JP6873490B2 - 糖尿病関連バイオマーカーおよび糖尿病関連状態の処置 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
この出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１５年１０月１８日出願の米国仮出願第６２／２４３，１３１号への優先権を主張する。
技術分野

本発明は、糖尿病と関連付けられたバイオマーカー、個人が糖尿病を進展させるであろうリスクを判定するためにバイオマーカーを用いる方法、および糖尿病を進展させるリスクがある人々を識別するために集団を選別する方法に関する。

糖尿病は、血糖レベルを調節する能力の喪失によって特徴付けられる重篤な病気である。世界保健機関（ＷＨＯ：Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）は、世界中で１億８０００万人を超える人々が糖尿病を有すると推定する。この数は、２０３０年までに２倍以上になると思われる。２００５年には、推定１１０万人の人々が糖尿病で死亡し、この推定は、糖尿病が、死因としてリストされてよい心疾患および腎疾患のような、他の疾患の原因となるので、糖尿病に起因する死亡を過少にカウントすると思われる。糖尿病死のほとんど８０％が低および中所得国において発生する。中国では、糖尿病の有病率が２０歳を超える人々で９．７％であり、なかでも男性ではこの率が１０．６％、女性では８．８％である。この有病率に基づいて、糖尿病の総数は、９２４０万人と推定され、世界中で一位である。一方で、前糖尿病の有病率は、１５．５％であり、推定数が１億４８００万人である。

肥満、慢性的な栄養不均衡の結果が２型糖尿病（Ｔ２Ｄ：ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ）のリスク増加と密接に関連付けられる。代謝的に健康（ＭＨ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｈｅａｌｔｈｙ）な範囲内であっても、正常体重（ＮＭ：ｎｏｒｍａｌ ｗｅｉｇｈｔ）の個人と比較すると、調整後の糖尿病リスクが過体重では２倍高く、肥満では４倍高いかもしくは１２倍高いことが報告されている。このように、より高リスクの過体重または肥満の（ＯＷ／ＯＢ：ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔまたはｏｂｅｓｅ）個人を認識し、Ｔ２Ｄの進行を予測するために、初期新陳代謝異常の識別を用いることができる。

当技術分野において必要とされるのは、糖尿病を識別するだけでなく、個人が糖尿病を進展させるであろうリスクを判定することも可能なバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせである。

本発明は、糖尿病、前糖尿病、または前糖尿病状態を有する被験者と関連付けられたバイオマーカーの識別に関する。本発明は、被験者が糖尿病を進展させるであろうリスクを評価し、かかるリスクをモニターし、糖尿病を進展させるリスクがある集団のメンバーを識別して、被験者が糖尿病を進展させるリスクを算出し、糖尿病を進展させるリスクについて被験者に助言し、糖尿病を進展させるリスクがある被験者を識別するための診断テストおよびそのためのキットを提供し、かつ被験者が糖尿病を進展させるリスクを判定するための診断テストおよびそのためのキットを提供するために有用なバイオマーカーを提供する。

本発明の第１の態様は、バイオマーカーのパネルを提供する。被験者が将来に糖尿病を進展させるであろうリスク（「糖尿病リスク」）、例えば、個人が次の１、２、５、または１０年のうちに糖尿病を進展させるであろうリスクを評価するために、本明細書に教示されるバイオマーカーのパネルを測定し、利用することできる。パネルは、バイオマーカーのパネルを採用した本発明の方法、キット、コンピュータ可読媒体、システムおよび他の態様のために採用できる１つ以上のバイオマーカーを備える。パネルは、図１１にリストされた１つ以上のバイオマーカーを備えることができる。随意的に、パネルは、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ〜ＢＺから選択されたパネルを備える。

本発明の第２の態様は、診断方法を提供する。本発明の診断方法は、本明細書において教示されるパネルの各バイオマーカーのレベルを、被験者から得られた生物学的サンプル（「サンプル」）中で、測定するステップと、測定レベルに基づいて被験者の糖尿病状況を評価するステップとを備える。

随意的に、糖尿病状況は、例えば、糖尿病を進展させるリスク、または糖尿病を進展させるリスクにおける変化を含むことができる。例えば、糖尿病状況を評価するステップは、例えば、糖尿病リスクを評価するステップ、または糖尿病状況をモニターするステップ（例えば、糖尿病リスクにおける変化を評価するステップ）を備えることができる。

随意的に、評価するステップは、各バイオマーカーの測定レベルを（例えば、個別的または集合的に）糖尿病リスクと相関付けるステップを備えることができる。例えば、相関付けは、
ａ．パネルの各バイオマーカーの測定レベルをコンパレータレベル（例えば、糖尿病リスクを示すレベル）と比較し、比較に基づいて糖尿病リスクを評価するステップ、または
ｂ．モデル（例えば、アルゴリズム）からの出力に基づいて糖尿病リスクを評価するステップであって、モデルは、パネルの各バイオマーカーの測定レベルの入力に基づいて実行される、評価するステップ
を備える。

随意的に、糖尿病リスクを評価するステップは、被験者が糖尿病を進展させるリスクがあることを判定するステップを備える。随意的に、評価するステップは、被験者が糖尿病を進展させるリスクまたは尤度を算出するステップ（例えば、リスクスコアを算出するステップ）を備える。

随意的に、被験者は、代謝的に健康な被験者、糖尿病を進展させるリスクがあるとこれまでに診断されなかった被験者、糖尿病または前糖尿病を有するとこれまでに診断されなかった被験者、および
糖尿病または糖尿病リスクを減少させる処置（例えば、メタボリックサージャリーまたは超低炭水化物食）を受けた被験者のいずれかである。

随意的に、サンプルは、血液、血漿、または血清である。

随意的に、測定する方法は、質量スペクトロメトリー（「ＭＳ：ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」）を備える。例えば、ガスクロマトグラフィー（「ＧＣ：ｇａｓｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」）または液体クロマトグラフィー（「ＬＣ：ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」）のような個別の技術に続いて、ＭＳを行うことができる。随意的に、ＭＳは、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、または超高速液体クロマトグラフィー−トリプル四重極型質量スペクトロメトリー（ＵＰＬＣ−ＴＱ：ｕｌｔｒａ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を備える。

本発明の第３の態様は、本発明による診断方法によって糖尿病を進展させるリスクがあると評価された被験者に対する処置、糖尿病の発症を遅らせるかまたは防ぐ処置を施すか、または勧めるステップ（以下、個別的または集合的に「投与するステップ」と呼ばれる）を備える処置の方法を提供する。

随意的に、処置は、糖尿病を有する被験者に対する任意の標準治療である。

随意的に、処置は、被験者によって示されたパネルの１つ以上のバイオマーカーのレベルと、減少した糖尿病リスクを示すコンパレータレベルとの間の偏差を減少させる処置である。

随意的に、処置は、メタボリックサージャリー、超低炭水化物食（「ＶＬＣＤ：ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｄｉｅｔ」、炭水化物制限、またはカロリー制限を備える。

随意的に、処置は、抗糖尿病薬を備える。

随意的に、方法は、処置を施すステップに続いて、処置後の被験者から得られたサンプル中でパネルの各バイオマーカーのレベルを測定するステップと、処置後レベルを処置前レベルと比較するステップと、処置が被験者の糖尿病レベルを減少させたかどうかを評価するステップとをさらに備える。随意的に、方法は、糖尿病リスクが処置によって減少しなかったという判定に続いて処置を修正するステップをさらに備える。

本発明の第４の態様は、本明細書に教示される１つ以上のバイオマーカーのパネルを検出するための１つ以上の試薬を備えるキットを提供する。１つ以上の試薬は、１つ以上の内部標準を備え、集合的に、１つ以上の内部標準がパネルのバイオマーカーごとに少なくとも１つ内部標準を提供する。随意的に、キットは、前記内部標準の混合物（例えば、それらの混合物）を備える。随意的に、１つ以上の内部標準は、凍結乾燥される。随意的に、１つ以上の試薬は、コンテナ中に提供される。

本発明のいずれの態様においても、パネルは、随意的に、１つ以上の胆汁酸、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の遊離脂肪酸、および／または１つ以上の血液生化学指標バイオマーカーを備える。

随意的に、１つ以上の胆汁酸は、グリコヒオデオキシコール酸（「ＧＨＤＣＡ」）、タウロヒオデオキシコール酸（「ＴＨＤＣＡ」）、ヒオデオキシコール酸（「ＨＤＣＡ」）、タウロケノデオキシコール酸（「ＴＣＤＣＡ」）、タウロデオキシコール酸（「ＴＤＣＡ」）、グリコヒオコール酸（「ＧＨＣＡ」）、ヒオコール酸（「ＨＣＡ」）、タウロヒオコール酸（「ＴＨＣＡ」）、およびタウロリトコール酸（「ＴＬＣＡ」）から選択される。

随意的に、１つ以上のアミノ酸は、１つ以上の分岐鎖アミノ酸（「ＢＣＡＡ：ｂｒａｎｃｈ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ」）および／または１つ以上の芳香族アミノ酸（ＡＡＡ：ａｒｏｍａｔｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を備える。随意的に、ＢＣＡＡは、ロイシン、イソロイシン、およびバリンのうちの１つ以上を備える。随意的に、ＡＡＡは、フェニルアラニンおよび／またはチロシンを備える。

随意的に、１つ以上のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸、βアラニン、クレアチン、シスチン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、N−アセチル−L−アスパラギン酸、プロリン、ピログルタミン酸、セリン、S−メチル−L−システイン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンのうちの１つ以上を備える。

随意的に、１つ以上の遊離脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、１２−メチルトリデカン酸（Ｃ１４：０ｉｓｏ）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１ｎ５）、１３−メチルミリスチン酸（Ｃ１５：０ｉｓｏ）、ペンタデカン酸（Ｃ１５：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、１４−メチルペンタデカン酸（Ｃ１６：０ｉｓｏ）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１ｎ７）、パルミトエライジン酸（Ｃ１６：１ｔ９）、１５−メチルパルミチン酸（Ｃ１７：０ｉｓｏ）、マーガリン酸（Ｃ１７：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、１６−メチルマーガリン酸（Ｃ１８：０ｉｓｏ）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、エライジン酸（Ｃ１８：１ｔ９）、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）、ノナデカン酸（Ｃ１９：０）、ノナデセン酸（Ｃ１９：１ｎ９）、エイコセン酸（Ｃ２０：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）、エルカ酸（Ｃ２２：１ｎ９）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−６）、およびエイコセン酸（Ｃ２０：１ｎ−９）のうちの１つ以上を備える。

随意的に、１つ以上の血液生化学指標バイオマーカーは、総トリグリセリド（「ＴＧ：ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ」）、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨＢＡ１ｃ：Ｇｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ）、グルコース、インスリン、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ：ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）のうちの１つ以上を備える。

随意的に、パネルは、
ａ．ＧＨＤＣＡまたは総胆汁酸のうちの％ＧＨＤＣＡ、ＴＨＤＣＡまたは％ＴＨＤＣＡ、ＨＤＣＡまたは総胆汁酸のうちの％ＨＤＣＡ、ＨＣＡまたは総胆汁酸のうちの％ＨＣＡ、ＧＨＣＡまたは％ＧＨＣＡ、ＴＨＣＡまたは％ＴＨＣＡのうちの１つ以上（例えば、各々）、
ｂ．パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、およびアラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）のうちの１つ以上（例えば、各々）、
ｃ．イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、およびフェニルアラニンのうちの１つ以上（例えば、各々）、
ｄ．ＴＧ、
ｅ．（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ａ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、または（ｃ）および（ｄ）の組み合わせ、
ｆ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせ、
ｇ．（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）の組み合わせ、
ｈ．（ａ）、（ｃ）、および（ｄ）の組み合わせ、または
ｉ．（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の組み合わせ
を備える。

本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。 本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。 本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。 本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。 本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。 本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。データは、Ｐ／Ｓ（Ｃ１６：０／Ｃ１８：０）比を用いて１０年追跡血清サンプルから生成された。 本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。データは、Ｐ／Ｓ（Ｃ１６：０／Ｃ１８：０）比およびＴＧを用いて１０年追跡血清サンプルから生成された。 本発明の方法を実行するのに有用なＲＯＣ曲線を示す。データは、Ｐ／Ｓ（Ｃ１６：０／Ｃ１８：０）比、Ｏ／Ｓ比（Ｃ１８：１ｎ９／Ｃ１８：０）およびＤＧＬＡ／Ａ比（Ｃ２０：３ ｎ６／Ｃ２０：４ｎ６）を用いて１０年追跡血清サンプルから生成された。 本発明のキットを示す。 本発明のキットを示す。 本発明のキットを示す。 本発明に有用なバイオマーカーを示す。 本発明に有用なバイオマーカー・パネルを示す。バイオマーカー・パネルは、パネルＡ〜ＢＺとして識別される。 本発明に有用なバイオマーカー・パネルを示す。バイオマーカー・パネルは、パネルＡ〜ＢＺとして識別される。 本発明に有用なバイオマーカー・パネルを示す。バイオマーカー・パネルは、パネルＡ〜ＢＺとして識別される。 種々の胆汁酸および対照（ＷＴ，野生型、および溶媒，ＤＭＳＯ）を用いた処置後のＴＧＲ５およびＧＬＰ１のレベルを示す。

方法
概要
本発明の一実施形態は、被験者における糖尿病状況（例えば、糖尿病リスク）を評価するステップを備える診断方法を提供する。本明細書に教示されるパネルの１つ以上のバイオマーカーのレベルを、被験者から得られたサンプル中で、測定して、１つ以上のバイオマーカーのレベルの測定レベルを糖尿病リスクと相関付けることによって、随意的に、糖尿病リスクを評価できる。相関に基づいて、本発明は、被験者が糖尿病を進展させる増加したリスクを有すると評価し、それによって、糖尿病を進展させる増加したリスクを有する被験者を識別できる。

随意的に、糖尿病を進展させる増加したリスクを有すると識別された被験者が糖尿病の発症を遅らせるか、もしくは防ぐ、または糖尿病リスクを減少させる処置を受けるために選択される。

随意的に、本方法は、パネルの１つ以上のバイオマーカーのレベルをモニターするステップを備える。モニタリングの方法は、初めに（例えば、処置を受ける前に）被験者から提供できる第１の生体サンプルと、後で（例えば、処置後に）被験者から提供できる第２の生体サンプルとを提供するステップと、第１のサンプルおよび第２のサンプル中で１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップとを備えることができる。

被験者
本発明の方法は、被験者から得られた生体サンプル中で１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定できる。被験者は、任意の被験者、例えば、ヒト被験者とすることができる。

本発明は、実装されたときに、ある被験者における糖尿病リスクを、糖尿病の典型的な表現型もしくは糖尿病リスクを示すかまたは示さない複数の被験者と相関付けるのに驚くほど有用である。

随意的に、被験者は、代謝的に健康な被験者である。

随意的に、被験者は、代謝的に健康な被験者、糖尿病を進展させるリスクがあるとこれまでに診断されなかった被験者、糖尿病または前糖尿病を有するとこれまでに診断されなかった被験者、および糖尿病または糖尿病リスクを減少させる処置（例えば、メタボリックサージャリーまたは超低炭水化物食）を受けた被験者のいずれかである。

随意的に、被験者は、代謝的に健康である。例えば、被験者は、ＦＰＧ≦６．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＯＧＴＴ≦７．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳＢＰ／ＤＢＰ＜１４０／９０ｍｍＨｇ、空腹時血漿ＴＧ＜１．７ ｍｍｏｌ、空腹時血漿ＨＤＬ≧０．９ｍｍｏｌ／Ｌ （男性について）または≧１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性について）のうちの１つ以上または各々を示す。随意的に、被験者は、高コレステロール（ＴＣ＜５．１８ｍｍｏｌ／Ｌ）の既往歴、心血管疾患または内分泌疾患の病歴を有さず、前に糖尿病と診断されたことがないか、および／または高血圧の既往歴を有さない。

随意的に、被験者は、低空腹時低血糖、インスリン、またはＨＢＡ１ｃレベルのうちの１つ以上（例えば、各々）を示す。例えば、被験者は、≦１０ｍＵ／ｍＬの空腹時インスリンレベル、６％未満の空腹時ＨＢＡ１ｃレベル、および／または≦１２６ｍｇ／ｄｌの空腹時グルコースレベルを示しうる。

随意的に、被験者は、高血圧、例えば、１４０／９０超の一貫した（例えば、経時的な繰り返し測定の）血圧を示さない。

随意的に、被験者は、１３７超のＬＤＬコレステロール・レベルおよび／または２００超の総コレステロール・レベルを示さない。

随意的に、被験者は、肥満でない被験者である。例えば、被験者は、３０未満、２９未満、または２５未満のＢＭＩを有しうる。

随意的に、被験者は、過体重でない。例えば、被験者は、２４未満のＢＭＩを有しうる。

随意的に、被験者は、過体重である。例えば、被験者は、少なくとも２４のＢＭＩを有しうる。

随意的に、被験者は、非病的に肥満の被験者である。例えば、被験者は、３５未満のＢＭＩを有しうる。

随意的に、被験者は、女性について≦３０％の脂肪率を有する女性、または≦２５％の体脂肪率を有する男性である。

随意的に、被験者は、少なくとも２４または少なくとも２８のＢＭＩを有し、被験者は、ＦＰＧ≦６．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＯＧＴＴ≦７．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳＢＰ／ＤＢＰ＜１４０／９０ｍｍＨｇ、空腹時血漿ＴＧ＜１．７ ｍｍｏｌ、空腹時血漿ＨＤＬ≧０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性について）または≧１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性について）を示す。

随意的に、被験者は、２８未満または２４未満のＢＭＩを有し、被験者は、ＦＰＧ≦６．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＯＧＴＴ≦７．８ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳＢＰ／ＤＢＰ＜１４０／９０ｍｍＨｇ、空腹時血漿ＴＧ＜１．７ｍｍｏｌ、空腹時血漿ＨＤＬ≧０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性について）または≧１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性について）を示す。

サンプル
本発明の方法は、被験者から得られた生体サンプル（「サンプル」）中で１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定できる。

