KR20140091688A - 마이크로rna 조절에 의한 전신 에너지 항상성의 제어 - Google Patents

마이크로rna 조절에 의한 전신 에너지 항상성의 제어 Download PDF

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KR20140091688A
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미라젠 세러퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b 활성 또는 발현의 조절제를 세포와 접촉시킴으로써 세포에서 지방산 또는 글루코오스 신진대사를 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 miR-208a 및/또는 miR-208b 활성 또는 발현의 억제제를 대상에게 투여함으로써 대상에서 비만, 당뇨병 또는 신진대사 증후군과 같은 신진대사 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한 miR-208a 및/또는 miR-208b 활성 또는 발현의 억제제를 대상에게 투여함으로써 대상에서 미토콘드리아 기능 및/또는 산화환원-항상성을 강화 또는 개선하는 방법이 제공된다.

Description

마이크로RNA 조절에 의한 전신 에너지 항상성의 제어{Control of Whole Body Energy Homeostasis by Microrna Regulation}
본 발명은 microRNA(miRNA)의 활성 또는 발현을 조절하는 물질들을 투여함으로써 신진대사 이상의 치료 및 예방에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대상의 세포들에서 miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성을 억제함으로써 신진대사 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성의 조절제를 세포와 접촉시킴으로써 세포에서 지방산 신진대사를 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 대상의 세포들에서 miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성을 억제함으로써 미토콘드리아 기능을 강화 또는 상승, 연료 신진대사 및/또는 산화환원-항상성의 유지를 개선하는 방법을 제공한다.
에너지 항상성을 유지하는 것은 에너지 소비와 에너지 지급 사이에 균형을 필요로 한다. 서구 사회에서, 과도한 음식 소비가 에너지 균형의 이동을 유도하여 비만의 급격한 증가(Van et al., (2006) Nature 444, 875-880), 제 2 형 당뇨병(T2D)의 위험을 증가시키는 다기관 이상, 고혈압, 고지혈증 및 심혈관 질환(Mathieu et al., (2008) The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 40, 821-836)을 초래하였다. 에너지 제공 기질의 손상된 신진대사 및 심근 지질 축적은 비만 및 인슐린 저항성 환자에서 발견된 초기 이상들이다(Harmancey et al., (2008) Hypertension 5,181-187). 신진대사 활성 조직(예를 들어, 지방, 간 및 골격근)의 미토콘드리아 기능이상은 신진대사 증후군(MS), 인슐린 저항성(IR) 및 T2D를 포함하는 신진대사 질환과 일반적으로 관련이 있다(Muoio and Newgard, (2008) Nat Rev Mol Cell Biol, 2008. 9, 193-205).
따라서, 미토콘드리아 기능을 강화시키는 것과 같이, 비만 및 관련 신진대사 질환을 치료 및 예방하는 효과적인 요법을 확인하기 위한 증가하는 요구가 존재한다.
본 발명은 miR-208 억제가 나이 유도 체중 증가 및 고 지방 유도 체중 증가를 감소시키고 글루코오스 내성, 연료 신진대사, 미토콘드리아 기능 및 산화환원 항상성을 개선한다는 놀라운 발견을 부분적으로 기초로 한다. 따라서, 본 발명은 치료 또는 예방이 필요한 대상의 세포들(예를 들어, 심근 및/또는 골격근 세포)에서 miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성을 조절함으로써 비만 및 당뇨와 같은 신진대사 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 치료 또는 예방이 필요한 대상의 세포들에서 miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성을 조절함으로써 미토콘드리아 기능, 산화환원 항상성 및 연료 신진대사를 강화하는 방법을 제공한다.
한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제)를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성은 투여 이후 대상의 세포들에서 감소한다. 억제제의 투여는 치료 또는 예방이 필요한 대상의 신진대사 이상을 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다. 한 실시태양에서, 억제제의 투여는 치료 또는 예방이 필요한 대상의 미토콘드리아 기능을 강화하기 위한 것이다.
치료될 신진대사 이상은 신진대사 증후군, 비만, 당뇨병, 당뇨병성 신장증, 인슐린 저항성, 죽상동맥경화증, 지질 저장 이상, 글리코겐 저장 질환, 중간 사슬 아실-보조효소 A 탈수소효소 결핍, 지질 산화, 고 콜레스테롤 또는 이상 글루코오스 섭취 및/또는 사용을 포함할 수 있다. 이런 신진대사 이상으로부터 기인하는 2차 질환 또는 질병은 본 발명의 방법들에 의해 예방 또는 치료될 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b를 투여함으로써 수면 무호흡증, 암, 뇌졸중 및 골관절염과 같은 비만으로부터 기인하는 2차 질환 또는 이상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 미토콘드리아 기능장애에 의한 이상은 본 발명에 개시된 방법들에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 대상은 근육 약화, 노쇠, 근육감소증, 근육 영양불량증, 근육 위축, 근위축성 측색 경화증, 또는 미토콘드리아 근병증을 앓고 있거나 위험상태이다.
본 발명의 방법들에 사용하는데 적합한 miR-208a 및 miR-208b 억제제들은 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 및/또는 miR-208b의 성숙한 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함한다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 잠금 핵산, 바이사이클릭 뉴클레오시드, 포스포노포르메이트, 2' O-알킬 변형 및 포스포로티오에이트 결합과 같은 하나 이상의 당 또는 주쇄 변형을 포함한다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2' O-알킬 변형 또는 2'-플루오로 변형과 같은 2'-할로 변형을 포함한다. 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제는 길이가 약 6 내지 약 22 뉴클레오티드의 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 세포를 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하여 세포에서 지방산 신진대사를 제어하는 방법을 제공한다. 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 억제제 또는 효현제일 수 있다. 특정 실시태양에서, 지방산 신진대사는 억제제에 노출되지 않는 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 접촉한 후 세포에서 증가된다. 다른 실시태양에서, 지방산 신진대사는 효현제에 노출되지 않는 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 접촉한 후 세포에서 감소된다. 세포는 인비트로 또는 인비보일 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 심장세포, 골격 근육 세포, 전지방세포, 지방세포, 간세포 또는 췌장 세포이다.
본 발명은 에너지 항상성에 영향을 주기 위해, miR-208a 및 miR-208b를 포함하는 miR-208 패밀리(family) miRNAs의 발현(예를 들어, 풍부)을 억제할 수 있는 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학적 조성물 및 신진대사 이상과 같은 에너지 항상성과 관련되거나 영향을 주는 질병 또는 이상을 가진 환자를 치료하는 방법을 추가로 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법들에 사용하기 위해 본 발명에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제를 포함하는 약학적 조성물 및 제제를 제공한다. 이런 제제 및 조성물은 세포 전달을 위한 다양한 거대분자 조합, 미셀 또는 리포좀 조성물 내에 안티센스 올리고뉴클레오티드의 포함을 필요로 할 수 있다. 특정 실시태양에서, 조성물은 피내, 피하, 근내, 복강내 또는 정맥내 주사 또는 표적 조직(예를 들어, 심근 또는 골격근 조직) 속에 직접 주사에 적절하거나 이를 위해 제제화된다.
본 발명의 다른 양태 및 실시태양은 본 발명의 다음 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
도 1. AntimiR-208a(M-10101)는 생쥐에서 나이 유도 체중 증가를 감소시킨다. 1, 2 및 3일에 3 x 25 mg/kg의 antimiR-208a(M-10101) 및 2주마다 25mg/kg의 유지 복용량으로 치료한 생쥐는 대조군(M-10591) 또는 식염수 주사 동물들(A)과 비교하여 나이와 함께 체중(BW)의 감소 증가를 나타낸다. 모든 그룹들이 8주령에 필적할만한 체중으로 시작한 반면, 식염수 및 대조군 주사 동물들은 나이 유도 체중의 감소 때문에 현저하게 낮은 심장 중량 대 체중(HW/BW) 비율을 나타낸다(B). 또한 각각 패널 C 및 D에서 다른 그룹들의 심장 중량(HW) 및 심장 중량 대 총 중량(HW/TL)이 도시된다.
도 2. AntimiR-208a(M-10101)는 쥐에서 나이 유도 체중 증가를 감소시킨다. 수컷 어른 쥐에 11주 동안 2주마다 antimiR-208a(M-10101), 대조군(M-10591) 또는 식염수의 투여는 antimiR-208a가 체중에 나이 유도 증가를 감소한다는 것을 나타낸다.
도 3. A. antimiR-208a 또는 대조군 antimiR(대조군)으로 6주 동안 치료한 생쥐의 노던 블럿 분석. U6 RNA는 로딩 대조군으로 탐지되었다. 각 치료로부터 5마리 생쥐의 심장을 분석하였다. antimiR-208a-치료 심장에서 miR-208a의 부존재를 주목한다. B. 6주 동안 정상 식사(NC) 또는 고지방 식사(HF) antimiR-208a 및 대조군 antimiR 치료된 생쥐로부터의 심장 중량(n=5-13). C. 6주 동안 NC로 antimiR-208a 및 대조군 antimiR 치료된 생쥐에 대한 분획 단축율(fractional shortening). (n=5). D. 6주 동안 NC로 antimiR-208a 및 대조군 antimiR 치료된 생쥐에 대한 분당 비트로 심장 박동.(n=5).
도 4. AntimiR-208a(M-10101) 치료된 생쥐는 식사 유도 비만에 대해 저항력이 있다. A. 정상 식사(NC) 및 고지방 식사(HF) 6주 후 대조군(M-10591) 및 antimiR-208a(M-10101)를 비교하는 대표적 이미지. B. 정상 식사(NC) 및 고지방 식사(HF) 후 대조군(M-10591) 및 antimiR-208a(M-10101) 치료된 생쥐를 비교하는 성장 곡선 및 체중 증가 백분율. C. 정상 식사(NC) 및 고지방 식사(HF) 6주 후 대조군(M-10591) 및 antimiR-208a(M-10101) 치료된 생쥐를 비교하는 NMR에 의해 측정된 신체 조성. 각 막대의 흰색 부분은 지방 중량을 나타낸다. D. 정상 식사(NC) 및 고지방 식사(HF) 후 대조군(M-10591) 및 antimiR-208a(M-10101)으로부터의 내장 백색 지방 조직(WAT) 및 견갑하근 갈색 지방 조직(BAT)의 중량. E. 정상 식사 또는 고지방 식사를 한 대조군 및 antimiR-208-치료생쥐로부터의 내장 WAT 및 견갑하근 BAT의 H&E. 스케일 바 = 40㎛. F. 6주 동안 고지방 식사를 한 antimiR-208a 및 대조군 antimiR 치료된 생쥐로부터의 내장 WAT 및 간의 사진. G. 내장 WAT의 세포 크기(n=5). 200mm 간격의 2 부분의 이미지는 >500 세포를 나타내는 각 그룹에서 7-8 생쥐로부터 분석하였다. 정상 식사(NC) 및 고지방 식사(HF) 6주 후 대조군(M-10591) 및 antimiR-208a(M-10101) 치료된 생쥐로부터의 혈청 트라이글리세라이드 수준(H) 및 혈청 콜레스테롤 수준(I).
도 5. AntimiR-208a(M-10101) 치료된 생쥐는 글루코오스 불인내성에 저항력이 있다. 정상 식사(NC) 및 고지방 식사(HF) 6주 후 대조군 antimiR(M-10591) 및 antimiR-208a(M-10101) 치료된 생쥐로부터의 글루코오스 인내성 검사(A) 및 글루코오스 인내성 검사에 대한 곡선 아래 면적(B). 정상 식사(NC) 및 고지방 식사(HF) 6주 후 대조군 및 antimiR-208a 치료된 생쥐로부터의 단식 인슐린(C) 및 렙틴(D) 수준.
도 6. 정상 식사(REG) 및 고지방 식사(HFD) 12주 후 식염수, 대조군 antimiR(M-10591, M-10649, M-10702, M-11182) 및 antimiR-208a(M-10101, M-10673, M-10681, M-10683) 치료된 생쥐를 비교하는 성장 곡선(A) 및 체중의 백분율 증가(B).
도 7. miR-208a 억제가 글루코오스 인내성을 강화시킨다. 규칙적 식사 및 고지방 식사(HFD) 11주 후 대조군 antimiR(M-10591) 및 antimiR-208a(M-10101, M-10673, M-10681, M-10683) 치료된 생쥐로부터의 글루코오스 인내성 검사.
도 8. 대조군 antimiR(M-10591) 또는 4개 antimiR-208a 화합물 중 하나(M-10101, M-10673, M-10681, M-10683)를 투여받은 비만 생쥐의 시간에 따른 체중(A) 및 체중의 백분율 변화(B).
본 발명은 치료 또는 예방이 필요한 환자의 신진대사 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 또한 미토콘드리아 기능, 산화환원 항상성 및/또는 연료 신진대사를 강화하는 방법이 제공된다. MiRNA는 비만, 당뇨병 및 다른 신진대사 이상을 포함하는 이런 질환에 대한 치료의 개발을 위한 새로운 치료 표적을 나타낸다.
한 실시태양에서, 상기 방법은 본 발명에 기술된 대로 miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성은 투여 이후 대상의 세포들에서 감소한다. 본 발명에서 사용된 용어 "환자" 또는 "대상"은 인간 및 다른 영장류(예를 들어, 침팬지 및 다른 유인원 및 원숭이 종), 가정 포유류(예를 들어, 개 및 고양이), 가축(예를 들어, 소, 양, 돼지, 염소 및 말), 실험실 동물(예를 들어, 생쥐, 쥐, 및 기니피그와 같은 설치류), 및 새(예를 들어, 사육, 야생 및 닭, 칠면조와 같은 게임 버드 및 다른 순계류, 오리, 거위 등)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 척추동물을 말한다. 일부 실시태양에서 대상은 포유동물이다. 다른 실시태양에서 대상은 인간이다.
특정 실시태양에서, 치료 또는 예방이 필요한 대상은 신진대사 질병 또는 이상으로 진단되고, 앓고 있으며 및/또는 이의 증상을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 대상은 신진대사 질병 또는 이상으로 진단되지 않고, 앓고 있지 않으며 및/또는 이의 증상을 나타내지 않는다. 신진대사 이상은 신진대사 증후군, 비만, 당뇨병, 당뇨병성 신장증, 인슐린 저항성, 죽상동맥경화증, 지질이상혈증(혼합 또는 당뇨병성 지질이상혈증), 고콜레스테롤혈증, 저 HDL 콜레스테롤, 고 LDL 콜레스테롤, 고지혈증, 고중성지방혈증, 저혈당, 고혈당, 글루코오스 불인내성, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 고혈압, 고지단백혈증, 신진대사 증후군, 증후군 X, 혈전성 이상, 파행증, 뇌졸중 및 기타, 신장 질환, 케톤산증, 신증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 지방간 또는 비알코올성 지방간염(NASH)과 같은 비알코올성 지방간 질환, 지질 저장 이상(예를 들어, 니만-피크병, 고세병, 화버병, 파브리병, 월만병 및 콜레스테릴 에스터 저장병), 다낭난소증후군(PCOS), 고 콜레스테롤 또는 이상 글루코오스 섭취 및/또는 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 방법들로 치료될 신진대사 이상은 비만, 고콜레스테롤혈증, 제 2 형 당뇨병, 지방간 또는 고지혈증이다.
다른 실시태양에서, 대상은 아테로마성 동맥경화증 및 앙기나, 심장마비, 심부전, 관상동맥질환, 심근경색, 울혈성 심부전 및/또는 심비대를 포함하는 이의 후유증과 같은 심혈관 질환 또는 이상으로 진단되지 않고, 앓고 있지 않으며 및/또는 이의 증상을 나타내지 않는다. 일부 실시태양에서, 대상은 심혈관 질환 또는 이상으로 진단되지 않고, 앓고 있지 않으며 및/또는 이의 증상을 나타내지 않으며 신진대사 질병 또는 이상으로 진단되고, 앓고 있으며 및/또는 이의 증상을 나타낸다.
특정 실시태양에서, 치료 또는 예방이 필요한 대상은 미토콘드리아 기능이상과 관련된 질병 또는 이상으로 진단되고, 앓고 있으며 및/또는 이의 증상을 나타낸다. 다른 실시태양에서, 대상은 미토콘드리아 기능이상과 관련된 질병 또는 이상으로 진단되지 않고, 앓고 있지 않으며 및/또는 이의 증상을 나타내지 않는다. 이상 또는 질병은 근육 약화, 노쇠, 근육감소증, 근육 영양불량증, 근육 위축, 근위축성 측색 경화증, 또는 미토콘드리아 근병증을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 치료 또는 예방이 필요한 대상은 미토콘드리아 기능이상과 관련된 질병 또는 이상으로 진단되고, 앓고 있으며 이의 증상을 나타내며 심혈관 질환 또는 이상으로 진단되지 않고, 앓고 있지 않으며 및/또는 이의 증상을 나타내지 않는다.
일부 실시태양에서, 신진대사 이상은 글리코겐 저장 질환(GSD)이다. 예를 들어, 본 발명의 방법들은 대상에게 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 투여함으로써 치료 또는 예방이 필요한 대상에서 GSD의 형태들(예를 들어, GSD 형태 0 및 GSD 형태 I 내지 GSD 형태 XIII) 중 임의의 것을 치료 또는 예방하는 것을 제공한다. GSD는 폰기르케병, 폼페병, 코리병 또는 포르브스병, 안데르센병, 맥아들병, 허스병, 타루이병, 판코니-비켈 증후군, 적혈구 알돌라아제 결핍을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 실시태양에서, 신진대사 이상은 중간 사슬 아실-보조효소 A 탈수소효소(MCAD) 결핍이다. MCAD 결핍을 가진 개인들은 치명적일 수 있는 지방산 산화에서 손상을 나타낸다. 본 발명의 한 실시태양에서, 지방산 신진대사는 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제의 투여 후 MCAD 결핍을 가진 대상들에서 증가한다.
본 발명자들은 miR-208a 활성의 억제가 간, 골격근 및 심근에서 강화된 미토콘드리아 기능을 초래하는 것을 놀랍게 발견하였다. 따라서, 본 발명은 또한 치료 또는 예방이 필요한 대상에서 미토콘드리아 기능 또는 산화환원 항상성을 강화시키는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 이 방법은 miR-208a 또는 miR-208b 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, miR-208a 또는 miR-208b의 발현 또는 활성은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여 후 대상의 세포들에서 감소한다. 특정 실시태양에서, 강화된 미토콘드리아 기능 또는 산화환원 항상성이 필요한 대상은 근육 약화, 노쇠, 근육감소증, 근육 영양불량증, 근육 위축, 근위축성 측색 경화증, 또는 미토콘드리아 근병증으로 진단되고, 앓고 있고 또는 위험상태이다. 미토콘드리아 근병증은 미토콘드리아 뇌병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 증후군(MELAS), 간대성 근경련 간질과 불균일 적색근육 섬유병(MERRF), 컨스-세이어 증후군(KSS) 또는 만성진행외안근마비(CPEO)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
관련 실시태양에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에서 근육 위축 또는 근육감소증을 치료하는 방법을 제공한다. 근육감소증은 느리지만 나이가 듦에 따라 진행하는 근육량의 손실이며 이동의 점진적 느려짐 및 힘의 감소를 유도하는 근육의 양과 질의 저하를 특징으로 한다(Ryall et al ., Biogerontology (2008) 9:213-228). 근육감소증은 노인 인구에서 주로 발견되는 노쇠 증후군의 구성요소이다. 한 실시태양에서, 치료가 필요한 대상에서 근육 위축 또는 근육감소증을 치료하는 방법은 miR-208a 또는 miR-208b 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, miR-208a 또는 miR-208b의 발현 또는 활성은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여 후 대상의 세포들에서 감소한다. 일부 실시태양에서, 상기 방법은 근육 위축에 대항하기 위해 하나 이상의 추가 치료제와 조합으로 miR-208a/miR-208b 올리고뉴클레오티드를 투여하는 단계를 더 포함한다. 이런 적절한 추가 치료제는 선택적 안드로겐 수용체 조절제(예를 들어, 오스타린, BMS-564,929 및 LGD-4033), 단백동화 스테로이드, 인간 성장 호르몬, 및 디하이드로에피안드로스테론(DHEA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시태양에서, 근육 위축 또는 근육감소증의 치료가 필요한 대상은 노인 환자, 특히 노인 인간 환자이다.
