CN105814204B - 促血管生成素样3表达的调节 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于降低动物中ANGPTL3 mRNA和蛋白质的表达的方法、化合物和组合物。本文也提供用于降低动物中的脂质和/或葡萄糖的方法、化合物和组合物。此类方法、化合物和组合物适用于治疗、预防、延迟或改善有需要的个体的心血管疾病和/或代谢疾病中的任何一个或多个、或其症状。

Description

促血管生成素样3表达的调节
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表以2014年12月22日创建，大小是.98MB，命名为BIOL0179WO_ST25.txt的文件形式提供。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本文提供用于降低动物中促血管生成素样3(ANGPTL3)mRNA和蛋白质的表达的方法、化合物和组合物。此外，本文提供用于减轻动物的ANGPTL3相关疾病或病状的具有ANGPTL3抑制剂的方法、化合物和组合物。此类方法、化合物和组合物例如适用于治疗、预防、延迟或改善动物的心血管疾病或代谢综合征中的任何一个或多个、或其症状。
背景
糖尿病和肥胖症(有时总称为“肥胖性糖尿病”)是相互关联的，因为已知肥胖症会加剧糖尿病的病变，并且大于60％的糖尿病患者是肥胖的。大多数人肥胖症伴有胰岛素抗性和瘦素抗性。实际上，已表明肥胖症可比糖尿病自身对胰岛素作用具有甚至更大影响(Sindelka等,Physiol Res.,2002,51,85-91)。另外，已知在售用于治疗糖尿病的若干化合物会诱发重量增加，这是极其不合乎治疗这个疾病需要的副作用。
心血管疾病也与肥胖症和糖尿病相互关联。心血管疾病涵盖广泛多种病因，并且具有同等广泛多种致病因素和相互关联的影响因素。许多致病因素促成各种症状，诸如血浆胆固醇(包括非高密度脂蛋白胆固醇(非HDL-C))水平升高以及其它脂质相关病症。通常被称为血脂异常的此类脂质相关病症包括高脂质血症、高胆固醇血症和高甘油三酯血症以及其它适应症。非HDL胆固醇升高与动脉粥样化形成和它的后遗症相关，所述后遗症包括心血管疾病，诸如动脉硬化、冠状动脉疾病、心肌梗塞、缺血性中风和其它形式的心脏病。在工业化国家，这些分级为最普遍类型的疾病。实际上，在美国，估计1200万人罹患冠状动脉疾病，并且约3600万需要治疗胆固醇水平升高。
流行病学和实验证据已显示高水平的循环甘油三酯(TG)可促成心血管疾病和无数代谢病症(Valdivielso等,2009,Atherosclerosis Zhang等,2008,Circ Res.1；102(2):250-6)。源于外源性或内源性来源的TG被并入，并且以乳糜微粒形式从肠分泌或以极低密度脂蛋白(VLDL)形式从肝分泌。一旦在循环中，TG即由脂蛋白脂肪酶(LpL)水解，并且所得游离脂肪酸可接着由局部组织吸收并用作能量来源。由于LpL对血浆TG以及一般来说代谢具有深远影响，所以发现和开发影响LpL活性的化合物受到极大关注。
代谢综合征是增加某人的心血管疾病和糖尿病风险的医学病症的组合。包括高血压、高甘油三酯、HDL降低和肥胖症的症状倾向于一起显现在一些个体中。这以簇集方式影响许多人。在一些研究中，在美国的发病率被计算为多达人口的25％。代谢综合征以各种其它名称而得知，诸如(代谢)综合征X、胰岛素抗性综合征、里文氏综合征(Reaven'ssyndrome)或CHAOS。由于心血管病症和代谢病症的高发病率，仍然需要用以治疗这些病状的改进方法。
促血管生成素是分泌的生长因子家族。连同它们的相应内皮特异性受体一起，促血管生成素在血管生成中起重要作用。一个家族成员促血管生成素样3(也称为促血管生成素样蛋白3、ANGPT5、ANGPTL3或促血管生成素5)主要在肝中表达，并且被认为在调控脂质代谢方面起作用(Kaplan等,J.Lipid Res.,2003,44,136-143)。考察基因组中与血浆HDL、LDL和甘油三酯浓度相关的常见变体的全基因组关联扫描(GWAS)发现甘油三酯与ANGPTL3附近的单核苷酸多态性(SNP)之间存在关联(Willer等,Nature Genetics,2008,40(2):161-169)。具有纯合性ANGPTL3功能丧失突变的个体呈现以所有致动脉粥样化血浆脂质和脂蛋白的水平都较低，所述脂质和脂蛋白诸如总胆固醇(TC)和TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白B(apoB)、非HDL-C以及HDL-C(Romeo等2009,J Clin Invest,119(1):70-79；Musunuru等2010N Engl J Med,363:2220-2227；Martin-Campos等2012,Clin Chim Acta,413:552-555；Minicocci等2012,J Clin Endocrinol Metab,97:e1266-1275；Noto等2012,Arterioscler Thromb Vasc Biol,32:805-809；Pisciotta等2012,CirculationCardiovasc Genet,5:42-50)。这个临床表型已被称为家族性合并低脂质血症(FHBL2)。尽管VLDL的分泌降低，但患有FHBL2的受试者不具有增加的肝脂肪含量。他们也似乎具有较低血浆葡萄糖和胰岛素水平，并且重要的是，糖尿病与心血管疾病两者均似乎不存在于这些受试者中。迄今为止尚未报道不利临床表型(Minicocci等2013,J of Lipid Research,54:3481-3490)。已在动物模型中显示降低ANGPTL3会导致TG、胆固醇和LDL水平降低(U.S.序列号13/520,997；PCT公布WO 2011/085271)。在ANGPTL3方面有缺陷的小鼠具有极低血浆甘油三酯(TG)和胆固醇水平，而过度表达产生相反作用(Koishi等2002；Koster 2005；Fujimoto2006)。因此，ANGPTL3在脂质代谢中的潜在作用使得它成为对于治疗干预来说有吸引力的靶标。
迄今为止，用以通过直接靶向ANGPTL3水平来治疗心脏代谢疾病的治疗策略一直受限。先前已提出或开发ANGPTL3多肽片段(U.S.序列号12/128,545)、抗ANGPTL3抗体(U.S.序列号12/001,012)和包括反义寡核苷酸的ANGPTL3核酸抑制剂(U.S.序列号13/520,997；PCT公布WO 2011/085271；以引用的方式整体并入本文)，但无直接靶向ANGPTL3的化合物已被核准用于治疗心脏代谢疾病。因此，对于用以抑制ANGPTL3的高度强力和可耐受化合物存在未满足的需要。本文公开的本发明涉及发现新颖高度强力ANGPTL3表达抑制剂以及它们在治疗方面的用途。
发明概述
本文提供用于调节ANGPTL3 mRNA和蛋白质的表达的组合物和方法。在某些实施方案中，组合物是ANGPTL3特异性抑制剂。在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂降低ANGPTL3 mRNA和蛋白质的表达。
在某些实施方案中，组合物是ANGPTL3特异性抑制剂。在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是核酸。在某些实施方案中，核酸是反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物是修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是修饰的寡核苷酸，其由12至30个连接的核苷组成，并且具有包含核碱基序列SEQ ID NO:77的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是修饰的寡核苷酸，其由12至30个连接的核苷组成，并且包含包括具有至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，所述部分与SEQID NO:1的核碱基1140-1159的相等长度部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是修饰的寡核苷酸，其由12至30个连接的核苷组成，并且包含包括具有至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，所述部分与SEQID NO:2的核碱基9715-9734的相等长度部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:2至少80％互补。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是修饰的寡核苷酸，其由20个连接的核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:77的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：(a)由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由5个连接的核苷组成的5’翼区段；(c)由5个连接的核苷组成的3’翼区段；并且其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是修饰的寡核苷酸，其由20个连接的核苷组成，并且具有由SEQ ID NO:77的至少8个连续核碱基组成的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸由以下组成：(a)由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；(b)由5个连接的核苷组成的5’翼区段；(c)由5个连接的核苷组成的3’翼区段；并且其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是由以下结构和标号ISIS 563580表示的修饰的寡核苷酸。在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂包括由以下结构表示的修饰的寡核苷酸ISIS 563580。
Figure BDA0001016123770000061
某些实施方案提供一种组合物，其包含本文所述的化合物或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，对ANGPTL3表达的调节发生在细胞或组织中。在某些实施方案中，调节发生在动物中的细胞或组织中。在某些实施方案中，动物是人。在某些实施方案中，调节是降低ANGPTL3mRNA水平。在某些实施方案中，调节是降低ANGPTL3蛋白质水平。在某些实施方案中，ANGPTL3 mRNA水平与蛋白质水平两者均被降低。此类降低可以时间依赖性或以剂量依赖性方式发生。
某些实施方案提供用于疗法中的组合物和方法。某些实施方案提供用于预防、治疗、延迟ANGPTL3相关疾病、病症和病状，减缓其进展，和/或改善其的组合物和方法。在某些实施方案中，此类疾病、病症和病状是心血管和/或代谢疾病、病症和病状。在某些实施方案中，用于疗法的组合物和方法包括向有需要的个体施用ANGPTL3特异性抑制剂。在某些实施方案中，ANGPTL3特异性抑制剂是核酸。在某些实施方案中，核酸是反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物是修饰的寡核苷酸。
发明详述
应了解上文一般性描述和下文详细描述仅具有示例性和说明性，并且不限制如所要求保护的本发明。在本文中，除非另外明确陈述，否则使用单数包括复数。除非另外陈述，否则如本文所用，使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其它形式(诸如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具有限制性。此外，除非另外明确陈述，否则诸如“要素”或“组分”的术语涵盖包含一个单元的要素和组分与包含超过一个子单元的要素和组分两者。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文件或文件的各部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和专著，都据此关于本文讨论的文件的各部分以引用的方式以及以整体方式明确并入本文。
定义
除非提供明确定义，否则关联本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的程序和技术是本领域中熟知和通常使用的那些。标准技术可用于化学合成和化学分析。当允许时，在本文公开内容整篇中提及的所有专利、申请、公布的申请和其它公布、可通过数据库(诸如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))获得的GENBANK登记号和相关序列信息和其它数据都关于本文讨论的文件的各部分以引用的方式以及以整体方式并入本文。
除非另外指示，否则以下术语具有以下含义：
“2’-O-甲氧基乙基”(也是2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)是指对呋喃糖基环的2’位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基核苷酸”意指包含2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分的核苷酸。
“3’靶标位点”或“3’终止位点”是指靶标核酸的与特定反义化合物的最3’核苷酸互补的核苷酸。
“5’靶标位点”或“5起始位点”是指靶标核酸的与特定反义化合物的最5’核苷酸互补的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意指用连接于5’位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”意指在某一值的±10％内。举例来说，如果陈述“标志物可增加约50％”，那么暗示所述标志物可增加在45％-55％之间
“活性药物制剂”意指药物组合物中一种或多种在向个体施用时提供治疗益处的物质。举例来说，在某些实施方案中，靶向ANGPTL3的反义寡核苷酸是活性药物制剂。
“活性靶标区域”或“靶标区域”意指一种或多种活性反义化合物所靶向的区域。
“活性反义化合物”意指降低靶标核酸水平或蛋白质水平的反义化合物。
“脂肪细胞发生(adipogenesis)”意指从前脂肪细胞发育成脂肪细胞。“脂肪生成(lipogenesis)”意指产生或形成脂肪，即脂肪变性或脂肪浸润。
“肥胖倾向”或“肥胖”是指相对于瘦性体质是肥胖的，或身体脂肪或脂肪组织的量过高的状态。身体脂肪的量包括对脂肪在全身的分布与脂肪组织沉积物的大小和质量两者的考虑。身体脂肪分布可通过皮肤皱褶量度、腰围相对于臀围比率、或诸如超声、计算机断层摄影术或磁共振成像的技术来估计。根据疾病控制和预防中心，身体质量指数(BMI)是30或大于30的个体被视为肥胖。如本文所用的术语“肥胖症”包括其中由于脂肪组织在体内过度积累而存在身体脂肪超过身体需求而增加的病状。术语“肥胖症”包括但不限于以下病状：成人发作性肥胖症；饮食性肥胖症；内源性或代谢性肥胖症；内分泌肥胖症；家族性肥胖症；胰岛功能亢进性肥胖症；增生性-肥大性肥胖症；性腺机能减退性肥胖症；甲状腺机能减退性肥胖症；终生肥胖症；病态性肥胖症和外源性肥胖症。
“相伴施用”是指两种药剂以其中其两者的药理学作用在患者中同时显现的任何方式共同施用。相伴施用不要求两种药剂于单一药物组合物中，以相同剂型或通过相同施用途径施用。两种药剂的作用本身无需同时显现。作用仅需重叠一段时间而无需共同延长。
“施用”意指向动物提供药剂，并且包括但不限于由医学专业人员施用和自行施用。
“药剂”意指在向动物施用时可提供治疗益处的活性物质。“第一药剂”意指本发明的治疗性化合物。举例来说，第一药剂可为靶向ANGPTL3的反义寡核苷酸。“第二药剂”意指本发明的第二治疗性化合物(例如靶向ANGPTL3的第二反义寡核苷酸)和/或非ANGPTL3治疗性化合物。
“改善”是指减轻相关疾病、病症或病状的至少一种指标、征象或症状。指标的严重性可通过本领域技术人员已知的主观或客观量度来确定。
“ANGPTL3”意指ANGPTL3的任何核酸或蛋白质。
“ANGPTL3表达”意指从编码ANGPTL3的基因转录的mRNA的水平或从mRNA翻译的蛋白质的水平。ANGPTL3表达可通过本领域已知的方法，诸如RNA印迹或蛋白质印迹来测定。
“ANGPTL3核酸”意指编码ANGPTL3的任何核酸。举例来说，在某些实施方案中，ANGPTL3核酸包括编码ANGPTL3的DNA序列、从编码ANGPTL3的DNA(包括包含内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列、以及编码ANGPTL3的mRNA序列。“ANGPTL3 mRNA”意指编码ANGPTL3蛋白的mRNA。
“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪以及非人灵长类动物，包括但不限于猴和黑猩猩。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与它的靶标核酸杂交的任何可检测或可测量活性。在某些实施方案中，反义活性是使靶标核酸或由此类靶标核酸编码的蛋白质的量或表达降低。
“反义化合物”意指能够通过氢键合而经受与靶标核酸杂交的寡聚化合物。
“反义抑制”意指相较于在不存在与靶标核酸互补的反义化合物下的靶标核酸水平或靶标蛋白质水平，在所述反义化合物存在下使靶标核酸水平或靶标蛋白质水平降低。
“反义寡核苷酸”意指具有允许与靶标核酸的相应区域或区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“含有ApoB的脂蛋白”意指具有载脂蛋白B作为它的蛋白质组分的任何脂蛋白，并且应理解为包括LDL、VLDL、IDL和脂蛋白(a)，并可通常由降脂质剂和疗法靶向。“含有ApoB-100的LDL”意指含有ApoB-100同工型的LDL。
“动脉粥样硬化”意指影响大尺寸和中等尺寸的动脉的动脉硬化，并且特征在于存在脂肪沉积物。脂肪沉积物被称为“动脉粥样化”或“斑块”，其主要由胆固醇以及其它脂肪、钙和疤痕组织组成，并且损害动脉内衬。
“双环糖”意指通过两个非孪位环原子的桥接而修饰的呋喃糖基环。双环糖是修饰的糖。
“双环核酸”或“BNA”是指其中核苷或核苷酸的呋喃糖部分包括连接呋喃糖环上两个碳原子，由此形成双环环系统的桥的核苷或核苷酸。
“帽结构”或“末端帽部分”意指已被并入在反义化合物的任一末端处的化学修饰。
“心血管疾病”或“心血管病症”是指一组与心脏、血管或循环相关的病状。心血管疾病或病症的实例包括但不限于动脉瘤、绞痛、心律不齐、动脉粥样硬化、脑血管疾病(中风)、冠心病、高血压、血脂异常、高脂质血症和高胆固醇血症。
“心脏代谢疾病”或“心脏代谢病症”是涉及心血管系统与代谢系统两者的疾病或病症。心脏代谢疾病或病症的实例包括但不限于糖尿病和血脂异常。
“化学不同区域”是指反义化合物的以某一方式在化学方面不同于同一反义化合物的另一区域的区域。举例来说，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域在化学方面不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域。
“嵌合反义化合物”意指具有至少两个化学不同区域的反义化合物。
“共同施用”意指向个体施用两种或更多种药剂。两种或更多种药剂可于单一药物组合物中，或可于单独药物组合物中。两种或更多种药剂各自可通过相同或不同施用途径施用。共同施用涵盖并行或依序施用。
“胆固醇”是见于所有动物组织的细胞膜中的固醇分子。胆固醇必须通过脂蛋白在动物的血浆中转运，所述脂蛋白包括极低密度脂蛋白(VLDL)、中等密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。“血浆胆固醇”是指血浆或血清中存在的所有脂蛋白(VDL、IDL、LDL、HDL)酯化和/或非酯化胆固醇的总和。
“胆固醇吸收抑制剂”意指抑制从膳食获得的外源性胆固醇的吸收的药剂。
“互补性”意指第一核酸和第二核酸的核碱基之间配对的能力。在某些实施方案中，第一和第二核酸之间的互补性可为在两条DNA链之间，在两条RNA链之间，或在DNA链与RNA链之间。在某些实施方案中，一条链上的一些核碱基与另一链上的互补性氢键合碱基匹配。在某些实施方案中，一条链上的所有核碱基都与另一链上的互补性氢键合碱基匹配。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物，并且第二核酸是靶标核酸。在某些此类实施方案中，反义寡核苷酸是第一核酸，并且靶标核酸是第二核酸。
“连续核碱基”意指彼此紧邻的核碱基。
“冠心病(CHD)”意指向心脏供应血液和氧的小血管的狭窄，其常常是动脉粥样硬化的结果。
“脱氧核糖核苷酸”意指在核苷酸的糖部分的2’位处具有氢的核苷酸。脱氧核糖核苷酸可用多种取代基中的任一个修饰。
“糖尿病(Diabetes mellitus/diabetes)”是由胰岛素水平不足或胰岛素敏感性降低所致的，特征在于代谢失调以及血糖异常较高(高血糖症)的综合征。特征性症状是归因于高血糖水平的尿产生过度(多尿症)、试图弥补排尿增加的过度口渴和液体摄取增加(烦渴)、归因于高血糖对眼光学影响的视力模糊、无法解释的重量减轻以及嗜睡。
“糖尿病性血脂异常”或“伴有血脂异常的2型糖尿病”意指特征在于2型糖尿病、HDL-C降低、甘油三酯升高以及小致密LDL颗粒升高的病状。
“稀释剂”意指组合物中缺乏药理学活性，但在药学上必要或可合乎需要的成分。举例来说，注射组合物中的稀释剂可为液体，例如盐水溶液。
“血脂异常”是指脂质和/或脂蛋白代谢病症，包括脂质和/或脂蛋白过度产生或缺乏。血脂异常可通过脂质(诸如胆固醇和甘油三酯)以及脂蛋白(诸如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇)的升高来显现。
“剂量单位”意指提供药物制剂所采用的形式，例如丸剂、片剂或本领域中已知的其它剂量单位。在某些实施方案中，剂量单位是含有冻干反义寡核苷酸的小瓶。在某些实施方案中，剂量单位是含有复原的反义寡核苷酸的小瓶。
“剂量”意指在单次施用时或在指定时期内提供的药物制剂的指定量。在某些实施方案中，剂量可以1次、2次或大于2次大丸剂、片剂或注射液方式施用。举例来说，在其中需要皮下施用的某些实施方案中，所需剂量需要不易于通过单次注射提供的体积，因此，两次或更多次注射可用于实现所需剂量。在某些实施方案中，历经一段延长时期或连续通过输注来施用药物制剂。剂量可被陈述为每小时、每天、每周或每月的药物制剂量。剂量可被表示为mg/kg或g/kg。
“有效量”或“治疗有效量”意指活性药物制剂足以在需要所述制剂的个体中实现所需生理结果的量。在个体之间，有效量可视待治疗的个体的健康和身体状况、待治疗的个体的分类组、组合物的配制、对个体的医学病状的评估以及其它相关因素而变化。
“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的核碱基序列的各核碱基在第二核酸的第二核碱基序列中都具有互补性核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物，并且靶标核酸是第二核酸。
“缺口聚体”意指其中具有支持RNA酶H裂解的多个核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中构成所述内部区域的核苷在化学方面不同于一个或多个构成所述外部区域的核苷。内部区域可被称为“缺口区段”，并且外部区域可被称为“翼区段”。
“缺口加宽”意指嵌合反义化合物具有位于具有1至6个核苷的5’翼区段与3’翼区段之间，并且紧邻于5’翼区段和3’翼区段的12个或大于12个连续2’-脱氧核糖核苷的缺口区段。
“葡萄糖”是由细胞用作能量来源和代谢中间体的单糖。“血浆葡萄糖”是指血浆中存在的葡萄糖。
“高密度脂蛋白-C(HDL-C)”意指与高密度脂蛋白颗粒缔合的胆固醇。血清(或血浆)中HDL-C的浓度通常以mg/dL或nmol/L定量。“血清HDL-C”和“血浆HDL-C”分别意指血清和血浆中的HDL-C。
“HMG-CoA还原酶抑制剂”意指通过抑制酶HMG-CoA还原酶来起作用的药剂，诸如阿托伐他汀(atorvastatin)、罗素他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)和辛伐他汀(simvastatin)。
“杂交”意指互补性核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补性核酸分子包括反义化合物和靶标核酸。
根据检测、评估、治疗成人高胆固醇的全国胆固醇教育计划(NCEP)的专家组报告的指导方针，“高胆固醇血症”意指特征在于胆固醇或循环(血浆)胆固醇、LDL-胆固醇和VLDL-胆固醇升高的病状(参见Arch.Int.Med.(1988)148,36-39)。
“高脂质血症”或“高脂血症”是特征在于血清脂质或循环(血浆)脂质升高的病状。这个病状显现脂肪的浓度异常较高。循环血液中的脂质部分是胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和甘油三酯。
“高甘油三酯血症”意指特征在于甘油三酯水平升高的病状。
“鉴定”或“选择患有代谢或心血管疾病的受试者”意指鉴定或选择已被诊断有代谢疾病、心血管疾病或代谢综合征的受试者；或鉴定或选择具有代谢疾病、心血管疾病或代谢综合征的任何症状的受试者，所述症状包括但不限于高胆固醇血症、高血糖症、高脂质血症、高甘油三酯血症、高血压、胰岛素抗性增加、胰岛素敏感性降低、体重超过正常、和/或身体脂肪含量超过正常或其任何组合。此类鉴定可通过包括但不限于以下的任何方法来实现：标准临床测试或评估，诸如测量血清或循环(血浆)胆固醇，测量血清或循环(血浆)血糖，测量血清或循环(血浆)甘油三酯，测量血压，测量身体脂肪含量，测量体重等。
“鉴定”或“选择糖尿病受试者”意指鉴定或选择已被鉴定为糖尿病患者的受试者，或鉴定或选择具有糖尿病(1型或2型)的任何症状的受试者，所述症状诸如但不限于具有空腹葡萄糖至少110mg/dL、糖尿、多尿症、烦渴、胰岛素抗性增加和/或胰岛素敏感性降低。
“鉴定”或“选择肥胖受试者”意指鉴定或选择已被诊断为肥胖的受试者，或鉴定或选择BMI超过30和/或男性腰围大于102cm或女性腰围大于88cm的受试者。
“鉴定”或“选择患有血脂异常的受试者”意指鉴定或选择被诊断有脂质和/或脂蛋白代谢病症，包括脂质和/或脂蛋白过度产生或缺乏的受试者。血脂异常可通过脂质(诸如胆固醇和甘油三酯)以及脂蛋白(诸如低密度脂蛋白(LDL)胆固醇)的升高来显现。
“鉴定”或“选择肥胖倾向增加的受试者”意指鉴定或选择身体脂肪的量(或肥胖倾向)增加的受试者，所述量包括对脂肪在全身的分布以及脂肪组织沉积物的大小和质量中的一者或两者的考虑。身体脂肪分布可通过皮肤皱褶量度、腰围相对于臀围比率、或诸如超声、计算机断层摄影术或磁共振成像的技术来估计。根据疾病控制和预防中心，身体质量指数(BMI)是30或大于30的个体被视为肥胖。
“改进的心血管结果”意指不利心血管事件或其风险的发生降低。不利心血管事件的实例包括不限于死亡、再梗塞、中风、心原性休克、肺水肿、心脏骤停和心房节律障碍。
“紧邻”意指在紧邻要素之间不存在间插要素。
“个体”或“受试者”或“动物”意指被选择供治疗或疗法用的人或非人动物。
“抑制表达或活性”是指降低或阻断表达或活性，并且未必指示完全消除表达或活性。
“胰岛素抗性”定义为其中正常量的胰岛素不足以由细胞(例如脂肪、肌肉和/或肝细胞)产生正常胰岛素应答的病状。脂肪细胞中的胰岛素抗性导致对储存的甘油三酯的水解，这使得血浆中的游离脂肪酸升高。肌肉中的胰岛素抗性降低葡萄糖摄取，而肝中的胰岛素抗性降低葡萄糖储存，其中两种效应均用于升高血糖。归因于胰岛素抗性的高血浆胰岛素和葡萄糖水平常导致代谢综合征和2型糖尿病。
“胰岛素敏感性”是个体加工葡萄糖的有效程度的量度。具有高胰岛素敏感性的个体有效加工葡萄糖，而具有低胰岛素敏感性的个体不有效加工葡萄糖。
“核苷间键联”是指核苷之间的化学键合。
“静脉内施用”意指向静脉中施用。
“连接的核苷”意指键合在一起的邻近核苷。
“降脂质”意指降低受试者中一种或多种脂质。降脂质可随时间以一次或多次剂量来进行。
“降脂质剂”意指向受试者提供以在所述受试者中实现脂质降低的药剂，例如ANGPTL3特异性调节剂。举例来说，在某些实施方案中，向受试者提供降脂质剂以降低受试者中apoB、apoC-III、总胆固醇、LDL-C、VLDL-C、IDL-C、非HDL-C、甘油三酯、小致密LDL颗粒和Lp(a)中的一个或多个。
“降脂质疗法”意指向受试者提供以降低受试者中一种或多种脂质的治疗方案。在某些实施方案中，提供降脂质疗法以降低受试者中apoB、apoC-III、总胆固醇、LDL-C、VLDL-C、IDL-C、非HDL-C、甘油三酯、小致密LDL颗粒和Lp(a)中的一个或多个。
诸如VLDL、LDL和HDL的“脂蛋白”是指一组见于血清、血浆和淋巴中的蛋白质，并且对于脂质转运是重要的。各脂蛋白的化学组成不同，因为HDL具有的蛋白质相对于脂质的比例较高，而VLDL具有蛋白质相对于脂质的比例较低。
“低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)”意指携带于低密度脂蛋白颗粒中的胆固醇。血清(或血浆)中LDL-C的浓度通常以mg/dL或nmol/L定量。“血清LDL-C”和“血浆LDL-C”分别意指血清和血浆中的LDL-C。
“主要风险因素”是指促成特定疾病或病状的高风险的因素。在某些实施方案中，冠心病的主要风险因素包括不限于抽烟、高血压、HDL-C较低、冠心病家族史、年龄和本文公开的其它因素。
“代谢病症”或“代谢疾病”是指特征在于代谢功能改变或紊乱的病状。“代谢(metabolic/metabolism)”是本领域中熟知的术语，并且通常包括发生在活生物体内的整个范围的生物化学过程。代谢病症包括但不限于高血糖症、糖尿病前期、糖尿病(I型和2型)、肥胖症、胰岛素抗性、代谢综合征和归因于2型糖尿病的血脂异常。
“代谢综合征”意指特征在于具有代谢来源的一簇脂质和非脂质心血管风险因素的病状。在某些实施方案中，代谢综合征是通过存在任何3个以下因素来鉴定：男性腰围大于102cm或女性腰围大于88cm；血清甘油三酯是至少150mg/dL；男性HDL-C小于40mg/dL或女性HDL-C小于50mg/dL；血压是至少130/85mmHg；以及空腹葡萄糖是至少110mg/dL。这些决定因素可易于在临床实践中测量(JAMA,2001,285:2486-2497)。
“错配”或“非互补性核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能够与第二或靶标核酸的相应核碱基配对时的情况。
“混合血脂异常”意指特征在于胆固醇升高以及甘油三酯升高的病状。
“修饰的核苷间键联”是指从天然存在的核苷间键合(即磷酸二酯核苷间键合)进行的取代或任何变化。
“修饰的核碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶以外的任何核碱基。“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”意指独立地具有一个或多个修饰的糖部分或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”意指独立地具有一个或多个修饰的糖部分、修饰的核苷间键联或修饰的核碱基的核苷酸。“修饰的核苷”意指独立地具有一个或多个修饰的糖部分或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个修饰的核苷酸的寡核苷酸。
“修饰的糖”是指从天然糖进行的取代或变化。
“基序”意指反义化合物中化学不同区域的样式。
“MTP抑制剂”意指抑制酶微粒体甘油三酯转移蛋白的药剂。
“天然存在的核苷间键联”意指3'至5'磷酸二酯键联。
“天然糖部分”意指见于DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中的糖。
“非酒精性脂肪肝疾病”或“NAFLD”意指特征在于具有不归因于过度使用酒精(例如酒精消耗超过20g/天)的肝脂肪炎症的病状。在某些实施方案中，NAFLD与胰岛素抗性和代谢综合征相关。NAFLD涵盖在肝细胞中单纯甘油三酯积累(肝脂肪变性)至伴有炎症(脂肪性肝炎)、纤维化和肝硬化的肝脂肪变性的范围内的疾病谱。
“非酒精性脂肪性肝炎”(NASH)由于NAFLD超出甘油三酯沉积进行进展而发生。能够诱发坏死、炎症和纤维化的“第二命中物(hit)”为NASH的发展所需。第二命中物的候选物可被分组成以下宽泛种类：导致氧化应激增加的因素和促进促炎性细胞因子的表达的因素。已表明肝甘油三酯增加导致动物和人的肝细胞中氧化应激增加，从而指示肝甘油三酯积累、氧化应激以及肝脂肪变性进展成NASH之间的潜在因果关系(Browning和Horton,JClin Invest,2004,114,147-152)。高甘油三酯血症和高脂肪酸血症可导致甘油三酯在外周组织中积累(Shimamura等,Biochem Biophys Res Commun,2004,322,1080-1085)。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微小RNA(miRNA)。核酸也可在单一分子中包含这些要素的组合。
