JP4062514B2 - ミエロペルオキシダーゼ、心臓血管疾患についての危険性指示因子 - Google Patents

Description

本願は、米国仮出願６０／２５９，３４０（２００１年１月２日出願）および米国仮出願６０／２８３，４３２（２００１年５月１２日出願）（これら両方は、その全体が本明細書中で援用される）の優先権を主張する。

本願に記載される研究は、少なくとも部分的に、国立衛生研究所の助成番号ＲＯ１ ＨＬ６２５２６−０１により支援された。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。

（背景）
本発明は、心臓血管疾患の分野に関する。より詳細には、本発明は、個体または試験被験体が、所定のヒト被験体集団中の他の個体よりも、心臓血管疾患を発症するかまたは心臓血管疾患を有する危険性が低いかまたは高いかを決定するために使用され得る、診断試験に関する。

心臓血管疾患（ＣＶＤ）は、心臓および血管の疾患についての一般的な用語であり、これにはアテローム性動脈硬化症、冠動脈心臓疾患、脳血管疾患、および末梢血管疾患が挙げられる。心臓血管障害は、ＣＶＤの急性症状であり、これには心筋梗塞、発作、狭心症、一過性脳虚血発作、およびうっ血性心不全が挙げられる。ＣＶＤは、米国における死因の２分の１を占め、そして第１の致命的疾患である。従って、心臓血管疾患の予防は、主な公衆衛生の重要性の分野である。

低脂肪食および運動は、ＣＶＤを予防するために推奨されている。さらに、多数の薬物が、ＣＶＤを発症する危険性があることが知られているヒトに、医師により処方され得る。これには、コレステロールおよびトリグリセリドの血液レベルを減少させる脂質低下剤が挙げられる。血圧を正常化する薬剤は、高血圧の患者に使用される。血小板の活性化を防止する薬剤（例えば、アスピリン）もまた、ＣＶＤを発症する危険性のある患者に処方され得る。より積極的な治療（例えば、複数の薬剤の投与）は、危険性の高い個体に使用され得る。ＣＶＤ治療は、有害な副作用を有し得るので、危険性のある個体、特にＣＶＤを発症する危険性の高い個体を同定するための診断試験を有することが望ましい。

現在、いくつかの危険因子が、個体のＣＶＤを発症する危険性を評価するためおよび高い危険性のある個体を同定するために、医師界のメンバーによって使用される。心臓血管疾患についての主な危険因子としては、高血圧、早期ＣＶＤの家族歴、喫煙、高い総コレステロール、低いＨＤＬコレステロールおよび糖尿病が挙げられる。ＣＶＤについての主な危険因子は、付加的であり、そして代表的には、ＣＶＤの処置から恩恵を受ける可能性が最も高い個体を標的化するための危険予測アルゴリズムにおいて、医師によって一緒に使用される。これらのアルゴリズムは、１０年以内の１５％のＣＶＤの危険性を予測するために、高い感度および特性を達成する。しかし、ＣＶＤを発症する高い可能性を予測する現在のアルゴリズムの能力は、制限されている。現在の危険因子のいずれも有さない個体の中で、１０年以内にＣＶＤを発症する危険性は、なおも約２％ある。さらに、現在公知の危険因子を使用して決定されるように、多数の心臓血管障害が、危険プロフィールを緩和する能力が明らかに低い個体において生じる。従って、ＣＶＤの危険性があるかまたはＣＶＤに罹患したより広範な個体を同定するために、現在の心臓血管危険アルゴリズムを拡大する必要性がある。

アテローム性動脈硬化症のメカニズムは、十分には理解されていない。過去十年間にわたって、多量の臨床的、病理学的、生化学的および遺伝的データは、アテローム性動脈硬化症は慢性炎症性障害であるという概念を支持してきた。急性期反応物質（例えば、Ｃ反応性タンパク質、補体タンパク質）は、高感度であるが非特異的な炎症のマーカーであり、これは脂肪線条およびアテローム性動脈硬化症病変の後期において豊富に存在する。最近の見込みのある臨床試験において、Ｃ反応性タンパク質のベースライン血漿レベルは、明らかに健康な個体における初めての心筋梗塞および発作の危険性を、独立して予測した。米国特許第６，０４０，１４７号は、Ｃ反応性タンパク質、サイトカインおよび細胞接着分子を使用して、個体の心臓血管障害を発症する危険性を特徴付ける方法を記載する。有用であるが、これらのマーカーは、ＣＶＤ以外の原因に起因する炎症を有する個体の血液において見出され得、従って、これらのマーカーは、高度には特異的ではない。

従って、個体の、心臓血管疾患を発症するかまたは心臓血管疾患を有する危険性を特徴付けるためのさらなる診断試験の必要性がなお存在する。従来のＣＶＤ危険因子（例えば、ＬＤＬレベル）に対して非依存性の危険因子を用いる診断試験が、特に望ましい。

（発明の要旨）
本発明は、個体の、心臓血管疾患を発症するかまたは心臓血管疾患を有する危険性を特徴付けるための新規な診断試験を提供する。本発明の試験は、非常に積極的なＣＶＤ治療を必要とする個体、およびＣＶＤの予防の際に標的化される治療を必要としない個体を同定するために、特に有用である。本発明の診断試験は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を有する患者が、血管造影的に有意なＣＡＤを有さない被験体よりも有意に高いレベルの白血球および血液ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）レベルを有するという発見に基づく。ＣＡＤ患者および非ＣＡＤ患者における白血球−ＭＰＯレベルは、年齢、性別、糖尿病、高血圧、喫煙（これまでの喫煙または現在の喫煙）、ＷＢＣ数、ＬＤＬ−Ｃ、トリグリセリドおよびＦｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｉｓｋ Ｓｃｏｒｅに対して非依存性であることもまた発見された。従って、本発明の診断試験（これは、試験被験体由来の血液サンプルまたはその誘導体中の、ＭＰＯ活性のレベル、ＭＰＯ量のレベル、または選択されたＭＰＯ生成酸化産物のレベルを評価する工程を包含する）は、医師により現在用いられる臨床的および診断的危険因子を用いた場合に観察される予測値を超える付加的な予測値を提供する。

１つの局面において、本発明の診断試験は、個体または試験被験体から得られた身体的サンプル中のＭＰＯ活性のレベルを決定する工程を包含する。この身体的サンプルは、血液またはその誘導体であり、これには白血球、好中球、単球、血清または血漿が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、この試験被験体由来の身体的サンプル中のＭＰＯ活性のレベルは、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団から得られた匹敵する身体的サンプル中のＭＰＯ活性の測定から誘導される予め決定された値と比較される。このような比較は、試験被験体のＣＶＤを発症する危険性を特徴付ける。例えば、ＭＰＯ活性の血液レベルが予め決定された値よりも高い試験被験体は、血液ＭＰＯ活性レベルが予め決定された値以下の個体よりも、ＣＶＤを発症するかまたはＣＶＤを有する危険性が高い。さらに、試験被験体のＭＰＯ活性レベルと予め決定された値との間の差異の程度はまた、この危険性の程度を特徴付け、それによりどの被験体が特定の治療から最も良く恩恵を受けるかを決定するために、有用である。

別の局面において、この診断試験は、試験被験体から得られた身体的サンプル中のＭＰＯ量のレベルを決定する工程を包含する。この身体的サンプルは、血液またはその誘導体であり、これには白血球、好中球、単球、血清または血漿が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、この試験被験体由来の身体的サンプル中のＭＰＯ量のレベルは、健康なコントロールから得られた匹敵する身体的サンプル中のＭＰＯ量の測定から誘導される予め決定された値と比較される。このような比較は、この試験被験体のＣＶＤを発症する危険性を特徴付ける。

別の局面において、この診断試験は、試験被験体から得られた身体的サンプル中の１つ以上の選択したＭＰＯ生成酸化産物のレベルを決定する工程を包含する。この選択したＭＰＯ生成酸化産物は、ジチロシン、ニトロチロシン、メチオニンスルホキシド、およびＭＰＯ生成脂質過酸化産物である。好ましいＭＰＯ脂質過酸化産物は、ヒドロキシ−エイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）；ヒドロキシ−オクタデカジエン酸（ＨＯＤＥ）；Ｆ２イソプロスタン；２−ｌｙｓｏＰＣのグルタル酸モノエステル（ｇｌｕｔａｒｉｃ ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ）およびノナン二酸モノエステル（ｎｏｎａｎｅｄｉｏｉｃ ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ）（それぞれ、Ｇ−ＰＣおよびＮＤ−ＰＣ）；２−ｌｙｓｏＰＣの９−ヒドロキシ−１０−ドデセン二酸エステルおよび５−ヒドロキシ−８−オキソ−６−オクテン二酸エステル（それぞれ、ＨＤｄｉＡ−ＰＣおよびＨＯｄｉＡ−ＰＣ）；２−ｌｙｓｏＰＣの９−ヒドロキシ−１２−オキソ−１０−ドデセン酸エステルおよび５−ヒドロキシ−８−オキソ−６−オクテン酸エステル（それぞれ、ＨＯＤＡ−ＰＣおよびＨＯＯＡ−ＰＣ）；２−ｌｙｓｏＰＣの９−ケト−１２−オキソ−１０−ドデセン酸エステルおよび５−ケト−８−オキソ−６−オクテン酸エステル（それぞれ、ＫＯＤＡ−ＰＣおよびＫＯＯＡ−ＰＣ）；２−ｌｙｓｏＰＣの９−ケト−１０−ドデセン二酸エステルおよび５−ケト−６−オクテン二酸エステル（それぞれ、ＫＤｄｉＡ−ＰＣおよびＫＯｄｉＡ−ＰＣ）；２−ｌｙｓｏＰＣの５−オキソ吉草酸エステルおよび９−オキソノナン酸エステル（それぞれ、ＯＶ−ＰＣおよびＯＮ−ＰＣ）；５−コレステン−５α，６α−エポキシ−３β−オール（コレステロールα−エポキシド）；５−コレステン−５β，６β−エポキシ−３β−オール（コレステロールβ−エポキシド）；５−コレステン−３β，７β−ジオール（７−ＯＨ−コレステロール）；５−コレステン−３β，２５−ジオール（２５−ＯＨコレステロール）；５−コレステン−３β−オール−７β−ヒドロペルオキシド（７−ＯＯＨコレステロール）；ならびにコレスタン−３β，５α，６β−トリオール（トリオール）である。身体的サンプルは、血液、尿または血液誘導体であり、これには白血球、好中球、単球、血清または血漿が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、試験被験体由来の身体的サンプル中の選択したＭＰＯ生成酸化産物のレベルが、健康なコントロールから得られた匹敵する身体的サンプル中の選択されたＭＰＯ生成酸化産物の測定から誘導される予め決定された値と比較される。このような比較は、この試験被験体のＣＶＤを発症する危険性を特徴付ける。

急性の有害な心臓血管事象（例えば、心筋梗塞または虚血性発作）をすでに経験した個体について、本発明の診断試験はまた、このような個体の再発事象を有する危険性を評価するために有用である。従って、本発明はまた、被験体におけるＣＶＤの状態を長時間にわたってモニタリングするための方法を提供する。この方法は、初期に被験体から採取した身体的サンプル、および後の時点でこの被験体から採取した対応する身体的流体において、１つ以上の当該危険因子（ＭＰＯ活性、ＭＰＯ量、選択したＭＰＯ生成酸化生成物およびその組み合わせを含む）のレベルを決定する工程を包含する。後の時点で採取した身体的流体由来の当該危険因子のレベルの、初期と比較した場合の増加は、被験体の将来心臓血管事象／障害を有する危険性が増加したことを示す。後の時点で採取した身体的流体由来の当該危険因子のレベルの、初期と比較した場合の減少は、被験体の心臓血管事象を有する危険性が減少したことを示す。

別の局面において、本発明は、心臓血管疾患を有することが疑われるかまたは心臓血管疾患を有する被験体における治療を評価するための方法を提供する。この方法は、治療前の被験体から採取した身体的サンプルおよび治療中または治療後の被験体から採取した対応する身体的流体において、１つ以上の当該危険因子（ＭＰＯ活性、ＭＰＯ量、選択したＭＰＯ生成酸化産物およびそれらの組み合わせを含む）のレベルを決定する工程を包含する。治療後または治療中に採取したサンプルにおける選択した危険因子のレベルの、治療前に採取したサンプルにおける選択した危険因子のレベルと比較した場合の減少は、処置された被験体における心臓血管疾患に対するポジティブな治療効果の指標である。

（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用されるすべての参考文献は、本明細書中において参考として具体的に援用される。

本発明は、ＣＶＤを発症する個体の危険性またはＣＶＤを有する個体の危険性を特徴付けるための診断試験を提供する。１つの局面において、この方法は、個体から得た身体サンプル中におけるＭＰＯ活性のレベルを得る工程を包含する。別の局面において、この方法は、個体由来の身体サンプル中のＭＰＯ量のレベルを得る工程を包含する。別の局面において、この方法は、個体または試験被験体由来の身体サンプル中の１つ以上の選択ＭＰＯ生成酸化生成物のレベルを得る工程を包含する。このようなＭＰＯ生成酸化生成物は、ジチロシン、ニトロチロシン、メチオニンスルホキシドおよび脂質過酸化生成物からなる群より選択される。なお別の局面において、この方法は、ＭＰＯ活性、もしくはＭＰＯ量、またはその両方のレベル、および個体から得られた身体サンプル中の１つ以上の選択ＭＰＯ生成酸化生成物のレベルを得る工程を包含する。

次いで、ＭＰＯ活性もしくはＭＰＯ量または個体の身体サンプル中の選択ＭＰＯ生成酸化生成物のレベルを、予め決定された値と比較して、ＣＶＤを発症する個体の危険性またはＣＶＤを有する個体の危険性を特徴付ける危険値を提供する。

本発明はまた、ＭＰＯ活性、もしくはＭＰＯ量、または選択ＭＰＯ生成酸化生成物についてのアッセイを含むキットに関連する。このようなアッセイは、本発明の診断方法に基づいて選択された予め決定された値に関して、適切な感受性を有する。本発明のキットは、例えば、アッセイの結果に基づいて危険を特徴付けるための、異なるカットオフ、特定のカットオフにおける異なる感受性、ならびに使用説明所または他の印刷物を含むことによって、ＭＰＯについて現在市販のキットとは異なる。

（身体サンプルの調製）
標準的診断手順を使用して、全血は個体または試験被験体から得られる。血漿は、抗凝固化血液の遠心分離によって全血サンプルから得られる。このようなプロセスは、白血球成分のバフィコートおよび血漿の上清を提供する。

血清は、抗凝固剤を含まない管中に収集された全血サンプルの遠心分離によって収集される。血液は、遠心分離の前に凝固し得る。遠心分離によって得られる黄色−赤色の流体が血清である。

白血球は、以下の実施例における記載のような浮遊密度遠心分離を含む、種々の技術のいずれかによって全血サンプルから単離され得る。

（ミエロペルオキシダーゼおよびミエロペルオキシダーゼ生成酸化生成物）
ＭＰＯ（ドナー：過酸化水素、オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１１．１．７）は、約１５０ｋＤａの、４量体の重グリコシル化塩基性（ＰＩ．１０）ヘムタンパク質である。これは、２つの同一なジスルフィド連結プロモーターから構成され、これらのそれぞれは、プロトポルフィリン含有５９〜６４ｋＤａ重サブユニットおよび１４ｋＤａ軽サブユニットを有する（Ｎａｕｓｅｅｆ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｂｌｏｏｄ ６７：１５０４−１５０７；１９８６）。

ＭＰＯは、好中球および単球において豊富に存在し、それぞれ、これらの細胞の乾燥重量の５％、および１〜２％を占める（Ｎａｕｓｅｅｆ，Ｗ．Ｍら、Ｂｌｏｏｄ ６７；１５０４−１５０７；１９８６．，（Ｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｋ．：Ｅｖｅｒｓｅ Ｊ．；Ｅｖｅｒｓｅ Ｋ．；Ｇｒｉｓｈａｍ Ｍ． Ｂ．編、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ １ｓｔ ｅｄ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；１９９１：３７−６２）。ヘムタンパク質は、白血球の一次アズール顆粒に保存され、そして種々のアゴニストによる食細胞活性化に続いて細胞外環境およびファゴリソソーム画分の両方に分泌される（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊら、Ｔｈｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ：ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；１９７８）。免疫組織化学法は、ＭＰＯが、ヒトアテローム性動脈硬化損傷に存在することを実証した。しかし、ＭＰＯは、ヒトアテローム性動脈硬化症を有する個体由来の血液サンプル中において増加したレベルで存在することはまだ示されていない。

ＭＰＯについての現在提案されている実用の動力学モデルを、図１に示す。ＭＰＯは、複合体ヘムタンパク質であり、これは、複数の中間状態を有し、このそれぞれは、Ｏ_２ ⁻およびＨ_２Ｏ_２ならびに酸化窒素（ＮＯ、一酸化窒素）のような還元酸素種の利用能によって影響される（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５−５４３０；２０００）。基底状態において、ＭＰＯは、第二鉄（Ｆｅ（ＩＩＩ））形態で存在する。Ｈ_２Ｏ_２の添加において、ＭＰＯのヘム基は、２ｅ⁻当量酸化されて、化合物Ｉと呼ばれる反応性第二鉄πカチオンラジカル中間体を形成する。Ｃｌ⁻、Ｂｒ⁻、およびＩ⁻のようなハライド、ならびに偽ハライドチオシアネート（ＳＣＮ⁻）の存在下で、化合物Ｉは、単一の２ｅ⁻工程で容易に還元され、ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）および対応する次亜ハロゲン酸（ｈｙｐｏｈａｌｏｕｓ ａｃｉｄ）（ＨＯＸ）を再生する。血漿レベルのハライドおよびチオシアネート（１００ｍＭ Ｃｌ⁻、１００ｍＭ、Ｂｒ⁻、５０ｍＭ ＳＣＮ⁻、１００ｎＭ Ｉ⁻）では、塩化物が好ましい基質であり、そして次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）（強力な塩素化剤）が形成される（Ｆｏｏｔｅ，Ｃ．Ｓ．ら；．Ｎａｔｕｒｅ ３０１：７１５−７２６；１９８３．，Ｗｅｉｓｓ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７０：５９８−６０７；１９８２）。

化合物Ｉはまた、多数の有機基質を酸化し得、一方、ヘムは、２つの連続した１ｅ⁻還元工程を受け、それぞれ、化合物ＩＩおよびＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）を生成する（図１）。低分子量化合物は、主に、ＭＰＯに対する基質として役立ち、拡散可能な酸化剤およびフリーラジカル種を生成し、これらは、次いで、酸化電位のヘムを異なる標的に運び得る。ハライドおよびＳＣＮ⁻に加えて、ＭＰＯについて天然に存在する基質のいくつかとしては、ニトライト（ＮＯ_２ ⁻）（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７６１７−７６２５；１９９７）、チロシン（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７６１７−７６２５；１９９７）、アスコルベート（Ｍａｒｑｕｅｚ，Ｌ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：５６６６−５６７０；１９９０）、ウレート（Ｍａｅｈｌｙ，Ｈ．Ｃ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２：７９８−８０１；１９５５）、カテコールアミン（Ｍｅｔｏｄｉｅｗａ，Ｄ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９３：４４５−４４８；１９９０）、エストロゲン（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４５：９８３−９９８；１９７７）、およびセロトニン（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．７０：３０５−３２１；１９８９）が挙げられる。ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）はまた、不活性な第１鉄形態、ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）に還元され得る（Ｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｋ．：Ｅｖｅｒｓｅ Ｊ．；Ｅｖｅｒｓｅ Ｋ．；Ｇｒｉｓｈａｍ Ｍ．Ｂ．編、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ １ｓｔ ｅｄ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；１９９１：３７−６２．，（Ｋｅｔｔｌｅ，Ａ．Ｊ．ら、Ｒｅｄｏｘ．Ｒｅｐ．３：３−１５；１９９７）。ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）およびＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）は、Ｏ_２ ^・−、およびＯ_２にそれぞれ結合し、第二鉄ジオキシ中間体（化合物ＩＩＩ（ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）−Ｏ_２）を形成する（図１）。スペクトル研究は、化合物ＩＩＩに対するＨ_２Ｏ_２の付加が、最終的に化合物ＩＩを形成することを実証した。従って、化合物ＩＩＩは、１ｅ⁻過酸化反応を間接的に促進し得る。

近年の研究はＮＯの役割を同定し、このＮＯは、ＭＰＯペルオキシダーゼ活性を調節する際に、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）によって生成される比較的長命のフリーラジカルである（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５〜５４３０；２０００）。ＭＰＯおよびＮＯＳの誘導可能なアイソフォームは、白血球の一次顆粒中に共存する。食細胞の活性化の間（例えば、細菌の摂取の間）、ＭＰＯおよびＮＯＳは、ファゴリソソームおよび細胞外画分へ分泌され、そして、細菌タンパク質のニトロ化が観察される（Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９５５３〜９５５８；１９９６）。急速な速度論の研究は、低レベルのＮＯでは、基質のＭＰＯ触媒過酸化の初発速度が増強されるということを立証した。この機構は、ＭＰＯ触媒作用中の律速工程である、化合物ＩＩのＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）への還元の加速化を介する（図１）（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５〜５４３０；２０００．、Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ．投稿；２０００）。より高いレベルのＮＯでは、ＭＰＯの可逆的阻害が、分光学的に識別可能なニトロシル複合体（ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＮＯ）の形成を介して生じる（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５〜５４３０；２０００）。ＮＯはまた、ＭＰＯ化合物Ｉのための基質として機能し得、化合物ＩＩへの還元を生じる（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ．投稿；２０００）。さらに、ＮＯの存在下では、ペルオキシダーゼサイクルを介したＭＰＯの全体の回転率が、約１０００倍に増強される（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ．；２０００）。最後に、ＮＯはまた、対応するＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）−ＮＯ中間体を形成するＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）に可逆的に結合し得、この中間体は、ＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩ）およびＭＰＯ−Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＮＯと平衡である（図１）（Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５４２５〜５４３０；２０００．、Ａｂｕ−Ｓｏｕｄ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｓ ａ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｉｍａｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ．投稿；２０００）。

上記で記述したように、ＭＰＯは、中間物として反応性酸素を生成するために、Ｈ_２Ｏ_２とともに種々の補基質を利用し得る。これらの種によって生成された多くの安定な最終生成物は、特徴付けられ、そして、タンパク質中、脂質中およびＬＤＬ中（ヒトアテローム性動脈硬化型病巣より収集された）で濃縮されることが示された（Ｃｈｉｓｏｌｍ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４５２〜１１４５６；１９９４、Ｈａｚｅｌｌ，Ｌ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５３５〜１５４４；１９９６、Ｈａｚｅｎ、Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２０７５〜２０８１；１９９７、Ｌｅｅｕｗｅｎｂｕｒｇｈ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４３３〜１４３６；１９９７、Ｌｅｅｕｗｅｎｂｕｒｇｈ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３５２０〜３５２６；１９９７）。図２は、ＭＰＯによって生成されたいくつかの反応性中間体および生成物を要約し、これらのいずれかは、血管障害において濃縮されるということは既知である。

（ＭＰＯ活性の決定法）
ミエロペルオキシダーゼ活性は、当該分野において公知である種々の標準的方法のいずれかによって、決定され得る。このような方法の１つは、比色定量に基づくアッセイであって、ここで、ペルオキシダーゼのための基質として役立つ発色団は、任意の種々の分光学法（紫外可視検出または蛍光検出を含む）によって追跡され得る固有波長を有する生成物を生成する。比色定量に基づくアッセイのさらなる詳細は、Ｋｅｔｔｌｅ，Ａ．Ｊ．およびＷｉｎｔｅｒｂｏｕｒｎ，Ｃ．Ｃ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．２３３：５０２〜５１２；ならびにＫｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．、Ｗａｌｔｅｒｓｄｏｒｐｈ，Ａ．Ｎ．およびＲｏｓｅｎ，Ｈ．（１９８４） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１０５：３９９〜４０３（各々が本明細書中で参考として援用される）中に見出され得る。Ｇｅｒｂｅｒ，Ｃｌａｕｄｉａ，Ｅ．ら（１９９６年にＥｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３４：９０１〜９０８中に刊行された表題「Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｂｕｒｓｔ ｏｆ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｐｅｒｓｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ」）による論文は、多型核白血球（すなわち好中球）の単離法および比色定量アッセイ（色原体である４−クロロ−１−ナフトールの酸化に関する）を用いたミエロペルオキシダーゼ活性の測定法を記述する。

ペルオキシダーゼ活性は、フローサイトメトリーに基づく方法を用いて、ＭＰＯ含有細胞をインサイチュペルオキシダーゼ染色することによって決定し得る。このような方法は、白血球および白血球の亜集団中のペルオキシダーゼ活性の定量のためのハイスループットなスクリーニングを可能とする。１つの例は、ペルオキシダーゼ染色法に基づく血液学アナライザーを用いて白血球カウントおよび鑑別を生成するために使用される細胞化学ペルオキシダーゼ染色である。例えば、ＢａｙｅｒによるＡｄｖｉａ １２０血液学系は、フローサイトメトリーによって全血を分析し、そして、全白血球カウント（ＣＢＣ）を得るため、そして、種々の白血球群間を区別するために白血球のペルオキシダーゼ染色を実施する。

これらの方法を用いると、全血は機器に入り、そして、赤血球は、溶解チャンバー中で溶解される。次いで、残存する白血球は固定され、そして、ペルオキシダーゼ活性のためにインサイチュで染色される。この染色された細胞は、ペルオキシダーゼ染色の強度および細胞の全体の大きさに基づく特徴付け（所定の細胞の光散乱量に反映される）のためにフローサイトメーターへ導かれる。これらの２つのパラメーターは、通常のフローサイトメトリーソフトウェアによって、ｘ軸およびｙ軸上に各々プロットされ、そして、個々の細胞集団のクラスターは、容易に認識可能となる。細胞集団としては以下が挙げられるが、これらに限定されない；好中球、単球および好酸球（可視的なペルオキシダーゼ染色を含む３つの主要な白血球集団）。

これらの分析の過程の間、白血球（例えば、単球、好中球、好酸球およびリンパ球）は、ペルオキシダーゼ染色の強度およびそれらの全体の大きさによって同定される。従って、特定の細胞集団内の全体のペルオキシダーゼ活性染色についての情報は、個々の細胞クラスター（例えば、好中球クラスター、単球クラスター、好酸球クラスター）の位置において固有であり、そして、特定の細胞集団内のペルオキシダーゼレベルが決定され得る。本検出法におけるペルオキシダーゼ活性／染色は、ペルオキシダーゼ染色参照または校正物質と比較される。白血球あたりより高レベルのペルオキシダーゼ活性を有する個体は、サイトグラム上の位置がより高いペルオキシダーゼレベル（すなわち、白血球あたりのペルオキシダーゼ活性の平均）を示す細胞集団を有すること、または平均もしくはより高い亜群（例えば、三分位点または四分位点）のいずれかより高いレベルのペルオキシダーゼ活性を含有する細胞クラスター（例えば、好中球クラスター、単球クラスター、好酸球クラスター）内の細胞亜集団を立証することによって、同定される。

（ＭＰＯ量の決定法）
所定のサンプル中のミエロペルオキシダーゼの量は、免疫学的方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって容易に決定される。ＥＬＩＳＡによるＭＰＯ定量のための市販のキットが、利用可能である。

サンプル中のＭＰＯ量はまた、身体サンプルのインサイチュペルオキシダーゼ染色によって、間接的に決定され得る。白血球ペルオキシダーゼ染色を分析する方法は、全血に対して実施され得る（例えば、インサイチュペルオキシダーゼ染色に基づいて機能する血液学アナライザーを用いた方法）。他の研究者らによる以前の研究は、染色の全体強度がペルオキシダーゼ量に比例するということを立証した（例えば、Ｃｌａｕｄｉａ Ｅ．Ｇｅｒｂｅｒ，Ｓｅｌｉｍ Ｋｕｃｉ，Ｍａｔｔｈｉａｓ Ｚｉｐｆｅｌ，Ｄｉｔｒｉｃｈ ＮｉｅｔｈａｍｍｅｒおよびＧｅｒｎｏｔ Ｂｒｕｃｈｆｅｌｔ、「Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｂｕｒｓｔ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐｅｒｓｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ」Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）３４：９０１〜９０８）。

血液学アナライザーを介したフローサイトメトリーは、ＭＰＯ活性もしくは量レベル、または上昇したＭＰＯ活性レベルもしくは量レベルを含む細胞の数を決定する際に使用されるパラメーターを定量化するための、ハイスループットな技術である。これらの技術を使用する利点は、使用の容易さおよび迅速さである。Ａｄｖｉａ １２０は、１時間で１２０個の全細胞血液カウントおよび鑑別を実施し得、そして、一度に数μｌの血液しか利用しない。ペルオキシダーゼ活性の決定のために必要な全てのデータは、全白血球カウントおよびその鑑別を最終的に計算するために使用されるフローサイトメトリー細胞クラスター内に、保持される。読み出しは、全体のペルオキシダーゼ活性の多数の異なる指標を含むように、この装置のソフトウェアを僅かに調整することで、改変され得る。例えば、好中球クラスターの平均ペルオキシダーゼ活性が全体的に上昇（すなわち、平均ぺルオキシダーゼ指標の上昇）する個体は、心臓血管疾患発達についての危険が増加する。単に所定の細胞型についての平均ペルオキシダーゼ活性を決定することに加えて、ＣＶＤ発達の危険が増加した個体は、所定の細胞クラスター内のペルオキシダーゼ活性の全体的な分布（平均＋モード、など）を検査することによって、同定される。白血球あたりのペルオキシダーゼ活性の集団を見ることによって、細胞の一部分（例えば、上の四分位点、または上の三分位点）中に高いペルオキシダーゼ活性を含有する細胞をより高い比率で有する白血球を保持する個体は、特にハイリスクであり得るということが、推定される。

（ＭＰＯ活性およびＭＰＯ量のレベル）
体液中のＭＰＯ活性またはＭＰＯ量のレベルは、体液中のＭＰＯ活性またはＭＰＯ量を測定することによって、および血液１ｍｌあたり、血清１ｍｌあたり、血漿１ｍｌあたり、白血球（例えば、好中球または単球）あたり、重量あたり（例えば、全血液タンパク質１ｍｇあたり）白血球タンパク質の重量あたり（例えば、好中球タンパク質または単球タンパク質の重量あたり）のＭＰＯ活性またはＭＰＯ量を得るためにこの値を基準化することによって、決定され得る。あるいは、体液中のＭＰＯ活性またはＭＰＯ量のレベルは、試験被験体血液または血液誘導体中のＭＰＯ活性に基づく代表値であり得る。例えば、ＭＰＯ活性のレベルは、上昇したＭＰＯ活性レベルまたはＭＰＯ量レベルを含む、試験被験体の好中球または単球のパーセント（％）または実測数であり得る。他の代表値の例としては、サイトグラムに基づくフローサイトメトリーから取得され得るパラメーター（例えば、Ｘ軸およびＹ軸上の好中球クラスターの位置、またはＸ軸およびＹ軸に比例する好中球クラスターの主軸の角度）についての任意の単位が挙げられるが、これに限定されない。

（ミエロペルオキシダーゼにより生成される酸化生成物）
（ＨＥＴＥおよびＨＯＤＥならびに酸化されたコレステロールエステルの生成における、ＭＰＯの役割）
ＬＤＬの酸化および脂質の過酸化におけるＭＰＯの役割は、最近、いく人かの研究者によって疑問とされた。Ｎｏｇｕｃｈｉおよび共同研究者らは、野生型マウスおよびＭＰＯノックアウトマウスから単離された白血球が、エキソビボのモデル系でのＬＤＬの酸化を促進する能力を試験し、そしてモニタリングされた脂質酸化のパラメータにおいて、適度な差異のみを観察した（Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｎら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）２０００；１２７：９７１−９７６）。特に、タンパク質の酸化生成物に注目する場合に、ＮＯ_２ ⁻の存在によって、ＭＰＯにより触媒されるＬＤＬの酸化が、促進ではなく阻害されることもまた、最近示唆された（Ｃａｒｒ ＡＣら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：１８２２−１８２８）。さらに、ＭＰＯにより生成されるチロシン酸化生成物に対する、酸化促進機能よりむしろ抗酸化機能、ならびにＬＤＬ酸化が提唱された（Ｓａｎｔａｎａｍ Ｎ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １９９５：９５：２５９４−２６００、Ｅｘｎｅｒ Ｍ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００１；４９０：２８−３１）。ＭＰＯによって生成されたＨＯＣｌが、リポタンパク質脂質の酸化および過酸化水素の形成を促進し得ることもまた、いく人かの研究者によって示唆され（Ｐａｎａｓｅｎｋｏ ＯＭ．、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ １９９７；６：１８１−１９０）、一方で、他の研究は、これらの観察を支持しなかった（Ｓｃｈｍｉｔｔ Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９；３８：１６９０４−１６９１５、Ｈａｚｅｎ ＳＬら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９９９；８５：９５０−９５８）。最後に、最近の研究は、ＭＰＯおよび反応性酸化剤種の生成に関する、マウス白血球とヒト白血球との間の種の差異に注目した（Ｘｉｅ ＱＷら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｘｉｄａｎｔｓ：ｇｅｎｅｒｅａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｊｕｒｉｏｕｓ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９２、Ｒａｕｓｃｈ ＰＧら、Ｂｌｏｏｄ １９７５；４６：９１３−９１９、Ｎａｕｓｅｅｆ ＷＭ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０７：４０１−４０３、Ｂｒｅｎｎａｎ ＭＬら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ２００１；１０７：４１９−４３０）。

血漿における脂質酸化の促進におけるＭＰＯの役割を決定するために、本発明者らは、健常な被験体およびミエロペルオキシダーゼ欠損を罹患する被験体由来の活性化した好中球を、全血漿（５０％、ｖ／ｖ）および生理学的レベルのＣｌ⁻（最終１００ｍＭ）と共にインキュベートした。貪食細胞をＰＭＡで活性化させ、そしてリノール酸およびアラキドン酸それぞれの特異的酸化生成物の形成を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにより決定した。

（ＭＰＯおよびリポタンパク質の単離）
ＭＰＯ（ドナー：過酸化水素、オキシドレダクターゼ、ＥＣ １．１１．１．７）を、記載されるように単離し、そして特徴付けた（Ｈｅｉｎｅｃｋｅ ＪＷら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：４０６９−４０７７、Ｗｕ Ｗら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９；３８：３５３８−３５４８）。単離されたＭＰＯの純度を、Ｒ／Ｚ≧０．８５（Ａ_４３０／Ａ_２８０）を実証すること、クーマシーブルー染色を用いるＳＤＳ ＰＡＧＥ分析、およびゲル内でのテトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ染色によって確定し、好酸球ペルオキシダーゼの夾雑がないことを確認した（Ｗｕ Ｗら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９；３８：３５３８−３５４８）。精製したＭＰＯを、５０％グリセロール中−２０℃で貯蔵した。酵素濃度を、分光光度法で決定した（ε_４３０＝１７０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１）（Ｏｄａｊｉｍａ Ｔら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９７０；：７１−７７）。ＬＤＬを、新鮮な血漿から、逐次的な超遠心分離によって、１．０１９＜ｄ＜１．０６３ｇ／ｍｌの画分として単離し、透析を、アルゴン雰囲気下で密封された瓶内で実施した（Ｈａｔｃｈ ＦＴ．Ａｄｖ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９６８；６：１−６８）。最終の調製物を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００μＭ ＤＴＰＡ中に維持し、そして使用するまでＮ_２下で貯蔵した。ＬＤＬ濃度を、１ｍｇのＬＤＬタンパク質あたりで表す。

（ヒト好中球調製物）
ヒト好中球を、正常な被験体およびＭＰＯ欠損の被験体由来の全血から、記載されるように単離した（Ｈａｚｅｎ ＳＬら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６；２７１：１８６１−１８６７）。好中球調製物を、ＨＢＳＳ（Ｍｇ^２＋なし、Ｃａ^２＋なし、フェノールなしかつ重炭酸なし、ｐＨ７．０）中に懸濁させ、そして試験のためにすぐに使用した。

（脂質過酸化反応）
単離したヒト好中球（１０^６／ｍｌ）を、５０％（ｖ／ｖ）正常ヒト血漿または単離したヒトＬＤＬ（０．２ｍｇ／ｍｌ）のいずれかと共に、空気中で、１００μＭ ＤＴＰＡを補充されたＨＢＳＳ中、３７℃でインキュベートした。好中球を、２００ｎＭの酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を添加することにより活性化し、そして５分ごとに穏やかに攪拌することによって、懸濁状態に維持した。２時間後、氷／水浴に浸漬することによって反応を停止させ、４℃で遠心分離し、そしてすぐに、５０μＭのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）および３００ｎＭのカタラーゼを上清に添加した。次いで、この上清における脂質の過酸化生成物を、以下に記載するように迅速にアッセイした。

単離したＭＰＯとの反応を、代表的に、３７℃で、１００μＭのＤＴＰＡを補充されたリン酸ナトリウム緩衝液中（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）で、３０ｎＭ ＭＰＯ、１ｍＭ グルコース（Ｇ）、２０ｎｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）を使用して実施した。この条件下で、Ｈ_２Ｏ_２の一定の流束（０．１８μＭ／分）が、グルコース／グルコースオキシダーゼ（Ｇ／ＧＯ）系によって発生した。他に言及しない限り、反応を、氷／水浴に浸漬させ、そしてこの反応混合物に５０μＭのＢＨＴと３００ｎＭのカタラーゼとの両方を添加することによって、停止させた。

（脂質抽出およびサンプル調製）
脂質を抽出し、そして全ての工程において、アルゴン雰囲気下または窒素雰囲気下で、質量分光分析のために調製した。第１に、ＳｎＣｌ_２（最終１ｍＭ）を添加することによって、反応混合物中の過酸化水素を、その対応する水酸化物に還元した。既知量の重水素化内部標準である、１２（Ｓ）−ヒドロキシ−５，８，１０，１４−エイコサテトラエン−５，６，８，９，１１，１２，１４，１５−ｄ８酸（１２−ＨＥＴＥ−ｄ８；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）をサンプルに添加し、次いで１Ｍ酢酸／２−イソプロパノール／ヘキサン混合物（２／２０／３０、ｖ／ｖ／ｖ）を、５ｍｌ有機溶媒混合物：１ｍｌ血漿の比で添加することによって、血漿脂質を抽出した。この混合物をボルテックスし、そして遠心分離した後に、脂質をヘキサン層に抽出した。等量のヘキサンを添加し、続いてボルテックスおよび遠心分離することによって、血漿を再抽出した。合わせたヘキサン抽出物をＮ_２下で乾燥させ、サンプルを２００μｌの２−イソプロパノール／アセトニトリル／水（４４／５４／２、ｖ／ｖ／ｖ）で再構築し、そして分析するまで−８０℃でアルゴン下で貯蔵することによって、コレステリルエステルヒドロペルオキシド（ＣＥ−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥ）は、これらの安定なＳｎＣｌ_２還元水酸化物形態であることを分析した。遊離脂肪酸およびこれらの酸化生成物のアッセイのために、全脂質（リン脂質、コレステロールエステル、トリグリセリド）をＮ_２下で乾燥させ、１．５ｍｌの２−イソプロパノールに再懸濁させ、次いで１．５ｍｌ １Ｍ ＮａＯＨでの６０℃、３０分間、アルゴン下での塩基加水分解によって、脂肪酸を遊離させた。加水分解したサンプルを、２Ｍ ＨＣｌでｐＨ３．０まで酸性化し、そして脂肪酸を５ｍｌのヘキサンで２回抽出した。合わせたヘキサン層をＮ_２下で乾燥し、１００μＬのメタノールに再懸濁し、そして以下に記載されるＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによる分析まで、アルゴン下−８０℃で貯蔵した。

（血漿濾液のＨＰＬＣ分画）
脂質の過酸化の促進におけるＭＰＯに対する基質のような、血漿中の低分子量化合物によって果たされる役割を研究するために、正常な健常なドナー由来の全血漿を、１０ｋＤａ ＭＷｔカットオフフィルタ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ＹＭ−１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ ＵＳＡ）を通して、遠心分離により濾過した。この血漿の濾液を、直接、またはＨＰＬＣによる分画に続いてのいずれかで使用した。逆相ＨＰＬＣ分画を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ−１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ ＯＤＳ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を使用して実施した。血漿濾液（０．５ｍｌ）中の低分子量化合物の分離を、１．０ｍｌ／分の流速で、以下の勾配を用いて実施した：１００％移動相Ａ（０．１％の酢酸を含む水）で１０分間、次いで１００％移動相Ｂ（０．１％の酢酸を含むメタノール）までの直線勾配で１０分間、続いて１００％移動相Ｂで５分間。溶出液を１ｍｌの画分として収集し、Ｎ_２下で乾燥させ、次いで分析のために、緩衝液（０．１ｍｌ）に再懸濁した。強力な陰イオン交換ＨＰＬＣ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）による血漿濾液（０．５ｍｌ）の分画を、ＳＰＨＥＲＩＳ ＨＰＬＣカラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ ＳＡＸ；Ｐｈａｓｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．Ｎｏｒｗａｌｋ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）で実施した。血漿濾液中の低分子量化合物の分離を、０．９ｍｌ／分の流速で、無勾配条件下で、移動相として４５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．０）を使用して実施した。溶出液を、１．０ｍｌの画分として収集し、Ｎ_２下で乾燥させ、次いで分析のために、緩衝液（０．１ｍｌ）に再懸濁した。

ａ）質量分析
ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳを使用して、アラキドン酸（９−ヒドロキシ−５，７，１１，１４−エイコサテトラエン酸および９−ヒドロペルオキシ−５，７，１１，１４−エイコサテトラエン酸（９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥ））およびリノール酸（９−ヒドロキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸および９−ヒドロペルオキシ−１０，１２−オクタデカジエン酸（９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥ））のフリーラジカル依存性酸化生成物を定量した。分析の直前に、１容量のＨ_２Ｏを、５容量のメタノールに懸濁させたサンプルに添加し、これを次いで、０．２２μｍのフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に通した。サンプル（２０μｌ）をＰｒｏｄｉｇｙ Ｃ−１８カラム（１×２５０ｍｍ、５μｍ ＯＤＳ、１００Ａ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｒａｎｃｈｏ Ｐａｌｏｓ Ｖｅｒｄｅｓ，ＣＡ）に、５０μｌ／分の流速で注入した。分離を、移動相として水中９５％メタノールを使用して、無勾配条件下で実施した。各分析において、ＨＰＬＣカラム溶出物の全体を、Ｑｕａｔｔｒｏ ＩＩ ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｎｄｒｕｐｏｌｅ ＭＳ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｉｎｃ．）に導入した。分析を、エレクトロスプレーイオン化を使用して、陰イオン様式で、モニタリングされる異性体に対して特異的な、親イオンおよび特徴的な娘イオンの複数の反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて実施した。モニタリングされた遷移は、９−ＨＯＤＥについては質量対電荷の比（ｍ／ｚ）で２９５ １７１であり；９−ＨＥＴＥについてはｍ／ｚ ３１９ １５１であり；１２−ＨＥＴＥ−ｄ８についてはｍ／ｚ ３２７ １８４であった。Ｎ_２を、エレクトロスプレー界面におけるカーテン気体として使用した。内部標準１２−ＨＥＴＥ−ｄ８を使用して、抽出効率を計算した（これは、全ての分析について８０％を超えた）。真性標準を用いて構築した外部較正曲線を使用して、９−ＨＥＴＥおよび９−ＨＯＤＥを定量した。

ｂ）ＣＥ−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥのＲＰ−ＨＰＬＣ定量
メタノール中で再構築したサンプル（１００μｌ）（塩基加水分解なし）を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ−１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ ＯＤＳ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）に注入した。脂質を、２−イソプロパノール／アセトニトリル／水（４４／５４／２、ｖ／ｖ／ｖ）からなる無勾配溶媒系を使用して、１．５ｍｌ／分の流速で分離した。ＣＥ−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥを、これらの安定なヒドロキシド形態として、２３４ｎｍでのＵＶ検出によって、外部較正曲線を作成するためにＣＥ−９−ＨＯＤＥ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、定量した。

（結果）
正常な好中球は、有意なレベルの９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥおよび９−（Ｈ）ＰＥＴＥを、ＰＭＡによる細胞活性化に続いて、血漿中で生成した（図４）。全く対照的に、ＭＰＯ欠損の好中球は、これらがＯ_２ ^・−を生成する増強された能力にもかかわらず、有意なレベルの脂質過酸化生成物を、ＰＭＡでの刺激の後に生成しなかった。触媒量のＭＰＯを添加することによって、ＭＰＯ欠損好中球が、内因性血漿脂質の過酸化を開始する能力が回復した（図４）。

細胞混合物へのカタラーゼの添加（しかし熱により不活化されたカタラーゼではない）によって、血漿中での脂質過酸化のより完全な消耗が生じ、このことは、細胞依存性反応におけるＨ_２Ｏ_２の重要な役割を強く示唆する（図５）。反応混合物をスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）と共にインキュベートすることは、血漿脂質の酸化を減衰させない（図５）。対照的に、ヘム毒（例えば、アジド、シアニド）および水溶性抗酸化剤であるアスコルベートを添加することにより、好中球に依存する血漿脂質の過酸化が完全に阻害された。最後に、ＨＯＣｌスカベンジャー（例えば、ジチオトレイトールおよびチオエーテルメチオニン）の添加は、９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥおよび９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥの定量によって評価されると、好中球依存性の内因性血漿脂質の過酸化を減衰しなかった（図５）。

ここまでに示された結果は、好中球は、ＭＰＯ−Ｈ_２Ｏ_２系を用い、血漿における脂質過酸化の開始のための１次酸化剤として、塩素化中間体と異なる反応性種を生成することを強く示唆する。ＭＰＯに関する生理学的役割を確認するために、本発明者らは、次いで、精製されたヒトＭＰＯおよびＨ_２Ｏ_２生成系（グルコース／グルコースオキシダーゼ、Ｇ／ＧＯ）を、血漿に加え、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析によって、特定の酸化生成物の形成をモニターした。９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥおよび９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥの形成が、容易に起こり、ＭＰＯおよびＨ_２Ｏ_２生成系両方の存在のための、絶対的な必要条件を有した（図６）。脂質酸化は、また、カタラーゼ、アジドまたはアスコルビン酸によって阻害されたが、ＳＯＤまたはメチオニンの添加によって影響されなかった（図６）。ひとまとめにすると、これらの結果は、複雑な生物学的組織、および血漿のような流体において、脂質過酸化を開始するための１次機構としてのＭＰＯ−Ｈ_２Ｏ_２系に関する白血球の中枢的役割を強く支持する。

（アテローム性動脈硬化症の損傷におけるＬＤＬのＭＰＯ酸化および生成する酸化産物の存在）
（一般的手順）ヒトミエロペルオキシダーゼ（ドナー；過酸化水素、オキシドレダクターゼ、ＥＣ１．１１．１．７）およびＬＤＬを単離し、記載されるように定量した（Ｐｏｄｒｅｚ，Ｅ．Ａら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５４７）。全ての緩衝液をＣｈｅｌｅｘ−１００樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて処理し、そして、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を補い、インキュベーション中にＬＤＬ酸化を触媒し得る微量レベルの遷移金属イオンを除去した。ＬＤＬを、記載されたように、１００ｄｐｍ／ｎｇタンパク質と２５０ｄｐｍ／ｎｇタンパク質の間の比放射能となるように、Ｎａ［^１２５Ｉ］で標識した（Ｈｏｐｐｅ，Ｇ．ら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４、１５０６−１２）。細胞の脂質の抽出ならびに放射標識されたコレステロールエステルおよび標識されていないコレステロールの薄相クロマトグラフィー分離を、記載のように実行した（Ｐｏｄｒｅｚ，Ｅ．Ａら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５４７）。示されたリポタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）とのインキュベーション後の、細胞によるコレステロールエステルへの［^１４Ｃ］オレエートの取り込みを、記載のように決定した（Ｐｏｄｒｅｚ，Ｅ．Ａら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５４７）。ウサギ胸大動脈をＷＨＨＬウサギから単離し、１００μＭブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）および１００μＭ ＤＴＰＡを補充されたアルゴン噴霧ＰＢＳ中でリンスし、同じ緩衝液中に浸し、アルゴンをかぶせそして液体窒素中で瞬間凍結し、次いで、分析まで−８０℃で保存した。脂質損傷に比較的侵されていない大動脈を１０〜１２週齢のＷＨＨＬウサギから得、十分損傷している大動脈を、６ヶ月齢を越えたＷＨＨＬウサギから回収した。

（リポタンパク質改変）ＭＰＯ生成ニトロ化中間体によって改変されたＬＤＬ（ＮＯ_２−ＬＤＬ）を、他に明記されていなければ、３７℃で、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１００μＭ ＤＴＰＡ、３０ｎＭ ＭＰＯ、１００μｇ／ｍｌグルコース、２０ｎｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼおよび０．５ｍＭ ＮａＮＯ_２中で８時間、ＬＤＬ（０．２ｍｇタンパク質／ｍｌ）をインキュベートすることによって形成した。これらの条件下で、Ｈ_２Ｏ_２の定常流（１０μＭ／時間）を、Ｆｅ（ＩＩ）の酸化およびＦｅ（ＩＩＩ）−チオシアネート錯体の形成によって決定される、グルコース／グルコースオキシダーゼ系によって生成する（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｌｉｅｔ，Ａ．ら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：７６１７）。酸化反応を、反応混合物への４０μＭ ＢＨＴおよび３００ｎＭカタラーゼの、添加によって終了した。ＬＤＬアセチル化を、以前に記載されたように実施した（Ｐｏｄｒｅｚ，Ｅ．Ａら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１５４７）。

（リン脂質の分離および質量分光分析）脂質を、不活性な環境（アルゴンまたは窒素）下で、絶えず維持した。等容量の飽和ＮａＣｌ溶液を（脂質の抽出を高めるために）加えた直後に、脂質を、酸化ＰＡＰＣもしくは酸化ＰＬＰＣまたはＮＯ_２−ＬＤＬのいずれかから、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの方法［Ｂｌｉｇｈ，１９５９＃５２］によって、連続的に３回抽出した。合わせたクロロホルム抽出物を、窒素下でエバポレートし、次いで、脂質をメタノール中に（約２００μｇ／０．１ｍＬで）再懸濁し、Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＣＲ ＰＴＦＥフィルターを通して濾過し、逆相カラム（Ｌｕｎａ Ｃ１８，２５０×１０ｍｍ，５μｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）にアプライした。脂質を、Ｗａｔｅｒｓ ６００Ｅ多重溶媒送達システムＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって生成された３元勾配（アセトニトリル／メタノール／Ｈ_２Ｏ）を使用して、３ｍＬ／分の流速で分離し、蒸発光散乱検出器（Ｓｅｄｅｘ ５５，Ｓｅｄｅｒｅ，Ａｌｆｏｒｔｖｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用してモニターした。

生理活性脂質のさらなる分画および単離を、Ｎ_２下で乾燥され、ＢＨＴを補充されたクロロホルム（３００μｌ）中に再懸濁され、アルゴン環境下で維持された、３回の分離の混合脂質抽出物に対して実行した。その画分のアリコート（２／３）を、取り出し、窒素下でエバポレートし、そして、逆相ＨＰＬＣカラムに注入する直前に、ＨＰＬＣ緩衝液（メタノール／水；８５／１５；ｖ／ｖ）中に再懸濁した。

質量分光分析は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）プローブを備え、ＨＰ １１００ ＨＰＬＣ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）とインターフェースされた、Ｑｕａｔｒｏ ＩＩ ３連四重極質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌｔｒｉｎｃｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）で実行した。脂質（遊離の脂質および誘導体後の脂質の両方）は、Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０×４．６ｍｍ、５μｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）で、０．８ｍｌ／分の流速で分離した。不連続勾配（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ＩＩ）を、以下のように、溶媒Ａ（メタノール（ＭｅＯＨ）：Ｈ_２Ｏ、８５：１５、ｖ：ｖ）を溶媒Ｂ（ＭｅＯＨ）と混合することによって使用した：０〜７分、溶媒Ａでのイソクラティック溶出；７〜１０分、８８％の溶媒Ｂへ増加；１０〜３４分、９１％の溶媒Ｂへ増加；次いで、３４〜５２分、９４％の溶媒Ｂへ増加。４５μｌ／分を質量分析計に導入し、そして７５５μｌ／分を収集し、生物学的活性を分析するために、カラム溶出物を分割した。いくつかの場合において、生物学的活性をまた、真正標準物の注入後に、同じ勾配を使用して決定した。質量分光分析を、エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）を、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）モード（コーン電圧６０ｅＶ／衝突エネルギー２０〜２５ｅＶ）で陽性イオンモードにて使用して、オンラインで実行した。各々の画分中に存在する、酸化されたリン脂質を検出するために使用されたＭＲＭ遷移は、分子カチオン［ＭＨ］^＋および ｍ／ｚ １８４の娘イオン（ホスホコリン基）に対する質量対電荷比（ｍ／ｚ）（すなわち、［ＭＨ］^＋→ｍ／ｚ １８４）であった。リン脂質のオキシム誘導体を、［ＭＨ^＋２９］^＋→ｍ／ｚ１８４でモニターした。

種々の酸化されたＰＣ種の定量化を、ＭＲＭを使用した陽イオンモードでＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳを使用して実行した。蟻酸（０．１％）が、移動層に含まれた。別個の酸化されたリン脂質種を、図２および図３に図示されるように、各々個々のリン脂質に対して特異的な、プロトン化された親→娘遷移についての、ｍ／ｚおよびそれらの保持時間を使用することによって同定した。ＯＶ−ＰＣおよびＮＤ−ＰＣを、同様にしかし各々の検体に対してメタノールと形成されたヘミアセタールと極性ヘッド基の損失の間の遷移についてのｍ／ｚ（ｍ／ｚ１８４）でモニタリングすることによっても、定量化した。

脂質は、リポタンパク質または組織から、ＢＨＴの存在下で、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．ら、１９５９、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、３７、９１１−９１７）によって、まず３回抽出された。合わせた抽出物を、窒素下で迅速に乾燥し、メタノール：Ｈ_２Ｏ（９８：２、ｖ：ｖ）中に再懸濁し、次いで、脂質抽出物中の中性脂質を、１８Ｃミニカラム（Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ−１８ ＳＰＥ ｔｕｂｅ，３ｍｌ；Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）を通すことによって除去した。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）の既知量を、内部標準として極性脂質画分に加え、脂質を、窒素下で乾燥し、分析の２４時間以内まで、−８０℃のアルゴン環境下で保存した。較正曲線を、固定量のＤＭＰＣおよび各々の酸化された合成ＰＣ種の変動するモル％を用いて作成し、異なる脂質間で観測された、イオン化応答因子における差異について較正するために使用した。さらなる予備的な研究において、使用された定量法は、標準的な添加の方法によって得られた結果と同一の結果であることを示すことによって、各々の検体について独立に検証された。

（結果）
ＬＤＬのネイティブ形態および酸化形態におけるＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析による、種々の特定の酸化されたＰＣ種の定量によって、酸化ホスファチジルコリン種の量の実質的な増加が明らかになった（図７ａ、ネイティブＬＤＬ、ＮＯ_２−ＬＤＬに関するデータを示す）。酸化のどの時点が検査されたかに関わらず、ＨＯＤＡ−ＰＣおよびＨＯＯＡ−ＰＣは、ＭＰＯによるＬＤＬ酸化の主要な生成物であった。ＮＯ_２−ＬＤＬにおいて検出された、（残存する、酸化されないリン脂質およびＮＤ−ＰＣに比例する）合わせたモル％（図７ａ）は、約１．２モル％に対応する。これらのうち、ＮＯ_２ＬＤＬ調製物において定量された、８個の酸化されたＰＣ種の合わせた量（図７ａ）は、０．７３モル％に対応する。

酸化されたＰＣ種が、インビボで形成されるかどうかを決定するために、広範なアテローム性動脈硬化症の損傷を有する胸大動脈および有しない胸大動脈を、Ｗａｔａｎａｂｅ遺伝性高脂質血症（ＷＨＨＬ）ウサギから単離し、複数の異なる特定の酸化されたリン脂質のレベルを、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析を使用して決定した。ｏｘＰＡＰＣ（ＨＯＯＡ−ＰＣ，ＫＯＯＡ−ＰＣ，ＨＯｄｉＡ−ＰＣ，ＫＯｄｉＡ−ＰＣ）ならびにｏｘＰＬＰＣ（ＨＯＤＡ−ＰＣ，ＫＯＤＡ−ＰＣ，ＨＤｄｉＡ−ＰＣおよびＫＤｄｉＡ−ＰＣ）由来の、酸化されたＰＣの各々の量における有意な増加が、疾患の血管において注目された（図７ｂ）。興味深いことに、ＰＬＰＣ由来の酸化されたＰＣ種のレベルが、より高度に酸化されたＯＮ−ＰＣおよびＮＤ−ＰＣについて観測されたレベルより低かったのに対して、ＰＡＰＣ由来の酸化されたＰＣ種のレベルは、ＯＶ−ＰＣおよびＧ−ＰＣについて観測されたレベルと同等であった（図７ａ）。

（ヒト被験体の、アテローム性動脈硬化症の損傷におけるＨＥＴＥ、ＨＯＤＥ、Ｆ_２イソプロスタンおよび酸化されたＰＣ種の存在）
Ａｎｇｉｏｇａｒｄは、経皮的血管介入の間、使用するために最近発明された、塞栓保護デバイスである。このデバイスは、血管形成術のためのバルーン膨張の前に、標的損傷に対して遠位側で展開される。このデバイスは、一時的な保護として作用し、不活性なふるい様メッシュを通して、押し出された脂質リッチなプラーク物質を捕捉する。メッシュの孔は大きく、顕微鏡によって、それらの孔が、血球の流れも血小板の流れも遮断せず、しかし大きな脂質小球を捕捉することが確認される。介入の時にＡｎｇｉｏｇａｒｄ中に捕捉された物質は、分析され、プラーク物質中の脂質種が決定された。図８は、Ａｎｇｉｏｇａｒｄから回収されるプラーク物質中の、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ法によって定量される、複数の異なる脂質酸化産物のレベルを示す。比較のために、本発明者らは、心臓移植ドナーからの器官採取の時に回収された、正常な大動脈内膜中の、同じ酸化された脂質のレベルもまた評価した。モニターした、Ｆ_２−イソプロスタンおよびＨＥＴＥ各々における劇的な増加を観測した。Ａｎｇｉｏｇａｒｄ中に捕捉されたプラーク物質の分析によって、複数の異なるｏｘＰＣ種の検出もまた確認された（データは示さず）。

（選択したミエロペルオキシダーゼにより生成された酸化産物のレベルを決定する方法）
（Ａ．ジチロシンおよびニトロチロシン）
身体サンプルにおけるジチロシンレベルおよびニトロチロシンレベルは、そのようなチロシン種と反応性であるモノクローナル抗体を使用して、決定され得る。例えば、抗ニトロチロシン抗体が、標準的手順を使用して生成および標識され得、その後、そのサンプルにおける遊離ニトロチロシンまたはペプチド結合ニトロチロシンの存在を検出するために免疫アッセイにおいて使用され得る。適切な免疫アッセイとしては、例として、（固相および液相の両方の）ラジオイムノアッセイ、蛍光結合アッセイまたは酵素結合イムノソルベントアッセイが挙げられる。好ましくは、その免疫アッセイは、そのサンプル中に存在するチロシン種の量を定量するためにも使用され得る。

そのジチロシン種に対するモノクローナル抗体およびニトロチロシン種に対するモノクローナル抗体は、確立された手順に従って生成される。一般的に、そのジチロシン残基またはニトロチロシン残基（ハプテンとして公知である）は、まず、キャリアタンパク質に結合体化され、そして宿主動物を免疫するために使用される。好ましくは、ジチロシン残基およびニトロチロシン残基は、異なる周囲配列とともに合成ペプチド中に挿入され、その後、キャリアタンパク質に結合される。そのキャリアに結合されたそのペプチド内のジチロシン種およびニトロチロシン種の周囲の配列を交代させる（ｒｏｔａｔｅ）ことによって、その周囲配列の状況に関わらず、そのジチロシン種のみ対する抗体およびニトロチロシン種のみ対する抗体が、生成される。類似するストラテジーが、種々の他の低分子量アミノ酸アナログを用いて首尾良く使用されている。

適切な宿主動物としては、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、およびモルモットが挙げられるが、これらに限定されない。種々のアジュバントが、その宿主動物における免疫学的応答を増加させるために使用され得る。使用されるアジュバントは、その宿主種に、少なくとも部分的に依存する。そのジチロシンに特異的なモノクローナル抗体およびニトロチロシンに特異的なモノクローナル抗体が生成される可能性を増加させるために、それぞれのジチロシン種およびニトロチロシン種を含むペプチドが、免疫される動物中に存在するキャリアタンパク質に結合体化され得る。例えば、モルモットアルブミンが、モルモットにおける免疫のためのキャリアとして、一般的に使用される。そのような動物は、抗体分子の不均質集団を生成し、その集団は、ポリクローナル抗体と呼ばれ、そしてその集団は、免疫された動物の血清に由来し得る。

モノクローナル抗体（これは、特定の抗原に結合する抗体の均質集団である）が、連続細胞系列から得られる。モノクローナル抗体を生成するための従来の技術は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ ３５６：４９５−４９７（１９７５））およびＫｏｓｂｏｒらのヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３））である。このような抗体は、任意の免疫グロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む）およびその任意のサブクラスであり得る。改変アミノ酸（例えば、３−ニトロチロシン）に対する抗体を調製するための手順は、Ｙｅ，Ｙ．Ｚ．，Ｍ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｚ．Ｑ．ＨｕａｎｇおよびＪ．Ｓ．Ｂｅｃｋｍａｎ、１９９６、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６９：２０１〜２０９に記載される。

一般に、体液に由来するタンパク質結合ジチロシン種およびタンパク質結合ニトロチロシン種を直接測定するための技術は、遊離アミノ酸残基を含む液体抽出物を提供するためにタンパク質および脂質を除去することを包含する。その組織および体液は、好ましくは、緩衝化し、キレート化し、そして抗酸化剤保護した溶液中に、好ましくは−８０℃にて、上記のように保存される。その後、その凍結組織および凍結体液は、解凍され、ホモジナイズされ、そして好ましくは、上記のようにメタノール：ジエチルエーテル：水の単相混合物で抽出されて、脂質および塩が除去される。重い同位体で標識された内部標準が、そのペレットに添加され、それは、好ましくは、真空下で乾燥され、加水分解され、その後、アミノ酸加水分解産物が、好ましくは水：メタノール混合物中に再懸濁され、ミニ固相Ｃ１８抽出カラムに通され、誘導体化され、そして上記のように安定なアイソトープ希釈ガスクロマトグラフィー−質量分析法によって分析される。その身体サンプル中の遊離ジチロシン種およびニトロチロシン種の値は、上記のように、タンパク質含量またはチロシンのようなアミノ酸に対して正規化され得る。

非常に好ましい手順において、タンパク質は、Ｈ_２Ｏ／メタノール／Ｈ_２Ｏ飽和ジエチルエーテル（１：３：８ ｖ／ｖ／ｖ）の単相混合物を用いる２回の連続抽出を使用して、脱脂および脱塩される。酸化チロシン標準物（各々２ｐｍｏｌ）およびユニバーサル標識チロシン（２ｎｍｏｌ）が、タンパク質ペレットに添加される。脱塩されたタンパク質ペレットを、１％フェノールを補充した脱気６Ｎ ＨＣｌとともにアルゴン雰囲気下で２４時間インキュベートすることによって、タンパク質は加水分解される。アミノ酸加水分解産物は、ｃｈｅｌｅｘ処理水中に再懸濁され、そして０．１％トリフルオロ酢酸で予め平衡化されたミニ固相Ｃ１８抽出カラム（Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ−Ｃ１８ＳＰＥミニカラム；３ｍｌ；Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｌｌｆｏｎｅ，ＰＡ）に適用される。２ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸で連続洗浄した後、酸化チロシンおよびチロシンが、２ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸中の３０％メタノールを用いて溶出され、真空下で乾燥され、その後、質量分析法によって分析される。

タンデム質量分析法が、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＰ４０００高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にインターフェースされたイオン捕捉質量分析計（ＬＣＱ Ｄｅｃａ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｉｇａｎｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いるエレクトロスプレーイオン化および検出を使用して、実施される。サンプルは、平衡溶媒（０．１％ギ酸を含むＨ_２Ｏ）中に懸濁され、そしてＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｉｎｅｘ，５μｍ，２．０ｍｍ×１５０ｍｍ）上に注入される。Ｌ−チロシンおよびその酸化産物が、メタノール（ｐＨ２．５）中０．１％ギ酸に対して生成される直線勾配を第２の移動相として使用して、流速２００μｌ／分で溶出される。分析物は、単位分離度で、フルスキャン生成物イオンＭＳ／ＭＳを用いて陽イオンモードでモニターされる。応答は、スプレー電圧設定５ＫＶおよびスプレー電流８０μＡにより最適にされる。加熱キャピラリー電圧は、１０Ｖに設定され、そして温度は３５０℃にされる。窒素が、シース、および補助ガスの両方として、それぞれ、流速７０任意単位および３０任意単位にて使用される。フルスキャン全イオンクロマトグラムから抽出された選択された生成物イオンのクロマトグラフィーピーク面積を、対応するイオン捕捉生成物イオンスペクトルに従って測定することによって、分析物の量が評価される。各分析物についてモニターされたイオンは、以下である：３−ニトロ［^１２Ｃ_６］チロシン（質量対電荷比（ｍ／ｚ）２２７、１８１、および２１０）、３−ニトロ［^１３Ｃ_６］チロシン（ｍ／ｚ ２３３、１８７、および２１６）、３−ニトロ［^１３Ｃ_９ ^１５Ｎ_１］チロシン（ｍ／ｚ ２３７、１９０、および２１９）、［^１２Ｃ_６］チロシン（ｍ／ｚ １８２、１３６および１６５）、［^１３Ｃ_９ ^１５Ｎ_１］チロシン（ｍ／ｚ １９２、１４５、および１７４）。チロシンおよびニトロチロシンは、使用されるＨＰＬＣの条件下でベースライン分離され、これにより、チロシンイソトポマーの検出のために０〜７分間にわたって、そして３−ニトロチロシンイソトポマーの検出のために７分から、分析するためのＬＣＱ Ｄｅｃａのプログラミングが可能になる。

遊離ニトロチロシンおよびジチロシンは、サンプルにおいて同様に測定されるが、組織または体液は、まず、低分子量カットオフフィルターを通され、そしてその低分子量成分が、ＬＣ／ＥＣＳ／ＭＳ／ＭＳによって分析される。身体サンプル中の遊離ジチロシン種および遊離ニトロチロシン種ならびにタンパク質結合ジチロシン種およびタンパク質結合チロシン種の値は、下記にように、タンパク質含量、または前駆体チロシンのようなアミノ酸に対して、正規化され得る。

（Ｂ．脂質酸化産物）
脂質酸化産物は、ＵＶ検出を用いるＨＰＬＣまたはオンライン質量分析法を用いるＨＰＬＣによって、測定され得る。他の分析法（ＧＣ／ＭＳ法および免疫細胞化学法を含む）もまた、使用され得る。Ｆ_２−イソプロスタンが、当該分野で公知である種々の質量分析法技術によって測定可能である。

ＭＰＯ生成脂質酸化産物である、ヒドロキシ−エイコサテトラエノン酸（ＨＥＴＥ）、ヒドロキシ−オクタデカジエノン酸（ＨＯＤＥ）、Ｆ_２−イソプロスタン；２−リソＰＣの５−オキソ吉草酸エステル（ＯＶ−ＰＣ）；５−コレステン−５α，６α−エポキシ−３β−オール（コレステロールαエポキシド）；５−コレステン−５β，６β−エポキシ−３β−オール（コレステロールβエポキシド）；５−コレステン−３β，７β−ジオール（７−ＯＨ−コレステロール）；５−コレステン−３β，２５−ジオール（２５−ＯＨコレステロール５−コレステン−３β−オール−７β−ヒドロペルオキシド（７−ＯＯＨコレステロール）；およびコレスタン−３β，５α，６β−トリオール（トリオール）を抽出および定量する方法は、Ｓｃｈｍｉｔｔら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３８，１６９０４−１６９１５（これは、参考として本明細書中に特に援用される）に記載される。９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥ、９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥおよびＦ_２−イソプロスタンの測定のために、反応混合物中のヒドロペルオキシドが、改変Ｄｏｌｅ手順を使用する抽出の間に、対応するその水酸化物に還元される。この改変Ｄｏｌｅ手順において、還元剤であるトリフェニルホスフィンが存在する（Ｓａｖｅｎｋｏｖａ，Ｍ．Ｌ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２０３９４−２０４００）。これらの条件はまた、イソプロスタンおよび酸化脂質の人工的形成を阻害する。脂質は、Ｎ_２下で乾燥され、イソプロパノール（２ｍｌ）中に再懸濁され、その後、Ｎ_２下で室温にて９０分間、１Ｎ水酸化ナトリウム（２ｍｌ）を用いる塩基加水分解によって脂肪酸が遊離される。そのサンプルは、２Ｎ ＨＣｌを用いて酸性化（ｐＨ３．０）され、既知量の内部標準が添加され、そしてヘキサン（５ｍｌ）を用いて遊離脂肪酸が２回抽出される。その後、９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥ、９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥおよびＦ_２−イソプロスタンの含量が、下記に概略されるようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって測定される。

１−パルミトイル−２オキソバレリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰｏｘｖＰＣ）が、上記のような９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥ分析、９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥ分析およびＦ_２−イソプロスタン分析のために使用されるのと同じ改変Ｄｏｌｅ手順（しかし、還元剤であるトリフェニルホスフィンの添加は省く）によって、抽出される。脂質は、Ｎ_２下で乾燥され、メタノール中に再懸濁され、そして下記に概略されるような後のＬＣ／ＭＳ分析まで、−７０℃にてアルゴン下で保存される。ステロール酸化産物が、４Ｍ ＮａＣｌ（１５０μｌ）およびアセトニトリル（５００μｌ）を添加することによって抽出される。サンプルは、ボルテックスされ、遠心分離され、そして上部有機相が取り出される。抽出物は、Ｎ_２下で乾燥され、メタノール中に再懸濁され、そしてオンライン質量分析を用いるＨＰＬＣによる分析まで、−７０℃にてアルゴン下で保存される。

質量分析は、ＨＰ １１００ ＨＰＬＣをインターフェースしたＱｕａｔｒｏ ＩＩ三連四重極質量分析計にて実施される。Ｍａｌｌａｔ（Ｍａｌｌａｔ，Ｚ．ら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３，４２１−４２７）により記載されるように、８−エピ−［^２Ｈ_４］ＰＧＦ_２αを標準として用いるオンライン逆相ＨＰＬＣタンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を使用して、安定同位体希釈質量分析法によって、Ｆ_２−イソプロスタンが定量される。９−ＨＯＤＥ分析および９−ＨＥＴＥ分析のために、還元脂質の塩基加水分解後に生成される脂質抽出物（上記）は、Ｎ_２下で乾燥され、そしてメタノール中に再懸濁される。その後、その混合物のアリコートが、平衡化されたＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８カラム上に注入され、そしてメタノール：Ｈ_２Ｏ（８５：１５ ｖ／ｖ）を溶媒と使用するイソクラティック条件下で実行される。カラム溶出物が、分離され（ＵＶ検出器に９３０μｌ／分、そして質量検出器に７０μｌ／分）、そして質量分析計によって分析される。カラム溶出物における９−ＨＯＤＥ、９−ＨＥＴＥおよびＦ_２−イソプロスタンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析が、陰イオンモードにて、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）を用いてエレクトロスプレーイオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）を使用して実施され、この９−ＨＯＤＥについてのｍ／ｚ ２９５→１７１の遷移；９−ＨＥＴＥについてのｍ／ｚ ３１９→１５１の遷移；Ｆ_２−イソプロスタンについてのｍ／ｚ ３５３→３０９の遷移；および［^２Ｈ_４］ＰＧＦ_２αについてのｍ／ｚ ３５７→３１３の遷移をモニターする。

ＰＯｘｖＰＣの定量が、陽イオンモードでのオンラインＥＳＩ−ＭＳ分析ならびにそれぞれｍ／ｚ ７８２およびｍ／ｚ ５９４での選択されたイオンモニタリングを用いるＨＰＬＣを使用して、脂質抽出物に対して実施される。メタノール中に再構成された脂質抽出物のアリコート（上記）が、メタノール中の０．１％ギ酸（移動相Ｂ）と混合され、そして７０％移動相Ｂ，３０％移動相Ａ（水中の０．１％ギ酸）中に事前に平衡化されたＣｏｌｕｍｂｕｓ Ｃ１８カラム（１×２５０ｍｍ、５μｍ、Ｐ．Ｊ．Ｃｏｂｅｒｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上に流速３０μｌ／分でローディングされる。７０％移動相Ｂでの３分間の洗浄期間の後、そのカラムは、１００％移動相Ｂまでの直線勾配を用いて展開され、その後、１００％移動相Ｂを用いてイソクラティック溶出される。真正ＰＯｘｖＰＣを用いて構築した外部較正曲線が、定量のために使用される。７−ＯＨコレステロール、７−ケトコレステロール、および７−ＯＯＨコレステロールが、Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ ＯＤＳ Ｃ１８カラム上で分離される。溶出勾配は、９１：９のアセトニトリル：水＋０．１％ギ酸塩（ｖ：ｖ）からなった。カラムは、実行の間に、アセトニトリル＋０．１％ギ酸塩で洗浄される。カラム溶出物は、分離され（ＵＶ検出器に９００μｌ／分、そして質量検出器に１００μｌ／分）、そして選択されたイオンモニタリングを用いて陽イオンモードでの大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）によってイオン化される。７−ＯＨコレステロールの同定は、ｍ／ｚ ３８５．３を有するイオン（Ｍ−Ｈ_２Ｏ）^＋およびｍ／ｚ ３６７．３を有するイオン（Ｍ−２Ｈ_２Ｏ）^＋の同時移動を、真正標準物として同じ保持時間を用いて示すことによって、実施される。ｍ／ｚ ３６７．３でモニターされるピークについてのイオン電流の積分面積が、定量のために使用される。７−ＯＯＨコレステロールの同定は、ｍ／ｚ ４０１．３を有するイオン（Ｍ−Ｈ_２Ｏ）^＋、ｍ／ｚ ３８３．３を有するイオン（Ｍ−２Ｈ_２Ｏ）^＋およびｍ／ｚ ３６７．３を有するイオン（Ｍ−Ｈ_２Ｏ_２）^＋の同時移動を、真正標準物として同じ保持時間を用いて示すことによって、実施される。ｍ／ｚ ４０１．３でモニターされるピークについてのイオン電流の積分面積が、定量のために使用される。７−ケトコレステロールの同定は、ｍ／ｚ ４０１．３を有するイオン（Ｍ＋Ｈ）^＋およびｍ／ｚ ３８３．３を有するイオン（Ｍ−Ｈ_２Ｏ）^＋の同時移動を、真正標準物として同じ保持時間を用いて示すことによって、実施される。ｍ／ｚ ４０１．３でモニターされるピークについてのイオン電流の積分面積が、定量のために使用される。真正７−ＯＨコレステロール、７−ＯＯＨコレステロール、および７−ケトコレステロールを用いて構築された外部較正曲線が、標準物添加法により得られる結果と同一の結果を示す予備ＡＰＣＩ ＬＣ／ＭＳ実験の後に、定量のために使用される。２５−ＯＨコレステロールについての保持時間、５，６α−エポキシドについての保持時間、５，６β−エポキシドについての保持時間、およびトリオールについての保持時間が、真正標準物のＬＣ／ＭＳ分析によって測定される。

（予め決定された値）
試験被験体から得られた身体サンプル中の、ＭＰＯ量のレベル、ＭＰＯ活性のレベル、または選択した、ＭＰＯにより生成される酸化産物のレベルを、予め決定された値と比較し得る。この予め決定された値は、一般集団またはヒト被験体の選択した集団から得られる匹敵するサンプル中の、ＭＰＯ活性のレベル、ＭＰＯ量のレベル、または選択したＭＰＯにより生成される酸化産物のレベルに基づく。例えば、選択した集団は、明らかに健康な被験体から構成され得る。「明らかに健康な」とは、本明細書中で使用される場合、アテローム性動脈硬化症の存在を示す徴候または症状（例えば、狭心症）、急性有害心臓血管事象（例えば、心筋梗塞または発作）の病歴、診断画像方法（冠動脈造影が挙げられるがこれに限定されない）によるアテローム性動脈硬化症の徴候（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）のいずれも以前に有していない個体を意味する。明らかに健康な個体はまた、その他にも疾患の症状を示さない。言い換えると、このような個体は、医学の専門家によって試験された場合、健康でかつ疾患の症状がないものとして特徴付けられる。

予め決定された値は、試験被験体から得られる身体サンプル中の、ＭＰＯ活性のレベルまたはＭＰＯ量のレベルを特徴付けるために使用される値に関する。従って、ＭＰＯ活性のレベルが、白血球１個あたりまたは血液１ｍｌあたりのＭＰＯ活性の単位のような絶対値である場合、この予め決定された値はまた、一般集団またはヒト被験体の選択した集団内の個体における、白血球１個あたりまたは血液１ｍｌあたりのＭＰＯ活性の単位に基づく。同様に、ＭＰＯ活性またはＭＰＯ量のレベルが、サイトグラム（ｃｙｔｏｇｒａｍ）から得られる任意の単位のような代表値である場合、この予め決定された値はまた、この代表値に基づく。

この予め決定された値は、種々の形態を取り得る。予め決定された値は、単一のカットオフ値（例えば、中央値または平均値）であり得る。予め決定された値は、比較集団（例えば、１つの規定された集団内の危険性が、別の規定された集団内の危険性の２倍である）に基づいて設定され得る。予め決定された値は、例えば、一般集団が、集団（例えば、低い危険性の集団、中間の危険性の集団および高い危険性の集団）にかまたは象限（最も低い象限は、最も低い危険性を伴う個体であり、最も高い象限は、最も高い危険性を伴う個体である）に等しく（または、不等に）分けられる範囲であり得る。

予め決定された値は、一般集団内のＭＰＯ活性のレベルまたはＭＰＯ量のレベルを決定することによって導き出され得る。あるいは、予め決定された値は、選択した集団（例えば、明らかに健康な非喫煙者集団）内のＭＰＯ活性のレベルまたはＭＰＯ量のレベルを決定することによって導き出され得る。例えば、明らかに健康な非喫煙者集団は、喫煙者集団またはメンバーが以前に心臓血管障害を患った集団とは、ＭＰＯ活性またはＭＰＯ量の、異なる正常範囲を有し得る。従って、選択された予め決定された値は、個体が含まれるカテゴリーを考慮し得る。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者によって慣用的にすぎない実験を用いて選択され得る。

ＭＰＯ活性またはＭＰＯ量の予め決定された値（例えば、平均レベル、中間レベル、または「カットオフ」レベル）は、一般集団または選択した集団内の個体の多量のサンプルをアッセイすることによって、そして、Ｋｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．，およびＭｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ＷｉｌｌｉａｍおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｈａｒｕａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ（これは、特に、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、最適な特異度（最も高い真の負の割合）および感度（最も高い真の正の割合）を規定する、確実性基準または受信動作特性曲線を選択するための、統計学的モデル（例えば、推定値方法）を使用することによって、設定される。「カットオフ」値は、アッセイされる各危険予測因子（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）について決定され得る。以下の実施例１において使用される規格化方法は、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｗａｌｔｅｒｓｄｏｒｐｈ，Ａ．Ｎ．およびＲｏｓｅｎ，Ｈ．１９８４「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１０５：３９９〜４０３に記載されるようなグアヤコール酸化アッセイを使用する。

（試験被験体由来の身体サンプル中の、ＭＰＯ活性のレベル、ＭＰＯ量のレベルおよび選択したＭＰＯにより生成される酸化産物のレベルと、予め決定された値との比較）
各危険予測因子（例えば、個体の身体サンプル中の、ＭＰＯ活性、ＭＰＯ量および選択したＭＰＯにより生成される酸化産物）のレベルは、単一の予め決定された値または予め決定された値の範囲と比較され得る。試験被験体の身体サンプル中の提示される危険予測因子のレベルが、この予め決定された値または予め決定された値の範囲よりも高い場合、この試験被験体は、この予め決定された値または予め決定された値の範囲に匹敵するかまたはそれよりも低いレベルを有する個体よりも、ＣＶＤを発病するかまたはＣＶＤを有する危険性が高い。対照的に、試験被験体の身体サンプル中の、提示される危険予測因子のレベルが、この予め決定された値または予め決定された値の範囲よりも低い場合、この試験被験体は、この予め決定された値または予め決定された値の範囲に匹敵するかまたはそれよりも高いレベルを有する個体よりも、ＣＶＤを発病するかまたはＣＶＤを有する危険性が低い。例えば、この予め決定された値と比較して、高いレベルのＭＰＯ活性またはＭＰＯ量を伴う、より多数の好中球または単球またはそれら両方を有する試験被験体は、心臓血管疾患を発病する危険性が高く、そして、この予め決定された値と比較して、減少したレベルまたは低いレベルのＭＰＯ活性またはＭＰＯ量を伴う、より少数の好中球または単球またはそれら両方を有する試験被験体は、心臓血管疾患を発病する危険性が低い。試験被験体の危険予測因子レベルと予め決定された値との間の差異の程度はまた、危険性の程度を特徴付けるために有用であり、それによって、どの個体が、特定の積極的治療から最も大きい利益を得るか否かが決定される。これらの場合において、予め決定された値の範囲が複数の集団に分けられる（例えば、高い危険性、平均的な危険性、および低い危険性の個体に対する予め決定された値の範囲）場合、この比較は、どの集団が試験被験体の関連した危険予測因子のレベルを低下させるかを決定することを含む。

提示される診断試験は、ＣＶＤを予防する際に標的化される治療剤を、患者に処方すべきか否か、ならびに処方すべき場合および処方すべきでない場合を決定するために有用である。例えば、特定のカットオフ値より高いＭＰＯ活性の値（Ｕ／ｍｇ ＰＭＮタンパク質；またはＵ／ｍｌ 血液）を有する個体、または「正常範囲」のより高い三分位数もしくは四分位数内にある個体は、脂質低下剤、生活様式の変化などを用いたより積極的介入の必要性のある個体として同定され得る。

ＣＶＤに対する危険予測因子としての、ＭＰＯの増加の最も魅力的な知見の１つは、それが、心臓血管疾患に対する危険性の増加した個体を同定するための、非依存的なマーカーを表わすことである。これは、多変量解析 対 ＣＶＤに対する他の公知の危険因子（例えば、脂質レベル（例えば、ＬＤＬ、ＨＤＬ、全コレステロール、トリグリセリド）、および家族の病歴、喫煙、高血圧症、糖尿病）において、非依存的にＣＶＤとの関連性が予測される、高いレベルのＭＰＯ活性およびＭＰＯ量である。従って、提示される診断試験は、既存のスクリーニングプロトコル／スクリーニング方法によって他に同定されなかった、危険性の増加した個体を同定するために、特に有用である。さらに、提示される危険予測因子は、現在使用される危険予測因子（例えば、血中ＬＤＬレベル、血中トリグリセリドレベルおよび血中Ｃ反応性タンパク質レベル）と、それに基づくアルゴリズムとを組み合わせて使用されて、ＣＶＤを発病するかまたはＣＶＤを有する個体の危険性が、より正確に特徴付けられ得る。

（ＣＶＤ治療剤の評価）
提示される診断試験はまた、ＣＶＤを有するかまたはＣＶＤを発病する危険性を有する患者として診断された患者に対するＣＶＤ治療剤の効果を評価するために有用である。このような治療剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗炎症剤、インスリン感作剤、抗高血圧剤、抗血栓剤、抗血小板剤、線維素溶解性剤、脂質低下剤、直接型トロンビンインヒビター、ＡＣＡＴインヒビター、ＣＤＴＰインヒビターチオグリチゾン、およびグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターインヒビター。このような評価は、治療剤を投与する前に被験体から得られる身体サンプル、および治療剤を投与した後に被験体から得られる、対応する体液中の、１つ以上の提示される危険予測因子（ＭＰＯ活性、ＭＰＯ量、選択したＭＰＯにより生成される酸化産物、およびそれらの組み合わせを含む）のレベルを決定することを含む。治療剤を投与する前に得られるサンプルにおける選択された危険因子のレベルと比較して、治療剤を投与した後に得られるサンプルにおける選択された危険因子のレベルの低下は、処置される被験体における心臓血管疾患に対するこの治療剤のポジティブな効果を示している。

（実施例）
以下の実施例は、例示の目的のみであり、添付の特許請求の範囲を制限することを意図しない。

（実施例１：冠動脈疾患を有する患者および有さない患者の血液サンプル中のＭＰＯ活性およびＭＰＯ量のレベル）
（方法）
研究集団：ロジスティック回帰検出力演算（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｐｏｗｅｒ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ）（等サイズ群を仮定する）に基づいて、高ＭＰＯ（上方の四分位数）について少なくとも２．０の統計学的に有意な確率比を検出するために８０％検出力（α＝０．０５）を提供するのに、３２６人の患者が必要とされた。被験体（ｎ＝３３３）をＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ内での２つの実施基準から同定した。まず、８５人の一通りの連続した患者を、Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎｉｃから登録した。同時に、１２５人の連続した患者を、カテーテル処置実験所（ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から登録した。この一続きのＣＡＤ罹患率に基づいて、１１６人のさらなるコントロール被験体の必要性が決定された。その前の６ヶ月にわたるカテーテル処置の際に有意なＣＡＤを有さない全ての患者をカテーテル処置データベースから同定し、次いで１４０を、無作為に（郵便番号／電話番号に基づいて）選択し、ＭＰＯ測定に参加するよう要請した。ＣＡＤを、書類に示された心筋梗塞、先の冠動脈血管再生介入（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ（ＣＡＢＧまたは経皮冠動脈介入（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ））の履歴によって、または心臓カテーテル処置の間に同定された１つ以上の冠動脈における５０％以上の狭窄の存在として定義した。ＣＡＤ群の排除基準は、登録前３ヶ月内の急性冠動脈事象、末期腎疾患、および骨髄移植であった。コントロール群は、有意なＣＡＤの形跡を示さなかった、診断冠動脈造影を受けた被験体からなった。コントロール被験体の排除基準は、５０％以上の狭窄を有する１つ以上の冠血管、心臓弁疾患、左心室機能不全、末期腎疾患、骨髄移植、または履歴および検査によって示されるような感染症または活動性の炎症性疾患の形跡であった。全ての患者は、４５歳以上であり、無熱であった。臨床履歴は、真性糖尿病、過去および現在の喫煙歴、高血圧、および第一親等がＣＡＤ（男性は５０歳まで、および女性は６０歳まで）を有するか否かについて評価した。研究プロトコルおよび承諾形式は、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって認可され、そして十分な認識に基づいた、かつ書面による承諾を全ての被験体から得た。サンプルは記号化して、匿名であることを確実にし、そして全ての分析を盲験式に実施した。

測定：血液を一晩の断食後にＥＤＴＡ含有チューブ中に採取し、ＷＢＣ、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）、高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬｃ）、総コレステロール（ＴＣ）、および空腹時（ｆａｓｔｉｎｇ）トリグリセリド（ＴＧ）を定量するために使用した。好中球浮遊密度遠心分離によって好中球を単離した（Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８６１−１８６７）。細胞調製物は、視覚検査によって少なくとも９８％均質であった。白血球調製物を、細胞溶解のために０．２％セチルトリメチルアンモニウムブロミドに添加し、室温で１０分間インキュベートし、液体窒素中で急速冷凍し、そして分析まで−８０℃で保存した。

機能的ＭＰＯを好中球溶解物のペルオキシダーゼ活性アッセイによって定量した。簡単に言えば、界面活性剤溶解細胞（１０^４／ｍｌ；三連サンプル）を、１４．４ｍＭ グアヤコール、０．３４ｍＭ Ｈ_２Ｏ_２、および２００μＭ ＤＴＰＡを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）に添加し、そしてグアヤコール酸化産物の形成を、２５℃でのＡ_４７０でモニターした（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０５：３９９−４０３，Ｃａｐｅｉｌｌｅｒｅ−Ｂｌａｎｄｉｎ，Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６ （Ｐｔ２）：３９５−４０４）。ジグアヤコール酸化産物についての２６．６ｍＭ^−１ｃｍ^−１のミリモル濃度吸光係数を用いて、ペルオキシダーゼ活性を計算した。ここでＭＰＯ活性の一単位は、２５℃で１分あたり１μｍｏｌのＨ_２Ｏ_２を消費する量として定義される。報告されたＭＰＯ活性は、好中球タンパク質１ｍｇ当たり（白血球−ＭＰＯ）または血液１ｍｌ当たり（血液−ＭＰＯ）のいずれかで正規化した。血液−ＭＰＯ（血液１ｍｌ当たりＭＰＯ単位）を好中球当たりのＭＰＯ活性の単位数×絶対好中球数（血液１μｌ当たり）×１０００によって概算した。タンパク質濃度は、記載のように決定した（Ｍａｒｋｗｅｌｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７：２０６−２１０）。

個体中の白血球−ＭＰＯのレベルは、極めて再現性であることが見出された。これは、経時的に被験体における±７％未満の変動を示した（ｎ＝６の男性を２年を超える期間の間１〜３ヶ月に一度評価した）。白血球−ＭＰＯの決定についての分散係数（サンプルの分析を複数回連続して行うことにより決定される）は、４．２％であった。３日、別々の日に実施した１０のサンプルについての血液−ＭＰＯ決定は、４．６％の分散係数を生じた。血液−ＭＰＯの決定についての分散係数（サンプルの分析を複数回連続して行うことにより決定される）は、４．２％であった。３日、別々の日に実施した１０のサンプルについての白血球−ＭＰＯ決定は、４．８％の分散係数を生じた。好中球当たりのＭＰＯ量を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定した。捕捉プレートを、９６ウェルプレートをヒトＭＰＯの重鎖に対して惹起されたポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と一晩インキュベート（１０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中）することにより作製した。プレートを洗浄し、そしてサンドイッチＥＬＩＳＡをヒトＭＰＯに対するアルカリホスファターゼ標識抗体を用いて白血球溶解物に対して実施した。ＭＰＯ量を、記載のように白血球から精製した既知量のヒトＭＰＯで作成した標準曲線に基づいて計算した（Ｈａｚｅｎ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１８６１−１８６７）。単離されたＭＰＯの純度を、ＲＺが０．８７（Ａ_４３０／Ａ_２８０）であること、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析、およびゲル中テトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ染色を示すことにより確立した（Ｐｏｄｒｅｚ，Ｅ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １０３：１５４７−１５６０）。酵素濃度を８９，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１／ヘムの吸光係数を利用して分光光度的に決定した。

統計学的解析：提示特性は、連続測定値について平均±標準偏差またはメジアン（四分位数間領域）のいずれか、およびカテゴリー測定値（ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｓ）について数およびパーセントとして示される。ＣＡＤ被験体とコントロール被験体との間の差異をＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和またはχ二乗検定を用いて評価した。ＭＰＯレベルを分析のために四分位数に分割した。なぜなら、白血球−ＭＰＯ活性も血液−ＭＰＯ活性もＧａｕｓｓｉａｎ分布に従わないからである。ＭＰＯ活性の増加に伴うＣＡＤ率の増加について調整されないトレンド（ｔｒｅｎｄ）を、Ｃｏｃｈｒａｎ−Ａｒｍｉｔａｇｅトレンド検定で評価した。改変されたＦｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｉｓｋスコアを、カテーテル処置の時点において記録した血圧よりむしろ文書に記録された高血圧の履歴を用いて決定した（Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｊ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０１：１２４３−１２４８）。

ロジスティック回帰モデル（ＳＡＳ Ｓｙｓｔｅｍ，ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ ＮＣ）を、ＭＰＯ活性の２番目および３番目の四分位数の組み合わせと関連した相対的危険値を概算する確率比（ＯＲ）を計算するために開発し、そしてＭＰＯ活性の最も高い四分位数を最も低い四分位数と比較した。調整は、個々の伝統的なＣＡＤ危険因子（年齢、性、糖尿病、高血圧、喫煙（以前または現在）、家族歴、ＴＣ、ＬＤＬｃ、ＨＤＬｃ、ＴＧ、ＷＢＣ）について行った。Ｈｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ適合度検定を用いて、適当なモデル適合を評価した。連続変動間の関連を、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位−相関係数を用いて評価した。カテゴリー変動間の関連を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を用いて評価した。

（結果）
患者個体群統計学：本研究に参加した被験体の臨床特性および生化学的特性を表１に示す。ＣＡＤを有する被験体は、より年長であり、どちらかといえば男性であり、そしてどちらかといえば糖尿病、高血圧、および喫煙の履歴を有する傾向がある。ＣＡＤ被験体はまた、増加した空腹時トリグリセリドレベル、脂質低下投薬（主としてスタチン）、アスピリンおよび他の心血管投薬の使用の増加を示した。他の研究と一致して、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｉｓｋ Ｓｃｏｒｅ、絶対好中球数、およびＷＢＣは、ＣＡＤを有する被験体において有意に増加した（それぞれに対してｐ＜０．００１；表１）。

白血球−ＭＰＯ、血液−ＭＰＯおよび白血球数対冠動脈疾患の罹患率の層化：より高いレベルのＭＰＯを有する個体がより高いＣＡＤの罹患率を有するという仮説を検定するために、本発明者らは、好中球を単離し、それらのＭＰＯ含有量を測定した。好中球タンパク質１ｍｇ当たりのＭＰＯ活性（白血球−ＭＰＯ）は、ＣＡＤ状態によって有意に異なった。ＣＡＤ患者については１８．１Ｕ／ｍｇであるのに対してコントロール被験体については１３．４Ｕ／ｍｇのメジアンであった（ｐ＜０．００１（トレンドについて、および差異について；図１）。コーホート全体についての四分位数による白血球−ＭＰＯレベルの層化は、ＣＡＤ状態と正の相関を示した（ｐ＜０．００１（トレンドについて））。最も高い四分位数における個体が、最も高い危険を有する（ＯＲ（ＣＩ）、８．８（４．４−１７．５）；表２）。その触媒活性により白血球ＭＰＯ含有量を定量すること（すなわち、機能的アッセイ）に加えて、本発明者らは、独立して、酵素結合免疫吸着アッセイを用いて被験体の無作為なサブセット（ｎ＝１１１）における好中球当たりのＭＰＯ量を定量した。このアッセイから観察された結果は、活性測定値（データは示さず）と有意に相関した（ｒ＝０．９５）。白血球−ＭＰＯの二番目および三番目の四分位数におけるＣＡＤ率が匹敵するようであるので（表２）、それらを全てのさらなる解析のために合わせた。そしてこれを、単変量モデルおよび多変量モデルにおける中央範囲レベルと称する。他の研究において見られたように、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｉｓｋ ＳｃｏｒｅおよびＷＢＣは、同様に、ＣＡＤ率と正の相関を示した（表２）。

（表２）
ミエロペルオキシダーゼレベル、白血球数およびフラミンガム総体危険度スコア（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｇｌｏｂａｌ Ｒｉｓｋ Ｓｃｏｒｅ）に従う冠動脈疾患有病率の確率比
１．
２）四分位数

血中のＭＰＯの総含有量は、白血球あたりのＭＰＯレベルおよび白血球の総数の両方に依存する。好中球は、血中の＞９５％のＭＰＯ含量を有するので、本発明者らは、好中球あたりのＭＰＯ含量を、好中球の絶対数と掛けることにより、血液１ｍｌあたりのＭＰＯレベル（血液−ＭＰＯ）を見積もった。ＣＡＤの比率は、血液−ＭＰＯ四分位数（ｑｕａｒｔｉｌｅ）と正に相関していた（トレンド（ｔｒｅｎｄ）についてｐ＜０．００１；図９、表２）。

（白血球−ＭＰＯは、伝統的な冠動脈危険因子と有意に相関しない）：
伝統的ＣＡＤ危険因子と白血球−ＭＰＯとの間の可能な相関を、次に評価した。白血球−ＭＰＯレベルは、年齢、性別、糖尿病、高血圧、喫煙（過去または現在）、ＷＢＣ、トリグリセリドＬＤＬｃおよびフラミンガム総体危険度には依存していなかった。白血球−ＭＰＯと、総コレステロール（ｒ＝−０．１５、ｐ＝０．００５）およびＨＤＬｃ（ｒ＝−０．１４、ｐ−０．０１）の両方との間の弱い負の相関が観察された。白血球−ＭＰＯと好中球絶対数（ｒ＝０．２０、ｐ＜０．００１）とＣＡＤの家族歴（メジアン白血球−ＭＰＯ＝１５．９（家族歴有りの場合）対１４．１（家族歴なしの場合）ｐ＝０．０５）との間に正の関係が見られた。同様の相関が血液−ＭＰＯについて示された。

（白血球−ＭＰＯおよび血液−ＭＰＯは、単一および複数の危険因子の調整後の冠動脈疾患状態と強く相関する）：白血球−ＭＰＯおよび血液−ＭＰＯは、独立してＣＡＤ状態と関連するか否かを評価するために、白血球−ＭＰＯおよび血液−ＭＰＯの四分位数についての確率比を、個々の伝統的なＣＡＤ危険因子について調整した。最も低い（第１の）、白血球−ＭＰＯおよび血液−ＭＰＯの両方の四分位数に対する、中間（第２および第３）および最も高い（第４）四分位数の両方についての確率比は、個々の伝統的ＣＡＤ危険因子、ＷＢＣおよびフラミンガム総体危険度スコアの調整後のＣＡＤ状態と高度に相関したままであり（データは示されていない）、確率比は、ＨＤＬｃについての調整後の８．４（ＣＩ＝４．２−１６．９、ｐ＜０．００１）から、喫煙についての調整後の１３．５（ＣＩ＝６．３−２９．１、ｐ＜０．００１）までの範囲にわたった。糖尿病、高血圧、喫煙、ならびに（より低い程度で）年齢、ＨＤＬｃ、フラミンガム総体危険度およびＷＢＣはまた、単一の因子の調整後のＣＡＤ状態についての有意な予測因子のままであった。同様の結果が、個々の伝統的ＣＡＤ危険因子についての単一因子調整後の血液−ＭＰＯについて観察された（データは示されていない）。

次いで、多変量回帰分析を、いくつかのモデルを使用して行った（表２、図１０）。モデル１は、以前の工程（すなわち、単変量回帰）においてＣＡＤと有意に相関していた単一危険因子の各々に対する同時調整後の白血球−ＭＰＯおよび血液ＭＰＯを調べた。白血球−ＭＰＯは、ＣＡＤ状態の強力な予測因子のままであり、８．５（ＣＩ＝３．７−１９．７、中間四分位数 対 低四分位数）および２０．３（ＣＩ＝７．９−５２．１、高四分位数 対 低四分位数）の調整されたＯＲであった。ＷＢＣ（ＣＡＤについての増大された危険度を予測するマーカー）に対する調整された確率比（２；３；２３−２５）は、１．１（ＣＩ＝１．０２−１．２１）であった。フラミンガム総体危険度スコアおよびＷＢＣを調整する第２の回帰モデルにより、白血球−ＭＰＯについてのＯＲが得られ、これは、モデル１において観察された大きなＯＲと一致していた（中間ＯＲ 対 低ＯＲ＝４．２；高ＯＲ 対 低ＯＲ＝１１．９）。フラミンガム総体危険度スコアおよびＷＢＣについて調整されたＯＲはまた有意であった。血液−ＭＰＯも同様に、伝統的ＣＡＤ危険因子、フラミンガム総体危険度スコアおよびＷＢＣと比較して、多変量調整後のＣＡＤ状態の強力な予測因子のままであった（表２）。

（実施例２：ＣＡＤを有する被験体およびＣＡＤを有していない被験体由来の血液サンプルのフローサイトメトリー分析）
白血球が正常レベルより高いかまたは低いＭＰＯを有する患者由来の血液サンプルを、フローサイトメトリーにより分析した。各患者からの全血を、血液分析機（Ｂａｙｅｒ製Ａｄｖｉａ １２０）に注入した。この分析機は、インサイチュ細胞化学的ペルオキシダーゼ染色に基づいて白血球を同定する。この機器において、全血は、最初に溶解され、インタクトなＷＢＣがホルムアルデヒドを用いて加熱／固定される。次いで、ペルオキシダーゼ基質（過酸化水素および発色団）を、白血球と共にインキュベートし、そして得られた染色された細胞をフローサイトメトリーにより調べる（サンプルの注入からサイトグラム（ｃｙｔｏｇｒａｍ）が得られるまでの間に全部で２０秒間）。その結果を図１１に示す。異なる色で示された細胞のクラスターは、以下を指す：１）紫色−好中球；２）緑色−単球；３）暗青色−リンパ球；４）黄色−好酸球；５）青緑色−染色されない大細胞；６）白色−ＲＢＣ ゴースト／ノイズ。これらのデータに基づいて、総白血球数（ＷＢＣ）および差（好中球、単球、好酸球およびリンパ球の％分布）を示す。

サイトグラム上の所定の細胞クラスター位置の配置は、その光吸収強度（Ｙ軸−ペルオキシダーゼ活性に関連する特性、従って、染色の強度）および光散乱（Ｘ軸−サイズおよび顆粒性／屈折率の両方に関連する特性、ペルオキシダーゼ活性および染色と関連した特性）に関連する。

左のパネルは、好中球あたりのＭＰＯレベル（好中球−ＭＰＯともいう）が集団における平均より低い（例えば、下の方の２５％）個体由来のサイトグラムを図示する。右のパネルは、好中球あたりのＭＰＯレベルが、集団における平均より高い（例えば、５０〜７５％）個体由来のサイトグラムの位置を図示する。Ｘ軸およびＹ軸上の好中球クラスターの位置は異なり、そして概して、ＭＰＯが高いほど右にシフトすることに留意のこと。また、好中球クラスターを含む楕円の長軸の傾きは異なる。これらの変化は、その細胞型中のＭＰＯの含量に関連する情報を含んでいる。

モデリングおよび既知のペルオキシダーゼ含量を有する標準の使用により、本発明者らは、この情報を使用して白血球あたりのペルオキシダーゼの相対レベルを同定するために、標準曲線を開発することができる。同じ種類の分析は、単球（ＭＰＯを含む血液中の別の主要な細胞型）に対しても可能である。好酸球におけるペルオキシダーゼ染色は、好酸球ペルオキシダーゼ（ＭＰＯに関連する酵素）に起因するが、異なる遺伝子産物には起因しない。

（実施例３：ＣＡＤを有するヒト被験体およびＣＡＤを有していないヒト被験体由来の血液中のジチロシンレベル）
タンパク質結合ジチロシンのレベルを、ＣＡＤを有する１１２人の個体および１２８人の明らかに健康なコントロール被験体由来の血液サンプルにおいて測定した。これらのレベルを、オンライン蛍光検出を備えたＨＰＬＣにより測定し、そして合成ジチロシンを用いて生成した外部較正曲線を使用して定量した。結果を、オンラインダイオードアレイ検出を備えたＨＰＬＣにより同時に定量された前駆体アミノ酸（チロシン）の含量に対して正規化した。これらの結果は、ＣＡＤを有する被験体が、年齢および性別の同じ健常被験体由来の血清中で観察されるレベルよりも、高レベル（５０％の増加、ＣＡＤ対健常被験体の比較についてＰ＜０．００１）のジチロシンを血清中に有することを実証した。

（実施例４：ＣＡＤを有するヒト被験体およびＣＡＤを有していないヒト被験体由来の血液中のニトロチロシンレベル）
タンパク質結合３−ニトロチロシンのレベルを、実施例３と同じ被験体（ＣＡＤを有する１１２人の個体および明らかに健康な１２８人のコントロール被験体を試験した）由来の血液サンプルにおいて測定した。ニトロチロシンレベルを、安定同位体希釈技術を使用してオンラインエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）を用いるＨＰＬＣにより測定した。結果を、前駆体アミノ酸（チロシン）の含量に対して正規化した（チロシンの含量は、安定同位体希釈ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）により同時に定量した。これらの結果は、ＣＡＤを有する被験体が、年齢および性別の一致する健常被験体よりも、高いレベルの血清中ニトロチロシン（２．８倍増加、ＣＡＤ対健常被験体の比較に関してＰ＜０．００１）を有することを実証した。

（実施例５：ＣＡＤを有するヒト被験体およびＣＡＤを有していないヒト被験体におけるＨＥＴＥ、ＨＯＤＥ、およびＦ２イソプロスタン（Ｉｓｏｐｒｏｓｔａｎｅ）の血液レベル）
ＨＥＴＥ、ＨＯＤＥ、およびＦ２イソプロスタンのレベルを、実施例３の被験体と同じ被験体由来の血液サンプルで測定した。ＣＡＤを有する１１２人の個体および明らかに健康な１２８人のコントロール被験体を調べた。脂質を、オンラインエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）を用いるＨＰＬＣにより測定した。結果を、前駆体脂質（ＨＥＴＥおよびＦ２イソプロスタンについてはアラキドン酸、ならびにＨＯＤＥについてはリノール酸）の含量に対して正規化した。この前駆体脂質の含量を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにより同時に定量した。これらの結果は、ＣＡＤを有する被験体が、年齢および性別の一致する健康な被験体よりも、高レベルな血漿中の各酸化産物を有していることを実証した。Ｆ２イソプロスタンレベルは、ＣＡＤを有していない被験体に対してＣＡＤを有している被験体から得られた血漿において８０％高かった（Ｐ＜０．００１）；ＨＥＴＥおよびＨＯＤＥのレベルは、ＣＡＤを有していない被験体に対してＣＡＤを有する被験体において６０％高かった（Ｐ＜０．００１）。

（実施例６：ＣＡＤを有するヒト被験体およびＣＡＤを有していないヒト被験体におけるＭＰＯ産生脂質酸化産物の血液レベル）
ＭＰＯにより生成されることが示された以下のリン脂質酸化産物のレベルを、ＣＡＤを有する２５人の被験体および明らかに健康な１２人のコントロール被験体由来の血液サンプルにおいて測定した：Ｇ−ＰＣおよびＮＤ−ＰＣ（２−ｌｙｓｏＰＣの、グルタル酸モノエステルおよびノナン二酸モノエステル）；ＨＤｄｉＡ−ＰＣおよびＨＯｄｉＡ−ＰＣ（２−ｌｙｓｏＰＣの、９−ヒドロキシ−１０−ドデセン二酸エステルおよび５−ヒドロキシ−８−オキソ−６−オクテン二酸エステル）；ＨＯＤＡ−ＰＣおよびＨＯＯＡ−ＰＣ（２−ｌｙｓｏＰＣの、９−ヒドロキシ−１２−オキソ−１０−ドデセン酸エステルおよび５−ヒドロキシ−８−オキソ−６−オクテン酸エステル）；ＫＯＤＡ−ＰＣおよびＫＯＯＡ−ＰＣ（２−ｌｙｓｏＰＣの、９−ケト−１２−オキソ−１０−ドデセン酸エステルおよび５−ケト−８−オキソ−６−オクテン酸エステル）；ＫＤｄｉＡ−ＰＣおよびＫＯｄｉＡ−ＰＣ（２−ｌｙｓｏＰＣの、９−ケト−１０−ドデセン二酸エステルおよび５−ケト−６−オクテン二酸エステル）；ＯＶ−ＰＣおよびＯＮ−ＰＣ（２−ｌｙｓｏＰＣの、５−オキソ吉草酸エステルおよび９−オキソノナン酸エステル）。さらに、コレステロールα−エポキシド（５−コレステン−５α，６αエポキシ−３β−オール）；コレステロールβ−エポキシド（５−コレステン−５β，６β−エポキシ−３β−オール）；７−ＯＨコレステロール（５−コレステン−３β，７β−ジオール）；２５−ＯＨコレステロール（５−コレステン−３β，２５−ジオール）；７−ＯＯＨコレステロール（５−コレステン−３β−オール−７β−ヒドロペルオキシド）；トリオール（コレスタン−３β，５α，６β−トリオール）のレベルを、ＣＡＤを有する２５人の被験体および明らかに健康な１２人のコントロール被験体由来の血液サンプルにおいて測定した。脂質を、確立された方法を使用してオンラインエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ）を用いるＨＰＬＣにより測定した。結果を、前駆体脂質（ＰＡＰＣ（１−ヘキサデカノイル−２−エイコサテトラ−５’，８’，１１’，１４’−エノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＰＬＰＣ（１−ヘキサデカノイル−２−オクタデカジ−９’，１２’−エノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；またはコレステロール）の含量に対して正規化した。これらの前駆体脂質の含量は、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳにより同時に定量された。この結果は、ＣＡＤを有する被験体が、年齢および性別の一致する健康な被験体よりも高いレベルの（脂質に依存して、５０％〜４倍）血漿中の各リン脂質酸化産物を有することを実証した。

図１は、ミエロペルオキシダーゼについての動力学的モデルを示す。 図２は、特定のミエロペルオキシダーゼ生成反応性中間体およびいくつかのＭＰＯ生成酸化生成物の概略図を示す。 図３は、ジチロシンおよびニトロチロシンの化学構造を示す。 図４は、健康な被験体およびＭＰＯ欠損被験体由来の好中球を有する血漿における脂質過酸化を示す。正常な個体およびＭＰＯ欠損個体から単離された好中球（１×１０^６／ｍｌ）を、ＤＴＰＡ（１００μＭ、ｐＨ７．０）および新鮮なヒト血漿（５０％ｖ／ｖ）を補充したＨＢＳＳ中で、３７℃でインキュベートした。細胞を、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ、２００ｎＭ）の添加によって活性化し、そして２時間インキュベートした（完全系）。次いで、内因性血漿脂質内に形成される９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥおよび９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥの含有量を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによって決定した。示される場合、ヒトＭＰＯ（３０ｎＭ）を、反応混合物に添加した。データは、３連の測定の平均±ＳＤを表す。所与の条件についてのクラスター内のそれぞれのバーは、異なるドナー由来の好中球調製物を用いて行った独立した実験から得られた結果を表す。ＰＭＮ（ＭＰＯ＋）、正常な被験体から単離された好中球；ＰＭＮ（ＭＰＯ−）、ＭＰＯ欠損被験体から単離された好中球。 図５は、内因性血漿脂質の脂質過酸化の好中球依存性の開始の特徴を示す。正常な被験体（ＰＭＮ）から単離された好中球（１×１０^６／ｍｌ）を、ＤＴＰＡ（１００μＭ、ｐＨ７．０）および新鮮なヒト血漿（５０％ｖ／ｖ）を補充したＨＢＳＳ中で、３７℃でインキュベートした。細胞を、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ、２００ｎＭ）の添加によって活性化し、次いで２時間インキュベートした（完全系）。次いで、内因性血漿脂質内に形成される９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥおよび９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥの含有量を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによって決定した。完全系に対する付加また削除は、示されるとおりであった。完全系への添加の最終濃度は、３０ｎＭ ヒトＭＰＯ、１ｍＭ ＮａＮ_３、３００ｎＭ カタラーゼ（Ｃａｔ）、３００ｎＭ 熱不活化カタラーゼ（ｈｉＣａｔ）、１００μＭ メチオニン（Ｍｅｔ）、１００μＭ アスコルベートおよび１０μｇ／ｍｌ スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）であった。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。 図６は、内因性血漿脂質の脂質過酸化のＭＰＯ依存性の開始の特徴を示す。新鮮なヒト血漿（５０％、ｖ／ｖ）を、ＤＴＰＡ（１００μＭ、ｐＨ７．０）およびＨ_２Ｏ_２生成系（グルコース／グルコースオキシダーゼ（Ｇ／ＧＯ）から構成される）を補充したＨＢＳＳ中で、１２時間、３７℃で、単離されたヒトＭＰＯ（３０ｎＭ）とともにインキュベートした（完全系）。この条件下で、Ｈ_２Ｏ_２の連続フラックスを、１０μＭ／時間で形成する。次いで、内因性血漿脂質内に形成される９−Ｈ（Ｐ）ＯＤＥおよび９−Ｈ（Ｐ）ＥＴＥの含有量を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによって決定した。完全系に対する付加また削除は、示されるとおりであった。完全系への添加の最終濃度は、１ｍＭ ＮａＮ_３、３００ｎＭ カタラーゼ（Ｃａｔ）、３００ｎＭ 熱不活化カタラーゼ（ｈｉＣａｔ）、２００ｎＭ ＳＯＤ、１００μＭ メチオニン（Ｍｅｔ）、および１００μＭ アスコルベートであった。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。 図７は、ＬＤＬのＭＰＯ酸化によって生成された、酸化ホスファチジルコリン種が、アテローム性動脈硬化損傷において濃縮されることを示す。示される酸化ＰＣ種の含有量を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳを使用して、ネイティブなＬＤＬおよびＭＰＯ−Ｈ_２Ｏ_２−ＮＯ_２系によって酸化されたＬＤＬ（ＮＯ_２−ＬＤＬ）において決定した。データは、２回行われた代表的な実験の３連の測定の平均±Ｓ．Ｄ．を表す。ＬＤＬ調製物およびＮＯ_２−ＬＤＬ調製物中のＰＡＰＣの含有量は、それぞれ、０．１２２±０．０７μｍｏｌ／ｍｇのアポタンパク質および０．００８±０．００１μｍｏｌ／ｍｇのアポタンパク質であった。ＬＤＬ調製物およびＮＯ_２−ＬＤＬ調製物中のＰＬＰＣの含有量は、それぞれ、０．８８±０．０５μｍｏｌ／ｍｇのアポタンパク質および０．３５±０．０５μｍｏｌ／ｍｇのアポタンパク質であった。Ｗａｔａｎａｂｅ Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｒａｂｂｉｔ由来の胸大動脈を単離し、１００μＭ ＢＨＴおよび１００μＭ ＤＴＰＡを補充したアルゴン散布（ｓｐａｒｇｅｄ）ＰＢＳ中でリンスし、同じ緩衝液中に浸し、アルゴンでカバーし、液体窒素中でフラッシュ凍結し、次いで、分析まで−８０℃で保存した。脂質損傷を比較的含まない動脈を、１０〜１２週齢のＷＨＨＬウサギから得た一方で、コンフルエントな損傷を有する動脈を、６か月齢より上のＷＨＨＬウサギから回収した。個々の凍結動脈を、液体窒素下でステンレス鋼乳鉢および乳棒を用いて粉砕し、この粉末を、ＰＴＦＥを裏打ちされたキャップを備えるガラスネジキャップ付き試験管に移し、次いで、ＢＨＴの存在下で、アルゴン下で、ＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒの方法によって、脂質を抽出した。３つの動脈を、各群において分析した。次いで、脂質の定量化を、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳによって実行した。データを、平均±Ｓ．Ｄ．として表す。 図８は、ヒト患者のアテローム性動脈硬化プラーク物質および心臓移植ドナーの正常動脈内膜中の選択ＭＰＯ−ｇ生成酸化脂質の含有量を示す。 図９は、単離された白血球中のＭＰＯの含有量（白血球−ＭＰＯ）および血液１ｍｌ当たりのＭＰＯの含有量（血液−ＭＰＯ）を、「方法」において記載したように、３３３の被験体（１５８が既知の冠状動脈疾患を有し、そして１７５が血管造影的に有意なＣＡＤを有さなかった）中で決定したことを示す。ＭＰＯレベル対ＣＡＤ状態のボックス−ウイスカー（ｂｏｘ−ｗｈｉｓｋｅｒ）プロットが示される。ボックスは、２５〜７５パーセンタイルを含む。ボックス内の線は、中央値を表す。バーは、２．５パーセンタイルおよび９７．５パーセンタイルを表す。ＡＮＣ、絶対好中球計数；ＣＡＤ，冠状動脈疾患；ＰＭＮ、多形核白血球。 図１０は、モデル１−単変量調節（年齢、性別、高血圧、喫煙履歴、ＨＤＬｃ、ＷＢＣ四分位数、およびＭＰＯ四分位数）に従って有意な危険性因子について調節した確率比（ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ）；モデル２−フラミンガム総体危険度評価、ＷＢＣ四分位数およびＭＰＯ四分位数について調節した確率比を示す。黒丸、非調節確率比。黒三角、モデル１。黒四角、モデル２。 図１１は、好中球１個当たりのＭＰＯレベルが、集団における平均より下である個体（左パネル）、および、好中球１個当たりのＭＰＯレベルが、集団における平均より上である個体（右パネル）由来のＷＢＣのサイトグラムを示す。

Claims (19)

1. ヒト患者の、心臓血管疾患を有する危険性を特徴付けるのを支援するための方法であって、該方法は、以下：
   ａ）該ヒト患者由来の身体サンプル中の、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性のレベル、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）量のレベル、またはこれらの両方を決定する工程であって、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、循環白血球、またはこれらの任意の組み合わせである、工程；ならびに
   ｂ）該ヒト患者由来の身体サンプル中の、該ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性のレベル、該ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）量のレベル、またはこれらの両方を、それぞれ、コントロール被験体の集団から得られた匹敵する身体サンプル中の、該ＭＰＯ活性のレベル、該ＭＰＯ量のレベル、またはこれらの両方に基づく少なくとも１つのコントロール値と比較する工程、
   を包含し、
   ここで、該少なくとも１つのコントロール値と比較した場合の該試験被験体の身体サンプル中のＭＰＯ活性、ＭＰＯ量、またはこれらの両方の上昇したレベルは、該試験被験が、アテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患を有する危険性があることを示す、
   方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、１つの正規化された値であるか、または正規化された値の範囲であり、そして、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ活性レベル、ＭＰＯ量レベルまたはその両方に基づく、方法。
3. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、１つの代表的な値であるか、または代表的な値の範囲であり、そして、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ活性レベル、ＭＰＯ量レベルまたはその両方に基づく、方法。
4. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ活性レベルに基づく、複数の予め決定されたＭＰＯ活性レベルの範囲であり、そして、
   前記比較する工程は、該複数の予め決定されたＭＰＯ活性レベルの範囲のうちのどれに、該ヒト被験体のＭＰＯ活性レベルが入るかを決定する工程を包含する、
   方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記身体サンプルは、好中球、単球、好中球の亜集団、および単球の亜集団からなる群より選択される、１つ以上の循環白血球である、方法。
6. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ量レベルに基づく、複数の予め決定されたＭＰＯ量レベルの範囲であり、そして、
   前記比較する工程は、該複数の予め決定されたＭＰＯ量レベルの範囲のうちのどれに、該ヒト被験体のＭＰＯ量レベルが入るかを決定する工程を包含する、
   方法。
7. ヒト患者の、アテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患を有する危険性を特徴付けるのを支援するための方法であって、該方法は、以下：
   ａ）該ヒト患者由来の身体サンプル中の、ミエロペルオキシダーゼ活性のレベル、ミエロペルオキシダーゼ量のレベル、またはこれらの両方を決定する工程であって、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、循環白血球、またはこれらの任意の組み合わせであり、該循環白血球は、好中球、単球、好中球の亜集団、および単球の亜集団からなる群より選択される、工程；
   ｂ）該ヒト患者由来の身体サンプル中の、選択されたミエロペルオキシダーゼ生成酸化産物のレベルを決定する工程であって、ここで、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、もしくは尿またはこれらの組み合わせであり、ここで、該選択されたミエロペルオキシダーゼ生成酸化産物は、遊離のニトロチロシン、および、ペプチド結合ニトロチロシンからなる群より選択され、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、もしくは尿またはこれらの組み合わせである、工程；
   ｃ）該ヒト患者由来の身体サンプル中の、ミエロペルオキシダーゼ活性のレベル、ミエロペルオキシダーゼ量のレベル、またはこれらの両方のそれぞれを、コントロール被験体の集団から得られた匹敵する身体サンプル中の、該ＭＰＯ活性のレベルまたは該ＭＰＯ量のレベルに基づく第一のコントロール値と比較する工程；ならびに
   ｄ）該身体サンプル中の、該選択されたミエロペルオキシダーゼ生成酸化産物のレベルを、コントロール被験体の集団から得られた匹敵する身体サンプル中の、該ＭＰＯ活性のレベルまたは該ＭＰＯ量のレベルに基づく第二のコントロール値と比較する工程、
   を包含し、
   ここで、工程ｃおよび工程ｄの比較は、該ヒト患者の、心臓血管疾患を有する危険性を特徴付けるための情報を提供する、
   方法。
8. アテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患を有すると疑われる被験体またはアテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患を有する被験体におけるアテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患のための治療剤を評価するのを支援するための方法であって、該方法は、
   該治療剤での処置後の被験体から採取された身体サンプル中のＭＰＯ活性レベル、ＭＰＯ量レベルまたはその両方を、それぞれ、該治療剤での処置前の該被験体から採取された対応する身体サンプル中のＭＰＯ活性レベル、ＭＰＯ量レベルまたはその両方と比較する工程であって、ここで、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、循環白血球であり、該循環白血球は、好中球、単球、好中球の亜集団、単球の亜集団およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、工程、
   を包含する、方法。
9. 請求項８に記載の方法であって、前記治療剤を用いた処置後の被験体から採取された血液サンプル中の第２の危険予測因子のレベルを、処置後の該被験体から採取された血液サンプル中の第２の危険因子のレベルと比較する工程であって、ここで、該第２の危険予測因子は、ＬＤＬ、Ｃ−反応性タンパク質、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、ＬＤＬ／ＨＤＬ比、Ｌｐ（ａ）、インターロイキン６、およびホモシステインからなる群より選択される、工程、
   をさらに包含する、方法。
10. アテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患を有する患者においてアテローム性動脈硬化症の血管疾患の進行のモニタリングを支援する方法であって、該方法は、以下：
    初期に被験体から採取した身体サンプル中の、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性のレベル、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）量のレベル、またはこれらの両方と、後の時点で該被験体から採取した身体サンプル中の、ＭＰＯ活性のレベル、ＭＰＯ量のレベル、またはこれらの両方とを比較する工程、
    を包含し、
    ここで、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、または循環白血球の集団もしくは亜集団であり、該循環白血球の集団もしくは亜集団は、単球、好中球、単球の亜集団、好中球の亜集団またはこれらの任意の組み合わせからなる群より選択され、そして
    後の時点で採取した身体サンプル中の、ＭＰＯ活性のレベル、ＭＰＯ量のレベル、またはこれらの両方における増加は、該疾患が悪化したことを示す、
    方法。
11. 患者における心筋梗塞、発作、狭心症、一過性脳虚血発作、うっ血性心不全またはこれらの任意の組み合わせを経験する危険性の評価を支援するための方法であって、該方法は、
    該被験体の身体サンプル中の、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性のレベル、ＭＰＯ量のレベル、またはこれらの両方を決定する工程であって、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、循環白血球またはこれらの任意の組み合わせであり、該循環白血球は、単球、好中球、単球の亜集団、および好中球の亜集団からなる群より選択される、工程；
    該ＭＰＯ活性のレベル、該ＭＰＯ量のレベル、またはこれらの両方を、コントロール被験体から得られた匹敵する身体サンプル中の、該ＭＰＯ活性のレベル、該ＭＰＯ量のレベル、またはこれらの両方に基づく１つ以上の予め決定された値と比較する工程、
    を包含し、
    ここで該身体サンプル中の該ＭＰＯ量のレベルが該予め決定された値より大きい患者は、心筋梗塞、発作、狭心症、一過性脳虚血発作、うっ血性心不全またはこれらの任意の組み合わせを経験する危険性が、該ＭＰＯ量のレベルが該予め決定された値以下である患者より大きい、
    方法。
12. 試験被験体の、アテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患を発生させる危険性を特徴付けるのを支援するための方法であって、該方法は、
    該試験被験体由来の身体サンプル中の、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性のレベル、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）量のレベル、またはこれらの両方を決定する工程であって、該身体サンプルは、血液、血清、血漿、血液の白血球であり、該白血球は、好中球、単球およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、工程、
    を包含し、
    ここでコントロール被験体から得られた匹敵する身体サンプル中の、該ＭＰＯ活性のレベル、ＭＰＯ量のレベル、またはこれらの両方に基づく少なくとも１つの値と比較した場合の、該試験被験体の身体サンプル中の、該ＭＰＯ活性、ＭＰＯ量、またはこれらの両方の上昇したレベルは、アテローム性動脈硬化症の心臓血管疾患を発生させる危険性があることを示す、
    方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、１つの正規化された値であるか、または正規化された値の範囲であり、そして、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ活性レベル、ＭＰＯ量レベルまたはその両方に基づく、方法。
14. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、１つの代表的な値であるか、または代表的な値の範囲であり、そして、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ活性レベル、ＭＰＯ量レベルまたはその両方に基づく、方法。
15. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ活性レベルに基づく、複数の予め決定されたＭＰＯ活性レベルの範囲であり、そして、
    前記比較する工程は、該複数の予め決定されたＭＰＯ活性レベルの範囲のうちのどれに、該ヒト被験体のＭＰＯ活性レベルが入るかを決定する工程を包含する、
    方法。
16. 請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記身体サンプルは、好中球、単球、好中球の亜集団、および単球の亜集団からなる群より選択される、１つ以上の循環白血球である、方法。
17. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、前記コントロール値が、一般的なヒト被験体集団または選択されたヒト被験体集団由来の匹敵する身体サンプルにおけるＭＰＯ量レベルに基づく、複数の予め決定されたＭＰＯ量レベルの範囲であり、そして、
    前記比較する工程は、該複数の予め決定されたＭＰＯ量レベルの範囲のうちのどれに、該ヒト被験体のＭＰＯ量レベルが入るかを決定する工程を包含する、
    方法。
18. 前記患者のＭＰＯ活性のレベルまたはＭＰＯ量のレベルが、フローサイトメトリーを使用する方法によって決定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記試験被験体の身体サンプルにおけるミエロペルオキシダーゼ量のレベルが、免疫学的技術によって決定される、請求項１〜３、５〜１４、１６、または１７のいずれか１項に記載の方法。

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