CN105008931A - 非高密度脂蛋白来源的cvd标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明特别涉及包含确定脂质/脂质浓度比的方法和应用，从而诊断、预测、预防和/或治疗动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)及其并发症，包括例如急性心肌梗塞。所述方法包括分析来自患者的非高密度脂蛋白样品的脂质浓度和由此获得的脂质/脂质浓度比，并将它们与对照进行比较。
Description
技术领域
本发明涉及包含确定脂质/脂质浓度比的方法和应用，从而诊断、预测、预防和/或治疗动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)及其并发症，包括例如急性心肌梗塞或心血管死亡。所述方法包括分析生物样品的脂质浓度和脂质/脂质浓度比，并将它们与对照进行比较。特别是，本发明涉及鉴定新脂质生物标志物，该新脂质生物标志物与包括血浆/血清总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C或其比率的标准脂质测试相比是更优越的CVD标志物。所述新生物标志物是从分子脂质物种或三酰基甘油脂质类别总和以及神经酰胺和神经酰胺衍生物(葡萄糖基/半乳糖基神经酰胺、GM3神经节苷脂)、胆固醇脂或溶血磷脂的浓度获得的比值。
背景技术
在全世界范围内，心血管疾病(CVD)是死亡率和发病率的最主要的原因之一，且患病率一直在升高。CVD用来对影响人体的心脏、心脏瓣膜、血液和脉管系统的多种病况进行分类。这些病况之一是冠状动脉疾病(CAD)。CAD发展的中心方面是血管壁中脂质物质的累积，其可导致动脉粥样硬化斑块，其是含有多种脂质的复杂分子形成物。主要脂质来源是低密度脂蛋白(LDL)颗粒，其容易穿过动脉壁并被捕获在动脉壁中，它们在此受到修饰(例如，氧化或聚集)从而增强其保留。通常被认为具有抗粥样动脉硬化能力的高密度脂蛋白(HDL)颗粒能够在称为反向胆固醇输送的过程中从血管壁上除去源自LDL的脂质。另外，HDL颗粒具有有利的抗炎性、抗凋亡性和抗氧化性。
通常认可的是，血液中的高总胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)浓度预示了CVD风险。血浆或血清总胆固醇、LDL-C或HDL-C浓度已经被用作CVD/CAD风险预测的金标准生物标志物。基于大规模人群研究，标准胆固醇测定显然与CAD风险和CAD终点例如急性心肌梗塞(AMI)或心血管死亡相关。降低胆固醇浓度、尤其是LDL-C浓度(主要通过他汀(statin)治疗)因此已成为主要治疗策略，该策略已经在群体水平上成功降低了发病数量。
然而，出于若干原因，LDL-C可能不是用于诊断/治疗目的最佳标的。首先，已经发现有一半的急性心肌梗塞(AMI)患者的LDL-胆固醇水平在推荐的正常范围内。其次，重要的是注意到虽然降低了LDL-C，经他汀治疗的患者仍有相当的剩余(～65％)风险发展CVD/CAD。因此，需要LDL-C以外的其他诊断/治疗靶标。
部分剩余风险是由于低HDL-C水平。载脂蛋白A1(HDL颗粒的主要表面蛋白)水平和HDL-C水平(这些颗粒中的胆固醇量)彼此相互关联，并且各自被视为负面风险因素。根据标准脂质测试容易计算出总胆固醇/HDL胆固醇的比值，该比值因此是另一个充分建立的CVD风险评估标志物。提高HDL-C水平(例如，利用烟酸、贝特类物质或CETP抑制剂)已成为与降低LDL-C联合的另一治疗途径。除了总胆固醇、LDL-C和HDL-C，还使用数种非脂质风险因素(包括年龄、血压、糖尿病、吸烟和身体质量指数)进行风险评估以评价/计算个体发生心血管事件的风险。最好的已知风险评分(Framingham评分)评价了个体发生心血管事件的10年风险，其根据包括总胆固醇和HDL-C、年龄、性别、血压、吸烟状况和降脂药的使用在内的因素计算得出。然而，虽然这些风险评分可在群体水平上使用，它们并不能非常准确地揭示个体发生心血管事件的风险。
他汀类药物是供有较高风险患心血管并发症的人使用的一类降胆固醇药。他汀类药物被广泛使用。例如，仅在美国就有近2千万接受他汀类药物治疗的患者。而且，据计算，仅在美国就有约5千万患者会获益于他汀类药物治疗。然而，虽然进行了他汀类药物治疗，但CVD患者仍有相当高的风险发展严重的CVD并发症。在早期有目的地开始对CVD相关的严重并发症(例如AMI和死亡)采取预防措施将非常有益，并且能够有较大机会降低CVD患者的死亡率和发病率。准确鉴定出有风险发展CVD和CVD并发症的个体是非常重要的。传统的风险评估未能识别出大比例的高风险患者，而是将很大比例的个体归类为中度风险，从而使患者管理不可靠。因此，非常需要将对高风险CVD的风险评估进一步精细化的其他策略。
LDL和HDL均是高度异质的颗粒类别；并且二者均可以根据尺寸、密度、电荷以及其分子组成的不同而进一步划分成多个子类。以下性质被认为直接影响脂蛋白的致动脉粥样硬化或抗动脉粥样硬化潜能：渗透和被捕获在动脉壁中的能力，或发挥抗氧化和抗炎性质并从动脉壁上除去胆固醇的能力。然而，颗粒子类和促/抗动脉粥样硬化潜能的联系不是非常清楚。例如，已提出较小的LDL颗粒比较大的LDL颗粒更致动脉粥样硬化，但还存在矛盾的证据。
除了LDL和HDL，人体血浆或血清中含有其他富含甘油三酯的颗粒。这些包括极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。含有LDL、VLDL和IDL颗粒的全血浆/血清统称为非HDL部分。非HDL部分简单地是不含HDL组分的全血浆/血清组分。非HDL组分的脂蛋白具有共同来源，并且被认为在功能和组成上相关。VLDL在肝脏中合成，在血管中被脂肪酶和脂质交换蛋白加工，从而产生中间产物IDL，其进一步加工为LDL。LDL是非HDL组分的主要成分，其次是VLDL(其质量为LDL的大约三分之一)，而IDL作为少数物种存在。在实践中，LDL-C往往不能直接测量，而是利用公式(例如，Friedewald公式)通过从总胆固醇含量中减去HDL-C和甘油三酯含量(除以2.2)来计算。
不同的脂蛋白子类可以在其脂质成分方面显著不同。因而，在标准胆固醇试验中具有相同结果的两个人可能在脂蛋白颗粒的量和大小方面明显不同(图1)。因此已经提出，以颗粒数量替代胆固醇含量能更好地反映发展CVD的风险。载脂蛋白B(ApoB)是LDL、VLDL和IDL颗粒(非HDL组分)的主表面蛋白，表现为每个颗粒上的一个ApoB分子。ApoB水平因此直接反映样品中存在的促动脉粥样硬化脂蛋白颗粒的量，而当颗粒尺寸(与胆固醇含量)变化时，对给定的LDL-C浓度而言颗粒的量和心血管风险可能有很大不同。样品的分布、尺寸和颗粒数容易通过核磁共振(NMR)谱获得。一些研究(但不是全部)已经发现，LDL颗粒(LDL-P)或ApoB的量与CVD风险的关联比LDL-C更紧密。然而，最近的研究已经表明，LDL-P的确定或小和大颗粒的分布均不能改善通过计算总/HDL胆固醇比而获得的CVD风险评估(Parish等,2012).