“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基序列”意指连续核碱基的独立于任何糖、键联或核碱基修饰的顺序。
“核苷”意指连接于糖的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于替换寡聚化合物的一个或多个位置处的糖或糖和碱基而未必替换键联的那些结构，诸如例如具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物(例如非呋喃糖单元)的核苷模拟物。
“核苷酸”意指具有共价连接于核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。
“核苷酸模拟物”包括用于替换寡聚化合物的一个或多个位置处的核苷和键联的那些结构，诸如例如肽核酸或吗啉代寡核苷酸(morpholinos)(由-N(H)-C(＝O)-O-或其它非磷酸二酯键联连接的吗啉代寡核苷酸)。
“寡聚化合物”或“寡聚物”是指包含两个或更多个亚结构，并且能够与核酸分子的区域杂交的聚合结构。在某些实施方案中，寡聚化合物是寡核苷。在某些实施方案中，寡聚化合物是寡核苷酸。在某些实施方案中，寡聚化合物是反义化合物。在某些实施方案中，寡聚化合物是反义寡核苷酸。在某些实施方案中，寡聚化合物是嵌合寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，所述核苷各自可独立于彼此被修饰或未修饰。
“胃肠外施用”意指以除通过消化道以外的方式施用。胃肠外施用包括局部施用、皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。施用可为连续的，或长期的，或短暂的或间歇的。
“肽”意指通过酰胺键连接至少两个氨基酸所形成的分子。肽是指多肽和蛋白质。
“药物制剂”意指在向个体施用时提供治疗益处的物质。举例来说，在某些实施方案中，靶向ANGPTL3的反义寡核苷酸是药物制剂。
“药物组合物”意指适于向个体施用的物质的混合物。举例来说，药物组合物可包含一种或多种活性剂和无菌水溶液。
“药学上可接受的载体”意指不干扰寡核苷酸的结构或功能的介质或稀释剂。某些此类载体使得药物组合物能够被配制成例如供受试者口服摄取的片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、浆液、混悬剂和糖锭剂。某些此类载体使得药物组合物能够被配制以用于注射或输注。举例来说，药学上可接受的载体可为无菌水溶液。
“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即保留母体寡核苷酸的所需生物活性，并且不对其赋予非所需毒理学作用的盐。
“硫代磷酸酯键联”意指核苷之间的键联，其中磷酸二酯键通过用硫原子替换一个非桥接氧原子而被修饰。硫代磷酸酯键联是修饰的核苷间键联。
“部分”意指核酸的确定数目的连续(即连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶标核酸的确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的确定数目的连续核碱基。
“预防”是指延迟或阻止疾病、病症或病状的发作或发展从数分钟至无限期的一段时期。预防也意指降低显现疾病、病症或病状的风险。
“前药”意指以非活性形式制备的治疗剂，其在身体或其细胞内通过内源性酶或其它化学物质或条件的作用转化成活性形式。
“副作用”意指可归因于治疗，除所需作用以外的生理应答。在某些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病变和不适。举例来说，血清中氨基转移酶水平增加可指示肝毒性或肝功能异常。举例来说，胆红素增加可指示肝毒性或肝功能异常。
“单链寡核苷酸”意指未与互补链杂交的寡核苷酸。
“可特异性杂交”是指在其中需要特异性结合的条件下，即在体内测定和治疗性处理的情况下在生理条件下，反义化合物与靶标核酸具有足以诱导所需作用的互补性程度，同时展现最小或不展现对非靶标核酸的作用。
“他汀类(Statin)”意指抑制HMG-CoA还原酶的活性的药剂。
“皮下施用”意指仅在皮肤以下施用。
“靶向(targeting/targeted)”意指设计和选择将特异性与靶标核酸杂交并诱导所需作用的反义化合物的过程。
“靶标核酸”、“靶标RNA”和“靶标RNA转录物”全都是指能够由反义化合物靶向的核酸。
“靶标区域”定义为靶标核酸的具有至少一种可鉴定结构、功能或特征的部分。
“靶标区段”意指靶标核酸的由一种或多种反义化合物靶向的核苷酸序列。“5’靶标位点”或“5’起始位点”是指靶标区段的最5’核苷酸。“3’靶标位点”或“3’终止位点”是指靶标区段的最3’核苷酸。
“治疗有效量”意指药剂的向个体提供治疗益处的量。
“治疗性生活方式变化”意指意图降低脂肪/脂肪组织质量和/或胆固醇的膳食和生活方式变化。此类变化可降低发展心脏病的风险，并且可包括对于总每日卡路里、总脂肪、饱和脂肪、多不饱和脂肪、单不饱和脂肪、碳水化合物、蛋白质、胆固醇、不溶性纤维的膳食摄取量的推荐，以及对于身体活动的推荐。
“甘油三酯”意指由与三个脂肪酸分子组合的甘油组成的脂质或中性脂肪。
“2型糖尿病(type 2 diabetes)”(也称为“2型糖尿病(type 2 diabetesmellitus)”或“糖尿病，2型”，并且先前称为“糖尿病2型”、“非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)”、“肥胖症相关的糖尿病”或“成人发作性糖尿病”)是一种特征主要在于胰岛素抗性、相对胰岛素缺乏和高血糖症的代谢病症。
“治疗”是指施用药物组合物以实现疾病、病症或病状的改变或改进。
“未修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间键联组成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即β-D-脱氧核糖核苷)。
某些实施方案
在本文公开的某些实施方案中，ANGPTL3具有如以GenBank登记号NM_014495.2阐述的序列(作为SEQ ID NO:1并入本文)。在某些实施方案中，ANGPTL3具有如以GenBank登记号NT_032977.9核苷酸33032001至33046000阐述的序列(作为SEQ ID NO:2并入本文)。
本文公开的某些实施方案提供包含由12至30个核苷组成的修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸具有包含至少8个与SEQ ID NO:1-2的相等长度部分互补的连续核碱基的核碱基序列。
本文公开的某些实施方案提供包含长度是12至30个连接的核苷，靶向ANGPTL3的修饰的寡核苷酸的化合物或组合物。ANGPTL靶标可具有选自SEQ ID NO:1-2中的任一个的序列。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且包含包括具有至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，所述部分与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159的相等长度部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或20个连续核碱基与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159的相等长度部分互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且包含与SEQ ID NO:1的核碱基1140至1159互补的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且包含包括具有至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，所述部分与SEQ ID NO:1的核碱基1907至1926的相等长度部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或20个连续核碱基与SEQ ID NO:1的核碱基1907至1926的相等长度部分互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且包含与SEQ ID NO:1的核碱基1907至1926互补的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且包含包括具有至少8个连续核碱基的部分的核碱基序列，所述部分与SEQ ID NO:1的核碱基147至162的相等长度部分互补，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、或16个连续核碱基与SEQ ID NO:1的核碱基147至162的相等长度部分互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且包含与SEQ ID NO:1的核碱基147至162互补的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少80％互补。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由12至30、15至30、18至24、19至22、13至25、14至25、15至25或16至24个连接的核苷组成。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连接的核苷或由这些值中的任何两个界定的范围组成。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的长度是16个连接的核苷。在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的长度是20个连接的核苷。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含包括具有至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或20个连续核碱基的部分的核碱基序列，所述部分与SEQ ID NO:1或2的相等长度部分互补。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且具有包含选自SEQ ID NO:15-27、30-73、75-85、87-232、238、240-243、245-247、249-262、264-397、399-469、471-541、543-600、604-760、762-819、821-966、968-971、973-975、977-990、992-1110、1112-1186、1188-1216、1218-1226、1228-1279、1281-1293、1295-1304、1306-1943、1945-1951、1953-1977、1979-1981、1983-2044、2046-2097、2099-2181、2183-2232、2234-2238、2240-2258、2260-2265、2267-2971、2973-2976、2978-4162、4164-4329、4331-4389、4391-4394、4396-4877中的任一个的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或20个连续核碱基的核碱基序列。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且具有包含核碱基序列SEQ ID NO:77的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或20个连续核碱基的核碱基序列。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且具有包含核碱基序列SEQ ID NO:20的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、或20个连续核碱基的核碱基序列。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且具有包含核碱基序列SEQ ID NO:110的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、或16个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1-2中的任一个至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％互补，如横跨修饰的寡核苷酸的整体所测量。
在某些实施方案中，本文公开的化合物是单链寡核苷酸。在某些实施方案中，本文公开的化合物是单链修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，各核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖是双环糖。在某些实施方案中，至少一个修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基、受约束乙基、3’-氟-HNA或4’-(CH2)n-O-2’桥，其中n是1或2。
在某些实施方案中，所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
本文公开的某些实施方案提供包含修饰的寡核苷酸的化合物或组合物，所述修饰的寡核苷酸具有：a)由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；b)由连接的核苷组成的5’翼区段；和c)由连接的核苷组成的3’翼区段。缺口区段位于5’翼区段与3’翼区段之间，并且各翼区段的各核苷包含修饰的糖。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成，并且包含：由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；由连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，并且其中各翼区段的各核苷包含修饰的糖。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，其具有包含至少8个与SEQ ID NO:1-2的相等长度部分互补的连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由5个连接的核苷组成的5’翼区段；和由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成，并且包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由5个连接的核苷组成的5’翼区段；由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，其具有包含所选核碱基序列SEQ ID NO:77的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由5个连接的核苷组成的5’翼区段；和由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由具有核碱基序列SEQ ID NO:77的20个连接的核苷组成，并且包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由5个连接的核苷组成的5’翼区段；由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸是ISIS 563580。在某些实施方案中，ISIS563580被表征为5-10-5MOE缺口聚体，具有序列(从5’至3’)GGACATTGCCAGTAATCGCA(作为SEQ ID NO:77并入本文)，其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，各胞嘧啶是5’-甲基胞嘧啶，核苷1-5以及16-20各自是2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，并且核苷6-15各自是2’-脱氧核苷。
在某些实施方案中，ISIS 563580由以下化学符号描述：Ges Ges Aes mCes AesTds Tds Gds mCds mCds Ads Gds Tds Ads Ads Tes mCes Ges mCes Ae；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，ISIS 563580由以下化学结构描述：
Figure BDA0001016123770000301
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包括由先前化学结构表示的ISIS 563580。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含由20个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，其具有包含所选核碱基序列SEQ ID NO:20的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由5个连接的核苷组成的5’翼区段；和由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由具有核碱基序列SEQ ID NO:20的20个连接的核苷组成，并且包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由5个连接的核苷组成的5’翼区段；由5个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含由16个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸，其具有包含核碱基序列SEQ ID NO:110的至少8个连续核碱基的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由3个连接的核苷组成的5’翼区段；和由3个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段包含至少一个2’-O-甲氧基乙基糖和至少一个cEt糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由具有核碱基序列SEQ ID NO:110的16个连接的核苷组成，并且包含：由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由3个连接的核苷组成的5’翼区段；由3个连接的核苷组成的3’翼区段；其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中各翼区段包含至少一个2’-O-甲氧基乙基糖和至少一个cEt糖；其中各核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
某些实施方案提供使用本文所述的化合物和组合物抑制ANGPTL3表达的方法。在某些实施方案中，化合物或组合物使ANGPTL3抑制至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少50％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少55％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少60％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少65％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少70％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少75％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少80％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少85％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少90％。在一优选实施方案中，包括修饰的寡核苷酸的反义化合物使ANGPTL3降低至少95％。
某些实施方案提供使用本文所述的化合物和组合物降低甘油三酯、LDL-胆固醇、非HDL胆固醇、VLDL-胆固醇、总胆固醇、ApoB和ApoC-III中的一个或多个的方法。在某些实施方案中，化合物或组合物使甘油三酯、LDL-胆固醇、非HDL胆固醇、VLDL-胆固醇、总胆固醇、ApoB和ApoC-III中的一个或多个降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在某些实施方案中，当如实施例2-3以及7-10中所述以人细胞，例如于Hep3B细胞系中测试时，本文公开的化合物或组合物具有的IC50小于20μM、小于10μM、小于8μM、小于5μM、小于2μM、小于1μM或小于0.8μM。
在某些实施方案中，当如实施例13中所述通过各种参数测量时，本文公开的化合物或组合物由于具有的粘度小于40cP、小于35cP、小于30cP、小于25cP、小于20cP或小于15cP而是有效的。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物是高度耐受的，如通过实施例中所述的体内耐受性测量结果所证明。在某些实施方案中，如本文所述的反义化合物是高度耐受的，如通过ALT和/或AST值超过盐水处理的动物增加至多4倍、3倍、2倍或1.5倍所证明。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物包含修饰的寡核苷酸的盐。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物还包含药学上可接受的载体或稀释剂。
在某些实施方案中，动物是人。
某些实施方案提供在疗法中使用本文所述的化合物和组合物的方法。在某些实施方案中，疗法用于治疗、预防与ANGPTL3升高相关的疾病或减缓其进展。在某些实施方案中，疾病是心血管和/或代谢疾病、病症或病状。在某些实施方案中，代谢和/或心血管疾病包括但不限于肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化、血脂异常、脂肪营养不良、冠心病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、高脂肪酸血症或代谢综合征或其组合。血脂异常可为高脂质血症。高脂质血症可为合并高脂质血症、家族性合并高脂质血症(FCHL)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、或高胆固醇血症与高甘油三酯血症两者。高胆固醇血症可为家族性纯合性高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合性高胆固醇血症(HeFH)。高甘油三酯血症可为家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)或IV型高脂蛋白血症。NAFLD可为肝脂肪变性或脂肪性肝炎。糖尿病可为2型糖尿病或伴有血脂异常的2型糖尿病。
在某些实施方案中，本文公开的化合物或组合物被指定为第一药剂，并且本文公开的方法或用途还包括施用第二药剂。在某些实施方案中，共同施用第一药剂和第二药剂。在某些实施方案中，依序或相伴共同施用第一药剂和第二药剂。
在某些实施方案中，第二药剂是降葡萄糖剂。降葡萄糖剂可包括但不限于治疗性生活方式变化、PPAR激动剂、二肽基肽酶(IV)抑制剂、GLP-1类似物、胰岛素或胰岛素类似物、胰岛素促泌素、SGLT2抑制剂、人胰淀素类似物、双胍、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。降葡萄糖剂可包括但不限于二甲双胍、磺酰脲、罗格列酮(rosiglitazone)、氯茴苯酸(meglitinide)、噻唑烷二酮(thiazolidinedione)、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。磺酰脲可为乙酰苯磺酰环已脲(acetohexamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)或格列齐特(gliclazide)。氯茴苯酸可为那格列奈(nateglinide)或瑞格列奈(repaglinide)。噻唑烷二酮可为匹格列酮(pioglitazone)或罗格列酮。α-葡萄糖苷酶可为阿卡波糖(acarbose)或米格列醇(miglitol)。
在某些实施方案中，第二药剂是降脂质疗法。在某些实施方案中，降脂质疗法可包括但不限于治疗性生活方式变化、HMG-CoA还原酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、MTP抑制剂(例如靶向MTP的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、ApoB抑制剂(例如靶向ApoB的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、ApoC3抑制剂(例如靶向ApoC3的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、PCSK9抑制剂(例如靶向PCSK9的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、CETP抑制剂(例如靶向CETP的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、贝特类(fibrate)、有益油(例如磷虾油或鱼油(例如VascepaR)、亚麻籽油或富含诸如α-亚麻酸(ALA)、二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)的ω-3脂肪酸的其它油)或其任何组合。HMG-CoA还原酶抑制剂可为阿托伐他汀、罗素他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀或辛伐他汀。胆固醇吸收抑制剂可为依折麦布(ezetimibe)。贝特类可为非诺贝特(fenofibrate)、苯扎贝特(bezafibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、氯贝特(clofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)等。
在某些实施方案中，施用包括胃肠外施用。
在某些实施方案中，施用本文公开的化合物导致脂质水平(包括甘油三酯水平)、胆固醇水平、胰岛素抗性、葡萄糖水平或其组合降低。一种或多种水平可独立地降低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。施用化合物可导致胰岛素敏感性或肝胰岛素敏感性改进。施用本文公开的化合物可导致动脉粥样硬化性斑块、肥胖、葡萄糖、脂质、葡萄糖抗性、胆固醇降低或胰岛素敏感性改进或其任何组合。
某些实施方案提供如本文所述的化合物制造用于治疗、改善、延迟或预防代谢疾病或心血管疾病中的一个或多个的药剂的用途。
某些实施方案提供一种用于治疗、预防或改善如本文所述的代谢疾病或心血管疾病中的一个或多个的试剂盒，其中所述试剂盒包括：a)如本文所述的化合物；以及任选b)如本文所述的另一药剂或疗法。试剂盒可还包括使用试剂盒治疗、预防或改善代谢疾病或心血管疾病中的一个或多个的说明书或标签。
反义化合物
寡聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸和siRNA。寡聚化合物可为靶标核酸的“反义序列”，这意味着能够经受通过氢键合与靶标核酸杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有以下核碱基序列：当在5’至3’方向上书写时包含靶标核酸的由它靶向的靶标区段的反向互补序列。在某些此类实施方案中，反义寡核苷酸具有以下核碱基序列：当在5’至3’方向上书写时包含靶标核酸的由它靶向的靶标区段的反向互补序列。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物的长度是10至30个核苷酸。换句话说，反义化合物是10至30个连接的核碱基。在其它实施方案中，反义化合物包括由8至80、10至80、12至50、12至30、15至30、18至24、19至22、或20个连接的核碱基组成的修饰的寡核苷酸。在某些此类实施方案中，反义化合物包括长度由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连接的核碱基或由任何两个以上值界定的范围组成的修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，反义化合物包括缩短或截短的修饰的寡核苷酸。缩短或截短的修饰的寡核苷酸可从5’末端(5’截短)或者可选地从3’末端(3’截短)缺失单一核苷。缩短或截短的寡核苷酸可从5’末端缺失两个或更多个核苷，或者可选地可从3’末端缺失两个或更多个核苷。可选地，缺失的核苷可分散在整个修饰的寡核苷酸中，例如在从5’末端缺失一个或多个核苷以及从3’末端缺失一个或多个核苷的反义化合物中。
当单一额外核苷存在于加长的寡核苷酸中时，所述额外核苷可位于寡核苷酸的5’末端、3’末端或中心部分。当存在两个或更多个额外核苷时，添加的核苷可彼此邻近，例如在两个核苷被添加至寡核苷酸的5’末端(5’添加)或者可选地3’末端(3’添加)或中心部分的寡核苷酸中。可选地，添加的核苷可分散在整个反义化合物中，例如在一个或多个核苷被添加至5’末端，一个或多个核苷被添加至3’末端，和/或一个或多个核苷被添加至中心部分的寡核苷酸中。
有可能增加或降低诸如反义寡核苷酸的反义化合物的长度，和/或引入错配碱基而不消除活性。举例来说，在Woolf等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，在卵母细胞注射模型中测试一系列长度是13-25个核碱基的反义寡核苷酸诱导靶标RNA裂解的能力。长度是25个核碱基，在反义寡核苷酸的末端附近具有8或11个错配碱基的反义寡核苷酸能够引导对靶标mRNA的特异性裂解，虽然程度小于不含有错配的反义寡核苷酸。类似地，使用具有13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配的那些)实现靶标特异性裂解。
Gautschi等(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,2001年3月)证明与bcl-2 mRNA具有100％互补性以及与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸能够降低bcl-2与bcl-xL两者的体外和体内表达。此外，这个寡核苷酸在体内显示强力抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)在兔网织红细胞测定中测试一系列具有串联14个核碱基的反义寡核苷酸以及分别包含两个或三个串联反义寡核苷酸的序列的具有28和42个核碱基的反义寡核苷酸遏止人DHFR的翻译的能力。三种具有仅仅14个核碱基的反义寡核苷酸各自能够抑制翻译，虽然程度比具有28或42个核碱基的反义寡核苷酸更小。
某些反义化合物基序和机理
在某些实施方案中，反义化合物具有以各种样式或基序排列的化学修饰的亚单位以对反义化合物赋予诸如抑制活性增强、对靶标核酸的结合亲和力增加、或对由体内核酸酶进行的降解具有抗性的性质。嵌合反义化合物通常含有至少一个被修饰以便赋予对核酸酶降解的抗性增加、细胞摄取增加、对靶标核酸的结合亲和力增加、和/或抑制活性增加的区域。嵌合反义化合物的第二区域可赋予另一所需性质，例如充当裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶RNA酶H的底物。