随意的に、サンプルは、血液、血漿、または血清を備える。例えば、かかるサンプルのいずれかを絶食の期間後に被験者から得ることができる。空腹時サンプルの採取は、当技術分野ではよく知られている。

随意的に、サンプルは、血清を備えるか、または血清からなる。本明細書では、「血清」は、フィブリン塊および血液細胞の除去後に得られる血液の流体部分を指し、循環血液中の血漿から区別される。

内部標準
本発明の方法は、随意的に、測定されるバイオマーカーのうちの１つ以上（例えば、各々）のための内部標準の使用を備える。随意的に、内部標準を測定前にいつでもサンプルと混合することができる。

随意的に、内部標準は、サンプル調製前のサンプル中で既知の初期レベルを有し、それぞれのバイオマーカーの信号を正規化するために用いる測定信号を提供できる。

サンプル調製のステップが時には測定前にバイオマーカーの実質的な損失を誘発することがある。予測可能なサンプル調製技術の開発と同じ分離および測定装置（例えば、同じＬＣＭＳマシン）の使用とによって測定の正確さおよび精度を向上できるが、異なるサンプル調製媒体、方法、および測定マシンの使用が、バイオマーカーの回収および／または測定信号に予測不可能な変化を誘発することがありうる。適宜に、本発明では、サンプル調製および測定の間のそれぞれのバイオマーカーの損失（すなわち、回収の非一貫性）および／または信号レベルの変動を補償するために、随意的に、内部標準を用いることができる。例えば、サンプル収集後ではあるが測定のためのサンプル調製前（例えば、濾過、抽出、および／または沈殿ステップ前）に、内部標準をサンプルに加えることができる。

随意的に、内部標準は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ用に構成される。

随意的に、提供される内部標準は、その原子の１つ以上が１つ以上の原子の安定同位体（例えば、（２）Ｈ、（１３）Ｃ、（１５）Ｎ、または（１８）Ｏ）で置き換えられたことを除いて、パネルの対応するバイオマーカーと同じ化合物である。例えば、パネルの各バイオマーカーの同位体標識バリアントを提供することによってバイオマーカーの所与のパネルに対する内部標準のセットを提供できる。

随意的に、内部標準化合物は、測定されるそれぞれの１つ以上のバイオマーカーと化学的に同様であるが、同一ではなく、その結果、内部標準は、サンプル調製中に同様の挙動を示すが、測定ステップの間に一意的にそれを識別できる。随意的に、内部標準は、内部標準の測定信号レベルに対するサンプル調製の影響がそれぞれのバイオマーカーの測定信号レベルと比較して同じでなければならないように選択される。

随意的に、内部標準は、１つ以上の調製（例えば、抽出または他の精製）ステップ、およびバイオマーカー分離ステップの前にサンプルと混合される。

随意的に、パネルは、複数のバイオマーカーとバイオマーカーごとに異なる内部標準（例えば、標識以外はそれぞれのバイオマーカーと同一の標識したバイオマーカー）とを備える。代わりに、複数のバイオマーカーの正規化のために少なくとも１つの内部標準（例えば、同じ化合物クラスの１つのバイオマーカー、１つ以上のそれぞれのバイオマーカー、例えば、複数の胆汁酸に対する標識したステロイド酸または胆汁酸、複数の脂肪酸バイオマーカーに対する標識した脂肪酸、および／または複数のアミノ酸に対する標識したアミノ酸）が提供される。例えば、本明細書に教示されるパネルのすべての遊離脂肪酸に対する内部標準として、随意的に、ノナデカン酸−ｄ３７を提供できる。

随意的に、内部標準は、同位体標識した化合物である。代わりに、内部標準は、サンプル中に見出されない、例えば、血液、血漿、または血清中には見出されないいずれかの化合物である。

随意的に、内部標準は、安定同位体標識した化合物（例えば、バイオマーカーの標識バリアントまたはバイオマーカーと同様の特性をもつ化合物の標識バリアント）である。随意的に、安定同位体は、（２）Ｈ、（１３）Ｃ、（１５）Ｎ、または（１８）Ｏである。

随意的に、１つ以上の内部標準は、（例えば、胆汁酸バイオマーカーに用いる）胆汁酸のような標識したステロイド酸、（例えば、脂肪酸バイオマーカーに用いる）標識した脂肪酸、および／または（例えば、アミノ酸バイオマーカーに用いる）標識したアミノ酸から選択される。

随意的に、有用な内部標準は、サンプル中で決定されることになるそれぞれのバイオマーカーのいずれかの安定同位体標識バリアントである。随意的に、内部標準は、パネルから測定されることになる代謝物バイオマーカーと同じ化学的特性を有する。例えば、タンパク質沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ：ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、アセトン、またはエタノールによる）および／または（本明細書に教示されるフィルターを用いた）濾過によってサンプルから抽出されたときに、パネルの対応するバイオマーカーに対して、同じ回収パーセントをもたらすように、内部標準を選択できる。特定のバイオマーカー・パネルを所与として、当業者は、対応するバイオマーカーと同じかまたは共通の化学的特性を有する内部標準を直ちに選択することができ、同じかまたは共通の化学的特性とはバイオマーカーおよび内部標準の回収パーセンテージに影響を与える化学的特性（例えば、分子量、極性、共通のＲ基など）のことである。随意的に、各内部標準の回収率は、それぞれのバイオマーカーと実質的に同じであり、例えば、対応するバイオマーカーと比較して回収率における差が１０％、７％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満である。

例えば、以下は、本発明において対応するバイオマーカー測定に有用な内部標準を示す、すなわち、

（例えば、ヒオコール酸（ＨＣＡ」）のために用いる）コール酸（ＣＡ）−ｄ４、

（例えば、グリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ）のために用いる）ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）−ｄ４、タウロケノデオキシコール酸（「ＴＣＤＣＡ」）、タウロデオキシコール酸（「ＴＤＣＡ」）、グリコヒオコール酸（「ＧＨＣＡ」）、および／またはタウロヒオコール酸（「ＴＨＣＡ」））、

（例えば、タウロリトコール酸（「ＴＬＣＡ」）のために用いる）リトコール酸（ＬＣＡ）−ｄ４、

（例えば、一価不飽和遊離脂肪酸のために用いる）トリデカン酸−Ｄ２５、

（例えば、飽和遊離脂肪酸のために用いる）ノナデカン酸−ｄ３７、

（バリンのために用いる）バリン−ｄ８、

（ロイシンのために用いる）ロイシン−５，５，５−ｄ３、

（イソロイシンのために用いる）イソロイシン−２−ｄ１、

（チロシンのために用いる）チロシン−３，３−ｄ２、および

（フェニルアラニンのために用いる）フェニルアラニン−３，３−ｄ２。

本明細書に提供される教示を用いると、当業者は、バイオマーカー・パネルの選択に基づいて有用な内部標準を直ちに選択できる。

サンプル調製
本発明において測定されるバイオマーカーを、随意的に、被験者から得られたサンプルから抽出できる。例えば、方法は、随意的に、サンプルを抽出媒質と接触させるステップと、サンプルからバイオマーカーを抽出するステップと、抽出された脂質を（例えば、クロマトグラフィーによるバイオマーカーの分離に続いて質量スペクトロメトリーによって）測定するステップとを備える。

抽出媒質は、測定するステップでは測定されないサンプルの１つ以上の他の成分からバイオマーカーを抽出することを許容する任意の媒質とすることができる。随意的に、抽出媒質は、溶液（例えば、タンパク質沈殿溶液）、フィルター、または両方を備える。

測定
本発明の方法は、随意的に、生体サンプル中に存在する１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定する。本明細書に教示されるバイオマーカーを測定するのに有用な任意の仕方で、測定するステップを行うことができる。

随意的に、測定する方法は、質量スペクトロメトリー（「ＭＳ」）を備える。例えば、ガスクロマトグラフィー（「ＧＣ」）または液体クロマトグラフィー（「ＬＣ」）のような個別の技術に続いて、ＭＳを行うことができる。随意的に、ＭＳは、ＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、または超高速液体クロマトグラフィー−トリプル四重極型質量スペクトロメトリー（ＵＰＬＣ−ＴＱ）を備える。

随意的に、測定のステップには抽出（例えば、濾過）および／または分離（例えば、クロマトグラフィー）のステップが先行する。クロマトグラフィーは、サンプル中の成分を移動相と固定相と間の分配挙動の差に基づいて分離する方法である。典型的に、カラムが固定相を保持し、移動相がカラムを通してサンプルを運ぶ。固定相中へ強く分配するサンプル成分は、より多くの時間をカラム中で過ごし、主として移動相に留まってカラムをより速く通過する成分から分離される。成分がカラムから溶離するにつれて、例えば、質量スペクトロメータを用いてそれらの成分を測定できる。

随意的に、クロマトグラフィー・カラム中では、本明細書に教示されるパネルの各々のバイオマーカーがサンプルの同じアリコットからアリコットのインストラクションに従って測定される。かかる実施形態は、すべてのバイオマーカーを単一のアリコットから分離することができ、並列したサンプル調製、抽出、および分離ステップの必要性をなくすことによって効率的な方法を提供する。

十分な分離を得るために、クロマトグラフィー条件、例えば、カラム温度、移動相の組成、移動相の流速、溶離条件、分析時間ならびに代謝物の質量フラグメンテーション・パターン（測定されることになるバイオマーカーの親イオンおよび娘イオン）を目的に合わせることによって、すべてのバイオマーカーのかかる同時進行を提供できる。

着目するバイオマーカーが検体（例えば、パルミチン酸またはステアリン酸）であるときには、「測定する」ステップは、検体のレベルを測定するステップ（例えば、レベルを示す信号を測定するステップ）を含むことができる。着目するバイオマーカーが複数の検体に基づく算出結果、例えば、比（例えば、Ｐ／Ｓ比）、パーセンテージ（例えば、総胆汁酸のうちの％ＧＨＤＣＡ）、または合計（例えば、ＴＧ，総トリグリセリド）であるときには、測定するステップは、複数の検体の各々のレベルを測定するステップと、測定レベルに基づいてバイオマーカーのレベルを算出するステップとを含むことができる。

バイオマーカーに関して本明細書に用いる用語「レベル」は、サンプル中に存在するバイオマーカーのいずれかの定量的または定性的表現、例えば、量（例えば、質量）または濃度（例えば、ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、もしくはモル濃度）とすることができる。濃度として表現されるときには、レベルをサンプル調製（例えば、抽出）前に得られるサンプルの体積（または重量）に関して表現すことができる。

相関
本発明の方法によれば、糖尿病状況を評価するステップは、随意的に、パネルの１つ以上のバイオマーカーの測定レベルを糖尿病リスクと相関付けるステップを備えることができる。相関に基づいて、糖尿病を進展させるリスク（例えば、糖尿病を進展させる尤度）を随意的に判定できる。例えば、被験者が糖尿病を進展させると思われるか（例えば、尤度が予め設定した尤度閾値より大きいか）、または糖尿病を進展させる（例えば、リスク閾値より大きい）高いリスクを有するかどうかを判定できる。かかる被験者は、糖尿病を進展させるリスクがあると本明細書では時には言われる。リスクがあると判定された被験者が、例えば、助言および／または処置を受けるように、これらの被験者を、随意的に、識別および／または選択できる。

随意的に、相関付けるステップは、１つ以上の測定されたバイオマーカーレベルをそれぞれのコンパレータレベル（例えば、低リスクもしくはリスクなしを示すレベル、またはリスクレベルを区別する閾値レベル）と比較するステップを備える。加えてまたは代わりに、バイオマーカーの１つまたは複数の測定レベルをモデル（例えば、数式またはアルゴリズム）へ入力できて、このモデルが測定レベルに基づいて単一のスコアを計算する。かかるスコア自体を糖尿病を進展させるリスクと相関付けることができる（例えば、このスコアが、ある期間内の糖尿病の進展のような、臨床エンドポイントを示す閾値スコアと比較される）。

バイオマーカーレベル（例えば、測定レベル）または（例えば、モデルによって計算された）スコアを、参照限界、判別限界、または糖尿病リスクのような状態に関するカットオフポイントおよび異常値を定義するためのリスク定義閾値のような技術を利用して、それぞれ、コンパレータレベルまたはコンパレータスコアと比較することができる。バイオマーカーのコンパレータレベルまたは組み合わされたバイオマーカースコアは、例えば、糖尿病を進展させるリスクがないか、または糖尿病を進展させるリスクが低い被験者（あるいは、逆にリスクがあるか、またリスクが高い被験者）に典型的に見出される、それぞれ、レベルまたはスコアとすることができる。リスクは、被験者の測定レベルまたはスコアがコンパレータレベルまたはスコアより大きいか、または低いかに依存して上昇または下降しうる（例えば、注目されるのは、表３に関して、ＧＨＤＣＡおよび％ＧＨＤＣＡ以外のすべてのバイオマーカーが以降に糖尿病を進展させた被験者では増加し、ＧＨＤＣＡおよび％ＧＨＤＣＡが以降に糖尿病を進展させた被験者では減少したことである）。かかるコンパレータレベルまたはカットオフポイントは、随意的に、バイオマーカーが単独で用いられるが、または他のバイオマーカーをスコア中に組み合わせた式に用いられるかどうかに基づいて変動してよい。代わりに、コンパレータレベルまたはスコアは、臨床的に意義のある時間地平（例えば、１、２、５、または１０年）にわたって糖尿病を進展させなかった先にテストされた被験者から、または、（例えば、実施例に教示されるように）臨床的に意義のある時間地平にわたって糖尿病を進展させた被験者を糖尿病を進展させなかった被験者から区別すると判定された閾値からこれを決定できる。随意的に、コンパレータレベルまたはコンパレータスコアは、高リスクリスク被験者と低リスク被験者とを区別する、それぞれ、レベルまたはスコアである。高リスクスコアまたは糖尿病進展尤度は、臨床医によって随意に定義できて、例えば、少なくとも７０％のリスク（例えば、コンパレータ以上のレベルまたはスコアを有した調査被験者の７０％が時間地平にわたって糖尿病を進展させた）、少なくとも７５％のリスク、少なくとも８０％のリスク、少なくとも８５％のリスク、少なくとも９０％のリスク、少なくとも８５％のリスク、少なくとも９０％のリスク、または少なくとも９５％のリスクを示すことができる。加えてまたは代わりに、いくつかのリスク分類（例えば、非常に低い、低い、中間、高い、および非常に高い）を提供できて、各分類が所与のレベルまたはスコア範囲によって識別される。加えてまたは代わりに、レベルまたはスコアを糖尿病を進展させるリスク（例えば、相対もしくは絶対）または尤度（例えば、パーセント尤度）と相関付ける式（例えば、曲線）を提供できる。

随意的に、パネルの１つ以上のバイオマーカーの測定または算出レベルの各々を備えるプロファイルが提供されて、この測定プロファイルがコンパレータのバイオマーカー・プロファイルと比較される。コンパレータのバイオマーカー・プロファイルを発生させるために、本発明のバイオマーカーを用いることができる。コンパレータのバイオマーカー・プロファイルは、例えば、バイオマーカー・プロファイルを示したサンプルの取得に続く臨床的に有意な期間内に糖尿病を進展させなかった、または稀にしか糖尿病を進展させなかった被験者から採られた、低リスクまたはリスクなしのコンパレータとすることができる。代わりに、コンパレータ・プロファイルは、例えば、バイオマーカーを示したサンプルの取得に続く臨床的に有意な期間後に糖尿病を進展させた、または通常は糖尿病を進展させた被験者から採られた、高リスクのコンパレータとすることができる。随意的に、糖尿病を進展させるリスクがある被験者を識別するため、疾患の進行をモニターするため、糖尿病リスクの進行をモニターするため、または処置の有効性をモニターするために、高リスクのコンパレータ・プロファイルを低リスクのプロファイルと比較することができる。随意的に、高リスクのコンパレータ・プロファイルおよび／または低リスクのコンパレータ・プロファイルを不揮発性メモリ上に記憶することができる。

随意的に、本発明の方法は、測定されたバイオマーカーレベルを糖尿病リスクと相関付けるためにモデル（例えば、アルゴリズム）を用いる。モデルを用いたかかる相関は、そのために構成されたシステム、例えば、モデルを実装して、スコアを測定されたマーカーレベルの入力に基づいて算出するコンピュータ上でこれを行うことができる。随意的に、本発明のバイオマーカー・パネルの測定結果は、リスクスコアを計算するアルゴリズムを実装するモデルでプログラムされたコンピュータまたはマイクロプロセッサへの入力としての役割を果たす。最終リスクスコアを算出するために、システムでテストされるバイオマーカーに加えて、いくつかの因子（例えば、ＢＭＩ、年齢、および性別のような生理的因子）を用いる場合には、システムがリスクスコア算出を完了できるようにこれらの因子をモデルに供給できるか、あるいは、アルゴリズムが予備スコアを生成できて、最終リスクスコアを算出するためにその予備スコアが報告されて、外部的に他の因子と組み合わされることになろう。