본 발명은 또한 본 발명에 기술된 대로 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여함으로써 신진대사 이상 또는 미토콘드리아 기능이상으로부터 기인하는 2차 질환 또는 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 포함한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여함으로써 수면 무호흡증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여함으로써 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여함으로써 골관절염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여함으로써 뇌졸중을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법들은 신진대사 이상 또는 미토콘드리아 기능이상으로부터 기인하는 임의의 신진대사 이상 또는 2차 질환 또는 질병의 발전 이전에 예방적으로 사용된다. 이런 실시태양에서, 예방 치료가 필요한 대상들은 임의의 신진대사 이상 또는 2차 질환 또는 질병의 가족력으로서 이런 인자들을 기초로 확인될 수 있다.
특정 실시태양에서, 치료 또는 예방이 필요한 대상에서 신진대사 이상을 치료 또는 예방하는 방법들은 신진대사 이상을 치료하기 위해 하나 이상의 통상적인 치료제를 투여하는 단계를 더 포함한다. 따라서, 본 발명에 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이런 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물 또는 제제 이외에, 다른 치료제 및/또는 활성 성분을 함유하는 조성물 및 의약의 공동 투여를 포함하는 실시태양들이 본 발명의 범위 내에 포함된다. 조합 치료로 종종 불리는 이런 다중 약물 요법은 신진대사 이상의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
본 발명에 기술된 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이런 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물 또는 제제와 조합으로 투여될 수 있고 개별적으로 또는 동일한 약학적 조성물로 투여될 수 있는 통상적인 치료제들의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다:
(a) 글리타존 및 비-글리타존(예를 들어, 트로글리타존, 피오글리타존, 엔글리타존, MCC-555, 로시글리타존, 발라글리타존, 네토글리타존, T-131, LY-30012 및 LY-818)을 포함하는 PPARγ 효현제 및 부분 효현제;
(b) 메트포르민 및 펜포르민과 같은 비구아나이드;
(c) 단백질 티로신 포스파타제-1B(PTP-1B) 억제제;
(d) MK-0431 및 LAF-237과 같은 다이펩티딜 펩티다아제 IV(DP-IV) 억제제;
(e) 인슐린 또는 인슐린 모방체;
(f) 톨부타미드 및 글리피지드 또는 관련 재료와 같은 설폰일우레아;
(g) α-글루코시다제 억제제(예를 들어 아카르보스);
(h) (i) HMG-CoA 환원효소 억제제(로바스타틴, 심바스타틴, 로수바스타틴, 프라바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 리바스타틴, 이타바스타틴, ZD-4522 및 다른 스타틴), (ii) 담즙산 결합제(콜레스티르아민, 콜레스티폴 및 가교 덱스트란의 다이알킬아미노알킬 유도체), (iii) 니코틴일 알코올, 니코틴산 또는 이의 염, (iv) 페노피브르산 유도체(젬피브로질, 클로피브레이트, 페노피브레이트 및 베자피브레이트)와 같은 PPARα 효현제, (v) 에제티미베와 같은 콜레스테롤 흡수 억제제, (vi) 아바시미베와 같은 아실 CoA: 콜레스테롤 아실트랜스페라제(ACAT) 억제제, (vii) 토르세트라피브와 같은 CETP 억제제 및 (viii) 프로부콜과 같은 페놀 항산화제와 같은 환자의 지질 프로파일을 개선하는 물질;
(i) 무라글리타자르, 테사글리타자르, 파르글리타자르 및 JT-501과 같은 PPARα/γ;
(j) WO97/28149에 개시된 것과 같은 PPARα 효현제;
(k) 펜플루라민, 덱스텐플루라민, 펜트라민, 수비트라민, 오르리스타트, 뉴로펩티드 Y5 억제제, MC4R 효현제, 칸나비노이드 수용체 1 길항제/역 효현제 및 β3 아드레날린 수용체 효현제와 같은 항비만 화합물;
(l) 회장 담즙산 수송체 억제제;
(m) 아스피린, 비-스테로이드성, 항염증제, 글루코코르티코이드, 아줄피딘 및 사이클로-산소화효소 2 선택성 억제제와 같은 염증 질병에 사용하기 위한 물질;
(n) 글루카곤 수용체 길항제;
(o) 예를 들어, 엑세니티드인 엑센딘과 같은 GLP-1 또는 GLP-1 유사체;
(p) GIP-1; 및
(q) 하이드록시스테롤 탈수소효소-1(HSD-1) 억제제.
상기 종래의 치료제들 중 하나 이상은 치료 또는 예방이 필요한 대상에서 신진대사 이상을 치료 또는 예방하기 위해 본 발명에 기술된 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이런 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물 또는 제제와 동시 투여될 수 있다. 조합 치료제의 비-제한적인 예들은 비구아니드, 설폰일우레아, HMG-CoA 환원효소 억제제, 다른 PPAR 효현제, PTP-1B 억제제, DP-IV 억제제 및 항비만 화합물로부터 선택된 하나 이상의 종래의 치료제와 miR-208a 및/또는 miR-208b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합을 포함한다.
본 발명에 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이런 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 약학적 조성물 또는 제제 및 통상적인 치료제는 동일한 제형으로 또는 각각의 제형으로 투여될 수 있다. 각각의 제형으로 투여될 때, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상적인 치료제와 동시에 또는 연속적으로(즉, 약간의 간격으로 분리됨) 투여될 수 있다. 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 종래의 치료제의 투여 이전, 동시 또는 이후일 수 있다.
본 발명자들은 신진대사에 대한 miR-208 억제의 효과들은 심장 조직에서와 같은 이의 표적 MED13(즉, THRAP1)의 탈억제를 통해 부분적으로 매개된다는 것을 발견하였다. 생쥐에서 MED13의 심장 특이적 과다 발현은 고지방 식사 유도 비만에 대한 저항성을 제공하며 전신 인슐린 민감성 및 글루코오스 내성을 개선하는 반면, 심근세포에서와 같은 MED13의 유전적 결실은 고지방 식사에 반응하는 비만을 강화하며 신진대사 증후군을 악화시킨다(데이터 도시되지 않음). 따라서, 본 발명은 또한 심장 세포들에서와 같이, MED13 발현을 강화하는 것을 포함하여 치료 또는 예방이 필요한 대상에서 신진대사 이상을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 예를 들어, MED13을 암호화하는 발현 벡터와 같은 MED13 효현제를 투여하는 방법이 본 발명에 제공된다. MED13을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 알파-미오신 중사슬과 같은 심장 특이적 프로모터의 제어하에 있을 수 있다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 대로 miR-208a 및/또는 miR-208b 활성 또는 발현의 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 필요한 대상에서 글루코오스 흡수 및/또는 사용을 증가시키는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, 대상은 인슐린 저항성 또는 당뇨병으로 진단된다. 한 실시태양에서, 대상의 혈당 수준은 억제제의 투여 이전 대상의 혈당 수준과 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제의 투여 후 감소된다. 다른 실시태양에서, 대상의 혈당 수준은 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제의 투여 후 경구 글루코오스 인내성 검사에 의해 측정한 대로 정상 수준 내로 감소된다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 대상의 금식 혈당 수준은 약 110mg/dl 미만이다. 다른 실시태양에서, 글루코오스 주사 2시간 후 대상의 금식 혈당 수준은 약 140mg/dl 미만이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 대로 miR-208a 및/또는 miR-208b 활성 또는 발현의 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 필요한 대상에서 콜레스테롤을 감소시키는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, 대상은 관상 심장질환, 뇌졸중, 밀초혈관질환, 제 2 형 당뇨병, 및 고혈압과 같은 고 콜레스테롤과 관련이 있는 질병으로 진단된다. 한 실시태양에서, 억제제의 투여 이전 대상의 전체 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤 수준과 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제의 투여 후 대상의 전체 콜레스테롤 수준은 감소하며 및/또는 HDL 콜레스테롤 수준은 증가한다. 다른 실시태양에서, 대상의 콜레스테롤 수준은 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제의 투여 후 지질단백질 프로파일 혈액 검사에 의해 측정된 대로 정상 수준 내로 회복된다. 예를 들어, 특정 실시태양에서, 대상의 전체 콜레스테롤 수준은 약 200mg/dL 미만으로 감소한다. 다른 실시태양에서, 대상의 HDL 콜레스테롤 수준은 약 40mg/dL 이상으로 증가된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 대로 miR-208a 및/또는 miR-208b 활성 또는 발현의 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 필요한 대상에서 비만을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시태양에서, 대상은 비만으로 진단된다. 특정 실시태양에서, 치료가 필요한 대상은 25 이상의 체질량 지수를 가진다. 다른 실시태양에서, 치료가 필요한 대상은 30 이상의 체질량 지수를 가진다. 한 실시태양에서, 대상의 체질량 지수 및/또는 허리 둘레는 억제제의 투여 이전 대상의 체질량 지수 및/또는 허리 둘레와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제의 투여 후 감소된다. 다른 실시태양에서, 대상의 체질량 지수 및/또는 허리 둘레는 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제의 투여 후 대상의 성별 및 나이에 대해 조절된 정상 수준 내로 감소된다.
본 발명은 또한 세포에서 지방산 신진대사를 조절하는 방법을 제공한다. 글리코겐 합성을 조절함으로써, 글루코오스 신진대사를 조절하는 방법이 또한 본 발명에 제공된다. miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 억제제와 같은 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의의 조절제를 투여함으로써 미토콘드리아 기능을 강화하고 산화환원 항상성을 개선하는 방법이 또한 제공된다.
한 실시태양에서, 본 발명에 개시된 방법들은 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제와 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 사용된 대로, "조절제"는 miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성을 조절하는 분자이다. 조절제들은 miR-208a 및/또는 miR-208b 기능의 효현제(즉, miR-208a 또는 miR-208b의 활성 또는 발현을 강화한다)일 수 있거나 miR-208a 및/또는 miR-208b 기능의 억제제(즉, miR-208a 및/또는 miR-208b의 활성 또는 발현을 감소시킨다)일 수 있다. 조절제들은 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 소형 분자를 포함할 수 있다. miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제들은 본 발명에 기술된 대로 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제 및 효현제를 포함한다.
특정 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 억제제이며 지방산 신진대사는 억제제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 접촉한 후 세포에서 증가된다. 다른 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 효현제이며 지방산 신진대사는 효현제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 효현제와 접촉한 후 세포에서 감소된다.
특정 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 억제제이며 글루코오스 신진대사는 억제제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 접촉한 후 세포에서 증가된다. 다른 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 효현제이며 글루코오스 신진대사는 효현제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 효현제와 접촉한 후 세포에서 감소된다. 세포는 인비트로 또는 인비보일 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 심근세포, 골격근 세포, 지방전구세포, 지방세포, 간세포 또는 췌장 세포이나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 억제제이며 미토콘드리아 기능은 억제제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 접촉한 후 세포에서 증가된다. 다른 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 효현제이며 미토콘드리아 기능은 효현제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 효현제와 접촉한 후 세포에서 감소된다. 세포는 인비트로 또는 인비보일 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 심근세포, 골격근 세포, 지방전구세포, 지방세포, 간세포 또는 췌장 세포이나 이에 제한되지 않는다.
일부 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 억제제이며 산화환원 항상성은 억제제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 접촉한 후 세포에서 개선된다. 다른 실시태양에서, 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 효현제이며 산화환원 항상성은 효현제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 효현제와 접촉한 후 세포에서 손상된다. 세포는 인비트로 또는 인비보일 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포는 심근세포, 골격근 세포, 지방전구세포, 지방세포, 간세포 또는 췌장 세포이나 이에 제한되지 않는다.
한 특정한 실시태양에서, 세포는 심근세포이다. 따라서, 본 발명은 또한 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제와 심근세포를 접촉시킴으로써 심근 신진대사를 조절하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 심근세포를 접촉하면 스트레서에 의해 유도된 산화성 신진대사로부터 당분해 신진대사로의 신진대사 전환을 예방하거나 감소시킨다. 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 심근세포를 접촉하면 심근세포에서 탄수화물 신진대사를 감소시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 심근세포를 접촉하면 심근세포에서 지방산 신진대사를 증가시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 심근세포를 접촉하면 심근세포에서 글루코오스 신진대사를 증가시킨다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 심근세포를 접촉하면 심근세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시킨다. 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 심근세포를 접촉하면 심근세포에서 산화환원 항상성을 증가시킨다. 심근세포는 인비트로 또는 인비보일 수 있다.
다른 특정한 실시태양에서, 세포는 골격근 세포이다. 따라서, 본 발명은 또한 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제와 골격근 세포를 접촉시킴으로써 골격근 세포에서 신진대사를 조절하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 스트레서에 의해 유도된 산화성 신진대사로부터 당분해 신진대사로의 신진대사 전환을 예방하거나 감소시킨다. 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 골격근 세포에서 탄수화물 신진대사를 감소시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 골격근 세포에서 지방산 신진대사를 증가시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 골격근 세포에서 글루코오스 신진대사를 증가시킨다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 골격근 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시킨다. 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 골격근 세포에서 산화환원 항상성을 증가시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 골격근 세포에서 다이펩타이드의 수준을 증가시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 골격근 세포를 접촉하면 골격근 세포 성장을 억제한다. 골격근 세포는 인비트로 또는 인비보일 수 있다.
다른 특정한 실시태양에서, 세포는 간 세포(liver cell or hepatocyte)이다. 따라서, 본 발명은 또한 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제와 간 세포를 접촉시킴으로써 간 세포에서 신진대사를 조절하는 방법을 포함한다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 간 세포를 접촉하면 스트레서에 의해 유도된 산화성 신진대사로부터 당분해 신진대사로의 신진대사 전환을 예방하거나 감소시킨다. 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 간 세포를 접촉하면 간 세포에서 탄수화물 신진대사를 감소시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 간 세포를 접촉하면 간 세포에서 지방산 신진대사를 증가시킨다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 간 세포를 접촉하면 간 세포에서 글루코오스 신진대사를 증가시킨다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 간 세포를 접촉하면 간 세포에서 미토콘드리아 기능을 증가시킨다. 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 간 세포를 접촉하면 간 세포에서 산화환원 항상성을 증가시킨다. 간 세포는 인 비트로 또는 인 비보일 수 있다.
본 발명은 또한 당분해 또는 지방산 신진대사에 결핍과 관련된 이상 또는 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 miR-208a 및/또는 miR-208b 효현제를 대상에게 투여함으로써 예방 또는 치료가 필요한 대상에서 저혈당 또는 고인슐린혈증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 저혈당 또는 고인슐린혈증이 발생할 위험이 있는 대상들은 인슐린 또는 특정 당뇨병 의약(예를 들어, 클로르프로파미드, 톨라자미드, 아세토헥사미드, 글리피지드, 또는 톨부타미드)을 과다복용하는 당뇨병 환자, 인슐린 분비 종양(인슐린종)을 가진 대상, 고인슐린혈증을 유발하는 간 질환 또는 유전 질병으로 진단된 환자를 포함한다. 본 발명에 기술된 miR-208a 및/또는 miR-208b의 효현제로 치료 또는 예방될 수 있는 다른 이상 또는 질병은 환자들이 정상 체중을 유지하는데 어려움을 갖거나 의도하지 않은 체중 손실을 경험하는 것들이다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b 효현제를 대상에게 투여함으로써 치료 또는 예방이 필요한 대상에서 갑상성기능항진증(그레이브스병)을 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
구조와 프로세싱을 포함하는 miR-208a는 전문이 참조로 본 발명에 포함되는 WO 2008/016924에 기술된다.
miR-208a는 α-MHC 유전자의 인트론 내에 위치된다. 정확한 인트론 위치는 특정 종들 및 특이 전사체에 의존한다. 예를 들어, 인간에서, miR-208a는 α-MHC 유전자의 28번째 인트론 내에 암호화되는 반면, 생쥐에서는, 29번째 인트론 내에 암호화된다. 인간, 생쥐, 쥐 및 개에 대한 miR-208a에 대한 서열들을 암호화하는 pre-miRNA는 각각으로 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및 SEQ ID NO: 8 아래 도시된다. 성숙한 miR-208a 서열은 SEQ ID NO: 9에 제공된다. 유사 α-MHC, miR-208a는 오직 심장에 발현된다.
인간 pre-miR-208a (SEQ ID NO: 5)
ACGGGCGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A
생쥐 pre-miR-208a (SEQ ID NO: 6)
ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A
쥐 pre-miR-208a (SEQ ID NO: 7)
ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A
개 pre-miR-208a (SEQ ID NO: 8)
ACGCATGAGC TTTTGGCTCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A
성숙한 miR-208a (SEQ ID NO: 9)
AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU
게놈은 miR-208b라 불리는, β-MHC 유전자 내의 인트론 31에 위치하는 miR208a와 관련된 다른 마이크로RNA를 포함하며 β-MHC와 유사하게 오직 심장 및 느린 골격근(slow skeletal muscle)(예를 들어, 가자미근)에서 발현된다. miR-208b에 의해 조절되는 유전자들은 예를 들어, Sp3, 미오스타틴(Myostatin), PUR베타, THRAP1, 및 속 골격근 단백질 유전자들(fast skeletal muscle protein genes)을 포함한다. 이 miRNA의 서열은 대부분 miR-208a와 일정한 miRNA의 mRNA 표적을 정의하는“시드 영역(seed region)”에서 100% 상동성(homology)을 가지고 중복된다. pre-miR-208b 서열은 여러 포유동물 종 전역에서 보존된다(예를 들어, 인간, 생쥐, 쥐, 및 개). 성숙한 miR-208b 서열뿐만 아니라 pre-miR-208b 서열 역시 아래에 나타나있다:
pre-miR-208b (SEQ ID NO: 10)
TTTCTGATCC GAATATAAGA CGAACAAAAG GTTTGTCTGA GGG
성숙한 miR-208b (SEQ ID NO: 11)
AUAAGACGAA CAAAAGGUUU GU
miR-208b의 구조 및 프로세싱은 전문이 참조로 본 발명에 포함되는 WO 2009/018492에 기술된다. miR-208a 및 miR-208b의 다양한 형태에 대한 서열들은 본 발명에 따라 상보적 억제제들을 설계하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 개시된 모든 리보핵산 서열들은 서열에서 우리딘 염기를 티미딘 염기로 대체함으로써 데옥시리보핵산 서열로 전환될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 개시된 모든 데옥시리보핵산 서열들은 서열에서 티미딘 염기를 우리딘 염기로 대체함으로써 리보핵산 서열로 전환될 수 있다. 데옥시리보핵산 서열, 리보핵산 서열 및 본 발명에 개시된 모든 서열들의 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드의 혼합물을 함유하는 서열들이 본 발명에 포함된다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법들의 임의의 것에서 사용하기에 적합한 miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 화학적 변형(예를 들어, 당(sugar) 또는 주쇄(backbone) 변형)을 가진다. 예를 들어, 적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 "형태적으로 속박된(conformationally constrained)" 또는 바이사이클릭 당 뉴클레오시드 변형들(BSN)로 이루어질 수 있으며 이들은 BSN을 포함하는 올리고뉴클레오티드 및 그들의 상보적 microRNA 표적 가닥 사이에 형성된 복합체에 증가된 열적 안정성을 부여한다. 예를 들어, 한 실시태양에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 잠금 핵산(LANs) 잔기 또는 "잠금 뉴클레오티드"를 포함한다. LNA는 예를 들어, 미국특허 6,268,490, 미국특허 6,316,198, 미국특허 6,403,566, 미국특허 6,770,748, 미국특허 6,998,484, 미국특허 6,670,461, 및 미국특허 7,034,133에서 기술되며, 이들 모두는 전체로써 본 발명에 참조로 포함된다. LNA는 "잠금" 형태 및/또는 바이사이클릭 구조를 형성하는 리보스 당 모이어티의 2' 및 4' 탄소들 사이에 추가적인 다리를 포함하는 변형된 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이다. 예시적 실시태양에서, 잠금 뉴클레오티드는 예를 들어, 구조식 A에 나타난 대로 2' 내지 4' 메틸렌 다리를 가진다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O, 4'-C-메틸렌 리보뉴클레오시드(구조식 A)를 포함하며, 여기서 리보오스 당 모이어티는 "잠금" 형태이다. 또 다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O, 4'-C-에틸렌 리보뉴클레오시드와 같은 2'-O, 4'-C-에틸렌-연결 핵산(ENA)을 포함한다. 선택적으로 또는 추가로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 2', 4'-C-연결된 2' 데옥시리보뉴클레오시드(2',4'-C-bridged 2' deoxyribonucleoside)(CDNA, 구조식 B)를 포함할 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 아래 구조식 C에 나타난 구조를 가진 하나 이상의 LNA를 포함한다.