反义活性可由涉及反义化合物(例如寡核苷酸)与靶标核酸杂交的任何机理所致，其中杂交最终产生生物作用。在某些实施方案中，调节靶标核酸的量和/或活性。在某些实施方案中，降低靶标核酸的量和/或活性。在某些实施方案中，反义化合物与靶标核酸杂交最终导致靶标核酸降解。在某些实施方案中，反义化合物与靶标核酸杂交不导致靶标核酸降解。在某些此类实施方案中，存在与靶标核酸杂交的反义化合物(占位性)导致对反义活性的调节。在某些实施方案中，具有特定化学基序或样式的化学修饰的反义化合物特别适于利用一种或多种机理。在某些实施方案中，反义化合物通过超过一种机理和/或通过尚未阐明的机理起作用。因此，本文所述的反义化合物不受特定机理限制。
反义机理包括不限于RNA酶H介导的反义；RNAi机理，其利用RISC路径，并且包括不限于siRNA、ssRNA和微小RNA机理；以及基于占位性的机理。某些反义化合物可通过超过一种此类机理和/或通过其它机理起作用。
RNA酶H介导的反义
在某些实施方案中，反义活性至少部分由RNA酶H降解靶标RNA所致。RNA酶H是一种裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域中已知“DNA样”的单链反义化合物在哺乳动物细胞中引发RNA酶H活性。因此，包含至少一部分DNA或DNA样核苷的反义化合物可活化RNA酶H，从而导致对靶标核酸的裂解。在某些实施方案中，利用RNA酶H的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷。在某些实施方案中，此类反义化合物包含至少一个具有1-8个修饰的核苷的嵌段。在某些此类实施方案中，修饰的核苷不支持RNA酶H活性。在某些实施方案中，此类反义化合物是如本文所述的缺口聚体。在某些此类实施方案中，缺口聚体的缺口包含DNA核苷。在某些此类实施方案中，缺口聚体的缺口包含DNA样核苷。在某些此类实施方案中，缺口聚体的缺口包含DNA核苷和DNA样核苷。
具有缺口聚体基序的某些反义化合物被视为嵌合反义化合物。在一缺口聚体中，具有支持RNA酶H裂解的多个核苷酸的内部区域位于具有在化学方面不同于所述内部区域的核苷的多个核苷酸的外部区域之间。在具有缺口聚体基序的反义寡核苷酸的情况下，缺口区段通常充当核酸内切酶裂解底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口聚体的区域根据构成各不同区域的糖部分的类型来区分。在一些实施方案中，用于区分缺口聚体的区域的糖部分的类型可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'修饰的核苷(此类2’修饰的核苷可尤其包括2’-MOE和2’-O-CH3)和双环糖修饰的核苷(此类双环糖修饰的核苷可包括具有受约束乙基的那些)。在某些实施方案中，翼区中的核苷可包括若干修饰的糖部分，包括例如2’-MOE和双环糖部分，诸如受约束乙基或LNA。在某些实施方案中，翼区可包括若干修饰的和未修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼区可包括2’-MOE核苷、双环糖部分(诸如受约束乙基核苷或LNA核苷)和2’-脱氧核苷的各种组合。
各不同区域可包含统一糖部分、变化或交替糖部分。翼区-缺口-翼区基序常常描述为“X-Y-Z”，其中“X”代表5’翼区的长度，“Y”代表缺口的长度，并且“Z”代表3’翼区的长度。“X”和“Z”可包含统一、变化或交替糖部分。在某些实施方案中，“X”和“Y”可包括一个或多个2’-脱氧核苷。“Y”可包含2’-脱氧核苷。如本文所用，描述为“X-Y-Z”的缺口聚体具有使得缺口的位置紧邻各个5’翼区和3’翼区的构型。因此，在5’翼区与缺口之间，或在缺口与3’翼区之间不存在间插核苷酸。任何本文所述的反义化合物都可具有缺口聚体基序。在某些实施方案中，“X”和“Z”相同；在其它实施方案中，它们不同。在某些实施方案中，“Y”在8个与15个核苷之间。X、Y或Z可为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或大于30个核苷中的任一个。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物具有缺口聚体基序，其中缺口由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连接的核苷组成。
在某些实施方案中，反义寡核苷酸具有由如下式A描述的糖基序：(J)m-(B)n-(J)p-(B)r-(A)t-(D)g-(A)v-(B)w-(J)x-(B)y-(J)z
其中：
各A独立地是2’取代的核苷；
各B独立地是双环核苷；
各J独立地是2’取代的核苷或2’-脱氧核苷；
各D是2’-脱氧核苷；
m是0-4；n是0-2；p是0-2；r是0-2；t是0-2；v是0-2；w是0-4；x是0-2；y是0-2；z是0-4；g是6-14；
前提是：
m、n和r中的至少一个不是0；
w和y中的至少一个不是0；
m、n、p、r和t的总和是2至5；并且
v、w、x、y和z的总和是2至5。
RNAi化合物
在某些实施方案中，反义化合物是干扰RNA化合物(RNAi)，其包括双链RNA化合物(也被称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。此类化合物至少部分通过RISC路径起降解和/或螯合靶标核酸的作用(因此，包括微小RNA/微小RNA模拟化合物)。在某些实施方案中，反义化合物包含使得它们特别适于此类机理的修饰。
i.ssRNA化合物
在某些实施方案中，反义化合物，包括特别适于用作单链RNAi化合物(ssRNA)的那些，包含修饰的5’末端。在某些此类实施方案中，5’末端包含修饰的磷酸酯部分。在某些实施方案中，此类修饰的磷酸酯被稳定化(例如相较于未修饰的5’磷酸酯，对降解/裂解具有抗性)。在某些实施方案中，此类5’末端核苷使5’磷部分稳定。某些修饰的5’末端核苷可见于本领域中，例如WO/2011/139702中。
在某些实施方案中，ssRNA化合物的5’核苷具有式IIc：
Figure BDA0001016123770000411
其中：
T1是任选保护的磷部分；
T2是使式IIc化合物连接于寡聚化合物的核苷间连接基团；
A具有下式中的一个：
Figure BDA0001016123770000412
Q1和Q2各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(R3)(R4)；
Q3是O、S、N(R5)或C(R6)(R7)；
各R3、R4R5、R6和R7独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基或C1-C6烷氧基；
M3是O、S、NR14、C(R15)(R16)、C(R15)(R16)C(R17)(R18)、C(R15)＝C(R17)、OC(R15)(R16)或OC(R15)(Bx2)；
R14是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
R15、R16、R17和R18各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
Bx1是杂环碱基部分；
或如果Bx2存在，那么Bx2是杂环碱基部分，并且Bx1是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
J4、J5、J6和J7各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
或J4与J5或J7中的一个形成桥，其中所述桥包含1至3个选自O、S、NR19、C(R20)(R21)、C(R20)＝C(R21)、C[＝C(R20)(R21)]和C(＝O)的连接的双基基团，并且J5、J6和J7中的另外两个各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
各R19、R20和R21独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
G是H、OH、卤素或O-[C(R8)(R9)]n-[(C＝O)m-X1]j-Z；
各R8和R9独立地是H、卤素、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
X1是O、S或N(E1)；
Z是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或N(E2)(E3)；
E1、E2和E3各自独立地是H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
n是1至约6；
m是0或1；
j是0或1；
各取代的基团包含一个或多个独立地选自卤素、OJ1、N(J1)(J2)、＝NJ1、SJ1、N3、CN、OC(＝X2)J1、OC(＝X2)N(J1)(J2)和C(＝X2)N(J1)(J2)的任选保护的取代基；
X2是O、S或NJ3；
各J1,J2和J3独立地是H或C1-C6烷基；
当j是1时，那么Z不是卤素或N(E2)(E3)；并且
其中所述寡聚化合物包含8至40个单体亚单位，并且可与靶标核酸的至少一部分杂交。
在某些实施方案中，M3是O、CH＝CH、OCH2或OC(H)(Bx2)。在某些实施方案中，M3是O。
在某些实施方案中，J4、J5、J6和J7各自是H。在某些实施方案中，J4与J5或J7中的一个形成桥。
在某些实施方案中，A具有下式中的一个：
Figure BDA0001016123770000441
其中：
Q1和Q2各自独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或取代的C1-C6烷氧基。在某些实施方案中，Q1和Q2各自是H。在某些实施方案中，Q1和Q2各自独立地是H或卤素。在某些实施方案中，Q1和Q2是H，并且Q1和Q2中的另一个是F、CH3或OCH3。
在某些实施方案中，T1具有下式：
Figure BDA0001016123770000442
其中：
Ra和Rc各自独立地是保护的羟基、保护的硫醇、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、保护的氨基或取代的氨基；并且
Rb是O或S。在某些实施方案中，Rb是O，并且Ra和Rc各自独立地是OCH3、OCH2CH3或CH(CH3)2。
在某些实施方案中，G是卤素、OCH3、OCH2F、OCHF2、OCF3、OCH2CH3、O(CH2)2F、OCH2CHF2、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-SCH3、O(CH2)2-OCF3、O(CH2)3-N(R10)(R11)、O(CH2)2-ON(R10)(R11)、O(CH2)2-O(CH2)2-N(R10)(R11)、OCH2C(＝O)-N(R10)(R11)、OCH2C(＝O)-N(R12)-(CH2)2-N(R10)(R11)或O(CH2)2-N(R12)-C(＝NR13)[N(R10)(R11)]，其中R10、R11、R12和R13各自独立地是H或C1-C6烷基。在某些实施方案中，G是卤素、OCH3、OCF3、OCH2CH3、OCH2CF3、OCH2-CH＝CH2、O(CH2)2-OCH3、O(CH2)2-O(CH2)2-N(CH3)2、OCH2C(＝O)-N(H)CH3、OCH2C(＝O)-N(H)-(CH2)2-N(CH3)2或OCH2-N(H)-C(＝NH)NH2。在某些实施方案中，G是F、OCH3或O(CH2)2-OCH3。在某些实施方案中，G是O(CH2)2-OCH3。
在某些实施方案中，5'末端核苷具有式IIe：
Figure BDA0001016123770000451
在某些实施方案中，反义化合物，包括特别适于ssRNA的那些，包含一种或多种类型的以确定样式或糖修饰基序沿寡核苷酸或其区域排列的修饰的糖部分和/或天然存在的糖部分。此类基序可包括任何本文讨论的糖修饰和/或其它已知糖修饰。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有统一糖修饰的区域或由其组成。在某些此类实施方案中，区域的各核苷包含相同RNA样糖修饰。在某些实施方案中，区域的各核苷是2’-F核苷。在某些实施方案中，区域的各核苷是2’-OMe核苷。在某些实施方案中，区域的各核苷是2’-MOE核苷。在某些实施方案中，区域的各核苷是cEt核苷。在某些实施方案中，区域的各核苷是LNA核苷。在某些实施方案中，统一区域构成寡核苷酸的全部或基本上全部。在某些实施方案中，区域构成除1-4个末端核苷之外的整个寡核苷酸。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个具有交替糖修饰的区域，其中核苷在具有第一类型的糖修饰的核苷酸与具有第二类型的糖修饰的核苷酸之间交替。在某些实施方案中，两种类型的核苷均是RNA样核苷。在某些实施方案中，交替核苷选自2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA和cEt。在某些实施方案中，交替修饰是2’-F和2’-OMe。此类区域可为连续的，或可被差异性修饰的核苷或缀合的核苷中断。
在某些实施方案中，具有交替修饰的交替区域各自由单一核苷组成(即样式是(AB)xAy，其中A是具有第一类型的糖修饰的核苷，并且B是具有第二类型的糖修饰的核苷；x是1-20，并且y是0或1)。在某些实施方案中，一个或多个呈交替基序的交替区域包括一个以上具有某一类型的核苷。举例来说，寡核苷酸可包括一个或多个具有任何以下核苷基序的区域：
AABBAA；
ABBABB；
AABAAB；
ABBABAABB；
ABABAA；
AABABAB；
ABABAA；
ABBAABBABABAA；
BABBAABBABABAA；或
ABABBAABBABABAA；
其中A是第一类型的核苷，并且B是第二类型的核苷。在某些实施方案中，A和B各自选自2’-F、2’-OMe、BNA和MOE。
在某些实施方案中，具有此类交替基序的寡核苷酸也包含修饰的5’末端核苷，诸如式IIc或IIe的那些。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有2-2-3基序的区域。此类区域包含以下基序：
-(A)2-(B)x-(A)2-(C)y-(A)3-
其中：A是第一类型的修饰的核苷；
B和C是以不同于A的方式修饰的核苷，然而，B和C可具有彼此相同或不同修饰；
x和y是1至15。
在某些实施方案中，A是2’-OMe修饰的核苷。在某些实施方案中，B和C均是2’-F修饰的核苷。在某些实施方案中，A是2’-OMe修饰的核苷，并且B和C均是2’-F修饰的核苷。
在某些实施方案中，寡核苷具有以下糖基序：
5’-(Q)-(AB)xAy-(D)z
其中：
Q是包含稳定化磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q是具有式IIc或IIe的核苷；
A是第一类型的修饰的核苷；
B是第二类型的修饰的核苷；
D是包含不同于邻近于它的核苷的修饰的修饰的核苷。因此，如果y是0，那么D必须以不同于B的方式修饰，并且如果y是1，那么D必须以不同于A的方式修饰。在某些实施方案中，D不同于A与B两者。
X是5-15；
Y是0或1；
Z是0-4。
在某些实施方案中，寡核苷具有以下糖基序：
5’-(Q)-(A)x-(D)z
其中：
Q是包含稳定化磷酸酯部分的核苷。在某些实施方案中，Q是具有式IIc或IIe的核苷；
A是第一类型的修饰的核苷；
D是包含不同于A的修饰的修饰的核苷。
X是11-30；
Z是0-4。
在某些实施方案中，以上基序中的A、B、C和D选自：2’-OMe、2’-F、2’-MOE、LNA和cEt。在某些实施方案中，D代表末端核苷。在某些实施方案中，此类末端核苷不被设计以与靶标核酸杂交(尽管一个或多个可能偶然杂交)。在某些实施方案中，无论在靶标核酸的相应位置处的核碱基的身份如何，各D核苷的核碱基都是腺嘌呤。在某些实施方案中，各D核苷的核碱基都是胸腺嘧啶。
在某些实施方案中，反义化合物，包括特别适于用作ssRNA的那些，包含以确定样式或修饰的核苷间键联基序沿寡核苷酸或其区域排列的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替核苷间键联基序的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区域。在某些此类实施方案中，寡核苷酸包含由硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸是由硫代磷酸酯核苷间键联统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的各核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的各核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯，并且至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少12个连续硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些此类实施方案中，至少一个此类嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些此类实施方案中，至少一个此类嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
具有本文所述的各种糖基序中的任一个的寡核苷酸可具有任何键联基序。举例来说，寡核苷酸，包括但不限于上述那些，可具有选自以下非限制性表格的键联基序：
最5’键联 中心区域 3’区域
PS 交替PO/PS 6PS
PS 交替PO/PS 7PS
PS 交替PO/PS 8PS
ii.siRNA化合物
在某些实施方案中，反义化合物是双链RNAi化合物(siRNA)。在此类实施方案中，一条或两条链可包含以上对于ssRNA所述的任何修饰基序。在某些实施方案中，ssRNA化合物可为未修饰的RNA。在某些实施方案中，siRNA化合物可包含未修饰的RNA核苷，但修饰的核苷间键联。
若干实施方案涉及双链组合物，其中各链包含由一个或多个修饰或未修饰的核苷的位置确定的基序。在某些实施方案中，提供包含完全或至少部分杂交以形成双链体区域的第一和第二寡聚化合物，以及还包含与核酸靶标互补并与核酸靶标杂交的区域的组合物。适合的是此类组合物包含作为与核酸靶标具有完全或部分互补性的反义链的第一寡聚化合物，和作为具有一个或多个与所述第一寡聚化合物具有互补性的区域并与所述第一寡聚化合物形成至少一个双链体区域的有义链的第二寡聚化合物。
若干实施方案的组合物通过与核酸靶标杂交，从而导致它的正常功能损失来调节基因表达。在一些实施方案中，靶标核酸是ANGPTL3。在某一实施方案中，通过以本文公开的组合物形成的活化的RISC复合物来促进对靶向ANGPTL3的降解。
若干实施方案涉及双链组合物，其中一条链适用于例如影响相对链优先装载至RISC(或裂解)复合物中。组合物适用于靶向所选核酸分子以及调节一种或多种基因的表达。在一些实施方案中，本发明的组合物与靶标RNA的一部分杂交，从而导致所述靶标RNA的正常功能损失。
某些实施方案涉及双链组合物，其中两条链均包含半体(hemimer)基序、完全修饰的基序、定位修饰的基序或交替基序。本发明的组合物的各链可被修饰以实现在例如siRNA路径中的特定作用。在各链中使用不同基序或在各链中使用具有不同化学修饰的相同基序允许使反义链靶向RISC复合物，同时抑制有义链的并入。在这个模型内，各链可被独立地修饰以使它的特定作用得以增强。反义链可在5'末端处被修饰以增强它在RISC的一个区域中的作用，而3'末端可被差异性修饰以增强它在RISC的不同区域中的作用。
双链寡核苷酸分子可为包含自身互补性有义和反义区域的双链多核苷酸分子，其中所述反义区域包含与靶标核酸分子中的核苷酸序列或其一部分互补的核苷酸序列，并且所述有义区域具有对应于靶标核酸序列或其一部分的核苷酸序列。双链寡核苷酸分子可由两个单独寡核苷酸装配，其中一条链是有义链，并且另一链是反义链，其中反义和有义链是自身互补的(即各链包含与另一链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列)；诸如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区域是约15至约30，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对；反义链包含与靶标核酸分子中的核苷酸序列或其一部分互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶标核酸序列或其一部分的核苷酸序列(例如双链寡核苷酸分子的约15至约25或大于25个核苷酸与靶标核酸或其一部分互补)。或者，双链寡核苷酸由单一寡核苷酸装配，其中siRNA的自身互补性有义和反义区域借助于基于核酸或非基于核酸的接头而连接。
双链寡核苷酸可为具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，所述二级结构具有自身互补性有义和反义区域，其中所述反义区域包含与单独靶标核酸分子中的核苷酸序列或其一部分互补的核苷酸序列，并且所述有义区域具有对应于靶标核酸序列或其一部分的核苷酸序列。双链寡核苷酸可为具有两个或更多个环结构和包含自身互补性有义和反义区域的茎的环状单链多核苷酸，其中所述反义区域包含与靶标核酸分子中的核苷酸序列或其一部分互补的核苷酸序列，并且所述有义区域具有对应于靶标核酸序列或其一部分的核苷酸序列，并且其中所述环状多核苷酸可在体内或在体外被加工以产生能够介导RNAi的活性siRNA分子。
在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含单独有义和反义序列或区域，其中所述有义和反义区域由如本领域中已知的核苷酸或非核苷酸接头分子共价连接，或通过离子相互作用、氢键合、范德华(van der waals)相互作用、疏水性相互作用和/或堆积相互作用替代地非共价连接。在某些实施方案中，双链寡核苷酸包含与靶标基因的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在另一实施方案中，双链寡核苷酸以导致抑制靶标基因表达的方式与靶标基因的核苷酸序列相互作用。
如本文所用，双链寡核苷酸无需限于仅含有RNA的那些分子，而是进一步涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸分子缺乏含有2'-羟基(2'-OH)的核苷酸。在某些实施方案中，短干扰核酸任选不包括任何核糖核苷酸(例如具有2'-OH基团的核苷酸)。然而，不要求在分子内存在核糖核苷酸以支持RNAi的此类双链寡核苷酸可具有含有一个或多个具有2'-OH基团的核苷酸的一个或多个连接的接头或其它连接或缔合的基团、部分或链。任选地，双链寡核苷酸可在约5、10、20、30、40或50％的核苷酸位置处包含核糖核苷酸。如本文所用，术语siRNA意图等效于用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其它术语，例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。此外，如本文所用，术语RNAi意图等效于用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语，诸如转录后基因沉默、翻译抑制或表观遗传。举例来说，双链寡核苷酸可用于在转录后水平与转录前水平两者上使基因表观遗传沉默。在一非限制性实例中，通过本发明的siRNA分子来表观遗传调控基因表达可由siRNA介导的对染色质结构或甲基化样式的修饰以改变基因表达所致(参见例如Verdel等,2004,Science,303,672-676；Pal-Bhadra等,2004,Science,303,669-672；Allshire,2002,Science,297,1818-1819；Volpe等,2002,Science,297,1833-1837；Jenuwein,2002,Science,297,2215-2218；以及Hall等,2002,Science,297,2232-2237)。
预期本文提供的若干实施方案的化合物和组合物可通过dsRNA介导的基因沉默或RNAi机理来靶向ANGPTL3，包括例如“发夹”或茎-环双链RNA效应物分子，其中具有自身互补性序列的单一RNA链能够采用双链构象；或包含两个单独RNA链的双链体dsRNA效应物分子。在各种实施方案中，dsRNA完全由核糖核苷酸组成，或由核糖核苷酸和脱氧核苷酸的混合物组成，所述混合物诸如例如由2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.序列号60/130,377公开的RNA/DNA杂交物。dsRNA或dsRNA效应物分子可为具有自身互补性区域的单一分子，以使所述分子的一个区段中的核苷酸与所述分子的另一区段中的核苷酸碱基配对。在各种实施方案中，由单一分子组成的dsRNA完全由核糖核苷酸组成，或包括与脱氧核糖核苷酸区域互补的核糖核苷酸区域。可选地，dsRNA可包括两个具有彼此具有互补性的区域的不同链。
在各种实施方案中，两条链均完全由核糖核苷酸组成，一条链完全由核糖核苷酸组成，并且一条链完全由脱氧核糖核苷酸组成，或一条或两条链含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。在某些实施方案中，互补性区域是彼此以及与靶标核酸序列至少70、80、90、95、98或100％互补。在某些实施方案中，dsRNA的以双链构象存在的区域包括至少19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、50、75、100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸，或包括cDNA中全部核苷酸或dsRNA中代表的其它靶标核酸序列。在一些实施方案中，dsRNA不含有任何单链区域，诸如单链末端，或dsRNA是发夹。在其它实施方案中，dsRNA具有一个或多个单链区域或突出部分。在某些实施方案中，RNA/DNA杂交物包括作为反义链或区域(例如与靶标核酸具有至少70、80、90、95、98或100％互补性)的DNA链或区域和作为有义链或区域(例如与靶标核酸具有至少70、80、90、95、98或100％同一性)的RNA链或区域，并且反之亦然。
在各种实施方案中，RNA/DNA杂交物是使用酶促或化学合成方法在体外制备，所述方法诸如本文所述的那些或2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.序列号60/130,377中所述的那些。在其它实施方案中，在将体外合成的DNA链转化至细胞中之前、之后或同时，使所述DNA链与体内或体外制备的RNA链复合。在其它实施方案中，dsRNA是含有有义和反义区域的单一环状核酸，或dsRNA包括环状核酸以及第二环状核酸或线性核酸(参见例如2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.序列号60/130,377)。示例性环状核酸包括套索结构，其中核苷酸的游离5'磷酰基变得以环回方式连接于另一核苷酸的2'羟基。
在其它实施方案中，dsRNA包括一个或多个修饰的核苷酸，其中糖中的2'位含有卤素(诸如氟基团)或含有烷氧基(诸如甲氧基)，相较于其中相应2'位含有氢或羟基的相应dsRNA，这使得dsRNA的体外或体内半衰期增加。在其它实施方案中，dsRNA在邻近核苷酸之间包括一个或多个除天然存在的磷酸二酯键联以外的键联。此类键联的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯键联。dsRNA也可为如美国专利号6,673,661中教导的化学修饰的核酸分子。在其它实施方案中，dsRNA含有一个或两个加帽链，如例如由2000年4月19日提交的WO 00/63364或1999年4月21日提交的U.S.序列号60/130,377所公开。
在其它实施方案中，dsRNA可为WO 00/63364中公开的至少部分dsRNA分子中的任何一个，以及美国临时申请60/399,998；以及美国临时申请60/419,532和PCT/US2003/033466中所述的dsRNA分子中的任何一个，所述专利的教义据此以引用的方式并入本文。dsRNA中的任何一个都可使用本文所述的方法或标准方法(诸如WO 00/63364中所述的那些)在体外或在体内表达。
占位性
在某些实施方案中，不预期反义化合物通过RNA酶H导致靶标核酸裂解，或通过RISC路径导致裂解或螯合。在某些此类实施方案中，反义活性可由占位性所致，其中存在杂交的反义化合物会破坏靶标核酸的活性。在某些此类实施方案中，反义化合物可被统一修饰，或可包含混合修饰和/或修饰和未修饰的核苷。
靶标核酸、靶标区域和核苷酸序列
编码ANGPTL3的核苷酸序列包括不限于以下：如以GenBank登记号NM_014495.2(作为SEQ ID NO:1并入本文)或GenBank登记号NT_032977.9核苷酸33032001至33046000(作为SEQ ID NO:2并入本文)阐述的人序列。应了解本文含有的实施例中以各SEQ ID NO阐述的序列独立于对糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰。因此，由SEQ ID NO确定的反义化合物可独立地包含一个或多个对糖部分、核苷间键联或核碱基的修饰。由Isis编号(Isis号)描述的反义化合物指示核碱基序列和基序的组合。
在某些实施方案中，靶标区域是靶标核酸的结构确定区域。举例来说，靶标区域可涵盖3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合处、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其它确定的核酸区域。ANGPTL3的结构确定区域可通过登记号从诸如NCBI的序列数据库获得，并且此类信息以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，靶标区域可涵盖从靶标区域内一个靶标区段的5’靶标位点至靶标区域内另一靶标区段的3’靶标位点的序列。
在某些实施方案中，“靶标区段”是核酸内靶标区域的较小子部分。举例来说，靶标区段可为靶标核酸的由一种或多种反义化合物靶向的核苷酸序列。“5’靶标位点”或“5’起始位点”是指靶标区段的最5’核苷酸。“3’靶标位点”或“3’终止位点”是指靶标区段的最3’核苷酸。
靶向包括确定至少一个由反义化合物杂交的靶标区段，以使发生所需作用。在某些实施方案中，所需作用是降低mRNA靶标核酸水平。在某些实施方案中，所需作用是降低由靶标核酸编码的蛋白质的水平或是与靶标核酸相关的表型变化。
靶标区域可含有一个或多个靶标区段。靶标区域内多个靶标区段可为重叠的。可选地，它们可为非重叠的。在某些实施方案中，靶标区域内靶标区段相隔至多约300个核苷酸。在某些实施方案中，靶标区域内靶标区段相隔靶标核酸上是以下数目、约以下数目、至多以下数目、至多约以下数目的核苷酸：250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸，或是由任何两个先前值界定的范围。在某些实施方案中，靶标区域内靶标区段相隔靶标核酸上至多或至多约5个核苷酸。在某些实施方案中，靶标区段是连续的。涵盖由具有是本文所列的5’靶标位点或3’靶标位点中的任一个的起始核酸的范围界定的靶标区域。
合适的靶标区段可见于5’UTR、编码区、3’UTR、内含子、外显子、或外显子/内含子接合处内。含有起始密码子或终止密码子的靶标区段也是合适的靶标区段。合适的靶标区段可明确排除某一结构确定区域，诸如起始密码子或终止密码子。
确定合适的靶标区段可包括将靶标核酸的序列与整个基因组中其它序列进行比较。举例来说，BLAST算法可用于鉴定在不同核酸之间具有类似性的区域。这个比较可防止选择可以非特异性方式与除所选靶标核酸以外的序列(即非靶标或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
反义化合物在活性靶标区域内的活性(例如如由靶标核酸水平降低百分比所确定)可存在变化。在某些实施方案中，ANGPTL3 mRNA水平降低指示对ANGPTL3蛋白表达的抑制。ANGPTL3蛋白水平降低也指示对靶标mRNA表达的抑制。此外，诸如胆固醇、LDL、甘油三酯或葡萄糖水平降低的表型变化可指示对ANGPTL3 mRNA和/或蛋白质表达的抑制。
杂交
在一些实施方案中，杂交发生在本文公开的反义化合物与ANGPTL3核酸之间。最常见的杂交机理涉及核酸分子的互补性核碱基之间的氢键合(例如沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合)。
杂交可在不同条件下发生。严格条件是序列依赖性的，并且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可特异性与靶标核酸杂交的方法在本领域中是熟知的(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与ANGPTL3核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物的足够数目的核碱基可与靶标核酸的相应核碱基氢键合，以使将发生所需作用(例如反义抑制靶标核酸，诸如ANGPTL3核酸)时，所述反义化合物和所述靶标核酸彼此互补。
