WO2002057785A1 - Verfahren zum nachweis pankreatitischer und gastrointestinaler erkrankungen - Google Patents

Verfahren zum nachweis pankreatitischer und gastrointestinaler erkrankungen Download PDF

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Manfred Nilius
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Definitions

  • the present invention relates to methods for the detection of pancreatic and gastrointestinal diseases, in particular methods for the detection of pancreatic carcinomas, chronic pancreatitis, gastric lesions and inflammatory bowel diseases.
  • Pancreatic diseases such as pancreatic carcinoma or chronic pancreatitis, as well as gastrointestinal diseases, for example gastric lesions or inflammatory bowel diseases, pose serious threats to the human and animal body.
  • gastrointestinal diseases for example gastric lesions or inflammatory bowel diseases
  • invasive methods endoscopy, colonoscopy, ERCP, etc.
  • imaging methods sonography, x-ray, computer tomography, etc.
  • some laboratory methods have become established as routine methods that can provide information about the insufficiency of certain internal organs such as the pancreas.
  • breath tests have recently been carried out (for example 13 C-urea breath test, H 2 -glucose breath test, 13 C-triglyceride breath test, etc. ), but their implementation has so far only been possible at a few centers, since correspondingly expensive equipment (e.g. mass spectrometer) must be available, and the costs thereof, for example due to expensive 13 C marking, can no longer be reduced.
  • correspondingly expensive equipment e.g. mass spectrometer
  • test for pancreatic elastase it can be stated that the test is a useful method for diagnosing severe exocrine pancreatic insufficiency, but it proves relatively poorly to mild to moderate functional restrictions.
  • K-Ras mutations can be detected at a pre-malignant stage, i.e. at a stage in which a carcinoma is "developing", while the tumor suppressor genes pl ⁇ and p53 are inactivated when the carcinoma is present
  • Carcinoma development have the disadvantage, however, that they also occur in the preliminary stages of tumor development, so-called “pre-malignant” conditions and in patients with chronic pancreatitis without tumor can be detected, which in turn limits their predictive power.
  • a combination of different tumor markers or other specific markers for pancreatic carcinoma should therefore be aimed for.
  • CA 19-9 a tumor marker used as a progression parameter, which is determined in patient serum as a progression marker and recurrence indicator.
  • CCA carboxypeptidase A
  • PCPA procarbypypasease A
  • PCPA is increased in the serum of pancreatic tumor patients.
  • carboxypeptidase A is only secreted to a small extent by the healthy pancreas (approx. 5% of the enzyme secretion). It is therefore to be expected that a pathological change in the pancreas (pancreatitis, pancreatic carcinoma) leads to the enzyme falling below the detection limit and / or to an increase in the “immature” proenzyme (PCPA).
  • Another advantage is that carboxypeptidase A survives the bowel passage undamaged and can be quantified in the stool.
  • Crohn's disease and ulcerative colitis are chronic inflammatory bowel diseases (IBD) of unclear etiology. logic for which there are currently no satisfactory diagnostic or therapeutic options available.
  • IBD chronic inflammatory bowel diseases
  • the methods currently used to diagnose Crohn's disease or ulcerative colitis include determining inflammation parameters and microbiological and serological examinations of body fluids and stool. In addition, there are sonographic and endoscopic examination procedures in some cases.
  • US Pat. No. 5,455,160 describes methods for diagnosing oncological diseases of the gastrointestinal tract and Crohn's disease and ulcerative colitis.
  • the document discloses the use of antibodies that are directed against calprotectin, in particular the power of • an enzyme immunoassays for the quantification of calprotectin in faeces of patients with an increased amount of calprotectin gives an indication of one of the aforementioned diseases.
  • DE 41 07 765 AI describes a method for obtaining a highly specific pancreatic elastase 1 antibody which reacts both with body fluids and with stool. An antibody obtained according to this procedure is suitable for the diagnosis of chronic and acute pancreatitis in the stool.
  • SLPI Secretory Leukocyte Proteinase Inhibitor
  • Si-Tahar Gastroenterology 118 (2000), 1061-1071
  • SLPI SLPI
  • WO 99/17800 describes the use of SLPI in powdered form as a pharmaceutical agent.
  • the powdered dosage form specifically described there serves the use of SLPI in the context of inhalation therapy.
  • US Pat. No. 5,633,227 shows the use of SLPI for the treatment of asthma or allergic rhinitis.
  • ⁇ logical sandwich assays for SLPI or SLPI go from JP 07103977 immunological elastase complexes indicate where SLPI fragments are detected with the amino acid residues 1 to 54 and 55 to the 107th It is described that diseases of the respiratory tract can be detected using the system described.
  • JP 03279862 also discloses antibody-based test methods for SLPI.
  • SLPI is known to have inhibitory activity against chymotrypsin type proteases (such as pancreatic elastase) and trypsin type proteases.
  • the first-mentioned activity is known to be assigned to the C-terminal area and the second-mentioned activity to the N-internal area of SLPI.
  • No. 5,851,983 describes truncated and fusion proteins produced on the basis of these findings, as well as pharmaceutical applications of the same.
  • WO 96/08275 discloses further fragments of SLPI and their use for inhibiting tryptases.
  • the technical problem underlying the present invention is therefore to provide simple, gentle, inexpensive and quick detection methods for pancreatic and gastrointestinal diseases, in particular pancreatic carcinoma, chronic pancreatitis, gastric lesions and inflammatory bowel diseases.
  • the invention solves this problem by providing a method for detecting a disease of a human or animal body, selected from the group consisting of pancreatic carcinoma, chronic pancreatitis, gastric lesion and inflammatory bowel disease, whereby serum or stool of the human or animal body is obtained and SLPI (Secretory Leukocyte Protease Inhibitor), fragments or complexes thereof by contacting them.
  • immunological agents is detected, especially where the concentration ration on SLPI, fragments or complexes thereof is determined in serum or stool.
  • patients suffering from chronic pancreatitis or pancreatic carcinoma can be diagnosed by having SLPI in their stool, in particular in an increased concentration compared to healthy people.
  • the stool of healthy human or animal bodies has very little or no SLPI.
  • not only chronic pancreatitis or pancreatic carcinoma can be determined in the stool of patients by means of the present invention, but also the degree of disease can be quantified by means of an SLPI concentration determination. It was shown that the SLPI concentrations in the stool correlate with the concentrations of elastase-1 present there.
  • the invention is surprising, inter alia, because it could be shown that SLPI is not immediately degraded in the intestinal tract in every case. Rather, SLPI can be demonstrated in stool in patients with chronic pancreatitis and pancreatic carcinoma.
