體學變量的經過濾列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之92個代謝體學變量中，將一組八個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表36提供對於

之代謝體學模型而言八個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖39提供

之代謝體學模型的ROC曲線。表54提供在經預測機率臨限值之範圍內之靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)及陰性預測值(NPV)；估計曲線下面積(AUC)及準確度。

b.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，6個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表37提供針對

之6個代謝體學變量的列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之6個代謝體學變量中，將一組所有六個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表38提供對於

之代謝體學模型而言六個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖40提供

c.禁食中之顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，48個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表39提供針對

之48個代謝體學變量的列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之48個代謝體學變量中，將一組七個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表40提供對於

之代謝體學模型而言七個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖41提供

III. 自體CAD中之50%狹窄-S ^nCAD

a.禁食及未禁食組合中之顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，49個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表41提供針對

之49個代謝體學變量的列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之49個代謝體學變量中，將一組八個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表42提供對於

之代謝體學模型而言八個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖43提供

之代謝體學模型的ROC曲線。表55提供在經預測機率臨限值之範圍內之靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)及陰性預測值(NPV)；估計曲線下面積(AUC)及準確度。

b.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，2個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表43提供針對

之2個代謝體學變量的列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之2個代謝體學變量中，將一組兩個變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表44提供對於

之代謝體學模型而言兩個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖44提供

c.禁食中之顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，28個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表45提供針對

之28個代謝體學變量的經過濾列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之28個代謝體學變量中，將一組八個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將其在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表46提供對於

之代謝體學模型而言八個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖45提供

IV. 所有CAD中之50%狹窄(inc revasc)-S ^aCAD

a.禁食及未禁食組合中之顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，72個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表47提供針對

之72個代謝體學變量的列表。

表47：

在對於

展現名義上單變量關聯之72個代謝體學變量中，將一組八個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表48提供對於

之代謝體學模型而言八個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖47提供

之代謝體學模型的ROC曲線。表56提供在經預測機率臨限值之範圍內之靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)及陰性預測值(NPV)；估計曲線下面積(AUC)及準確度。

b.禁食及未禁食中之獨立顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，5個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表49提供針對

之5個代謝體學變量的經過濾列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之5個代謝體學變量中，將一組所有五個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表50提供對於

之代謝體學模型而言五個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖48提供

c.在禁食中之分析物顯著性-

i. 在所量測之481種分析物中，40個代謝體學變量對於

展現名義上單變量關聯(原始p<0.05)。表51提供針對

之40個代謝體學變量的經過濾列表。

在對於

展現名義上單變量關聯之40個代謝體學變量中，將一組八個代謝體學變量選擇為最佳預測因子；將該等在CAD之預測模型中與年齡及性別組合。表52提供對於

之代謝體學模型而言八個代謝體學變量與年齡及性別組合之相對影響。圖49提供

對於以下每一模型，計算在經預測機率臨限值之範圍內之靈敏度、特異度、陽性預測值(PPV)及陰性預測值(NPV)(表53、54、55、 56)。產生接受者操作特徵(ROC)曲線以將靈敏度繪製為(1-特異度)之函數。基於準確度(其定義為正確預測之比例)確定最佳分類臨限值。另外，估計曲線下面積(AUC)及準確度(表53、54、55、56，分別針對自體CAD、所有CAD、自體CAD中之50%狹窄及所有CAD中之50%狹窄)。每一模型之第一列指示最大準確度臨限值之性能、靈敏度與特異度之間之最佳平衡。具有第二列之彼等模型針對高陰性預測值(NPV)經最佳化。

DF=Diamond-Forrester

DF=Diamond-Forrester

表55：

DF=Diamond-Forrester

DF=Diamond-Forrester

其他實施例

應瞭解，儘管本發明已結合其具體說明闡述，但上文說明意欲說明而並非限制本發明之範圍，本發明之範圍係由隨附申請專利範圍之範疇所界定。其他態樣、優點及修改在以下申請專利範圍之範圍內。