反义化合物可横跨ANGPTL3核酸的一个或多个区段杂交，以使间插或邻近区段不涉及于杂交事件中(例如环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与ANGPTL3核酸、其靶标区域、靶标区段或指定部分是或是至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与SEQ ID NO:1-2中的一个或多个的序列是或是至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。可使用常规方法确定反义化合物与靶标核酸的互补性百分比。
举例来说，其中反义化合物的20个核碱基中的18个与靶标区域互补，并且将因此特异性杂交的反义化合物将代表90％互补性。在这个实例中，其余非互补性核碱基可簇集或与互补性核碱基交替，并且无需彼此或与互补性核碱基邻接。因此，长度是18个核碱基，具有4(四)个由两个与靶标核酸具有完全互补性的区域侧接的非互补性核碱基的反义化合物将与靶标核酸具有77.8％总体互补性，并且将因此落在本发明的范围内。可使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序以常规方式确定反义化合物与靶标核酸的区域的互补性百分比(Altschul等,J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649 656)。可例如通过使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的Gap程序(Wisconsin序列分析程序包,供Unix用的第8版,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)，利用默认设置来确定同源性百分比、序列同一性或互补性。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分完全互补(即100％互补)于靶标核酸或其指定部分。举例来说，反义化合物可与ANGPTL3核酸或其靶标区域或靶标区段或靶标序列完全互补。如本文所用，“完全互补”意指反义化合物的各核碱基能够与靶标核酸的相应核碱基精确碱基配对。举例来说，具有20个核碱基的反义化合物与长度是400个核碱基的靶标序列完全互补，只要所述靶标核酸中有相应具有20个核碱基的部分与反义化合物完全互补即可。完全互补也可关于第一和/或第二核酸的指定部分加以使用。举例来说，具有30个核碱基的反义化合物的具有20个核碱基的部分可与长度是400个核碱基的靶标序列“完全互补”。如果靶标序列具有相应具有20个核碱基的部分，其中各核碱基与反义化合物的具有20个核碱基的部分互补，那么具有30个核碱基的寡核苷酸的具有20个核碱基的部分与靶标序列完全互补。同时，视反义化合物的其余10个核碱基是否也与靶标序列互补而定，整个具有30个核碱基的反义化合物可与靶标序列完全互补。
非互补性核碱基的位置可在反义化合物的5’末端或3’末端处。可选地，一个或多个非互补性核碱基可在反义化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补性核碱基时，它们可为连续的(即连接的)或非连续的。在一个实施方案中，非互补性核碱基位于缺口聚体反义寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施方案中，相对于靶标核酸，诸如ANGPTL3核酸或其指定部分，长度是或是多达10、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基的反义化合物包含至多4个、至多3个、至多2个、或至多1个非互补性核碱基。
在某些实施方案中，相对于靶标核酸，诸如ANGPTL3核酸或其指定部分，长度是或是多达10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的反义化合物包含至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个、或至多1个非互补性核碱基。
本文提供的反义化合物也包括与靶标核酸的一部分互补的那些。如本文所用，“部分”是指靶标核酸的区域或区段内确定数目的连续(即连接的)核碱基。“部分”也可指反义化合物的确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的具有至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的具有至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶标区段的具有至少15个核碱基的部分互补。也涵盖与靶标区段的具有至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或大于20个核碱基的部分互补，或由这些值中的任何两个界定的范围的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物也可与特定核苷酸序列、SEQ ID NO、或由特定Isis编号表示的化合物的序列或其部分具有确定同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同核碱基配对能力，那么它与本文公开的序列同一。举例来说，含有尿嘧啶而非公开的DNA序列中的胸苷的RNA将被视为与所述DNA序列同一，因为尿嘧啶与胸苷两者均与腺嘌呤配对。也涵盖本文所述的反义化合物的缩短和加长形式以及相对于本文提供的反义化合物具有非同一碱基的化合物。非同一碱基可彼此邻近或分散在整个反义化合物中。根据相对于反义化合物所比较的序列具有同一碱基配对的碱基数来计算反义化合物的同一性百分比。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的反义化合物或SEQ ID NO或其一部分中的一个或多个至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
修饰
核苷是碱基-糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常是杂环碱基部分。核苷酸是还包括共价连接于核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸酯基团可连接于糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是通过邻近核苷彼此共价连接以形成线性聚合寡核苷酸来形成。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基团通常被认为形成寡核苷酸的核苷间键联。
对反义化合物的修饰涵盖取代或改变核苷间键联、糖部分或核碱基。由于合乎需要的性质，诸如例如细胞摄取增强、对核酸靶标的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增加、或抑制活性增加，所以修饰的反义化合物常常超过天然形式而是优选的。
化学修饰的核苷也可用于增加缩短或截短的反义寡核苷酸对它的靶标核酸的结合亲和力。因此，类似结果可常常以具有此类化学修饰的核苷的较短反义化合物获得。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联是3'至5'磷酸二酯键联。由于合乎需要的性质，诸如例如细胞摄取增强、对靶标核酸的亲和力增强以及在核酸酶存在下的稳定性增加，所以具有一个或多个修饰的，即非天然存在的核苷间键联的反义化合物常常超过具有天然存在的核苷间键联的反义化合物而加以选择。
具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具有磷原子的核苷间键联。代表性含磷核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷和非含磷键联的方法是熟知的。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，反义化合物的各核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
修饰的糖部分
本发明的反义化合物可任选含有一个或多个其中糖基团已被修饰的核苷。此类糖修饰的核苷可对反义化合物赋予增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力、或某一其它有益生物性质。在某些实施方案中，核苷包含化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5'和2'取代基)；非孪位环原子桥接以形成双环核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1和R2各自独立地是H、C1-C12烷基或保护基)替换核糖基环氧原子及其组合。化学修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其它公开的5',2'-双取代的核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)，或用S替换核糖基环氧原子，并且在2'位处进行进一步取代(参见公布的美国专利申请US2005-0130923，于2005年6月16日公布)，或者可选地对BNA进行5'取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。在2’位处的取代基也可选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中各Rl、Rm和Rn独立地是H或取代或未取代的C1-C10烷基。
如本文所用，“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核酸(BNA)的实例包括不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个BNA核苷，其中桥包含下式中的一个：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其类似物，参见2008年7月15日授予的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其类似物，参见以2009年1月8日公布的WO/2009/006478公布的PCT/US2008/068922)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其类似物，参见以2008年12月11日公布的WO/2008/150729公布的PCT/US2008/064591)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见公布的美国专利申请US2004-0171570，2004年9月2日公布)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基(参见2008年9月23日授予的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Chattopadhyaya等,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'(及其类似物，参见以2008年12月8日公布的WO 2008/154401公布的PCT/US2008/066154)。
其它双环核苷已报道于公布的文献中(参见例如：Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372；Elayadi等,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等,Chem.Biol.,2001,8,1-7；Orum等,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；Wahlestedt等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Singh等,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；美国专利号：7,399,845；7,053,207；7,034,133；6,794,499；6,770,748；6,670,461；6,525,191；6,268,490；美国专利公布号：US2008-0039618；US2007-0287831；US2004-0171570；美国专利申请序列号：12/129,154；61/099,844；61/097,787；61/086,231；61/056,564；61/026,998；61/026,995；60/989,574；国际申请WO 2007/134181；WO 2005/021570；WO 2004/106356；WO 94/14226；以及PCT国际申请号：PCT/US2008/068922；PCT/US2008/066154；和PCT/US2008/064591)。可制备具有一个或多个立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖的各先前双环核苷(参见1999年3月25日以WO 99/14226公布的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。
如本文所用，“单环核苷”是指包含不是双环糖部分的修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置处被修饰或取代。
如本文所用，“4’-2’双环核苷”或“4’至2’双环核苷”是指包含呋喃糖环的双环核苷，所述呋喃糖环包含连接所述呋喃糖环的两个碳原子(即连接糖环的2’碳原子和4’碳原子)的桥。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在戊呋喃糖基糖部分的4’与2’碳原子之间具有至少一个桥的化合物，所述桥包括不限于包含1个或1至4个独立地选自以下的连接的基团的桥：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-；其中：x是0、1或2；n是1、2、3或4；各Ra和Rb独立地是H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基团、取代的杂环基团、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环族基团、取代的C5-C7脂环族基团、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或硫氧基(S(＝O)-J1)；并且
各J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基团、取代的杂环基团、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥是4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中各R独立地是H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型确定。举例来说，包含4'-(CH2)-O-2'桥的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。在先前，α-L-亚甲基氧基(4'-CH2-O-2')BNA已被并入显示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括具有4'至2'桥的那些，其中此类桥包括不限于α-L-4'-(CH2)-O-2'、β-D-4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、4'-CH2-N(R)-O-2'、4'-CH(CH3)-O-2'、4'-CH2-S-2'、4'-CH2-N(R)-2'、4'-CH2-CH(CH3)-2'和4'-(CH2)3-2'，其中R是H、保护基或C1-C12烷基。
在某一实施方案中，双环核苷具有下式：
Figure BDA0001016123770000641
其中：
Bx是杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-是-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc是C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支撑介质的共价连接。
在某些实施方案中，双环核苷具有下式：
Figure BDA0001016123770000651
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Za是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇或取代的硫醇。
在一个实施方案中，各取代的基团独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧代基、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd，其中各Jc、Jd和Je独立地是H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，并且X是O或NJc。
在某些实施方案中，双环核苷具有下式：
Figure BDA0001016123770000661
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Zb是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，双环核苷具有下式：
Figure BDA0001016123770000662
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Rd是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
各qa、qb、qc和qd独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，双环核苷具有下式：
Figure BDA0001016123770000671
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qa、qb、qe和qf各自独立地是氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe和qf一起是＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
已描述具有4'-CH2-O-2'桥的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶双环核苷的合成和制备以及它们的寡聚和核酸识别性质(Koshkin等,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。双环核苷的合成也已描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。
也已制备具有诸如4'-CH2-O-2'和4'-CH2-S-2'的4'至2'桥接基团的各种双环核苷的类似物(Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。也已描述包含双环核苷，用作核酸聚合酶的底物的寡脱氧核糖核苷酸双链体的制备(Wengel等,WO 99/14226)。此外，本领域中已描述作为一种新颖构象限制的高亲和力寡核苷酸类似物的2'-氨基-BNA的合成(Singh等,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。此外，已制备2'-氨基-BNA和2'-甲基氨基-BNA，并且先前已报道它们与互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
在某些实施方案中，双环核苷具有下式：
Figure BDA0001016123770000681
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基团、磷部分或与支撑介质的共价连接；
各qi、qj、qk和ql独立地是H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk一起是＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
已描述一种具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的碳环双环核苷(Frier等,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443以及Albaek等,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。也已描述碳环双环核苷的合成和制备以及它们的寡聚和生物化学研究(Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)氧基氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA、(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(也被称为受约束乙基或cEt)、(G)亚甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA、(J)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA和(K)乙烯基BNA，如下所描绘。
Figure BDA0001016123770000691
其中Bx是碱基部分，并且R独立地是H、保护基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
如本文所用，术语“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意指具有取代正常核苷中的戊呋喃糖基残基，并且可被称为糖替代物的六元四氢吡喃“糖”的核苷。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中被称为具有如下说明的四氢吡喃基环系统的己糖醇核酸(HNA)、安尼妥(anitol)核酸(ANA)、甘露糖醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)或氟代HNA(F-HNA)的核苷。
Figure BDA0001016123770000701
在某一实施方案中，选择具有下式的糖替代物：
Figure BDA0001016123770000702
其中：
Bx是杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地是使四氢吡喃核苷类似物连接于寡聚化合物的核苷间连接基团，或T3和T4中的一个是使四氢吡喃核苷类似物连接于寡聚化合物或寡核苷酸的核苷间连接基团，并且T3和T4中的另一个是H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'末端基团或3'末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且
R1和R2中的一个是氢，并且另一个选自卤素、取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X是O、S或NJ1，并且各J1、J2和J3独立地是H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个是甲基。在某些实施方案中，提供THP核苷，其中R1和R2中的一个是F。在某些实施方案中，R1是氟代基，而R2是H；R1是甲氧基，而R2是H，并且R1是甲氧基乙氧基，而R2是H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有超过5个原子和超过1个杂原子的环。举例来说，已报道包含吗啉代糖部分的核苷和它们在寡聚化合物中的使用(参见例如：Braasch等,Biochemistry,2002,41,4503-4510；以及美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444；和5,034,506)。如此处所用，术语“吗啉代”意指具有下式的糖替代物：
Figure BDA0001016123770000711
在某些实施方案中，可例如通过根据以上吗啉代结构添加或改变各种取代基来修饰吗啉代基。此类糖替代物在本文中被称为“修饰的吗啉代基”。
也不加限制地提供修饰的组合，诸如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其它公开的5',2'-双取代的核苷，参见于8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)以及用S替换核糖基环氧原子，并且在2'位处进行进一步取代(参见公布的美国专利申请US2005-0130923，于2005年6月16日公布)，或者可选地对双环核酸进行5'取代(参见于11/22/07公布的PCT国际申请WO 2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位处被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。也已描述碳环双环核苷的合成和制备以及它们的寡聚和生物化学研究(参见例如Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个修饰的环己烯基核苷，其是具有6元环己烯基而非天然存在的核苷中的戊呋喃糖基残基的核苷。修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中所述的那些(参见例如共同拥有的公布的PCT申请WO 2010/036696(于2010年4月10日公布)；Robeyns等,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等,Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等,,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等,Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等,ActaCrystallographica,Section F:Structural Biology and CrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等,Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等,J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；公布的PCT申请WO 06/047842；以及公布的PCT申请WO 01/049687；各自的正文以引用的方式整体并入本文)。某些修饰的环己烯基核苷具有式X。
Figure BDA0001016123770000721
其中独立地对于所述至少一个式X环己烯基核苷类似物中的各个：
Bx是杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地是使环己烯基核苷类似物连接于反义化合物的核苷间连接基团，或T3和T4中的一个是使四氢吡喃核苷类似物连接于反义化合物的核苷间连接基团，并且T3和T4中的另一个是H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'末端基团或3'末端基团；并且
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8和q9各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或其它糖取代基。
许多其它单环、双环和三环环系统在本领域中是已知的，并且适合作为可用于修饰核苷以并入如本文提供的寡聚化合物中的糖替代物(参见例如综述文章：Leumann,Christian J.Bioorg.&Med.Chem.,2002,10,841-854)。此类环系统可经受各种其它取代以进一步增强它们的活性。
如本文所用，“2’修饰的糖”意指在2’位处修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，此类修饰包括选自以下的取代基：卤化物，包括但不限于取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的硫代烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的烯丙基以及取代和未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m是1至约10。其它2'-取代基也可选自：C1-C12烷基,取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报道基团、嵌入剂、用于改进药代动力学性质的基团、或用于改进反义化合物的药效学性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2’-MOE侧链(Baker等,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。相较于未修饰的核苷和其它修饰的核苷，诸如2’-O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基，此类2'-MOE取代已被描述为具有改进的结合亲和力。也已显示具有2'-MOE取代基的寡核苷酸是具有有希望供体内使用的特征的基因表达反义抑制剂(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；以及Altmann等,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
如本文所用，“2’修饰”或“2’取代”是指核苷包含的糖在2’位处包含除H或OH以外的取代基。2’修饰的核苷包括但不限于双环核苷，其中连接糖环的两个碳原子的桥使2’碳和糖环的另一碳连接；以及具有非桥接2’取代基的核苷，所述取代基诸如烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中各Rm和Rn独立地是H或取代或未取代的C1-C10烷基。2’修饰的核苷可还包含其它修饰，例如在糖的其它位置处和/或在核碱基处。
如本文所用，“2’-F”是指核苷包含的糖在糖环的2’位处包含氟代基。
如本文所用，“2’-OMe”或“2’-OCH3”、“2’-O-甲基”或“2’-甲氧基”各自是指核苷包含的糖在糖环的2’位处包含-OCH3基团。
如本文所用，“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”各自是指核苷包含的糖在糖环的2’位处包含-OCH2CH2OCH3基团。
用于制备修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。教导此类修饰的糖的制备的一些代表性美国专利包括不限于U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,670,633；5,700,920；5,792,847和6,600,032以及2005年6月2日提交，并且于2005年12月22日以WO 2005/121371公布的国际申请PCT/US2005/019219，并且其各自以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一个或多个被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、修饰或其组合)被维持以与适当核酸靶标杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，修饰的糖部分是2’-MOE。在某些实施方案中，2’-MOE修饰的核苷是以缺口聚体基序排列。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷是在缺口聚体基序的整个翼区中排列。