Figure pct00001
miR-208a 및/또는 miR-208b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 BSN(LNA, ENA, CDNA 및 기타 등등) 및 다른 변형 뉴클레오티드, 및 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 BSN(LNA, ENA, CDNA 및 기타 등등) 및 2'-O-알킬 변형 및/또는 2'-플루오로 변형과 같은 2' 할로 변형을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 BSN(LNA, ENA, CDNA 및 기타 등등) 또는 다른 변형 및 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 조합을 포함한다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 BSN(LNA, ENA, CDNA 및 기타 등등) 및 2'-O-알킬 변형 및/또는 2'-플루오로 변형과 같은 2' 할로 변형의 조합을 포함한다.
한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O, 4'-C-에틸렌 리보뉴클레오시드와 같은 2'-O, 4'-C-에틸렌-연결 핵산 및 2'-O, 4'-C-메틸렌 리보뉴클레오시드를 포함한다. 다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-O, 4'-C-에틸렌 리보뉴클레오시드와 같은 2'-O, 4'-C-에틸렌-연결 핵산, 2'-O, 4'-C-메틸렌 리보뉴클레오시드 및 2'-O-알킬 변형 및/또는 2'-플루오로 변형과 같은 2' 할로 변형을 포함한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에서 사용될 수 있는 다른 적절한 잠금 뉴클레오티드는 미국특허 6,403,566 및 미국특허 6,833,361에 서술된 것을 포함하며, 이들 모두는 전체로써 본 발명에 참조로 포함된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 전장 또는 절단된 miR-208a 또는 miR-208b 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 이로 필수적으로 이루어지거나 이루어질 수 있다. 본 발명에서 사용된 대로, miRNA 서열을 참조하여 "전장"이란 용어는 성숙한 miRNA의 길이를 의미한다. 따라서 본 발명에 기술된 억제제들은 절단되거나 전장인, 안티센스, 성숙한 miRNA 서열들일 수 있으며 또는 다른 폴리뉴클레오티드 서열들과 조합으로 이런 서열들을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명에 기술된 화학적 변형 모티프는 전장 안티센스 miRNA(성숙한) 서열들을 불필요하게 한다. 이런 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 20개 뉴클레오티드 길이이거나 약 10 내지 18개 뉴클레오티드 길이이거나 약 11 내지 약 16개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시태양에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17 또는 약 18개 뉴클레오티드 길이이다. 절단된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 억제에 의해 5' - UAAGACGAGCAAAAAG - 3'(SEQ ID NO:7) 내의 miR-208a 서열 또는 UAAGACGAACAAAAAG - 3'(SEQ ID NO:8) 내의 miR-208b 서열을 표적으로 하는 서열을 가질 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 성숙한 miR-208a 및/또는 miR-208b를 표적화하기 위해 디자인된 뉴클레오티드 서열을 가진다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 이런 실시태양 또는 다른 실시태양에서, 또한 또는 선택적으로 pre- 또는 pri-miRNA 형태를 표적화하기 위해 디자인될 수 있다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 완전히 상보적인(성숙한) miR-208 서열에 대해 1 내지 5(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4) 미스매치를 함유하는 서열을 갖도록 디자인될 수 있다.
특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 또는 miR-208b의 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' - TGCTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 서열 또는 5' - TGTTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:2)의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 5' - CTTTTTGCTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:3) 또는 5' - CCTTTTGTTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:4)을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나 이루어진다. 이 내용에서, "필수적으로 이루어지다"는 추가 뉴클레오티드(들)가 표적 miRNA 활성의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 억제에 실질적으로 영향을 미치지 않는 한, 5' 및 3' 말단의 한쪽 또는 모두 위에 뉴클레오티드의 추가 첨가(예를 들어, 하나 또는 둘)를 포함한다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표 1에 도시된 화합물 10101, 10673, 10674, 10677, 10679, 10707, 10680, 10681, 또는 10683의 구조를 가진다. 다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표 1에 도시된 화합물 10101, 10673, 10681, 또는 10683의 구조를 가진다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표 1에 도시된 화합물 10101 또는 10683의 구조를 가진다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 약 3개, 적어도 약 5개, 또는 적어도 약 7개의 잠금 뉴클레오티드를 함유할 수 있으나, 다양한 실시태양들에서 잠금 뉴클레오티드로 완전히 이루어지지 않는다. 일반적으로, 잠금 뉴클레오티드의 수와 위치는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 기술한 대로 인비트로 또는 인비보로 측정된 대로 miR-208a 및/또는 miR-208b 활성을 감소시키는 것이다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 넷 초과 또는 셋 초과 연속적인 비-잠금 뉴클레오티드를 가진 연속된 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 둘 초과 연속적인 비-잠금 뉴클레오티드를 가진 연속된 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 특정 실시태양들에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 둘 초과 연속적인 비-잠금 뉴클레오티드를 가진 연속된 뉴클레오티드를 함유하지 않는다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연속적인 비-잠금 뉴클레오티드의 단지 하나의 발생을 가질 수 있다. 이런 실시태양 또는 다른 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 씨드 영역에 상보적인 영역은 적어도 3개 또는 적어도 4개의 잠금 뉴클레오티드를 포함한다. 이런 실시태양은, 예를 들어, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다.
따라서, 다양한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 9개의 잠금 뉴클레오티드 또는 적어도 11개의 잠금 뉴클레오티드를 함유한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 3개의 비-잠금 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 9개의 잠금 뉴클레오티드 및 7개의 비-잠금 뉴클레오티드를 함유할 수 있거나 11개의 잠금 뉴클레오티드 및 5개의 비-잠금 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
잠금 뉴클레오티드의 패턴은 적어도 위치 1, 6, 10, 13 및 15가 잠금 뉴클레오티드인 것일 수 있다. 특정 실시태양에서, 위치 1, 5, 6, 8, 10, 11, 13, 15 및 16은 잠금 뉴클레오티드이며, 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이다. 다른 실시태양에서, 위치 1, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 15 및 16은 잠금 뉴클레오티드이며, 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이다. 일부 실시태양에서, 위치 1, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 14 및 16은 잠금 뉴클레오티드이며, 나머지 위치는 비-잠금 뉴클레오티드이다. 예시적 실시태양에서, 이런 패턴은 SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:4의 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 사용할 수 있다.
비-잠금 뉴클레오티드의 경우, 뉴클레오티드는 2'하이드록실에 대하여 2' 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2'변형은 2'데옥시일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 2'-변형된 뉴클레오티드의 합체(incorporation)는 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오티드의 저항성 및 상보적인 RNA와의 열적 안정성을 모두 증가시킬 수 있다. 2'위치에서의 다양한 변형들은 RNA 표적 또는 세포 기관과의 분자 상호작용을 손상시키지 않고 증가된 뉴클레아제 민감성을 제공하는 것들로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 이러한 변형들은 이들의 증가된 인비트로 또는 인비보 효력을 기반으로 선택될 수 있다.
일부 실시태양에서, 2'변형은 (치환될 수 있는) O-알킬, 할로 및 데옥시(H)로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 특정 실시태양에서, 실질적으로 모든, 또는 모든 비-잠금 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 2'위치가 변형되며, 예를 들어 O-알킬 (예를 들어, O-메틸), 할로 (예를 들어, 플루오르), 및 데옥시(H)로부터 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 2'변형은 O-메틸 및 플루오르로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 퓨린 뉴클레오티드는 각각 2'OMe를 가지며 피리미딘 뉴클레오티드는 각각 2'-F를 가진다. 특정 실시태양에서, 1 내지 약 5개의 2'위치, 또는 약 1 내지 약 3개의 2'위치는 변형되지 않은 상태로 (예를 들어, 2'하이드록실들로) 남겨진다.
본 발명에 따른 2'변형은 또한 소수의 탄화수소 치환기들을 포함한다. 탄화수소 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 알콕시알킬을 포함하며, 여기서 알킬 (알콕시의 알킬 부분 포함), 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 또는 비치환될 수 있다. 알킬, 알케닐, 및 알키닐은 C1, C2 또는 C3과 같은 C1 내지 C10 알킬, 알케닐 또는 알키닐일 수 있다. 탄화수소 치환기는 한 개 또는 두 개 또는 세 개의 비-탄소 원자를 포함할 수 있으며, N, O, 및/또는 S로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 2' 변형은 O-알킬, O-알케닐, 및 O-알키닐과 같은 알킬, 알케닐, 및 알키닐을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 예시적인 2'변형은 2'-O-알킬 (2'OMe 또는 2'OEt와 같은 C1-3 알킬), 2'-O-메톡시에틸 (2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸 (2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필 (2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸 (2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 치환을 포함한다.
특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 2'-플루오르, 2'-클로로, 2'-브로모, 및 2'-요오드와 같은 적어도 하나의 2'-할로 변형(예를 들어, 2'하이드록실 대신에)을 포함한다. 일부 실시태양에서, 2'할로 변형은 플루오르이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1 내지 약 5개의 2'-할로 변형(예를 들어, 플루오르), 또는 1 내지 약 3개의 2'-할로 변형(예를 들어, 플루오르)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-잠금 위치에서 모두 2'-플루오르인 뉴클레오티드, 또는 모든 비-잠금 피리미딘 뉴클레오티드 상에 2'-플루오르를 포함한다. 특정 실시태양에서, 2'-플루오르기는 독립적으로 디-, 트리-, 또는 비-메틸화된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 2'-데옥시 변형(예를 들어, 2'하이드록실의 경우 H)을 가질 수 있으며, 일부 실시태양들에서, 비-잠금 위치에 2 내지 약 10개의 2'-데옥시 변형을 함유하거나 모든 비-잠금 위치에 2'-데옥시를 함유한다.
예시적인 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 비-잠금 위치에서 2'OMe로 변형된 2'위치를 포함한다. 선택적으로, 비-잠금 퓨린 뉴클레오티드는 2'위치에서 2'OMe로 변형되고, 비-잠금 피리미딘 뉴클레오티드는 2'위치에서 2'-플루오르로 변형된다.
특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 변형 또는 "캡"을 추가로 포함한다. 캡은 5' 및/또는 3'-캡 구조일 수 있다. 용어 "캡" 또는 "말단-캡"은 (말단 리보뉴클레오티드에 대한) 올리고뉴클레오티드의 양쪽 말단에서 화학 변형을 포함하며 5'말단 상의 마지막 두 개의 뉴클레오티드 및 3'말단 상의 마지막 두 개의 뉴클레오티드 사이의 결합에서 변형을 포함한다. 본 발명에서 서술된 캡 구조는 RNA 표적 또는 세포 기관과의 분자 상호작용을 손상시키지 않고 올리고뉴클레오티드의 엑소뉴클레아제에 대한 저항성을 증가시킨다. 이러한 변형들은 이들의 증가된 인비트로 또는 인비보 효력을 기반으로 선택될 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡) 또는 3'-말단 (3'-캡)에서 또는 양쪽 말단 모두에서 존재할 수 있다. 특정 실시태양에서, 5'- 및/또는 3'-캡은 포스포로티오에이트 모노포스페이트, 무염기 잔기 (모이어티), 포스포로티오에이트 결합, 4'-티오 뉴클레오티드, 카보사이클릭 뉴클레오티드, 포스포로디티오에이트 결합, 반전된 뉴클레오티드(inverted nucleotide) 또는 반전된 무염기 모이어티(inverted abasic mioety)(2'-3'또는 3'-3'), 포스포로디티오에이트 모노포스페이트, 및 메틸포스포네이트 모이어티로부터 독립적으로 선택된다. 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 결합(들)은, 캡 구조의 일부인 경우, 일반적으로 5'말단 상의 두 개의 말단 뉴클레오티드 및 3'말단 상의 두 개의 말단 뉴클레오티드 사이에 위치한다.
특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 말단 포스포로티오에이트 모노포스페이트를 가진다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 엑소뉴클레아제의 작용을 억제함으로써 더 높은 효력을 지원할 수 있다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 및/또는 3'말단에 있을 수 있다. 포스포로티오에이트 모노포스페이트는 아래에 서술된 B가 염기이고, R이 2'변형인 다음 구조에 의해 정의된다:
Figure pct00002
캡 구조가 잠금 뉴클레오티드의 화학적 성질을 지원할 수 있는 경우, 캡 구조는 본 발명에 기술된 대로 잠금 뉴클레오티드를 합체할 수 있다.
일부 실시태양에서 포스포로티오에이트 결합은 5' 및 3'말단상의 마지막 2개의 뉴클레오티드(예를 들어, 캡 구조의 일부로서)들 사이에 존재할 수 있거나 포스포다이에스터 결합과 교대로 존재할 수 있다. 이런 실시태양 또는 다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' 및 3'말단 중 하나 또는 모두에서 적어도 하나의 말단 무염기 잔기를 포함할 수 있다. 무염기 모이어티는 아데노신, 구아닌, 시토신, 우라실 또는 티민과 같은 일반적으로 인정되는 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오티드 염기를 포함하지 않는다. 따라서 이러한 무염기 모이어티는 뉴클레오티드 염기가 부족하거나 또는 1'위치에서 다른 비-뉴클레오티드 염기 화학 그룹을 가진다. 예를 들어, 무염기 뉴클레오티드는 역 무염기 뉴클레오티드(reverse abasic nucleotide)일 수 있으며, 예를 들어, 역 무염기 포스포라미디트는 (3'아미디트 대신) 5'아미디트를 통해 결합되고 5'-5'포스페이트 결합을 초래한다. 폴리뉴클레오티드의 5'및 3'말단에 대한 역 무염기 뉴클레오시드의 구조가 아래에 도시된다.
Figure pct00003
안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있다. 포스포로티오에이트 결합은 안티센스 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제 절단(cleavage)에 대해 보다 저항성으로 만들기 위해 사용되었다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 부분적으로 포스포로티오에이트 결합될 수 있거나, 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합은 포스포디에스터 결합과 번갈아 올 수 있다. 그러나, 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 완전히 포스포로티오에이트 결합된다. 다른 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1개 내지 5개 또는 1개 내지 3개 포스페이트 결합을 가진다.
한 실시태양에서, 본 발명은 miR-208a 및 miR-208b를 포함하는 miR-208 패밀리 miRNA의 발현(예를 들어, 풍부)을 억제하는 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 일부 실시태양에서, 심장 및/또는 골격 근육 조직에서 miR-208a 및 miR-208b의 각각의 발현 또는 풍부를 특정 방식으로 억제하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 신진대사 이상과 같은 miR-208 패밀리 miRNA와 관련된 또는 필요로 하는 질병 또는 이상을 가진 환자들을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제 또는 억제제에 의한 지방산 신진대사를 조절하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명에 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 및/또는 miR-208b 서열에 적어도 부분적으로 상보적인, 예를 들어, miR-208a 및/또는 miR-208b 서열에 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 및/또는 miR-208b 서열에 실질적으로 상보적일 수 있는데, 즉 miR-208a 및/또는 miR-208b 서열에 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다. 한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 및/또는 miR-208b 서열에 완전히 상보적(즉, 100% 상보적)인 서열을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용된 miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제는 miR-208a 또는 miR-208b 뉴클레오티드 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용된 miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제는 인간 miR-208a 및/또는 miR-208b(또는 상응하는 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)의 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 선택적으로 포스포로티오에이트 주쇄와 잠금 및 비 잠금 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 3개 또는 적어도 5개 또는 적어도 7개의 잠금 뉴클레오티드 및 적어도 하나의 비 잠금 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 실질적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 또는 miR-208b의 표적 서열에 대해 1 내지 4개 미스매치(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개 미스매치)를 가질 수 있다. 예시적 실시태양에서, 잠금 뉴클레오티드는 2' 내지 4' 메틸렌 다리를 가질 수 있다. 일부 실시태양에서, 하나 이상의 잠금 뉴클레오티드를 가진 이런 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전체 포스포로티오에이트 주쇄를 가진다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 전장 또는 절단된 miR-208a 또는 miR-208b에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, 이로 필수적으로 이루어지거나 이루어질 수 있다. 이런 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 6 내지 22개 뉴클레오티드 길이이거나 약 10 내지 18개 뉴클레오티드 길이이거나 약 11 내지 약 16개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시태양에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 14, 15, 16 또는 17개 뉴클레오티드 길이이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' - TGCTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:1)의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고 또는 5' - TGTTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:2)의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열 5' - CTTTTTGCTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:3) 또는 5' - CCTTTTGTTCGTCTTA - 3'(SEQ ID NO:4)를 포함하며, 이로 필수적으로 이루어지거나 이루어진다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 완전히 포스포로티오에이트 연결될 수 있다.
본 발명의 방법들에서 사용하기 위한 예시적 억제제들은 아래 표 1에 나열된 화합물의 구조를 가진 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. miR-208a 및 miR-208b 활성을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 전문이 참조로 본 발명에 포함된 WO2012/083005로 공개된 국제특허출원 No. PCT/US2011/065121에 기술된다.
예시적 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제
Cmpd #
(M) 		별칭 서열( 5' 에서 3') SEQ ID NO : 길이
10101 208a_DNA_LNA_16_PS lCs;dTs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 13 16
10570 208fam_optdes1 lTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;lA 14 11
10571 208fam_optdes2 lTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 15 11
10572 208fam_optdes3 lTs;dGs;lCs;dAs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;lA 16 11
10573 208fam_optdes4 lTs;lGs;dCs;dAs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 17 11
10673 208a LNA C_T_DNA_16_1 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 18 16
10674 208a_ LNA C_T_DNA_16_2 lCs;dTs;dTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;lTs;lCs;lTs;lTs;dA 19 16
10677 208a_ LNA C_T_DNA_16_3 lCs;lTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;lTs;lCs;lTs;lTs;dA 20 16
10679 208_LNA_opt_1 lCs;dTs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;dA 21 16
10680 208_LNA_opt_2 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;dTs;lA 22 16
10681 208_LNA_opt_3 lCs;dTs;lTs;lTs;dTs;lTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 23 16
10682 208_LNA_opt_4 lCs;dTs;lTs;dTs;lTs;dTs;lGs;dCs;lTs;dCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 24 16
10683 208_LNA_opt_5 lCs;dTs;dTs;lTs;lTs;dTs;lGs;dCs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA 25 16

10707
 208b_DNA_LNA_16_PS lCs;dCs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 26 16
10718 208a like_15_1 lTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 27 15
10719 208a like_15_2 lTs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 28 15
10720 208a like_15_3 lTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dCs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;dA 29 15
10721 208a like_15_4 lTs;dTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;dA 30 15
10722 208a like_15_5 lTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;lA 31 15
10723 208a like_15_6 lTs;dTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;lA 32 15
10724 208b like_15_1 lCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 33 15
10725 208b like_15_2 lCs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 34 15
10726 208b like_15_3 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;dA 35 15
10727 208b like_15_4 lCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 36 15
10728 208b like_15_5 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 37 15
10729 208b like_15_6 lCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dCs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;dA 38 15
10730 208b _15_1 lCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 39 15
10731 208b _15_2 lCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 40 15
10732 208b _15_3 lCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;dA 41 15
10733 208a like_15_7 lTs;dTs;lTs;dTs;lTs;dGs;dCs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 42 15
10734 208b like_15_7 lCs;dTs;lTs;dTs;lTs;dGs;dCs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 43 15
10735 208b_15_4 lCs;dTs;lTs;dTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 44 15
10736 208a like_14_1 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 45 14
10737 208a like_14_2 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 46 14
10738 208a like_14_3 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 47 14
10739 208a like_14_4 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dCs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;lA 48 14
10740 208a like_14_5 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dCs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;dA 49 14
10741 208a like_14_6 lTs;dTs;lTs;dTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 50 14
10742 208b_14_1 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 51 14
10743 208b_14_2 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 52 14
10744 208b_14_3 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 53 14
10745 208b_14_4 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;lA 54 14
10746 208b_14_5 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dTs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;dA 55 14
10747 208b_14_6 lTs;dTs;lTs;dTs;dGs;lTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 56 14
10748 208a like_13_1 lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 57 13
10749 208a like_13_2 lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 58 13
10750 208a like_13_3 lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 59 13
10751 208a like_13_4 lTs;dTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 60 13
10752 208b_13_1 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 61 13
10753 208b_13_2 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 62 13
10754 208b_13_3 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 63 13
10755 208b_13_4 lTs;dTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lA 64 13
10756 208a like_11_1 lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 65 11
10757 208a like_11_2 lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 66 11
10758 208b_11_1 lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 67 11
10759 208b_11_2 lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA 68 11
10760 208b_16_1 lCs;dCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 69 16
10761 208b_16_2 lCs;dCs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;dA 70 16
10762 208b_16_3 lCs;dCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;dTs;lA 71 16
10763 208b like_16_1 lCs;dCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA 72 16
10764 208b like_16_2 lCs;dCs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;lTs;dA 73 16
10765 208b like_16_3 lCs;dCs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;dTs;lA 74 16
10775 208b_15_5 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dAs;lT 75 15
10776 208b_15_6 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lAs;lT 76 15
10777 208b_15_7 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;dAs;lT 77 15
10778 208b_15_8 lTs;lTs;dTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lAs;lT 78 15
10779 208b_15_9 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lAs;dT 79 15
10780 208b_15_10 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;lAs;dT 80 15
10781 208b_15_11 lTs;lTs;dTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lAs;dT 81 15
10782 208b_15_12 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;dAs;lT 82 15
10783 208b_15_13 lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;lAs;dT 83 15
10784 208b_14_7 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dAs;lT 84 14
10785 208b_14_8 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lAs;lT 85 14
10786 208b_14_9 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;dAs;lT 86 14
10787 208b_14_10 lTs;dTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lAs;lT 87 14
10788 208b_14_11 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lAs;dT 88 14
10789 208b_14_12 lTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;dGs;lTs;lCs;dTs;lTs;lAs;dT 89 14
10790 208b_14_13 lTs;dTs;lTs;dGs;lTs;dTs;lCs;lGs;lTs;lCs;lTs;lTs;lAs;dT 90 14
10791 208b_14_14 lTs;lTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;dAs;lT 91 14
10792 208b_14_15 lTs;lTs;lTs;dGs;dTs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;lTs;lTs;lAs;dT 92 14
10793 208b_16_4 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;lGs;dTs;lTs;dCs;lGs;dTs;dCs;lTs;dTs;lAs;dT 93 16
표 1의 표시의 설명
deoxy A dA
deoxy G dG
deoxy C dC
deoxy T dT
lna A lA
lnaG lG
lna C lC
lna T lT
deoxy A P=S dAs
deoxy G P=S dGs
deoxy C P=S dCs
deoxy T P=S dTs
lna A P=S lAs
lnaG P=S lGs
lna C P=S lCs
lna T P=S lTs
특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 10101, 10673, 10674, 10677, 10679, 10707, 10680, 10681 또는 10683 또는 표 1에 기술된 다른 올리고뉴클레오티드이다.
고체상 합성법(solid phase synthesis)에 의한 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 합성은 잘 알려져 있으며 폴리뉴클레오티드 합성을 위한 새로운 화학적 방법(New Chemical Methods for Synthesizing Polynucleotides). Caruthers MH, Beaucage SL, Efcavitch JW, Fisher EF, Matteucci MD, Stabinsky Y. Nucleic Acids Symp . Ser . 1980;(7):215-23에서 검토되었다.
선택적으로, 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 당-인산 주쇄(sugar-phosphate backbone) 대신 펩티드-기본 주쇄(peptide-based backbone)를 포함하는 펩티드 핵산(peptide nucleic acids; PNAs)을 포함할 수 있다. 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 다른 변형된 당 또는 포스포다이에스터 변형이 고려될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함할 수 있는 다른 화학적 변형들은 2'-O-알킬(예를 들어, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로, 및 4' 티오 변형과 같은 당 변형(sugar modification), 및 하나 이상의 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 모르폴리노(morpholino), 또는 포스포노카복실레이트 결합(phosphonocarboxylate linkages)과 같은 주쇄 변형(backbone modifications)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다(예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 No. 6,693,187 및 7,067,641 참조). 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각 염기(base)에 2'O-메틸 당 변형을 포함하며 포스포로티오에이트 결합으로 연결된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 짧은 길이의 것들은(예를 들어, 뉴클레오티드 15개 미만) 하나 이상의 LNA, 바이사이클릭 뉴클레오시드(bicyclic nucleoside), 포스포노포르메이트(phosphonoformates), 2'O-알킬 변형 등과 같은 하지만 여기에 한정되지 않는 친화도 증가 변형(affinity enhancing modifications)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' 및 3' 양쪽 말단 모두에 2'-O-메톡시에틸-변형된 리보뉴클레오티드를 포함하며 적어도 10개의 디옥시리보뉴클레오티드를 중심에 가지는 2'-O-메톡시에틸 "갑머(gapmers)"이다. 이러한 "갑머"는 RNA 표적의 RNase H-의존적 분해 메커니즘을 유발할 수 있다. 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함되는 미국특허 6,838,283에 기술된 것과 같은 안정성을 증가시키고 효율을 향상시키기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 다른 변형들은 당업계에 알려졌으며 본 발명의 방법에 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 인 비보 전달 및 안정성을 돕기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이의 3' 말단에서 콜레스테롤 모이어티, 비타민, 지방산, 탄수화물 또는 글리코시드, 펩티드, 또는 다른 소형 분자 리간드와 같은 스테로이드에 연결될 수 있다.
일부 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안타고미르(antagomirs)이다. "안타고미르"는 miR-208a 및/또는 miR-208b 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 단일 가닥의, 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드들이다. 안타고미르는 2'-O-메틸-당 변형(2'-O-methyl-sugar modifications)과 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 안타고미르는 오직 변형된 뉴클레오티드만을 포함한다. 안타고미르는 부분 또는 전체 포스포로티오에이트 주쇄를 형성하는 하나 또는 그 이상의 포스포로티오에이트 연결(phosphorothioate linkage)을 포함할 수 있다. 인 비보 전달(delivery) 및 안정(stability)을 돕기 위하여, 안타고미르는 자신의 3' 말단에서 콜레스테롤 또는 다른 모이어티와 연결될 수 있다. miR-208a 및/또는 miR-208b를 억제하기에 적합한 안타고미르는 약 8 내지 20 뉴클레오티드 길이 또는 약 10 내지 18 뉴클레오티드 길이 또는 약 11 내지 약 16 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 안타고미르는 miR-208a 또는 miR-208b 서열에 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보적일 수 있다. 일부 실시태양에서, 안타고미르는 miR-208a 또는 miR-208b 서열과 실질적으로 상보적일 수 있으며, 즉 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상보적이다. 다른 실시태양에서, 안타고미르는 miR-208a 또는 miR-208b 서열에 100% 상보적이다. 안타고미르는 miR-208a 또는 miR-208b를 위한 전구체 miRNA 서열(pre-miRNA) 또는 1차 miRNA 서열(pri-miRNA)에 실질적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있다.
또한 miR-208a 및 miR-208b의 효현제들이 본 발명에 제공된다. miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 효현제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 한 실시태양에서, miR-208a 효현제는 SEQ ID NO: 5-9와 같은 miR-208a 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시태양에서, miR-208a 효현제는 SEQ ID NO: 9와 같은 성숙한 miR-208a 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시태양에서, miR-208a 효현제는 SEQ ID NO: 5와 같은 miR-208a에 대한 pre-miRNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 다른 실시태양에서, miR-208b 효현제는 miR-208b를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시태양에서, 효현제는 SEQ ID NO: 11과 같은 성숙한 miR-208b 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시태양에서, miR-208b 효현제는 SEQ ID NO: 10과 같은 miR-208b에 대한 pre-miRNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
miR-208a 및/또는 miR-208b 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 약 18 내지 약 2000 뉴클레오티드 길이, 약 70 내지 약 200 뉴클레오티드 길이, 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드 길이 또는 약 18 내지 약 25 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 성숙한 miR-208a, 성숙한 miR-208b, pre-miR-208a, 또는 pri-miR-208b 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 화학적 변형, 예를 들어, 잠금 핵산(locked nucleic acids), 펩티드 핵산(peptide nucleic acids), 당 변형(sugar modification), 예를 들어, 2'-O-알킬(예를 들어, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸), 2'-플루오로, 및 4' 티오 변형 및 주쇄 변형(backbone modifications), 예를 들어, 하나 이상의 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 모르폴리노(morpholino), 또는 포스포노카복실레이트 결합(phosphonocarboxylate linkages)을 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, miR-208 서열(예를 들어, 성숙한 miR-208a, 성숙한 miR-208b, pre-miR-208a, 또는 pri-miR-208b 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 콜레스테롤, 비타민, 지방산, 탄수화물 또는 글리코시드, 펩티드 또는 다른 소형 분자 리간드와 같은 스테로이드에 연결된다.
본 발명에 기술된 miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제 또는 효현제 중 임의의 것은 miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제 또는 효현제를 암호화하는 발현 벡터에 세포를 전달하거나 표적 세포에 억제제 또는 효현제 자체를 직접 전달함으로써 표적 세포(예를 들어, 심장 또는 골격근 세포)에 전달될 수 있다. "벡터"는 관심 핵산을 세포의 내부로 전달하기 위해 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 친양쪽성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하지만 여기에 제한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서 용어 "벡터"는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 바이러스성 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나 여기에 제한되지 않는다. 발현 구조체(expression construct)는 살아있는 세포(living cell)에서 복제되거나 또는 합성적으로 만들어질 수 있다. 이러한 응용 목적을 위하여 용어 "발현 구조체", "발현 벡터", 및 "벡터"라는 용어는 일반적이고, 설명적인 의미에서 본 발명의 출원을 설명하기 위해 상호 교환적으로 사용되며 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제 또는 효현제를 발현하기 위한 발현 벡터는 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 효현제 올리고뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 한 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 발현된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열은 miR-208a(예를 들어, SEQ ID NO: 9)의 성숙한 서열 또는 miR-208b(SEQ ID NO: 11)의 성숙한 서열에 부분적으로 또는 완벽하게 상보적이다. 다른 실시태양에서, miR-208a 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 발현 벡터는 인간 pre-miR-208a 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 5)을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 다른 실시태양에서, miR-208b 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 발현 벡터는 pre-miR-208b 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 10)을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 본 발명에서 사용된 "작동가능하게 연결된(operably linked)" 또는 "전사 조절 하에서(under transcriptional control)"라는 문구는 프로모터가 RNA 중합효소 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 전사의 개시를 제어하기 위해 폴리뉴클레오티드에 대한 관계에서 정확한 위치와 방향에 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 대로, "프로모터"는 세포의 합성 기관(synthetic machinery) 또는 유전자의 특정 전사를 시작하기에 필요한 유도된 합성 기관(induced synthetic machinery)에 의해 인식된 DNA 서열을 나타낸다. 적합한 프로모터는 RNA 중합효소I(polI), RNA 중합효소II(polII), RNA 중합효소III(polIII), 및 바이러스성 프로모터(viral promoter)(예를 들어, 인간 세포거대바이러스 즉각 조기 유전자 프로모터(human cytomegalovirus (CMV) immediate early gene promoter), SV40 초기 프로모터(SV40 early promoter), 및 라우스육종바이러스 긴말단반복(the Rous sarcoma virus long terminal repeat)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 한 실시태양에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 특히 관심있는 것은 근육 특이적 프로모터들이며, 더욱 특히 심장 특이적 프로모터들이다. 이들은 미오신 경쇄-2 프로모터(the myosin light chain-2 promoter)(Franz 외. (1994) Cardioscience, Vol. 5(4):235-43; Kelly 외 (1995) J. Cell Biol, Vol. 129(2):383-396), 알파 액틴 프로모터(the alpha actin promoter)(Moss 외 (1996) Biol. Chem ., Vol. 271(49):31688-31694), 트로포닌 1 프로모터(the troponin 1 promoter)(Bhavsar 외. (1996) Genomics, Vol. 35(1): 11-23); Na+/Ca2+ 교환기 프로모터(the Na+/Ca2+ exchanger promoter)(Barnes 외 (1997) J. Biol . Chem., Vol. 272(17):11510-11517), 디스트로핀 프로모터(the dystrophin promoter)(Kimura 외. (1997) Dev . Growth Differ., Vol. 39(3):257-265), 알파7 인테그린 프로모터(the alpha7 integrin promoter)(Ziober and Kramer (1996) J. Bio . Chem., Vol. 271(37):22915-22), 뇌성나트륨이뇨펩타이드 프로모터(the brain natriuretic peptide promoter)(LaPointe 외 (1996) Hypertension, Vol. 27(3 Pt 2):715-22) 및 알파 B-크리스탈린/작은열충격단백질 프로모터(the alpha B-crystallin/small heat shock protein promoter)(Gopal-Srivastava (1995) J. MoI . Cell . Biol, Vol. 15(12):7081-709O), 알파 미오신 중쇄 프로모터(alpha myosin heavy chain promoter)(Yamauchi-Takihara 외 (1989) Proc . Natl . Acad . Sci USA, Vol. 86(10):3504-3508) 및 ANF 프로모터(ANF promoter)(LaPointe 외. (1988) J. Biol . Chem., Vol. 263(19):9075-9078)를 포함한다. 한 실시태양에서, 조직-특이적 프로모터는 지방세포 단백질 2(ap2)/지방산 결합 단백질 4(FABP4) 프로모터 또는 PPARγ 프로모터와 같은 지방세포-특이적 프로모터이다.
특정 실시태양에서, miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 miR-208a 또는 miR-208b 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 유도성 프로모터(inducible promoter)일 수 있다. 유도성 프로모터들이 당업계에 공지되어 있으며 테트라사이클린 프로모터(tetracycline promoter), 메탈로티오네인 IIA 프로모터(metallothionein IIA promoter), 열충격 프로모터(heat shock promoter), 스테로이드/갑상선호르몬/레티노산 반응 요소(steroid/thyroid hormone/retinoic acid response elements), 아데노바이러스 후기 프로모터(the adenovirus late promoter), 및 유도성 생쥐 유방 종양 바이러스 LTR(the inducible mouse mammary tumor virus LTR)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
발현 구조체와 핵산을 세포에 전달하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 인산칼슘 공동 침전, 전기천공법, 미세주사, DEAE-덱스트란, 리포펙션, 폴리아민 형질감염 시약을 사용하는 형질감염, 세포 초음파, 고속 미세추진체를 사용하는 유전자 충돌 및 수용체-매개 형질감염을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 처리 이후 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제를 청소 또는 제거하기 위한 방법을 포함한다. 이 방법은 폐 조직에 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제에 대한 결합 부위를 과다발현하는 것을 포함할 수 있다. 결합 부위 영역은 바람직하게는 miR-208a 및/또는 miR-208b에 대한 씨드 영역의 서열을 포함한다. 씨드 영역은 표적 인식에 중요한 염기 2-8에 미치는 miRNA의 5' 부분이다. 일부 실시태양에서, 결합 부위는 갑상선 호르몬 수용체 관련 단백질 1(THRAP1, 즉 MED 13), Sox6, Sp3, 미오스타틴, PUR베타 및 빠른 골격근 단백질 유전자와 같은 miR-208a 및/또는 miR-208b의 하나 이상의 표적의 3'UTR로부터의 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 억제제(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 효현제는 다양한 거대분자 어셈블리 또는 조성물 내에 포함될 수 있다. 전달을 위한 이러한 복합체는 다양한 리포솜, 나노입자, 및 미셀을 포함할 수 있으며 환자로의 전달을 위해 제제화된다. 복합체는 세포막 침투를 개시하기 위해 하나 이상의 융합 유도성(fusogenic) 또는 친유성(lipophilic) 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분자들은 예를 들어, 미국특허 7,404,969 및 미국특허 7,202,227에서 서술되며, 그 전체가 본 발명에 참조로서 포함된다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 참조로서 포함된 WO 2010/129672에 기술된 것과 같은 세포 전달을 보조하기 위한 펜던트 친유성 그룹을 더 포함할 수 있다.
조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 하나를 포함하는 다수의 치료적 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 조성물 또는 제제는 본 발명에 기술된 적어도 2, 3, 4 또는 5개 miRNA 억제제를 사용할 수 있다.
본 발명의 억제제(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 효현제는 다양한 약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 약학적 조성물은 의도된 사용에 적합한 형태로 제조될 것이다. 일반적으로, 이는 발열원(pyrogens) 뿐만 아니라 인간 또는 동물에 해로울 수 있는 다른 불순물이 없는 조성물의 제조를 필요로 할 것이다. 예시적인 전달/제제 시스템은 콜로이드 분산 시스템, 고분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 수중유 에멀전, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 상업적으로 이용 가능한 본 발명의 핵산을 심장 및 골격 근육 조직으로 전달하기에 적합한 지방 에멀전은 Intralipid?, Liposyn?, Liposyn?II, Liposyn?III, Nutrilipid, 및 다른 유사한 지질 에멀전을 포함한다. 인비보 전달 비히클로 사용하기 위한 바람직한 콜로이드 시스템은 리포솜(즉, 인공 막소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 또한 예시적인 제제가 그 전체로 본 발명에 참조로서 포함되는 US 5,981,505; US 6,217,900; US 6,383,512; US 5,783,565; US 7,202,227; US 6,379,965; US 6,127,170; US 5,837,533; US 6,747,014; 및 WO03/093449에서 개시된다.
약학적 조성물 및 제제는 전달 비히클을 안정하게 만들고 표적 세포에 의해 흡수될 수 있도록 적절한 염 및 완충액을 사용할 수 있다. 본 발명의 수용성 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 수성 매질(aqueous medium)에 용해 또는 분산된 억제제 폴리뉴클레오티드들(예를 들어, 리포솜 또는 다른 복합체)을 포함하는 유효한 양의 전달 부형제를 포함한다. "약학적으로 허용가능한" 또는 "약리학적으로 허용가능한"은 동물 또는 사람에게 투여되었을 때, 해로운, 알레르기의, 또는 다른 뜻밖의(untoward) 반응들을 만들지 않는 분자 독립체들(molecular entities) 및 조성물을 나타낸다. 여기에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"는 용매, 버퍼, 용액, 분산매, 코팅, 항균 및 항진균 약품(antibacterial and antifungal agents), 등장성 및 흡수 지연 약품(isotonic and absorption delaying agents) 및 인간에 투여하기 적합한 약과 같은 약의 제제화에 사용이 허용되는 기타 같은 종류의 것을 포함한다. 약학적 활성 물질들을 위한 이와 같은 매질(media) 및 약품(agent)의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 보충적인 활성 성분들 또한 조성물에 혼합될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 또는 전달은 표적 조직이 그 경로를 통해 이용할 수 있는 한 임의의 경로를 통할 수 있다. 예를 들어, 투여는 피내, 피하, 근육내, 복강내 또는 정맥내 주사, 또는 표적 조직(예를 들어, 심장 조직) 내로의 직접 주사에 의할 수 있다. 본 발명에 개시된 올리고뉴클레오티드의 안정성 및/또는 효력은 피하, 피내 및 근육내를 포함하는 편리한 투여 경로를 고려한다. 또한 miRNA 서열을 포함하는 miRNA 억제제를 포함하는 약학적 조성물은 카테터 시스템 또는 치료 물질을 심장으로 전달하기 위해 관상 순환을 격리시키는 시스템에 의해 투여될 수 있다. 치료 물질을 심장 및 관상 맥관구조로 전달하기 위한 다양한 카테터 시스템은 당업계에 알려져 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 카테터-기반 전달 방법 또는 관상 격리 방법의 일부 비제한적인 예들은 그 전체가 본 발명에 참조로서 포함되는 미국특허 6,416,510; 미국특허 6,716,196; 미국특허 6,953,466, WO 2005/082440, WO 2006/089340, 미국특허공보 2007/0203445, 미국특허공보 2006/0148742, 및 미국특허공보 2007/0060907에 개시된다.
특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 25mg/kg 이하의 투여량, 10mg/kg 이하의 투여량 또는 5mg/kg 이하의 투여량으로 투여된다. 이런 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 조성물은 근육내 또는 피하 주사 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
또한 조성물 또는 제제는 비경구 또는 복막내로 투여될 수 있다. 예로써, 유리 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서 콘주게이트의 용액은 물에서 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합하여 제조될 수 있다. 또한 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건 하에서 이들 제제들은 미생물의 성장을 막기 위해 일반적으로 방부제를 포함한다.
주사용 또는 카테터 전달에 적합한 약학적 형태는 예를 들어, 살균 수성 용액 또는 분산액 및 살균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 살균 분말 를 포함한다. 일반적으로 이들 제제는 살균되며 쉬운 주입성이 존재할 정도로 유동성이다. 제제는 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하며 세균 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대비하여 보관되어야 한다. 적합한 용매 또는 분산매는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및 식물 오일을 포함할 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등의 다양한 항균 및 항진균 물질에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 적합할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에서 사용하여 이루어질 수 있다.
살균 주사 용액은 적절한 양의 컨주게이트를 용매에 원하는 임의의 다른 성분(예를 들어, 상기에서 열거한 것)과 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 살균 활성 성분들을 기본적인 분산매와 원하는 다른 성분들, 예를 들어 앞에서 열거한 것들을 포함하는 살균 비히클에 혼합함으로써 제조된다. 살균 주사 용액 제조를 위한 살균 분말의 경우, 바람직한 제조방법은 상기 살균-여과된 용액으로부터 어떠한 추가적으로 요구되는 성분들을 더한 활성 성분(들)의 파우더를 생산하는 진공-건조 및 동결-건조 기술을 포함한다.
제제에서, 용액들은 되도록 투약 제제에 적합한 방식 및 치료에 효과적인 양으로 투여된다. 제제는 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약 형태로 쉽게 투여될 수 있다. 수용액에서 비경구적 투여를 위해서, 예를 들어, 용액은 일반적으로 적절하게 완충되고, 액상 희석액은 먼저 예를 들어 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성을 만든다. 이러한 수용액은 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 특히 본 명세서의 관점에서, 당업계의 통상적인 기술을 가진자에게 이미 알려진 바대로 살균 수성 매질이 사용된다. 예로써, 단일 복용량은 1ml의 등장성 NaCl 용액에 용해되고 1000ml의 피하주액 유체(hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나 또는 예정된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580 참조). 치료받는 대상의 질환에 따라 용량의 일부 변화는 필연적으로 생기게 된다. 투여에 대해 책임을 지는 사람은 어떤 일이 있어도 개개의 대상을 위한 적합한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여에 있어, 제형들은 FDA 생물학 기준 사무국에 의해 요구되는 살균성, 발열원성, 일반 안전 및 순도 기준을 만족해야만 한다.
임의의 도면 및 부록을 포함하는 모든 공개공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공개공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함될 것으로 나타내어진 경우와 동일한 정도로 참조로 본 발명에 포함된다.
본 발명은 제한적으로 해석되지 않는 다음 추가 실시예에 의해 추가로 설명된다. 당업자는 본 발명의 관점에서 개시된 특정 실시태양에 여러 변화를 가할 수 있고 본 발명의 취지와 범위를 벗어나지 않고 유사하거나 동일한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 안다.
실시예
실시예 1: AntimiR-208은 나이 유도 체중 증가를 억제한다
생쥐에서 miR-208 억제제의 잠재적 치료 효과를 연구하면서, antimiR-208에 의해 장기간 연구를 위해 치료된 동물들은 생쥐가 일반적으로 나타내는 체중의 나이 유도 증가를 나타내지 않았던 반면, 대조군 치료(M-10591) 또는 식염수 치료된 생쥐는 나타내었다. 치료는 8주령(20-25g 사이의 체중)에 시작하였고 6개월까지 지속하였고, 그동안 생쥐는 1, 2 및 3일에 3 x 25mg/kg 및 2주에 한 번 25mg/kg의 antimiR-208(M-10101), 비 표적화 대조군(M-10591) 또는 필적할만한 부피의 식염수의 부하용량을 투여받았다. M-10591은 꼬마선충 특이적 miRNA를 표적화하며 다음 서열: TCCTAGAAAGAGTAGA (SEQ ID NO: 12)을 가진다. M-10101과 같이, M-10591은 또한 9개 LNA 변형 뉴클레오티드를 포함하며 16개 뉴클레오티드 길이이다. M-10101로 치료된 생쥐는 대조군 치료 또는 식염수 주사 동물과 비교하여 현저하게 높은 심장 대 체중 비율을 나타내었다. 이런 차이는 연구 과정 동안 심장 중량(HW)의 증가 때문이 아니라, 체중의 더 적은 증가 때문이었다(도 1).
2주마다 25mg/kg의 M-10101로 오랜 기간 동안 8주령 위스타 쥐에게 투여했을 때 필적할만한 관찰이 이루어진 반면, 이런 효과는 M-10591-치료 그룹에서 관찰되지 않았다(도 2).
실시예 2: AntimiR-208은 고 지방식사 유도 비만에 대한 저항성을 제공한다
antimiR-208a 올리고뉴클레오티에 의한 장기간 치료의 효과를 측정하기 위해서, 6주령, 수컷 C57B16 생쥐에 꼬마선충 특이적 miRNA(M-10591)에 대해 영향을 미치는 식염수 또는 대조군 올리고뉴클레오티드에 용해된 10mg/kg의 LNA-변형 antimiR-208a(M-10101)로 피하로 주사하였다. 생쥐에 3일 동안 연속 주사한 후 실험 내내 매주 유지 주사를 제공하였다. antimiR-208a(M-10101)의 피하 전달은 노던 블럿 분석에 의해 탐지된 대로 심장에서 miR-208a 수준을 효과적으로 억제하였다(도 3a). antimiR-208a 또는 대조군 antimiR에 의한 6주 동안의 생쥐의 치료는 심장 중량, 심장 수축 또는 심박률에 영향을 미치지 않았다(도 3b-d).
체중과 신진대사를 조절하는데 miR-208a의 역할을 추가로 조사하기 위해서, 고 지방(HF) 식사에 반응하는 체중 증가에 대한 antimiR-208a의 효과를 테스트하였다. 6주령 수컷 C57B16 생쥐에 연속 3일 동안 10mg/kg 체중의 antimiR-208a(M-10101) 또는 대조군 antimiR(M-10591)으로 피하 주사하였다. 3일째에, 생쥐에게 HF 식사(60% kcal/fat) 또는 정상 식사(NC; 10% kcal/fat)를 제공하였다. 생쥐를 계량하고 연구 내내 매주 10mg/kg의 유지 투여량을 제공하였다. HF 식사를 하고 대조군 antimiR로 치료된 생쥐는 6주 내에 75% 체중이 증가한 반면, HF 식사를 한 antimiR-208a 치료 생쥐는 체중에 29% 증가를 나타내었고(도 4a-b), 이는 정상 식사로 유지되고 대조군 antimiR 또는 antimiR-208a로 치료된 생쥐에 필적할만한 것이었다(각각 28% 및 25%).
NMR 스펙트럼은 치료 그룹들 사이의 체중에 차이는 도 4c의 각 막대에서 흰색 부분으로 나타낸 지방 중량의 차이 때문이었다는 것을 나타내었다. 이런 발견들과 일치하여, 백색 및 갈색 지방을 모두 포함하는 내장 백색 지방 조직 및 견갑하근 갈색 지방 조직은 지방 질량 및 지방세포 크기를 기초로 한, 대조군 antimiR 치료 동물들과 비교하여 HF 식사 및 NC에 대해 atnimiR-208a 치료 그룹들에서 현저하게 더 작았다(도 4d-g). 혈청 트라이글리세라이드 및 콜레스테롤 수준은 또한 HF 식사를 한 antimiR-208a 치료 생쥐에서 감소하였다(도 4h 및 4i). 유사하게, HF 식사를 한 대조군 동물들에서 보인 지방간은 antimiR-208a에 의한 치료로 약해졌다(도 4f).
HF 식사 유도 비만은 글루코오스 불인내성을 유발한다. NC를 한 antimiR-208a 치료 생쥐는 글루코오스 인내성 테스트(GTT)에 의해 측정된 대로, 정상적인 글루코오스 반응을 나타내었다(도 5a). 글루코오스 인내성 테스트는 밤새 금식 후 실행하였다. 기준선 측정은 아쿠-첵 컴팩트 플러스 글루코미터(로체)(Accu-Chek Compact Plus glucometer(Roche))를 사용하여 실시하였다. 뒤이어 생쥐에게 1mg/g 글루코오스로 복강으로 주사하였다. 그런 후에 글루코오스 주사 후 글루코오스 수준을 15, 30, 60 및 120분에 측정하였다. HF 식사를 한, 대조군 antimiR-치료, 비만 생쥐는 지방 질량과 글루코오스 불인내성에 증가를 나타내었다(도 4d 및 5a). 반대로, antimiR-208a 치료 생쥐는 GTT 및 곡선 아래 계산된 면적에 의해 나타낸 대로 6주의 HF 식사 후 정상적인 글루코오스 반응을 나타내었다(도 5a 및 5b).
antimiR-208a 치료 생쥐로부터의 금식 인슐린 수준은 대조군 antimiR 치료 생쥐의 수준보다 현저하게 낮았다(도 5c). 유사하게, 신체 지질 함량을 반영하는 지방세포 유래 순환 호르몬(Frederich et al., Nat. Med., Vol. 1: 1311-1314, 1995)인 렙틴의 수준은 NC 및 HF 식사를 한 동물들에서 대조군 antimiR과 비교한 antimiR-208a에 의해 감소하였다(도 5d). AntimiR-208a는 신체적 활동 또는 식품 소비에 영향을 미치지 않는다(데이터는 도시되지 않음). 이런 발견들은 miR-208a 억제가 전신 인슐린 민감성을 개선한다는 것을 나타낸다. miR-208a는 심근세포에서만 발현되기 때문에(Callis et al., J. Clin. Invest., Vol. 119: 2772-2786, 2009; van Rooij et al., Science, Vol. 316: 575-579, 2007), antimiR-208a의 유익한 신진대사 효과는 전신 신진대사에 대한 심장의 잠재적 영향을 나타낸다.
이런 일련의 실험의 결과는 antimiR의 전신 전달을 통해 심장 특이적인 miR-208a의 약리학적 불활성화가 강화된 신진대사 표현형을 제공하며, miR-208a 억제제들은 비만, 고콜레스테롤혈증, 제 2 형 당뇨병, 지방간 및 고지혈증과 같은 다양한 신진대사 이상에서 치료 유효성을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: AntimiR-208 화합물들은 신진대사를 조절한다
miR-208a의 다른 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제들을 확인하는 것은 신진대사를 조절하는데 효과적이며, 고지방 식사를 한 생쥐는 4개의 다른 antimiR-208 억제제 중 하나를 투여받았고, 이중 2개는 이미 인비보 표적 탈억제를 나타내었고(M-10101 및 M-10683) 및 이중 2개는 이미 인비보 표적 탈억제를 나타내지 않았다(M-10673 및 M-10681). 생쥐의 4개의 다른 그룹은 4개의 대조군 올리고뉴클레오티드(M-10591, M-10649, M-10702, 및 M-11182) 중 하나를 투여받았다. 6-8주령의 C57B1/6 생쥐에게 60% 고지방(HF) 식사 또는 정상 식사를 제공하였고 25mg/kg 피하 투여량의 antimiR 올리고뉴클레오티드를 매주 투여하였다. 치료 그룹은 표 3에 나열된다.
AntimiR-208 화합물 확인을 위한 치료 그룹
그룹 동물의 수 식사 화학물질 서열(5' 에서 3') 1 별칭
1 8 정상
식사		 식염수
2 8 고지방 식염수
3 8 고지방 M-10101 lCs;dTs;dTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;lGs;dTs;lCs;dTs;lTs;lA (SEQ ID NO: 13) Trunc_208_PS
4 8 고지방 M-10673 lCs;dTs;lTs;lTs;lTs;lTs;dGs;lCs;dTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA (SEQ ID NO: 18) 208a LNA C_T_DNA_16_1
5 8 고지방 M-10681 lCs;dTs;lTs;lTs;dTs;lTs;dGs;lCs;lTs;lCs;dGs;dTs;lCs;dTs;lTs;dA (SEQ ID NO: 23) 208_LNA_opt_3
6 8 고지방 M-10683 lCs;dTs;dTs;lTs;lTs;dTs;lGs;dCs;lTs;lCs;dGs;lTs;dCs;lTs;dTs;lA (SEQ ID NO: 25) 208_LNA_opt_5
7 8 고지방 M-10591 lTs;dCs;dCs;lTs;lAs;dGs;lAs;lAs; dAs;lGs;lAs;dGs;dTs;lAs;dGs;lA (SEQ ID NO: 94) Control; Trunc 16mer_UnivMM
8 8 고지방 M-10649 lCs;dCs;lTs;dAs;dGs;lAs;lAs;dAs;dGs;lAs;dGs;lTs;dAs;lGs;lA (SEQ ID NO: 95) Control; Trunc 15mer_Univ
9 8 고지방 M-10702 lAs;dCs;lTs;dTs;lTs;lTs;dGs;lTs;dGs;lTs;lAs;dGs;lTs;dAs;dCs;lA (SEQ ID NO: 96) Control; UnivCont2_16mer
10 8 고지방 M-11182 lCs;dTs;lTs;dTs;dTs;lGs;lTs;dGs;dTs;lAs;dGs;lTs;dAs;lCs;lA (SEQ ID NO: 97) Control; UnivCont2_15mer
1 표시는 표 2에 정의된다.
모든 antimiR-208a 화합물은 체중을 감소시키는데 효과를 가졌다(도 6a 및 6b). M-10101 및 M-10683은 가장 효과적이며 이런 억제제를 투여받은 생쥐는 정상 식사를 한 식염수 치료 생쥐에 필적할만한 체중을 나타내었다. M-10673 및 M-10681은 체중 증가에 중간의 효과를 갖는 것으로 보였다. 11주의 고지방 식사 후 글루코오스 인내성 테스트를 실행하였고 모든 antimiR-208a 화합물에 의한 antimiR 치료는 모든 antimiR-208a 화합물은 글루코오스 인내성에 일부 영향을 가졌고 M-10101이 가장 효과적이었다는 것을 나타내었다(도 7). 분자 분석은 모든 antimiR-208a 화합물 치료 그룹들이 심장에서 miR-208a의 강한 억제를 가졌다는 것을 나타내었고 모든 antimiR-208a 치료 그룹은 입증된 miR-208a 표적인 Sox6의 현저한 탈억제를 나타내었다(데이터 도시되지 않음).
요약하면, 모든 antimiR-208a 화합물은 시간이 지남에 따라 고지방 식사 유도 체중 증가를 감소시켰고, M-10101 및 M-10683은 가장 효과적인 miR-208a 억제제인 것으로 테스트되었다. 이런 동일한 두 화합물은 쥐 심장 조직에서 최고의 표적 탈억제를 나타내었다(데이터 도시되지 않음).
다음 일련의 실험들에서, 반전 연구를 실행하여 antimiR-208a 화합물들이 이미 비만인 동물들에서 체중을 감소시킬 수 있는지를 측정하였다. 생쥐들에게 ~45그램에 도달할 때까지 고지방 식사를 제공하였다. 이때에, 생쥐에게 4개의 antimiR-208a 화합물(M-10101, M-10683, M-10673 및 M-10681) 중 하나를 25mg/kg으로 매주 피하로 투여하였다. 실험 동안 생쥐들은 고지방 식사를 유지하였다. 치료 그룹은 표 4에 나열된다.
반전 연구를 위한 치료 그룹
그룹 동물의 수 식사 화학물질 SEQ ID NO : 별칭
1 7 고지방 M-10101 13 Trunc_208_PS
2 8 고지방 M-10673 18 208a LNA C_T_DNA_16_1
3 7 고지방 M-10681 23 208_LNA_opt_3
4 7 고지방 M-10683 25 208_LNA_opt_5
5 8 고지방 M-10591 94 Trunc 16mer_UnivMM
주간 체중 측정은 모든 antimiR-208a 화합물들이 비만 생쥐에서 체중을 감소시켰다는 것을 나타내었다(도 8). M-10101은 가장 효과적인 화합물이었는데 이는 이 화합물에 의한 치료가 비만 생쥐에서 ~10 퍼센트의 체중 감소를 초래하였기 때문이다. 이런 체중 감소는 생쥐가 고지방 식사를 지속하면서 일어났다. 반대로, 대조군 올리고(M-10591)로 치료된 생쥐는 고지방 식사로 체중이 지속적으로 증가하였다. 3개의 다른 antimiR-208a 화합물들은 체중 감소에 중간 효과를 나타내었으나, 모든 화합물들은 체중 증가를 추가로 감소시켰다.
이런 실시예에 기술된 연구들로부터의 데이터는 miR-208a의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제들이 신진대사를 조절하는데 중요한 역할을 하며 비만 및 관련 신진대사 이상을 치료하고 예방하기 위한 효과적인 치료제로 작용할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4: AntimiR-208은 간 에너지 신진대사 및 미토콘드리아 기능을 증진한다
그룹당 6마리 생쥐를 고지방 식사(HFD) 단독(대조군) 또는 antimiR-208a M-10101과 조합된 HFD로 처리하였다. 샘플들은 처음에 볼 수 없게 하였고 생화학적 확인 및 데이터 선별 이후, 데이터 분석을 위해 샘플들을 보게 하였고, 그룹 1은 HFD + antimiR-208a로 나타내었고 그룹 2는 HFD 단독(대조군)으로 나타내었다.