LDL-C、HDL-C以及决定颗粒数的其他参数的主要缺点在于它们不必然反映颗粒的品质。胆固醇显然是与CVD有关，但尽管其核心作用已广为人知，似乎并不存在胆固醇是有效风险分子的令人信服的证据。支持胆固醇的作用的一种主要论据来自于与他汀使用相关的风险降低：服用降胆固醇药物降低了CVD风险。然而，这是一种粗糙的过度简化，因为已知他汀还减少除了胆固醇之外的数种其他分子的水平。由于胆固醇基本存在于所有脂蛋白颗粒中，它可能只是与由LDL颗粒携带的其它危险分子相关的间接测量。而且，从分子观点来看，胆固醇以功能上的不同形式存在于脂蛋白颗粒中：游离胆固醇，或与不同的脂肪酸酯化。因此，确定这些特定颗粒中的总胆固醇(游离和酯化的)的LDL-C和HDL-C测试可能不会非常准确地反映出颗粒的品质和功能。这些性质可能是由总胆固醇之外的其他因素决定，例如生物活性蛋白或脂质分子的存在，这可能具有更好的诊断或预后价值。脂蛋白的品质通常通过生物化学方法研究，例如测量LDL颗粒氧化或聚集的趋势。这些方法费时，并且不适合用于常规临床用途。因此，需要能够测量脂蛋白的品质并且适合于常规临床应用的稳健方法。因此，识别哪些分子直接涉及脂蛋白的功能以及危险的或甚至致命的心血管事件是非常重要的。
与经常出现在特定的脂蛋白类别中的蛋白成分相比，基本上可在任何脂蛋白(子)类别中找到任何给定的脂质分子(尽管量不同)。脂蛋白颗粒由中性核心构成，该核心中疏水性脂质(例如三酰基甘油(TAG)和胆固醇脂(CE))大量存在，并且被结构蛋白和极性脂质层(包括磷脂和鞘脂)包围。位于脂蛋白表面的次要脂质组分包括高度有效的生物活性神经酰胺(Cer,Glc/GalCer)、GM3神经节苷脂和溶血磷脂，其血浆水平的升高已被认为与包括糖尿病和动脉粥样硬化在内的代谢疾病有关。升高的血浆TAG水平也同样被认为与心血管风险相关。在循环中，多数TAG主要是在VLDL和IDL颗粒中运输，而对这些脂质在LDL组分中的作用所知不多。
由于脂蛋白(子)类别有不同的功能作用，适当的是评估哪种颗粒与特定脂质分子有关。因此脂质在有害和有益颗粒之间的分布可在其循环水平不变的情况下受到影响，并且如果从全血浆/血清中测量，某些颗粒中相关脂质分子的富集可以被掩蔽。例如，胆固醇有时被称为“好”或“坏”，这分别取决于它是在HDL还是LDL组分中。然而，如上所述，LDL-C不是用于CVD诊断和治疗目的的最佳生物标志物。
本领域中需要能够指示动脉粥样硬化或CVD和其并发症或因此指示所述风险的新生物标志物，该生物标志物可替代或优于包括血浆/血清总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C或其比率的标准脂质测试。
发明内容
本发明特别提供了新的生物标志物以及相关的诊断方法和应用，以鉴定患有动脉粥样硬化或CVD和/或一种或多种CVD并发症、或有风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或一种或多种CVD并发症的受试者。这样方法和应用包括：监测来自所述受试者的非HDL样品(如受试者的血浆或血清的LDL组分)的特异性脂质/脂质浓度比，和将所述比率与对照进行比较。
相应地，在本发明的第一方面，提供了一种确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自表1所示的任意神经酰胺/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自：Glc/GalCer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),Cer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和GM3-d18:1/24:0/TAG 54:2总(18:0/18:1/18:1)。
在本发明该方面的另一实施方式中，提供了一种确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自表2所示的任意CE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自：CE22:6/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和CE 22:6/TAG50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自表3所示的任意LPE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自：LPE18:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),LPE 18:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)和LPE 16:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的神经酰胺/CE浓度比选自表4所示的任意神经酰胺/CE浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比升高的神经酰胺/CE浓度比选自：Cer(d18:1/18:0)/CE 22:0,Cer(d18:1/20:0)/CE 22:0和Cer(d18:1/22:0)/CE 22:0。
在本发明的另一方面，提供了一种获得用于确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的数据的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比。
在优选的实施方式中，神经酰胺/TAG浓度比选自表1所示的任意神经酰胺/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，神经酰胺/TAG浓度比选自：Glc/GalCer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),Cer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和GM3-d18:1/24:0/TAG 54:2总(18:0/18:1/18:1)。
在本发明该方面的另一实施方式中，提供了一种获得用于确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的数据的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比。
在优选的实施方式中，CE/TAG浓度比选自表2所示的任意CE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，CE/TAG浓度比选自：CE 22:6/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和CE 22:6/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种获得用于确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的数据的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比。
在优选的实施方式中，LPE/TAG浓度比选自表3所示的任意LPE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，LPE/TAG浓度比选自：LPE 18:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),LPE 18:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)和LPE 16:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种获得用于确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的数据的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比。
在优选的实施方式中，神经酰胺/CE浓度比选自表4所示的任意神经酰胺/CE浓度比。
根据特别优选的实施方式，神经酰胺/CE浓度比选自：Cer(d18:1/18:0)/CE 22:0,Cer(d18:1/20:0)/CE 22:0和Cer(d18:1/22:0)/CE 22:0。
在本发明的另一方面，提供了一种评估对受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的治疗的有效性的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自表1所示的任意神经酰胺/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自：Glc/GalCer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),Cer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和GM3-d18:1/24:0/TAG 54:2总(18:0/18:1/18:1)。
在本发明该方面的另一实施方式中，提供了一种评估对受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的治疗的有效性的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自表2所示的任意CE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自：CE22:6/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和CE 22:6/TAG50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种评估对受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的治疗的有效性的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自表3所示的任意LPE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自：LPE18:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),LPE 18:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)和LPE 16:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种评估对受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的治疗的有效性的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的神经酰胺/CE浓度比选自表4所示的任意神经酰胺/CE浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比升高的神经酰胺/CE浓度比选自：Cer(d18:1/18:0)/CE 22:0,Cer(d18:1/20:0)/CE 22:0和Cer(d18:1/22:0)/CE 22:0。
在另一优选实施方式中，本发明的评估对受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的治疗的有效性的方法还可以包括：在所述确定步骤之后，基于在所述确定步骤中获得的所述神经酰胺/TAG浓度比、CE/TAG浓度比、LPE/TAG浓度比或神经酰胺/CE浓度比，改变、补充或保持对所述受试者已经施用的治疗。
在本发明的另一方面，提供了一种为受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症选择合适的治疗的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自表1所示的任意神经酰胺/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自：Glc/GalCer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),Cer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和GM3-d18:1/24:0/TAG 54:2总(18:0/18:1/18:1)。
在本发明该方面的另一实施方式中，提供了一种为受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症选择合适的治疗的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自表2所示的任意CE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自：CE22:6/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和CE 22:6/TAG50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种为受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症选择合适的治疗的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自表3所示的任意LPE/TAG浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自：LPE18:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),LPE 18:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)和LPE 16:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)。