修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代在结构上可与天然存在或合成未修饰的核碱基区分，但在功能上可与其互换。天然核碱基与修饰的核碱基两者均能够参与氢键合。此类核碱基修饰可对反义化合物赋予核酸酶稳定性、结合亲和力或某一其它有益生物性质。修饰的核碱基包括合成和天然核碱基，诸如例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。包括5-甲基胞嘧啶取代的某些核碱基取代特别适用于增加反义化合物对靶标核酸的结合亲和力。举例来说，已显示5-甲基胞嘧啶取代会使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编,Antisense Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)。
其它修饰的核碱基包括5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧碇和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代基、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代基(特别是5-溴代基、5-三氟甲基)和其它5取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
杂环碱基部分也可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其它杂环，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮置换的那些。特别适用于增加反义化合物的结合亲和力的核碱基包括5取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6及O-6取代的嘌呤(包括2氨基丙基腺嘌呤)、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，靶向ANGPTL3核酸的缩短或缺口加宽的反义寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，各胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
用于配制药物组合物的组合物和方法
可使反义寡核苷酸与药学上可接受的活性或惰性物质掺合以制备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于许多准则，包括但不限于施用途径、疾病程度或待施用的剂量。
可通过组合反义化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载体来使靶向ANGPTL3核酸的反义化合物用于药物组合物中。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。PBS是一种适用于待胃肠外递送的组合物中的稀释剂。因此，在一个实施方案中，用于本文所述的方法中的是一种包含靶向ANGPTL3核酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是PBS。在某些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸。
包含反义化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐、或在向包括人的动物施用后能够提供(直接或间接)生物活性代谢物或其残余物的任何其它寡核苷酸。因此，举例来说，本公开也涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐以及其它生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可包括在反义化合物的一个或两个末端处并入在身体内由内源性核酸酶裂解以形成活性反义化合物的其它核苷。
缀合的反义化合物
可使反义化合物共价连接于一种或多种增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物。典型缀合基团包括胆固醇部分和脂质部分。其它缀合基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、啡嗪、叶酸酯基、啡啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。
反义化合物也可被修饰以具有一个或多个通常连接于反义化合物的一个或两个末端的稳定化基团以增强诸如例如核酸酶稳定性的性质。包括在稳定化基团中的是帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免遭核酸外切酶降解，并且可帮助在细胞内递送和/或定位。帽可存在于5'末端(5'帽)或3'末端(3'帽)，或可存在于两个末端上。帽结构在本领域中是熟知的，并且包括例如反向脱氧无碱基帽。可用于对反义化合物的一个或两个末端加帽以赋予核酸酶稳定性的其它3'和5'稳定化基团包括于2003年1月16日公布的WO 03/004602中公开的那些。
细胞培养和反义化合物处理
可在多种细胞类型中体外测试反义化合物对ANGPTL3核酸的水平、活性或表达的影响。用于此类分析的细胞类型可从商业供应商(例如American Type CultureCollection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；CloneticsCorporation,Walkersville,MD)获得，并且根据供应商说明书，使用可商购获得的试剂(例如Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)培养细胞。说明性细胞类型包括但不限于HepG2细胞、Hep3B细胞、Huh7(肝细胞癌)细胞、原代肝细胞、A549细胞、GM04281纤维母细胞和LLC-MK2细胞。
对反义寡核苷酸的体外测试
本文描述用于用反义寡核苷酸处理细胞的方法，其可被适当修改以用其它反义化合物进行处理。
一般来说，当细胞在培养时达到约60-80％汇合时，用反义寡核苷酸处理细胞。
一种通常用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的试剂包括阳离子脂质转染试剂
Figure BDA0001016123770000781
(Invitrogen,Carlsbad,CA)。使反义寡核苷酸与
Figure BDA0001016123770000782
在
Figure BDA0001016123770000783
1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达到反义寡核苷酸的所需最终浓度和通常在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL的范围内的
Figure BDA0001016123770000784
浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的另一试剂包括LIPOFECTAMINE
Figure BDA0001016123770000785
(Invitrogen,Carlsbad,CA)。使反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE
Figure BDA0001016123770000786
在
Figure BDA0001016123770000787
1降血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达到反义寡核苷酸的所需浓度和通常在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL的范围内的
Figure BDA0001016123770000788
浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的另一试剂包括
Figure BDA0001016123770000789
(Invitrogen,Carlsbad,CA)。使反义寡核苷酸与
Figure BDA00010161237700007810
在
Figure BDA00010161237700007811
1降血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达到反义寡核苷酸的所需浓度和通常在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL的范围内的
Figure BDA0001016123770000791
浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的另一试剂包括OligofectamineTM(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)。使反义寡核苷酸与OligofectamineTM在Opti-MEMTM-1降血清培养基(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中混合以达到寡核苷酸的所需浓度，其中OligofectamineTM与寡核苷酸比率是每100nM约0.2至0.8μL。
用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的另一试剂包括FuGENE 6(RocheDiagnostics Corp.,Indianapolis,IN)。使反义寡聚化合物与FuGENE 6在1mL无血清RPMI中混合以达到寡核苷酸的所需浓度，其中FuGENE 6与寡聚化合物比率是每100nM具有1至4μL FuGENE 6。
用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的另一技术包括电穿孔(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。通常在反义寡核苷酸处理之后16-24小时收获细胞，此时通过本领域中已知以及本文所述的方法测量靶标核酸的RNA或蛋白质水平。一般来说，当以多个平行测定进行处理时，将数据呈现为平行测定处理的平均值。
所用反义寡核苷酸的浓度在细胞系之间变化。用以确定针对特定细胞系的最优反义寡核苷酸浓度的方法在本领域中是熟知的。当用
Figure BDA0001016123770000792
脂质转染剂(Lipofectin)或细胞转染剂(Cytofectin)转染时，通常在1nM至300nM范围内的浓度下使用反义寡核苷酸。当使用电穿孔转染时，在625至20,000nM范围内的较高浓度下使用反义寡核苷酸。
RNA分离
可关于总细胞RNA或多聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。使用本领域中熟知的方法，例如根据制造商推荐的方案，使用
Figure BDA0001016123770000801
试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)制备RNA。
对抑制靶标水平或表达的分析
可以本领域中已知的多种方式测定对ANGPTL3核酸的水平或表达的抑制(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。举例来说，可通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量靶标核酸水平。可关于总细胞RNA或多聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA印迹分析在本领域中也是常规的。可使用可从PE-Applied Biosystems,Foster City,CA获得，并且根据制造商说明书使用的可商购获得的ABI
Figure BDA0001016123770000802
7600、7700或7900序列检测系统便利地完成定量实时PCR。
对靶标RNA水平的定量实时PCR分析
可通过根据制造商说明书，使用ABI
Figure BDA0001016123770000803
7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)进行定量实时PCR来实现对靶标RNA水平的定量。定量实时PCR的方法在本领域中是熟知的。
在实时PCR之前，使分离的RNA经受逆转录酶(RT)反应，其产生接着用作实时PCR扩增的底物的互补DNA(cDNA)。RT和实时PCR反应是在同一样品孔中依序进行。从Invitrogen(Carlsbad,CA)获得RT和实时PCR试剂。通过为本领域技术人员所熟知的方法进行RT和实时PCR反应。
可使用其表达是恒定的基因(诸如亲环蛋白A(cyclophilin A)或GADPH)的表达水平，或通过使用
Figure BDA0001016123770000811
(Life TechnologiesTM,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA来使通过实时PCR获得的基因(或RNA)靶标量标准化。可通过实时PCR，通过与靶标同时、多路化或单独操作来定量亲环蛋白A或GADPH表达。可使用
Figure BDA0001016123770000812
RNA定量试剂定量总RNA。通过
Figure BDA0001016123770000813
定量RNA的方法教导于Jones,L.J.,等(AnalyticalBiochemistry,1998,265,368-374)中。
Figure BDA0001016123770000814
4000仪器(PE AppliedBiosystems)可用于测量
Figure BDA0001016123770000815
荧光。
用于设计实时PCR探针和引物的方法在本领域中是熟知的，并且可包括使用软件，诸如PRIMER
Figure BDA0001016123770000816
软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)。用于实时PCR中的探针和引物被设计以与ANGPTL3特异性序列杂交，并且公开于以下实施例中。靶标特异性PCR探针可具有共价连接于5’末端的FAM和共价连接于3’末端的TAMRA或MGB，其中FAM是荧光染料，并且TAMRA或MGB是淬灭剂染料。
对蛋白质水平的分析
可通过测量ANGPTL3蛋白水平来评估对ANGPTL3核酸的反义抑制。可以本领域中熟知的多种方式评估或定量ANGPTL3的蛋白质水平，所述方式诸如免疫沉淀、蛋白质印迹分析(免疫印迹)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如半胱天冬酶(caspase)活性测定)、免疫组织化学分析、免疫细胞化学分析或荧光激活的细胞分选(FACS)(Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001)。针对某一靶标的抗体可从多种来源，诸如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,MI)鉴定和获得，或可通过本领域中熟知的常规单克隆或多克隆抗体产生方法制备。
对反义化合物的体内测试
在动物中测试例如反义寡核苷酸的反义化合物以评估它们抑制ANGPTL3的表达以及产生表型变化的能力。可在正常动物中或在实验疾病模型中进行测试。对于向动物施用，将反义寡核苷酸配制在药学上可接受的稀释剂，诸如磷酸盐缓冲盐水中。施用包括胃肠外施用途径。在用反义寡核苷酸处理一段时期之后，从组织分离RNA，并且测量ANGPTL3核酸表达的变化。也测量ANGPTL3蛋白水平的变化。
某些适应症
在某些实施方案中，本文提供治疗个体的方法，其包括施用一种或多种如本文所述的药物组合物。在某些实施方案中，个体患有代谢疾病和/或心血管疾病。在某些实施方案中，个体患有高胆固醇血症(例如家族性纯合性高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合性高胆固醇血症(HeFH))、血脂异常、高甘油三酯血症(例如杂合性LPL缺乏症、纯合性LPL缺乏症、冠状动脉疾病(CAD)、家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)、IV型高脂蛋白血症)、脂肪营养不良、高脂质血症(例如合并高脂质血症、家族性合并高脂质血症(FCHL))、代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病(例如2型糖尿病)、血管壁增厚、高血压(例如肺动脉高血压)、硬化症(例如动脉粥样硬化、全身性硬化症、进行性皮肤硬化症和增生性闭塞性血管病变，诸如手指溃疡和肺血管牵连)。
在某些实施方案中，本文所述的靶向ANGPTL3的化合物调节动物中的脂质和/或能量代谢。在某些实施方案中，本文所述的靶向ANGPTL3的化合物调节高胆固醇血症、血脂异常、高甘油三酯血症、代谢综合征、NAFLD、NASH和/或糖尿病的生理标志物或表型。举例来说，向动物施用化合物可调节VLDL、非酯化脂肪酸(NEFA)、LDL、胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、胰岛素或ANGPTL3水平中的一个或多个。在某些实施方案中，对生理标志物或表型的调节可与由化合物对ANGPTL3的抑制相关。
在某些实施方案中，本文所述的靶向ANGPTL3的化合物减轻和/或预防以下中的一个或多个：肝TG积累(即肝脂肪变性)、动脉粥样硬化、血管壁增厚(例如动脉内膜中膜增厚)、高胆固醇血症(例如家族性纯合性高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合性高胆固醇血症(HeFH))、血脂异常、高甘油三酯血症(例如杂合性LPL缺乏症、纯合性LPL缺乏症、家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)、IV型高脂蛋白血症)、脂肪营养不良、高脂质血症(例如合并高脂质血症、家族性合并高脂质血症(FCHL))、代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病(例如2型糖尿病)、高血压和硬化症。在某些实施方案中，本文所述的靶向ANGPTL3的化合物改进胰岛素敏感性。
在某些实施方案中，施用如本文所述的靶向ANGPTL3核酸的反义化合物导致ANGPTL3表达降低约至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或由这些值中的任何两个界定的范围。
在某些实施方案中，施用如本文所述的靶向ANGPTL3核酸的反义化合物导致甘油三酯、LDL-胆固醇、非HDL胆固醇、VLDL-胆固醇、总胆固醇、ApoB和ApoC-III中的一个或多个降低约至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或由这些值中的任何两个界定的范围。
在某些实施方案中，包含靶向ANGPTL3的反义化合物的药物组合物用于制备用以治疗罹患或易患代谢疾病或心血管疾病的患者的药剂。在某些实施方案中，包含靶向ANGPTL3的反义化合物的药物组合物用于制备用以治疗罹患或易患以下中的一个或多个的患者的药剂：高胆固醇血症(例如家族性纯合性高胆固醇血症(HoFH)、家族性杂合性高胆固醇血症(HeFH))、血脂异常、高甘油三酯血症(例如家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)、IV型高脂蛋白血症)、脂肪营养不良、高脂质血症(例如合并高脂质血症、家族性合并高脂质血症(FCHL))、代谢综合征、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、糖尿病(例如2型糖尿病)、血管壁增厚、高血压和硬化症。
施用
在某些实施方案中，胃肠外施用如本文所述的化合物和组合物。
在某些实施方案中，胃肠外施用是通过输注达成。输注可为长期的或连续的或短暂的或间歇的。在某些实施方案中，输注的药物制剂用泵递送。
在某些实施方案中，胃肠外施用是通过注射达成。注射液可用注射器或泵递送。在某些实施方案中，注射是团式注射。在某些实施方案中，直接向组织或器官施用注射液。在某些实施方案中，注射在皮下进行。
某些组合疗法
在某些实施方案中，包含本文公开的修饰的寡核苷酸的第一药剂与一种或多种第二药剂共同施用。在某些实施方案中，此类第二药剂被设计以与本文所述的第一药剂治疗相同疾病、病症或病状。在某些实施方案中，此类第二药剂被设计以与本文所述的第一药剂治疗不同疾病、病症或病状。在某些实施方案中，此类第二药剂被设计以治疗一种或多种如本文所述的药物组合物的非所需副作用。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以治疗第一药剂的非所需作用。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生组合作用。在某些实施方案中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生协同作用。
在某些实施方案中，同时施用第一药剂和一种或多种第二药剂。在某些实施方案中，在不同时间施用第一药剂和一种或多种第二药剂。在某些实施方案中，将第一药剂和一种或多种第二药剂以单一药物制剂形式制备在一起。在某些实施方案中，分开制备第一药剂和一种或多种第二药剂。
在某些实施方案中，第二药剂包括但不限于降葡萄糖剂或降脂质剂。降葡萄糖剂可包括但不限于治疗性生活方式变化、PPAR激动剂、二肽基肽酶(IV)抑制剂、GLP-1类似物、胰岛素或胰岛素类似物、胰岛素促泌素、SGLT2抑制剂、人胰淀素类似物、双胍、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。降葡萄糖剂可包括但不限于二甲双胍、磺酰脲、罗格列酮、氯茴苯酸、噻唑烷二酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂或其组合。磺酰脲可为乙酰苯磺酰环已脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、妥拉磺脲、格列美脲、格列吡嗪、格列本脲或格列齐特。氯茴苯酸可为那格列奈或瑞格列奈。噻唑烷二酮可为匹格列酮或罗格列酮。α-葡萄糖苷酶可为阿卡波糖或米格列醇。在某些实施方案中，降脂质疗法可包括但不限于治疗性生活方式变化、烟酸(niacin)、HMG-CoA还原酶抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、MTP抑制剂(例如靶向MTP的小分子、多肽、抗体或反义化合物)、贝特类、PCSK9抑制剂(例如靶向PCSK9的PCSK9抗体、多肽、小分子核酸化合物)、CETP抑制剂(例如靶向CETP的小分子(诸如托塞曲匹(torcetrapib)和安塞曲匹(anacetrapib))、多肽、抗体或核酸化合物)、apoC-III抑制剂(例如靶向apoC-III的小分子、多肽、抗体或核酸化合物)、apoB抑制剂(例如靶向apoB的小分子、多肽、抗体或核酸化合物)、富含ω-3脂肪酸的有益油、ω-3脂肪酸或其任何组合。HMG-CoA还原酶抑制剂可为阿托伐他汀、罗素他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀等。胆固醇吸收抑制剂可为依折麦布。贝特类可为非诺贝特、苯扎贝特、环丙贝特、氯贝特、吉非罗齐等。富含ω-3脂肪酸的有益油可为磷虾油、鱼油(例如VascepaR)、亚麻籽油等。ω-3脂肪酸可为ALA、DHA、EPA等。
某些化合物
靶向人ANGPTL3的反义寡核苷酸描述于较早公布(参见2011年7月14日公布的PCT专利公布号WO 2011/085271，其以引用的方式整体并入本文)中。其中描述的若干寡核苷酸(233676、233690、233710、233717、233721、233722、337459、337460、337474、337477、337478、337479、337481、337484、337487、337488、337490、337491、337492、337497、337498、337503、337505、337506、337508、337513、337514、337516、337520、337521、337525、337526和337528)，包括体外最强力的前10个反义化合物，在整个体外选择筛选下文所述的新型反义化合物期间被用作基准。在WO 2011/085271中所述的最强力化合物之中，发现ISIS233722在它抑制ANGPTL3的能力方面是高度可变的。因此，尽管最初包括在一些体外研究中，但233722未被选作进一步研究的基准。在先前鉴定的体外强力基准化合物之中，选择5个(233710、233717、337477、337478、337479和337487)以如下文所述在huANGPTL3转基因小鼠中进行体内测试以评估在降低人mRNA转录物和蛋白质表达方面最强力者(实施例11)。在降低ANGPTL3水平方面具有最高初始体内效价的反义寡核苷酸(233710)被用作体内评估下文所述的新型反义化合物的基准。
在某些实施方案中，本文所述的反义化合物得益于相对于WO 2011/085271中所述的反义化合物，一种或多种性质得以改进。这些改进的性质在本文实施例中被证明，并且为便于引用在以下提供实施例的非详尽概述。
在本文所述的第一筛选中，在Hep3B细胞中测试约3000个靶向人ANGPTL3的新设计的5-10-5MOE缺口聚体反义化合物对人ANGPTL3 mRNA的体外影响(实施例1)。以一些先前设计的反义化合物(233717、337484、337487、337492和337516)用作选择研究中的基准，评估新型反义化合物的mRNA抑制水平。在来自这个第一筛选的约3000个新设计的反义化合物之中，选择约85个反义化合物进行体外剂量依赖性抑制研究以确定它们的半数最大抑制浓度(IC50)(实施例2-3)。在被测试它们的半数最大抑制浓度(IC50)的约85个新型反义化合物之中，选择显示强力剂量依赖性降低ANGPTL3的约38个反义化合物以在小鼠中进行体内效价和耐受性(ALT和AST)测试(实施例11-12)，其中以反义化合物233710用作基准。
在本文所述的第二筛选中，也在Hep3B细胞中测试约2000个靶向人ANGPTL3，具有MOE缺口聚体基序或混合基序(脱氧、5-10-5MOE和cET缺口聚体)的新设计的反义化合物对人ANGPTL3 mRNA的体外影响(实施例4-6)。以一些先前设计的反义化合物(233717、337487、337513、337514和337516)用作选择研究中的基准，评估新型反义化合物的抑制水平。在来自这个第二筛选的约2000个新设计的反义化合物之中，选择约147个反义化合物进行体外剂量依赖性抑制研究以确定它们的半数最大抑制浓度(IC50)(实施例7-10)。在被测试它们的半数最大抑制浓度(IC50)的约147个新型反义化合物之中，选择显示强力剂量依赖性降低ANGPTL3的约73个反义化合物以在小鼠中进行体内效价和耐受性(例如ALT和AST)测试(实施例11-12)，其中以反义化合物233710用作基准。
在来自筛选1和2的被在小鼠中测试效价和耐受性的约111个反义化合物之中，选择24个以通过评估肝代谢标志物(诸如丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白和胆红素)以及肾代谢标志物BUN和肌酸酐以及器官重量来在小鼠中进行更广泛耐受性测试(实施例12)。
与体内鼠类研究并行，选择17个反义化合物进行粘度测试(实施例13)。通常，关于粘度不是最优的反义化合物不被前推在进一步研究中采用。
基于小鼠耐受性研究的结果，选择20个反义化合物以在大鼠中进行体内耐受性测试(实施例14)。在大鼠中，测量肝代谢标志物(诸如ALT、AST、白蛋白和胆红素)、身体和器官重量、以及肾代谢标志物(诸如BUN、肌酸酐和总蛋白质/肌酸酐比率)以确定化合物在体内的耐受性。
也评估在大鼠中测试的20个反义化合物与恒河猴(rhesus monkey)ANGPTL3基因序列的交叉反应性(实施例15)。尽管在食蟹猴中测试这个研究中的反义化合物，但食蟹猴ANGPTL3序列不可用于与全长化合物的序列比较，因此将反义化合物的序列与密切相关的恒河猴的序列进行比较。发现8个反义化合物的序列与恒河猴ANGPTL3基因序列具有0-2个错配，并且在食蟹猴中进一步研究(实施例15)。在猴中测试8个反义化合物(ISIS 563580、ISIS 560400、ISIS 567320、ISIS 567321、ISIS 544199、ISIS 567233、ISIS 561011和ISIS559277)对ANGPTL3 mRNA和蛋白质表达的抑制以及耐受性。在耐受性研究中，测量体重、肝代谢标志物(ALT、AST和胆红素)、肾代谢标志物(BUN和肌酸酐)、血液学参数(血细胞计数、血红蛋白和血细胞比容)和促炎性标志物(CRP和C3)。另外，测量肝和肾中存在的全长寡核苷酸浓度，并且计算肾/肝中的全长寡核苷酸的比率。
因此，本文提供具有任何一种或多种改进的特征，例如相对于WO 2011/085271中所述的反义化合物改进的反义化合物。在某些实施方案中，本文提供反义化合物，其包括靶向SEQ ID NO:1-2中的任一个的核苷酸区域或可与所述区域特异性杂交的如本文所述的修饰的寡核苷酸。
在某些实施方案中，某些如本文所述的反义化合物由于它们在抑制ANGPTL3表达方面具有效价而是有效的。在某些实施方案中，化合物或组合物使ANGPTL3抑制至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
在某些实施方案中，当在人细胞中，例如在Hep3B细胞系中测试(如实施例2-3和7-10中所述)时，某些如本文所述的反义化合物由于体外IC50小于20μM、小于10μM、小于8μM、小于5μM、小于2μM,小于1μM、小于0.9μM、小于0.8μM、小于0.7μM、小于0.6μM或小于0.5μM而是有效的。在某些实施方案中，具有IC50<1.0μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO:15、20、24、34、35、36、37、42、43、44、47、50、51、57、58、60、77、79、82、87、88、90、91、93、94、100、101、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、169、170、177、188、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231和232。在某些实施方案中，具有IC50<0.9μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO:15、20、35、36、42、43、44、50、57、60、77、79、87、88、90、91、93、94、101、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、177、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231和232。在某些实施方案中，具有IC50<0.8μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO:15、20、35、36、42、43、44、50、57、60、77、79、87、88、90、91、93、94、101、104、110、111、112、113、114、115、116、117、118、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、177、209、210、211、212、213、214、215、217、218、219、220、221、222、223、224、225、228、229、230、231和232。在某些实施方案中，具有IC50<0.7μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO:15、20、36、42、43、57、60、114、117、127、131、177、209、210、211、212、213、214、215、217、218、219、220、221、222、223、224、225、228、229、230、231和232。在某些实施方案中，具有IC50<0.6μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO:15、20、36、42、43、57、60、114、117、127、131、177、209、210、211、212、213、215、217、218、219、220、221、222、224、225、228、229、230、231和232。在某些实施方案中，具有IC50<0.5μM的优选反义化合物包括SEQ ID NO:43、114、117、127、131、177、209、210、211、212、215、217、218、219、220、221、222、229、230和232。