Claims

一種評估患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體之方法，該方法包含：量測獲自個體之血液樣品、血清樣品或血漿樣品中一組分析物生物標記內之每一分析物之含量，其中該組分析物生物標記係選自由以下組成之群：(i)包含以下各項之一組生物標記：擷胺醯基白胺酸、麩胺酸鹽、埃西索加(acisoga)、尿酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、岩藻糖、丁醯基肉鹼(C4)及甘露糖；將該生物樣品中該等分析物之所量測含量與一或多種參考樣品相比較，其中該等參考係匹配之人類個體之代表物；及若該生物樣品中該等分析物之所量測含量相對於該等參考樣品中該等分析物之量增加或降低，則將該個體鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊。
如請求項1之方法，其進一步包含指示健康照護專業人員對鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體完成非侵入性心血管評估，以證實該個體具有或不具有冠狀動脈粥樣硬化症或冠狀動脈粥樣硬化斑塊。
如請求項1之方法，其進一步包含對鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體實施非侵入性心血管評估，以證實該個體具有或不具有冠狀動脈粥樣硬化症或冠狀動脈粥樣硬化斑塊。
如請求項2或3之方法，其中實施非侵入性心血管評估包含實施選自由以下組成之群之程序：心血管電腦斷層攝影(CT)成像、運動壓力測試、藥理學壓力測試、心肌灌注成像、負荷心臟超音波圖及心血管磁共振成像。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含向鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體選擇性投與包含有效量之治療劑之組合物以治療該個體，該治療劑選自由以下組成之群：史他汀(statin)、膽固醇吸收抑制劑、菸酸衍生物、ω-3-脂肪酸化合物、膽汁酸鉗合劑、抗血小板劑、醛固酮阻斷劑、血管收縮肽轉化酶(ACE)抑制劑、血管收縮肽-受體阻斷劑(ARB)、β阻斷劑、利尿劑、毛地黃、肼苯噠嗪(hydralazine)及硝酸鹽、香豆素(warfarin)及阿斯匹林(aspirin)。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含針對鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體選擇治療計劃以治療該個體。
如請求項6之方法，其中該治療計劃包含選擇性投與組合物，其包含投與有效量之選自由以下組成之群之治療劑：史他汀、膽固醇吸收抑制劑、菸酸衍生物、ω-3-脂肪酸化合物、膽汁酸鉗合劑、抗血小板劑、醛固酮阻斷劑、血管收縮肽轉化酶(ACE)抑制劑、血管收縮肽-受體阻斷劑(ARB)、β阻斷劑、利尿劑、毛地黃、肼苯噠嗪及硝酸鹽、香豆素及阿斯匹林。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該等含量係使用質譜(MS)分析法量測。
如請求項8之方法，其中該MS分析法包含液相層析-串聯質譜(UPLC-MS/MS)或氣相層析-質譜(GC-MS)。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法係用於評估患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)之人類個體。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該個體呈現有動脈粥樣硬化CAD之症狀，該等症狀包含胸痛、心絞痛、心絞痛相等症狀、呼吸困難或運動性呼吸困難。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該個體呈現有與冠狀動脈疾病相關之風險因子，該等風險因子選自由男性、高血壓、異常血脂症、糖尿病及冠狀動脈疾病之家族史組成之群。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該個體過去沒有冠狀動脈疾病病史。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該參考樣品係自至少一個未罹患心血管疾病之個體獲得。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該參考樣品包含預定、統計學顯著之參考分析物含量。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該測定步驟係使用多變量方法中之一者實施，例如梯度提升演算法、決策樹方法或藉由其他廣義線性回歸分析。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含修改該個體之臨床記錄以將該患者鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊。
如請求項17之方法，其中該臨床記錄係儲存於電腦可讀媒體中。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含選擇鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體用於治療，其中該治療包含向鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體選擇性投與包含有效量之治療劑之組合物以治療該個體，該治療劑選自由以下組成之群：史他汀、膽固醇吸收抑制劑、菸酸衍生物、ω-3-脂肪酸化合物、膽汁酸鉗合劑、抗血小板劑、醛固酮阻斷劑、血管收縮肽轉化酶(ACE)抑制劑、血管收縮肽-受體阻斷劑(ARB)、β阻斷劑、利尿劑、毛地黃、肼苯噠嗪及硝酸鹽、香豆素及阿斯匹林。
如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包含選擇鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體用於治療，其中該治療包含對鑑別為患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之患者實施非侵入性心血管評估，以證實該個體具有或不具有冠狀動脈粥樣硬化症或冠狀動脈粥樣硬化斑塊。
如請求項6之方法，其中該治療計劃包含開立改變生活方式之治療處方。
如請求項6之方法，其中該治療計劃包含實施非侵入性心血管評估，包含實施選自由以下組成之群之程序：心血管電腦斷層攝影(CT)成像、運動壓力測試、藥理學壓力測試、心肌灌注成像、負荷心臟超音波圖及心血管磁共振成像。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該比較步驟包括分析該等個體之年齡及/或性別。
一種用於評估患有冠狀動脈粥樣硬化症(ASCAD)或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之人類個體之套組，該套組包含：適於測定測試樣品中複數種分析物之含量的試劑，其中該複數種分析物包含：(i)包含以下各項之一組生物標記：擷胺醯基白胺酸、麩胺酸鹽、埃西索加、尿酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、岩藻糖、丁醯基肉鹼(C4)及甘露糖；視情況一或多種對照樣品，其包含預定量之相同分析物，其中比較測試樣品中該等分析物之含量與該等對照樣品中之含量，以鑑別患有冠狀動脈粥樣硬化症或具有冠狀動脈粥樣硬化斑塊之個體；及該套組在如請求項1至23中任一項之方法中之使用說明書。