치료 이후, 혈장, 심장, 골격근, 간 및 복막후 지방을 각 동물로부터 수집하였다; 신진대사 분석을 위해 빠르고 동결하여 메타볼론(Metabolon)(Durhan, NC)으로 보냈다. 전체 60개 샘플을 이 연구에서 분석하였다. 샘플은 한 시점(1주)에서 2개의 구별된 치료 그룹[HFD + antimiR-208a(그룹 1) vs. HFD 대조군(그룹 2)]으로 이루어졌고 각 매트릭스(matrix)에 대해 6개의 복제물을 가진다(혈장, 심장, 골격근, 간 및 지방). 샘플들을 추출하고 GC/MS 및 LC/MS/MS 플랫폼에서 분석하기 위해 동일한 부분으로 나눴다. 소프트웨어를 사용하여 피크 면적 적분에 의한 대사산물 확인 및 대사산물 정량화를 위해 표준들의 인-하우스 라이브러리(in-house library)에 이온들을 일치시켰다. 샘플들에 대한 대사산물의 확인 및 상대적 정량화는 메타볼론의 기술 플랫폼으로 완성하였고, 각각 혈장, 심장, 골격근, 간 및 복막후 지방에서 전체327, 275, 260, 314 및 234개 생화학물질을 탐지하였다. 생화학 데이터를 웰치스 두 샘플 t-테스트(Welch's two-sample t-test)로 분석하였다. 웰치스 두 샘플 t-테스트를 사용하여 상대 수준이 다양한 치료 그룹들 사이에서 다른 생화학물질을 확인하였다.
품질 제어를 위해, 질량 스펙트럼분석기에 주입되기 전에 각 실험 및 공정 표준 샘플에 여러 내부 표준을 첨가하였다. 플랫폼 변화성의 측정은 이런 내부 표준에 대한 중앙 상대 표준 편차(RSD)를 계산함으로써 측정하였다. 표 5는 내부 표준에 대한 중앙 상대 표준 편차(RSD)를 도시한다. 이런 표준들은 장치에 주입되기 직전에 샘플들에 첨가되기 때문에, 이런 값은 장치 변화를 반영한다. 또한, CMTRX(각 실험 혈장 샘플의 개별 분취량으로부터 만들어지고 합쳐진 "클라이언트 매트릭스"(Client Matrix). 이런 CMTRX 샘플들은 플랫폼 작동 내내 주입되었고 기술적 복제물(technical replicates)로 작용하였다)에서 지속적으로 측정된 생화학물질에 대한 중앙 상대 표준 편차(RSD)는 실제 실험 샘플들에 대한 과정 내의 전체 변화성 및 이런 샘플들 내의 내인성 대사산물의 정량화의 변화성을 나타낸다(표 5). CMTRX 및 내부 표준에 대한 결과들은 플랫폼이 공정 규격을 충족하는 데이터를 생산한다는 것을 알려주었다.
품질 제어 통계
품질 제어 샘플
(매트릭스) 		중앙 RSD
심장 복막후 지방 간 골격 근육 혈장
내부 표준 6% 6% 5% 6% 5%
내인성
생화학물질		 11% 11% 10% 14% 9%
간 샘플의 경우, 확인된 314개 생화학물질 중 36개는 antimiR-208a를 투여받은 HFD 생쥐 vs. HFD 대조군 사이의 현저한 차이를 나타내었다. 글루코오스 신진대사 및 TCA 사이클에 피루베이트 포함에 관여하는 생화학물질의 경우, 하류 대사산물의 동시 유지에 의한 당분해 경로의 초기 중간체의 증가가 표 6에 도시된 대로 나타났고, 각 대사산물에 대한 변화의 상대 배수가 제공된다.
간 글루코오스 신진대사에서 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
당 분해,
당 신생,
피루베이트
신진대사		 1,5-안하이드로글루시톨 (1,5-AG) 0.86
글리세레이트 0.94
글루코오스-6-포스페이트 (G6P) 1.62
글루코오스 1.06
프룩토오스-6-포스페이트 1.45
등압선: 프룩토오스 1,6-다이포스페이트, 글루코오스 1,6-다이포스페이트, 미오-이노시톨 1,4, 또는 1,3-다이포스페이트 2.09
3-포스포글리세레이트 0.94
다이하이드록시아세톤 포스페이트(DHAP) 1.8
1,3-다이하이드록아세톤 0.97
피루베이트 1.02
락테이트 1.04
글루쿠로네이트 0.88
글루코오스-6-포스페이트(G6P), 프룩토오스-6-포스페이트(F6P), 프룩토오스-1,6-포스페이트(MS/MS 단편화 및 다른 화학적 성질을 기초로 한 확인) 및 다이하이드록시아세톤-포스페이트(DHAP)는 antimiR-208a vs. 대조군의 치료에 의해 모두 상승한 것으로 나타났다(G6P 및 F6P는 추세적 유의성(trending significance, 0.05<p<0.10). 이런 패턴은 anti-miR 치료 및 트라이카복실산(TCA, Krebs) 사이클 속으로 공급되는 피루베이트의 효과적 사용 이후 간 글루코오스 신진대사에 증가와 일치한다. 당분해 최종 생성물 락테이트에서 변화의 결여는 TCA 사이클 에너지론을 충족하는 글루코오스 신진대사의 증가된 사용을 뒷받침하며 산화성 글루코오스 신진대사 vs. HFD 대조군의 유지를 나타낸다.
TCA 사이클 에너지론을 위한 글루코오스-관련 대사산물의 증가된 사용과 일치하여, 감소된 TCA 사이클 중간체의 패턴은 antimiR-208a vs. α-케토글루타레이트(통계적으로 유의, p<0.05), 숙신일 CoA 및 푸마레이트(추세적 유의성, 0.05<p<0.10) 및 시트레이트 및 말레이트를 포함하는 대조군 간 샘플에서 관찰되었다(표 7).
간 TCA 사이클에서 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
TCA/크렙스 사이클 시트레이트 0.69
알파-케토글루타레이트 0.73
숙시네이트 0.99
숙신일카르니틴 1.01
숙신일 CoA 0.51
푸마레이트 0.76
말레이트 0.77
판토테네이트 및 CoA 신진대사 판토테네이트 0.85
포스포판테테인 1.33
조효소 A 1.25
3'-디포스포조효소 A 1.13
전체적으로, TCA 사이클 중간체의 대다수에서 감소는 anti-miR 치료에 의한 HFD 모델 vs. 치료 없는 HFD 모델에서 에너지 신진대사 효율에서 증가를 나타낸다. 또한, TCA 경로 에너지 신진대사는 미토콘드리아에 고유한 것이기 때문에, 이런 변화들은 HFD 생쥐 모델에서 미토콘드리아 기능에 anti-miR-매개 개선을 나타낸다. HFD 생쥐 모델에서 증가된 글루코오스 사용은, 특히 식사 유도 이상혈당증에 더욱 민감한 것으로 알려진 C56/B1/6 균주에서 유리할 수 있다(Gallou-Kabani et al., (2007) Obesity, 15, p. 1996-2005). 또한, 조효소 A(CoA)는 α-케토글루타레이트의 숙신일 CoA로의 α-케토글루타레이트 탈수소효소-매개 전환에 필요하며 CoA 전구체 판토테네이트에서 감소와 함께 증가된 CoA의 패턴이 또한 antimiR-208a vs. HFD 단독으로 치료된 동물들의 간에서 관찰되었다. 변화의 이런 패턴은 THRAP1(즉 MED13)의 anti-miR-의존성 배출 및 갑상선 수용체 시그널링과 관련된 미토콘드리아 생합성에 후속 증가를 나타낼 수 있다.
측쇄 사슬 아미노산(BCAA) 신진대사는 인슐린 저항성 및 비만의 발생에 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Newgard et al., (2009) Cell Metab. 9, 311-26; Altmaier et al., (2008) Endocrinology, 149, 3478-89; She et al., (2007) Am J Physiol Endocrinol Metab, 293, E1552-63). BCAA, 아이소루신, 루신 및 발린의 증가된 수준은 인슐린 저항성의 질병 동안 주로 관찰되며 BCAA의 신진대사로부터 유래된 다양한 단사슬 대사산물은 인슐린 민감성 및/또는 IR과 관련된 발현의 뚜렷한 패턴을 나타낸다(Newgard et al., Altmaier et al.). BCAA 루신 및 발린은 antimiR-208a 치료 vs. 대조군(p<0.05)로 현저하게 감소한 것으로 나타났고 아이소루신은 HFD 모델에서 치료에 의해 현저한 감소(0.05<p<0.10)의 경향을 나타내었다(표 8). anti-miR 치료에 의한 상대적 감소의 이런 패턴은 또한 여러 BCAA 대사산물에서 관찰되었다.
간 BBCA 및 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
발린, 루신 및 아이소루신 신진대사 아이소루신 0.91
루신 0.90
발린 0.89
2-하이드록시아이소부티레이트 0.95
알파-하이드록시아이소발레레이트 1.01
하이드록시아이소발레로일 카르니틴 0.63
메틸글루타로일카르니틴 0.77
간에서 관찰된 글루코오스 신진대사의 증가 및 개선된 TCA 사이클 효율 이외에, 이런 기관에서 항-당뇨/비만 효율의 추가 징후는 antimiR-208a 치료 vs. 대조군에 의해 명백하였다. 글리코겐 신진대사의 양태들과 관련된 말토오스 유래 대사산물에서 현저한 변형은 antimiR-208a에 의한 치료 이후 증가된 간 글리코겐 증착의 징후를 제공하였다. 이 경우에, 더 긴 글루코사카라이드(즉, 말토펜타오스 및 말토헥사오스)는 1주에 HFD 모델에서 치료에 반응하여 통계적으로 유의한 증가(p<0.05)를 나타내었다(표 9).
간 글리코겐 생합성에서 대사산물에 대한 상대 배수 변화
생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
말토오스 0.79
말토트리오스 0.87
말토펜타오스 1.89
말토헥사오스 2.61
더 짧은 글루코사카라이드 전구체 말토오스(유의) 및 말토트리오스에서 동시 감소와의 조합으로, 더 긴 글루코사카라이드에서 관찰된 증가는 글리코겐 증착과 관련된 글리코겐 합성 및 이들의 증가에서 중간인 것으로 추측된다. 증가된 간 글루코오스 신진대사 및 강화된 미토콘드리아 기능의 면에서 antimiR-208a 치료의 명백한 항-당뇨/비만 효과에 의해, 증가된 간 글리코겐 합성은 유리한 antimiR-208a 효과와 일치한다. 간에서 글리코겐 침착 증가는 당뇨병/인슐린 저항성의 관리에서 고지혈증을 감소시키는 효과적인 메커니즘을 나타낸다. 혈장 글루코오스 수준이 HFD + antimiR-208a vs. HFD 단독 이후 1주에 실질적으로 변형되지 않은 반면(도시되지 않음, 1.09배 대조군), 이런 발견은 작용의 가능한 메커니즘에 통찰력을 제공하며 이에 의해 antimiR은 HFD 모델이 진행됨에 따라 혈당 제어에 영향을 미친다.
이런 실시예는 antimiR-208a로 치료된 생쥐로부터의 간은 이의 바람직한 에너지 원(예를 들어, 당분해) 및 프로세싱 초과 기질을 대조군 생쥐보다 더욱 최적으로(예를 들어, 글리코겐 침착) 사용한다는 것을 입증한다. 또한, 징후들은 antimiR-208a로 치료된 생쥐의 미토콘드리아가 대조군 생쥐와 비교하여 더욱 최적으로 기능한다는 것이다(예를 들어, TCA 사이클, 측쇄 아미노산). 모든 이런 효과는 THRAP1(MED13)에 대한 antimiR-208a의 효과를 통해 잠재적으로 조절될 수 있다는 갑상선 호르몬 시그널링의 개선과 일치할 수 있다.
실시예 5: AntimiR-208은 개선된 골격근 연료 사용 및 미토콘트리아 기능을 증진한다
고지방 식사(HFD) 단독 또는 antimiR-208a(M-10101)와 조합된 HFD로 치료한 생쥐로부터의 골격근의 대사체학 분석(metabolomic analysis)을 실시예 4에 기술된 대로 실행하였다. 골격근 신진대사에 변형은 IR, T2D 및 MS와 같은 신진대사 질환 상태와 일반적으로 관련이 있다(Muoio and Newgard, (2008) Nat Rev Mol Cell Biol, 9, 193-205; Hulver et al., (2003) Am J Physiol Endocrinol Metab, 284, E741-7).
표 10은 골격근 글루코오스 신진대사 상류 중간체들은 anti-miR 치료로 증가한 반면 하류 트라이오세포스페이트 중간체들은 유지되거나 약간 감소한다는 것을 도시한다.
골격근 글루코오스 신진대사에서 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
당 분해,
당 신생,
피루베이트
신진대사		 1,5-안하이드로글루시톨(1,5-AG) 0.88
글리세레이트 1.09
글루코오스-6-포스페이트(G6P) 2.85
글루코오스 1-포스페이트 2.59
글루코오스 1
프룩토오스-6-포스페이트 2.76
등압선: 프룩토오스 1,6-다이포스페이트, 글루코오스 1,6-다이포스페이트, 미오-이노시톨 1,4, 또는 1,3-다이포스페이트 1.13
2-포스포글리세레이트 0.96
3-포스포글리세레이트 0.92
포스포에놀피루베이트(PEP) 0.83
피루베이트 0.96
락테이트 0.9
이 패턴은 TCA 사이클 에너지 신진대사 경로 속에 효율적으로 공급되는 글루코오스의 증가된 사용과 다시 일치하며, 패턴은 anti-miR 치료 vs. HFD 대조군에 의해 치료된 동물들로부터의 간 샘플들에서 관찰된 패턴과 명백히 유사하다(실시예 4). 비록 이런 차이는 통계적 유의성에 도달하기 못했으나, 패턴이 치료에 의해 간에서 관찰된 이런 차이들을 면밀하게 반영한다는 사실은 HFD 모델의 세팅에서 신진대사 이점을 전달할 수 있는 간 및 골격근 모두에 영향을 미치는 작용의 유사한 메커니즘을 입증한다.
간에서 관찰된 anti-miR 관련 효과들과 일치하여, 골격근 샘플들은 시트레이트(통계적으로 유의, p<0.05), 푸마레이트 및 말레이트(통계적으로 유의, p<0.05)를 포함하는 HFD 대조군에 비례하여 다중 TCA 사이클 중간체의 감소를 나타내었다(표 11). 또한, TCA 사이클 중간체의 균일한 감소는 HFD 대조군과 비교할 때 anti-miR 치료에 의해 에너지 신진대사 효율에 상대적 증가를 나타낸다. 치료군 및 대조군 사이의 차이의 이런 패턴은 위에서 제안된 TCA 사이클 에너지론에 연료를 공급하기 위한 글루코오스 관련 트라이오세포스페이트 중간체의 효과적인 사용에 상승적인 증가를 입증한다. 간과 골격근 모두는 antim-miR 치료에 의해 상승된 글루코오스 신진대사 및 증가된 TCA 사이클 효율을 나타낸다는 조합된 관찰은 미토콘드리아 기능을 개선하거나 적어도 유지할 수 있는 약물 관련 효과를 나타내며, 이는 미토콘드리아 생합성을 증가시키는 THRAP1(MED13) 및 갑상선 수용체 시그널링의 anti-miR 매개 방출과 일치한다.
골격근 TCA 사이클에서 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
TCA/크렙스 사이클 시트레이트 0.72
숙신일카르니틴 0.96
푸마레이트 0.86
말레이트 0.79
비록 골격근 인슐린 저항성에서 생활성 지질의 역할은 완전히 이해되지 못하고 있으나, 비만과 영양과다는 인슐린 민감성과 부정적으로 관련이 있는 지질 및 지질 대사산물의 근육내 축적과 관련이 있다(Muoio and Newgard, (2008) Nat Rev Mol Cell Biol, 9, 193-205). 글리세로인지질(GPL)로부터 유래된 리소지질은 생활성 특성을 가지며 인슐린 시그널링 캐스케이트에서 다중 위치에서 서로 작용하여 인슐린 저항성을 초래한다고 알려져 있다(Wymann and Schneiter, (2008) Nat Rev Mol Cell Biol, 9, 162-76; Patti and Kahn, (2004) Nat Med, 10, 1049-50). 이 실시예에서, 여러 지질 종들은 도 12에 도시된 대로, HFD 대조군 샘플과 비교할 때 anti-miR 치료 동물들로부터의 골격근에서 감소하였다.
골격근 라이소인지질에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
라이소지질
 1-팔미토일글리세로포스포에탄올아민 0.88
2-팔미토일글리세로포스포에탄올아민* 0.98
1-팔미톨레오일글리세로포스포에탄올아민* 0.8
1-스테아로일글리세로포스포에탄올아민 0.96
1-올레오일글리세로포스포에탄올아민 0.82
2-올레오일글리세로포스포에탄올아민* 0.84
1-리놀레오일글리세로포스포에탄올아민* 0.99
2-리놀레오일글리세로포스포에탄올아민* 1.35
1-아라키돈오일글리세로포스포에탄올아민* 0.84
2-아라키돈오일글리세로포스포에탄올아민* 0.95
2-도코사펜타에노일글리세로포스포에탄올아민* 0.45
2-도코사헥사에노일글리세로포스포에탄올아민* 0.41
1-미리스토일글리세로포스포콜린 0.39
1-팔미토일글리세로포스포콜린 0.32
2-팔미토일글리세로포스포콜린* 0.39
1-팔미톨레오일글리세로포스포콜린* 0.48
1-스테아로일글리세로포스포콜린 0.3
1-올레오일글리세로포스포콜린 0.84
2-올레오일글리세로포스포콜린* 0.49
1-리놀레오일글리세로포스포콜린 0.9
2-아라키돈오일글리세로포스포콜린* 0.28
1-팔미톨일글리세로포스포이노시톨* 0.8
1-스테아로일l글리세로포스포이노시톨 0.81
1-아라키돈오일l글리세로포스포이노시톨* 0.95
2-아라키돈오일글리세로포스포이노시톨* 0.89
1-팔미토일플라스멘일에탄올아민* 0.94
*MS/MS 단편화 및 다른 화학적 특성을 기초로 한 확인
특히 GPL 유래 리소지질들은 anti-miR 치료 vs. 대조군에 의한 골격근에서 균일하게 감소하였고 에탄올아민- 및 콜린-컨쥬케이트 종들은 유사하게 영향을 받았다. 이런 차이는, HFD가 GPL 유래 리소지질의 축적을 유도하기 때문에, anti-miR 치료가 HFD 모델에서 리소지질의 일반적인 상승을 차단한다는 것을 암시한다. 또한 감소의 관찰된 패턴은 리소지질의 sn-1 및 sn-2 변형체 사이에 차이가 없었고, 이는 anti-miR 치료는 포스포리파아제 A1 또는 A2에 우선적으로 영향을 미치지 않았다는 것을 나타내며, 추가로 HFD 모델에서 리소지질 흡수의 anti-miR 유도 변화 vs. 생합성 변화를 입증하였다.
또한, anti-miR 치료는 골격근 모노- 및 다이아실글리세롤뿐만 아니라 스핀고지질을 감소시켰고(표 13), 이는 HFD가 지질 및 지질 중간체의 골격근 축적에서 일반적 증가와 관련이 있다는 주장과 일치한다. 따라서, 글루코오스 신진대사 및 증가된 TCA 사이클 효율(미토콘드리아 기능)의 경우, anti-miR 치료 이후 리소지질 수준에서 관찰된 변화의 균일한 패턴은 골격근 인슐린 민감성의 보존을 전달하기 위한 치료적 효과의 징후이다.
골격근 모노- 및 다이-아실글리세롤에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
모노아실글리세롤 1-팔미토일글리세롤*
(1-모노팔미틴)		 0.75
2-팔미토일글리세롤
(2-모노팔미틴)		 0.79
1-스테아로글리세롤 (1-모노스테아린) 0.8
다이아실글리세롤 1,2-다이팔미토일글리세롤 0.71
1,3-다이팔미토일글리세롤 0.51
스핀고지질 스핀고신 0.51
팔미토일 스핀고마이엘린* 0.79
스테아로일 스핀고마이엘린 0.85
*통계적으로 유의(p<0.05)
이런 결과들은 HFD와 동시의 anti-miR208a 치료가 개선된 골격근 연료 사용(당분해) 및 미토콘드리아 기능(TCA 사이클)을 초래하였다는 것을 입증한다. 또한, 내부 골격근 지방 침착에 감소가 있을 수 있다. 따라서, anti-miR208a의 투여는 anti-miR208a 촉진 THRAP1(MED13) 발현에 의한 증가된 갑상선 호르몬 수용체 시그널링을 통해 매개될 수 있는 골격근 신진대사를 개선할 수 있다.
실시예 6: AntimiR-208는 심장 신진대사를 증진한다
고지방 식사(HFD) 단독 또는 antimiR-208a(M-10101)와 조합된 HFD로 치료한 생쥐로부터의 심장의 대사체학 분석(metabolomic analysis)을 실시예 4에 기술된 대로 실행하였다.
심장 근육은 지배적 기질로서 지방산과 글루코오스인 여러 연료 기질 및 이의 바람직한 연료원으로서 지방산을 사용한다. 한 주 동안 식사 투여의 시작시에 anti-miR208a에 의한 생쥐의 동시 치료는 HFD 단독과 비교할 때 상승된 긴 사슬 지방산(LCFA)의 패턴을 초래하였고(표 14), 여기서 백시네이트, 에이코세노에이트, 다이호모리놀레이트 및 도코사다이에노에이트는 통계적으로 유의하였다(p<0.05).
심장 긴 사슬 지방산에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
긴 사슬 지방산
 미리스테이트 (14:0) 1.08
미리스톨레이트 (14:1n5) 1.11
펜타데카노에이트 (15:0) 0.99
팔미테이트 (16:0) 1.09
팔미톨레이트 (16:1n7) 1.14
마가레이트 (17:0) 1.1
10-헵타데케노에이트 (17:1n7) 1.1
스테아레이트 (18:0) 1.14
올레이트 (18:1n9) 1.11
시스-백시네이트 (18:1n7) 1.14
스테아리도네이트 (18:4n3) 0.8
노나데카노에이트 (19:0) 1.08
10-노나데케노에이트 (19:1n9) 1.08
에이코세노에이트 (20:1n9 또는 11) 1.22
다이호모리놀레이트 (20:2n6) 1.18
미드산 (20:3n9) 1.08
아라키도네이트 (20:4n6) 1.07
도코사디에노에이트 (22:2n6) 1.21
도코사트리에노에이트 (22:3n3) 1.31
아드레네이트 (22:4n6) 1.12
이런 차이는 anti-miR 치료에 의한 이의 바람직한 연료원의 심장 흡수의 증가를 암시한다. FA 산화가 압도되었고 케톤체 형성이 계속되는 병적 상태와 달리, anti-miR 치료에 의한 심장 LCFA 수준의 증가는 대조군과 비교할 때 심장 케톤체 수준에 상대적 감소와 관련이 있다(케톤체 3-하이드록시부티레이트(BHBA)에서 anti-miR-의존성 감소). 이것은 anti-miRa 치료에 의한 심장에서 바람직한 FA 연료 기질들의 더욱 효과적인 사용을 반영할 수 있다.
대부분의 지질 종들에서 일반적인 감소를 나타낸 골격근과 달리, anti-miR에 의한 치료는 리소지질, 모노- 및 다이아실글리세롤 및 스핀고지질을 포함하는 LCFA 이외에 여러 심장 지질 종들(2-스테아로일-GPC 및 2-스테아로일글리세롤은 통계적으로 유의하며(p<0.05,) 1-리놀레오일-GPE는 추세적 유의성(trending significance)(0.05<p<0.1)을 가짐)의 일반적인 증가와 관련이 있었다(표 15). 이런 데이터는 전체적으로 THRAP1(MED13)-매개 미토콘드리아 생합성에 아마도 2차적인 HFD 모델에서 개선된 신진대사 효율과 관련이 있는 심장 지질에서 antimiR-208a 관련 증가를 암시할 수 있다.
심장 리소지질 및 모노- 및 다이-아실글리세롤에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
리소지질 1-리놀레오일글리세로포스포에탄올아민* 1.49
1-스테아로일글리세로포스포콜린* 1.52
1-리놀레오일글리세로포스포콜린 1.45
1-올레오일글리세로포스포이노시톨* 1.22
모노아실글리세롤 1-팔미토일글리세롤 (1-모노팔미틴) 1.08
2-팔미토일글리세롤 (2-모노팔미틴) 1.11
1-스테아로글리세롤 (1-모노스테아린) 1.16
2-스테아로글리세롤 (2-모노스테아린) 1.28
1-올레오일글리세롤 (1-모노올레인) 1.1
2-올레오일글리세롤 (2-모노올레인) 1.86
2-리놀레오일글리세롤 (2-모노리놀레인) 1.15
다이아실글리세롤 1,2-다이팔미톨글리세롤 1.12
1,3-다이팔미톨글리세롤 1.08
스핀고지질 스핀가닌 1.16
스핀고신 1.25
팔미토일 스핀고마이엘린 0.99
스테아로일 스핀고마이엘린 0.99
*MS/MS 단편화 및 다른 화학적 특성을 기초로 한 확인
이의 바람직한 지질 연료 기질의 증가된 흡수 이외에, anti-miR 치료 동물들로부터의 심장 샘플들은 또한 글루코오스-6-포스페이트, 피루베이트 및 당분해 락테이트의 최종 생성물을 포함하는 당분해 경로의 여러 중간체에서 증가를 나타내었다(통계적으로 유의 vs. 대조군)(표 16).
심장 글루코오스 신진대사에서 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
당 분해,
당 신생,
피루베이트
신진대사		 글루코오스-1-포스페이트 1.91
글루코오스-6-포스페이트 (G6P) 1.28
2-포스포글리세레이트 0.9
3-포스포글리세레이트 0.92
피루베이트 1.3
락테이트 1.26
이 패턴은 락테이트에 증가를 나타내지 않았던 간과 골격근으로 관찰된 것과 약간 다른 반면, 이런 차이들은 심장근, 골격근 및 간 사이에 존재하는 바람직한 연료원들 및 심장에서 다른 락테이트 생산 경로 사이의 차이들을 고려하면 놀랍지 않다. 그러나, 전체적으로, 이런 데이터는 antimiR-208a 치료 vs. HFD 대조군에 의한 증가된 THRAP1(MED13)-유도 미토콘드리아 생합성과 관련된 개선된 신진대사 효율과 관련이 있을 수 있는 심장(지질 및 글루코오스)에 의해 사용된 1차 연료원들의 신진대사에 증가를 입증한다.
간의 글루코오스 신진대사와 심장 글루코오스 신진대사를 구별하는 다른 생화학적 사인은 포스포릴라제 활성을 통해 생산되어 글리코겐 대사산물들을 당분해 경로 속에 전달하는 글리코겐 분해 생성물 글루코오스-1-포스페이트에 현저한 증가이다(Salway, Metabolism at a glance. Third Edition ed. 2004, Malden, MA: Blackwell Publishing. 125; Stryer, L., Biochemistry. Fourth Edition ed. 1995, New York, NY: W.H.Freeman and Co. 1064.). 이것은 HFD에서 예상될 것과 반대인데, 여기서 공급된 상태의 글리코겐 합성은 글리코겐분해에 우선적으로 발생할 수 있으며, HFD 모델 심장에서 anti-miR의 독특한 신진대사 영향을 암시한다. 그러나, 종합적으로, 이런 데이터는 HFD 모델의 내용에서 개선된 탄소 핸들링을 암시하는 antimiR-208a 효율과 관련된 심장 연료 신진대사에 증가를 나타낸다.
TCA 사이클 중간체들에서 차이를 나타내는 간과 골격근이 개선된 신진대사 효율과 일치하는 것과 같이, anti-miR로 치료된 동물들로부터의 심장은 또한 TCA 사이클 중간체 vs. HFD 대조군에 변화들을 나타내었다. 놀랍지 않게, 심장 연료 신진대사 vs. 다른 조직들에서 관찰된 차이들은 간 또는 골격근에서 관찰된 것들과 관련하여, 심장 TCA 사이클 변화들에서 관찰된 차이들로 확장되었다(표 17).
심장 TCA 사이클에서 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
TCA/크렙스 사이클 시트레이트 1.55
숙시네이트 0.77
숙신일카르니틴 1.06
푸마레이트 1.3
말레이트 1.09
판토테네이트 및 CoA 신진대사 판토테네이트 0.93
포스포판테테인 0.94
조효소 A 1.53
3'-디포스포조효소 A 1.4
아세틸 CoA 1.51
시트레이트는, 푸마레이트와 같이, anti-miR 치료 동물들 vs. 대조군으로부터의 심장 조직들에서 현저하게 증가되었다. 트라이카복실레이트 담체에 의해 미토콘드리아로부터 전달될 수 있는 시트레이트는 뒤이어 아세틸- 및 말론일-CoA 중간체를 통해 지방산 합성 전구체로서 사용될 수 있다(Salway, Metabolism at a glance. Third Edition ed. 2004, Malden, MA: Blackwell Publishing. 125). 지방산 흡수는 anti-miR 치료 동물들의 심장에서 증가될 것으로 보였으며, FA 흡수에 증가는 FA 합성에 요구를 상쇄시켜 시트레이트와 같은 FA 전구체들의 축적을 초래할 수 있다. 또한, 숙시네이트의 푸마레이트로의 전환은 전자 수송 사슬에서 FADH2의 착물 II 생산과 연관된다. anti-miR vs. 대조군에 의해 치료된 동물들의 심장에서 숙시네이트에 현저한 감소(통계적으로 유의, p<0.05) 및 푸마레이트의 조화된 현저한 증가는 더욱 효과적인 전자 수송과 산화성 인산화 및 따라서 미토콘드리아 기능과 연관이 있는 이런 생화학물질의 더욱 효과적인 사용을 나타낸다. 지방산 산화 최종 생성물 아세틸 CoA 및 조효소 A 모두는 표 17에 도시된 대로 대조군과 비교하여 antimiR-208a로 치료된 동물들의 심장에서 증가하며, 이는 증가된 FA 신진대사 및 미토콘드리아 기능과 연관이 있다.
M-10101에 의한 miR-208a의 억제가 THRAP1(MED13) 및 따라서 TR 시그널링에 대한 miR-208a의 억제 효과를 나타내기 때문에, 산화성 인산화는 증가할 것이며, 이는 본 발명에 기술된 antimiR-208a 관련 변화와 일치한다. 전자 수송 사슬의 착물 II의 억제는 증가된 반응성 산소 종들(ROS) 및 자기 소화 세포 사망과 관련이 있으며, 착물 II의 개선된 효율은 antimiR-208a로 치료된 HFD 동물들의 심장들에서 개선된 산화환원 균형과 관련될 수 있다(Chen et al., (2007) J Cell Sci, 120, 4155-66).
실시예 7: 혈장 분석은 antimiR-208이 증가된 연료 사용, 지질 핸들링 및 미토콘드리아 기능을 증진하는 것을 나타낸다
고지방 식사(HFD) 단독 또는 antimiR-208a(M-10101)와 조합된 HFD로 치료한 생쥐로부터의 혈장의 대사체학 분석(metabolomic analysis)을 실시예 4에 기술된 대로 실행하였다.
혈장은 혈액 분획 내의 내인성 신진대사의 생화학적 사인들뿐만 아니라 숙주 전체에서 발생하는 사건들에 의해 변형되거나 생산된 대사산물들을 제공한다. 다중 소스 대사산물의 탐지는 소정의 치료 또는 연구될 공정과 관련된 전신 사건들을 반영하는 매우 유익한 데이터 세트를 제공한다. 혈장에서만 탐지된 대사산물 변화들은 통상적으로 특정 조직 또는 기관 시스템에서 무엇이 발생하는 지를 정확하게 드러내지 않는 반면, 기관 특이적 생화학적 사건들에 관해 추가 지지를 제공할 수 있다.
HFD 모델의 anti-miR 치료로부터 초래한 증가된 FA 신진대사의 초기 신호들과 일치하여, antimiR-208a 치료 동물들 vs. 치료되지 않은 동물들의 혈청에서 모두 통계적으로 유의한(p<0.05) 헵타노에이트 및 운데카노에이트 및 모두 추세적 유의성(0.05<p<0.10)을 나타내는 카프릴레이트 및 펠라르고네이트와 같은 여러 중간-사슬 지방산(MCFA)이 증가되었다(표 18).
혈장에서 MCFA에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
중간 사슬 지방산 아이소카프로에이트 1.27
카프로에이트 (6:0) 0.93
헵타노에이트 (7:0) 1.22
카프릴레이트 (8:0) 1.23
펠라르고네이트 (9:0) 1.21
카프레이트 (10:0) 1.21
운데카노에이트 (11:0) 1.41
라우레이트 (12:0) 1.17
팔미토일-카르니틴 트랜스페라제 I(CPT-I)를 통해 미토콘드리아 속으로 출입을 촉진하기 위해 통상적으로 아실카르니틴 컨쥬케이션을 필요로 하는 긴 사슬 지방산(LCFA)과 달리, MCFA는 이런 컨쥬게이션 단계 없이 미토콘드리아 속으로 전위될 수 있어서 이들의 LCFA 대응물보다 더욱 쉽게 이용가능한 연료 기질이 되게 한다. 혈장 MCFA에 증가는 지방 분해의 초기 신호들과 연관이 있다고 생각된다. 혈장 MCFA에서 관찰된 변화들은 생쥐 HFD 모델에서 anti-miR 효율과 관련된 FA 유동화 및 증가된 신진대사의 유익한 생화학적 경향을 반영한다.
특히 고지방 식사에 의한 혈장 담즙산(BA)의 식후 증가는 정상 체중 대상에서 일어나는 것으로 알려져 있으며, 다중 수용체의 BA-매개 활성화를 통해 혈당 제어 및 에너지 신진대사를 개선하는 것으로 알려졌다(Glicksman et al., (2010) Ann Clin Biochem. 47,482-4). 비록 이 실시예에서 HFD와 관련된 BA 변화들을 구별하는 것은 불가능하지만, HFD 단독과 비교할 때 1주 동안 HFD에 대한 anti-miR의 첨가는 탐지된 모든 종들에 대한 혈장 담즙산에 균일한 감소를 일으켰다(표 19).
혈장에서 담즙산 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
담즙산 신진대사 콜레이트 0.91
타우로콜레이트 0.13
타우로케노데옥시콜레이트 0.11
데옥시콜레이트 0.2
타우로데옥시콜레이트 0.22
베타-무리콜레이트 0.42
타우로-베타-무리콜레이트 0.11
알파-무리콜레이트 0.37
타우로우르소데옥시콜레이트 0.1
모든 BA 종들은 그룹 1(즉, antimiR-208a + HFD)에서 감소하였다. 이 결과는 HFD 모델에서 antimiR-208a 특이적 효과에 신뢰성을 제공한다. BA 수준에서 균일한 감소는 상승된 영양분 공급(즉, 증가된 미토콘드리아 신진대사 능력)을 처리하는 약물을 투여받은 동물들의 증가된 능력과 연관이 있을 수 있어서, 시스템으로부터 FA를 제거하기 위한 수단으로서 상승된 혈장 BA에 대한 요구를 감소시킨다. 선택적으로, 상기한 대로, BA 시그널링은 혈당 제어 및 에너지 신진대사를 개선하는 것으로 알려져 있다(Glicksman et al., (2010) Ann Clin Biochem. 47,482-4). 한편, 증가된 글루코오스 신진대사(간, 심장, 골격근), 간 글루코겐 합성에 대해 상기한 anti-miR 관련 관찰은 심장 FA 신진대사를 개선하며 여러 조직에서 미토콘드리아 기능의 넓은 개선은 초기 HFD 표현형(또는 경우에 따라, 발달하는 조직들)과 관련된 손상된 신진대사 조직들을 분해하기 위한 BA 시그널링에 대한 감소된 요구를 나타낼 수 있다.
미토콘드리아 기능이상의 특질들 중 하나는, 특히 증가된 FA 기질이 FA를 신진대사적으로 효율적으로 처리하기 위한 미토콘드리아의 능력을 압도하는 과영양의 경우에, FA 산화의 아실카르니틴 중간체(FA-AC)의 증가이다(Muoio and Newgard, (2008) Nat Rev Mol Cell Biol, 9, 193-205). 따라서 지금까지 제공된 여러 줄의 증거는 간, 골격근 및 심장에서 미토콘드리아 기능에서 개선을 나타낸다(실시예 4-7). HFD 단독 상태인 동물들과 비교하여 HFD 상태이면서 anti-miR 치료를 받은 동물들에서 혈장 FA-AC 수준들은 감소하였고(표 20), 추가로 HFD 모델에서 미토콘드리아 기능에서 약물 관련 개선을 입증하였다.
혈장에서 카르니틴 대사산물에 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
카르니틴 신진대사 데옥시카르니틴 1.21
카르니틴 1.18
3-디하이드로카르니틴* 1.03
아세틸카르니틴 0.94
헥사노일카르니틴 0.99
옥타노일카르니틴 0.88
라우릴카르니틴 0.74
팔미토일카르니틴 0.69
스테아로일카르니틴 0.75
올레오일카르니틴 0.7
MiR-208a는 THRAP1(MED13)을 음성적으로 조절하여, 잠재적으로 TR 매개 미토콘드리아 생합성에 부정적 영향을 미친다. 다중 조직 TAC 사이클 에너지론에서 주목할만한 변화와 함께 혈장 FA-AC에서 관찰된 감소는 미토콘드리아 생합성에서 THRAP1(MED13) 억제 및 후속 증가의 anti-miR 관련 배출의 개념을 강하게 지지하며, 이는 본 발명에 기술된 관찰들과 일치하는 개선된 미토콘드리아 기능 신호로서 증명될 수 있다.
따라서, HFD의 세팅에서 anti-miR208a 치료 생쥐로부터의 혈장 내의 생화학적 변형은 연료 사용, 지질 핸들링 및 미토콘드리아 기능에 증가가 존재한다는 것을 암시한다. 이것은 또한 갑상선 호르몬 수용체 시그널링에서 THRAP1(MED13) 매개 증가와 일치할 수 있다.
실시예 8: AntimiR-208은 산화환원-항상성을 증진한다
글루타티온 대사산물들에 대한 대사체학 분석을 고지방 식사(HFD) 단독 또는 antimiR-208a(M-10101)와 조합된 HFD로 치료한 생쥐로부터의 간, 골격근 및 심장에 대해 실시예 4에 기술된 대로 실행하였다. 글루타디온은 산화환원-항상성, 항산화제 방어, 단백질 접힘 및 약물의 독성제거에 중요한 역할을 하며, 이런 트라이펩타이드의 활성 형태를 나타내는 환원된 글루타티온(GSH)은 산화환원 균형에 실질적인 영향을 제공한다. 글루타티온의 티올기는 친전자체와 반응하여 GSH 부가물 및 독소를 가진 글루타티온-S-트랜스페라제(GST) 컨쥬게이트 GSH를 생성할 수 있고 배출을 위한 수용성 생성물들을 형성하는 약물 대사산물을 생성할 수 있다.
anti-miR로 치료된 동물들로부터의 간은 여러 글루타티온 대사산물 vs. 대조군 수준에 상승 이외에 현저하게 상승된 GSH 수준을 나타내었고, 이는 antimiR-208a 치료 vs. HFD 단독에 의한 개선된 간 산화환원 균형을 나타낸다(표 21). 시스테인-글루타티온 다이설파이드는 전세계 대사체학 분석에 사용된 산화성 스트레스의 일반적인 바이오마커이다. HFD 단독에 비해 약물 유도 산화환원 개선의 개념과 일치하여, 간 시스테인-글루타티온 다이설파이드는 대조군과 비교할 때 anti-miR 치료에 의해 감소하였다. 상승된 GSH 수준이 증가된 글루타티온 합성을 반영할 수 있는 반면, 글루타티온 생합성의 상류 중간체들은 anti-miR 치료에 의해 크게 영향을 받지 않았다(도시되지 않음). 이런 관찰은 상승된 간 GSH 수준은 변형된 글루타티온 반응 및/또는 글루타티온 리사이클링과 연관이 있다는 것을 암시한다.
간 글루타티온 신진대사에서 대사산물 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
글루타티온 신진대사 글루타티온, 환원된 (GSH) 1.71
S-메틸글루타티온 1.51
5-옥소프롤린 1.06
글루타티온, 산화된 (GSSG) 0.99
시스테인-글루타티온 다이설파이드 0.77
오프탈메이트 1.21
S-락톨글루타티온 1.88
antimiR-208a 치료와 긍정적으로 연관된 글루타티온 신진대사에서 관찰된 한 변화는 S-락토일글루타티온에서 상승이었다(1.88배 HFD 단독). GSH 재생은 트라이오세포스페이트 중간체들의 분해 경로를 통해 글루코오스 신진대사와 연결된다. 글루코오스 신진대사의 상류 중간체들은 antimiR-208a 치료 동물들의 간에서 상승한 반면, 글루코오스 신진대사의 트라이오세포스페이트 중간체들은 영향을 받지 않은 것으로 보였다. 이것은 TCA 사이클 에너지론에 대한 글루코오스 유도 피루베이트의 효율적인 사용 이외에, 트라이오세포스페이트 분해는 antimiR-208a 치료에 의해 발생할 수 있으며, S-락토일글루타티온으로부터의 글루타티온의 글리옥시라제-매개 회복을 통해 GSH 재생과 연관이 있다. 결과적으로, 글루코오스 신진대사에서 anti-miR-매개 증가는 antimiR-208a vs. 대조군으로 관찰된 GSH에서 증가에 적어도 부분적으로 기여할 수 있다.
상기 실시예 5에서 기술한 대로, 골격근은 상승된 상류 중간체들 및 트라이오세포스페이트 중간체들에 명백한 불변을 포함하는 antimiR-208a+HFD vs. HFD 단독의 내용에서 간에서 발견된 것과 같이 글루코오스 신진대사 중간체들의 유사한 패턴을 나타내었다. 그런 후에 놀랍지 않게, 약물로 치료된 동물들로부터의 골격근은 대조군과 비교할 때 GSH의 현저한 증가를 나타내었고(표 22), 이런 증가는 S-락토일글루타티온의 증가와 연관이 있다(1.67배 HFD 단독).
골격근 글루타티온 신진대사에서 대사산물 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
글루타티온 신진대사 글루타티온, 환원된 (GSH) 1.44
5-옥소프롤린 0.73
글루타티온, 산화된 (GSSG) 1
시스테인-글루타티온 다이설파이드 1.04
오프탈메이트 1.27
S-락톨글루타티온 1.67
산화성 스트레스 마커 시스테인-글루타티온 다이설파이드에서 약간 감소를 나타낸 간과 달리, antimiR-208a 치료 동물들로부터의 골격근 샘플들은 이런 생화학물질에서 변화를 나타내지 않았고, 잠재적으로 HFD 모델과 관련된 산화환원 균형에 조직 특이적 변화들에 차이를 나타낸다. 이런 데이터는 간 및 골격근에서 강화된 TCA 사이클 에너지론 및 GSH 리사이클링 모두와 조화를 이루는 글루코오스 신진대사에 대한 anti-miR 관련 작용을 추가로 입증하며, 식사 유도 신진대사 변화의 초기 단계에서 antimiR-208a 효과와 모두 일치한다.
간 및 골격근과 달리, 심장은 antimiR-208a 치료 vs. HFD 대조군에 의한 GSH 수준에서 약간 증가를 나타내었고, S-락토일글루타티온의 탐지는 없었다(표 23).
심장 글루타티온 신진대사에서 대사산물 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
글루타티온 신진대사 글루타티온, 환원된 (GSH) 1.19
5-옥소프롤린 1.02
글루타티온, 산화된 (GSSG) 1.01
시스테인-글루타티온 다이설파이드 1.21
상기 실시예 6에서 기술한 대로, 심장 신진대사는 간 또는 골격근에서의 신진대사와 다르며 FA 흡수/신진대사, 글루코오스 신진대사, 락테이트 생산 및 TCA 사이클 에너지론에서 차이들이 관찰되었다. 글루타티온의 S-락토일글루타티온/글리옥실라제 재생은 트라이오세포스페이트 분해에 의존하며 이것은 간과 골격근에서 관찰되었기 때문에, 이런 경로는 심장에서 관찰된 GSH의 상승에 기여하지 않을 수 있다. 그러나, 상기한 것은 심장 락테이트의 현저한 증가 및 피루베이트의 동시 감소였고, 말레이트/옥살로아세테이트 셔틀(shuttle)의 증가와 관련된 것으로 보이며; 약물로 치료된 동물들 vs. 치료되지 않은 HFD 대조군의 심장들에서 개선된 세포질 산화환원 상태의 잠재적 메커니즘을 제공한다.
심장 근육은 다른 조직으로부터 구별시키는 신진대사 경로에 관여하며, 신진대사 경로는 말레이트가 미토콘드리아로부터 세포질 속으로 운반되며, 이의 옥살로아세테이트로의 전환은 피루베이트의 락테이트로의 전환과 연관이 있는 말레이트-옥살로아세테이트 셔틀(Strong et al., (1979) Eur J Biochem, 102, 625-36) 및 NAD+/NADH의 사이클링을 포함한다.
이런 셔틀은 말레이트-아스파르테이트 셔틀과 연관된 세포질 산화를 잠재적으로 거역함으로써 심근세포들에서 조절된 산화환원-항상성에 대한 가능한 메커니즘으로 제안되었다(Strong et al.,). AntimiR-208a 치료를 통해 HFD 모델에서 산화환원 균형을 유지하는 이런 잠재적 메커니즘은 아래 기술한 치료된 샘플들 및 치료되지 않은 샘플들 사이의 글루타티온 신진대사에서 관찰된 차이들 및 antimiR-208a 치료에 의해 발생하는 환원된 글루타티온(GSH)의 재구성을 위한 심장, 간 및 골격근 중에서 관찰된 메커니즘 차이에 적어도 부분적으로 원인이 될 수 있다.
1주 동안 HFD 상태의 대조군에 비례하여, 1주 동안 HFD와 조합된 antimiR-208a 치료는 제한된 수의 현저한 생화학적 변화들을 초래하였다는 것을 나타낸 실시예 4-7에 기술된 대로 대산산물의 분석은 anti-miR 투여에 의한 유익한 신진대사 차이들의 정도를 입증할 수 있다. 생화학적 변화들의 조직 특이적 패턴들은 HFD 모델에서 anti-miR 치료의 1차 결과로서 간에서 증가와 관련된 미토콘드리아 기능의 개선 및 심장에서 근육 해당과정 및 증가된 지방산 흡수 및 신진대사를 나타내었다. 이런 결과들은 또한 개선된 미토콘드리아 기능을 암시하는 혈장 바이오마커의 차이들에 의해 지지되었다. 또한, antimiR-208a 치료에 반응하여, 간, 근육 및 심장에서 산화환원-항상성의 개선 또는 보존뿐만 아니라 증가된 간 글리코겐 합성은 명백하였다. 복막 후 지방에서 현저한 변화들이 없었고, 이는 C57B1/6 생쥐 모델에서 HFD 및/또는 조합된 HFD + antimiR-208a 치료의 짧은 지속과 일치한다.
실시예 9: AntimiR-208은 다이펩타이드 축적을 증진한다
다이펩타이드에 대한 대사체학 분석을 고지방 식사(HFD) 단독 또는 antimiR-208a(M-10101)와 조합된 HFD로 치료한 생쥐로부터의 골격근에 대해 실시예 4에 기술된 대로 실행하였다. 아미노산 다이펩타이드는 단백질 합성, 따라서 근육 성장에 대한 빌딩 블럭으로서 사용될 수 있다. Anti-miR에 의한 HFD 동물들의 치료는 여러 골격근 다이펩타이드 수준의 증가를 유발하였다(확인된 20개 중 증가 15개, 20개 중 5개 통계적 유의성, p<0.05 및 나머지 3개 추세적 유의성을 가짐)(표 24).
심장 글루타티온 신진대사에서 대사산물 대한 상대 배수 변화
서브 경로 생화학물질 그룹 1/그룹 2
(변화의 상대 배수)
다이펩타이드 글리실발린 1.24
글리실루신 1.2
알라닐발린 2.01
알라닐루신 1.2
알라닐티로신 1.63
프롤일루신 1.15
루실루신 0.86
발릴루신 1.89
히스티딜루신 0.94
아이소루실알라닌 1.05
아이소루실글리신 0.93
아이소루실세린 1,31
루실알라닌 1.45
루실글리신 1.37
루실세린 1.24
리실루신 1.32
페닐알라닐세린 1
세릴루신 1.64
세릴페닐알라닌 1.41
트레오닐루신 2.14
골격근 다이펩타이드의 넓은 증가는 다이펩타이드 빌딩 블럭들의 축적을 초래하는 골격근 성장의 억제를 나타낸다. 따라서, antimiR-208a는 골격근 단백질 합성을 변형시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Miragen Therapeutics The Board of Regents, The University of Texas System Rooij, Eva van Olson, Eric Grueter, Chad <120> CONTROL OF WHOLE BODY ENERGY HOMEOSTASIS BY MICRORNA REGULATION <130> MIRG-031/02WO 308934-2261 <140> PCT/US2012/059349 <141> 2012-10-09 <150> US 61/638,345 <151> 2012-04-25 <150> US 61/544,187 <151> 2011-10-06 <160> 99 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> miR-208a or miR-208b antisense oligonucleotide <400> 1 tgctcgtctt a 11 <210> 2 <211> 11 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> miR-208a or miR-208b antisense oligonucleotide <400> 2 tgttcgtctt a 11 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> miR-208a or miR-208b antisense oligonucleotide <400> 3 ctttttgctc gtctta 16 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> miR-208a or miR-208b antisense oligonucleotide <400> 4 ccttttgttc gtctta 16 <210> 5 <211> 71 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 acgggcgagc ttttggcccg ggttatacct gatgctcacg 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<221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a locked nucleic acid adenosine <400> 15 tgctcgtctt a 11 <210> 16 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 208fam_optdes3 oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> 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guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a locked nucleic acid adenosine <400> 17 tgcacgtctt a 11 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 208a LNA C_T_DNA_16_1 oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> May be a phosphorothioate thymidine 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<222> (12)..(12) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> May be a locked nucleic acid thymidine <400> 87 tttgttcgtc ttat 14 <210> 88 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 208b_14_11 oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> May be a deoxy thymidine <400> 88 tttgttcgtc ttat 14 <210> 89 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 208b_14_12 oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked 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thymidine <400> 89 tttgttcgtc ttat 14 <210> 90 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 208b_14_13 oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a 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<223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> May be a deoxy thymidine <400> 92 tttgttcgtc ttat 14 <210> 93 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 208b_16_4 oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> 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(3)..(3) <223> May be a phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> May be a 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phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> May be a phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(16) <223> May be a locked nucleic acid adenosine <400> 96 acttttgtgt agtaca 16 <210> 97 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UnivCont2_15mer oligonucleotide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> May be a phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> May be a phosphorothioate guanosine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate thymidine <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> May be a phosphorothioate adenosine <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> May be a locked nucleic acid phosphorothioate cytidine <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> May be a locked nucleic acid adenosine <400> 97 cttttgtgta gtaca 15 <210> 98 <211> 16 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> miR-208a mature sequence fragment <400> 98 uaagacgagc aaaaag 16 <210> 99 <211> 16 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> miR-208b mature sequence fragment <400> 99 uaagacgaac aaaaag 16

Claims (73)

  1. miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 치료 또는 예방이 필요한 대상에서 신진대사 이상을 치료 또는 예방하는 방법으로서, miR-208a 및/또는 miR-208b의 발현 또는 활성은 투여 이후 대상의 세포들에서 감소하는 것인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    신진대사 이상은 신진대사 증후군, 비만, 당뇨병, 당뇨병성 신장증, 인슐린 저항성, 죽상동맥경화증, 지질 저장 이상, 글리코겐 저장 질환, 중간 사슬 아실-보조효소 A 탈수소효소 결핍, 고 콜레스테롤 또는 이상 글루코오스 섭취 및/또는 사용인 것인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    지질 저장 이상은 니만-피크병, 고세병, 화버병, 파브리병, 월만병 및 콜레스테릴 에스터 저장병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 및/또는 miR-208b의 성숙한 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11에 적어도 부분으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  7. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 당 및/또는 주쇄 변형을 포함하는 것인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    당 변형은 잠금 핵산인 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    당 변형은 2'O-알킬 변형인 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    당 변형은 2'-할로 변형인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    2'-할로 변형은 2'-플루오로 변형인 방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    주쇄 변형은 포스포로티오에이트 결합인 방법.
  13. 제 4 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 6개 내지 약 22개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  14. 제 4 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 또는 miR-208b의 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  15. 제 4 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4의 서열을 갖는 것인 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10674, 10677, 10679, 10707, 10680, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 인간인 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    억제제는 피내, 피하, 근내, 복강내 또는 정맥내 주사 투여 경로에 의해 대상에게 투여되는 것인 방법.
  20. miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 조절제를 세포와 접촉하는 단계를 포함하는 세포에서 지방산 또는 글루코오스 신진대사를 조절하는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 억제제인 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    지방산 또는 글루코오스 신진대사는 억제제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 억제제와 접촉 이후 세포에서 증가되는 것인 방법.
  23. 제 21 항에 있어서,
    miR-208a 및/또는 miR-208b의 억제제는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 및/또는 miR-208b의 성숙한 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 당 및/또는 주쇄 변형을 포함하는 것인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    당 변형은 잠금 핵산인 방법.
  27. 제 25 항에 있어서,
    당 변형은 2'O-알킬 변형인 방법.
  28. 제 25 항에 있어서,
    당 변형은 2'-할로 변형인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    2'-할로 변형은 2'-플루오로 변형인 방법.
  30. 제 25 항에 있어서,
    주쇄 변형은 포스포로티오에이트 결합인 방법.
  31. 제 23 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 6개 내지 약 22개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  32. 제 23 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 miR-208a 또는 miR-208b의 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  33. 제 23 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4의 서열을 갖는 것인 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10674, 10677, 10679, 10707, 10680, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  35. 제 34 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  36. 제 20 항에 있어서,
    상기 조절제는 miR-208a 및/또는 miR-208b 발현 또는 활성의 효현제인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    지방산 또는 글루코오스 신진대사는 효현제에 노출되지 않은 세포와 비교하여 miR-208a 및/또는 miR-208b 효현제와 접촉 이후 세포에서 감소되는 것인 방법.
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서,
    효현제는 miR-208a 및/또는 miR-208b의 성숙한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드인 방법.
  39. 제 20 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포는 심근세포, 골격근 세포, 지방전구세포, 지방세포 또는 간세포인 방법.
  40. 제 20 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포는 인 비트로 또는 인 비보인 방법.
  41. 대상에게 miR-208a 또는 miR-208b 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴크레오티드를 투여하는 단계를 포함하여 강화가 필요한 대상에서 미토콘드리아 기능 또는 산화환원-항상성을 강화하는 방법으로서, miR-208a 또는 miR-208b의 발현 또는 활성은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여 이후 대상의 세포들에서 감소되는 것인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서,
    대상은 근육 약화, 노쇠, 근육감소증, 근육 영양불량증, 근육 위축, 근위축성 측색 경화증, 또는 미토콘드리아 근병증을 앓고 있거나 위험상태인 방법.
  43. 제 42 항에 있어서,
    미토콘드리아 근병증은 미토콘드리아 뇌병증, 유산산증 및 뇌졸중 유사 증후군(MELAS), 간대성 근경련 간질과 불균일 적색근육 섬유병(MERRF), 컨스-세이어 증후군(KSS) 또는 만성진행외안근마비(CPEO)인 방법.
  44. 제 41 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11에 적어도 부분으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  45. 제 41 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4의 서열을 포함하는 것인 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10674, 10677, 10679, 10707, 10680, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  48. 제 41 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 당 및/또는 주쇄 변형을 포함하는 것인 방법.
  49. 제 48 항에 있어서,
    당 변형은 잠금 핵산인 방법.
  50. 제 48 항에 있어서,
    당 변형은 2'O-알킬 변형인 방법.
  51. 제 48 항에 있어서,
    당 변형은 2'-할로 변형인 방법.
  52. 제 51 항에 있어서,
    2'-할로 변형은 2'-플루오로 변형인 방법.
  53. 제 48 항에 있어서,
    주쇄 변형은 포스포로티오에이트 결합인 방법.
  54. 제 41 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 6개 내지 약 22개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  55. 제 54 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 8개 내지 약 16개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  56. 제 41 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 인간인 방법.
  57. 제 41 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 피내, 피하, 근내, 복강내 또는 정맥내 주사 투여 경로에 의해 대상에게 투여되는 것인 방법.
  58. miR-208a 또는 miR-208b의 뉴클레오티드 서열에 완전히 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여 치료가 필요한 대상에서 근육 감소증 또는 근육 위축을 치료하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 11에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.
  60. 제 58 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 4의 서열을 갖는 것인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10674, 10677, 10679, 10707, 10680, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  62. 제 61 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 화합물 10101, 10673, 10681, 또는 10683의 구조를 갖는 것인 방법.
  63. 제 58 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 당 및/또는 주쇄 변형을 포함하는 것인 방법.
  64. 제 63 항에 있어서,
    당 변형은 잠금 핵산인 방법.
  65. 제 63 항에 있어서,
    당 변형은 2'O-알킬 변형인 방법.
  66. 제 63 항에 있어서,
    당 변형은 2'-할로 변형인 방법.
  67. 제 66 항에 있어서,
    2'-할로 변형은 2'-플루오로 변형인 방법.
  68. 제 63 항에 있어서,
    주쇄 변형은 포스포로티오에이트 결합인 방법.
  69. 제 58 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 6개 내지 약 22개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 8개 내지 약 16개 뉴클레오티드 길이인 방법.
  71. 제 58 항 내지 제 70 항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 인간인 방법.
  72. 제 71 항에 있어서,
    대상은 노인인 방법.
  73. 제 58 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고뉴클레오티드는 피내, 피하, 근내, 복강내 또는 정맥내 주사 투여 경로에 의해 대상에게 투여되는 것인 방법.
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