在本发明该方面的又一实施方式中，提供了一种为受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症选择合适的治疗的方法，所述方法包括确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充。
在优选的实施方式中，与对照相比下降的神经酰胺/CE浓度比选自表4所示的任意神经酰胺/CE浓度比。
根据特别优选的实施方式，与对照相比升高的神经酰胺/CE浓度比选自：Cer(d18:1/18:0)/CE 22:0,Cer(d18:1/20:0)/CE 22:0和Cer(d18:1/22:0)/CE 22:0。
在另一优选实施方式中，为受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症选择合适的治疗的方法还可以包括：在所述确定步骤之后，基于在所述确定步骤中获得的所述神经酰胺/TAG浓度比、CE/TAG浓度比、LPE/TAG浓度比或神经酰胺/CE浓度比治疗所述受试者。
根据本发明的所有方面和实施方式，所提供的方法可以是计算机执行的方法。
在优选的实施方式中，本发明的任何计算机执行的方法可以还包括以下步骤：(i)通过至少一个处理器获得反映所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度的信息；(ii)通过至少一个处理器确定所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度；和(iii)以用户可读形式输出所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度。
在本发明的计算机执行的方法的另一优选实施方式中，所述方法可另外还包括以下步骤：(iv)通过至少一个处理器确定对照与所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度之间的百分比差异；和(v)以用户可读形式输出在所述确定步骤(iv)中获得的所述百分比差异。
在本发明的计算机执行的方法的特别优选实施方式中，所述方法可另外还包括：基于在所述输出步骤中获得的所述百分比差异，确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症。
在计算机执行的方法的优选实施方式中，神经酰胺/TAG浓度比选自表1所示的任意神经酰胺/TAG浓度比，CE/TAG浓度比选自表2所示的任意CE/TAG浓度比，LPE/TAG浓度比选自表3所示的任意LPE/TAG浓度比，并且神经酰胺/CE浓度比选自表4所示的任意神经酰胺/CE浓度比。
根据计算机执行的方法的特别优选实施方式，所述神经酰胺/TAG浓度比选自：Glc/GalCer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),Cer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和GM3-d18:1/24:0/TAG 54:2总(18:0/18:1/18:1)；所述CE/TAG浓度比选自：CE 22:6/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)和CE22:6/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；所述LPE/TAG浓度比选自：LPE 18:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1),LPE 18:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)和LPE 16:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；并且所述神经酰胺/CE浓度比选自：Cer(d18:1/18:0)/CE 22:0,Cer(d18:1/20:0)/CE 22:0和Cer(d18:1/22:0)/CE 22:0。
同样根据本发明的所有方面和实施方式，可能并且可以有利的是确定各方面或实施方式所述的至少2种脂质/脂质浓度比。同样优选的是确定各方面或实施方式所述的至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8种脂质/脂质浓度比。
根据本发明，CVD是以冠状动脉疾病、外周动脉疾病、卒中和/或CVD死亡为特征的疾病。它可以由或可以不由动脉粥样硬化引起。
按照本发明的方法和应用而分析的非HDL样品所来自的受试者可以是患有动脉粥样硬化的受试者。作为另一选择，未患有动脉粥样硬化的受试者的样品也可以按照本发明的方法和应用进行分析。
应领会的是，可以对本发明的方法和应用有用甚至有利的是，还包括确定来自所述受试者的样品中的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白B(ApoB)和/或载脂蛋白C-III(ApoC-III)的血清水平的步骤。另外，根据本发明的方法和应用的优选实施方式，受试者优选是不具有血清水平升高的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白C-III(ApoC-III)或载脂蛋白B(ApoB)中的一种或多种或血清水平降低的HDL-胆固醇(HDL-C)的受试者。
根据本发明的任意方法和应用，受试者正接受或已经接受过他汀、另一种降脂药和/或脂质/脂质浓度比调节剂的治疗。作为选择，受试者还可以是还未接受过他汀疗法、另一种降脂药疗法、和/或脂质/脂质浓度比调节剂疗法的受试者。
要根据本发明分析的非HDL样品可以有利地是具有大幅降低的、基本不含或完全不含HDL颗粒的血浆或血清样品(即，减去了HDL的血浆或血清)。还优选的是所要分析的非HDL样品是LDL样品的实施方式。然而，在另一适合的实施方式中，非HDL样品还可以是极低密度脂蛋白(VLDL)样品。另外其还可以有利的是中间密度脂蛋白(IDL)样品。在又一个实施方式中，非HDL样品可以有利的是LDL样品和VLDL样品的组合。LDL样品和IDL样品的组合或VLDL样品和IDL样品的组合也是适合的。本发明的非HDL样品还优选为LDL样品、VLDL样品和IDL样品的组合。
在本发明的一个方面，提供了一种能够调节本发明的脂质/脂质浓度比的药物，用于治疗或预防动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。在一个实施方式中，施用所述药物从而使来自所述受试者的样品中的所述脂质/脂质浓度比在与对照相比时没有明显不同。在优选的实施方式中，所述药物是他汀。然而，其也可以有利地是另一种降脂药。作为选择，适合作为所述药物的还有脂质/脂质浓度比调节剂，特别是本文所述和/或要求保护的脂质/脂质浓度比的调节剂。
相应地，在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的能够调节本文所述和/或要求保护的脂质/脂质浓度比的药物。同样，适当施用所述药物从而使所述脂质/脂质浓度比在与对照相比时没有显著不同。药物优选为他汀，不过也涵盖了使用另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂。
在又一个方面，本发明提供一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效剂量的药物，其中，所述药物是他汀；选自除他汀以外的HMG-CoA还原酶抑制剂、尼克酸(烟酸)、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、胆汁酸多价螯合剂、贝特类物质、植物固醇和PCSK9抑制剂的另一种降脂药；或选自小分子、抗体、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或者天然或经修饰的脂质的脂质/脂质浓度比调节剂，并且其中，在施用所述药物前，基于与对照相比降低的神经酰胺/TAG浓度比、降低的CE/TAG浓度比、降低的LPE/TAG浓度比、或降低的神经酰胺/CE浓度比，所述受试者已被鉴定为患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在本发明另一方面，提供了一种用于预测或检测受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症、或用于实施本发明所示任意方法或应用的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：(a)一种或多种脂质标准品，所述标准品选自表1至4所述的任一脂质/脂质浓度比中的脂质；和/或校正曲线对照；和/或阳性和/或阴性对照。可选的是，本发明该方面的试剂盒还包括一种或多种以下组分：(b)一种或多种对照标志物，例如一种脂质或多种脂质，例如表1至4所述的任一脂质/脂质浓度比中的脂质，或蛋白；(c)内部和/或外部标准品；(d)能够结合表1至4所述的任一脂质/脂质浓度比中的任一脂质的试剂，可选地为抗体；和(e)用于实施所述方法或应用的试剂。
本发明的另一方面涉及本发明的试剂盒在预测或检测动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症中的应用，其中，来自受试者的样品中的脂质/脂质浓度比可选地利用质谱法确定。
在本发明另一方面，提供了一种用于预测或检测受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症、或用于实施本发明任一方法或应用的试剂盒，其中，所示试剂盒包括：(a)能够结合表1至4所述的任一脂质/脂质浓度比中的任一脂质的抗体，所述抗体缀合于酶或可检测标记；或表1至4中所述的任一脂质/脂质浓度比中的任一脂质，其缀合于酶或可检测标记。本发明该方面的试剂盒还可以可选地包括一种或多种以下组分：(b)所述酶的特异性底物；(c)包被有能够结合(a)中所述任意抗体的二抗的测试平板；(d)标准品和/或校正曲线标准品；(e)终止溶液；和(f)进行测试所需的必需缓冲剂和/或试剂。
在另一实施方式中，本发明的试剂盒包含对上述实施方式的(a)中抗体上的可检测标记具有特异性的蛋白缀合的酶，例如与抗生蛋白链菌素缀合的碱性磷酸酶。
在本发明该方面的优选实施方式中，上述实施方式的试剂盒包含缀合于酶或可检测标记的抗体，其能够结合本文所列项目或权利要求(例如第1项或权利要求1，特别是第7项或权利要求14)中提到的脂质/脂质浓度比中的任一脂质；且/或其中，与酶或可检测标记缀合的脂质是本文所列项目或权利要求(例如第1项或权利要求1，特别是第7项或权利要求14)中提到的脂质/脂质浓度比中的任一脂质。
本发明的所有试剂盒都可附有说明如何用该试剂盒预测、诊断或检测本文所述的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的说明书。
在另一方面，本发明涉及针对表1至4所述的任一脂质/脂质浓度比中的任一脂质的抗体，其用于a)预测受试者发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的风险；或b)预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。a)预测受试者发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的风险或b)预防或治疗动脉粥样硬化或CVD的相应方法(其中，使用了所述抗体以及所述抗体的相应用途)也是本发明该方面的实施方式。
在一方面，本发明涉及用于预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，当采用本文所述和/或要求保护的任何方法、药物、试剂盒、应用或抗体时，所述受试者会被鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在该方面的另一实施方式中，本发明涉及用于预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的他汀、另一种降脂药、或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，通过本文所述和/或要求保护的任何方法、药物、试剂盒、应用或抗体，已将所述受试者鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在该方面的又一实施方式中，本发明涉及用于预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，通过本文所述和/或要求保护的任何方法、药物、试剂盒、应用或抗体，所述受试者会被鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
在该方面的又一实施方式中，本发明涉及用于预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，通过本文所述和/或要求保护的任何方法、药物、试剂盒、应用或抗体，已将所述受试者鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
本发明的该方面也涵盖了通过施用治疗有效量的所述他汀、其他降脂药或所述脂质/脂质浓度比调节剂来预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的相应方法，以及所述他汀、其他降脂药或所述脂质/脂质浓度比调节剂的相应应用。
在本发明的背景下，通常利用测定来确定脂质浓度或脂质/脂质浓度比。优选的是，所述测定是或包括：质谱法、核磁共振谱法、荧光光谱法或双偏振干涉测量法，诸如HPLC、UHPLC或UPLC等高效分离方法，诸如ELISA等免疫测定，和/或用能够特异性地结合分析物的结合性部分进行的测定。特别优选的是采用质谱法。
在本发明的背景下，CVD包括内皮功能障碍、冠状动脉疾病、心绞痛、心肌梗塞、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、高血压、脑血管疾病、卒中、短暂性缺血发作、深静脉血栓形成、外周动脉疾病、心肌病、心律不齐、主动脉狭窄和动脉瘤。此类疾病经常涉及动脉粥样硬化。在本发明的优选实施方式中，心血管疾病是与动脉粥样硬化相关的心血管疾病。在另一实施方式中，CVD并发症包括但不限于心肌梗塞(MI)、心绞痛、短暂性缺血发作(TIA)、卒中和死亡。