  • the invention thus relates in particular to methods for the immunological detection of pancreatic diseases by detection of SLPI in the stool of human or animal bodies.
  • the present method for the immunological detection of pancreatic and gastrointestinal diseases can also be used for the diagnosis of gastric lesions, an increased SLPI concentration in the serum being detected compared to normal, healthy control subjects.
  • the invention therefore also relates in particular to methods for the immunological detection of gastrointestinal diseases by detection of SLPI in the serum of human or animal bodies.
  • the term “immunological agents” in particular understood the use of antibodies for the detection of antigens, in particular SLPI, SLPI-containing complexes, for example protein-protein complexes of homo- or heteromeric composition or SLPI fragments.
  • SLPI is also understood below to mean its complexes, for example with other proteins, such as an SLPI-elastase-1 complex, or fragments of SLPI, for example C- or N-internal fragments.
  • Such fragments can have, for example, amino acid residues 1 to 54 (N-terminal fragment) or 55 to 107 (C-terminal fragment).
  • the term antibody is understood to mean both monoclonal and polyclonal antibodies and fragments thereof, as long as they specifically recognize SLPI, SLPI-containing complexes, for example SLPI-Elastase-1 complexes, or SLPI fragments and tie. In preferred embodiments bind 'the antibodies or fragments thereof no other antigens.
  • the antibodies or fragments can be modified, for example with others Molecules or parts thereof are conjugated, associated or covalently or non-covalently bound, for example with colored labels, radioactive labels, enzymes which trigger measurable reactions, such as phosphatases, peroxidases, enzyme substrates, fluorescent substances, chemiluminescent substances, cytotoxic agents, spacers , Carriers or the like.
  • the labeled, conjugated or unmodified antibodies can be in soluble or immobilized form, for example on carrier matrices or beads.
  • the enzyme-labeled antibodies can be used in a second enzyme amplification system.
  • the use of immunological agents means contacting a sample, that is to say serum or stool, in particular homogenized stool, with an immunological agent, comprising at least one antibody which specifically recognizes the antigen, that is to say SLPI ,
  • the invention therefore also relates to the use of antibodies against SLPI for the qualitative and / or quantitative determination of SLPI in the stool or serum of a human or animal body. According to the invention, it is thus possible, using the antibody against SLPI, to specifically detect gastrointestinal diseases in serum and pancreatic carcinoma or chronic pancreatitis in the stool.
  • the methods according to the invention using immunological agents can preferably be carried out as sandwich ELISA, indirect or competitive ELISA, with HTP (high through put) methods being particularly preferred.
  • the at least two different monoclonal antibodies which are preferably directed against different epitopes, but alternatively also the same epitopes, from SLPI.
  • the at least two antibodies can, for example, be soluble and / or supported in a homogeneous or heterogeneous system.
  • the immunological agents as a system of three different antibodies, one of the antibodies being in the heterogeneous phase and the other two antibodies being soluble.
  • One of the two soluble antibodies is labeled, while the other is unlabeled.
  • the soluble antibody is directed against the unlabeled antibody.
  • Processes carried out according to the invention using immunological agents therefore require, in a particularly preferred embodiment, the incubation of the serum or, preferably homogenized and, if appropriate, diluted stool with at least two different antibodies which are specific for SLPI.
  • one of the two antibodies bound to a solid phase this being done in the usual way.
  • the further anti Body is advantageously in soluble form and in a preferred embodiment bears a marking. If further antibodies are used according to the invention, in a preferred embodiment only one of these bears a label.
  • one embodiment provides that either an antibody that is non-specifically bindable with SLPI or particularly preferably an antibody that is specifically bindable with SLPI is bound to a solid phase.
  • This antibody bound to the solid phase is then incubated with the serum or the stool and, optionally after a washing step, a second antibody which is specifically bindable with SLPI, is in a soluble form and bears a label. If the antibody bound to the solid phase is an antibody that is nonspecifically bindable with SLPI, not only SLPI but also other antigens bind to the solid phase.
  • the second antibody which however binds specifically with SLPI, now specifically reacts only with SLPI or the complex of SLPI and the first antibody, so that only SLPI molecules specifically carry a labeled antibody and can thus be quantified after separation of the solid from the liquid phase ,
  • SLPI-specific first antibody to a support, for example, in a sandwich ELISA
  • a second labeled antibody against SLPI is then added, which specifically reacts with SLPI or the complex of SLPI and the first antibody.
  • the amount of SLPI can be determined by means of the labeling of the second antibody using a calibration solution.
  • the invention also provides that a microtiter plate is coated with a first antibody, which binds specifically or nonspecifically to SLPI, that the serum or the stool is subsequently brought into contact with the coated microtiter plate and, after washing off unbound constituents, a labeled, for example biotin-labeled, second antibody against SLPI is added to the microtiter plate, the microtiter plate being incubated under conditions that the second antibody can bind to SLPI.
  • the solid phase is then separated from the liquid phase and either the labeling is detected directly or, if an enzyme-labeled second antibody is used, a substrate is added and the conversion of the substrate is determined quantitatively.
  • the second antibody labeled with biotin in next incubation with a conjugate of peroxidase (POD) and streptavidin.
  • POD peroxidase
  • streptavidin a conjugate of peroxidase
  • the peroxidase is able to oxidize the substrate ABTS (2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) di-ammonium salt). Oxidized ABTS can then be determined photometrically.
  • the first antibody is bound to a carrier matrix, for example a fleece, tissue or membrane structure, in such a way that it does not represent the bottom of the depression of an ELISA immunoplate, as is usually the case, but is instead integrated directly into the matrix
  • a carrier matrix for example a fleece, tissue or membrane structure
  • Preferred matrixes are hollow fiber membranes or microporous flat membranes, which in an advantageous embodiment of the invention can also be provided with ion exchange groups.
  • Polyclonal antibodies can be produced by immunizing animals with isolated and fully purified SLPI or fragments thereof
  • Antisera with polyclonal antibodies are obtained in a manner known per se. monoclonal
  • Antibodies are produced by methods known per se.
  • the antibodies against SLPI used according to the invention can be commercially available antibodies.
  • the gastric lesions detectable according to the invention can represent symptoms of gastritis or an ulcer.
  • the inflammatory diseases detectable according to the invention can be attributed, for example, to a Helicobacter pylori infection. or symptoms of Crohn's disease or ulcerative colitis.
  • the elastase 1 concentration is also detected at the same time.
  • Human pancreatic elastase-1 survives the passage through the intestine undamaged and can be quantified in the stool as a protein.
  • the concentration of elastase 1 in the stool reflects the exocrine pancreatic function. Values greater than 200 ⁇ g elastase / per gram of stool indicate normal exocrine pancreatic function and values less than 200 ⁇ g elastase / per gram of stool indicate exocrine prancreatic insufficiency.