進展のリスクが評価される糖尿病は、随意的に、いずれかの糖尿病状態とすることができ、糖尿病状態を有する被験者が示す任意のエンドポイントによってそれを識別できる。糖尿病エンドポイントは、例えば、少なくとも１４０（例えば、時には前糖尿病に対するエンドポイントとして用いる、１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬ）、または（時には古典的な糖尿病に対するエンドポイントとして用いる）少なくとも２００ｍｇ／ｄｌの２時間グルコースレベルを含むことができる。加えてまたは代わりに、糖尿病エンドポイントは、少なくとも５．７％（例えば、時には前糖尿病に対するエンドポイントとして用いる、５．７％および６．４％）の、または（時には古典的な糖尿病に対するエンドポイントとして用いる）少なくとも６．５％の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）レベルを含むことができる。糖尿病は、例えば、インスリン非依存性糖尿病とすることができ、前糖尿病または古典的な糖尿病とすることができる。代わりに、糖尿病を分類するために、任意の他エンドポイント、例えば、メタボリック症候群（「症候群Ｘ」）、耐糖能障害（ＩＧＴ：Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、および空腹時高血糖（ＩＦＧ：Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｆａｓｔｉｎｇ Ｇｌｙｃｅｍｉａ）を用いることができる。ＩＧＴは、食後のグルコース調節異常を指し、一方でＩＦＧは、空腹状態で測定される異常を指す。世界保健機構は、ＩＦＧの値を６．１ｍｍｏｌ／Ｌ（１００ｍｇ／ｄＬ）またはより大きい（全血５．６ｍｍｏｌ／Ｌ；１００ｍｇ／ｄＬ）が、７．０ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）（全血６．１ｍｍｏｌ／Ｌ；１１０ｍｇ／ｄＬ）より小さい空腹時血漿グルコース濃度として定義する。米国コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ）によるメタボリック症候群は、血圧１３０／８５ｍｍＨｇ以上、空腹時血漿グルコース６．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、腹囲＞１０２ｃｍ（男性）または８８ｍｍ（女性）、トリグリセリド１．７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、およびＨＤＬコレステロール＜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）または１．３ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）のうちの少なくとも３つを有するとして定義される。前糖尿病状態をもつ多くの個人は、２型糖尿病（「Ｔ２ＤＭ：ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ」）へ転換しないであろう。「耐糖能障害」（ＩＧＴ）は、正常より高いが、真性糖尿病として分類されるほど十分に高くはない血糖レベルを有するとして定義される前糖尿病状態である。ＩＧＴをもつ被験者は、７５ｇ経口グルコース負荷テストに対して１４０〜１９９ｍｇ／ｄＬ（７．８〜１１．０ｍｍｏｌ）の２時間グルコースレベルを有するであろう。これらのグルコースレベルは、正常を上回るが糖尿病に特徴的なレベルを下回る。耐糖能障害または空腹時グルコース異常をもつ被験者は、糖尿病を進展させるかなりのリスクを有し、従って一次予防に対する重要なターゲット・グループである。これらのエンドポイントは、臨床診断のよく知られたエンドポイントであるが、当業者は、かかるエンドポイントを変更して、有用な糖尿病エンドポイントを本発明に従って作り出すことができることがわかるであろう。さらに、糖尿病またはインスリン抵抗性の情報を与える他のエンドポイントを用いることもできる。随意的に、かかるエンドポイントを用いて、糖尿病を進展させた、またはさせなかった過去の被験者に基づくコンパレータ・プロファイル・スコアをトレーニングできて、このコンパレータ・プロファイル・スコアを用いて、彼の糖尿病リスクが評価されることを望む被験者に対する比較を行うことができる。

「リスク」は、本発明の文脈では、例えば、明白な２型糖尿病への転換におけるように、特定の期間にわたってある事象が発生するであろう確率を含み、被験者の「絶対」リスクまたは「相対」リスクを意味することができる。絶対リスクは、適切な時間コホートに関する実際観察の事後測定を参照するか、あるいは、適切な期間にわたって追跡した統計学的に有効な過去のコホートから開発されたインデックス値を参照してこれを測定できる。相対リスクは、被験者の絶対リスクを低リスク・コホートの絶対リスクか、または平均集団リスクのいずれかと比較した比を指し、臨床リスク因子をどのように算定するかによって変動しうる。オッズ比、所与のテスト結果に関する正事象の負事象に対する割合も非転換に対してよく用いられる（オッズは、式ｐ／（１−ｐ）により、ここでｐは事象ありの確率であり、（１−ｐ）は事象なしの確率である）。本発明の文脈において算定されてよい代わりの連続的な尺度は、糖尿病転換までの時間および治療上の糖尿病転換リスク減少比を含む。

「リスク評価」は、本発明の文脈では、事象または病状が発生するかもしれない確率、オッズ、もしくは尤度、事象の発生、または一方の病状から他方への、すなわち、正常血糖状態から前糖尿病状態もしくは前糖尿病への、あるいは前糖尿病状態から前糖尿病もしくは糖尿病への転換の比率の予測を行うステップを包含する。リスク評価は、先に測定された集団に関する、絶対的あるいは相対的な、将来のグルコース、ＢＨＡ１ｃスコアまたは糖尿病の他のインデックスの予測も備えることができる。本発明の方法は、随意的に、２型糖尿病への転換のリクスの連続的またはカテゴリー的な測定を行い、結果として、前糖尿病として定義された被験者のカテゴリーのリスク・スペクトルを診断して、定義するためにこれを用いることができる。カテゴリー的なシナリオでは、正常な被験者コホートと前糖尿病の被験者コホートとを区別するために本発明を用いることができる。他の実施形態では、前糖尿病を糖尿病から、または糖尿病を正常から区別するために本発明が用いられてよい。かかる異なった使用は、随意的に、個々のパネル、数学的アルゴリズム、および／またはカットオフポイントにおける異なるバイオマーカーの組み合わせを必要とすることがあるが、意図される使用に対して同じ前述の測定精度に従ってよい。

一実施形態において、糖尿病リスクの評価は、リスクスコアを算出するステップを備える。本発明のいくつかのスコアリング方法が（例えば、実施例に詳述されるように）ロジスティック回帰ベースの相関を用いて例示されるが、本発明は、相関の任意の方法を考慮する。例えば、糖尿病リスクスコアの算出のためのアルゴリズムを開発するために、本発明に開示されるようなバイオマーカーのセットの選択後に、よく知られた技術、例えば、相互相関、主成分分析（ＰＣＡ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、因子回転、ロジスティック回帰（ＬｏｇＲｅｇ：Ｌｏｇｉｓｔｉｃ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、線形判別分析（ＬＤＡ：Ｌｉｎｅａｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、Ｅｉｇｅｎｇｅｎｅ線形判別分析（ＥＬＤＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ：Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｍａｃｈｉｎｅ）、Ｒａｎｄｏｍ Ｆｏｒｅｓｔ（ＲＦ）、再帰的分割木（ＲＰＡＲＴ：Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ Ｔｒｅｅ）、関連する決定木分類技術、Ｓｈｒｕｎｋｅｎ Ｃｅｎｔｒｏｉｄｓ（ＳＣ）、ＳｔｅｐＡＩＣ、Ｋ近傍法、ブースティング、決定木、ニューラルネットワーク、ベイジアンネットワーク、サポートベクターマシン、および隠れマルコフモデル、線形回帰または分類アルゴリズム、非線形回帰または分類アルゴリズム、分散分析（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｔｓ）、階層的分析またはクラスタリング・アルゴリズム、決定木を用いた階層的アルゴリズム、カーネルベース・マシン・アルゴリズム、例えば、カーナル部分最小２乗アルゴリズム、カーナル・マッチング追跡アルゴリズム、カーネルフィッシャーの判別分析アルゴリズム、もしくはカーネル主成分分析アルゴリズム、または他の数学的および統計的方法を用いることができる。一般に、個人の選択集団を用い、この集団におけるバイオマーカーの値、および（例えば、実施例に詳述される）糖尿病の進展など、それらの臨床成績に関する過去の情報が利用可能である。糖尿病リスクスコアを所与の個人に関して算出するために、その個人から採取した１つ以上のサンプルから、随意的に、バイオマーカー値を得て、入力データとして、すなわち、個人のその選択集団から得られた実際の過去データにフィッティングしたモデル（例えば、アルゴリズム）への入力として、それらの値を用いることができる。

本発明の性能、従って、その絶対的または相対的な臨床的有用性は、先に指摘された多数の方法で算定されてよい。性能の様々な算定の中でも、本発明は、糖尿病リスクの予測および処置のモニタリングにおける精度を提供することを意図する。精度は、糖尿病を進展させるか、またはさせないであろう被験者を区別するためのテスト、アッセイ、あるいは方法の能力に係わり、１つ以上のバイオマーカーの有効レベルもしくはレベルにおける実質的な変化、またはそれらから算出したスコアを被験者が有するかどうかに基づく。有効レベルまたは実質的な変化が意味するのは、バイオマーカーの測定結果が、それぞれ、そのバイオマーカーまたはそのレベルの変化に関する所定のカットオフポイント（もしくは閾値）とは異なること、およびそれゆえに、被験者が糖尿病を進展させるリスクがあるか、または（例えば、モニタリングの方法での）糖尿病リスクの変化を経験したことをその測定結果が示すということである。リスクあり（または高リスク）とリスクなし（または低リスク）との間のバイオマーカーのレベルにおける差は、好ましくは、統計学的に有意であり、本明細書に教示される実施例からすぐに分かるように、バイオマーカーレベルにおける増加であってもまたはバイオマーカーレベルにおける減少であってよい。本発明は、（例えば、特定の遺伝的、生理的、臨床的状態を示す）いくつかの集団に関して、統計学的有意性、従って、好ましい分析的および臨床的精度を達成する、１つのバイオマーカー・パネルの使用を考慮するが、統計学的に有意なリスクスコアを達成するために、多くは、パネル中で一緒に用いられ、数学的モデル（例えば、アルゴリズム）と組み合わされることになるいくつかのバイオマーカーの組み合わせを含む。

病状のカテゴリー診断と同様に、本発明による糖尿病リスクに関するテストのカットポイントまたは閾値を変更すると、往々にして定性的に逆の関係においてではあるが、感受性と特異性とを変化させることがある。それゆえに、カットポイントの範囲にわたって感受性および特異性が著しく変動することがあるため、提案される方法の精度および有用性を算定するときに、テスト設計者は、随意的に、感受性および特異性の両方を考慮に入れ、感受性および特異性が報告されるカットポイントがどのようなカットポイントであるかを心に留めるとよい。本発明を用いたリスク評価には、すべての潜在的なカットポイント値を包含する、ＡＵＣのような統計データの使用が時には好ましい。

かかる統計データを用いると、糖尿病リスクを評価するために本発明の方法を用いた診断精度の許容しうる度合いは、ＡＵＣ（テストまたはアッセイに関するＲＯＣ曲線下の面積）が、随意的に、少なくとも０．６０、またはより大きい、例えば、少なくとも０．６５、少なくとも０．７０、少なくとも０．７５、少なくとも０．８０、または少なくとも０．８５である。随意的に、ＡＵＣは、さらに大きく、例えば、０．８７５、少なくとも０．９０、または少なくても０．９５である。

随意的に、診断精度の度合い、すなわち、ＲＯＣ曲線上のカットポイントを定義し、許容しうるＡＵＣ値を定義して、リスクがある被験者を低リスクの被験者から区別するバイオマーカーのレベル（またはスコア）を（個別的または集合的に）構成する許容範囲を相対濃度で決定することによって、本発明は、糖尿病を進展させるリスクがある被験者を高レベルの予測可能性および性能によって識別するために当業者がバイオマーカーを用いることを許容する。

以下に詳述されるように、モデルを開発し、および／または用いることもできる。

スコアリング・モデルの開発
本発明を実行するためのモデルの開発の詳細を本明細書に教示される実施例が提供するが、本明細書において特定されるバイオマーカーおよび本明細書に教示される関係を用いると、スコアを算出するために用いる数学的モデルをいずれかの仕方で作り出すことができて、本明細書において収集され、提示されるデータに依存する必要はないことが当業者にはわかるであろう。

（例えば、実施例に詳述されるように）バイオマーカーレベル測定に続く臨床的に有意な期間にわたって糖尿病を進展させた、およびさせなかった人々からのデータを含む代表集団からのバイオマーカーレベル・データを得ることによって、例えば、モデルを作り出すことができる。かかるデータは、本明細書に提供される教示（例えば、実施例に詳述されるバイオマーカー・データ）から、直接に集団から、ある期間にわたる代表集団の観察を伴う前向き（縦断）研究、サンプルに質問する代表集団のサンプルの後ろ向き研究から、および／または、ＮＩＨデータベースのような、以前の研究からの結果を含む後ろ向き疫学データ・ストレージから得ることができる。バイオマーカー・データは、単一の研究または複数の研究から導出されてもよく、一般に、本明細書に記載されるバイオマーカーの値、（エンドポイントを含んでよい）臨床的アノテーション、およびとりわけ、本発明に用いるために、多くの被験者にわたって、アルゴリズムをトレーニングするための所望のエンドポイントを含めて、所望の兆候に関するデータおよび代表集合のエンドポイントを含む。次にバイオマーカーレベル・データは、随意的に、不揮発性メモリ上に記憶される。

以下に記載されるように、バイオマーカーの選択に用いることになるモデルまたは分析の必要条件を満たすために、必要に応じて、次に代表集合のデータセットを準備できる。例えば、データセットの準備は、代表集団、またはその選ばれたサブセット内の各被験者からバイオマーカーレベル値を準備するステップを含んでよい。しかしながら、モデルのトレーニングのために未加工のバイオマーカーレベル・データだけでは完全に有用ではないことがある。そのように、データを準備するために、様々なデータ準備方法、例えば、ギャップフィル技術（例えば、最近接内挿または他のパターン認識）、品質チェック、様々な式（例えば、統計的分類アルゴリズム）を用いたデータの組み合わせ、正規化および／または変換、例えば、モデルの必要条件を満たすためにデータの分布を変化させるための対数関数（例えば、底１０、自然対数など）を用いてよい。この場合もやはり、特定のデータ準備手順は、代表集団データを用いてトレーニングされることになる１つまたは複数のモデルに依存する。様々に異なるモデル・タイプに特有のデータ準備技術が知られており、さらに記載する必要はない。

特定のバイオマーカーが随意的に選択されて、糖尿病状態を進展させるリスクを評価するために用いるモデルのトレーニングに引き続き用いられる。バイオマーカーの選択は、代表集団のデータセットを検証するために選択モデルを利用するステップと、最も再現性のある結果を提供するデータセットからバイオマーカー・データを選択するステップとを伴ってよい。データセット検証の例は、交差検証およびブートストラッピングを含んでよいが、それらには限定されない。バイオマーカーの選択から、糖尿病状態を進展させるリスクを評価するのに用いることになるモデルが決定され、選択されてよい。しかしながら、注目されるのは、すべてのモデルが同じデータセットによって同じ結果を提供する訳ではないことである。例えば、異なるモデルが異なる数のバイオマーカーを利用し、異なる結果を生成して、それによって選択モデル上のバイオマーカーの組み合わせに有意性を加えてもよい。適宜に、リスク評価のための最適モデルを識別するために、複数の選択モデルが選ばれて、代表集団のデータセット、またはデータセットのサブセットとともに利用されてよい。バイオマーカーを選択するために用いるとよい、統計モデル、アルゴリズムなどを含む、特定のモデルの例が上述された。

データセット、またはそのサブセットとともに用いる選択モデルごとに、バイオマーカーがモデルにおける各バイオマーカーの統計学的有意性に基づいて随意的に選択される。各モデルへ入力されたときに、バイオマーカーが統計学的有意性に関する様々な判定基準に基づいて随意的に選択され、累積投票および重み付けをさらに伴ってよい。統計学的有意性に関するテストは、出口テストおよび分散分析（ＡＮＯＶＡ）を含んでよい。モデルは、分類モデル（例えば、ＬＤＡ、ロジスティック回帰、ＳＶＭ、ＲＦ、ツリーモデルなど）および生存モデル（例えば、ｃｏｘ）を含んでよく、その多くの例が上述された。

注目されるのは、統計学的に有意なバイオマーカーを識別するために、バイオマーカーが各選択モデルに対して個々に適用されてよいが、いくつかの事例では、個々のバイオマーカーだけでは所望されるより低い予測力を提供しかねず、そのケースでは、選択モデルにバイオマーカーの組み合わせが適用されてよいということである。例えば、単変量のバイオマーカー選択を利用するのではなく、多変量のバイオマーカー選択が利用されてもよい。すなわち、バイオマーカーを他のバイオマーカーと組み合わせて用いるときに（例えば、モデルへの多変量入力）、各マーカーを単独に採用した場合には示さなかったであろう追加の情報をこの組み合わせにもたらすことがあるため、そのときと比較して、バイオマーカーを選択モデルへの単変数入力として用いるときには、それほど良いインジケータではないことがある。

リスクを評価するために用いることになるモデルが選択され、トレーニングされて、検証される。特に、主要な候補モデルは、その例が上述された１つ以上の性能基準に基づいて選択されてよい。例えば、データセット、またはデータサブセットを様々なモデルとともに用いることによって、統計学的に有意なバイオマーカーを決定するためにこれらのモデルを用いるだけではなく、最適モデルをバイオマーカーと一緒に選択するためにその結果を用いてよい。そのように、リスクを評価するために用いるモデルが、分類モデルおよび生存モデルを含めて、選択モデルとして用いるモデルのうちの１つを含んでよい。モデル・マーカーの組み合わせが、マーカー・サブセットを含めて、サブセットまたは個々のデータセット単位で比較され、検証されてよい。モデルをトレーニングし、検証して、適切なモデルを選ぶために、比較および検証が何度も繰り返されてよく、その適切なモデルが次に糖尿病を進展させるリスクを評価するためのモデルとして用いられる。

スコアリング・モデルの使用
本発明を実行するためのモデルを本明細書に教示される実施例が提供するが、本明細書において特定されるバイオマーカーおよび本明細書に教示される関係を用いると、本明細書に教示されるバイオマーカー・パネルを用いたいずれかの数学的モデルを糖尿病リスクを評価するために随意的に用いることができることが当業者にはわかるであろう。

例えば、本明細書に教示されるパネルの１つ以上のバイオマーカーの入力に基づいてリスクスコアを算出できる数学的モデルが提供される。バイオマーカーレベル・データが被験者から得られて、随意的に不揮発性メモリ）上に記憶される。被験者のバイオマーカー・データは、自己申告、健康診断、臨床検査および既存の医療記録、チャートまたはデータベースを含む様々な手段を通じて初めに導出されてよい。被験者のバイオマーカーレベルは、（例えば、本明細書に教示されるスコアリング・モデルを開発する方法に詳述されるように）選択され、トレーニングされたモデル・タイプに従って、例えば、必要に応じて算出、変換、ログ、組み合わせ、正規化などを用いて準備されてよい。データが一旦準備されると、被験者のバイオマーカー・データをモデルへ入力できる。モデルは、次に、リスクスコアを出力できる（例えば、リスクスコアは、糖尿病を進展させる尤度、相対リスク、または糖尿病罹患までの予測期間などを示す）。スコアおよび他の評価ステップによって予測される糖尿病は、例えば、２型糖尿病および他の糖尿病状態ならびに前糖尿病状態を含む。

処置
本発明の方法は、評価された被験者、例えば、糖尿尿を進展させるリスクが増加した（例えば、リスクあり、または高リスク）として識別された被験者を処置するステップを備える。

本発明において有用な処置は、例えば、運動レジメン、食事の変更、メタボリックサージャリー、医薬の投与、および糖尿病について知られたいずれかの処置を含むことができる。食事の変更の例は、毎日の炭水化物摂取の減少、超低炭水化物食（「ＶＬＣＤ：ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｄｉｅｔ」、炭水化物摂取＜２０ｇ／日））およびカロリー制限を含む。メタボリックサージャリーの例は、肥満外科手術、胃バイパス術、胆膵路転換手術、十二指腸スイッチ術およびルーワイ胃バイパス術を含む。

随意的に、処置は、抗糖尿病薬を投与するステップを備える。随意的に、抗糖尿病薬は、インスリン感受性改善薬（例えば、ビグアニジン）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（「ＰＰＡＲ：ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ」）活性化因子（例えば、チアゾリジンジオン）、胆汁酸、胆汁酸捕捉剤（例えば、コレセベラム）、ＤＰＰ−４阻害薬、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１受容体作動薬、ＴＧＲ５作動薬、スルホニル尿素系薬剤（例えば、グリベンクラミド）、メグリチニド、ナトリウム・グルコース共輸送体２（「ＳＧＬＴ２：Ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ２」阻害薬）、αグルコシダーゼ阻害薬、ドパミン作動薬（例えば、ｃｙｃｌｏｓｅｔ）、アミリン・ミメティック（例えば、プラムリンチド）、およびインスリンまたはそのアナログもしくは誘導体から選択される。

随意的に、処置は、抗糖尿病薬、例えば、小分子を備える。例は、メトホルミンのようなビグアニジン、またはロシグリタゾンもしくはピオグリタゾンのようなチアゾリジンジオンを含む。

随意的に、処置は、ＧＨＤＣＡ、ＴＨＤＣＡ、ＨＤＣＡ、ＨＣＡ、ＧＨＣＡ、ＴＨＣＡのような胆汁酸、またはそれらの誘導体を投与するステップを備える。かかる処置薬は、随意的に、経口または静脈内投与される。随意的に、経口投与される処置は、錠剤、カプセル、顆粒剤、または栄養補助食品として製剤される。他の有用な胆汁酸および胆汁酸誘導体は、Ｍｉｌｊｋｏｖｉｃらへの米国特許第６，０６０，４６５号、Ｋｒａｍｅｒらへの欧州特許出願公開第０４１７７２５（Ａ２）号、およびＰｅｌｌｉｃｃｉａｒｉへの米国特許第８，４４５，４７２号に開示される。他の有用な胆汁酸は、本明細書に教示される式ＩおよびＩＩの胆汁酸である。他の有用な胆汁酸は、Ｇ蛋白質共役胆汁酸受容体１（「ＴＧＲ５：Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １」）を結合するかまたは調節する（例えば、その作動薬である）か、またはその塩および抱合体を含めて、グルカゴン様ペプチド−１（「ＧＬＰ−１：Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１」）の産生を誘発する、コレステロールから誘導されるいずれかのステロイドカルボン酸である。例えば、自然に発生する胆汁酸は、しばしばグリシンまたはタウリンと抱合される。

随意的に、処置は、式Ｉの化合物を投与するステップを備える。随意的に、Ｒ１は、α−ＯＨおよびβ−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜１０から選択される。随意的に、Ｒ２は、α−ＯＨ、α−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜６、または−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜６から選択される。随意的に、Ｒ３は、α−ＯＨおよびＨから選択される。随意的に、Ｒ４は、Ｈおよび（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜６から選択される。随意的に、Ｒ５は、−ＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜１、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｅｔ、ｎ＝１〜１０から選択される。随意的に、Ｒ１〜Ｒ５は、化合物がヒトに自然に発生する胆汁酸ではないように選択される。例えば、ＨＤＣＡ、ＧＨＤＣＡ、およびＴＨＤＣＡは、すべてが同じＲ１＝α−ＯＨ、Ｒ２＝α−ＯＨ、Ｒ３＝Ｈ、Ｒ４＝Ｈを共有し、ＨＤＣＡではＲ５がＯＨであり、ＧＨＤＣＡではＲ５がＮＨ（ＣＨ２）ＣＯＯＨであり、およびＴＨＤＣＡではＲ５がＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈである。代わりに、Ｒ１〜Ｒ５は、任意の置換基とすることができる。

随意的に、処置は、式ＩＩの化合物を投与するステップを備える。随意的に、Ｒ１〜Ｒ５およびＲ７〜Ｒ９、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、独立して水素またはＸＬであり、ここでＸは、何もない、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮＬであり、Ｌは、水素、金属イオン、ハロゲン、最多で１０炭素原子を有し、分岐ありまたは分岐なしのアルキルまたはアレニルラジカル、３〜８炭素原子を有するシクロアルキルラジカル、置換なしかまたはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシによって１〜３回置換されたベンジルラジカルであり、Ｒ６は、Ｒ６は、（ＣＨ２）ｎ、０≦ｎ≦５であり、Ｌは、Ｒ１に結合され、Ｌは、択一的にアミノ酸とすることができる。随意的に、Ｒ１は、α−ＯＨおよびβ−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＨ、ｎ＝１〜１０から選択される。随意的に、Ｒ２は、α−ＯＨ、α−（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜６、または−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜６から選択される。随意的に、Ｒ３は、α−ＯＨおよびＨから選択される。随意的に、Ｒ４は、Ｈおよび（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜６から選択される。随意的に、Ｒ５は、ＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）ＣＯＯＨ、ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＯ３Ｈ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、ｎ＝０〜１、またはＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｅｔ、ｎ＝１〜１０から選択される。随意的に、Ｒ６は、（ＣＨ２）ｎ、ｎ＝１〜５から選択される。随意的に、Ｒ７は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル、およびＯＲ１０から選択される。随意的に、Ｒ８は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル、およびＯＲ１１から選択される。随意的に、Ｒ９は、Ｈ、Ｃ_１〜Ｃ_３アルキル、およびＯＲ１２から選択される。随意的に、Ｒ１０〜１２は、ＨおよびＣ_１〜Ｃ_３アルキルから各々が選択される。代わりにＲ１〜Ｒ１２は、任意の置換基とすることができる。

本発明は、式ＩもしくはＩＩの塩、溶媒和物、水和物、またはプロドラッグあるいはそれらを備える処置も考慮する。

本発明は、別の化合物（例えば、グリシンまたはタウリンのようなアミノ酸）へ抱合された式ＩまたＩＩの化合物を備える化合物および処置も考慮し、例えば、抱合体は、Ｒ５において形成され、Ｒ５がＯ、Ｎ、もしくはＳを備えるか、または抱合体は、式ＩまたはＩＩの環水素を置き換えたＯ、Ｎ、もしくはＳにおいて形成される。随意的に、ＧＬＰ１の産生を増加させる式ＩまたはＩＩの化合物が、例えば、ＴＧＲ５とは独立した仕方で選択される。それらに関するアッセイのいずれかの例が実施例２０に詳述される。

随意的に、処置は、例えば、胆汁酸（例えば、ＨＤＣＡおよび／またはＨＣＡ）あるいはそれらのアナログと、本明細書に教示される別の抗糖尿病薬（例えば、メトホルミンまたはチアゾリジンジオン）との薬剤の組み合わせを投与するステップを備える。

随意的に、処置は、ジペプチジルペプチダーゼ−４（「ＤＰＰ−４：ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４」）阻害薬を投与するステップを備える。随意的に、ＤＰＰ−４阻害薬は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、ゲミグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、アログリプチン、トレラグリプチン、デュトグリプチン、オマリグリプチン（ｍｋ−３１０２）、ベルベリン、およびルペオールから選択される。

随意的に、処置は、グルカゴン様ペプチド−１（「ＧＬＰ−１」）受容体作動薬を投与するステップを備える。随意的に、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、エキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、アルビグルチド、およびデュラグルチドから選択される。

随意的に、処理は、ＧＬＰ−１を投与するステップを備える。有用なＧＬＰ−１ペプチドの例は、ネイティブなＧＬＰ−１（例えば、ヒト）、またはＧｕｐｔａ（Ｇｕｐｔａ Ｖ．Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ−１ ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２０１３；１７（３）：４１３−４２１．ｄｏｉ：１０．４１０３／２２３０−８２１０．１１１６２５）、Ｂｕｃｋｌｅｙらへの米国特許第５，５４５，６１８号、およびＫｎｕｄｓｅｎらへの米国特許第６，４５８，９２４号によって教示されるもののような、ＧＬＰ−１ミメティックを含む。

随意的に、処置は、ＴＧＲ５作動薬を投与するステップを備える。有用なＴＧＲ５作動薬の例は、１，４−ジアゼピン−２−オン化合物、およびＫａｓａｔｋｉｎらへの国際公開第２０１６／１４９６２８（Ａ１）号、ロシア特許第２５４３４８５（Ｃ２）号（登録日２０１５年３月１０日）、およびＳｍｉｔｈらへの米国特許出願公開第２０１３／００８５１５７（Ａ１）号に教示される化合物を含む。他の有用なＴＧＲ５作動薬は、２−チオイミダゾール誘導体、例えば、化合物６ｇ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ａ Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ Ｏｒａｌｌｙ Ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ＴＧＲ５ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｇｏｎｉｓｔ．Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．Ｄｅｓａｉ ＡＣＳ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１６ ７ （１），５１−５）、およびＲＤＸ９８９４０を含む。

随意的に、処置は、ＳＧＬＴ２を投与するステップを備える。随意的に、ＳＧＬＴ２は、エンパグリフロジン、カナグリフロジン、ダパグリフロジン、およびイプラグリフロジンから選択される。

随意的に、処置は、αグルコシダーゼ阻害薬を投与するステップを備える。随意的に、αグルコシダーゼ阻害薬は、アカルボース、ミグリトール、およびボグリボースから選択される。

随意的に、処置は、胆汁酸捕捉剤、例えば、コレスチラミン、コレセベラム、またはコレスチポールを投与するステップを備える。

他の有用な処置は、国際公開第２０１６０９４７２９（Ａ１）号（Ｂｏｅｈｍら）、米国出願公開第２０１３０１９６８９８（Ａ１）号（Ｄｕｇｉら）、または米国特許第８５１３２６４（Ｂ２）号（Ｍａｒｋら）に教示されるいずれかの薬剤を投与するステップを含む。

随意的に、処置は、糖尿病の個人、例えば、２型糖尿病をもつ糖尿病の個人のためのいずれかの標準治療である。

理論によって束縛されることなく、本発明者が信じるのは、測定されたバイオマーカーレベル、または測定されたバイオマーカーレベルに基づく算出スコアに従って被験者の糖尿病リスクを低下させるために、本明細書に教示される処置を、糖尿病の発症を遅らせ、減少させるか、または防ぎ、被験者におけるバイオマーカーレベルを随意的に修正するであろう治療有効量で処方し、投与することができるということである。例えば、本発明者は、研究を実施して、その研究から糖尿病を進展させるリスクがある被験者におけるＰ／Ｓ比および血清トリグリセリドをＶＬＣＤが減少させることを見出した。治療効果を実証するために測定できるバイオマーカーは、本発明のバイオマーカーまたはそれらのパネル、あるいは空腹時血糖、インスリン、ＨＢＡ１ｃ、ＧＬＰ１、またはＴＧＲ５のような糖尿病状況のいずれかの既知のバイオマーカーを含む。

本発明は、本発明のバイオマーカーが測定された被験者の処置を考慮するが、本発明は、本発明の診断方法以外であっても、本明細書に開示される処置のうちのいずれかの使用を同様に考慮する。例えば、本明細書に開示された処置の方法を、本発明の診断方法に続いて、または本発明の診断方法を行うことなしに用いることができる。例えば、本発明者が信じるのは、ＨＤＣＡおよび／またはＨＣＡ、あるいはそれらのアナログまたは誘導体の投与など、本明細書に開示されるいくつかの治療方法が先行技術では知られておらず、糖尿病、前糖尿病、前糖尿病状態を有する被験者、またはそれらのいずれかを進展させるリスクがある被験者を処置する新規な方法をこれらが提供するというである。さらに、本発明は、（例えば、化合物を用いる方法に係わらず）式ＩまたはＩＩのいずれかの化合物の化合物自体を考慮する。

モニタリング
一実施形態において、本発明の方法は、１つ以上のバイオマーカーのレベルをモニターするステップを備える。本発明によるモニタリングの方法は、第１の生体サンプルおよび第２の生体サンプルを提供するステップであって、第１のサンプルは、１回目に被験者から得られ、第２のサンプルは、２回目に被験者から得られ、２回目が１回目より後である、提供するステップと、第１のサンプルおよび第２のサンプルの各々において１つ以上のバイオマーカーのレベルを測定するステップと、第１のサンプルからの測定レベルを第２のサンプルの測定レベルと比較するステップ、または各サンプルにおいて測定されたレベルを糖尿病リスクと相関付けて、第１のサンプルから相関付けられた糖尿病リスクを第２のサンプルから相関付けられた糖尿病リスクと比較するステップのいずれかとを備える。

随意的に、１回目は、被験者が処置を受ける前であり、２回目は、被験者が処置を受けた後である。適宜に、本発明によるバイオマーカーのレベルを測定するステップは、随意的に、被験者の糖尿病リスクをモニターするか、または治療経過をモニターすることをさらに許容にする。

随意的に、第１のサンプルおよび第２のサンプルからの１つ以上のバイオマーカーのレベルの比較が糖尿病リスクにおける所定の（例えば、実質的な）減少を示さないか、または１つ以上のバイオマーカーレベルのレベルにおける所定の（例えば、実質的な）変化を示さない場合には、処置が修正される。

適宜に、例えば、被験者における２型糖尿病の発症を遅らせる、減少させるか、または防ぐように様々な治療レジメン（または治療介入）の選択および開始を可能にするために、糖尿病を進展させるリスクが増加した被験者を識別するステップを用いることができる。バイオマーカーのレベルを測定するステップは、処置の経過をモニターすることを随意的にさらに許容する。この方法では、処置を受ける前に第１の生体サンプルを被験者から提供できて、処置後に第２の生体サンプルを被験者から提供できる。

キット
一実施形態において、本発明の方法は、本発明のパネルの１つ以上のバイオマーカーを検出するためのキットを提供する。キットに含まれるのは、本発明のパネルの１つ以上のバイオマーカーを検出するための１つ以上の内部標準である。集合的に、１つ以上の内部標準は、パネルのバイオマーカーごとに少なくとも１つ内部標準を提供する。

随意的に、キットは、コンテナ、フィルター、または両方（例えば、コンテナ中のフィルター）を備える。随意的に、コンテナは、１つ以上の内部標準を備える。加えてまたは代わりに、フィルターが１つ以上の内部標準を備える。かかるキットの例が図９Ａ、９Ｂ、および１０に示される。

随意的に、内部標準は、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳ用に構成される。

随意的に、１つ以上の内部標準は、複数の内部標準である。随意的に、内部標準は、混合物で提供される。代わりに、複数の内部標準のうちの１つ以上を互いに分離できる。

随意的に、１つ以上の内部標準は、固体または液体形態で提供される。随意的に、１つ以上の内部標準は、脱水されるか、または（例えば、凍結乾燥によって）フリーズドライされる。固体内部標準は、例えば、キットの使用の前に溶液中に懸濁できる。

随意的に、内部標準は、本明細書に教示されるいずれかである。

随意的に、１つ以上の内部標準は、標識したステロイド酸（例えば、胆汁酸）、標識した脂肪酸、および／または標識したアミノ酸を備える。標識は、（２）Ｈまたは（１３）Ｃのような同位体とすることができる。

随意的に、各内部標準は、その原子の１つ以上が１つ以上の原子の安定同位体（例えば、（２）Ｈ、（１３）Ｃ、（１５）Ｎ、または（１８）Ｏ）で置き換えられたことを除いて、パネルの対応するバイオマーカーと同じ化合物である。例えば、各バイオマーカーの同位体標識バリアントを提供することによって、バイオマーカーの所与のパネルのための内部標準のセットを提供できる。随意的に、パネルは、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ〜ＢＺから選択されたいずれかのパネルである。

随意的に、キットは、フィルターを備える。随意的に、１つ以上の内部標準は、（例えば、図９および図１０に示すように）フィルター上に堆積される。随意的に、フィルターは、（例えば、図９および図１０に示すように）コンテナ中に設けられるか、またはコンテナ中または上に配置されるように構成される。随意的に、フィルターは、（例えば、図９Ａに示すように）コンテナから取り外し可能である。随意的に、フィルターは、フィルターホルダへ、例えば、コンテナ中に置くことができるフィルターホルダ（例えば、筒状フィルターホルダ、および／または図９および図１０に示すような縁を有するフィルターホルダ）、例えば、図９Ａに示すように、例えば、別のコンテナの内部に置くことができる（硬い側壁をもつ）それ自体がコンテナであるフィルターホルダへ搭載される。随意的に、フィルターがコンテナ中にあるときに、（例えば、図９Ｂに示すように）コンテナは、例えば、フィルターの両側に空隙または空洞を設けることによって、ある体積の液体をフィルターの両側に保持することができる。かかるキットは、溶液をフィルターの第１の側からフィルターを通して溶液をフィルターの第２の側へ推し進めるように随意的にコンテナを構成することを許容する。濾液がフィルターの第１の側に補充された内部標準およびバイオマーカーを含むようにフィルターを構成できる。次に、バイオマーカーおよび内部標準を測定するために、例えば、フィルターを除去することによって（例えば、ＧＣＭＳまたはＬＣＭＳを用いて）濾液を分析できる。随意的に、フィルターは、パネルのバイオマーカーの通過および内部標準が通過することを許容するが、タンパク質（例えば、沈殿したタンパク質）のような他の成分を保持する細孔径をもついずれかのフィルターである。例えば、フィルターは、０．２２μｍフィルターとすることができる。随意的に、フィルターは、ポリフッ化ビニリデン、セルロース（例えば、酢酸セルロース）、またはナイロン・フィルターである。随意的に、フィルターは、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ：ｂｕｔｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｌｕｅｎｅ）のような抗酸化剤を備える。

随意的に、１つ以上の内部標準がブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような抗酸化剤と混合される。例えば、脂肪酸のような内部標準を分解から保護し、結果として、キットの貯蔵寿命を伸ばすためにかかる抗酸化剤を提供できる。

随意的に、キットは、１つ以上の内部標準をその中に備えた少なくとも１つのコンテナを備える。随意的に、コンテナは、チューブ、バイアル、またはマルチウェルもしくはマルチチャンバ・プレートである。キットは、単一のコンテナ（例えば、ウェルもしくはチャンバ）を有してもよく、または複数のコンテナ（例えば、ウェルもしくはチャンバ）を有してもよい。例えば、キットは、マルチウェル・プレート（例えば、９６ウェル・マイクロタイター・プレートのようなマイクロタイター・プレート）を備えることができる。他の類似したコンテナも考慮される。いくつかのキットでは、コンテナは、内部標準の測定および被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物の定量化に用いるのに適しうる。いくつかのキットでは、内部標準の測定および被験者サンプル中の１つ以上の代謝物の定量化に用いるコンテナを、例えば、クロマトグラフィー−質量スペクトロメトリーのようなスペクトル分析に用いるように構成する。例えば、コンテナをＧＣ−ＴＯＦＭＳおよび／またはＬＣ−ＴＱＭＳ用に構成してよい。他のキットでは、被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物に特有の（例えば、酵素、化学、比色、蛍光など）他の分析テスト用にコンテナを構成してもよい。

いくつかのキットは、複数のコンテナを含む。例えば、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上のコンテナを含む。加えて、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上のコンテナ、ならびに内部標準の測定および被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物の定量化に用いるための追加のコンテナ（例えば、マルチウェル・プレートまたは別のチューブもしくはバイアル）を含む。いくつかのキットには、１つ以上の内部標準を含むために用い、かつ内部標準の測定および被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物の定量化に用いる単一のコンテナが有る。

マルチウェル、マルチチャンバ、または他のマルチコンテナ・デバイスを備えるキットでは、使用のためのキットの分配の際に、内部標準が、随意的に、１つ以上のウェルまたはチャンバ中に配置されてよい。いくつかのキットでは、内部標準がコンテナの外側に提供され、キットを用いる間にコンテナ（単数または複数）中へ分散されなければならない。

生体サンプルを少なくとも１人の被験者から受け取るように、キットのコンテナを構成することもできる。例えば、キットが複数のチャンバもしくはウェルを含む場合に、１人の被験者からの生体試料を１つ以上のチャンバもしくはウェル中へ分配してもよい。いくつかの事例では、被験者サンプルの１つ以上の分量を複数のチャンバもしくはウェル中へ分配してもよい。一般に、キットのコンテナを流体サンプル（例えば、流体生体サンプルか、または分析用の流体を得るために処理した固体生体サンプル）を受け取るように構成する。

いくつかのキットは、内部標準の測定および被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物の定量化のために有用な試薬も含む。キットではこれらの試薬を１つ以上の追加のコンテナ中に含めてよい。

例示的なキットは、各々が同じかまたは個別のコンテナ中に提供された内部標準を備えてよい。コンテナは、随意的に、例えば、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳデバイスのいずれかとともに用いるように構成された、マイクロタイター・プレートの形態で設けられる。マイクロタイター・プレートは、少なくとも１つの内部標準を受け取るのに十分な数のウェルを有するであろう。内部標準は、既知の濃度を有し、コンテナ中に予め存在することになるか、または既知量の各内部標準をマイクロタイター・プレートの個別のウェルへ分注するために用いられることになろう。内部標準を分析コンテナへ分注した後に、被験者サンプルの一部分もマイクロタイター・プレートへ分注できる。被験者サンプルの単一の部分を分注するか、あるいは複数の部分を分注することができる。複数の部分をマイクロタイター・プレートへ分注する場合には、各部分を個別のウェルへ分注してよい。加えて、複数の部分をマイクロタイター・プレートへ分注する場合には、各部分が異なる分量であってよい。

コンピュータおよびモジュールならびに自動化システム
測定、関連付け、および報告のうちの１つ以上を行うように構成したコンピュータの使用を通じて本発明の方法を実装できる。適宜に、本発明の一実施形態は、測定（例えば、分析マシンからの測定信号をバイオマーカーレベルへ変換するステップ）、評価するステップ（例えば、バイオマーカーレベルを糖尿病リスクと相関付けるステップ、またはバイオマーカーレベルを、スコアを計算する数学的モデルへ入力するステップ）、および／または評価の結果を報告するステップのために構成されたモジュールを備える不揮発性メモリを提供する。随意的に、本発明は、マイクロプロセッサおよび不揮発性メモリを備えるコンピュータを提供し、マイクロプロセッサがモジュールを実行するように構成される。

測定および／または評価する（例えば、相関付ける、値を比較する、またはスコアを算出する）ステップは、そのためのモジュール（例えば、不揮発性メモリ上に記憶され、マイクロプロセッサによって実行されるプログラム）を備えるコンピュータを用いてこれらを行うことができる。例えば、接続された測定デバイス（例えば、「ＭＳ」）からのバイオマーカーレベルを示す信号を解釈して、バイオマーカーのレベルをそれから算出する測定モジュールを提供できる。随意的に、測定モジュールは、その信号をそれぞれの内部標準から（例えば、ＭＳを用いて）得た信号と比較することによってバイオマーカーのレベルを正規化するように構成される。別の例として、バイオマーカーレベルをアルゴリズム（例えば、リスクスコアまたは糖尿病を進展させる尤度を計算するか、またはバイオマーカーレベルをコンパレータレベルと比較するアルゴリズム）への入力として用いて糖尿病リスクの判定を行う評価モジュールを提供できる。

随意的に、モジュールは、評価の結果を報告するように構成される。報告メカニズムの例は、可視表示、データ構造もしくはデータベースへのリンク、またはプリンタを含む。報告手段は、随意的に、テスト結果を外部デバイス、例えば、データ構造、データベース、可視ディスプレイ、またはプリンタへ送るためのデータリンクとすることができる。

コンピュータまたはアナログマシンを利用する診断テストシステムを用いて、本発明の方法を自動化できる。バイオマーカーおよびバイオマーカー・パネルを測定するためのテストを多種多様な診断テストシステム上に実装できる。診断テストシステムは、典型的に、生体サンプルからテスト結果を得るための手段を含む装置とすることができる。かかる手段の例は、検査（例えば、検出アッセイ）を自動化するモジュールを含む。診断テストシステムは、随意的に、複数の生体サンプルを扱うように構成できて、各サンプルに関して同じかまたは異なるテストを実行するようにプログラムできる。診断テストシステムは、随意的に、各サンプルに関するテスト結果を、通常はデータ構造またはデータベースにおいて、収集、記憶および／または追跡するための手段を含む。例は、物理的不揮発性記憶デバイス（例えば、ハードドライブ、フラッシュメモリ、磁気テープ、またはペーパー・プリントアウト）を含む。随意的に、診断テストシステムは、テスト結果を報告するための手段である。報告手段の例は、可視ディスプレイ、データ構造もしくはデータベースへのリンク、またはプリンタを含む。報告手段は、随意的に、テスト結果を外部デバイス、例えば、データ構造、データベース、可視ディスプレイ、またはプリンタへ送るためのデータリンクとすることができる。

バイオマーカー
本発明によれば、１つ以上のバイオマーカーを備えるパネルが選択されて、本発明の方法またはキットのために用いられる。

随意的に、パネルは、図１１の１つ以上のバイオマーカーを備える。

随意的に、パネルは、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ〜ＢＺから選択される。各パネルに存在するバイオマーカーは、「ｘ」によって示される。例えば、パネルＡは、ＧＨＤＣＡ（または％ＧＨＤＣＡ）およびＣ１６：０／Ｃ１８：０脂肪酸の比を含む。パネルＡ〜ＢＺのいずれかに追加のバイオマーカー（例えば、図１１にリストされたいずれか）を追加することによって他の有用なパネルを生成できる。

レベルのレベル測定のために選択されるバイオマーカーは、随意的に、検体（例えば、パルミチン酸（「Ｐ」）またはステアリン酸（「Ｓ」）、例えば、検体の絶対レベルとすることができ、または複数の検体レベルに基づく算出結果とすることができる。例えば、算出結果は、検体の比（例えば、Ｐ／Ｓの比）、もしくは１つ以上の検体と比較した１つ以上の検体の相対レベル（例えば、パーセント）（例えば、総胆汁酸のうちの％ＧＨＤＣＡ）、または検体レベルの合計（例えば、総トリグリセリド）とすることができる。第１のバイオマーカーが第２のバイオマーカーの第３のバイオマーカーに対する比として算出されるときには、第２のバイオマーカーおよび第３のバイオマーカーのレベルを測定して、第２のバイオマーカーおよび第３のバイオマーカーの測定レベルから比を算出することによって、第１のバイオマーカーレベルを測定または決定できる。随意的に、パネルのバイオマーカーは、本明細書に教示される少なくとも２つのバイオマーカーの分量または量の合計（例えば、ＧＨＤＣＡ＋ＧＨＣＡもしくは％ＧＨＤＣＡ＋％ＧＨＣＡまたはすべてのＢＣＡＡの合計）によって提供される。

随意的に、本発明によるバイオマーカーのパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のバイオマーカー、またはそれ以上を備える。

本発明のいずれの態様においても、パネルは、随意的に、１つ以上の胆汁酸、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の遊離脂肪酸、および／または１つ以上の血液生化学指標を備える。

随意的に、１つ以上の胆汁酸バイオマーカーは、グリコヒオデオキシコール酸（「ＧＨＤＣＡ」）、パーセントＧＨＤＣＡ（％ ＧＨＤＣＡ）、タウロヒオデオキシコール酸（「ＴＨＤＣＡ」）、パーセントＴＨＤＣＡ（「％ＴＨＤＣＡ」）、ヒオデオキシコール酸（「ＨＤＣＡ」）、パーセントＨＤＣＡ（「％ＨＤＣＡ」）、タウロケノデオキシコール酸（「ＴＣＤＣＡ」）、タウロデオキシコール酸（「ＴＤＣＡ」）、グリコヒオコール酸（「ＧＨＣＡ」）、パーセントＧＨＣＡ（％ＧＨＣＡ）、ヒオコール酸（「ＨＣＡ」）、パーセントＨＣＡ（「％ＨＣＡ」）、タウロヒオコール酸（「ＴＨＣＡ」）、およびパーセントＴＨＣＡ（「％ＴＨＣＡ」）、ならびにタウロリトコール酸（「ＴＬＣＡ」）から選択される。これらの胆汁酸のいずれかの（例えば、後に糖尿病を進展させなかった被験者と比較して、あるいは対照またはコンパレータと比較して）低レベルまたは減少したレベルが糖尿病を進展させるリスク増加の原因となりうる。本発明によれば、ある胆汁酸のパーセント（例えば、％ＧＨＤＣ）、例えば、質量によるパーセント、または分子の数によるパーセントがサンプル中に存在するすべての胆汁酸に対して決定される。随意的に、パネルが複数の胆汁酸を備えるときには、胆汁酸の各々がパーセント胆汁酸として測定されるか、または胆汁酸の各々が胆汁酸の絶対レベルとして測定される。

随意的に、１つ以上のアミノ酸は、１つ以上の１つ以上の分岐鎖アミノ酸（「ＢＣＡＡ」）および／または１つ以上の芳香族アミノ酸（ＡＡＡ）を備える。随意的に、ＢＣＡＡは、ロイシン、イソロイシン、およびバリンのうちの１つ以上を備える。随意的に、ＡＡＡは、フェニルアラニンおよび／またはチロシンを備える。

随意的に、１つ以上のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン酸、βアラニン、クレアチン、シスチン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、N−アセチル−L−アスパラギン酸、プロリン、ピログルタミン酸、セリン、S−メチル−L−システイン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンおよびフェニルアラニンのうちの１つ以上を備える。

随意的に、１つ以上の遊離脂肪酸は、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、１２−メチルトリデカン酸（Ｃ１４：０ｉｓｏ）、ミリストレイン酸（Ｃ１４：１ｎ５）、１３−メチルミリスチン酸（Ｃ１５：０ｉｓｏ）、ペンタデカン酸（Ｃ１５：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、１４−メチルペンタデカン（Ｃ１６：０ｉｓｏ）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１ｎ７）、パルミトエライジン酸（Ｃ１６：１ｔ９）、１５−メチルパルミチン酸（Ｃ１７：０ｉｓｏ）、マーガリン酸（Ｃ１７：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、１６−メチルマーガリン酸（Ｃ１８：０ｉｓｏ）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、エライジン酸（Ｃ１８：１ｔ９）、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）、ノナデカン酸（Ｃ１９：０）、ノナデセン酸（Ｃ１９：１ｎ９）、エイコセン酸（Ｃ２０：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）、エルカ酸（Ｃ２２：１ｎ９）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４ｎ−６）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−６）、エイコセン酸（Ｃ２０：１ｎ−９）、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比、Ｃ１８：１ｎ９／Ｃ１８：０比、およびＣ２０：３ｎ６／Ｃ２０：４のうちの１つ以上を備える。

随意的に、１つ以上の血液生化学的は、総トリグリセリド（ＴＧ）、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨＢＡ１ｃ）、グルコース、インスリン、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）のうちの１つ以上を備える。

随意的に、パネルは、
ａ．ＧＨＤＣＡまたは％ＧＨＤＣＡ、ＴＨＤＣＡまたは％ＴＨＤＣＡ、ＨＤＣＡまたは％ＨＤＣＡ、ＨＣＡまたは％ＨＣＡ、ＧＨＣＡまたは％ＧＨＣＡ、およびＴＨＣＡまたは％ＴＨＣＡのうちの１つ以上（例えば、各々）、
ｂ．パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、およびアラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）のうちの１つ以上（例えば、各々）、
ｃ．イソロイシン、ロイシン、チロシン、バリン、およびフェニルアラニンのうちの１つ以上（例えば、各々）、
ｄ．ＴＧ、
ｅ．（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ａ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、または（ｃ）および（ｄ）の組み合わせ、
ｆ．（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の組み合わせ、
ｇ．（ａ）、（ｂ）、および（ｄ）の組み合わせ、
ｈ．（ａ）、（ｃ）、および（ｄ）の組み合わせ、または
ｉ．（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の組み合わせ
を備える。

随意的に、パネルは、パネルＡ〜ＢＺから選択されたパネルを備え、ＨＢＡ１ｃをさらに備える。

随意的に、パネルは、パネルＡ〜ＢＺから選択されたパネルを備え、総ＢＣＡＡをさらに備える。

随意的に、パネルは、パネルＡ〜ＢＺから選択されたパネルを備え、チロシン、バリン、または両方をさらに備える。

随意的に、パネルは、パネルＡ〜ＢＺから選択されたパネルを備え、ＴＧをさらに備える。

随意的に、パネルは、パネルＡ〜ＢＺから選択されたパネルを備え、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比をさらに備える。

本発明者の知見を通じて、および／または本明細書に教示される例に詳述される発見を通じて、糖尿病リスクを評価する診断能力を提供するために図１１にリストされたバイオマーカーおよび図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ〜ＢＺが決定された。当業者は、本明細書に教示されるバイオマーカーおよびバイオマーカー・パネルに基づいて糖尿病リスクの相関、例えば、ある期間にわたって糖尿病を進展させた、およびさせなかった個人のトレーニング・セットに基づくスコアリング・モデルを得るために、それらのバイオマーカーおよびバイオマーカー・パネルを用いることができる。本明細書に教示されるいくつかのバイオマーカーがこれまでに糖尿病または糖尿病リスクと相関付けられたが、本発明者が信じるのは、糖尿病または糖尿病リスクとこれまでに関連付けられなかったいくつかの他のバイオマーカーの追加が実質的な診断能力をこれまでに既知のかかるバイオマーカーに追加し、それによって、糖尿病を進展させるリスクがある被験者を識別する高い能力をもつ本発明のパネルを提供するということである。

研究設計および集団
研究は、上海交通大学附属第六人民医院において行った。研究プロトコルは、地域倫理委員会によって承認された。文書によるインフォームド・コンセントをすべての参加者から得た。

サンプルセット１： Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｓｔｕｄｙ（ＳＨＯＳ）から合計３１２人の被験者を選択して、横断的研究に登録した。ＳＨＯＳは、糖尿病およびそれと関連する疾患の発症および進展を調査するように設計された前向き研究であった。２００９年に始まって、ＳＨＯＳは、上海、中国における４つのコミュニティから５０００人の参加者を採用し、ベースライン研究ならびに１．５、３、および５年のフォローアップ研究を含んだ。コホート中の３１２人の被験者のうち、１３２人の健康な被験者が正常体重（ＮＷ）であり、１０７人の被験者が過体重または肥満のいずれか（ＨＯ）であり、７３人の被験者を高血圧、高コレステロールまたは高トリグリセリド血症を併発したＴ２Ｄ（ＵＯ）と診断した。集団の臨床的特徴を表１に示す。

サンプルセット２：１０年の縦断研究：Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ（ＳＨＤＳ）から６２人の被験者を選択した。ＳＨＤＳコホートは、糖尿病の罹患率および関連する代謝障害を算定するように設計された多段層化疫学研究であった。この研究は、１９９８年に開始し、そのときに上海、中国における２つの都市コミュニティ、ＨｕａｙａｎｇおよびＣａｏｙａｎｇから５９９４人の個人を登録して、そのうちの１２５０人が２０１０年と２０１１年との間にＨｕａｙａｎｇ地区でフォローアップ調査を完了した。１,２５０人の適格参加者のうちで、ベースラインにおいて過体重／肥満かつ代謝的に健康であった６２人の被験者を選択し、そのうち、５０人は、１０年後に不健康に過体重／肥満で糖尿病を伴い（ＵＯ）、１２人は、健康に過体重／肥満（ＨＯ）のままであった。集団の臨床的特徴を表２に示す。

表１．横断的研究におけるＮＷ、ＨＯおよびＵＯ被験者の臨床的特徴

注：表１における値は、平均値±標準偏差を表す。それぞれ、ＮＷとＨＯ、ＮＷとＵＯ、ＨＯとＵＯとの間でＦＦＡ差を比較するために、マン・ホイットニーのＵ検定を用いてＰ１、Ｐ２、Ｐ３値を算出する。変数は、Ｐ３値によって順序付ける。用いた略語：２ｈ ＩＮＳ，２ｈインスリン、２ｈ ＰＧ，２ｈ食後グルコース、ＤＢＰ，拡張期血圧、ＦＩＮＳ，空腹時インスリン、ＦＰＧ，空腹時血漿グルコース、ＨｂＡ１ｃ，糖化ヘモグロビンＡ１ｃ、ＨＤＬ−Ｃ，高密度リポタンパク質コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ，低密度リポタンパク質コレステロール、ＭＨ，代謝的に健康、ＮＷ，正常体重、ＯＷ／ＯＢ，過体重または肥満、Ｐ／Ｓ，パルミチン／ステアリン酸、ＳＢＰ，収縮期血圧、Ｔ２Ｄ，２型糖尿病、ＴＣ，総コレステロール、ＴＧ，グリセリド。

表２．１０年のフォローアップを伴う縦断研究における参加者のベースラインの臨床的特徴

注：表２における値は、平均値±標準偏差を表す。ＦＣ値は、ＵＯ群における中央値のＨＯ群に対する倍率変化比である。Ｐ１値は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いて算出し、ｐ＜０．０５であれば太字で強調表示する。ＯＲ（９５％ＣＩ）は、メタボリック症候群に関するロジスティック回帰からのオッズ比（９５％信頼区間）である。これらのモデルを年齢、性別、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、および空腹時グルコースについて調整する。Ｐ２値は、ロジスティック回帰モデルから算出する。

診断基準
中国人に関する過体重および肥満の勧告に基づいて、肥満（≧２８ｋｇ／ｍ^２）を定義するためにＢＭＩ ２８ｋｇ／ｍ^２のカットオフポイントを用い、過体重（≧２４ｋｇ／ｍ^２）を定義するために２４ｋｇ／ｍ^２のＢＭＩを用い、正常体重は、（＜２４ｋｇ／ｍ^２）として定義した。Ｚｈｏｕ Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ ２００２；１５（３）：２４５−５２。実施例１では、２つの独立した研究において、空腹時グルコース、経口グルコース負荷テスト（２ｈ−グルコースまたはＯＧＴＴ：ｏｒａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔ）、インスリンレベル、収縮期および拡張期血圧（ＳＢＰおよびＤＢＰ）、総コレステロール（ＴＣ）およびトリグリセリド（ＴＧ）、ならびに高密度リポタンパク質および低密度リポタンパク質（ＨＤＬおよびＬＤＬ）を含む、糖尿病と関連する臨床的特徴および代謝マーカーをすべての参加者について調べた。「代謝的に健康」は、以下のすべてを有するとして定義した、すなわち、ＦＰＧ≦６．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＯＧＴＴ≦７．８ｍｍｏｌ／Ｌおよび糖尿病の前歴がない、ＳＢＰ／ＤＢＰ＜１４０／９０ｍｍＨｇおよび高血圧の前歴がない、空腹時血漿ＴＧ＜１．７ｍｍｏｌ／Ｌおよび空腹時血漿ＨＤＬ≧０．９ｍｍｏｌ／Ｌ（男性）または≧１．０ｍｍｏｌ／Ｌ（女性）、ならびに高コレステロール（ＴＣ＜５．１８ｍｍｏｌ／Ｌ）の前歴がない、心血管または内分泌疾患の前歴がない。Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４；９（５）：ｅ９７９２８。これらの基準のすべてを満たさないことを「代謝的に不健康」と分類した。

耐糖能は、米国糖尿病学会基準、すなわち、正常耐糖能（ＮＧＴ：ｎｏｒｍａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、ＦＰＧ ６．１ｍｍｏｌ／Ｌおよび２ｈ ＰＧ＜７．８ｍｍｏｌ／Ｌ；グルコース調節障害（ＩＧＲ：ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の２つのカテゴリー：ａ）耐糖能障害（ＩＧＴ）、ＦＰＧ＜７．０ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｈ ＰＧ≧７．８および＜１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ならびにｂ）空腹時高血糖（ＩＦＧ：ｉｍｐａｉｒｅｄ ｆａｓｔｉｎｇ ｇｌｙｃｅｍｉａ）、ＦＰＧ＜７．０および≧６．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ならびに２ｈ ＰＧ＜７．８；およびＴ２Ｄ（ＦＰＧ≧７．０ｍｍｏｌ／Ｌもしくは２ｈ ＰＧ ≧１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ、または抗糖尿病処置に従って分類した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２００４；２７：Ｓ１５−３５。

人体測定および生化学的測定
各参加者は、身長、体重、腹囲および血圧の測定を含む健康診断を受けた。身長の２乗（ｍ^２）で除した体重（ｋｇ）として体型指数（ＢＭＩ：ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ）を算出した。腹囲は、中腋窩線上の肋骨下縁と腸骨稜との間の水平面で測定した。血圧は、２分間隔で血圧計を用いて行った３回の測定値の平均であった。

空腹時静脈血サンプルを採取した後に、各参加者が７５ｇ経口グルコース負荷テストを受けた。血漿グルコースレベルをグルコースオキシダーゼ法によって測定した。血清インスリンをバイオ抗体技術（リンコ（Ｌｉｎｃｏ）、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いてアッセイした。血清トリグリセリドおよび高密度リポタンパク質を並列マルチチャンネルアナライザー（日立７６００−０２０、東京、日本）上で標準的な市販の方法によって決定した。研究について知らされていない熟練技術者が高速液体クロマトグラフィー（ＨＬＣ−７３Ｇ７、東ソー、日本）を用いて糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）を測定した。すべての測定を血液採取の２時間以内に実行した。インスリン抵抗性およびβ細胞機能を以下の式を用いて評価した、すなわち、（１）ＨＯＭＡ ＩＲ（ｍＩＵ・ｍｍｏｌ／Ｌ２）＝空腹時インスリン（ｍＩＵ／Ｌ）×空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５、（２）ＨＯＭＡ−β（ｍＩＵ／ｍｍｏｌ／Ｌ）＝２０×空腹時インスリン（ｍＩＵ／Ｌ）／（空腹時グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）−３．５）。

胆汁酸（ＢＡ）のターゲット・メタボロミクス解析
血清サンプル調製。血清の５０μｌのアリコットを１５０μｌのメタノール（内部標準として用いた０．１０μｌのコール酸（ＣＡ）−ｄ４、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）−ｄ４、およびリトコール酸（ＬＣＡ）−ｄ４を含む）と混合した。混合物を次に２分間ボルテックスし、１０分間静置し、その後、４℃で１０分間２００００ｇで遠心分離した。１６０μＬの上澄みのアリコットを清浄なチューブへ移して、真空乾燥させた。残留物を等しい量のアセトニトリル（０．１％ギ酸）および水（０.１％ぎ酸）で再溶解し、４０μＬの最終体積にした。遠心分離後に、上澄みを超高速液体クロマトグラフィー−トリプル四重極型質量スペクトロメトリー（ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ）分析に用いた。

方法検証。混合原液を得るために４１個の標準原液の各アリコットを混合した。すべての４１個のＢＡ標準を含んだキャリブレーション溶液を、活性炭を用いてＢＡを枯渇させたナイーブなプール血清中に０．６１０、１．２２１、２．４４１、４．８８３、９．７６６、１９．５３１、３９．０６３、７８．１２５、１５６．２５０、３１２．５、６２５．０、１２５０．０００、および２５００．００ｎｇ／ｍＬの一連の濃度で調製した。キャリブレーション曲線および対応する回帰係数を内部標準の調整によって得た。測定範囲にわたってすべてのＢＡが直線的であることがわかった。

計装。若干の修正を伴うこれまでに報告された方法に従って血清ＢＡを測定した。Ｘｉｅ，ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ １４（２），８５０−８５９。バイナリソルベントデリバリーマネージャおよびサンプルマネージャを装備したＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ，ミルフォード，マサチューセッツ州）を研究の全体にわたって用いた。質量スペクトロメータは、ＥＳＩ源が付いたＷａｔｅｒｓ ＸＥＶＯ ＴＱ−Ｓ装置（Ｗａｔｅｒｓ，ミルフォード，マサチューセッツ州）であった。ＬＣ−ＭＳシステム全体をＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェアによって制御した。すべてのクトマトグラフィー分離をＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ，１００ｍｍ×２．１ｍｍ内部寸法）（Ｗａｔｅｒｓ，ミルフォード，マサチューセッツ州）を用いて行った。

ＬＣ−ＭＳ分析。移動相は、０.３ｍＬ／分の流速で流れるＬＣ−ＭＳグレード水中の０．１％ギ酸（移動相Ａ）およびＬＣ−ＭＳグレード・アセトニトリル中の０．１％ギ酸（移動相Ｂ）からなった。流速は、以下の移動相グラジエント、すなわち、０〜１分（５％Ｂ）、１〜５分（５−２５％Ｂ）、５〜１５．５分（２５〜４０％Ｂ）、１５．５〜１７．５分（４０〜９５％Ｂ）、１７．５〜１９分（９５％Ｂ）、１９〜１９．５分（９５〜５％Ｂ）、１９．６〜２１分（５％Ｂ）で０．４５ｍＬ／分であった。カラムを４５℃に維持し、すべてのサンプルの注入体積は、５μｌであった。

質量スペクトロメータを１．２ｋｖのキャピラリー電圧を用いて負イオンモードで動作させた。ソースおよび脱溶媒ガス温度は、それぞれ、１５０と５５０℃であった。多重反応モニター（ＭＲＭ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒ）を用いてデータを収集し、コーンおよび衝突エネルギーは、ＢＡごとにＱｕａｎＯｐｔｉｍｉｚｅアプリケーションマネージャ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，ミルフォード，マサチューセッツ州）から最適化した設定を用いた。

データ解析。キャリブレーション式およびサンプル中の各ＢＡの定量濃度を得るために、負モードで得たＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ生データをＴａｒｇｅｔＬｙｎｘアプリケーションマネージャ・バージョン４．１（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，ミルフォード，マサチューセッツ州）を用いて解析した。ＢＡ測定におけるグループ間の差を調べるためにスチューデントのｔ検定を用いた。誤発見率（ＦＤＲ：ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）法によって複数の検査を説明するために、すべての代謝物について得られたｐ値をその後に調整した。Ｐｉｋｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０１１，２（３） ２７８−２８２。ｐ値＜０．０５を有意と見做した。

遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のターゲット・メタボロミクス解析
ＦＦＡ抽出。若干の修正を伴うこれまでに報告された方法を用いて遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の濃度を決定した。Ｐｕｅｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９３；３９（５）：８２５−３２。手短に言えば、１０μＬの同位体標識した内部標準（５μｇ／ｍＬのノナデカン酸−ｄ３７およびトリデカン酸−Ｄ２５）を各４０μＬの血清サンプルへ、続いて５００μＬのイソプロピル／ヘキサン／リン酸（２Ｍ）（体積で４０／１０／１）へ加えた。サンプルを次に２分間ボルテックスした。室温で２０分間インキュベートした後に、４００μＬのｎ−ヘキサンおよび３００μＬの水を加えて、ボルテックスし、１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。次に、４００μＬの上部有機層を新しいチューブへ移し、下部層にはさらなる抽出のために４００μＬのｎ−ヘキサンを加えた。ボルテックスおよび遠心分離後に、すべての上部有機相を次に第１の上澄みと組み合わせて、真空下で乾燥させた。残留物を８０μＬのメタノールで戻して、超高速液体クロマトグラフィー−四重極飛行時間型質量スペクトロメトリー（ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ：ｕｌｔｒａ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）分析に供した。

ＬＣ−ＭＳ条件。バイナリソルベントデリバリー・システムおよびオートサンプラー（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，ミルフォード，マサチューセッツ州）を装備したＡＣＱＵＩＴＹ超高速液体クロマトグラフィー・システム（Ｗａｔｅｒｓ，ミルフォード，マサチューセッツ州）を１．７μｍ粒子をもつ１００ｃｍ×２．１ｍｍ ＢＥＨ Ｃ_１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ社，ミルフォード，マサチューセッツ州）上の４０℃での分離のために採用した。最適な移動相は、水（溶媒Ａ）およびアセトニトリル／イソプロピルアルコール（体積で８０／２０、溶媒Ｂ）からなり、流速を０．４ｍＬ／分に設定した。注入体積は、５μＬであった。グラジエント溶離条件を以下のように適用した、すなわち、０〜２分にわたって７０％Ｂ、２〜５分にわたって７０％〜７５％Ｂ、５〜１０分にわたって７５％〜８０％Ｂ、１０〜１３分にわたって８０％〜９０％Ｂ、１３〜１６分にわたって９０％〜１００％Ｂ、５分間維持して、次に２１〜２２．５分にわたって７０％Ｂへ戻り、１．５分間再平衡化した。質量スペクトロメトリ・データをタンデム・トリプル四重極型（ＴＱ：ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄｒｄｕｐｏｌｅ）質量スペクトロメトリー（マンチェスター、英国）を用いて収集した。ＥＩをイオン化源として用いて、分析を負モードで実行した。以下のパラメータを用いた：キャピラリー電圧，２５００Ｖ、サンプリング・コーン，５５Ｖ、引き出しコーン，４Ｖ，脱溶媒温度，４５０℃、ソース温度，１２０℃、脱溶媒ガス流量，６５０Ｌ／ｈ、コーンガス流量，５０Ｌ／ｈ、Ｌｍ分解能，４．７、Ｈｍ分解能，１５、スキャン時間，０．３５ｓ、およびインタースキャン時間０．０２ｓ。ロックマス（ｌｏｃｋ ｍａｓｓ）（ｍ／Ｚ ５５４．２６１５）としてロイシンエンケファリンを１００ｎｇ／ｍＬの濃度および０．２ｍＬ／分の流速で用い、ロックスプレー（ｌｏｃｋｓｐｒａｙ）周波数は、２０ｓであった。

アミノ酸（ＡＡ）のターゲット・メタボロミクス解析
登録したすべての参加者におけるアミノ酸（ＡＡ）の血清レベルを超高速液体クロマトグラフィートリプル四重極型質量スペクトロメトリー（ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ，Ｗａｔｅｒｓ，ミルフォード，マサチューセッツ州、米国）によって分析した。手短に言えば、１０μＬの同位体標識した内部標準（５μｇ／ｍＬのバリン−ｄ８、ロイシン−５，５，５−ｄ３、イソロイシン−２−ｄ１、チロシン−３，３−ｄ２、およびフェニルアラニン−３，３−ｄ２）を血清サンプルの各々の４０μＬアリコットへ加えた。８０μＬの水で希釈した後に、５００μＬのメタノールおよびアセトニトリルの混合物（１：９，ｖ／ｖ）を用いてサンプルを抽出した。２分のボルテックスおよび１分の超音波処理後に抽出手順を−２０℃で１０分間行った。サンプルを次に４℃で１５分間、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。２０μＬの上澄みのアリコットを室温で真空乾燥させた。その後、残留物を１μｇ／ｍＬのＬ−２−クロロフェニルアラニンを含むメタノールおよび水（１：１，ｖ／ｖ）の１００μＬの混合物によって再溶解し、同じボルテックス、超音波処理および遠心分離ステップがその先に続いた。８０μＬの体積の上澄みをＵＰＬＣ−ＴＱＭＳ分析（Ｗａｔｅｒｓ，マンチェスター、英国）のためにサンプリング・バイアルへ移した。サンプルの５μＬアリコットを４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍのＥｌｉｓｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ，米国）の付いた超高速液体クロマトグラフィー・システム（Ｗａｔｅｒｓ，英国）へ注入した。カラムを４０℃に保持した。カラムに対する溶離手順は、最初の０．５分にわたって１％、０．５〜９分にわたって１〜２０％Ｂ、９〜１１分にわたって２０〜７５％Ｂ、１１〜１６分にわたって７５〜９９％Ｂであり、組成を０．５分にわたって９９％Ｂに維持し、ここで正モード（ＥＳＩ＋）に対してＡ＝０．１％ギ酸を含む水、およびＢ＝０．１％ギ酸を含むアセトニトリルであり、流速は、０．４ｍＬ／分であった。Ｗａｔｅｒｓ ＸＥＶＯ−トリプル四重極型ＭＳを質量スペクトロメトリー検出に用いた。ソースおよび脱溶媒ガスのための温度は、それぞれ１５０および４５０℃に設定した。コーンおよび脱溶媒のためのガス流量は、それぞれ５０および８００Ｌ／ｈであった。キャピラリー電圧を３．０ｋＶに設定した。すべての化合物を多重反応モニター（ＭＲＭ）モードで検出した。

血清トリグリセリド分析
酵素法による血清トリグリセリド決定キットを用いて総トリグリセリドを決定した。

品質管理（ＱＣ）
再現性は、メタボロミクスの偏りのないプロファイリングにとって決定的に重要である。データに再現性があることを保証するためにメタボロミクス解析のプロセス全体が厳しいＱＣの対象となった。テスト混合物、内部標準、および、プールした生体サンプルを含む、３つのタイプのＱＣサンプルをメタボロミクス手順に用いた。ＱＣサンプルに加えて、最適な装置性能を得るために、コンディショニングおよび溶媒ブランク・サンプルも用い、再現性を算定するために無作為に選択したサンプルのうちの５％を繰り返した。テスト混合物は、システムの質量範囲にわたる質量範囲をもつ市販の標準からなった。装置が検査室仕様［保持時間安定性、ピーク分解能、ピーク信号強度、および質量精度（ＬＣ−ＭＳのみ）］内で機能することを保証するために、各バッチランの始めと終わりにこれらのテスト混合物を分析した。サンプル調製および分析プロセス全体の間の分析上の変動をモニターするために、内部標準（ＬＣ−ＭＳに対するクロロフェニルアラニン、ＧＣ−ＭＳに対するクロロフェニルアラニンおよびヘプタデカン酸）をテスト・サンプルへ追加した。バイオマーカー発見のためには、内部ＱＣ基準／メトリックスが、１）１００回の注入内で変動係数（ＣＶ）＜１５％、および２）３００回の注入内でＣＶ≦２０％である。ＣＶは、信号強度の平均ピークに対する標準偏差の比として定義する。全体的な再現性を算定し、バッチ間変動を補正するために、すべての研究被験者（またはテストすることになるサンプルの数に依存する代表的な被験者）からの血清アリコットを組み合わせたプールＱＣサンプルを用いる。ＱＣサンプルをテスト・サンプルとともに調製し、分析ランの全体にわたって（それぞれ、ＧＣ−ＭＡに対して、およびＬＣ−ＭＳに対して各１０個のテスト・サンプル後に）一定間隔で注入した。

統計的分析
ピーク信号を検出し、キャリブレーション式を得て、各代謝物の濃度を算出するために、ＵＰＬＣ−ＴＱＭＳのようなＵＰＬＣ−ＭＳによって生成した生データをＴａｒｇｅｔＬｙｎｘアプリケーションマネージャ・バージョン４．１（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，ミルフォード，マサチューセッツ州）を用いて最初に処理した。データ品質を保証するために、手作業の検査および補正が必要であった。すべての統計的計算およびのグラフィックスをＲおよびＳＩＭＣＡ１３．０．１ソフトウェア（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ，スウェーデン）を用いて実行した。

統計的分析の前に、シャピロ−ウィルク検定を用いて各連続変数（すなわち、臨床的特徴、代謝マーカーおよび代謝物マーカー）の分布を調べて、変数のうちの９０％が正規性からずれることがわかり、従って、ノンパラメトリック検定をこの研究のために用いた。各代謝マーカーまたは代謝物マーカーを、横断的研究におけるＨＯおよびＵＯグループのような、２つのサンプルセット間で比較するために、マン・ホイットニーＵ検定を用いた。ｐ値＜０．０５をもつ変数を統計的に有意と見做した。糖尿病を進展させる相対リスクを、年齢、性別、ＢＭＩおよび他の交絡因子について調整して、異なる代謝物マーカーレベルで推定するために、多変量ロジスティック回帰モデルを用いた。さらに、ロジスティック回帰分析からｐ値＜０．０５を有意と見做した。横断的研究におけるＨＯおよびＵＯグループを識別するそれらの性能と、糖尿病を進展させるリスクを算定する予測力とを評価するために、代謝物マーカーのＲＯＣ曲線面積をさらに算出した。

バイオマーカーの２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の将来の進展との相関
表３に示すように、横断的研究において、Ｔ２Ｄをもつ過体重／肥満被験者（ＵＯ）では遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、アミノ酸（ＡＡ）およびトリグリセリド（ＴＧ）濃度の著しい増加を観測した。ＧＨＤＣＡおよび％ＧＨＤＣＡは、Ｔ２Ｄをもつ過体重／肥満被験者では減少した。

表３．横断的研究において識別した代謝物バイオマーカー

注：表３における値は、平均値±標準偏差を表す。ＦＦＡおよびＡＡの濃度単位は、μｇ／ｍｌである。ＢＡの濃度単位は、ｎｇ／ｍｌである。それぞれ、ＮＷとＨＯ、ＮＷとＵＯ、ＨＯとＵＯとの間でＦＦＡ差を比較するために、マン・ホイットニーのＵ検定を用いてＰ１、Ｐ２、Ｐ３値を算出する。

ＡＡが将来の糖尿病を予測する
実施例１では６２人の過体重の被験者がベースラインにおいて正常な代謝マーカーを有し、１０年後の彼らの再評価によれば、そのうちの５０人が糖尿病を進展させ（ＵＯ）、一方では１２人が健康なままであった（ＨＯ）。かれらの代謝マーカーによれば、ベースラインではこれら２つのグループの間に差はなかった。しかしながら、ＵＯグループでは５つのＡＡ、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびチロシンのベースラインの血清レベルが著しく増加した（表４）。この結果は、これらのＡＡのベースライン濃度がこれらの被験者における将来の糖尿病の進展を予測することを確認した。糖尿病インシデントに関する５つのＡＡ、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびチロシンの予測力をＭＨ−ＯＷ／ＯＢ被験者のうちで単変量および多変量モデルを用いてさらに評価した。年齢、性別、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲおよび空腹時グルコースについて調整するロジスティック回帰モデルをフィッティングした。

ロジスティック回帰分析は、ベースラインのＡＡレベルが、性別、年齢、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨＯＭＡ−β、ＦＰＧおよび２ｈＰＧには依存しない、糖尿病の正の予測因子（調整オッズ比（ＯＲ）２．５３［９５％ＣＩ：１．６８〜３．８１］、Ｐ＝４．７９Ｅ−０３）であることを示した（表４）。５つのＡＡの組み合わせに関する受信者動作特性（ＲＯＣ：ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線は、０．８２（９５％ＣＩ：０．６５〜０．９１、Ｐ＝２．８４Ｅ−０３）の曲線下面積を有する（図１）。とりわけ、１．０のＡＵＣは、完全な予測を示し、０．５のＡＵＣは、任意選択に等しい予測を示す。

表４．縦断研究における参加者のベースラインのＦＦＡ、ＡＡ、ＢＡおよびＴＧレベル、ならびに糖尿病を進展させるリスクを判定するためのそれらの能力。

注：表４における値は、平均値±標準偏差を表す。ＦＦＡおよびＡＡの濃度単位は、μｇ／ｍｌである。ＢＡの濃度単位は、ｎｇ／ｍｌである。Ｐ１値をマン・ホイットニーのＵ検定を用いて算出する。ＯＲ（９５％ＣＩ）は、メタボリック症候群に関するロジスティック回帰からのオッズ比（９５％信頼区間）である。これらのモデルを年齢、性別、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、および空腹時グルコースについて調整する。Ｐ２値は、ロジスティック回帰モデルから算出する。

ＦＦＡが将来の糖尿病を予測する
実施例１では６２人の過体重の被験者がベースラインにおいて正常な代謝マーカーを有し、１０年後の彼らの再評価によれば、そのうちの５０人が糖尿病を進展させ（ＵＯ）、一方では１２人が健康なままであった（ＨＯ）。かれらの代謝マーカーによれば、ベースラインではこれら２つのグループの間に差はなかった。しかしながら、ＵＯグループでは５つのＦＦＡ、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、およびアラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）のベースラインの血清レベルが著しく増加した（表４）。この結果は、これらのＦＦＡのベースライン濃度がこれらの被験者における将来の糖尿病の進展を予測することをさらに確認した。糖尿病インシデントに関する５つのＦＦＡ、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、およびアラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）の予測力をＭＨ−ＯＷ／ＯＢ被験者のうちで単変量および多変量モデルを用いてさらに評価した。年齢、性別、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲおよび空腹時グルコースについて調整するロジスティック回帰モデルをフィッティングした。

ロジスティック回帰分析は、ベースラインのＦＦＡレベルが、性別、年齢、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨＯＭＡ−β、ＦＰＧおよび２ｈＰＧには依存しない、Ｔ２Ｄの正の予測因子（調整ＯＲ：８．７８［９５％ＣＩ：１．９２〜４０．１７］、Ｐ＝４．３３Ｅ−０４）であることを示した（表４）。５つのＦＦＡの組み合わせに関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、０．８３（９５％ＣＩ：０．６６〜１．００、Ｐ＝５．０６Ｅ−０３）の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する（図２）。とりわけ、１．０のＡＵＣは、完全な予測を示し、０．５のＡＵＣは、任意選択に等しい予測を示す。

胆汁酸が将来の糖尿病を予測する
実施例１では６２人の過体重の被験者がベースラインにおいて正常な代謝マーカーを有し、１０年後の彼らの再評価によれば、そのうちの５０人が糖尿病を進展させ（ＵＯ）、一方では１２人が健康なままであった（ＨＯ）。かれらの代謝マーカーによれば、ベースラインではこれら２つのグループの間に差はなかった。しかしながら、ＵＯグループではグリコヒオコール酸（ＧＨＤＣＡ）のベースラインの血清レベルが著しく減少した（表４）。この結果は、ＧＨＤＣＡのベースライン濃度がこれらの被験者における将来の糖尿病の進展を予測することを確認した。糖尿病インシデントに関するＧＨＤＣＡの予測力をＭＨ−ＯＷ／ＯＢ被験者のうちで単変量および多変量モデルを用いてさらに評価した。年齢、性別、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲおよび空腹時グルコースについて調整するロジスティック回帰モデルをフィッティングした。

ロジスティック回帰分析は、ベースラインのＧＨＤＣＡレベルが、性別、年齢、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨＯＭＡ−β、ＦＰＧおよび２ｈＰＧには依存しない、糖尿病の正の予測因子（調整ＯＲ ０．２６［９５％ＣＩ：０．０９〜０．７６］、Ｐ＝８．９３Ｅ−０３）であることを示した（表４）。ＧＨＤＣＡに関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、０．８０（９５％ＣＩ：０．６３〜０．９７、Ｐ＝１．４６Ｅ−０３）の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する（図３）。とりわけ、１．０のＡＵＣは、完全な予測を示し、０．５のＡＵＣは、任意選択に等しい予測を示す。

ＴＧが将来の糖尿病を予測する
実施例１では６２人の過体重の被験者がベースラインにおいて正常な代謝マーカーを有し、１０年後の彼らの再評価によれば、そのうちの５０人が糖尿病を進展させ（ＵＯ）、一方では１２人が健康なままであった（ＨＯ）。かれらの代謝マーカーによれば、ベースラインではこれら２つのグループの間に差はなかった。しかしながら、ＵＯグループではＴＧのベースラインの血清レベルが著しく増加した（表４）。この結果は、ＴＧのベースライン濃度がこれらの被験者における将来の糖尿病の進展を予測することを確認した。糖尿病インシデントに関するＴＧの予測力をＭＨ−ＯＷ／ＯＢ被験者のうちで単変量および多変量モデルを用いてさらに評価した。年齢、性別、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲおよび空腹時グルコースについて調整するロジスティック回帰モデルをフィッティングした。

ロジスティック回帰分析は、ベースラインのＴＧレベルが、性別、年齢、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨＯＭＡ−β、ＦＰＧおよび２ｈＰＧには依存しない、Ｔ２Ｄの正の予測因子（調整ＯＲ：３．０３［９５％ＣＩ：１．０９〜８．４１］、Ｐ＝３．３１Ｅ−０２）であることを示した（表４）。 ＴＧに関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、０．８２（９５％ＣＩ：０．５０〜０．９７、Ｐ＝４．９９Ｅ−０２）の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する（図４）。とりわけ、１．０のＡＵＣは、完全な予測を示し、０．５のＡＵＣは、任意選択に等しい予測を示す。

ＴＧ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ２０：３ｎ６、Ｃ２０：４ｎ６、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、およびＧＨＤＣＡの組み合わせが代謝的に健康なＯＷ／ＯＢの個人における将来の糖尿病を予測する。
糖尿病インシデントに関するＴＧ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ２０：３ｎ６、Ｃ２０：４ｎ６、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、およびＧＨＤＣＡの組み合わせの予測力をＭＨ−ＯＷ／ＯＢ被験者のうちで単変量および多変量モデルを用いてさらに評価した。ロジスティック回帰分析は、ＴＧ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ２０：３ｎ６、Ｃ２０：４ｎ６、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、およびＧＨＤＣＡの組み合わせのベースライン・レベルが、性別、年齢、ＢＭＩ、ＨＯＭＡ−ＩＲ、ＨＯＭＡ−β、ＦＰＧおよび２ｈＰＧには依存しない、糖尿病の正の予測因子（調整ＯＲ：１０．９４［９５％ＣＩ：１．３２〜５６．５５］、Ｐ＝８．３７Ｅ−０３）であることを示した（表４）。ＴＧ、Ｃ１６：０、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１ｎ９、Ｃ２０：３ｎ６、Ｃ２０：４ｎ６、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、およびＧＨＤＣＡの組み合わせに関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線は、０．９２（９５％ＣＩ：０．８４〜１．００、Ｐ＝３．１８Ｅ−０５）の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する（図５）。とりわけ、１．０のＡＵＣは、完全な予測を示し、０．５のＡＵＣは、任意選択に等しい予測を示す。

糖尿病を進展させるリスクを個人に通知するためのバイオインフォマティクス・ツール
単変量および多変量解析方法の両方を用いて可能性のあるバイオマーカーを最初に評価して、選択した。単変量法は、正規分布した変数に関するパラメトリック統計（例えば、スチューデントｔ検定およびＡＮＯＶＡ）、ならびに正規分布に従わない変数に関するノンパラメトリック検定（例えば、マン・ホイットニーＵ検定およびクラスカルウォリス検定）を含む。代謝物と糖尿病を進展させるリスクを推定するそれらの能力との間の相関をピアソンまたはスピアマン係数、クラスタリング、偏最小２乗（ＰＬＳ：ｐａｒｔｉａｌ ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅ）法およびロジスティック回帰を用いてさらに評価した。可能性のあるバイオマーカーのリストを用いて、バイオマーカーの最適な組み合わせを得るために、本発明ではロジスティック回帰モデルに基づくバイオインフォマティクス法を開発した。表３におけるグリコヒオデオキシコール酸（ＧＨＤＣＡ）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、アラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリグリセリド（ＴＧ）を含むバイオマーカーのパネルは、将来の糖尿病に関する有力な予測能力を有することを実証する。

ＴＧ、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１ｎ９）、ジホモ-γ-リノレン酸（Ｃ２０：３ｎ６）、およびアラキドン酸（Ｃ２０：４ｎ６）を含む５つのＦＦＡ、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む５つのＡＡ、ならびにＧＨＤＣＡを含むバイオマーカー（表４）のパネルは、ＲＯＣ曲線解析による有力な予測性能を達成し、ＲＯＣ曲線面積は、０．９２（９５％ＣＩ：０．８４〜１）であった。ＲＯＣモデルから算出したＹｕｄｅｎ ｉｎｄｅｘによれば、この組み合わせたバイオマーカーに関するスコアの最適閾値は、７．０８であり、糖尿病を進展させるリスクを予測するためにこの値を用いることができる。７．０８より大きいスコアを有する個人は、将来に糖尿病を進展させる高いリスクを有する。

キット
本発明のキット例は、モニターすることになる糖尿病でない個人か、または糖尿病患者のためのバイオマーカー・パネルに対応する既知量の同位体標識した（例えば、Ｃ１３で標識した）内部標準を含む。キットは、算定することになるすべての内部標準の単一の混合物を含んでもよく、または各内部標準の個別の量を含んでもよい。算定することになる代謝物プロファイルにおける各内部標準の量を測定して、被験者からのサンプル中の対応するバイオマーカーの対応する量と比較するために用いることができる。各内部標準は、分配キットにおいて固体形態であっても液体形態であってよい。内部標準が固体形態である場合には、キットの使用前にそれらを溶液中へ懸濁させるべきである。キットは、随意的に、表３にリストされた代謝物から選択した代謝物バイオマーカーの少なくとも１つの標識バリアントを備える。

キット例は、算定することになる糖尿病でない個人に関する代謝物プロファイルにおける内部標準を含むように構成した少なくとも１つのコンテナを含むことができる。コンテナは、チューブ、バイアル、またはマルチウェルもしくはマルチチャンバ・プレートであってよい。コンテナは、単一のウェルもしくはチャンバを有してもよく、またはコンテナは、複数のウェルもしくはチャンバを有してもよい。例えば、コンテナは、マルチウェル・プレート（例えば、９６ウェル・マイクロタイター・プレートのようなマイクロタイター・プレート）であってもよい。他の類似したコンテナも適切である。いくつかのキットでは、コンテナは、内部標準の測定および被験者サンプル中で算定することになる１つ以上のバイオマーカーの定量化に用いるのに適しうる。いくつかのキットでは、内部標準の測定および被験者サンプル中の１つ以上の代謝物の定量化に用いるコンテナを、例えば、クロマトグラフィー−質量スペクトロメトリーのようなスペクトル分析に用いるように構成する。例えば、コンテナをＧＣ−ＴＯＦＭＳおよび／またはＬＣ−ＴＱＭＳ用に構成してよい。他のキットでは、被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物に特有の（例えば、酵素、化学、比色、蛍光など）他の分析テスト用にコンテナを構成してもよい。内部標準混合物を、上述したように、１つ以上のバイアルもしくはチューブ中に、または１つ以上のチャンバもしくはウェル中に保持するように、コンテナを構成してもよい。代わりに、算定することになる各内部標準（例えば、チャンバもしくはウェルごとに１つの内部標準）の参照量を個別に保持するようにコンテナを構成してもよい。

いくつかのキットは、複数のコンテナを含む。例えば、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上のコンテナを含む。加えて、いくつかのキットは、内部標準を有する１つ以上のコンテナ、ならびに内部標準の測定および被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物の定量化に用いるための追加のコンテナ（例えば、マルチウェル・プレートまたは別のチューブもしくはバイアル）を含む。いくつかのキットには、１つ以上の内部標準を含むために用い、かつ内部標準の測定および被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物の定量化に用いる単一のコンテナが有る。

コンテナがマルチウェルもしくはマルチチャンバ・コンテナであるキットでは、使用のためのキットの分配の際に、算定することになる代謝物の参照量を１つ以上のウェルもしくはチャンバ中に配置してよい。いくつかのキットでは、キットを用いるときに、算定することになる代謝物の参照量を１つ以上のウェルもしくはチャンバ中に分散させなければならない。

生体サンプルを少なくとも１人の被験者から受け取るように、キットのコンテナを構成することもできる。例えば、キットのコンテナが複数のチャンバもしくはウェルを含む場合には、１人の被験者からの生体試料を１つ以上のチャンバもしくはウェル中へ分配してもよい。いくつかの事例では、被験者サンプルの１つ以上の分量を複数のチャンバもしくはウェル中へ分配してもよい。一般に、キットのコンテナを流体サンプル（例えば、流体生体サンプルか、または分析用の流体を得るために処理した固体生体サンプル）を受け取るように構成する。

いくつかのキットは、内部標準およびバイオマーカーの測定ならびに被験者サンプル中で算定することになる１つ以上の代謝物の定量化のために有用な試薬も含む。キットではこれらの試薬を１つ以上の追加のコンテナ中に含めてよい。

キット例は、複数の内部標準を備え、各内部標準を個別のコンテナに、または同じコンテナ中に提供する。分析コンテナは、ＧＣ−ＭＳまたはＬＣ−ＭＳデバイスのいずれかとともにも用いるために構成したマイクロタイター・プレートとなろう。マイクロタイター・プレートは、少なくとも１つの内部標準を受け取るのに十分な数のウェルを有するであろう。内部標準は、既知の濃度を有し、既知量の各内部標準をマイクロタイター・プレートの個別のウェルへ分注するためにこれを用いることになろう。内部標準を分析コンテナへ分注した後に、被験者サンプルの一部分もマイクロタイター・プレートへ分注できる。被験者サンプルの単一の部分を分注するか、あるいは複数の部分を分注することができる。複数の部分をマイクロタイター・プレートへ分注する場合には、各部分を個別のウェルへ分注してよい。加えて、複数の部分をマイクロタイター・プレートへ分注する場合には、各部分が異なる分量であってよい。

キットの使用
代謝物プロファイルにおける代謝物の定量化を可能にすることによって、糖尿病、または糖尿病を進展させるリスクを有する被験者に関する診断またはリスク予測を提供するように本発明の方法を行うためにキットを用いてよい。例えば、被験者が糖尿病を進展させる高いリスクを有するかどうかを判定するために本発明のキットを用いてよい。加えて、被験者が糖尿病を有するかどうかを判定するために本発明のキットを用いてよい。加えて、糖尿病を有する被験者が糖尿病の処置に反応しているかどうかを判定するために本発明のキットを用いてよい。

糖尿病、または糖尿病を進展させる高いリスクを有する被験者から得た生体サンプルを本発明のキットを用いて算定できる。サンプルは、流体サンプル（例えば、血漿または血清）であってよい。キットのいくつかの使用では、被験者サンプル中の代謝物プロファイルをサンプルの処理なしに算定してよい。キットの他の使用では、被験者サンプル中の代謝物プロファイルを算定する前にサンプルの処理を必要とすることがある。

医師は、被験者からサンプルを採り、本発明のキットを用いた検査のためにサンプルを臨床検査室へ送ってよい。代わりに、医師は、本発明のキットを用いて検査を行うことができる臨床または医療施設に居てもよい。

被験者サンプル中の１つ以上の代謝物の量を測定する様々なテストを実行するためにこれらのキットを用いてよい。例えば、被験者サンプルのスペクトル分析を実行するためにこれらのキットを用いてよい。ガスクロマトグラフィーおよび／または液体クロマトグラフィーのようなスペクトル分析用にいくつかのキットを構成する。例えば、被験者サンプル中の興味ある代謝物のＬＣ−ＴＱＭＳ分析用にキットを構成してよい。代わりに、被験者のサンプル中の興味ある代謝物の量を測定するために、異なるタイプの代謝物に特異的な（例えば、酵素、化学、比色、蛍光など）分析テストを実施できるようにキットを構成してもよい。いくつかの使用では、キットに含まれた内部標準を被験者サンプル中の興味ある代謝物の量を測定するために行う分析テスト用の陽性対照として用いる。いくつかの使用では、被験者サンプル中の興味ある代謝物の量をキャリブレートおよび／または測定するのを助けるために、キットに含まれた内部標準を用いる。被験者サンプル中の興味ある代謝物を測定するために実施することになる分析テストのタイプに依存して、分析テストを実施するために用いる異なる構成要素を１つ以上の内部標準およびコンテナとともにキット中に組み込むことができる。

キットを用いて行った分析テストから得られるデータは、被験者サンプル中の興味ある１つ以上の代謝物（すなわち、代謝物マーカー）の各々の量である。このデータを健康な被験者における参照バイオマーカーレベルと比較できる。

キットを用いて行った分析テストからデータ（すなわち、被験者サンプルに関する代謝物プロファイル（すなわち、興味ある各代謝物の量））を得た後に、テスト結果報告を発生させるために、検査室においてコンピュータ端末上にあるソフトウェアプログラムへデータを入力できて、次にその報告を医師または個人へ提供できる。医師は、臨床検査室からテスト結果報告を一旦受け取ると、被験者の身体状況を評価できる。算定した被験者のサンプルの代謝物プロファイルに基づいて、上述のように、テスト結果報告は、被験者が糖尿病を進展させる高いリスクを有さないか、あるいは有すること、被験者が糖尿病の特定の処置（例えば、外科的処置、薬物処置など）に反応していることを医師に示してよい。次に、医師は、テスト結果報告が示した個人の状況に基づいて、必要であれば、被験者のために提案を提供するか、または適切な処置を選択することができる。

バイオマーカーレベルのコンパレータレベルとの比較によるリスクの相関付け
実施例１では６２人の過体重／肥満の被験者がベースラインにおいて正常な代謝マーカーを有し、１０年後の彼らの再評価によれば、そのうちの５０人が糖尿病を進展させ（ＵＯ）、一方では１２人が健康なままであった（ＨＯ）。

１０年後に糖尿病を進展させたそれらの５０人の被験者を健康なままであった１２人の個人から区別するときのＰ／Ｓ比の性能を評価するために、Ｐ／Ｓ比（Ｃ１６：０／Ｃ１８：０）をバイオマーカーとして選択し、さらに受信者動作特性（ＲＯＣ）解析を適用した。得られたＰ／Ｓ比のＲＯＣ曲線面積は、０．７６（０．６０〜０．９１）であった（図６）。ＲＯＣモデルからのＹｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ（感度＋特異度−１の最大値）によれば、Ｐ／Ｓ比の最適閾値は、１．１５であり、これをコンパレータ値として用いた。従って、１．１５より大きいＰ／Ｓ比を有する過体重／肥満の被験者は、将来に糖尿病の高いリスクを有しうる。

マルチバイオマーカー・パネルのスコアリングのためのモデルを用いた糖尿病リスクの評価
実施例１では６２人の過体重／肥満の被験者がベースラインにおいて正常な代謝マーカーを有し、１０年後の彼らの再評価によれば、そのうちの５０人が糖尿病を進展させ（ＵＯ）、一方では１２人が健康なままであった（ＨＯ）。

Ｐ／Ｓ比（Ｃ１６：０／Ｃ１８：０）およびＴＧを備えるパネルを選択した。

ロジスティック回帰法を用い、選択したマーカーをパネルとして組み合わせ、式β_１Ｘ_１＋β_２Ｘ_２＋…＋αに従ってモデリングした、ここでＸは、ｊ番目のバイオマーカーに関する絶対濃度または標準化値を示し、β_ｊは、回帰モデルからの係数を示し、αは、定数値を示す。

開発したモデルは、式：Ｓｃｏｒｅ＝１．７９^＊ＴＧ＋３．６７^＊Ｐ／Ｓ−４．５７を有した。

１０年後に糖尿病を進展させたそれらの５０人の被験者を健康なままであった１２人の個人から区別するときの算出スコアの性能を評価するために、ＲＯＣ解析をさらに適用した。得られた組み合わせスコアのＲＯＣ曲線面積は、０．７８（０．６２〜０．９４）であった（図７）。ＲＯＣモデルからのＹｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ（感度＋特異度−１の最大値）によれば、スコアの最適閾値は、１．５８であった。従って、１．５８より大きいスクアを有する過体重／肥満の被験者を糖尿病を進展させる高いリスクを有するとして識別した。

被験者からサンプルを得て、Ｐ／ＳレベルおよびＴＧレベルを測定する。スコアを出力として得るために、測定レベルをモデル式へ入力する。スコアが１．５８より大きい場合に、糖尿病を進展させる高いリスクとして被験者を識別する。

マルチバイオマーカー・パネルのスコアリングのためのモデルを用いた糖尿病リスクの評価
実施例１では６２人の過体重／肥満の被験者がベースラインにおいて正常な代謝マーカーを有し、１０年後の彼らの再評価によれば、そのうちの５０人が糖尿病を進展させ（ＵＯ）、一方では１２人が健康なままであった（ＨＯ）。

Ｐ／Ｓ比（Ｃ１６：０／Ｃ１８：０）、Ｏ／Ｓ比（Ｃ１８：１ｎ９／Ｃ１８：０）およびＤＧＬＡ／ＡＡ比（Ｃ２０：３ｎ６／Ｃ２０：４ｎ６）を備えるパネルを選択した。

ロジスティック回帰法を用い、選択したマーカーをパネルとして組み合わせ、式β_１Ｘ_１＋β_２Ｘ_２＋…＋αに従ってモデリングした、ここでＸは、ｊ番目のバイオマーカーに関する絶対濃度または標準化値を示し、β_ｊは、回帰モデルからの係数を示し、αは、定数値を示す。

開発したモデルは、式：Ｓｃｏｒｅ＝０．５０^＊Ｃ１６：０／Ｃ１８：０＋５．２８^＊Ｃ１８：１ｎ９／Ｃ１８：０＋１１．８７^＊Ｃ２０：３ｎ６／Ｃ２０：４ｎ６−４．３７を有した。

１０年後に糖尿病を進展させたそれらの５０人の被験者を健康なままであった１２人の個人から区別するときの算出スコアの性能を評価するために、ＲＯＣ解析をさらに適用した。得られた組み合わせスコアのＲＯＣ曲線面積は、０．８２（０．６７〜０．９７）であった（図８）。ＲＯＣモデルからのＹｏｕｄｅｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ（感度＋特異度−１の最大値）によれば、スコアの最適閾値は、１．１９であった。従って、１．１９より大きいパネル・スクアを有する過体重／肥満の被験者を将来に糖尿病の高いリスクを有するとして識別する。

被験者からサンプルを得て、Ｐ／Ｓレベル、Ｏ／Ｓレベル、およびＤＧＬＡ／ＡＡレベルを測定する。スコアを出力として得るために、測定レベルをモデル式へ入力する。スコアが１．１９より大きい場合に、糖尿病を進展させる高いリスクとして被験者を識別する。

胆汁酸を用いた処置によって誘発されるＧＬＰ１の産生
ＧＬＰ−１の産生を増加させるいくつかの胆汁酸の能力についてそれらの胆汁酸をテストした。理論によって束縛されることなく、本発明者は、ＧＬＰ−１の産生を増加させる化合物が抗糖尿病効果を提供することを信じる。

ＣＣＬ−２４１、ヒト正常小腸上皮細胞を１００μＭの種々の胆汁酸で処置し、対照としてのその野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）およびＤＭＳＯ処置と比較した。ＴＧＲ５およびＧＬＰ１の発現を蛍光免疫染色によって検出した。結果を図１３に示す。一般に、ＨＣＡ、ＨＤＣＡ、ＧＨＤＣＡおよびＴＨＤＣＡは、最も強いＧＬＰ１促進効果を示した。ＬＣＡ、ＤＣＡおよびＴＣＡも実質的なＧＬＰ−１促進効果を示した。

適宜に、このデータは、糖尿病状態を有する被験者をこれらの胆汁酸またはそれらのアナログで処置できることを実証する。

さらに、高レベルのこれらの胆汁酸を生まれつき示す被験者は、糖尿病の進展から保護されうるか、または部分的に保護されうる。適宜に、これらの胆汁酸は、糖尿病リスクを評価するために有用なバイオマーカーを提供しうる。

参照による組み込み
本明細書に提供される（例えば、特許および非特許文献の）引用は、引用される主題に関する参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (19)

1. 被験者が糖尿病を進展させるリスクを判定するための方法であって、
   ａ．採取された前記被験者の生体サンプルを準備するステップと、
   ｂ．前記サンプル中でパネルの各バイオマーカーのレベルを測定するステップであって、前記パネルは、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比を含む、前記測定するステップと、
   ｃ．前記測定レベルを糖尿病を進展させるリスクと相関付けるステップと、
   ｄ．前記相関に基づいて前記被験者が糖尿病を進展させる前記リスクを判定するためのステップと、
   を備える、方法。
2. 相関付ける前記ステップは、前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記測定レベルからスコアを算出するステップを備える、請求項１に記載の方法。
3. 前記スコアは、モデルから出力され、前記モデルは、前記パネルの各バイオマーカーの前記測定レベルの入力に基づいて実行される、請求項２に記載の方法。
4. 判定するための前記ステップは、前記算出スコアを閾値スコアと比較するステップを備え、前記被験者は、前記算定スコアが前記閾値スコアを超える場合に糖尿病を進展させると思われると判定される、請求項３に記載の方法。
5. 相関付ける前記ステップは、前記少なくとも１つのバイオマーカーの各々の前記測定レベルをそれぞれのコンパレータレベルと比較するステップを備える、請求項１に記載の方法。
6. 前記パネルは、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｚ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＪ、ＡＫ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＯ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ、ＢＮ、ＢＯ及びＢＳから選択されたパネルを備える、請求項１に記載の方法。
7. 前記少なくとも１つのバイオマーカーは、
   ａ．Ｃ１８：１ｎ９／Ｃ１８：０比、
   ｂ．Ｃ２０：３ｎ６／Ｃ２０：４ｎ６、および
   ｃ．総トリグリセリド（「ＴＧ」）
   のうちの１つ以上を備える、請求項１に記載の方法。
8. 被験者の糖尿病処置をモニターするための方法であって、
   ａ．採取された前記被験者の第１の生体サンプル、および採取された前記被験者の第２の生体サンプルを準備するステップであって、前記第１の生体サンプルは、前記被験者が糖尿病処置を受ける前に前記被験者から得られたものであり、前記第２の生体サンプルは、前記被験者が前記糖尿病処置を受けた後に前記被験者から得られたものである、前記準備するステップと、
   ｂ．前記第１のサンプルおよび前記第２のサンプル中で図１１の少なくとも１つのバイオマーカーの前記レベルを測定するステップであって、前記少なくとも１つのバイオマーカーは、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比を含む、前記測定するステップと、
   ｃ．前記第１のサンプル中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記測定レベルを前記第２のサンプル中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記測定レベルと比較するステップと、
   ｄ．前記第２のサンプル中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記測定レベルに対する前記第１のサンプル中の前記少なくとも１つのバイオマーカーの前記測定レベルにおける偏差に基づいて前記処置の有効性を判定するためのステップと、
   を備える、方法。
9. 前記パネルは、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ、Ｈ、Ｖ、Ｚ、ＡＧ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ及びＢＳから選択されたパネルを備える、請求項１に記載の方法。
10. 前記パネルは、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比を備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＳ、ＡＲ、ＡＳ、ＡＴ、ＡＵ、ＢＶ及びＢＷから選択されたパネルをさらに備える、請求項１に記載の方法。
11. 前記パネルは、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比を備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｓ、ＡＡ、ＡＢ、ＡＥ、ＡＨ、ＡＩ、ＡＬ、ＡＲ、ＡＳ、ＡＴ、ＡＵ、ＡＹ、ＡＺ、ＢＡ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＧ、ＢＨ、ＢＩ、ＢＪ、ＢＬ、ＢＭ、ＢＰ、ＢＴ、ＢＵ、ＢＶ、ＢＷ、ＢＸ及びＢＺから選択されたパネルをさらに備える、請求項１に記載の方法。
12. 前記パネルは、総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＶ、Ｚ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ及びＢＳから選択されたパネルをさらに備える、請求項１に記載の方法。
13. 前記パネルは、チロシンを備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＶ、Ｚ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ及びＢＳから選択されたパネルをさらに備える、請求項１に記載の方法。
14. 前記少なくとも１つのバイオマーカーは、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｘ、Ｚ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＪ、ＡＫ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＯ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ、ＢＮ、ＢＯ及びＢＳから選択されたバイオマーカーのパネルを備える、請求項８に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つのバイオマーカーは、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ、Ｈ、Ｖ、Ｚ、ＡＧ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ及びＢＳから選択されたバイオマーカーのパネルを備える、請求項８に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つのバイオマーカーは、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比を備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＳ、ＡＲ、ＡＳ、ＡＴ、ＡＵ、ＢＶ及びＢＷから選択されたバイオマーカーのパネルをさらに備える、請求項８に記載の方法。
17. 前記少なくとも１つのバイオマーカーは、Ｃ１６：０／Ｃ１８：０比を備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｊ、Ｍ、Ｓ、ＡＡ、ＡＢ、ＡＥ、ＡＨ、ＡＩ、ＡＬ、ＡＲ、ＡＳ、ＡＴ、ＡＵ、ＡＹ、ＡＺ、ＢＡ、ＢＢ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＧ、ＢＨ、ＢＩ、ＢＪ、ＢＬ、ＢＭ、ＢＰ、ＢＴ、ＢＵ、ＢＶ、ＢＷ、ＢＸ及びＢＺから選択されたバイオマーカーのパネルをさらに備える、請求項８に記載の方法。
18. 前記少なくとも１つのバイオマーカーは、総分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）を備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＶ、Ｚ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ及びＢＳから選択されたバイオマーカーのパネルをさらに備える、請求項８に記載の方法。
19. 前記少なくとも１つのバイオマーカーは、チロシンを備え、図１２Ａ〜１２ＣにリストされたパネルＶ、Ｚ、ＡＶ、ＡＷ、ＡＸ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＫ及びＢＳから選択されたバイオマーカーのパネルをさらに備える、請求項８に記載の方法。

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