附图说明
图1:颗粒尺寸和胆固醇含量之间的关系。在LDL-C浓度相同情况下的两个颗粒组成的实例表明随着平均颗粒尺寸不同，颗粒数量可显著不同。
图2:标准脂质测试不能从健康对照中鉴定出比例明显的CVD患者。A.标准脂质测试在火山图的底部框(虚线)中突出显示，其中将CVD患者(“病例”)和对照之间的平均百分比变化对统计学显著性(p值)进行作图。各符号表示从血清或LDL组分中测量的分析物(脂质或脂质/脂质比率)。B.描绘了“病例”(方形)和对照(圆圈)的临床测量浓度(g/l或mmol/l)。
图3:表示病例和对照之间的计算出的LDL脂质/脂质比率的平均百分比变化相对于统计学显著性(p值)的火山图。各符号表示计算出的脂质/脂质比率。框突出显示了研究组之间无统计学显著差异(下部框)或具有高度显著差异(上部框)的分析物或脂质比率。具有正％差异值(x-轴)的分析物是与对照相比在CVD病例中“增高”的。具有负％差异值(x-轴)的分析物是与对照相比在CVD病例中“降低”的。
图4:在CVD患者(病例；方形)和健康对照(对照；圆圈)之间存在差异的生物标志物比率的实例。
图5:全血浆(A)和LDL组分(B)中的Cer(d18:1/18:0)/总TAG比以及从全血浆中测量的LDL胆固醇(C)的ROC曲线和曲线下面积(AUC)值。
图6:本发明一些实施方式的系统的示意图。具体而言，该图示出了可以用于根据所公开的系统和方法执行计算机系统106的各种硬件、软件和其它资源。在所示的实施方式中，计算机系统106可以包括与随机存取存储器偶联的一个或多个处理器110，其在操作系统的控制下或结合操作系统运行。实施方式中的处理器110可包括在一个或多个服务器、机群或其他计算机或硬件资源中，或可利用基于云的资源来执行。所述操作系统可以是，例如，分发的LinuxTM操作系统、UNIXTM操作系统或其他开源或专有操作系统或平台。处理器110可以与数据存储库112通讯，例如硬盘驱动器或驱动器阵列上储存的数据库，以访问或储存程序指令和其他数据。
处理器110可以经由网络接口108进一步通讯，而网络接口108又可以经由一种或多种网络104(例如互联网或其它公共或私人网络)进行通讯，从而可以从客户端102或其它设备或服务器接收查询或其他请求。此外，经由一种或多种网络104，处理器110可以利用网络接口108来向使用者发送信息、指令、工作流查询部分工作流、或其他数据。网络接口104可包括或可通信地连接至一个或多个服务器。客户端102可以是例如接入互联网的个人计算机。
处理器110通常可以被编程或配置成执行控制逻辑和控制操作来实施本文中所公开的方法。处理器110可以进一步与协处理器114通讯连接(即，通过通讯通道连接)。协处理器114可以是专门的硬件和/或固件组件，经配置以执行本文中所披露的方法。因此，本文公开的方法可以由处理器110和/或协处理器114执行。
计算机系统106、相关网络连接和其他硬件、软件和服务器资源还可以有其他配置。
具体实施方式
本发明基于以下发现：在CVD患者的非HDL颗粒中某些(非蛋白)分子减少而某些分子增多，这很可能是由于颗粒品质的改变。令人吃惊的是，由这些分子获得的脂质比率是CVD的优异生物标志物。根据本发明，(非胆固醇相关)生物活性神经酰胺和神经酰胺的葡萄糖基化/半乳糖基化/神经节苷脂衍生物，以及酯化胆固醇(非总胆固醇)，在CVD患者的LDL颗粒中以更低浓度存在。本发明人提供证据表明这些分子在LDL颗粒中较低的水平可能有害并且可能与CVD的发展相关。如果测量全血浆/血清中的这些标志物或标准标志物，则这些改变可能被掩盖，因此本发明的重要方面是从血浆/血清样品的非HDL组分(优选包括LDL组分)确定所述比率。
心血管疾病是高度异质性的疾病。因此，为了能够在个体水平上进行诊断测量，应当将个体差异归一化。TAG分子被鉴定为在CVD患者的LDL颗粒中以更高浓度表达。本发明提出，神经酰胺、神经酰胺衍生物、酯化胆固醇和溶血磷脂分子水平可以与TAG分子水平组合用来计算浓度比。该比率提高了将CVD患者与对照区分开的诊断能力。因此该比率的变化反映了个体患有或发展CVD的风险。
对于CVD，已经提出了CE/TAG比率与LDL和HDL的结构和组成相关(Deckelbaum等)。然而，降低的比率往往被解读为表示小的致密LDL颗粒类型出现更多，而这被认为是有害的。另外，最近的研究表明基于LDL颗粒尺寸的CVD风险评估与传统的基于总/HDL胆固醇比率的风险评估相比并未改善(Parish等,2012)。根据本发明，特定的CE和TAG分子以及它们的比率，而非LDL尺寸，有助于CVD风险升高。
本发明的方法提供了特异性的灵敏测试，这些测试可用于鉴定和预测CVD。另外，当常规CVD和动脉粥样硬化标志物为阴性时，本发明可用于CVD和动脉粥样硬化的诊断。本发明可有利地用于正接受他汀治疗的患者，从而评估他们是否有高风险发展CVD并发症。
通常，本发明提供检测动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括以下步骤：测量来自受试者的测试样品(血浆或血清样品)的非HDL组分(例如LDL组分)的标志物水平，计算标志物水平的比率，和确定基于非HDL的标志物比率是否与动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症相关。
由于脂质组学兼具高的灵敏度和特异性，甚至能够对最小样品量进行分析。可通过各种化学技术和高分辨率分析技术根据本发明的方法从受试者的样品以及对照样品中收集关于脂质生物标志物的信息(即，本文描述和/或要求保护的脂质/脂质浓度比)。特别适合的分析技术包括但不限于质谱法和核磁共振谱法。实际上，可以使用能够分辨个体脂质或脂质类别并提供其结构信息的任何高分辨率技术来确定受试者的样品以及对照样品中的本发明的脂质标志物。出于本发明方法的目的，脂质浓度或脂质/脂质浓度比因此优选利用质谱法来确定。然而，在此方面，也可以采用核磁共振谱法、荧光光谱法或双偏振波干涉测量法，高性能分离方法如HPLC或UPLC，免疫测定例如ELISA，和/或使用能够特异性结合脂质分析物的结合部分。
在本发明中，已经鉴定了从血浆/血清样品的非HDL组分(例如LDL组分)中确定的新脂质生物标志物。令人吃惊的是，当用非HDL组分(例如LDL组分)进行测量时，与现有的常规使用的生物标志物相比，神经酰胺或神经酰胺衍生物(葡萄糖基化/半乳糖基化/神经节苷脂)、胆固醇脂、溶血磷脂分子物种或任何这些分子物种的总和与甘油三酯(TAG)分子物种或TAG分子物种的总和的比率显示出优越的CVD标志物性能。
与本发明相关的是，已经确定了全血浆的LDL组分中的脂质比率。由于LDL是功能相关的促动脉粥样硬化的非HDL脂蛋白类别(VLDL、IDL和LDL)中的主要类别，因此假设如果用非HDL组分而不是LDL组分进行测量，本发明的比率也可以用于CVD风险评估。因此，本发明的诊断方法还可用于测量血浆或血清样品的非HDL组分(而不是LDL组分)中的所述比率。
定义：
本文中使用的“CVD”是冠状血管疾病/心血管疾病，其在本领域的通常意义是对影响人体的心脏、心脏瓣膜、血液和脉管系统的病况进行分类。“CAD”为冠状动脉疾病，“AMI”为急性心肌梗死，“ACS”为急性冠脉综合征，“CAC”为冠状动脉钙化，“RCT”为逆向胆固醇运输，“LDL”为低密度脂蛋白，“HDL”为高密度脂蛋白，“LDL-C”为低密度脂蛋白胆固醇，“HDL-C”为高密度脂蛋白胆固醇，“ApoA”为载脂蛋白A，“ApoB”为载脂蛋白B，“ApoC”为载脂蛋白C，“MS”为质谱测定法，“HPLC”为高效液相色谱，“UPLC”为超效液相色谱。
本文中使用的“神经酰胺”是指任何神经酰胺类分子，包括葡萄糖基神经酰胺、半乳糖基神经酰胺和神经节苷脂(寡糖连接的神经酰胺)。
本文中使用的“受试者”包括所有哺乳动物，包括但不限于人，以及非人灵长类动物、犬、猫、马、绵羊、山羊、牛、兔、猪和啮齿类动物。应理解的是本发明特别优选的受试者是人受试者。
“样品”的定义为从受试者或受试者的组或群体获得的生物样品。
“非HDL样品”是血清或血浆样品，或从血清或血浆获得的样品，例如如本文所述获得的含有脂蛋白的组分，其含有大幅降低的、基本不含或完全不含HDL颗粒。“大幅降低”的HDL颗粒表明样品中少于70％(w/w)、优选少于80％(w/w)和更优选少于90％(w/w)的脂蛋白是HDL。“基本不含”HDL颗粒表明样品中少于95％(w/w)和优选少于98％(w/w)的脂蛋白是HDL。“完全不含”HDL颗粒表明样品中少于99％(w/w)和优选少于99.5％(w/w)的脂蛋白是HDL。因此，本发明的非HDL样品有利地是已通过本文所述的方法去除了HDL颗粒的血清或血浆，从而使其如上所述具有大幅降低的、基本不含或完全不含HDL颗粒(即，减去了HDL的血浆或血清)。然而，还优选的是待分析的非HDL样品是从血清或血浆获得的LDL样品的实施方式。还可以有利的是从血清或血浆获得的VLDL样品或IDL样品或LDL、VLDL和IDL样品的组合。所有这些非HDL样品都可通过用本领域已知和/或本文所述的方法从血清或血浆分别制备出非HDL组分、LDL组分、VLDL组分或IDL组分而获得。另外，采集患者的血液样品以获得血清或血浆属于常规临床实践。可以为了例如测量患者的胆固醇水平来采集血液样品。可以用本领域技术人员公知的技术来制备所采集的血液样品并分离出血浆或血清。静脉血液样品可以使用针和BD塑料管或Plus塑料管(BDSSTTM管包含喷涂的二氧化硅和用于血清分离的聚合物凝胶)来从患者中采集。可以通过在室温下以1300 RCF离心10分钟来分离出血清，并将其储存在-80℃的小塑料试管中。
“非HDL组分”的定义是全血浆/血清的排除了HDL的组分。其可包括LDL、VLDL和/或IDL，或其组合；其中LDL通常是主要成分。其在功能上不同于含HDL的组分。非HDL组分可利用本领域已知的任何技术来制备，包括离心和/或沉降，例如等所述的利用溴化钾溶液的连续差异微量超速离心，或Burstein等描述的沉降。作为另一选择，非HDL部分可通过例如Wiesner等描述的快速液相色谱(FPLC)或例如Dallinga-Thie等描述的凝胶过滤方法来制备。
“LDL组分”的定义是全血浆/血清的包含LDL并排除HDL的组分。除了LDL之外，其可包含VLDL和/或IDL；其中LDL通常是主要成分。其在功能上不同于含HDL的组分。LDL组分可利用本领域已知的任何技术来制备，包括超速离心和/或沉降，例如等所述的利用溴化钾溶液的连续差异微量超速离心，或Burstein等描述的沉降。
“VLDL组分”的定义是全血浆/血清的包含VLDL并排除HDL的组分。除了VLDL之外，其可包含LDL和/或IDL；其中VLDL通常是主要成分。其在功能上不同于含HDL的组分。VLDL组分可利用本领域已知的任何技术制备，包括超速离心和/或沉降，例如等所述的利用溴化钾溶液的连续差异微量超速离心，或Burstein等描述的沉降。
“IDL组分”的定义是全血浆/血清的包含IDL并排除HDL的组分。除了IDL之外，其可包含LDL和/或VLDL；其中IDL通常是主要成分。其在功能上不同于含HDL的组分。IDL组分可利用本领域已知的任何技术制备，包括超速离心和/或沉降，例如等所述的利用溴化钾溶液的连续差异微量超速离心，或Burstein等描述的沉降。
“含HDL的组分”的定义是全血浆/血清的包含HDL颗粒的组分。其通常排除了LDL、VLDL和IDL颗粒。其在功能上不同于非HDL、LDL、VLDL和IDL组分。
本发明的“非HDL样品”包含来自全血浆/血清的“非HDL组分”的材料，优选基本由来自全血浆/血清的“非HDL组分”的材料组成，更优选由来自全血浆/血清的“非HDL组分”的材料组成，或对应于来自全血浆/血清的“非HDL组分”的材料。
同样，本发明的“LDL样品”、“VLDL样品”或“IDL样品”分别包含全血浆/血清的“非HDL组分”的“LDL组分”、“VLDL组分”或“IDL组分”的材料，优选分别基本由这些材料组成，更优选分别由这些材料组成，或分别对应于这些的材料。
本文中使用的术语“对照”可以是对照样品。作为另一选择，其还可以是对照值。在其为对照值的情况下，应理解的是其可以在执行本发明的方法之前就已经确定、计算出或推断出。作为另一选择，可以在根据本发明的方法确定所述脂质/脂质浓度比之后再确定、计算或推断出对照值。因此，应理解的是本发明的合适的对照值还可以是获自文献的值。
本文中使用的“对照”，即，对照值或对照样品，通常是受试者组或受试者群的代表。在此情况下，“代表”是指在本发明的背景下进行比较的所述对照值所反映出的脂质/脂质浓度对应于来自所述组或群的受试者的对应个体样品的所述脂质/脂质浓度比的平均浓度值。同样，在对照样品的情况下，“代表”是指在本发明背景下进行比较的所述对照样品中的脂质/脂质浓度对应于来自所述组或群的受试者的对应个体样品的所述脂质/脂质浓度比的平均浓度。优选的是，所述对照样品中所有脂质/脂质浓度比的浓度都对应于来自所述组或群的受试者的对应个体样品的所述脂质/脂质浓度比的平均浓度。具有所述值的个体就本发明的目的而言被认为是“健康个体”。在优选实施方式中，本发明意义下的来自受试者组的对照样品或来自受试者群的对照样品通过以下方法获得：混合等量的直接获自或取自所述受试者组或群的样品，或混合等量的其部分、成分或反应产物(例如，酶促反应的产物或沉淀物)。
在本发明的背景下，对照样品可来自健康个体、普通健康个体群、已经没有任何主要CVD并发症的CAD患者、或已经没有任何主要CVD并发症的CAD患者群。
在本发明的背景下，提到来自同一受试者或来自(另)一受试者的对照样品，可以意味着该对照样品直接获自所述受试者。然而，作为另一选择，其还可以意味着通过对直接获自或取自所述受试者的样品进行物理或化学处理而获得，例如，离心、分级分离、酶促消化和沉降等。这也适用于本文中提到来自受试者组或受试者群的对照样品的任何情况。
如果对照样品与受试者的样品以相同或基本相同的方式获自相同类型的生物组织或来源，则该对照样品可以特别适合于与受试者的样品进行比较。例如，如果受试者的样品是本文定义的非HDL样品、LDL样品、VLDL样品或IDL样品，对应的对照样品同样分别为非HDL样品、LDL样品、VLDL样品或IDL样品。应理解的是所述对应的对照样品包括通过混合来自受试者组或群的各非HDL样品、LDL样品、VLDL样品或IDL样品而获得的非HDL样品、LDL样品、VLDL样品或IDL样品。
应理解的是对本发明的目的而言，有用的对照值优选为利用本文所述的任一种合适的对照样品获得或已经获得的对照值。
本文所用的术语“脂质”的定义为疏水性或两亲性小分子。
对于本发明目的而言，脂质根据以下命名法来命名：Cer是神经酰胺，Glc/GalCer是葡萄糖基-和半乳糖基神经酰胺，GM是单唾液酸神经节苷脂，GM3是单唾液酸二己糖基神经节苷脂，CE是胆固醇脂，LPE是溶血磷脂酰乙醇胺，TAG是三酰基甘油。