  • elastase-1 is released into the serum in the acute inflammatory phase, so that quantification of the elastase in the serum allows the diagnosis or the exclusion of this disease.
  • a high concentration of elastase-1 in the serum therefore indicates pancreatitis.
  • FIG. 1 a histogram of SLPI concentration in the stool
  • FIG. 2 shows a histogram for the elastase 1 concentration in the stool
  • 3 and 4 each show a histogram of the SLPI concentration in the serum.
  • the extraction is carried out by vigorously mixing the stool sample suspension several times at room temperature with a test tube shaker.
  • the chairs must be well homogenized to ensure full extraction. After at least five minutes of extraction, the mixture is finally mixed again. After the particles have settled, the stool sample extracts are diluted as follows.
  • sample extracts were diluted for the measurement of SLPI in a dilution of 1: 100 and for the comparative measurement of Elastase-1 with a dilution of 1: 500.
  • the - SLPI concentrations in the stool were determined using an SLPI ELISA (Quantikine ® , Cat. No. DP 100, 6/99) from R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Germany).
  • This ELISA uses a 96-well polystyrene microtiter plate coated with mouse monoclonal anti-human SLPI antibody. After pipetting the extract into the wells, SLPI becomes monoclonal through the immobilized. Antibody bound. After washing away unbound substances, an enzyme-linked polyclonal antibody, which is specific for human SLPI, is added to the wells (polyclonal antibody against human SLPI, linked to horseradish peroxidase). After washing off unbound antibody-enzyme reagents, a substrate solution is added to the wells and the color development is measured as a measure of bound SLPI. '
  • pankreatitischer elastase-1 The concentration of pankreatitischer elastase-1 was measured by an elastase-1-ELISAs Company ScheBo-Tech ® (Giessen, Germany, cat. No. 07, April 2000 EP 0547059 Bl) is determined.
  • FIG. 1 shows the SLPI concentrations in the stool of the patient (SLPI in picogram per gram of stool), ' plotted for the patient group without chronic pancreatitis, the patient group with pancreatic carcinoma and the patient group with chronic pancreatitis. It clearly shows that the control group members have no or only have very little SLPI in the stool, while the two patient groups with chronic pancreatitis and pancreatic carcinoma have significantly increased SLPI concentrations in the stool.
  • FIG. 2 shows the concentration measurements of elastase-1 carried out on the same patient groups.
  • the healthy control group has an elastase content well above 200 ⁇ g / g stool, while the two patient groups with chronic pancreatitis and pancreatic carcinoma have significantly reduced elastase 1 concentrations in the stool.
  • the serum samples were diluted to measure SLPI at a dilution of 1: 100.
  • the SLPI concentrations in the serum were determined by means of SLPI ELISAs (Quantikine®, Cat. No. DP 100, 6/99) from R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Germany). The ELISA was carried out as described in Example 1.
  • FIG. 3 shows the SLPI concentration in ng / ml in the control group and the patients.
  • the patient group showed significantly higher SLPI serum concentrations than the control group.
  • 17 ml of blood were obtained from 17 patients with normal gastric findings (controls), 16 patients with chronic gastritis and 18 patients with ulcer disease, and serum was obtained by centrifuging at 3000 rpm, RT, 10 min.
  • the serum samples were diluted to measure SLPI in a dilution of 1: 100.
  • SLPI concentrations in the serum were determined by means of SLPI ELISAs (Quantkine®, Cat. No. DP 100, 6/99) from R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Germany).
  • the ELISA was carried out as described in Example 1.
  • Figure 4 shows the SLPI concentration in ng / ml in the serum of patients with normal gastric finding Patients with chronic gastritis and patients with ulcers. The figure clearly shows that the healthy control group has a significantly lower SLPI concentration in the serum than both the patient group with chronic gastritis and those with ulcer disease.
  • SLPI serum concentrations are also suitable as markers for gastrointestinal lesions.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis gastraler und pankreatitischer Erkrankungen unter Einsatz von Antikörpern in Serum und Stuhl.

Description

Verfahren zum Nachweis pan reatitischer und gastro- intes inaler Erkrankungen
Besehreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis pankreatischer und gastrointestinaler Erkrankungen, insbesondere Verfahren zum Nachweis von Pankreaskarzinomen, chronischer Pankreatitis, gast- rischer Läsionen und entzündlicher Darmerkrankungen .
Pankreatische Erkrankungen, wie Pankreaskarzinom oder chronische Pankreatitis, stellen ebenso wie gastrointestinale Erkrankungen, also zum Beispiel gastrische Läsionen oder entzündliche Darmerkrankungen, ernsthafte Gefährdungen des menschlichen und tierischen Körpers dar. Eine frühzeitige und möglichst spezifische Diagnose derartiger Krankheiten ist für eine erfolgversprechende Therapie uner- lässlich. Bisher werden fast alle Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes mit invasiven Methoden (En- doskopie, Koloskopie, ERCP, etc.) mit Gewebeprobenentnahme, unterstützt durch bildgebende Verfahren (Sonografie, Röntgenologie, Computertomografie, etc.) als Standardmethoden diagnostiziert. In der Vorphase dieser Untersuchungen haben sich einige Labormethoden als Routinemethoden etabliert, die Aufschluss über eine Insuffizienz bestimmter innerer Organe wie zum Beispiel des Pankreas geben kön- nen. Diese Labormethoden • sind jedoch meist aufwendig und müssen oft an frischem Material (Magensaft, Pankreassaft, Duodenalsaft> etc.) innerhalb einer kurzen Zeit durchgeführt werden, da durch die enzy- matische Zusammensetzung des Probenmaterials sonst ein Nachweis spezifischer Faktoren oft nicht mehr gelingt (dies gilt vor allem für Enzym-Substrat- Reaktionen) . Werden bestimmte Parameter im Serum der Patienten bestimmt, sind diese Werte oft nicht in gewünschtem Maße zuverlässig (große intra- und interindividuelle Schwankungen) und zeigen eine extrem geringere Sensitivität .
Bei einigen wenigen Erkrankungen (chronische Pankreatitis, Helicobacter pylori-Infektion des Magens, bakterielle Darmfehlbesiedlung, etc.) haben sich in jüngster Zeit auch Atemteste (zum Beispiel 13C-Harnstoffatemtest, H2-Glucoseatemtest, 13C- Triglycerid-Atemtest, etc.) etablieren können, deren Durchführung aber bisher nur an wenigen Zentren möglich ist, da entsprechend teures Equipment (zum Beispiel Massenspektrometer) zur Verfügung muss, und deren Kosten, bedingt durch zum Beispiel teure 13C-Markierung, nicht mehr weiter gesenkt werden können.