在某些实施方案中，当通过测定测量(如实施例13中所述)时，某些如本文所述的反义化合物由于具有的粘度小于40cP、小于35cP、小于30cP、小于25cP、小于20cP、小于15cP或小于10cP而是有效的。具有的粘度大于40cP的寡核苷酸将具有小于最优的粘度。在某些实施方案中，具有粘度<20cP的优选反义化合物包括SEQ ID NO:16、18、20、34、35、36、38、49、77、90、93和94。在某些实施方案中，具有粘度<15cP的优选反义化合物包括SEQ ID NO:16、18、20、34、35、38、49、90、93和94。在某些实施方案中，具有粘度<10cP的优选反义化合物包括SEQ ID NO:18、34、35、49、90、93和94。
在某些实施方案中，某些如本文所述的反义化合物是高度耐受的，如通过实施例中所述的体内耐受性测量结果所证明。在某些实施方案中，某些如本文所述的反义化合物是高度耐受的，如通过ALT和/或AST值超过盐水处理的动物增加至多3倍、2倍或1.5倍所证明。
在某些实施方案中，某些如本文所述的反义化合物由于具有以下中的一个或多个而是有效的：抑制效价大于50％、体外IC50小于1μM、粘度小于20cP、以及ALT和/或AST增加至多3倍。
在某些实施方案中，ISIS 563580(SEQ ID NO:77)是优选的。发现这个化合物是ANGPTL3转基因小鼠中强力抑制剂，并且是最耐受的反义化合物。它具有可接受的粘度约16.83cP和体外IC50值<0.8μM。在小鼠中，它使ALT和/或AST水平超过盐水处理的动物增加至多3倍。此外，在猴中，它处于在抑制ANGPTL3方面是最耐受和强力的化合物之中，并且具有最佳全长寡核苷酸浓度比率。
在某些实施方案中，ISIS 544199(SEQ ID NO:20)是优选的。发现这个化合物是强力和耐受的反义化合物。它具有可接受的粘度1.7cP和体外IC50值<0.5μM。在小鼠中，它使ALT和/或AST水平超过盐水处理的动物增加至多3倍。此外，在猴中，它处于在抑制ANGPTL3方面是最强力的化合物之中，并且具有良好全长寡核苷酸浓度比率。
在某些实施方案中，ISIS 559277(SEQ ID NO:110)是优选的。发现这个化合物是强力和耐受的反义化合物。它具有体外IC50值<0.8μM。在小鼠中，它使ALT和/或AST水平超过盐水处理的动物增加至多3倍。此外，在猴中，它处于在抑制ANGPTL3方面是最强力的化合物之中，并且具有良好全长寡核苷酸浓度比率。
实施例
非限制性公开和以引用的方式并入
尽管本文所述的某些化合物、组合物和方法已根据某些实施方案特定描述，但以下实施例仅用于说明本文所述的化合物，并且不意图限制本文所述的化合物。本申请中叙述的参考文献各自以引用的方式整体并入本文。
实施例1：由MOE缺口聚体对Hep3B细胞中人促血管生成素样3的反义抑制
设计靶向促血管生成素样3(ANGPTL3)核酸的反义寡核苷酸，并且体外测试它们对ANGPTL3 mRNA的影响。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。各实验的结果呈现于以下显示的单独表中。使用电穿孔，用4,500nM反义寡核苷酸转染处于每孔20,000个细胞的密度下的培养的Hep3B细胞。在约24小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3mR NA水平。人引物探针组RTS3492_MGB(正向序列CCGTGGAAGAC CAATATAAACAATT，在本文中指定为SEQ ID NO:4；AGTCCTTCTGAGCTGATTTTCTATTTCT；反向序列，在本文中指定为SEQ ID NO:5；探针序列AACCAACAGCATAGTCAAATA，在本文中指定为SEQ ID NO:6)用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770000922
Figure BDA0001016123770000921
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚体。5-10-5MOE缺口聚体的长度是20个核苷，其中中心缺口区段包含10个2’-脱氧核苷，并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼区段侧接。5’翼区段中的各核苷和3’翼区段中的各核苷具有2’-MOE修饰。在整个各缺口聚体中的核苷间键联都是硫代磷酸酯(P＝S)键联。在整个各缺口聚体中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人基因序列中由缺口聚体靶向的最5’核苷。“终止位点”指示人基因序列中由缺口聚体靶向的最3’核苷。下表中所列的各缺口聚体靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人ANGPTL3 mRNA(GENBANK登记号NM_014495.2)或在本文中指定为SEQ ID NO:2的人ANGPTL3基因组序列(GENBANK登记号NT_032977.9，从核苷酸33032001至33046000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表1
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770000931
Figure BDA0001016123770000941
表2
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770000951
Figure BDA0001016123770000961
表3
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770000971
Figure BDA0001016123770000981
表4
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770000991
Figure BDA0001016123770001001
表5
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001011
Figure BDA0001016123770001021
表6
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001031
Figure BDA0001016123770001041
Figure BDA0001016123770001051
Figure BDA0001016123770001061
Figure BDA0001016123770001071
Figure BDA0001016123770001081
表7
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001082
Figure BDA0001016123770001091
Figure BDA0001016123770001101
Figure BDA0001016123770001111
Figure BDA0001016123770001121
Figure BDA0001016123770001131
Figure BDA0001016123770001141
表8
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001142
Figure BDA0001016123770001151
Figure BDA0001016123770001161
Figure BDA0001016123770001171
Figure BDA0001016123770001181
Figure BDA0001016123770001191
Figure BDA0001016123770001201
Figure BDA0001016123770001211
Figure BDA0001016123770001221
Figure BDA0001016123770001231
表9
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001241
Figure BDA0001016123770001251
Figure BDA0001016123770001261
Figure BDA0001016123770001271
Figure BDA0001016123770001281
Figure BDA0001016123770001291
Figure BDA0001016123770001301
Figure BDA0001016123770001311
Figure BDA0001016123770001321
Figure BDA0001016123770001331
表10
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001332
Figure BDA0001016123770001341
Figure BDA0001016123770001351
Figure BDA0001016123770001361
Figure BDA0001016123770001371
Figure BDA0001016123770001381
Figure BDA0001016123770001391
Figure BDA0001016123770001401
Figure BDA0001016123770001411
Figure BDA0001016123770001421
Figure BDA0001016123770001431
表11
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001432
Figure BDA0001016123770001441
Figure BDA0001016123770001451
Figure BDA0001016123770001461
Figure BDA0001016123770001471
Figure BDA0001016123770001481
Figure BDA0001016123770001491
表12
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001492
Figure BDA0001016123770001501
Figure BDA0001016123770001511
Figure BDA0001016123770001521
Figure BDA0001016123770001531
Figure BDA0001016123770001541
表13
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001551
Figure BDA0001016123770001561
Figure BDA0001016123770001571
Figure BDA0001016123770001581
Figure BDA0001016123770001591
Figure BDA0001016123770001601
Figure BDA0001016123770001611
Figure BDA0001016123770001621
Figure BDA0001016123770001631
Figure BDA0001016123770001641
表14
由靶向SEQ ID NO:1和2的5-10-5MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001642
Figure BDA0001016123770001651
Figure BDA0001016123770001661
实施例2：由MOE缺口聚体对Hep3B细胞中人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自上述研究的展现显著体外抑制ANGPTL3 mRNA的5-10-5MOE缺口聚体，并且在各种剂量下在Hep3B细胞中测试。在每孔20,000个细胞的密度下涂铺细胞，并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.75μM、1.50μM、3.00μM、6.00μM和12.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770001662
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
也呈现各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表15
Figure BDA0001016123770001671
实施例3：由MOE缺口聚体对Hep3B细胞中人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自上述研究的展现显著体外抑制ANGPTL3 mRNA的5-10-5MOE缺口聚体，并且在各种剂量下在Hep3B细胞中测试。在每孔20,000个细胞的密度下涂铺细胞，并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.813μM、1.625μM、3.25μM、6.50μM和13.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770001672
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
也呈现各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表16
Figure BDA0001016123770001681
表17
Figure BDA0001016123770001691
表18
Figure BDA0001016123770001701
表19
Figure BDA0001016123770001702
表20
Figure BDA0001016123770001711
表21
Figure BDA0001016123770001712
Figure BDA0001016123770001721
表22
Figure BDA0001016123770001722
表23
Figure BDA0001016123770001731
实施例4：由脱氧、MOE和(S)-cEt缺口聚体对Hep3B细胞中人ANGPTL3的反义抑制
设计靶向ANGPTL3核酸的其它反义寡核苷酸，并且体外测试它们对ANGPTL3 mRNA的影响。使用电穿孔，用4,500nM反义寡核苷酸转染处于每孔20,000个细胞的密度下的培养的Hep3B细胞。在约24小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770001732
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸。脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸的长度是16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧糖残基。各反义寡核苷酸的糖修饰被描述为‘eek-d10-kke’，其中‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；数字指示脱氧核糖糖残基的数目；并且‘e’指示MOE糖修饰。在整个各寡核苷酸中的核苷间键联都是硫代磷酸酯(P＝S)键联。在整个各寡核苷酸中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人基因序列中由寡核苷酸靶向的最5’核苷。“终止位点”指示人基因序列中由寡核苷酸靶向的最3’核苷。下表中所列的各寡核苷酸靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人ANGPTL3 mRNA(GENBANK登记号NM_014495.2)或在本文中指定为SEQ ID NO:2的人ANGPTL3基因组序列(GENBANK登记号NT_032977.9，从核苷酸33032001至33046000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表24
由靶向SEQ ID NO:1和2的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001751
Figure BDA0001016123770001761
Figure BDA0001016123770001771
Figure BDA0001016123770001781
Figure BDA0001016123770001791
Figure BDA0001016123770001801
表25
由靶向SEQ ID NO:1和2的脱氧、MOE和(S)-cEt缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001811
Figure BDA0001016123770001821
Figure BDA0001016123770001831
Figure BDA0001016123770001841
实施例5：由脱氧、MOE和(S)-cEt缺口聚体对Hep3B细胞中人ANGPTL3的反义抑制
设计靶向ANGPTL3核酸的其它反义寡核苷酸，并且体外测试它们对ANGPTL3 mRNA的影响。作为5-10-5MOE缺口聚体的ISIS 337487和ISIS 233717也作为基准寡核苷酸包括在测定中。使用电穿孔，用4,500nM反义寡核苷酸转染处于每孔20,000个细胞的密度下的培养的Hep3B细胞。在约24小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770001852
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸或5-10-5MOE缺口聚体。脱氧、MOE和(S)-cEt寡核苷酸的长度是16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、(S)-cEt糖修饰或脱氧糖残基。各反义寡核苷酸的糖修饰被描述为‘eek-d10-kke’，其中‘k’指示(S)-cEt糖修饰；‘d’指示脱氧核糖；数字指示脱氧核糖糖残基的数目；并且‘e’指示MOE修饰。5-10-5MOE缺口聚体的长度是20个核苷，其中中心缺口区段包含10个2’-脱氧核苷，并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼区段侧接。在整个各寡核苷酸中的核苷间键联都是硫代磷酸酯(P＝S)键联。在整个各寡核苷酸中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人基因序列中由寡核苷酸靶向的最5’核苷。“终止位点”指示人基因序列中由寡核苷酸靶向的最3’核苷。下表中所列的各寡核苷酸靶向在本文中指定为SEQID NO:1的人ANGPTL3 mRNA(GENBANK登记号NM_014495.2)或在本文中指定为SEQ ID NO:2的人ANGPTL3基因组序列(GENBANK登记号NT_032977.9，从核苷酸33032001至33046000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表26
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770001851
Figure BDA0001016123770001861
Figure BDA0001016123770001871
Figure BDA0001016123770001881
Figure BDA0001016123770001891
Figure BDA0001016123770001901
Figure BDA0001016123770001911
Figure BDA0001016123770001921
Figure BDA0001016123770001931
Figure BDA0001016123770001941
Figure BDA0001016123770001951
Figure BDA0001016123770001961
Figure BDA0001016123770001971
Figure BDA0001016123770001981
Figure BDA0001016123770001991
Figure BDA0001016123770002001
Figure BDA0001016123770002011
表27
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770002012
Figure BDA0001016123770002021
Figure BDA0001016123770002031
Figure BDA0001016123770002041
Figure BDA0001016123770002051
Figure BDA0001016123770002061
Figure BDA0001016123770002071
Figure BDA0001016123770002081
Figure BDA0001016123770002091
Figure BDA0001016123770002101
Figure BDA0001016123770002111
表28
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770002112
Figure BDA0001016123770002121
Figure BDA0001016123770002131
Figure BDA0001016123770002141
Figure BDA0001016123770002151
Figure BDA0001016123770002161
Figure BDA0001016123770002171
Figure BDA0001016123770002181
Figure BDA0001016123770002191
Figure BDA0001016123770002201
表29
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770002202
Figure BDA0001016123770002211
Figure BDA0001016123770002221
Figure BDA0001016123770002231
Figure BDA0001016123770002241
Figure BDA0001016123770002251
Figure BDA0001016123770002261
Figure BDA0001016123770002271
Figure BDA0001016123770002281
Figure BDA0001016123770002291
Figure BDA0001016123770002301
Figure BDA0001016123770002311
Figure BDA0001016123770002321
Figure BDA0001016123770002331
Figure BDA0001016123770002341
Figure BDA0001016123770002351
Figure BDA0001016123770002361
Figure BDA0001016123770002371
Figure BDA0001016123770002381
Figure BDA0001016123770002391
Figure BDA0001016123770002401
表30
由靶向SEQ ID NO:1和2的寡核苷酸对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770002402
Figure BDA0001016123770002411
Figure BDA0001016123770002421
Figure BDA0001016123770002431
Figure BDA0001016123770002441
Figure BDA0001016123770002451
Figure BDA0001016123770002461
Figure BDA0001016123770002471
Figure BDA0001016123770002481
Figure BDA0001016123770002491
Figure BDA0001016123770002501
Figure BDA0001016123770002511
Figure BDA0001016123770002521
Figure BDA0001016123770002531
实施例6：由MOE缺口聚体对Hep3B细胞中人ANGPTL3的反义抑制
设计靶向ANGPTL3核酸的其它反义寡核苷酸，并且体外测试它们对ANGPTL3 mRNA的影响。使用电穿孔，用4,500nM反义寡核苷酸转染处于每孔20,000个细胞的密度下的培养的Hep3B细胞。在约24小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770002541
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
下表中新设计的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE或3-10-4MOE缺口聚体。5-10-5MOE缺口聚体的长度是20个核苷，其中中心缺口区段包含10个2’-脱氧核苷，并且在5’方向和3’方向上由各自包含5个核苷的翼区段侧接。3-10-4MOE缺口聚体的长度是17个核苷，其中中心缺口区段包含10个2’-脱氧核苷，并且在5’方向和3’方向上由分别包含3个和4个核苷的翼区段侧接。5’翼区段中的各核苷和3’翼区段中的各核苷具有2’-MOE修饰。5’翼区段中的各核苷和3’翼区段中的各核苷具有2’-MOE修饰。在整个各缺口聚体中的核苷间键联都是硫代磷酸酯(P＝S)键联。在整个各缺口聚体中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人基因序列中由缺口聚体靶向的最5’核苷。“终止位点”指示人基因序列中由缺口聚体靶向的最3’核苷。下表中所列的各缺口聚体靶向在本文中指定为SEQ IDNO:1的人ANGPTL3 mRNA(GENBANK登记号NM_014495.2)或在本文中指定为SEQ ID NO:2的人ANGPTL3基因组序列(GENBANK登记号NT_032977.9，从核苷酸33032001至33046000截短)。‘n/a’指示反义寡核苷酸不以100％互补性靶向那个特定基因序列。
表31
由靶向SEQ ID NO:1和2的MOE缺口聚体对ANGPTL3 mRNA的抑制
Figure BDA0001016123770002551
Figure BDA0001016123770002561
实施例7：对Hep3B细胞中人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自上述研究的展现显著体外抑制ANGPTL3 mRNA的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸，并且在各种剂量下在Hep3B细胞中测试。两者均是5-10-5MOE缺口聚体的ISIS 233717和ISIS 337847也包括在研究中。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。各实验的结果呈现于以下单独表中。
在每孔20,000个细胞的密度下涂铺细胞，并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.813μM、1.625μM、3.25μM、6.500μM和13.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770002572
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
也呈现各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表32
Figure BDA0001016123770002571
Figure BDA0001016123770002581
表33
Figure BDA0001016123770002582
表34
Figure BDA0001016123770002591
表35
Figure BDA0001016123770002592
实施例8：对Hep3B细胞中人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自上述研究的展现显著体外抑制ANGPTL3 mRNA的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸，并且在各种剂量下在Hep3B细胞中测试。作为5-10-5MOE缺口聚体的ISIS 337847也包括在研究中。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。各实验的结果呈现于以下单独表中。
在每孔20,000个细胞的密度下涂铺细胞，并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.160μM、0.481μM、1.444μM、4.333μM和13.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770002601
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
也呈现各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表36
Figure BDA0001016123770002611
表37
Figure BDA0001016123770002612
表38
Figure BDA0001016123770002621
实施例9：由MOE缺口聚体对Hep3B细胞中人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上实施例的展现显著体外抑制ANGPTL3 mRNA的MOE缺口聚体，并且在各种剂量下在Hep3B细胞中测试。在每孔20,000个细胞的密度下涂铺细胞，并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.160μM、0.481μM、1.444μM、4.333μM和13.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770002622
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
也呈现各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表39
Figure BDA0001016123770002631
实施例10：由脱氧、MOE和cEt寡核苷酸对Hep3B细胞中人ANGPTL3的剂量依赖性反义抑制
选择来自上述研究的展现显著体外抑制ANGPTL3 mRNA的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸，并且在各种剂量下在Hep3B细胞中测试。在每孔20,000个细胞的密度下涂铺细胞，并且使用电穿孔，用如下表中指定的0.111μM、0.333μM、1.00μM、3.00μM和9.00μM浓度的反义寡核苷酸转染。在约16小时的处理期之后，从细胞分离RNA，并且通过定量实时PCR测量ANGPTL3 mRNA水平。人引物探针组RTS3492_MGB用于测量mRNA水平。根据如通过
Figure BDA0001016123770002632
测量的总RNA含量调整ANGPTL3 mRNA水平。结果呈现为相对于未处理对照细胞的ANGPTL3抑制百分比。
也呈现各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，ANGPTL3 mRNA水平以剂量依赖性方式显著降低。
表40
Figure BDA0001016123770002641
表41
Figure BDA0001016123770002642
表42
Figure BDA0001016123770002651
表43
Figure BDA0001016123770002652