命名法X:Y表示：X为分子的脂肪酸部分中的碳原子总数，Y为分子的脂肪酸部分中的双键总数。
命名法A/B/C表示：对于TAG的分子，A、B和C类型的脂肪酸部分连接到分子的甘油骨架上。
命名法(dE/F)(例如Cer(d18:0/20:0))表示：对于Cer、GlcCer和GM的分子，E类型的长链基底通过酰胺连接有脂肪酸部分F。
对于GM分子，后面的数字(例如GM2和GM3)表征了糖的顺序。
在本发明的背景下，“神经酰胺”是指神经酰胺脂质家族的任一种脂质，包括神经酰胺的葡萄糖基化(Glc)衍生物、半乳糖基化(Gal)衍生物和神经节苷脂衍生物(例如GM3)，其通过相应的葡萄糖基或半乳糖基合成酶、或在GM3的情况下通过β-半乳糖苷酶和神经节苷脂GM3合成酶从神经酰胺修饰而得。
术语“TAG总物种”的定义是由脂肪酸的一种或多种可能的组合组成的TAG分子物种(例如见表7)。
“神经酰胺/TAG浓度比”的定义为至少一种神经酰胺分子的浓度与至少一种TAG分子的浓度的比率，即，神经酰胺的浓度除以TAG的浓度。作为另一选择，其为至少一种神经酰胺分子的浓度与任何TAG总物种的浓度的比率，或其为所有神经酰胺分子的总浓度与所有TAG分子的总浓度的比率。
“CE/TAG浓度比”的定义为至少一种CE分子的浓度与至少一种TAG分子的浓度的比率，即，CE的浓度除以TAG的浓度。作为另一选择，其为至少一种CE分子的浓度与任何TAG总物种的浓度的比率，或其为所有CE分子的总浓度与所有TAG分子的总浓度的比率。
“LPE/TAG浓度比”的定义为至少一种LPE分子的浓度与至少一种TAG分子的浓度的比率，即，LPE的浓度除以TAG的浓度。作为另一选择，其为至少一种LPE分子的浓度与任何TAG总物种的浓度的比率，或其为所有LPE分子的总浓度和所有TAG分子的总浓度的比率。
“神经酰胺/CE浓度比”的定义为至少一种神经酰胺分子的浓度与至少一种CE分子的浓度的比率，即，神经酰胺浓度除以CE浓度。作为另一选择，其为所有神经酰胺分子的总浓度与所有CE分子的总浓度的比率。
“降低的比率”的定义为受试者的样品与对照之间脂质/脂质浓度比值的负百分比差异(％差异)，由此受试者的样品和对照之间特定脂质/脂质比的负百分比差异表示与对照相比受试者中该脂质/脂质比具有更小的值。例如，-50％的特定比率的％差异表示与对照相比受试者中的该特定比率的值低50％。
以下计算是基于表6的平均浓度值进行的示例性计算。
脂质比率:CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)
对照中的浓度：
CE 16:0 308.7pmol/μg
TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)20.3pmol/μg
对照中的脂质比率：308.7pmol/μg/20.3pmol/μg＝15.2
病例中的浓度：
CE 16:0 298.4pmol/μg
TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)29.2pmol/μg
病例中的脂质比率：298.4pmol/μg/29.2pmol/μg＝10.2
病例和对照之间的百分比差异：
(病例比率-对照比率)/病例比率＝％差异
(10.2–15.2)/10.2＝-0.49->x100％->-49％
与对照相比，病例中该比率低50％。
本发明的背景下，降低的比率对应于受试者和对照之间脂质/脂质比率的至少-10％、优选至少-20％、-30％、或-40％、更优选至少-50％、或-60％、-70％、-80％、或-90％的％差异，并且在特别优选的实施方式中，至少-100％、进一步至少-120％、至少-140％、至少-160％、至少-180％或至少-200％的％差异。
“升高的比率”的定义为受试者与对照之间脂质/脂质浓度比值的正百分比差异(％差异)，由此受试者和对照之间特定脂质/脂质比的正百分比差异表示与对照相比受试者中该脂质/脂质比具有更大数值。例如，50％的特定比率的％差异表示与对照相比受试者中的该特定比率的值高50％。
本发明的背景下，升高的比率对应于受试者和对照之间脂质/脂质比率的至少10％、优选至少20％、30％、或40％、更优选至少50％、或60％、70％、80％、或90％的％差异，并且在特别优选的实施方式中，至少100％、进一步至少120％、至少140％、至少160％、至少180％或至少200％的％差异。
术语“明显差异”是指对受试者和对照之间脂质/脂质比率的比较揭示了该值之间在正向或负向上有大于15％的差异。相应地，术语“没有明显差异”是指对受试者和对照之间脂质/脂质比率的比较揭示了该值之间在正向或负向上有小于15％的差异(即，非显著差异)。
本发明背景下的术语“计算机执行的方法”是指利用机器或装置实现其目标的方法。
术语“处理器”是指能够解读和执行指令的设备。具体而言，处理器采用逻辑电路来接收输入数据并提供适当的输出数据。处理器可以经由网络相互通信。
术语“治疗有效性”用来表示治疗实现施用其所要达到的治疗目标的能力。
在本文描述和/或要求保护的本发明的所有方面和实施方式的背景下，“他汀”可以选自但不限于由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、氟伐他汀XL、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗舒伐他汀和/或辛伐他汀组成的组。
本发明所述的“调节剂”可以是小分子(<1500道尔顿的分子量，优选<800道尔顿的分子量)、抗体、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或者天然或经修饰的脂质，优选表1至4所述的任一脂质/脂质浓度比中的脂质。
本发明所述的“降脂药”优选为HMG-CoA还原酶抑制剂、尼克酸(烟酸)、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂、胆汁酸多价螯合剂、贝特类物质、植物固醇和PCSK9抑制剂。
出于本发明的目的，“胆固醇吸收抑制剂”优选为依泽替米贝或SCH-48461；胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂优选为依塞曲匹(evacetrapib)、安塞曲匹(anacetrapib)或达塞曲匹(dalcetrapib)；胆汁酸多价螯合剂优选为考来维仑、考来烯胺和考来替泊；贝特类物质优选为非诺贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯或苯扎贝特，PCSK9抑制剂选自PCSK9特异性抗体、siRNA和肽模拟物。
如本文所用，术语“抗体”是指包括通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端至羧基末端以下述顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
本发明的抗体包括显示出与所述脂质的特异性结合的单克隆抗体与多克隆抗体、完整抗体、抗体片段和抗体亚片段。因此，适合的“抗体”可以是任何类别的完整免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体或杂交抗体)或片段(例如F(ab')2、Fab'、Fab等，包括杂交片段)，且还包括任何免疫球蛋白或通过结合特异性抗原以形成复合物而具有类似抗体的行为的任何天然的、合成的或遗传改造的蛋白。术语“抗体”涵盖了抗体的抗原结合片段(例如单链抗体、Fab片段、F(ab’)2、Fd片段、Fv片段、dAb片段)以及完整的抗体。例如，Fab分子可以在经遗传转化的宿主(如大肠杆菌)中表达和组装。因此λ载体系统可以用来表达Fab'群，其潜在多样性等于或超过产生前驱抗体的主体。参见Huse WD等,Science1989,246:1275-81。此类Fab'包含在“抗体”的定义中。给定的分子(包括抗体片段或亚片段)模仿抗体行为并特异性地结合特定抗原的能力可以用本领域已知的结合测定来确定，例如，使用所关注的抗原作为结合配对物来确定。
抗本发明的脂质的抗体可以用本领域技术人员公知的方法来制备。例如，可以用脂质和佐剂来使小鼠免疫化。以两周为间隔对小鼠实施3次免疫化，并每隔一周进行测试采血以获得血清抗体效价，随后从小鼠采集并汇集脾细胞。将脾细胞制备成3个等分部分，这些等分部分或者立即用于融合实验，或者储存在液氮中供今后融合使用。
随后按照Stewart和Fuller,J.Immunol.Methods 1989,123:45-53中的程序进行融合实验。在包被有所述脂质的96孔ELISA平板上，用酶联免疫吸附测定(ELISA)对具有正在生长的杂交细胞的孔中的上清液进行单克隆抗体(MAb)分泌者筛选。通过有限稀释来克隆ELISA阳性培养物，通常在2个连续的克隆实验后从单集落建立得到杂交瘤。
出于本发明的目的，“酶”是适合于在ELISA中用于检测的酶。所述酶是本领域技术人员已知的。所述酶例如可以是乙酰胆碱酯酶、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
相似的是，“可检测标记”在本发明的含义中是指适合于在ELISA、EIA(酶免疫测定)、或RIA(放射性免疫测定)中用于进行检测的标记。同样，本领域技术人员熟悉适合的可检测标记，其例如可以为生物素或另一种半抗原。作为另一选择，其可以为荧光标记，例如FITC、TRITC、德克萨斯红、若丹明、藻红蛋白(PE)、APC、Cy-3、Cy-5、Cy-7、Alexa Fluor、DyLight Fluor、ATTO染料或任何其它适合的荧光标记或其变体。在生物素为可检测标记的情况中，可使用与酶或可检测标记缀合的抗生蛋白链菌素来检测生物素。可检测标记还可以是放射性同位素，例如125I、131I或32P。
本文使用的术语“本发明”、“根据本发明”、或“本发明所述”意指本文描述和/或要求保护的的发明的所有方面和实施方式。
本文所使用的术语“包含”应被理解为涵盖了“包括”和“由…组成”，这两种含义均是具体意指并因此单独公开的本发明的具体实施方式。
实施例
实施例1
材料和方法
血清样品获自Health2000调查，其包括全面的健康检查和对参与者的访谈。包括了具有冠心病症状(心绞痛或心肌梗塞)的患者和健康受试者。
通过等所述的利用溴化钾溶液的连续差异微量超速离心，从19名冠状动脉疾病(基于非脂质的诊断)患者和10名健康对照的血清样品中分出了低密度脂蛋白(LDL)颗粒。将LDL颗粒收集在密度d＝1.063的一份组分中。使用了Beckman CoulterOptima MAX-XP超速离心机和TLA-120.2转子进行脂蛋白分离。
在脂质提取之前，利用Micro BCATM蛋白测定试剂盒确定LDL样品的总蛋白含量。如Deckelbaum等此前所述进行脂质提取，之后运行提供LDL样品的定量分子脂质组学分析的已建立/验证的平台。将所得脂质数据针对样品蛋白浓度进行归一化。
为了定量神经酰胺(Cer)、三酰基甘油(TAG)、胆固醇脂(CE)和溶血磷脂，如Jung等所述利用在Hamilton Microlab Star机器人上进行的改进Folch脂质提取法来提取脂质。在样品中掺入已知量的非内源合成内参标准。在脂质提取后，将样品在氯仿:甲烷(1:2,v/v)中复原，并在提取后在提取物中掺入合成的外参标准。进行MS分析之前，将提取物储存在-20℃。
根据经略微调整的Fong和同事(2009)的方法提取神经节苷脂。在样品中掺入已知量的非内源合成内参标准。在脂质提取后，将样品在氯仿:甲烷(1:2,v/v)中复原，并进行MS分析之前储存在-20℃。
在鸟枪脂质组学中，根据和同事(2008)的方法，使用配备有自动纳米流离子源(NanoMate HD,Advion Biosciences)的混合三重四级杆/线性离子阱质谱仪(QTRAP,AB Sciex)分析了脂质提取物。根据Ekroos等(2002,2003)所述，利用基于多前体离子扫描(MPIS)的方法，在正离子模式和负离子模式下分析了分子脂质。使用基于前体离子扫描(PIS)和中性丢失扫描(NL)的方法分析了三酰基甘油(TAG)。根据Ejsing等(2006)所述，对分子脂质物种进行了鉴定和半绝对或绝对量的定量。
在配备有超高压液相色谱(UHPLC)系统(CTC HTC PAL自动进样器和RheosAllegro泵)的混合三重四级杆/线性离子阱质谱仪(QTRAP)上，根据Sullards等(2007)的描述利用基于多反应监测(MRM)的方法以负离子模式分析了鞘脂。
将通过质谱检测到的峰的质量和计数转化为相应脂质名称和浓度的列表。制作校正曲线以确定所监测的每种脂质类别的动态定量范围，例如，定量限。采用内参标准来对内源脂质物种进行定量。使用校正曲线来确定所述方法的定量限。
对于各平台，采用严格的截止值来将背景噪声与真实的脂质峰分离。对各样品进行控制并仅在满足接受标准的时候才予以接受。将检测到的峰的质量和计数转化为相应脂质名称列表。将脂质针对其各自的内参标准和样品体积进行归一化，以得到其浓度。
由于数据具有近似的对数正态，对于经对数转换的脂质浓度进行非配对学生t检验。对于脂质/脂质比率，对于近似为对数正态的经对数转换的脂质比率，采用t检验。ROC曲线、比值比(OR)和所有相关的描述性统计都获自对经对数转化的脂质浓度和脂质/脂质比率拟合的逻辑回归模型。用Shapiro-Wilk检验测试了所用方法的正态假设。利用SAS9.3软件进行所有分析。根据原始标度计算组平均值之间的报告差异。
实施例2
结果
用个体的血浆/血清样品常规地测量标准脂质参数，以评估个体的CVD风险。作为Health2000调查的一部分，进行包括标准脂质参数在内的全面健康检查来获得普通群体的整体健康状况。通常，高水平的载脂蛋白B、总胆固醇(总-C)、LDL胆固醇(LDL-C)和甘油三酯，以及另一方面的低水平的HDL胆固醇(HDL-C)，被视为风险因素。总胆固醇对HDL胆固醇的比率升高也用来评价CVD风险。然而，如上所述，这些参数不能鉴别大比例的CVD患者。本发明人将来自证实患有CVD的患者的标准脂质测试的结果与对照个体进行了比较。如图2A所示，在病例和对照之间，任何标准脂质测试都不存在显著差异。所有这些目前使用的CVD标志物都出现在火山图的底部(虚线)框中(图2A)，表明这些标志物在病例和对照之间没有差别。这证明了现有方法在基于实验室测试来区分CVD患者方面表现较差。图2B示出了标准测试的浓度。实际上，该实验群中的CVD患者比对照具有更有利的脂质结果，包括更低的载脂蛋白B、总-C和LDL-C。需要注意的是，由于这些参与者中没有他汀使用者，更低的LDL-C不能通过降脂药物治疗来解释。