Daher eignen sich diese Methoden meist auch nicht zur Aufnahme in entsprechende Vorsorge-Screening- Programme .
Bisher gibt es nur ganz wenige diagnostische Tests, mit denen bestimmte Erkrankungen im Stuhl der Patienten nachgewiesen werden können. Dazu zählt zum Beispiel der Hämoccult-Test zum Nachweis okulten Blutes im Stuhl als Screening-Methode für das Darm- karzinom, der Nachweis von Pankreas-Elastase im Stuhl zur Diagnose der , chronischen Pankreatitis und der jüngst entwickelte Helicobacter pylori-Stuhl- Test zum Nachweis der Helicobacter pylori-Infektion im Magen. Bei den letzten beiden Tests wird der Nachweis mittels Antikörpertechnologie durchge- führt .
Bezüglich des Tests für die Pankreaselastase lässt sich feststellen, dass der Test zwar ein brauchbares Verfahren zur Diagnose der schweren exokrinen Pankreasinsuffizienz ist, milde bis mäßige Funkti- onseinschränkungen jedoch relativ schlecht nachweist .
Eine sichere Methode zur nicht-invasiven Differenz- zierung malignomverdächtiger Pankreasveränderungen steht nach wie vor nicht zur Verfügung. Als Kandi- daten für die nicht-invasive Diagnostik des Pankre- askarzinoms sind vor allem Marker in der Diskussion, die bestimmte Genmutationen nachweisen (K-Ras, plβ, p53) . Da die einzelnen Gene im zeitlichen Verlauf der Entstehung eines Karzinoms unterschiedlich in Aktion treten, sind sie auch mit einer unterschiedlichen Wahrscheinlichkeit mit dem Entstehen eines Karzinoms assoziiert.
So können zum Beispiel K-Ras Mutationen schon in einem prämalignen Stadium, also in einem Stadium des „Entstehens" eines Karzinoms, nachgewiesen werden, während die Tumor-Supressor-Gene plβ und p53 bei vorhandenem Karzinom inaktiviert sind. Gene, die früh an der Entstehung des Karzinoms beteiligt sind, haben allerdings den Nachteil, dass sie auch in Vorstufen der Tumorentstehung, sogenannten „prämalignen" Zuständen und bei Patienten mit chroni- scher Pankreatitis ohne Tumor nachgewiesen werden können, was ihre Vorhersagekraft wiederum einschränkt. Deshalb ist eine Kombination verschiedener dieser Tumormarker beziehungsweise anderer spe- zifischer Marker für das Pankreaskarzinom anzustreben.
Dasselbe gilt für den als Verlaufsparameter genutzten Nachweis von CA 19-9, einem Tumormarker der in Patientenserum als Verlaufs-Marker und Rezidiv- Indikator bestimmt wird. Studien zeigen, dass eben auch 5/7 Patienten mit einer chronischen Pankreatitis erhöhte CA 19-9 Serumwerte haben, und nach einer erfolgten Operation eines Pankreaskarzinoms eine Normalisierung der Serum CA 19-9 Spiegel nur in 10-29% der Fälle eintritt.
Bisher steht ein kommerzieller Kit zum Nachweis von K-Ras mittels PCR-Technik zur Verfügung (Elucigene K-Ras7; Zeneca Diagnostics), doch ist diese Technik zeitaufwendig und teuer und erfordert wie alle mo- lekularbiologischen Methoden einen sehr sorgfältigen (sterilen) Umgang mit dem Untersuchungsmaterial und der Durchführung des Testverfahrens, um DNA- Kontaminationen aus der Umwelt zu vermeiden, die den Nachweis falsch negativ oder falsch positiv be- einflussen können.
Als ein weiterer Marker zur Diagnose des Pankreaskarzinoms bietet sich die Bestimmung von Carboxy- peptidase A (CPA) an. Dieses Enzym wird ausschließlich im Pankreas als Vorläufer- („Proenzym") Procar- boxypeptidase A (PCPA) gebildet. Durch Abspaltung des Propeptids wird das Enzym in aktive Carboxypeptidase überführt.
PCPA wird im Serum von Pankreastumorpatienten erhöht nachgewiesen. Außerdem wird Carboxypeptidase A vom gesunden Pankreas im Vergleich mit anderen Pankreasenzymen (Elastase, Amylase, etc.) nur in geringem Maße sezerniert (ca. 5% Anteil an der Enzymsekretion) . Es ist deshalb zu erwarten, dass eine krankhafte Veränderung des Pankreas (Pankrea- titis, Pankreaskarzinom) zum Abfall des Enzyms unter die Nachweisgrenze und/oder zu einem Anstieg des „unreifen" Proenzyms (PCPA) führt. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Carboxypeptidase A die Darmpassage unbeschadet übersteht und im Stuhl zu quantifizieren ist.
Es gibt bisher keinen kommerziellen Nachweiskit zur Bestimmung von CPA beziehungsweise PCPA in Körperflüssigkeiten oder Stuhl.
Insgesamt lässt sich feststellen, dass eine siche- re, nicht-invasive Diagnostik chronischer Veränderungen bei den meisten gastrointestinalen Erkrankungen nach wie vor nicht zur Verfügung steht.
Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa vergeht zwischen dem Auftreten erster Symptome bis zur Diagnosestellung im Allgemeinen ein sehr langer Zeitraum, der die Durchführung einer Heilbehandlung in vielen Fällen sehr erschwert oder sogar unmöglich macht. Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) unklarer Ätio- logie für die gegenwärtig weder befriedigende Diagnose- noch Therapiemöglichkeiten zur Verfügung stehen. Die gegenwärtig zur Diagnose von Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa durchgeführten Verfahren um- fassen das Feststellen von Entzündungsparametern sowie mikrobiologische und serologische Untersuchungen von Körperflüssigkeiten und Stuhl. Hinzu kommen in einigen Fällen sonografische und endosko- pische Untersuchungsverfahren. Überdies wurden Ver- fahren unter Einsatz radioaktiver Isotopen wie lι:LIndium oder "Technezium entwickelt, im Rahmen derer mit diesen Isotopen Leukozyten markiert und nachgewiesen wurden. Obgleich diese Verfahren eine hohe Sensitivität und Spezifität für den Nachweis von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa aufweisen, erweisen sie sich als technisch kompliziert, teuer und für den Patienten als belastend. Bestimmte Pa-
. tientengruppen wie Kinder oder schwangere Frauen können diesen Diagnoseverfahren nicht ausgesetzt werden.