实施例11：对huANGPTL3转基因小鼠中人ANGPTL3的反义抑制
进一步评估以上研究中所述的反义寡核苷酸降低具有人ANGPTL3转基因的C57Bl/6小鼠(Tg小鼠)中人ANGPTL3 mRNA转录物的能力。
研究1
以12小时光照/黑暗循环来维持雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在50mg/kg的剂量下接受腹膜内注射5-10-5MOE缺口聚体。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用RTS3492_MGB对ANGP TL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。也用人引物探针组RTS19 84(正向序列CTTCAATGAAACGTGGGAGAACT，在本文中指定为S EQ ID NO:7；反向序列TCTCTAGGCCCAACCAAAATTC，在本文中指定为SEQ ID NO:8；探针序列AAATATGGTTTTGGGAGGCT TGAT，在本文中指定为SEQ ID NO:9)测量mRNA水平。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002661
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。
表44
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分
比
Figure BDA0001016123770002671
蛋白质分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。结果指示用ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白水平降低。
表45
对转基因小鼠中血浆蛋白质水平的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002672
血浆化学标志物
为评估在第10天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表46
在第10天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770002681
研究2
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在50mg/kg的剂量下接受腹膜内注射5-10-5MOE缺口聚体。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用RTS1984对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002682
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。
表47
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002691
蛋白质分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。结果指示用ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白水平降低。
表48
对转基因小鼠中血浆蛋白质水平的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002701
血浆化学标志物
为评估在第8天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表49
在第8天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770002711
研究3
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续3周在2.5mg/kg、12.5mg/kg或25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射5-10-5MOE缺口聚体。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用hANGPTL3_LTS01022(正向序列AAATTTTAGCCAATGGCCTCC，在本文中指定为SEQ ID NO:10；反向序列TGTCATTAATTTGGCCCTTCG，在本文中指定为SEQ ID NO:11；探针序列TCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACT TTGTCC，在本文中指定为SEQ ID NO:12)对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002722
加以标准化。如下表中所示，相较于PB S对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。各缺口聚体的ED50也呈现于下表中。‘n.d.’指示ED50不可测出。
表50
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002721
Figure BDA0001016123770002731
蛋白质分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。结果指示用ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白水平降低。‘n.d.’指示ED50不可测出。
表51
对转基因小鼠中血浆蛋白质水平的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002741
血浆化学标志物
为评估在第17天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表52
在第17天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770002751
Figure BDA0001016123770002761
研究4
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射5-10-5MOE缺口聚体。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用hANGPTL3_LTS01022对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002762
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。
表53
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002771
血浆化学标志物
为评估在第10天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表54
在第10天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770002781
研究5
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射5-10-5MOE缺口聚体或脱氧、MOE和cEt缺口聚体。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用RTS1984对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002791
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。
表55
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 79 233
544156 5-10-5MOE 92 17
559277 脱氧、MOE和cEt 75 110
560265 5-10-5MOE 52 31
560285 5-10-5MOE 42 33
560574 5-10-5MOE 93 44
560847 5-10-5MOE 61 69
560992 脱氧、MOE和cEt 80 112
561010 脱氧、MOE和cEt 66 113
561011 脱氧、MOE和cEt 96 114
561022 脱氧、MOE和cEt 79 115
561025 脱氧、MOE和cEt 57 116
563580 5-10-5MOE 80 77
567115 5-10-5MOE 78 88
567233 5-10-5MOE 91 90
血浆化学标志物
为评估在第9天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表56
在第9天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
化学 ALT AST SEQ ID NO
PBS - 48 65
ISIS 233710 5-10-5MOE 24 43 233
ISIS 544156 5-10-5MOE 29 44 17
ISIS 559277 脱氧、MOE和cEt 22 38 110
ISIS 560265 5-10-5MOE 28 83 31
ISIS 560285 5-10-5MOE 29 44 33
ISIS 560574 5-10-5MOE 24 54 44
ISIS 560847 5-10-5MOE 25 45 69
ISIS 560992 脱氧、MOE和cEt 32 128 112
ISIS 561010 脱氧、MOE和cEt 22 51 113
ISIS 561011 脱氧、MOE和cEt 28 43 114
ISIS 561022 脱氧、MOE和cEt 51 85 115
ISIS 561025 脱氧、MOE和cEt 22 48 116
ISIS 563580 5-10-5MOE 28 109 77
ISIS 567115 5-10-5MOE 21 42 88
ISIS 567233 5-10-5MOE 22 73 90
研究6
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。作为5-10-5MOE缺口聚体的ISIS233710也作为基准加以包括。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用hANGPTL3_LTS01022对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002811
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用若干ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。
表57
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 68 233
561026 脱氧、MOE和cEt 94 117
561079 脱氧、MOE和cEt 51 160
561084 脱氧、MOE和cEt 56 161
561123 脱氧、MOE和cEt 47 163
561208 脱氧、MOE和cEt 42 118
561241 脱氧、MOE和cEt 13 164
561400 脱氧、MOE和cEt 31 173
561418 脱氧、MOE和cEt 32 169
561436 脱氧、MOE和cEt 67 170
561443 脱氧、MOE和cEt 12 171
561458 脱氧、MOE和cEt 57 124
蛋白质分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。结果指示用若干ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3蛋白水平降低。
表58
对转基因小鼠中血浆蛋白质水平的抑制百分比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 82 233
561026 脱氧、MOE和cEt 92 117
561079 脱氧、MOE和cEt 80 160
561084 脱氧、MOE和cEt 89 161
561123 脱氧、MOE和cEt 62 163
561208 脱氧、MOE和cEt 0 118
561241 脱氧、MOE和cEt 36 164
561400 脱氧、MOE和cEt 60 173
561418 脱氧、MOE和cEt 42 169
561436 脱氧、MOE和cEt 46 170
561443 脱氧、MOE和cEt 27 171
561458 脱氧、MOE和cEt 71 124
血浆化学标志物
为评估在第10天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表59
在第10天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
化学 ALT AST SAE ID NO
PBS - 41 64
ISIS 233710 5-10-5MOE 25 74 233
ISIS 561026 脱氧、MOE和cEt 30 67 117
ISIS 561079 脱氧、MOE和cEt 42 62 160
ISIS 561084 脱氧、MOE和cEt 70 101 161
ISIS 561123 脱氧、MOE和cEt 24 41 163
ISIS 561208 脱氧、MOE和cEt 203 168 118
ISIS 561241 脱氧、MOE和cEt 26 47 164
ISIS 561400 脱氧、MOE和cEt 27 83 173
ISIS 561418 脱氧、MOE和cEt 58 164 169
ISIS 561436 脱氧、MOE和cEt 24 42 170
ISIS 561443 脱氧、MOE和cEt 27 91 171
ISIS 561458 脱氧、MOE和cEt 30 144 124
研究7
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。作为5-10-5MOE缺口聚体的ISIS233710也作为基准加以包括。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用hANGPTL3_LTS01022对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002831
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。
表60
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 80 233
561462 脱氧、MOE和cEt 84 126
561463 脱氧、MOE和cEt 84 127
561486 脱氧、MOE和cEt 74 130
561487 脱氧、MOE和cEt 82 131
561504 脱氧、MOE和cEt 51 133
561528 脱氧、MOE和cEt 87 174
561565 脱氧、MOE和cEt 94 175
561566 脱氧、MOE和cEt 76 176
561571 脱氧、MOE和cEt 51 178
561621 脱氧、MOE和cEt 93 134
561646 脱氧、MOE和cEt 39 140
561649 脱氧、MOE和cEt 93 141
561650 脱氧、MOE和cEt 82 142
561689 脱氧、MOE和cEt 51 180
561722 脱氧、MOE和cEt 88 183
561723 脱氧、MOE和cEt 85 184
561770 脱氧、MOE和cEt 70 143
562024 脱氧、MOE和cEt 82 189
蛋白质分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。结果指示用一些ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3水平降低。在这个情况下，‘0’值暗示用ISIS寡核苷酸处理不抑制表达；在一些情况下，可已记录表达水平增加。
表61
对转基因小鼠中血浆蛋白质水平的抑制百分比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 60 233
561462 脱氧、MOE和cEt 62 126
561463 脱氧、MOE和cEt 59 127
561486 脱氧、MOE和cEt 0 130
561487 脱氧、MOE和cEt 0 131
561504 脱氧、MOE和cEt 0 133
561528 脱氧、MOE和cEt 0 174
561565 脱氧、MOE和cEt 71 175
561566 脱氧、MOE和cEt 0 176
561571 脱氧、MOE和cEt 0 178
561621 脱氧、MOE和cEt 72 134
561646 脱氧、MOE和cEt 0 140
561649 脱氧、MOE和cEt 63 141
561650 脱氧、MOE和cEt 0 142
561689 脱氧、MOE和cEt 0 180
561722 脱氧、MOE和cEt 0 183
561723 脱氧、MOE和cEt 0 184
561770 脱氧、MOE和cEt 0 143
562024 脱氧、MOE和cEt 0 189
血浆化学标志物
为评估在第9天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表62
在第9天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
化学 ALT AST SEQ ID NO
PBS - 35 72
ISIS 233710 5-10-5MOE 23 39 233
ISIS 561462 脱氧、MOE和cEt 26 56 126
ISIS 561463 脱氧、MOE和cEt 34 61 127
ISIS 561486 脱氧、MOE和cEt 23 61 130
ISIS 561487 脱氧、MOE和cEt 21 64 131
ISIS 561504 脱氧、MOE和cEt 26 66 133
ISIS 561528 脱氧、MOE和cEt 26 86 174
ISIS 561565 脱氧、MOE和cEt 24 43 175
ISIS 561566 脱氧、MOE和cEt 23 62 176
ISIS 561571 脱氧、MOE和cEt 26 68 178
ISIS 561621 脱氧、MOE和cEt 26 96 134
ISIS 561646 脱氧、MOE和cEt 24 77 140
ISIS 561649 脱氧、MOE和cEt 22 94 141
ISIS 561650 脱氧、MOE和cEt 34 121 142
ISIS 561689 脱氧、MOE和cEt 24 73 180
ISIS 561722 脱氧、MOE和cEt 34 89 183
ISIS 561723 脱氧、MOE和cEt 24 65 184
ISIS 561770 脱氧、MOE和cEt 22 69 143
ISIS 562024 脱氧、MOE和cEt 32 162 189
研究8
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。作为5-10-5MOE缺口聚体的ISIS233710也作为基准加以包括。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用hANGPTL3_LTS01022对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002871
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。
表63
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 99 233
562078 脱氧、MOE和cEt 73 147
562086 脱氧、MOE和cEt 85 148
562103 脱氧、MOE和cEt 58 149
562110 脱氧、MOE和cEt 94 150
562155 脱氧、MOE和cEt 85 192
562181 脱氧、MOE和cEt 79 195
562433 脱氧、MOE和cEt 59 155
562436 脱氧、MOE和cEt 99 156
586669 脱氧、MOE和cEt 95 210
586676 脱氧、MOE和cEt 80 211
蛋白质分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。结果指示用ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3水平降低。
表64
对转基因小鼠中血浆蛋白质水平的抑制百分比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 69 233
562078 脱氧、MOE和cEt 44 147
562086 脱氧、MOE和cEt 91 148
562103 脱氧、MOE和cEt 26 149
562110 脱氧、MOE和cEt 68 150
562155 脱氧、MOE和cEt 75 192
562181 脱氧、MOE和cEt 86 195
562433 脱氧、MOE和cEt 80 155
562436 脱氧、MOE和cEt 98 156
586669 脱氧、MOE和cEt 98 210
586676 脱氧、MOE和cEt 95 211
血浆化学标志物
为评估在第8天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表65
在第8天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770002881
Figure BDA0001016123770002891
研究9
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。作为5-10-5MOE缺口聚体的ISIS233710也作为基准加以包括。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用hANGPTL3_LTS01022对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002892
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用一些ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。在这个情况下，‘0’值暗示用ISIS寡核苷酸处理不抑制表达；在一些情况下，可已记录表达水平增加。
表66
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分
比
ISIS编号 化学 ％ SEQ ID NO
233710 5-10-5MOE 84 233
586690 脱氧、MOE和cEt 45 213
586692 脱氧、MOE和cEt 45 220
586700 脱氧、MOE和cEt 46 221
586707 脱氧、MOE和cEt 88 218
586708 脱氧、MOE和cEt 73 222
586718 脱氧、MOE和cEt 20 219
586744 脱氧、MOE和cEt 0 223
586745 脱氧、MOE和cEt 0 224
586755 脱氧、MOE和cEt 75 226
586761 脱氧、MOE和cEt 66 227
586787 脱氧、MOE和cEt 47 228
586796 脱氧、MOE和cEt 88 229
586797 脱氧、MOE和cEt 81 230
586802 脱氧、MOE和cEt 33 231
586804 脱氧、MOE和cEt 60 232
蛋白质分析
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。结果指示用一些ISIS寡核苷酸处理导致ANGPTL3水平降低。在这个情况下，‘0’值暗示用ISIS寡核苷酸处理不抑制表达；在一些情况下，可已记录表达水平增加。
表67
对转基因小鼠中血浆蛋白质水平的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002901
Figure BDA0001016123770002911
血浆化学标志物
为评估在第9天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表68
在第9天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770002912
Figure BDA0001016123770002921
研究10
以12小时光照/黑暗循环来维持雄性和雌性Tg小鼠。在启始实验之前，在研究设施中驯化动物至少7天。于缓冲盐水(PBS)中制备反义寡核苷酸(ASO)，并且通过经0.2微米过滤器过滤来灭菌。将寡核苷酸溶解于0.9％PBS中以供注射。
各组小鼠每周1次持续2周在5mg/kg、12.5mg/kg或25mg/kg的剂量下接受腹膜内注射5-10-5MOE缺口聚体或脱氧、MOE和cEt寡核苷酸。一组小鼠每周1次持续2周接受皮下注射PBS。PBS注射组充当相应寡核苷酸处理组与其进行比较的对照组。
RNA分析
在处理期结束时，从肝提取RNA以用hANGPTL3_LTS01022，并且也用RTS3492_MGB对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770002922
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用一些ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA降低。
表69
相对于PBS对照，对转基因小鼠肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001016123770002931
血浆化学标志物
为评估在第8天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表70
在第8天转基因小鼠中的血浆转氨酶水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770002941
实施例12：靶向人ANGPTL3的反义寡核苷酸在CD1小鼠中的耐受性
Figure BDA0001016123770002942
小鼠(Charles River,MA)是一种多用途小鼠模型，常常用于安全性和功效测试。用选自上述研究的ISIS反义寡核苷酸处理小鼠，并且评估各种血浆化学标志物的水平变化。
研究1
用200mg/kg单次剂量的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射雄性CD1小鼠(每个处理组1只动物)。用单次剂量的PBS皮下注射1只雄性CD1小鼠。在末次剂量之后48小时使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
血浆化学标志物
为评估在第4天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表71
在第4天CD1小鼠血浆中的血浆转氨酶水平
Figure BDA0001016123770002951
Figure BDA0001016123770002961
体重
在单次剂量的ISIS寡核苷酸之后1天测量体重，并且呈现于下表中。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表72
在反义寡核苷酸处理之后的CD1小鼠体重(g)
Figure BDA0001016123770002962
研究2
用200mg/kg单次剂量的脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射雄性CD1小鼠(每个处理组1只动物)。用单次剂量的PBS皮下注射1只雄性CD1小鼠。在末次剂量之后48小时使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
血浆化学标志物
为评估在第5天ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶(ALT和AST)水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些肝功能标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表73
在第5天CD1小鼠血浆中的血浆转氨酶水平
Figure BDA0001016123770002981
体重
在单次剂量的ISIS寡核苷酸之后第5天测量体重，并且呈现于下表中。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表74
在反义寡核苷酸处理之后的CD1小鼠体重(g)
Figure BDA0001016123770002991
研究3
用一周一次持续6周给予的100mg/kg 5-10-5MOE缺口聚体腹膜内注射雄性CD1小鼠(每个处理组4只动物)。用一周一次持续6周给予的PBS腹膜内注射1组4只雄性CD1小鼠。在末次剂量之后48小时使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
血浆化学标志物
为评估ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(Hitachi OlympusAU400e,Melville,NY)在第45天测量各种肝和肾功能标志物的血浆水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表75
在第45天CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物水平
Figure BDA0001016123770003001
体重
在第43天测量体重，并且呈现于下表中。在第45天在研究结束时测量肾、肝和脾重量。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表76
在反义寡核苷酸处理之后的CD1小鼠重量(g)
Figure BDA0001016123770003002
Figure BDA0001016123770003011
研究4
用一周一次持续6周给予的50mg/kg或100mg/kg 5-10-5 MOE缺口聚体或脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射雄性CD1小鼠(每个处理组4只动物)。用一周一次持续6周给予的PBS腹膜内注射1组4只雄性CD1小鼠。在末次剂量之后48小时使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
血浆化学标志物
为评估ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(Hitachi OlympusAU400e,Melville,NY)在第46天测量各种肝和肾功能标志物的血浆水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表77
在第45天CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物水平
Figure BDA0001016123770003012
Figure BDA0001016123770003021
体重
在第44天测量体重，并且呈现于下表中。在第46天在研究结束时测量肾、肝和脾重量。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表78
在反义寡核苷酸处理之后的CD1小鼠重量(g)
Figure BDA0001016123770003022
研究5
用一周一次持续6周给予的50mg/kg脱氧、MOE和cEt寡核苷酸腹膜内注射雄性CD1小鼠(每个处理组4只动物)。用一周一次持续6周给予的PBS腹膜内注射1组4只雄性CD1小鼠。在末次剂量之后48小时使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
血浆化学标志物
为评估ISIS寡核苷酸的影响，使用自动化临床化学分析器(Hitachi OlympusAU400e,Melville,NY)在第43天测量各种肝和肾功能标志物的血浆水平。结果呈现于下表中。在进一步研究中排除导致这些标志物中的任一个的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表79