在全血浆/血清水平上测试常规测量的标准脂质测试，包括特异性HDL-C和LDL-C测试。因为特定脂质的功能可能随与其联结的脂蛋白颗粒而有所不同，本发明人决定分离样品的LDL组分以进行进一步分析。对这些组分的脂质含量进行了全面分析。脂质数据由来自数种脂质类别的分子脂质(即，脂质类别和鉴定的脂肪酸部分)的浓度以及通过将该脂质类别的分子脂质浓度相加获得的脂质类别浓度构成。
在临床应用中，将脂质浓度针对总样品体积进行归一化，且浓度单位例如为mmol/l或mg/dl。LDL组分由物理性质(包括尺寸、密度和电荷)以及脂质分子的量不同的异质颗粒群组成。这表明，对于给定脂质浓度，颗粒数量可能在个体之间有很大不同(见图1)，这可能导致风险评估中的明显偏差。为了消除样品中颗粒数量的差异的影响，使其成为CVD风险的有信息的标志物，本发明人将脂质数据针对样品的总蛋白浓度进行了归一化。
根据这些脂质数据，利用分子脂质物种的浓度和/或总脂质类别浓度(按上述方式获得)计算出多种脂质比率以及病例和对照之间各比率的统计学显著性。将个体脂质浓度结合到独特的脂质/脂质比率中，显著改善了将病例与对照区分的预测值。图3中，分子脂质浓度和脂质类别浓度以及计算出的脂质/脂质比率作为火山图给出。该图以颜色强度示出了CVD病例和对照之间各分析物(圆圈)的差异以及其统计学显著性。下部框(虚线)中的圆圈表示在CVD病例和对照之间没有差异的分析物。大多数定量的脂质和计算出的比率以及标准脂质测试都落入下部框中(图3)。另一方面，多种脂质比率在组间具有非常显著的差别(p<0.001)(图3，上部框)，并将CVD病例与对照区分开。圆圈沿X轴的位置表明与对照相比CVD患者的该分析物水平降低或升高。表1总结了高度显著(p<0.001)的脂质比率。对于每种脂质比率，示出了百分比差异(％差异)和置信区间为95％(95％CI)的每单位标准偏差所对应的比值比(OR/SD)，以及它们的P值。这些比率中使用的分子脂质的浓度如表6所示。
表1中大部分鉴定出的比率由相对于三酰基甘油(TAG)脂质的神经酰胺(Cer)、神经酰胺衍生物(Glc/GalCer/GM3神经节苷脂)或胆固醇脂(CE)脂质构成。另外，溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)脂质与TAG脂质的比率在CVD患者和对照之间显著不同。重要的是，由分子脂质物种以及脂质类别总和构成的比率能够将两个组明显区分开。因此与现在使用的常规脂质测试相比，这些比率是优异的CVD生物标志物。
本发明涉及非HDL组分中的神经酰胺、神经酰胺衍生物或胆固醇酯与甘油三酯的比率作为CVD生物标志物的应用。所述甘油三酯分子物种作为分子总和(例如TAG52:2总)出现，其由如表7所示的脂肪酸的一种或多种可能的组合构成。所述生物标志物可以由所述分子脂质和/或脂质类别总和的浓度构成。生物标志物比率的一些实例在图4中示出。
本发明的重要方面是用非HDL组分(例如LDL组分)确定所述脂质比率，其与用全血/血浆/血清确定的相同脂质比率相比，产生了对CVD患者与对照的优异区分(图5,表5)。显示了LDL组分(图5A)和全血浆(图5A)中的Cer(d18:1/18:0)/总TAG比率的ROC曲线和曲线下面积(AUC)值。显示了LDL胆固醇的ROC曲线(图5C)以进行比较。其他的血浆/LDL脂质比率的AUC值在表5中列出。这证明了确定特定组分而不是全血/血浆样品中的脂质比率的本发明具有诊断方面的改进。
表1.CVD和健康受试者之间的统计学上高度显著地受影响的神经酰胺/TAG比率的列表(按字母顺序排列)。缩写：Cer，神经酰胺；TAG，三酰基甘油；CI，置信区间；OR，比值比；SD，标准偏差。
表2.CVD和健康受试者之间的统计学上高度显著地受影响的CE/TAG比率的列表(按字母顺序排列)。缩写：CE，胆固醇酯；TAG，三酰基甘油；CI，置信区间；OR，比值比；SD，标准偏差。
表3.CVD和健康受试者之间的统计学上高度显著地受影响的LPE/TAG比率的列表(按字母顺序排列)。缩写：LPE，溶血磷脂酰乙醇胺；TAG，三酰基甘油；CI，置信区间；OR，比值比；SD，标准偏差。
表4.CVD和健康受试者之间的统计学上高度显著地受影响的神经酰胺/CE比率的列表(按字母顺序排列)。缩写：Cer，神经酰胺；CE，胆固醇脂；CI，置信区间；OR，比值比；SD，标准偏差。
表5 血浆和LDL组分之间选定的脂质比率的95％置信区间(95％CI)的曲线下面积(AUC)值的比较，表明了LDL组分具有明显更好的区分度。
表6 用于计算表1的比率的分子脂质的平均脂质浓度(pmol/μg总蛋白)
表7 各TAG总物种的可能的脂肪酸组合。
本发明的其他实施方式
根据以上内容，应领会的是本发明还涵盖了以下段落的编号项中提出的实施方式。
1.一种确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
2.一种评估对受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的治疗的有效性的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效。
3.一种为受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症选择合适的治疗的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充。
4.如1至3项中任一项所述的方法，其中
(a)与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自表1所示的任意神经酰胺/TAG浓度比；
(b)与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自表2所示的任意CE/TAG浓度比；
(c)与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自表3所示的任意LPE/TAG浓度比；或
(d)与对照相比下降的神经酰胺/CE浓度比选自表4所示的任意神经酰胺/CE浓度比。
5.如第1至4项中任一项所述的方法，其中，利用测定来完成对脂质/脂质浓度比的确定。
6.如第2或3项所述的方法，其中，所述治疗是调脂性(lipid modifying)治疗。
7.如前述任一项所述的方法，其中
(a)与对照相比下降的神经酰胺/TAG浓度比选自：
Glc/GalCer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；
Cer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；或
GM3-d18:1/24:0/TAG 54:2总(18:0/18:1/18:1)；
(b)与对照相比下降的CE/TAG浓度比选自：
CE 22:6/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；
CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；或
CE 22:6/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；
(c)与对照相比下降的LPE/TAG浓度比选自：
LPE 18:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；
LPE 18:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；或
LPE 16:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；
或
(d)与对照相比升高的神经酰胺/CE浓度比选自：
Cer(d18:1/18:0)/CE 22:0；
Cer(d18:1/20:0)/CE 22:0；或
Cer(d18:1/22:0)/CE 22:0。
8.如前述任一项所述的方法，所述方法包括确定至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、或至少8种本文提到的所述脂质/脂质浓度比或其组合。
9.如前述任一项所述的方法，其中，
(a)所述CVD的特征为冠状动脉疾病、外周动脉疾病、卒中和/或CVD死亡；和/或
(b)所述CVD是动脉粥样硬化引起的；和/或
(c)所述受试者具有动脉粥样硬化；或
(d)所述受试者不具有动脉粥样硬化。
10.如前述任一项所述的方法，其中
(a)所述方法还包括：确定来自所述受试者的样品中的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白B(ApoB)和/或载脂蛋白C-III(ApoC-III)的血清水平；和/或
(b)所述受试者不具有：血清水平升高的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白C-III(ApoC-III)或载脂蛋白B(ApoB)中的一种或多种，或血清水平降低的HDL-胆固醇(HDL-C)。
11.如前述任一项所述的方法，其中，所述受试者
(a)正接受或已经接受过他汀、另一种降脂药、和/或脂质/脂质浓度比调节剂的治疗；或
(b)还未接受过他汀疗法、另一种降脂药疗法、和/或脂质/脂质浓度比调节剂疗法。
12.如前述任一项所述的方法，其中，所述非HDL样品是LDL样品、极低密度脂蛋白(VLDL)样品、或中间密度脂蛋白(IDL)样品，或其组合。
13.如前述任一项所述的方法，其中，所述非HDL样品是LDL样品。
14.如前述任一项所述的方法，其中，所述脂质/脂质浓度比利用以下方式确定：质谱法，核磁共振谱法，荧光光谱法或双偏振干涉测量法，诸如HPLC、UHPLC或UPLC等高效分离方法，诸如ELISA等免疫测定，和/或用能够特异性地结合分析物的结合性部分进行的测定。
15.如前述任一项所述的方法，其中，所述方法用于：
(a)确定患者发展CVD的风险；
(b)确定患者的CVD早期预警信号；
(c)确定或预测动脉粥样硬化在患者中的存在；和/或
(d)预测和/或诊断CVD和/或CVD并发症，包括预测和/或诊断心肌梗塞(MI)、心绞痛、短暂缺血发作(TIA)和卒中，或预测死亡。
16.一种能够调节第1至4项或第7项中任一项所述的脂质/脂质浓度比的药物，用于治疗或预防动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症，其中，施用所述药物从而使来自所述受试者的样品中的所述脂质/脂质浓度比在与对照相比时没有显著不同，并且其中，所述药物是他汀、另一种降脂药、或脂质/脂质浓度比调节剂。
17.一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的能够调节第1至4项或第7项中任一项所述的脂质/脂质浓度比的药物，其中，施用所述药物从而使所述脂质/脂质浓度比在与对照相比时没有显著不同，并且其中，所述药物是他汀、另一种降脂药、或脂质/脂质浓度比调节剂。
18.一种用于预测或检测受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症、或用于实施前述或后述任一项所述的方法或应用的试剂盒，其中，所述试剂盒包含：
(a)一种或多种脂质标准品，其选自第1至4或7项中提到的任一种脂质/脂质浓度比中的脂质；和/或校正曲线对照；和/或阳性和/或阴性对照；
和可选的一种或多种以下物质：
(b)一种或多种对照标志物，例如一种脂质或多种脂质，例如第1至4或7项中提到的任一种脂质/脂质浓度比中的脂质，或蛋白；
(c)内参标准和/或外参标准；
(d)能够结合第1至4或7项中提到的任一种脂质/脂质浓度比中的任一脂质的试剂，可选地为抗体；和
(e)用于实施所述方法或应用的试剂。
19.第18项所述的试剂盒在预测或检测动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症中的应用，其中，来自受试者的样品中的所述脂质/脂质浓度比可选地利用质谱法来确定。
20.一种用于预测或检测受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症、或用于实施前述任一项所述的方法或应用的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
(a)能够结合第1至4或7项中提到的任一种脂质/脂质浓度比中的任一脂质的抗体，所述抗体缀合于酶或可检测标记；或第1至4或7项中提到的任一种脂质/脂质浓度比中的任一脂质，其缀合于酶或可检测标记；
和可选的一种或多种以下物质：
(b)对所述酶具有特异性的底物；
(c)包被有能够结合(a)中的任意抗体的二抗的测定平板；
(d)标准品和/或校正曲线标准品；
(e)终止溶液；和
(f)执行测定所需的必要的缓冲剂和/或试剂。
21.如第20项所述的试剂盒，其中，缀合于酶或可检测标记的所述抗体能够结合第7项所述的脂质/脂质浓度比中的任一脂质；和/或其中缀合于酶或可检测标记的所述脂质是第7项所述的脂质/脂质浓度比中的任一脂质。
22.一种抗体，所述抗体针对第1至4或7项中提到的任一种脂质/脂质浓度比中的任一脂质，所述抗体用于：
a)预测受试者发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的风险；或
b)预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
23.如前述任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体，其中，所述受试者有风险发展或已患有一种或多种CVD并发症，例如急性心肌梗塞，且/或有心血管死亡的风险。
24.如前述任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体，其中，所述受试者已经患有心血管疾病。
25.一种他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，用于预防或治疗受者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症，其中，
a)当采用前述任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体时，所述受试者将被鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
b)通过前述任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体，已将所述受试者鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
