AT407580B

AT407580B - Indikatorpeptid zur diagnose und/oder vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen erkrankungen, antikörperzusammensetzung und immunoassay

Info

Publication number: AT407580B
Application number: AT144499A
Authority: AT
Original assignee: Biomedica Gmbh
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 1999-08-20
Publication date: 2001-04-25
Also published as: ATA144499A; WO2001014885A3; AU6415000A; DE10082504B4; DE10082504D2; WO2001014885A2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Indikatorpeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen Erkrankungen, auf eine Antikörperzusammensetzung zur Bestimmung von C-Typ natriuretischen Peptiden sowie auf ein Immunoassay-Verfahren für proCNP(1-80), einen Immunoassay zur Bestimmung von humanem proCNP(1-80) und ein in vitro- Diagnose- bzw. Prognoseverfahren.

Cardiovasculäre Schäden sind häufige klinische Krankheiten, die zu verschiedenen Syndro- men beitragen oder, speziell bei älteren Personen, dafür verantwortlich sind, wie z. B. für Arterio- sklerose, Nierenversagen u.dgl. Es gibt einige Marker, die in der Lage sind, die Diagnose von solchen Zuständen zu erleichtern. Es ist verständlich, dass einfache Screening-Verfahren, die Risikopersonen identifizieren und eine rasche Diagnose erlauben, hilfreich für ein zeitgerechtes Einschreiten und Verhindern des Fortschreitens der Krankheiten sind. Es ist daher wünschenswert, solche Risikopersonen schon zu identifizieren, bevor sich die Krankheit ausgebildet hat, um so ein zeitgerechtes Einschreiten der Medizin zu ermöglichen.

Derzeit gibt es wenige Methoden, die die Wahrscheinlichkeit von cardiovasculären Erkrank- heiten vorherzusagen vermögen. Häufig beobachtete Probleme mit derartigen Verfahren sind die ungenügende Genauigkeit und Empfindlichkeit oder das Erfordernis nach Ausarbeitung von Unter- suchungen oder einer teuren Ausrüstung, für die ein speziell trainiertes Personal erforderlich ist. Es besteht daher der Bedarf für ein einfaches Verfahren einer genauen und empfindlichen Methode, die nicht nur diagnostiziert, sondern auch die Wahrscheinlichkeit einer cardiovasculären Erkran- kung vorhersagen kann, u. zw. entweder als chronischer Zustand oder als akuter Zustand, wie beispielsweise septische Komplikationen. Personen mit besonderem Risiko vor dem Auftreten grösserer Schäden identifizieren, erfassen und behandeln zu können, würde grosse klinische Bedeu- tung haben.

Derzeit existierende Behandlungen sind teuer und auch alternative Erfindungen sind kostenaufwendig, sodass es nicht kosteneffektiv ist, jedermann ohne Indikation in der Absicht zu behandeln, das Entstehen einer Krankheit zu verhindern.

C-Typ natriuretisches Peptid (CNP) ist ein Polypeptid, das ursprünglich aus Schweinehirn durch T. Sudoh und seine Mitarbeiter (Biochem- Biophys. Res. Commun., 168:863-879, 1990) iso- liert wurde. Nach Klonieren und Durchführen der Sequenzanalyse der cDNA, die für das Peptid kodiert, wurde gezeigt, dass menschliches CNP im menschlichen Vascularsystem durch Endothe- lialzellen erzeugt wird (S. Suga et al, J.Clin Invest 1992 : 90 :1145-9). Es wird angenommen, dass menschliches C-Typ natriuretisches Peptid als ein Precurser, der aus 126 Aminosäuren besteht, produziert wird. Von den ersten 23 Resten wird angenommen, dass sie als Signalpeptid wirken, wobei diese ersten 23 Reste abgeschnitten werden, um proCNP zu erhalten (proCNP oder CNP(1-103)). ProCNP wird vor oder während der Sekretion gespalten, um die biologisch aktive Form von CNP, CNP-22 zu bilden.

Eine am N-Terminus verlängerte Form, CNP 53, ist die haupt- sächlich im Schweinehirn (Minamino et al, Biochem. Biophys. Res.commun. 1990,170:973-9) vor- kommende molekulare Form von CNP. CNP Immunreaktivität wurde in menschlichen Vascular- endothelzellen (Singo et al Am. J.Physiol 199; 263 : H1318-21) in Plasma und in Nieren (Mattingly et al. Kidney Int. 1994; 46 :744-7) gefunden. Die Plasmakonzentrationen von proCNP(1-80) und proCNP(1-50), das sind die Peptide, die aus den ersten 80 bzw. 50 Aminosäure, gerechnet vom N-Terminus von proCNP bestehen, sind in Patienten, die an endothelialen Erkrankungen (z.B.

Arteriosklerose, Naruka T. et al, Circulation 1996 ; 94 :3103-8) und Nierenversagen (Igaki T. et al,
Kidney Int. Suppo. 1996, 55 :144-7) leiden, erhöht.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Überlegung, dass die N-terminalen Fragmente von menschlichem proCNP(1-103), ähnlich wie proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) und proCNP(1-50), aufgrund ihrer gegenüber CNP-Hormonen (CNP-22 bzw. CNP 53) langen Halbwertszeit als gute diagnostische Indikatoren oder Prognosemittel für alle Fälle von endothelialen Schäden oder renalen Krankheiten, z. B. Risiko für Arteriosklerose, septischen Schock oder chronischer Nieren- disfunktion dienen können.

Menschliches proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) und proCNP(1-50) kann daher als Basis entweder für ein Diagnose- oder für einen Prognosetest für die vorgenannten Zustände, und auch in erster
Linie für die Biosynthese von Antikörpern, zum Gebrauch in solchen Tests dienen, weiters aber auch als Antigen für einen kompetitiven Bindungsimmunoassay. ProCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) oder ein immunogenes Fragment daraus kann vorteilhafterweise an ein immunogenes Protein oder
Peptid, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, konjugiert werden.

Demgemäss liegt die Erfindung in der Schaffung eines Indikatorpolypeptids zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen Erkrankungen, wobei das Poly- peptid erfindungsgemäss das N-terminale Fragment proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) des C-Typ natriuretischen Prekursers Aminosäure (1-126) Swiss Prot. P23582) ist.

Derartige Polypeptide können zur Erzielung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper einge- setzt werden, die spezifisch auf CNP(1-80)(SEQ ID NO:1) sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Immunoassay-Verfahren für mensch- liches CNP(1-80)(SEQ ID NO:1), ein antigenes Fragment davon, oder eine Polypeptidverlän- gerung davon zur Verfügung zu stellen, wobei der primäre Bindungspartner ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung ist. Immunoassays sind natürlich im Stand der Technik bekannt, wie z.B. RIA, EIA, Fluoreszenzimmunoassay (FIA) oder Trocken- chemieteststreifen-Immunoassays. So ein Immunoassay verwendet grundsätzlich einen mono- klonalen oder polyklonalen Antikörper gemäss der Erfindung in immobilisierter Form, z. B. an einer Mikrotiterplatte, an Membranen oder Partikel, um die Ziel-Verbindung proCNP(1-80) zu isolieren.

In einem Sandwichassay kann das gebundene Antigen mittels eines zusätzlichen löslichen Anti- körpers gemäss der Erfindung, der ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein kann, nach- gewiesen werden. Dieser Antikörper kann entweder eine Markierung tragen oder, noch einfacher, selbst später durch Reaktion mit einem zweiten Antikörper, der eine Markierung trägt, markiert werden. Wenn dabei also der erste Antikörper gemäss der Erfindung in einem Schaf gezüchtet wurde, kann der zweite Antikörper ein Antischafantikörper sein.

Geeignete Markierungen umfassen Radionuklide, fluoreszierende Substanzen, z. B. Europium basierte Hybridverfahren, Farbstoffe oder gefärbte Partikel, wie z.B. kolloidales Gold. Alternativ kann ein Bindungsassay verwendet werden, bei welchem eine bekannte Menge von markiertem menschlichem proCNP(1-80){SEQ.ID NO.1) oder ein antigenes Fragment davon einer Analyt- lösung zugesetzt und mit einer begrenzten Menge von immobilisiertem Antikörper in Kontakt gebracht wird, wodurch die Menge des markierten Antigens, welches immobilisiert wird, umgekehrt proportional der Menge des im Analyt vorhandenen Zielantigens ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Immunoassay-Kit aus mensch- lichem proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1), einem antigenen Fragment davon oder einer Polypeptidver- längerung davon, welche folgendes enthält : (a) einen Antikörper gemäss der vorliegenden Erfindung in immobilisierter Form, und (b) eine weitere Komponente ausgewählt aus (bi), eine markierte Probe von menschlichem proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) oder ein antigenes Fragment davon, (bii) ein Antikörper in nicht immobilisierter Form, und (biii) ein markierter zweiter Antikörper, der spezifisch für den nicht immobilisierten Antikörper gemäss (bii) ist.

Ein solcher Immunoassay und Testsatz kann dazu verwendet werden, verwandte biologische Systeme zu untersuchen, sowie auch Diagnosen oder Prognosen von Zuständen zu stellen, in welchen der Titer von menschlichem proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) in Körperflüssigkeiten ein diag- nostischer oder präventiver Indikator ist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Diagnose oder
Prognose von Zuständen, in welchen die Konzentration von menschlichem proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) oder einem antigenen Fragment oder einer Polypeptidverlängerung davon ein diagnos- tischer oder prädiktiver Indikator ist, bei dem Körperflüssigkeit eines Patienten in vitro einem
Immunoassay unterworfen wird, um die Gegenwart oder Menge von menschlichem proCNP(1-80)(SEQ ID N0:1) darin aufzufinden oder zu bestimmen.

Resultate von unter Dialysebehandlung stehenden Patienten zeigen eindeutig, dass das proCNP-Niveau deutlich bei Patienten erhöht ist, welche an chronischer Nierenfehlfunktion leiden.

Dies wird auch noch dadurch gestützt, dass proCNP in sogenannten Hemofiltraten von Dialyse- patienten aufgefunden wird (siehe auch Schulz-Knappe et al J. Chromatogr.A776 (1997) 125-132), wie dies in Fig. 3 illustriert ist.

Folgende Konzentrationen wurden gefunden:
CNP3 : 1,7 pmolll
CNP1: 12,4 pmol/l Hemofiltrat.

Hemofiltrate wurden deshalb verwendet, weil sie nahezu unbeschränkt vorliegen und überdies die Peptidhormonkonzentrationen jener von menschlichem Plasma sehr ähnlich sind (Schulz- Knappe et al Eur. J.Med. Res.(1995/96) 1:223-236).

Demgemäss können die Immunoassays zur Beobachtung von chronischer Nierenfehlfunktion eingesetzt werden.

Obwohl derzeit wenig dokumentiert, kann humanes proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) auch als diagnostisches Werkzeug zur Risikoabwägung für die Entwicklung von Arteriosklerose eingesetzt werden (Naruka T. et al, circulation 1996, 94:3103-8).

Die Körperflüssigkeit, an welcher der Immunoassay ausgeführt wird, kann jegliche Körper- flüssigkeit sein, in welcher menschliche proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) vorhanden ist; es wird aber üblicherweise Plasma-Serum oder Harn verwendet werden. In einigen Fällen kann es angezeigt sein, die Peptide zu extrahieren oder die Probe vor der Durchführung des Assays anderweitig zu behandeln.

Das menschliche proCNP(1-80)(SEQ ID.NO:1) Peptid oder ein Antigen oder immunogenes Fragment davon kann mit in der Wissenschaft gut bekannten Techniken durch Synthese aus den sie bildenden Aminosäuren zusammengestellt oder durch das Zusammensetzen von vorsyntheti- sierten Aminosäureblöcken gebildet werden. Rekombinante Expression von Peptiden ist natürlich eine andere, sehr passende Methode zur Erzeugung des Antigens für die Immunisierung. Wo markiertes Material notwendig ist, kann die Markierung durch Standardtechniken eingebracht werden.

Zum Zweck der Herstellung von Antikörpern kann das menschliche proCNP(1-80)(SEQ.ID NO:1) oder ein antigenes Fragment davon an ein immunogenes Protein oder Peptide, wie es Stand der Technik ist, konjugiert werden.

Die erfindungsgemässen Antikörper können durch Injizierung von proCNP-Antigen gemäss der Erfindung in ein Wirtstier hergestellt werden, u.zw. vorteilhafterweise durch ein Konjugat mit einem immunogenen Protein wie vorstehend beschrieben. Geeignete Wirtstiere sind z. B. ein Schaf, um entweder ein Serum, weiches polyklonale Antikörper enthält, oder z. B. eine Maus oder ein Kaninchen, um Milzzellen für die Umwandlung zu Hybridomas oder immortalisierten Zelllinien zu gewinnen und damit monoklonale Antikörper herzustellen.

Beispiel 1: Produktion von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern gegen CNP(1-80)
Konjugation:
3 synthetisierte Fragmente aus proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1): proCNP(1-19), proCNP(29-50) und proCNP (51-79) durch die Fa. Pichem GmbH, in Graz (Österreich) synthetisiert und an ein passendes Trägerprotein konjugiert (z.B. Thyroglobulin).

Immunisierung:
18 Schafe wurden verwendet. Die Schafe erhielten 2 mg des entsprechenden Antigens, das mit nicht ulcerativem Freund'schem Adjuvans (Guildhay, GB) und BCG (bacillus Calmette Guerlin) gemischt ist.

Screening:
Mikrotiterplatten wurden mit synthetischen proCNP Peptidsequenzen (1 g/ml) beschichtet.

Probeblut wurde in Phosphatpuffer mit 3%igem BSA 1 : 1000/10000/100000 verdünnt, und die
Bindung eines Antikörpers wurde durch Zusatz von Antischaf IgG-Peroxidase-konjugat. gefolgt von Substratzugabe (TMB) nachgewiesen.

Monoklonale Antikörper können analog hergestellt werden, wobei Mäuse oder Kaninchen als
Wirtstiere verwendet werden und Hybridomas nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden.

Beispiel 2 : Immunoassay für proCNP(1-80)(SEQ ID NO:1) oder immunreaktive Fragmente davon.

Die Antikörper können in verschiedenen Arten von Immunoassay für proCNP(1-80)(SEQ ID
NO:1) oder immunreaktiven Fragmenten davon verwendet werden Diese sind u.a.

(a) Radioimmunoassay (RIA) (b) Enzymimmunoassay (EIA) (c) Enzymgebundenes Immunosorbentassay (ELISA) einschliesslich "sandwich"-Typ Metho- den, die auf Mikrotiterplatten oder Membranen ausgeführt werden.

(d) verschiedene trockenchemische Teststreifenimmunoassays.

Nachfolgend ist ein Beispiel basierend auf einem kompetitiven Enzymimmunassay wieder- gegeben. Mikrotiterplatten werden mit Schafantikörpern vorbeschichtet. Dann wird der spezifische proCNP Antikörper zugesetzt und für drei bis fünf Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert Alternativ dazu können Platten, die mit proCNP vorbeschichtet sind und mit Karion F (Merk, Nr. 2993) stabilisiert sind, verwendet werden.

200 1 der Probe oder des Standards zusammen mit 50 1 eines Tracers (Biotin-markiertes proCNP(1-80) oder ein Fragment davon) wird in die Vertiefungen eingegeben und 3 Stunden be Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden gewaschen und mit 200 1 von Streptavidin- Peroxidase von Southern Biotechnology (SB-7100-05) inkubiert. Nach einem letzten Waschschritl und Zusatz von Substrat (Tetramethylenbenzidin, TMB) bildet sich eine Farbe aus, die umgekehrt proportional zu der proCNP-Konzentration der Probe ist und in einem Mikrotiterplattenphotometer gemessen wird. Ein Beispiel einer Standardkurve für proCNP(1-19) und proCNP (51-79), diemit dieser Art von Assay erhalten wurden, ist in Fig. 2 wiedergegeben.

Sequenzprotokoll SEQUENZ ID.-Nr. 1 < 110 > Biomedica GmbH < 120 > proCNP Immunoassay < 160 > 1 < 210 > 1 < 211 > 80 < 212 > PRT < 213 > Homo Sapiens < 400 > Lys Pro Gly Ala Pro Pro Lys Val Pro Asn
1 5 10
Thr Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ala Glu Pro
15 20
GiN Ala Ala Gly Gly Gly Gin Lys Lys Gly
25 30
Asp Lys Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ala Asn
35 40
Leu Lys Gly Asp Arg Ser Arg Leu Leu Asn
45 50
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala
55 60
Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gin Glu His Pro
65 70
Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys
75 80
PATENTANSPRÜCHE:
1.

Indikatorpolypeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovascsulären und/oder endothelialen Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid, das N-terminale
Fragment proCNP(1-80)(SEQ.ID NO:1) des C-Typ-natriuretischen Precursers (1-126
Aminosäuren, Swiss Prot; P23582) oder ein Fragment davon ist.

Claims

2. Antikörperzusammensetzung zur Bestimmung von C-Typ natriuretischen Peptiden, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Antikörper enthält, der spezifisch an ein Polypeptid gemäss Anspruch 1 bindet, welches aus den Aminosäuren 1 - 80 des N-terminus des menschlichen pro C-Typ natriuretischen Peptiden (proCNP(1 - 80)) (SEQ. ID. No. 1), oder eines Fragmentes davon besteht.

3. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Anti- <Desc/Clms Page number 5> körper ein polyklonaler Antikörper ist.

4. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Anti- körper ein monoklonaler Antikörper ist.

5. Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper mit einer Markierung versehen ist.

6. Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Markie- rung ein Radionuklid, Biotin, eine fluoreszierende Substanz, ein Enzym, ein Farbstoff oder gefärbte Partikel sind.

7. Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper an einem festen Träger immobilisiert ist.

8. Immunoassayverfahren für proCNP(1 - 80), (SEQ. ID. No.1),gekennzeichnet durch folgen- de Schritte: a) Kontaktieren einer Patientenkörperflüssigkeit mit einem primären Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 6, um einen Komplex aus Antikörper und proCNP(1 - 80)(SEQ.

ID No. 1) zu bilden ; und b) Messung der Bildung dieses Komplexes.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein an Mikrotiterplatten, Memb- ranen oder Partikeln (Beads) immobilisierter Antikörper eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Bildung des Komplexes aus Antikörper und proCNP(1 - 80)(SEQ. ID. No. 1) dieser Komp- lex mit einem zweiten Antikörper, der an proCNP(1 - 80)(SEQ. ID. No. 1) bindet, in Kontakt gebracht wird, um einen Sekundärkomplex aus beiden Antikörpern und proCNP zu bilden, der dann in Form eines Sandwichassays erfasst wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper am festen Träger immobilisiert wird und dass eine bekannte Menge von markier- tem humanem proCNP(1 - 80)(SEQ. ID. No. 1) oder ein markiertes Antigenfragment davon der in Lösung befindlichen Körperflüssigkeit zugesetzt wird, um einen kompetitiven Bin- dungsassay zu erzielen.

12. immunoassay-Kit zur Bestimmung von humanem CNP(1 - 80)(SEQ. ID. No. 1), welcher folgendes enthält: a) einen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in immobilisierter Form und b) wenigstens eine weitere Zusammensetzung aus folgender Gruppe b i) eine markierte Probe von menschlichem proCNP(1 - 80)(SEQ. ID No. 1) oder ein antigenes Fragment davon. b ii) ein Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie b iii) ein markierter zweiter Antikörper, der speziell an einem Antikörper nach einem der Ansprüche 1 und 3 bindet.

13. In vitro-Diagnose- bzw.-Prognoseverfahren für Krankheiten, die zu einer erhöhten Bildung von proCNP führen, bei welchem eine Körperflüssigkeit eines Patienten mit einem ersten Antikörper nach einem der Ansprüche 2 bis 4 in Kontakt gebracht wird, um einen Komplex aus erstem Antikörper und proCNP(1 - 80)(SEQ. ID. No. 1) zu bilden, und die Bildung des genannten Komplexes gemessen wird, um die Konzentration von proCNP(1 - 80)(SEQ. ID.

No.1) in der Körperflüssigkeit zu bestimmen, wobei eine erhöhte Konzentration von proCNP(1 - 80)(SEQ. ID. No. 1) im Vergleich zur Konzentration bei normalen Personen zur Diagnose von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen genutzt wird.