Es wurden daher schonendere Verfahren entwickelt, die auf der Basis von Antikörpertests einen spezifischen Nachweis bestimmter Krankheitsbilder schon frühzeitig ermöglichen. So beschreibt die US-PS 5,455,160 Verfahren zur Diagnose onkologischer Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes sowie von Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. Die Druckschrift offenbart den Einsatz von Antikörpern, die gegen Calprotectin gerichtet sind, insbesondere den Ein- • satz eines Enzym-Immuntests zur Quantifikation von Calprotectin im Stuhl von Patienten, wobei eine erhöhte Menge von Calprotectin einen Hinweis auf eine der vorgenannten Krankheiten gibt. Die DE 41 07 765 AI beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von einem hochspezifischen Pankreas- Elastase 1-Antikörper, der sowohl mit Körperflüssigkeiten als auch mit Stuhl reagiert. Ein gemäß dieses Verfahrens gewonnener Antikörper eignet sich zur Diagnose der chronischen und akuten Pankreatitis im Stuhl.
SLPI (Secretory Leukocyte Proteinase Inhibitor) , ein 11,7 kDa großes Protein mit Protease- inhibitorischer Funktion ist aus Si-Tahar (Gastroenterology 118 (2000), 1061-1071) als mögliches therapeutisches Agens gegen intestinale schädigende Einflüsse wie mikrobielle Infektionen, bekannt .
Aus der WO 94/06454 ist die Verwendung von SLPI als prophylaktisches Agens gegenüber einer HIV- Infektion bekannt. In der WO 99/17800 ist die Verwendung von SLPI in pulverisierter Form als pharmazeutisches Agens beschrieben. Die dort speziell be- schriebene pulverisierte Darreichungsform dient dem Einsatz von SLPI im Rahmen einer Inhalationstherapie. Aus der US 5,633,227 geht die Verwendung von SLPI zur Behandlung von Asthma oder allergischer Rhinitis hervor. Aus der JP 07103977 gehen immuno- logische ■ Sandwich-Tests für SLPI oder SLPI- Elastase-Komplexe hervor, wobei SLPI Fragmente mit den Aminosäureresten 1 bis 54 und 55 bis 107 erkannt werden. Es wird beschrieben, dass mittels des beschriebenen Systems Erkrankungen der Atemwege nachgewiesen werden können. Aus der JP 03279862 gehen ebenfalls' Antikörper-basierte Testverfahren für SLPI hervor. Für SLPI ist bekannt, dass dieses Protein inhibitorische Aktivität gegenüber Chymotrypsintyp- Proteasen (wie pankreatische Elastase) und Trypsin- typ-Proteasen aufweist. Für die erstgenannte Akti- vität ist bekannt, dass diese dem C-terminalen Bereich und die zweitgenannte Aktivität dem N- ter inalen Bereich von SLPI zuzuordnen ist. Die US 5,851,983 beschreibt auf der Basis dieser Erkenntnisse hergestellte verkürzte und Fusionsproteine sowie pharmazeutische Anwendungsmöglichkeiten derselben. Schließlich offenbart die WO 96/08275 weitere Fragmente von SLPI und deren Einsatz zur Inhibierung von Tryptasen.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem liegt also darin, einfach durchzuführende, schonende, kostengünstige sowie schnell durchzuführende Nachweisverfahren für pankreatische und gastrointestinale Erkrankungen, insbesondere Pankreaskarzinom, chronische Pankreatitis, gastri- sehe Läsionen und entzündliche Darmerkrankungen bereitzustellen.
Die Erfindung löst dieses Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis einer Krankheit eines menschlichen oder tierischen Körpers, ausgewählt aus de'r Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom, chronischer Pankreatitis, gastrischer Läsion ■ und entzündlicher Darmerkrankung, wobei Serum oder Stuhl des menschlichen oder tierischen Körpers gewonnen und SLPI (Sekretorischer Leukozyten- Protease-Inhibitor) , Fragmente oder Komplexe davon durch Inkontaktbringen mit . immunologischen Mitteln nachgewiesen wird-, insbesondere, wobei die Konzent- ration an SLPI, Fragmenten oder Komplexen davon im Serum oder Stuhl bestimmt wird. Erfindungsgemäß konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass unter Einsatz immunologischer Mittel, insbesondere monoclonaler oder polyclonaler Antikörper, ein Nachweis der genannten Krankheiten im Serum oder im Stuhl des menschlichen oder tierischen Körpers möglich ist, indem die Anwesenheit beziehungsweise Abwesenheit von SLPI, Komplexen oder Fragmenten da- von, insbesondere die Konzentration an vorhandenem SLPI, im Vergleich zu nicht erkrankten Kontrollpersonen bestimmt wird.
An chronischer Pankreatitis oder Pankreaskarzinom erkrankte Patienten lassen sich erfindungsgemäß da- durch diagnostizieren, dass in ihrem Stuhl SLPI auftritt, insbesondere in erhöhter Konzentration gegenüber Gesunden. Der Stuhl von gesunden menschlichen oder tierischen Körpern weist sehr wenig o- der kein SLPI auf. Erfindungsgemäß kann mittels der vorliegenden Erfindung im Stuhl von Patienten nicht nur chronische Pankreatitis oder Pankreaskarzinom bestimmt, sondern überdies auch der Erkrankungsgrad mittels einer SLPI-Konzentrationsbestimmung quantifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die SLPI-Konzentrationen im Stuhl mit den dort vorhandenen Konzentrationen an Elastase-1 korrelieren. Es konnte insbesondere gezeigt werden, dass bei Patienten mit chronischer Pankreatitis die SLPI- Konzentrationen im Stuhl mit den Elastase-1- Konzentrationen und dass auch die SLPI- Konzentration bei gesunden Kontrollpersonen mit den Elastase-1-Konzentrationen dieser Personen korre- liert. Gleiches gilt für die SLPI-Konzentration von Patienten mit Pankreaskarzinom, die demgemäß ebenfalls mit den Elastase-1-Konzentrationen dieser Patienten korreliert.
Die Erfindung ist unter anderem deswegen überra- sehend, als dass gezeigt werden konnte, dass SLPI im Darmtrakt nicht in jedem Fall sofort abgebaut wird. Vielmehr kann bei Patienten mit chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom SLPI im Stuhl nachgewiesen werden.
Die Erfindung betrifft also insbesondere Verfahren zum immunologischen Nachweis von pankreatischen Erkrankungen durch Detektion von SLPI im Stuhl von menschlichen oder tierischen Körpern.
Erfindungsgemäß konnte überdies gezeigt werden, dass bei gesunden Kontrollpersonen, die keine gastrischen Läsionen wie Gastritis oder Ulkus aufwiesen, die SLPI-Konzentration im Serum geringer als bei Patienten mit solchen Läsionen ist. Erfindungsgemäß kann das vorliegende Verfahren zum immunolo- gischen Nachweis von pankreatischen und gastroin- testinalen Erkrankungen also auch zur Diagnose von gastralen Läsionen dienen, wobei eine gegenüber normalen, gesunden Vergleichspersonen erhöhte SLPI- Konzentrationen im Serum nachgewiesen wird. Die Er- findung betrifft daher insbesondere auch Verfahren zum immunologischen Nachweis von gastrointestinalen Erkrankungen durch Detektion von SLPI im Serum von menschlichen oder tierischen Körpern.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff "immunologische Mittel" insbeson- dere der Einsatz von Antikörpern zum Nachweis von Antigenen, insbesondere SLPI, SLPI-haltigen Komplexen, zum Beispiel Protein-Protein-Komplexen homo- oder heteromerer Zusammensetzung oder SLPI- Fragmenten verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff SLPI im Folgenden auch dessen Komplexe zum Beispiel mit anderen Proteinen, wie ein SLPI-Elastase-1-Komplex, oder Fragmente von SLPI, zum Beispiel C- oder N- ter inale Fragmente, verstanden. Solche Fragmente können zum Beispiel Aminosäurereste 1 bis 54 (N- ferminales Fragment) oder 55 bis 107 (C-terminales Fragment) aufweisen. Hinsichtlich der vorgenannten Positionsangaben wird auf die US 5,851,983 und die dort in SEQ ID Nr. 4 angegebene Nummerierung verwiesen. Der Offenbarungsgehalt der US 5,851,983 sowie der WO 96/08275 hinsichtlich der dort offenbarten Fragmente von SLPI wird hiermit vollständig in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung mit einbezogen und verdeutlicht, dass für die dort genannten Fragmente in Kombination mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren Schutz begehrt wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wer- den unter dem Begriff Antikörper sowohl monoclonale als auch polyclonale Antikörper sowie Fragmente davon verstanden, solange diese spezifisch SLPI, SLPI-haltige Komplexe, zum Beispiel SLPI-Elastase- 1-Komplexe, oder SLPI-Fragmente erkennen und bin- den. In bevorzugter Ausführung binden' die Antikörper oder Fragmente davon keine anderen Antigene. Selbstverständlich können die Antikörper oder Fragmente modifiziert sein, zum Beispiel mit anderen Molekülen oder Teilen davon konjugiert, assoziiert oder kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein, zum Beispiel mit Farbmarkierungen, radioaktiven Markierungen, messbare Reaktionen auslösenden Enzy- men, wie Phosphatasen, Peroxidasen, Enzymsubstraten, fluoreszierenden Substanzen, chemiluminiszen- ten Substanzen, cytotoxischen Agentien, Spacern, Trägerstoffen oder ähnliches. Die markierten, konjugierten oder nicht-modifizierten Antikörper kön- nen in löslicher oder immobilisierter Form, zum Beispiel auf Trägermatrices oder Kügelchen, vorliegen. Zum Beispiel können die enzymmarkierten Antikörper in einem zweiten Enzymamplifikationssystem eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß wird in bevorzugter Ausführung unter dem Einsatz immunologischer Mittel das Inkontaktbringen einer Probe, das heißt von Serum oder Stuhl, insbesondere homogenisierten Stuhls, mit einem immunologischen Agens verstanden, umfassend we- nigstens einen Antikörper, der spezifisch das Anti- gen, also SLPI, erkennt.
Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von Antikörpern gegen SLPI zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von SLPI im Stuhl oder Serum eines menschlichen oder tierischen Körpers. Erfindungsgemäß ist es so möglich, unter Verwendung des Antikörpers gegen SLPI gastrointestina- le Erkrankungen spezifisch in Serum und Pankreaskarzinom oder chronische Pankreatitis im Stuhl nachzuweisen. Die erfindungsgemäßen Verfahren unter Einsatz immunologischer Mittel können bevorzugt als Sandwich- ELISA, indirekter oder kompetitiver ELISA ausgeführt sein, wobei besonders bevorzugt HTP-Verfahren (high through put) eingesetzt werden.
Im Rahmen eines erfindungsgemäßen Sandwich-ELISAs ist die Bereitstellung mindestens zwei verschiedener monoclonaler Antikörper nötig, die vorzugsweise gegen unterschiedliche Epitope, alternativ aber auch gleiche Epitope, von SLPI gerichtet sind. Die mindestens zwei Antikörper können in homogenen oder heterogenen System zum Beispiel löslich und/oder geträgert vorliegen.
Erfindungsgemäß ist es selbstverständlich auch mög- lieh, die immunologischen Mittel als System aus drei unterschiedlichen Antikörpern auszuführen, wobei einer der Antikörper in heterogener Phase vorliegt und die beiden anderen Antikörper löslich sind. Einer der beiden löslichen Antikörper ist markiert, während der andere unmarkiert ist. Der lösliche Antikörper ist in dieser Ausführungsform gegen den nicht markierten Antikörper gerichtet.
Erfindungsgemäß durchgeführte Verfahren unter Einsatz immunologischer Mittel erfordern in besonders bevorzugter Ausführungsform also die Inkubation des Serums oder, bevorzugt homogenisierten und gegebenenfalls verdünnten, Stuhls mit mindestens zwei verschiedenen Antikörpern, die spezifisch für SLPI sind. In bevorzugter Ausführungsform ist . einer der beiden Antikörper an eine Festphase gebunden, wobei dies in üblicher Weise geschieht. Der weitere Anti- körper liegt vorteilhafterweise in löslicher Form vor und trägt in bevorzugter Ausführungsform eine Markierung. Werden erfindungsgemäß weitere Antikörper verwendet, so trägt in bevorzugter Ausführungs- form nur einer von diesen eine Markierung.
Erfindungsgemäß ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass entweder ein unspezifisch mit SLPI bindefähiger Antikörper oder besonders bevorzugt ein spezifisch mit SLPI bindefähiger Antikörper an eine feste Phase gebunden wird. Dieser an die Festphase gebundene Antikörper wird anschließend mit dem Serum oder dem Stuhl und, gegebenenfalls nach einem Waschschritt, einem zweiten Antikörper inkubiert, der spezifisch mit SLPI bindefähig ist, in einer löslichen Form vorliegt und eine Markierung trägt. Sofern der an die Festphase gebundene Antikörper ein unspezifisch mit SLPI bindefähiger Antikörper ist, binden an der Festphase nicht nur SLPI, sondern auch andere Antigene. Der zweite Antikörper, der jedoch spezifisch mit SLPI bindet, reagiert nun spezifisch nur mit SLPI beziehungsweise dem Komplex aus SLPI und erstem Antikörper, so dass nur SLPI- Moleküle spezifisch einen markierten Antikörper tragen und so nach Trennung der festen von der flüssigen Phase quantifiziert werden können.
Er indungsgemäß kann also beispielsweise auch vorgesehen sein, im Rahmen eines Sandwich-ELISAs einen nicht markierten SLPI-spezifischen ersten Antikörper zum Beispiel an einen Träger zu binden, die Testlösung beziehungsweise -Suspension hinzuzugeben, wobei das in der Testlösung oder -Suspension vorhandene SLPI von dem ersten Antikörper gebunden wird. Anschließend wird eine zweiter markierter Antikörper gegen SLPI hinzugegeben, der spezifisch mit SLPI oder dem Komplex aus SLPI und erstem Antikörper reagiert. Mittels der Markierung des zweiten Antikörpers kann unter Einsatz einer Eichlösung die Menge an SLPI bestimmt werden.
Wird an die Festphase ein an SLPI spezifisch bindender erster Antikörper fixiert, so wird an der Festphase auch nur SLPI spezifisch gebunden. Bei der Inkubation mit dem zweiten löslichen Antikörper reagiert auch dieser ausschließlich mit SLPI. Nach Trennung der festen von der flüssigen Phase kann über die Markierung des zweiten Antikörpers eine genaue Quantifizierung von SLPI vorgenommen werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sieht die Erfindung auch vor, dass eine Mikroti- terplatte mit einem ersten spezifisch oder unspezifisch an SLPI bindenden Antikörper überzogen wird, dass anschließend das Serum oder der Stuhl mit der beschichteten Mikrotiterplatte in Kontakt gebracht und, nach Abwaschen ungebundener Bestandteile,' ein markierter, zum Beispiel Biotin-markierter, zweiter Antikörper gegen SLPI zu der Mikrotiterplatte gegeben wird, wobei die Mikrotiterplatte unter Bedin- gungen inkubiert wird, dass der zweite Antikörper an SLPI binden kann. Anschließend wird die feste von der flüssigen Phase getrennt und entweder die Markierung direkt nachgewiesen oder, bei Verwendung eines enzymmarkierten zweiten Antikörpers, ein Sub- strat hinzugegeben, und die Umsetzung des Substrates quantitativ bestimmt. So kann vorgesehen sein, dass der mit Biotin markierte zweite Antikörper in einer nächsten Inkubation mit einem Konjugat von Peroxidase (POD) und Streptavidin reagiert. Die Pe- roxidase ist in der Lage, das Substrat ABTS (2, 2'- Azino-bis- (3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) Di- amoniumsalz) zu oxidieren. Oxidiertes ABTS kann anschließend photometrisch bestimmt werden.
In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform wird der erste Antikörper an einer Trägermatrix, zum Beispiel einer Vlies-, Gewebs- oder Membranstruktur, derart gebunden, dass er nicht wie üblicherweise den Boden der Vertiefung einer ELISA-Immunoplatte darstellt, sondern direkt in die Matrix eingebunden ist. Bevorzugte Matrixes sind Hohlfaser-Membranen oder mikroporöse Flach- membranen, die in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung auch mit Ionenaustauschergruppen versehen sein können.
Polyclonale Antikörper lassen sich herstellen, indem Tiere mit isolierter und vollständig gereinig- tem SLPI oder- Fragmenten davon immunisiert werden
■ uns so Antiseren mit polyclonalen Antikörpern in an sich bekannter Weise erhalten werden. Monoclonale
Antikörper werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt. Die erfindungsgemäß eingesetzten Anti- körper gegen SLPI können im Handel erhältliche Antikörper sein.
Die erfindungsgemäß nachweisbaren gastrischen Läsionen können Symptome einer Gastritis oder eines Ul- cus darstellen. Die erfindungsgemäß nachweisbaren entzündlichen Erkrankungen können beispielsweise auf eine Helicobacter pylori-Infektion zurückzufüh- ren oder Symptome von Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass bei dem Nachweis von SLPI im Serum oder Stuhl des Patienten gleichzeitig auch die Elastase 1-Konzentration nachgewiesen wird. Die menschliche pankreatische Elastase-1 übersteht die Passage durch den Darm unbeschadet und kann im Stuhl als Protein quantifi- ziert werden. Die Elastase-1-Konzentration im Stuhl spiegelt die exokrine Pankreasfunktion wieder. Werte größer 200 μg Elastase/pro Gramm Stuhl weisen auf eine normale exokrine Pankreasfunktion und Werte kleiner 200 μg Elastase/pro Gramm Stuhl weisen auf eine exokrine Prankreasinsuffizienz hin. Bei einer akuten Pankreatitis wird in der akuten Entzündungsphase Elastase-1 in das Serum abgegeben, so dass eine Quantifizierung der Elastase im Serum die Diagnose oder den Ausschluss dieser Krankheit er- laubt . Eine hohe Konzentration an Elastase-1 im Serum deutet daher auf eine Pankreatitis hin.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der dazugehörigen Figuren näher erläutert.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 . ein Histogramm zur SLPI-Konzentration im Stuhl, Figur 2 ein Histogramm zur Elastase-1-Konzentra- tion im Stuhl und '
Figur 3 und 4 jeweils ein Histogramm zur SLPI- Konzentration im Serum.
Beispiel 1
Nachweis von SLPI im Stuhl von Patienten mit chronischer Pankreatitis
Von 42 Patienten ohne chronische Pankreatitis, 6 Patienten mit Pankreaskarzinom und 19 Patienten mit chronischer Pankreatitis wurden jeweils 100 mg Stuhl gewonnen, abgewogen und mit Extraktions- Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,2, mit Detergenz und Natriumazid) extrahiert und verdünnt .
Die Extraktion wird durchgeführt, indem die Stuhlprobensuspension bei Raumtemperatur mehrfach kräftig mit einem Reagenzglasschüttelgerät gemixt wird. Die Stühle müssen gut homogenisiert sein, um eine vollständige Extraktion zu gewährleisten. Nach min- destens fünf Minuten Extraktion wird noch einmal abschließend gemixt. Nach Absetzen der Partikel werden die Stuhlprobenextrakte wie folgt verdünnt.
Die Verdünnung der Probenextrakte erfolgte zur Messung von SLPI in einer Verdünnung von 1:100 und zur vergleichenden Messung von Elastase-1 mit einer Verdünnung von 1:500.
Die - SLPI-Konzentrationen im Stuhl wurden mittels eines SLPI-ELISAs (Quantikine®, Kat . Nr. DP 100, 6/99) der Firma R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Deutschland) bestimmt.
Dieser ELISA setzt eine 96 Vertiefungen umfassende Polystyrolmikrotiterplatte ein, die mit monoclona- len gegen menschliches SLPI gerichteten Antikörper aus der Maus beschichtet ist. Nach Pipettieren des Extraktes in die Vertiefungen wird SLPI durch den immobilisierten monoclonaler. Antikörper gebunden. Nach Abwaschen ungebundener Substanzen wird ein mit einem Enzym verbundener polyclonaler Antikörper, der spezifisch für menschliches SLPI ist, in die Vertiefungen gegeben (polyclonaler Antikörper gegen menschliches SLPI, verbunden mit Meerrettich- Peroxidase) . Nach Abwaschen ungebundener Antikör- per-Enzymreagenzien wird eine Substratlösung in die Vertiefungen gegeben und die Farbentwicklung als Maß für gebundenes SLPI gemessen.'
Die Konzentration an pankreatitischer Elastase-1 wurde mittels eines Elastase-1-ELISAs der Firma ScheBo-Tech® (Giessen, Deutschland, Kat . Nr. 07, April 2000, EP 0 547 059 Bl) bestimmt.
Es ergaben sich folgende in den Figuren 1 und 2 dargestellte Resultate:
Die Figur 1 zeigt die SLPI-Konzentrationen im Stuhl der Patienten (SLPI in Picogramm pro Gramm Stuhl) ,' aufgetragen für die Patientengruppe ohne chronische Pankreatitis, die Patientengruppe mit Pankreaskar- .zino und die Patientengruppe mit chronischer Pankreatitis. Es zeigt sich deutlich, dass die Mit- glieder der Kontrollgruppe kein beziehungsweise nur sehr wenig SLPI im Stuhl haben, während die beiden Patientengruppen mit chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom erheblich erhöhte SLPI-Konzentrationen im Stuhl aufweisen.
Die Figur 2 zeigt die an den gleichen Patientengruppen durchgeführten Konzentrationsmessungen von Elastase-1. Die gesunde Kontrollgruppe weist einen deutlich über 200 μg/g Stuhl liegenden Elastasege- halt auf, während die beiden Patientengruppen mit chronischer Pankreatitis und Pankreaskarzinom signifikant reduzierte Elastase-1-Konzentrationen im Stuhl aufweisen.
Beispiel 2
Beispiel 2a
Nachweis von SLPI im Serum von Patienten mit beziehungsweise ohne eine Magenerkrankung.
Von 17 Patienten mit normalem Magenbefund (oB) und
33 Patienten mit einem Magen- oder Dünndarmgeschwür
(Ulcus ventriculi oder Ulcus duodeni) wurde jeweils 5 ml Blut gewonnen und durch Zentrifugieren bei
3000 rpm, RT, 10 Minuten Serum gewonnen.
Die Verdünnung der Serumproben erfolgte zur Messung von SLPI in einer Verdünnung von 1:100.
Die SLPI-Konzentrationen im Serum wurden mittels SLPI-ELISAs (Quantikine®, Kat . Nr. DP 100, 6/99 ) der Firma R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Deutschland) bestimmt. Der ELISA wurde- wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Figur 3 zeigt die SLPI-Konzentration in ng/ml in der Kontrollgruppe und der Patienten.
Resultate :
Die Patientengruppe zeigte im Vergleich zur Kon- trollgruppe signifikant höhere SLPI-Serumkonzen- trationen.
Beispiel 2b
Von 17 Patienten mit normalem Magenbefund (Kontrollen) , 16 Patienten mit chronischer Gastritis und 18 Patienten mit Geschwürsleiden wurde jeweils 5 ml Blut gewonnen und durch Zentrifugieren bei 3000 rpm, RT, 10 Min. Serum gewonnen.
Die Verdünnung der Serumproben erfolgte zur Messung von SLPI in einer Verdünnung 1:100.
Die SLPI-Konzentrationen im Serum wurden mittels SLPI-ELISAs (Quantkine®, Kat . Nr. DP 100, 6/99) der Firma R&D Systems (R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Deutschland) bestimmt.
Der ELISA wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Sowohl Patienten mit einer chronischen Gastritis als auch Patienten mit Geschwürsleiden (Ulcus ventriculi oder Ulcus duodeni) hatten eine signifikant erhöhte SLPI-Konzentration im Serum.
• Die Figur 4 zeigt die SLPI-Konzentrationen in ng/ml im Serum von Patienten mit normalem Magenbefund, Patienten mit chronischer Gastritis und Patienten mit Geschwürsleiden (Ulcus) . Die Figur zeigt deutlich, dass die gesunde Kontrollgruppe eine erheblich geringere SLPI-Konzentration im Serum aufweist als sowohl die Patientengruppe mit chronischer Gastritis als auch die mit Ulcus-Leiden.
Resultate :
SLPI-Serumkonzentrationen sind auch als Marker für gastrointestinale Läsionen geeignet.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer Krankheit eines menschlichen oder tierischen Körpers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom, chronischer Pankreatitis, gastrischer Läsion und entzündlicher Darmerkrankung, wobei Serum oder Stuhl des Körpers gewonnen und in diesem vorhandenes SLPI (sekretorischer Leukocyten-Protease-Inhibitor) , ein Fragment oder ein Komplex davon durch Inkontaktbringen mit immunologischen Mitteln nachgewiesen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Stuhl vor Inkontaktbringen mit den immunologischen Mitteln homogenisiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die immunologischen Mittel Antikörper, insbesondere markierte Antikörper, gegen SLPI, Fragmente oder Kom- plexe davon sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die SLPI- Antikörperreaktion mittels eines ELISA-Tests nachgewiesen wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei die gastrische Läsion auf eine Gastritis oder einen Ulcus zurückzuführen ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die entzündliche Darmerkrankung Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei im Serum oder Stuhl des Körpers neben der SLPI-Antikörperreaktion auch die Elastase 1- Konzentration nachgewiesen wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Antikörper monoclonale Antikörper sind.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Komplex ein SLPI-Elastase-1-Komplex ist .
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprü- ehe, wobei das Fragment von SLPI der N-terminale
Bereich von SLPI mit den Aminosäureresten 1 bis 54 ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Fragment von SLPI der C-terminale Teil von SLPI mit den Aminosäureresten 55 bis 107 ist.
12. Verwendung von gegen SLPI-Frag enten oder Komplexen davon gerichteten Antikörpern zum Nachweis einer Krankheit eines menschlichen oder tierischen Körpers in Stuhl oder Serum des menschlichen oder tierischen Körpers, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pankreaskarzinom, chronischer Pankreatitis, gastrischer Läsion und entzündlicher 'Darmerkrankung.
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