c)当采用前述任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体时，所述受试者将被鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；和/或
d)通过前述任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体，已将所述受试者鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
26.如第11-15、17、23或24项中任一项所述的方法，第16、23或24项中任一项所述的药物，或第25项所述的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述降脂药选自除他汀以外的HMG-CoA还原酶抑制剂；尼克酸(烟酸)；胆固醇吸收抑制剂；胆固醇酯转移蛋白(CETP)；胆汁酸多价螯合剂；贝特类物质；植物固醇；或PCSK9抑制剂。
27.如第26项所述的方法、药物或其他降脂药，其中
所述胆固醇吸收抑制剂选自依泽替米贝和SCH-48461；
所述胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂选自安塞曲匹、依塞曲匹和达塞曲匹；
所述胆汁酸多价螯合剂选自考来维仑、考来烯胺和考来替泊；
所述贝特类物质选自非诺贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯和苯扎贝特；并且
所述PCSK9抑制剂选自PCSK9特异性抗体、siRNA和肽模拟物。
28.如第11-15、17、23或24项中任一项所述的方法，第16、23或24项中任一项所述的药物，或第25项所述的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述他汀选自由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、氟伐他汀XL、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗舒伐他汀和辛伐他汀组成的组。
29.如第11-15、17、23或24项中任一项所述的方法，第16、23或24项中任一项所述的药物，或第25所述的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述脂质/脂质浓度比调节剂选自小分子、抗体、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或者天然的或经修饰的脂质，优选第1至4或7项中所述的任一种脂质/脂质浓度比中的脂质。
30.如第1-15、17、23、24和26-29项中任一项所述的方法，第16、23、24和26-29项中任一项所述的药物，或第25-29项中任一项所述的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述对照来自：健康个体，
普通健康个体群，
已经没有任何主要CVD并发症的CAD患者，或
已经没有任何主要CVD并发症的CAD患者群。
31.如第30项所述的方法、药物、他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述对照是非HDL样品。
32.如第30或31项所述的方法、药物、他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述对照是
LDL样品,
极低密度脂蛋白(VLDL)样品，或
中间密度脂蛋白(IDL)样品，或其组合。
33.如第30或31项所述的方法、药物、他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述对照是LDL样品。
34.前述任一项所述的方法、药物、应用、试剂盒、抗体、他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所要预防或治疗的动脉粥样硬化或CVD的一种或多种并发症选自心肌梗塞(MI)、急性心肌梗塞(AMI)、心绞痛、短暂缺血发作(TIA)和卒中。
35.前述任一项所述的方法、药物、应用、试剂盒、抗体、他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所要预防的动脉粥样硬化或CVD的一种或多种并发症是死亡。
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本领域的技术人员将认识到，或仅利用常规实验就能够确定，实施例和本专利说明书全文中公开的具体实施方式的多种等同方式。认为所述等同方式在本发明的范围内，并意图由所附权利要求或以上列出的各项涵盖。本文引用的所有专利、专利申请和公开参考文献都通过引用方式全文并入文本。
Claims (51)
1.一种获得用于确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的数据的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比。
2.一种确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
3.一种评估对受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的治疗的有效性的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述治疗有效。
4.一种为受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症选择合适的治疗的方法，所述方法包括：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者需要治疗或需要对已经施用的治疗进行改变或补充。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述方法是计算机执行的方法。
6.如权利要求5所述的方法，所述方法还包括：
(e)通过至少一个处理器获得反映出所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度的信息；
(f)通过至少一个处理器确定所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度；和
(g)以用户可读形式输出所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度。
7.如权利要求6所述的方法，所述方法还包括：
(h)通过至少一个处理器确定对照与所述非HDL样品中的所述神经酰胺/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述CE/TAG浓度比、所述非HDL样品中的所述LPE/TAG浓度比、或所述非HDL样品中的所述神经酰胺/CE浓度之间的百分比差异；和
(i)以用户可读形式输出在确定步骤(h)中获得的所述百分比差异。
8.如权利要求7所述的方法，所述方法还包括：基于在输出步骤中获得的所述百分比差异，确定受试者是否有风险发展或是否患有动脉粥样硬化或心血管疾病(CVD)和/或其一种或多种并发症。
9.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括：在确定步骤之后，基于在所述确定步骤中获得的所述神经酰胺/TAG浓度比、CE/TAG浓度比、LPE/TAG浓度比、或神经酰胺/CE浓度比，改变、补充或保持对所述受试者已经施用的治疗。
10.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括：在确定步骤之后，基于在所述确定步骤中获得的所述神经酰胺/TAG浓度比、CE/TAG浓度比、LPE/TAG浓度比、或神经酰胺/CE浓度比来治疗所述受试者。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中
(a)所述神经酰胺/TAG浓度比选自表1中提到的任意神经酰胺/TAG浓度比；
(b)所述CE/TAG浓度比选自表2中提到的任意CE/TAG浓度比；
(c)所述LPE/TAG浓度比选自表3中提到的任意LPE/TAG浓度比；或
(d)所述神经酰胺/CE浓度比选自表4中提到的任意神经酰胺/CE浓度比。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，利用测定来完成对脂质/脂质浓度比的确定。
13.如权利要求3、4、9或10所述的方法，其中，所述治疗是调脂性治疗。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
(a)所述神经酰胺/TAG浓度比选自：
Glc/GalCer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；
Cer(d18:1/22:0)/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；或
GM3-d18:1/24:0/TAG 54:2总(18:0/18:1/18:1)；
(b)所述CE/TAG浓度比选自：
CE 22:6/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；
CE 16:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；或
CE 22:6/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；
(c)所述LPE/TAG浓度比选自：
LPE 18:0/TAG 50:1总(16:0/16:0/18:1)；
LPE 18:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；或
LPE 16:0/TAG 50:2总(14:0/18:1/18:1)(16:0/16:0/18:2)(16:0/16:1/18:1)；
或
(d)所述神经酰胺/CE浓度比选自：
Cer(d18:1/18:0)/CE 22:0；
Cer(d18:1/20:0)/CE 22:0；或
Cer(d18:1/22:0)/CE 22:0。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括确定至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、或至少8种本文提到的脂质/脂质浓度比或其组合。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
(a)所述CVD的特征为冠状动脉疾病、外周动脉疾病、卒中和/或CVD死亡；和/或
(b)所述CVD是动脉粥样硬化引起的；和/或
(c)所述受试者具有动脉粥样硬化；或
(d)所述受试者不具有动脉粥样硬化。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中
(a)所述方法还包括：确定来自所述受试者的样品中的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白B(ApoB)和/或载脂蛋白C-III(ApoC-III)的血清水平；和/或
(b)所述受试者不具有血清水平升高的总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白C-III(ApoC-III)或载脂蛋白B(ApoB)中的一种或多种，或血清水平降低的HDL-胆固醇(HDL-C)。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者
(a)正接受或已经接受过他汀、另一种降脂药、和/或脂质/脂质浓度比调节剂的治疗；或
(b)还未接受过他汀疗法、另一种降脂药疗法、和/或脂质/脂质浓度比调节剂疗法。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述非HDL样品是LDL样品、极低密度脂蛋白(VLDL)样品、或中间密度脂蛋白(IDL)样品，或其组合。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述非HDL样品是LDL样品。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，脂质/脂质浓度比利用以下方法确定：质谱法，核磁共振谱法，荧光光谱法或双偏振干涉测量法，诸如HPLC、UHPLC或UPLC等高效分离方法，诸如ELISA等免疫测定，和/或用能够特异性地结合分析物的结合性部分进行的测定。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法用于：
(a)确定患者发展CVD的风险；
(b)确定患者的CVD早期预警信号；
(c)确定或预测动脉粥样硬化在患者中的存在；和/或
(d)预测和/或诊断CVD和/或CVD并发症，包括预测和/或诊断心肌梗塞(MI)、心绞痛、短暂缺血发作(TIA)和卒中，或预测死亡。
23.一种能够调节权利要求1至4、11或14中任一项所述的脂质/脂质浓度比的药物，所述药物用于治疗或预防动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症，其中，施用所述药物使得来自所述受试者的样品中的所述脂质/脂质浓度比在与对照相比时没有显著不同，并且其中，所述药物是他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂。
24.一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的能够调节权利要求1至4、11或14中任一项所述的脂质/脂质浓度比的药物，其中，施用所述药物使得所述脂质/脂质浓度比在与对照相比时没有显著不同，并且其中，所述药物是他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂。