在第43天CD1小鼠血浆中的血浆化学标志物水平
Figure BDA0001016123770003031
体重
在第41天测量体重，并且呈现于下表中。在第43天在研究结束时测量肾、肝和脾重量。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表80
在反义寡核苷酸处理之后的CD1小鼠重量(g)
Figure BDA0001016123770003041
实施例13：测量靶向人ANGPTL3的ISIS反义寡核苷酸的粘度
测量从上述研究选择的反义寡核苷酸的粘度以筛选出具有超过40厘泊(cP)的粘度的反义寡核苷酸。具有的粘度大于40cP的寡核苷酸将具有小于最优的粘度。
将ISIS寡核苷酸(32-35mg)称重至玻璃小瓶中，添加120μL水，并且通过在50℃下加热小瓶来将反义寡核苷酸溶解成溶液。将一份(75μL)预加热样品吸移至微量粘度计(Cambridge)中。将微量粘度计的温度设置成25℃，并且测量样品的粘度。将另一份(20μL)预加热样品吸移至10mL水中以在85℃下在260nM下进行UV读取(Cary UV仪器)。结果呈现于下表中，其中各反义寡核苷酸的浓度是350mg/ml，并且指示根据上述准则，大多数反义寡核苷酸溶液在它们的粘度方面是最优的。
表81
靶向人ANGPTL3的ISIS反义寡核苷酸的粘度
Figure BDA0001016123770003051
实施例14：靶向人ANGPTL3的反义寡核苷酸在Sprague-Dawley大鼠中的耐受性
Sprague-Dawley大鼠是一种用于安全性和功效评估的多用途模型。用来自以上实施例中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理大鼠，并且评估各种血浆化学标志物的水平变化。
研究1
以12小时光照/黑暗循环维持雄性Sprague-Dawley大鼠，并且用Purina正常大鼠食物膳食5001随意喂食。各组4只Sprague-Dawley大鼠各自一周一次持续6周用PBS或用100mg/kg 5-10-5MOE缺口聚体皮下注射。在末次剂量之后48小时，使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶水平。在第45天测量血浆ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)水平，并且结果用IU/L表示呈现于下表中。也使用相同临床化学分析器测量血浆胆红素水平，并且结果也用mg/dL表示呈现于下表中。在进一步研究中排除导致任何肝功能标志物的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表82
Sprague-Dawley大鼠中的肝功能标志物
ALT(IU/L) AST(IU/L) 胆红素(mg/dL) SEQ ID NO
PBS 25 65 0.11
ISIS 544145 225 407 0.30 16
ISIS 544199 56 102 0.11 20
ISIS 560400 55 175 0.12 35
ISIS 560401 89 206 0.13 36
ISIS 560469 227 290 0.15 38
ISIS 567320 55 172 0.11 93
ISIS 567321 39 109 0.10 94
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酸酐水平。结果用mg/dL表示呈现于下表中。在进一步研究中排除导致任何肾功能标志物的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。测量总尿蛋白质和尿肌酸酐水平，并且评估总尿蛋白质与肌酸酐的比率。结果呈现于下表中。
表83
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能血浆标志物(mg/dL)
BUN 肌酸酐 SEQ ID NO
PBS 16 0.27
ISIS 544145 53 0.26 16
ISIS 544199 24 0.34 20
ISIS 560400 28 0.31 35
ISIS 560401 29 0.28 36
ISIS 560469 23 0.32 38
ISIS 567320 26 0.35 93
ISIS 567321 24 0.37 94
表84
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能尿标志物
Figure BDA0001016123770003071
器官重量
在第42天测量体重，并且呈现于下表中。在第45天在研究结束时测量肝、脾和肾重量，并且呈现于下表中。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表85
Sprague Dawley大鼠的身体和器官重量(g)
身体 肾 肝 脾 SEQ ID NO
PBS 441 3.3 11.8 0.8
ISIS 544145 240 3.0 11.2 1.7 16
ISIS 544199 307 2.6 10.3 2.0 20
ISIS 560400 294 2.8 12.3 2.0 35
ISIS 560401 281 3.4 11.6 2.3 36
ISIS 560469 316 3.0 11.8 2.0 38
ISIS 567320 312 3.1 12.4 2.5 93
ISIS 567321 332 3.3 11.6 2.3 94
研究2
以12小时光照/黑暗循环维持雄性Sprague-Dawley大鼠，并且用Purina正常大鼠食物膳食5001随意喂食。各组4只Sprague-Dawley大鼠各自一周一次持续6周用PBS或用50mg/kg或100mg/kg 5-10-5MOE缺口聚体或脱氧、MOE和cEt寡核苷酸皮下注射。在末次剂量之后48小时，使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶水平。在第44天测量血浆ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)水平，并且结果用IU/L表示呈现于下表中。也使用相同临床化学分析器测量血浆胆红素水平，并且结果也用mg/dL表示呈现于下表中。在进一步研究中排除导致任何肝功能标志物的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表86
Sprague-Dawley大鼠中的肝功能标志物
Figure BDA0001016123770003091
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)在第44天测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酸酐水平。结果用mg/dL表示呈现于下表中。在进一步研究中排除导致任何肾功能标志物的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。测量总尿蛋白质和尿肌酸酐水平，并且评估总尿蛋白质与肌酸酐的比率。结果呈现于下表中。
表87
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能血浆标志物(mg/dL)
Figure BDA0001016123770003101
表88
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能尿标志物
Figure BDA0001016123770003102
器官重量
在第42天测量体重，并且呈现于下表中。在第44天在研究结束时测量肝、脾和肾重量，并且呈现于下表中。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表89
Sprague Dawley大鼠的身体和器官重量(g)
Figure BDA0001016123770003111
研究3
以12小时光照/黑暗循环维持雄性Sprague-Dawley大鼠，并且用Purina正常大鼠食物膳食5001随意喂食。各组4只Sprague-Dawley大鼠各自一周一次持续6周用PBS或用50mg/kg脱氧、MOE和cEt寡核苷酸皮下注射。在末次剂量之后48小时，使大鼠安乐死，并且收获器官和血浆以进行进一步分析。
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)测量血浆转氨酶水平。在第44天测量血浆ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)水平，并且结果用IU/L表示呈现于下表中。也使用相同临床化学分析器测量血浆胆红素水平，并且结果也用mg/dL表示呈现于下表中。在进一步研究中排除导致任何肝功能标志物的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表90
Sprague-Dawley大鼠中的肝功能标志物
Figure BDA0001016123770003121
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动化临床化学分析器(HitachiOlympus AU400e,Melville,NY)在第44天测量血浆血液尿素氮(BUN)和肌酸酐水平。结果用mg/dL表示呈现于下表中。在进一步研究中排除导致任何肾功能标志物的水平变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。测量总尿蛋白质和尿肌酸酐水平，并且评估总尿蛋白质与肌酸酐的比率。结果呈现于下表中。
表91
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能血浆标志物(mg/dL)
Figure BDA0001016123770003131
表92
Sprague-Dawley大鼠中的肾功能尿标志物
Figure BDA0001016123770003132
Figure BDA0001016123770003141
器官重量
在第42天测量体重，并且呈现于下表中。在第44天在研究结束时测量肝、脾和肾重量，并且呈现于下表中。从进一步研究排除导致器官重量的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围的ISIS寡核苷酸。
表93
Sprague Dawley大鼠的身体和器官重量(g)
Figure BDA0001016123770003142
实施例15：靶向人ANGPTL3的ISIS反义寡核苷酸在食蟹猴中的效应
用选自以上实施例中所述的研究的ISIS反义寡核苷酸处理食蟹猴。评估反义寡核苷酸功效和耐受性以及它们在肝和肾中的药代动力学概况。
在进行这个研究时，食蟹猴基因组序列不可在国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)数据库中获得；因此，不可确认与食蟹猴基因序列的交叉反应性。作为替代，将用于食蟹猴中的ISIS反义寡核苷酸的序列与恒河猴序列关于同源性进行比较。预期与恒河猴序列具有同源性的ISIS寡核苷酸也与食蟹猴序列具有完全交叉反应性。测试的人反义寡核苷酸与恒河猴基因组序列(GENBANK登记号NW_001108682.1，从核苷酸3049001至3062000截短，在本文中指定为SEQ ID NO:3)具有交叉反应性。人寡核苷酸与恒河猴序列之间的互补性越大，人寡核苷酸可与恒河猴序列交叉反应的可能性越大。各寡核苷酸针对SEQ ID NO:3的起始和终止位点呈现于下表中。“起始位点”指示恒河猴基因序列中由缺口聚体靶向的最5’核苷酸。‘错配’指示人寡核苷酸中与恒河猴基因组序列不匹配的核碱基的数目。
表94
与恒河猴ANGPTL3基因组序列(SEQ ID NO:3)互补的反义寡核苷酸
Figure BDA0001016123770003151
处理
在研究之前，将猴隔离保持至少30天时期，在此期间每日观察动物的总体健康。猴是2-4岁，并且称重在2与4kg之间。9组5只随机指定的雄性食蟹猴各自用ISIS寡核苷酸或PBS在背部上呈顺时针旋转的4个部位(即左侧、顶部、右侧和底部)处皮下注射，每剂1个部位。每两天持续第一周(第1、3、5和7天)向猴给予负荷剂量的PBS或40mg/kg ISIS寡核苷酸，并且随后一周一次持续12周(第14、21、28、35、42、49、56、63、70、77和84天)用PBS或40mg/kgISIS寡核苷酸给药。
在研究期期间，每日两次观察猴的疾病或痛苦征象。经受归因于处理、损伤或疾病的超过瞬间或轻微疼痛或痛苦的任何动物都在与研究指导者磋商之后由兽医学工作人员用核准的止痛剂或用以减轻疼痛的药剂处理。健康不佳或处于可能的濒死状况下的任何动物都被鉴定以进行进一步监测以及可能安乐死。举例来说，ISIS 567321处理组中的1只动物在第45天被发现濒死，并且加以终止。在第86天(在最终剂量之后约48小时)，在氯胺酮/甲苯噻嗪诱导的麻醉以及施用戊巴比妥钠之后通过放血来对动物进行预定安乐死。实施例中所述的方案由实验动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee，IACUC)核准。
肝靶标降低
RNA分析
在第86天，从肝提取RNA以对ANGPTL3 mRNA表达进行实时PCR测量分析。结果呈现为相对于PBS对照的mRNA变化百分比，用
Figure BDA0001016123770003161
加以标准化。如下表中所示，相较于PBS对照，用ISIS反义寡核苷酸处理导致ANGPTL3 mRNA显著降低。对ANGPTL3 mRNA水平的分析揭示均与恒河猴序列具有完全交叉反应性的ISIS 544199和ISIS 559277两者显著降低表达水平。在错配下靶向猴序列的其它ISIS寡核苷酸也能够降低ANGPTL3 mRNA水平。
表95
相对于PBS对照，对食蟹猴肝中ANGPTL3 mRNA的抑制百分比
Figure BDA0001016123770003171
蛋白质分析
在第85天从所有可用的动物收集约1mL血液，并且放置在含有EDTA的钾盐的管中。将血液样品放置在冰中并离心(在4℃下，3000rpm，持续10分钟)以获得血浆。
使用可商购获得的ELISA试剂盒(目录号DANL30，通过R&D Systems,Minneapolis,MN获得)，使用制造商所述的方案，用1:20,000稀释的转基因血浆样品定量人ANGPTL3蛋白水平。结果呈现于下表中。对血浆ANGPTL3的分析揭示ISIS 563580、544199和ISIS 559277以持续方式降低蛋白质水平。其它ISIS寡核苷酸也能够降低ANGPTL3水平。
表96
食蟹猴中的血浆蛋白质水平(ng/mL)
Figure BDA0001016123770003172
Figure BDA0001016123770003181
耐受性研究
体重测量
为评估ISIS寡核苷酸对动物的总体健康的影响，测量体重，并且呈现于下表中。结果指示用反义寡核苷酸处理对体重的影响在对反义寡核苷酸的预期范围内。具体来说，用ISIS 563580处理就猴的体重而言被良好耐受。
表97
食蟹猴的最终体重(g)
Figure BDA0001016123770003182
Figure BDA0001016123770003191
肝功能
为评估ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，从所有研究组收集血液样品。在给药后48小时，从头静脉、隐静脉或股静脉收集血液样品。在血液收集之前，使猴禁食过夜。将血液收集在无抗凝剂的管中以进行血清分离。使管在室温下保持至少90分钟，接着离心(约3,000rpm，持续10分钟)以获得血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析器(Toshiba Co.,Japan)测量各种肝功能标志物的水平。测量血浆ALT和AST水平，并且结果用IU/L表示呈现于下表中。类似地测量作为一种肝功能标志物的胆红素，并且用mg/dL表示呈现于下表中。结果指示大多数反义寡核苷酸对肝功能的影响不超出对反义寡核苷酸的预期范围。具体来说，用ISIS 563580处理就肝功能而言在猴中被良好耐受。
表98
食蟹猴血浆中的ALT水平(IU/L)
Figure BDA0001016123770003192
Figure BDA0001016123770003201
表99
食蟹猴血浆中的AST水平(IU/L)
第1天 第30天 第58天 第86天 SEQ ID NO
PBS 76 42 39 60
ISIS 563580 75 56 42 81 77
ISIS 560400 85 63 59 99 35
ISIS 567320 104 64 55 153 93
ISIS 567321 83 47 45 66 94
ISIS 544199 68 68 70 91 20
ISIS 567233 46 80 66 86 90
ISIS 561011 48 39 41 51 114
ISIS 559277 50 56 55 77 110
表100
食蟹猴血浆中的胆红素水平(mg/dL)
第1天 第30天 第58天 第86天 SEQ ID NO
PBS 0.31 0.24 0.20 0.19
ISIS 563580 0.34 0.23 0.17 0.18 77
ISIS 560400 0.29 0.19 0.14 0.13 35
ISIS 567320 0.38 0.24 0.16 0.19 93
ISIS 567321 0.35 0.20 0.16 0.17 94
ISIS 544199 0.23 0.16 0.17 0.15 20
ISIS 567233 0.26 0.17 0.15 0.12 90
ISIS 561011 0.20 0.13 0.16 0.13 114
ISIS 559277 0.22 0.15 0.16 0.15 110
肾功能
为评估ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，从所有研究组收集血液样品。在给药后48小时，从头静脉、隐静脉或股静脉收集血液样品。在血液收集之前，使猴禁食过夜。将血液收集在无抗凝剂的管中以进行血清分离。使管在室温下保持至少90分钟，接着离心(约3,000rpm，持续10分钟)以获得血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析器(Toshiba Co.,Japan)测量BUN和肌酸酐的水平。结果用mg/dL表示呈现于下表中。
血浆化学数据指示大多数ISIS寡核苷酸对肾功能的任何影响都不超出对反义寡核苷酸的预期范围。具体来说，用ISIS 563580处理就猴的肾功能而言被良好耐受。
表101
食蟹猴中的血浆BUN水平(mg/dL)
第1天 第30天 第58天 第86天 SEQ ID NO
PBS 28 28 27 29
ISIS 563580 27 27 25 27 77
ISIS 560400 25 24 21 27 35
ISIS 567320 27 28 26 32 93
ISIS 567321 25 24 23 24 94
ISIS 544199 23 25 24 23 20
ISIS 567233 23 32 30 29 90
ISIS 561011 25 24 23 24 114
ISIS 559277 26 28 24 26 110
表102
食蟹猴中的血浆肌酸酐水平(mg/dL)
第1天 第30天 第58天 第86天 SEQ ID NO
PBS 0.96 0.95 0.89 0.88
ISIS 563580 0.97 1.04 0.88 0.85 77
ISIS 560400 0.99 1.00 0.93 0.91 35
ISIS 567320 0.95 0.94 0.89 0.87 93
ISIS 567321 0.97 0.94 0.89 0.87 94
ISIS 544199 0.86 0.87 0.88 0.87 20
ISIS 567233 0.89 1.08 1.06 1.00 90
ISIS 561011 0.93 0.93 0.91 0.90 114
ISIS 559277 0.86 0.91 0.87 0.91 110
血液学
为评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中对血液学参数的任何影响，将约0.5mL血液的血液样品从各可用的研究动物收集于含有K2-EDTA的管中。使用ADVIA120血液学分析器(Bayer,USA)分析样品的红血细胞(RBC)计数、白血细胞(WBC)计数、个别白血细胞计数(诸如单核细胞、嗜中性白细胞、淋巴细胞的计数)以及血小板计数、血红蛋白含量和血细胞比容。数据呈现于下表中。
数据指示在这个剂量下，寡核苷酸不导致血液学参数的任何变化超出对反义寡核苷酸的预期范围。具体来说，用ISIS 563580处理就猴的血液学参数而言被良好耐受。
表103
食蟹猴中的血细胞计数
Figure BDA0001016123770003221
表104
食蟹猴中的血液学参数
血红蛋白(g/dL) HCT(％) SEQ ID NO
PBS 13 43
ISIS 563580 12 40 77
ISIS 560400 12 41 35
ISIS 567320 11 38 93
ISIS 567321 12 41 94
ISIS 544199 13 44 20
ISIS 567233 11 38 90
ISIS 561011 13 42 114
ISIS 559277 12 40 110
对促炎性分子的影响
为评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中的任何炎症性影响，在第84天在给药前获取血液样品以分析C反应性蛋白和C3水平。从各动物收集约1.5mL血液，并且放置至无抗凝剂的管中以进行血清分离。使管在室温下保持至少90分钟，接着在室温下在3,000rpm下离心10分钟以获得血清。使用Toshiba 200FR NEO化学分析器(Toshiba Co.,Japan)测量充当炎症标志物的C反应性蛋白(CRP)和补体C3。结果指示用ISIS 563580处理在猴中是耐受的。
表105
食蟹猴血浆中的C反应性蛋白水平(mg/L)
第1天 第30天 第58天 第86天 SEQ ID NO
PBS 3.1 5.5 2.7 4.1
ISIS 563580 2.4 2.4 4.5 3.9 77
ISIS 560400 3.4 7.5 9.2 14.4 35
ISIS 567320 2.5 1.7 2.5 4.3 93
ISIS 567321 3.7 3.1 5.5 7.0 94
ISIS 544199 1.2 1.5 8.8 8.1 20
ISIS 567233 1.9 12.0 6.8 6.6 90
ISIS 561011 1.7 1.2 2.1 3.7 114
ISIS 559277 1.8 2.1 10.9 5.2 110
表106
食蟹猴血浆中的C3水平(mg/dL)
给药前 第84天 SEQ ID NO
PBS 122 117
ISIS 563580 116 84 77
ISIS 560400 120 105 35
ISIS 567320 114 100 93
ISIS 567321 106 93 94
ISIS 544199 113 66 20
ISIS 567233 113 63 90
ISIS 561011 115 79 114
ISIS 559277 119 87 110
测量寡核苷酸浓度
测量全长寡核苷酸的浓度。所用方法是由苯酚-氯仿(液体-液体)提取，继之以固相提取组成的先前公布的方法(Leeds等,1996；Geary等,1999)的修改形式。在提取之前添加内标(ISIS 355868，即一种27-mer 2’-O-甲氧基乙基修饰的硫代磷酸酯寡核苷酸，GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT，在本文中指定为SEQ ID NO:13)。使用校正曲线计算组织样品浓度，其中定量下限(LLOQ)是约1.14μg/g。结果呈现于下表中，表示为每克肝或肾组织的微克数。计算肾相对于肝中的全长寡核苷酸浓度比率。发现相较于评估的其它化合物，在用ISIS 563580处理之后，肾相对于肝中的全长寡核苷酸浓度比率是最优的。
表107
寡核苷酸全长浓度
Figure BDA0001016123770003241
Figure BDA0001016123770003251
实施例16：ISIS 563580临床试验
为评估研究药物ISIS 563580的效应，对具有正常脂质概况的健康志愿者进行1期盲化、随机化、安慰剂对照的剂量逐步升高研究。所述研究评估在单次和多次剂量的研究药物ISIS 563580之后的安全性、耐受性、药代动力学、对血浆ANGPLT3水平的影响和研究受试者的脂蛋白概况。
研究群体是年龄18-65岁(包括端值)的健康男性或女性。排除准则包括在任何受试者的医学史方面以及在筛选实验室值方面存在临床显著异常。受试者被3:1随机化以在各单次剂量和多次剂量群组内接受ISIS 563580或安慰剂。受试者被皮下(SC)施用研究药物或安慰剂。
在整个研究期间定期收集血液和尿样品以进行安全性、药代动力学和药效学分析。通过确定不利事件的发生率、严重性和剂量关系、生命征象以及临床实验室参数来评估ISIS 563580的安全性和耐受性。将用ISIS 563580给药的受试者的安全性结果与用安慰剂给药的受试者的安全性结果进行比较。
最频繁的不利事件是在注射部位处的轻度局部反应。用ISIS 563580处理通常被良好耐受，并且显示可接受的安全性概况。
单次剂量研究的研究药物和处理
提供含于2mL带塞玻璃小瓶中的研究药物ISIS 563580的溶液(200mg/mL，1.0mL)。小瓶仅供单次使用。由药剂师(或合格代表)制备ISIS 563580溶液和安慰剂。经训练的专业人员在各给药日在腹部、大腿或上臂外部区域中施用单次剂量的研究药物。这个研究中招募总计16名受试者。研究设计呈现于下表中：
表108：用ISIS 563580进行的单次剂量研究的研究设计
群组 剂量(mg)
A 50
B 100
C 200
D 400
对于群组A、B、C和D，皮下注射体积分别是0.25、0.5、1.0和2.0mL，其中2.0mL体积以2次非连续性1.0mL注射液形式给予。对于群组A，在向前2名受试者施用研究药物与向群组中其余2名受试者施用研究药物之间需要至少24小时的时期。当先前单次剂量群组中的受试者已完成给药，并且第4天安全性评估显示可接受的安全性概况时，进行剂量逐步升高。
各受试者的参与时长是约8周，包括4周筛选期、单次给药、和4周处理后评估期。在第2、4、8、15天，受试者在研究中心进行随访，并且在第30天进行电话联系。研究药物的效应正被评估。
多次剂量研究的研究药物和处理
提供含于带塞玻璃小瓶中的研究药物ISIS 563580的溶液(200mg/mL，1.0mL)。小瓶仅供单次使用。由药剂师(或合格代表)制备ISIS 563580溶液和安慰剂。经训练的专业人员在各给药日在腹部、大腿或上臂外部区域中施用研究药物。这个研究中招募总计32名受试者。研究设计呈现于下表中
表109：用ISIS 563580进行的多次剂量研究的研究设计
Figure BDA0001016123770003261
Figure BDA0001016123770003271
对于群组AA、BB、CC和DD，皮下注射体积分别是0.5、1.0、1.5和2.0mL，其中2.0mL体积以2次非连续性1.0mL注射液形式给予。在单次剂量群组(群组D)中的至少4名受试者已完成给药，并且第4天安全性评估显示可接受的安全性概况之后开始对第一群组(群组AA)的给药。受试者在第1周期间隔日(第1、3和5天)接受研究药物的3次皮下给药，随后在紧接着的5周期间(第8、15、22、29和36天)接受每周一次SC施用，总计8次给药。
各受试者的参与时长是约5.5个月，包括4周筛选期、6周处理期和13周处理后评估期。在第37、43、50、64、78、92、106和127天，受试者在研究中心进行随访。在第36天受试者的脂质概况的结果呈现于下表中。星号指示统计显著变化(p<0.05)。
用ISIS 563580处理在第36天通常在血浆ANGPTL3、甘油三酯、LDL-胆固醇、非HDL胆固醇、VLDL-胆固醇、总胆固醇、ApoB和ApoC-III方面产生剂量依赖性降低。一般来说，降低的量级与基线脂质水平相关，其中观察到在基线较高的受试者中的降低较大。
表110：在第36天相较于基线的平均变化％
Figure BDA0001016123770003272
Figure BDA0001016123770003281
*P<0.05；**p<0.01。

Claims (20)

1.一种包括单链的修饰的寡核苷酸的化合物，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:77的至少17个连续核碱基的核碱基序列，且其中所述修饰的寡核苷酸包含：
由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接的核苷组成的5’翼区段；
由5个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少90％互补。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1至少95％互补。
4.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:1100％互补。
5.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有包含核碱基序列SEQ IDNO:77的至少18个连续核碱基的核碱基序列。
6.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有包含核碱基序列SEQ IDNO:77的至少19个连续核碱基的核碱基序列。
7.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸具有SEQ ID NO:77的核碱基序列。
8.一种根据下式的单链的修饰的寡核苷酸：Ges Ges Aes mCes Aes Tds Tds GdsmCds mCds Ads Gds Tds Ads Ads Tes mCes Ges mCes Ae；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
9.如权利要求1-8中任一所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其中所述修饰的寡核苷酸是缀合的。
10.如权利要求9所述的化合物或修饰的寡核苷酸，其中所述修饰的寡核苷酸与碳水化合物缀合物基团缀合。
11.一种组合物，其包含根据权利要求1-8中任一所述的化合物或修饰的寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂。
12.一种包含根据权利要求1-8中任一所述的化合物或修饰的寡核苷酸的组合物在制备用于疗法的药物中的用途。
13.如权利要求1-8中任一所述的化合物或修饰的寡核苷酸在制备用于治疗、预防与ANGPTL3升高相关的疾病或减缓其进展的药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述疾病是心血管和/或代谢疾病、病症或病状。
15.如权利要求14所述的用途，其中所述心血管和/或代谢疾病、病症或病状是肥胖症、动脉粥样硬化、血脂异常、冠心病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或代谢综合征。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述血脂异常是高脂质血症或高脂肪酸血症。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述高脂质血症是高胆固醇血症。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述高胆固醇血症是家族性纯合性高胆固醇血症(HoFH)。
19.如权利要求14所述的用途，其中所述心血管和/或代谢疾病、病症或病状是糖尿病或脂肪代谢障碍。
20.一种单链的修饰的寡核苷酸，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:77的核碱基序列，其中所述修饰的寡核苷酸包含：
由10个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接的核苷组成的5’翼区段；
由5个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中各翼区段的各核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖，其中至少一个核苷间键联是硫代磷酸酯键联，并且其中各胞嘧啶残基是5-甲基胞嘧啶。
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