25.一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效剂量的能够调节权利要求1至4、11或14中任一项所述的脂质/脂质浓度比的药物，其中，施用所述药物使得所述脂质/脂质浓度比在与对照相比时没有显著不同，并且其中，所述药物是：他汀；选自除他汀以外的HMG-CoA还原酶抑制剂、尼克酸(烟酸)、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、胆汁酸多价螯合剂、贝特类物质、植物固醇和PCSK9抑制剂的另一种降脂药；或选自小分子、抗体、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或者天然的或经修饰的脂质的脂质/脂质浓度比调节剂。
26.一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效剂量的药物，其中，所述药物是他汀；选自除他汀以外的HMG-CoA还原酶抑制剂、尼克酸(烟酸)、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、胆汁酸多价螯合剂、贝特类物质、植物固醇和PCSK9抑制剂的另一种降脂药；或选自小分子、抗体、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或者天然的或经修饰的脂质的脂质/脂质浓度比调节剂，并且其中，在施用所述药物之前，基于与对照相比降低的神经酰胺/TAG浓度比、降低的CE/TAG浓度比、降低的LPE/TAG浓度比、或降低的神经酰胺/CE浓度比，已将所述受试者鉴定为患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
27.一种用于预测或检测受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症、或用于执行前述或后续权利要求中任一项所述的方法的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
(a)一种或多种脂质标准品，所述标准品选自权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的脂质；和/或校正曲线对照；和/或阳性和/或阴性对照。
28.如权利要求27所述的试剂盒，所述试剂盒还包括一种或多种以下物质：
(b)一种或多种对照标志物，其中，所述一种或多种对照标志物是：权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的脂质，或蛋白；
(c)内参标准和/或外参标准；
(d)能够结合权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的任一种脂质的试剂；和
(e)用于执行所述方法的试剂。
29.如权利要求28所述的试剂盒，其中，所述能够结合权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的任一种脂质的试剂是抗体。
30.权利要求27至29中任一项所述试剂盒在预测或检测动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症中的应用，其中，来自受试者的样品中的所述脂质/脂质浓度比可选地利用质谱法来确定。
31.一种用于预测或检测受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症、或用于实施前述权利要求中任一项所述的方法或用途的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
(a)能够结合权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的任一种脂质的抗体，所述抗体缀合于酶或可检测标记；或权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的任一种脂质，其缀合于酶或可检测标记；和可选的一种或多种以下物质：
(b)对所述酶具有特异性的底物；
(c)包被有能够结合(a)中的任意抗体的二抗的测定平板；
(d)标准品和/或校正曲线标准品；
(e)终止溶液；和
(f)一种或多种缓冲剂和/或试剂。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其中，缀合于酶或可检测标记的所述抗体能够结合权利要求14所述的脂质/脂质浓度比中的任一种脂质；和/或其中，缀合于酶或可检测标记的所述脂质是权利要求14所述的脂质/脂质浓度比中的任一种脂质。
33.一种预测或检测受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括利用权利要求27至29、31和32中任一项所述的试剂盒来：
(a)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(b)确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(c)确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；或
(d)确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，其中，与对照相比所述样品中浓度比下降表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
34.如权利要求33所述的方法，其中，来自所述受试者的样品中的所述脂质/脂质浓度比利用质谱法来确定。
35.一种确定受试者是否有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括：
(a)利用抗体确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/TAG浓度比，所述抗体针对权利要求1至4、11或14所述的任一种神经酰胺/TAG浓度比中的任一种脂质，其中，与对照相比所述样品中降低的神经酰胺/TAG浓度比表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(b)利用抗体确定来自所述受试者的非HDL样品中的CE/TAG浓度比，所述抗体针对权利要求1至4、11或14所述的任一种CE/TAG浓度比中的任一种脂质，其中，与对照相比所述样品中降低的CE/TAG浓度比表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
(c)利用抗体确定来自所述受试者的非HDL样品中的LPE/TAG浓度比，所述抗体针对权利要求1至4、11或14所述的任一种LPE/TAG浓度比中的任一种脂质，其中，与对照相比所述样品中降低的LPE/TAG浓度比表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；或
(d)利用抗体确定来自所述受试者的非HDL样品中的神经酰胺/CE浓度比，所述抗体针对权利要求1至4、11或14所述的任一种神经酰胺/CE浓度比中的任一种脂质，其中，与对照相比所述样品中降低的神经酰胺/CE浓度比表明所述受试者患有或有增加的风险发展动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
36.一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的抗体，所述抗体针对权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的任一种脂质。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者有风险发展或患有一种或多种CVD并发症，例如急性心肌梗塞，且/或有心血管死亡的风险。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述受试者已经患有心血管疾病。
39.一种抗体，所述抗体针对权利要求1至4、11或14所述的任一种脂质/脂质浓度比中的任一种脂质，所述抗体用于：
a)预测受试者发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的风险；或
b)预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
40.一种他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，用于预防或治疗受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症，其中，
a)当采用前述权利要求中任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体时，所述受试者将被鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
b)通过前述权利要求中任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体，已将所述受试者鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
c)当采用前述权利要求中任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体时，所述受试者将被鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；和/或
d)通过前述权利要求中任一项所述的方法、药物、试剂盒、应用或抗体，已将所述受试者鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
41.如权利要求18至22、25或26中任一项所述的方法，权利要求23所述的药物，或权利要求40所述的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述降脂药选自：除他汀以外的HMG-CoA还原酶抑制剂；尼克酸(烟酸)；胆固醇吸收抑制剂；胆固醇酯转移蛋白(CETP)；胆汁酸多价螯合剂；贝特类物质；植物固醇；或PCSK9抑制剂。
42.一种治疗或预防有需要的受试者的动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症的方法，所述方法包括对所述受试者施用治疗有效剂量的：他汀；选自除他汀以外的HMG-CoA还原酶抑制剂、尼克酸(烟酸)、胆固醇吸收抑制剂、胆固醇酯转移蛋白(CETP)、胆汁酸多价螯合剂、贝特类物质、植物固醇和PCSK9抑制剂的另一种降脂药；或选自小分子、抗体、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或者天然的或经修饰的脂质的脂质/脂质浓度比调节剂，并且其中
a)根据权利要求2至22或33至35中任一项所述的方法，所述受试者将被鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
b)根据权利要求2至22或33至35中任一项所述的方法，已将所述受试者鉴定为有风险发展或患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；
c)根据权利要求2至22或33至35中任一项所述的方法，所述受试者将被鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症；和/或
d)根据权利要求2至22或33至35中任一项所述的方法，已将所述受试者鉴定为没有风险发展或未患有动脉粥样硬化或CVD和/或其一种或多种并发症。
43.如权利要求25、26、41或42中任一项所述的方法，其中，所述胆固醇吸收抑制剂选自依泽替米贝和SCH-48461；所述胆固醇酯转移蛋白(CETP)抑制剂选自安塞曲匹、依塞曲匹和达塞曲匹；所述胆汁酸多价螯合剂选自考来维仑、考来烯胺和考来替泊；所述贝特类物质选自非诺贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯和苯扎贝特；并且所述PCSK9抑制剂选自PCSK9特异性抗体、siRNA和肽模拟物。
44.如权利要求18、25、26、41或42中任一项所述的方法，其中，所述他汀选自由阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、氟伐他汀XL、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、罗舒伐他汀和辛伐他汀组成的组。
45.如权利要求18至22、25、26、41或42中任一项所述的方法，权利要求23所述的药物，或权利要求40所述的他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所述脂质/脂质浓度比调节剂选自小分子、抗体、反义RNA、小干扰RNA(siRNA)或者天然的或经修饰的脂质，优选权利要求1至4或7中所述的任一种脂质/脂质浓度比中的脂质。
46.如权利要求2至22、24、25、26、33至35、41或42中任一项所述的方法，其中，所述对照来自健康个体、普通健康个体群、已经没有任何主要CVD并发症的CAD患者、或已经没有任何主要CVD并发症的CAD患者群。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述对照是非HDL样品。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述非HDL样品是LDL样品、极低密度脂蛋白(VLDL)样品或中间密度脂蛋白(IDL)样品，或其组合。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述非HDL样品是LDL样品。
50.前述权利要求中任一项所述的方法、药物、应用、试剂盒、抗体、他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所要预防或治疗的动脉粥样硬化或CVD的一种或多种并发症选自心肌梗塞(MI)、急性心肌梗塞(AMI)、心绞痛、短暂缺血发作(TIA)和卒中。
51.前述权利要求中任一项所述的方法、药物、应用、试剂盒、抗体、他汀、另一种降脂药或脂质/脂质浓度比调节剂，其中，所要预防的动脉粥样硬化或CVD的一种或多种并发症是死亡。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |