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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, einen Immunoassay sowie
ein Kit zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und
endothelialen Erkrankungen.
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Cardiovasculäre Schäden sind
häufige
klinische Krankheiten, die zu verschiedenen Syndromen beitragen
oder, speziell bei älteren
Personen, dafür verantwortlich
sind, wie z. B. für
Arteriosklerose, Nierenversagen u. dgl. Es gibt einige Marker, die
in der Lage sind, die Diagnose von solchen Zuständen zu erleichtern. Es ist
verständlich,
dass einfache Screening-Verfahren, die Risikopersonen identifizieren
und eine rasche Diagnose erlauben, hilfreich für ein zeitgerechtes Einschreiten
und Verhindern des Fortschreitens der Krankheiten sind. Es ist daher
wünschenswert,
solche Risikopersonen schon zu identifizieren, bevor sich die Krankheit
ausgebildet hat, um so ein zeitgerechtes Einschreiten der Medizin
zu ermöglichen.
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Derzeit
gibt es wenige Methoden, die die Wahrscheinlichkeit von cardiovasculären Erkrankheiten
vorherzusagen vermögen.
Häufig
beobachtete Probleme mit derartigen Verfahren sind die ungenügende Genauigkeit
und Empfindlichkeit oder das Erfordernis nach Ausarbeitung von Untersuchungen oder
einer teuren Ausrüstung,
für die
ein speziell trainiertes Personal erforderlich ist. Es besteht daher
der Bedarf für
ein einfaches Verfahren einer genauen und empfindlichen Methode,
die nicht nur diagnostiziert, sondern auch die Wahrscheinlichkeit
einer cardiovasculären
Erkrankung vorhersagen kann, u. zw. entweder als chronischer Zustand
oder als akuter Zustand, wie beispielsweise septische Komplikationen. Personen
mit besonderem Risiko vor dem Auftreten größerer Schäden identifizieren, erfassen
und behandeln zu können,
würde große klinische
Bedeutung haben. Derzeit existierende Behandlungen sind teuer und
auch alternative Erfindungen sind kostenaufwendig, so dass es nicht
kosteneffektiv ist, jedermann ohne Indikation in der Absicht zu
behandeln, das Entstehen einer Krankheit zu verhindern.
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C-Typ
natriuretisches Peptid (CNP) ist ein Polypeptid, das ursprünglich aus
Schweinehirn durch T. Sudoh und seine Mitarbeiter (Biochem-Biophys. Res.
Commun., 168: 863–879,
1990) isoliert wurde. Nach Klonieren und Durchführen der Sequenzanalyse der
cDNA, die für
das Peptid kodiert, wurde gezeigt, dass menschliches CNP im menschlichen
Vascularsystem durch Endothelialzellen erzeugt wird (S. Suga et
al, J. Clin Invest 1992: 90: 1145–9). Es wird angenommen, dass
menschliches C-Typ natriuretisches Peptid als ein Precurser, der
aus 126 Aminosäuren
besteht, produziert wird. Von den ersten 23 Resten wird angenommen,
dass sie als Signalpeptid wirken, wobei diese ersten 23 Reste abgeschnitten werden,
um proCNP zu erhalten (proCNP oder CNP (1–103)). ProCNP wird vor oder
während
der Sekretion gespalten, um die biologisch aktive Form von CNP,
CNP-22 zu bilden. Eine am N-Terminus verlängerte Form, CNP 53, ist die
hauptsächlich
im Schweinehirn (Minamino et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.
1990, 170: 973–9)
vorkommende molekulare Form von CNP. CNP Immunreaktivität wurde in
menschlichen Vascularendothelzellen (Singo et al Am. J. Physiol
199; 263: H1318–21)
in Plasma und in Nieren (Mattingly et al. Kidney Int. 1994; 46:
744–7) gefunden.
Die Plasmakonzentrationen von proCNP (1–80) und proCNP (1–50), das
sind die Peptide, die aus den ersten 80 bzw. 50 Aminosäuren, gerechnet vom
N-Terminus von proCNP bestehen, sind in Patienten, die an endothelialen
Erkrankungen (z. B. Arteriosklerose, Naruka T. et al, Circulation
1996; 94: 3103–8)
und Nierenversagen (Igaki T. et al, Kidney Int. Suppo. 1996, 55:
144–7)
leiden, erhöht.
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Gen
und Struktur des menschlichen C-Typ-natriuretischen Peptids (CNP)
sind bekannt (Tawaragi Y. et al. Biochemical and Biophysical Research
Communications, 1991, 175, 2, 645–651). Auch bekannt sind Antikörperzusammensetzungen zur
Bestimmung von CNP, bzw. proCNP, sowie Verfahren für deren
Herstellung (Hama N et al. J. Endocrinol. 1994, 141, 3, 473–479).
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Es
gibt im Stand der Technik keine Hinweise auf einen Zusammenhang
zwischen der Konzentration von proCNP (1–80) in Körperflüssigkeiten und cardiovasculären oder
endothelialen Erkrankungen.
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Überlegung, dass die N-terminalen
Fragmente von menschlichem proCNP (1–103) (SEQ ID NO: 1), ähnlich wie
proCNP (1–80)
und proCNP (1–50),
aufgrund ihrer gegenüber
CNP-Hormonen (CNP-22 bzw. CNP 53) langen Halbwertszeit als gute
diagnostische Indikatoren oder Prognosemittel für alle Fälle von endothelialen Schäden oder
renalen Krankheiten, z. B. Risiko für Arteriosklerose, septischen
Schock oder chronischer Nierendisfunktion dienen können.
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Menschliches
proCNP (1–80)
(SEQ ID NO: 1) und proCNP (1–50)
kann daher als Basis entweder für
ein Diagnose- oder für
einen Prognosetest für
die vorgenannten Zustände,
und auch in erster Linie für die
Biosynthese von Antikörpern,
zum Gebrauch in solchen Tests dienen, weiters aber auch als Antigen für einen
kompetitiven Bindungsimmunoassay. PrOCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) oder ein
immunogenes Fragment daraus kann vorteilhafterweise an ein immunogenes
Protein oder Peptid, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist,
konjugiert werden.
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Dieser
Stand der Technik stellt sich als Problem dar. Es ist Aufgabe der
Erfindung, ein Verfahren und Mittel zur Diagnose und/oder Vorhersage
von cardiovasculären
und endothelialen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe
wird gelöst durch
das Verfahren nach Anspruch 1, sowie den Immunoassay nach Anspruch
8 und den Kit nach Anspruch 12.
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Weiter
bereitgestellt ist eine Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an humanes
proCNP (1–80)
(SEQ ID NO: 1) bindet, in einer Antikörperzusammensetzung zur Diagnose
und/oder Vorhersage von cardiovasculären und endothelialen Erkrankungen
nach Anspruch 2.
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Somit
kann ein Indikatorpolypeptid zur Diagnose und/oder Vorhersage von
cardiovasculären und/oder
endothelialen Erkrankungen dienen, wobei das Polypeptid das N-terminale
Fragment proCNP (1–80)
(SEQ ID NO: 1) des C-Typ natriuretischen Prekursers Aminosäure (1–126) (Swiss
Prot. P23582) ist.
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Derartige
Polypeptide können
zur Erzielung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper eingesetzt
werden, die spezifisch auf CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) sind.
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Ein
Aspekt der Erfindung ist es, ein Immunoassay-Verfahren für menschliches
CNP (1–80)
(SEQ ID NO: 1) zur Verfügung
zu stellen, wobei der primäre Bindungspartner
ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist. Immunoassays sind
natürlich
im Stand der Technik bekannt, wie z. B. RIA, EIA, Fluoreszenzimmunoassay
(FIA) oder Trockenchemieteststreifen-Immunoassays. So ein Immunoassay
verwendet grundsätzlich
einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in immobilisierter Form,
z. B. an einer Mikrotiterplatte, an Membranen oder Partikel, um
die Ziel-Verbindung
proCNP (1–80)
zu isolieren. In einem Sandwichassay kann das gebundene Antigen mittels
eines zusätzlichen
löslichen
Antikörpers,
der ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein kann, nachgewiesen
werden. Dieser Antikörper
kann entweder eine Markierung tragen oder, noch einfacher, selbst
später
durch Reaktion mit einem zweiten Antikörper, der eine Markierung trägt, markiert
werden. Wenn dabei also der erste Antikörper in einem Schaf gezüchtet wurde,
kann der zweite Antikörper ein
Antischafantikörper
sein.
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Geeignete
Markierungen umfassen Radionuklide, fluoreszierende Substanzen,
z. B. Europium basierte Hybridverfahren, Farbstoffe oder farbige Partikel,
wie z. B. kolloidales Gold. Alternativ kann ein Bindungsassay verwendet
werden, bei welchem eine bekannte Menge von markiertem menschlichem proCNP
(1–80)
(SEQ. ID NO: 1) oder ein antigenes Fragment davon einer Analytlösung zugesetzt
und mit einer begrenzten Menge von immobilisiertem Antikörper in
Kontakt gebracht wird, wodurch die Menge des markierten Antigens,
welches immobilisiert wird, umgekehrt proportional der Menge des
im Analyt vorhandenen Zielantigens ist.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Immunoassay-Kit,
welcher folgendes enthält:
- (a) einen Antikörper, der spezifisch an humanes pro-CNP
(1–80)
(SEQ ID NO: 1) bindet, in immobilisierter Form; und
- (b) mindestens eine weitere Zusammensetzung aus der Gruppe:
- (b1) markierte Probe von humanem pro-CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) oder einem
markierten antigenen Fragment davon;
- (b2) Antikörper,
der spezifisch an humanes pro-CNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) bindet;
und
- (b3) markierter zweiter Antikörper, der an einen Antikörper, spezifisch
bindend an humanes pro-CNP (1–80)
(SEQ ID NO: 1), bindet.
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Ein
solcher Immunoassay und Testsatz kann dazu verwendet werden, verwandte
biologische Systeme zu untersuchen, sowie auch Diagnosen oder Prognosen
von Zuständen
zu stellen, in welchen der Titer von menschlichem proCNP (1–80) (SEQ
ID NO: 1) in Körperflüssigkeiten
ein diagnostischer oder präventiver
Indikator ist.
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Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren
zur Diagnose und/oder Vorhersage von cardiovasculären und
endothelialen Erkrankungen, wobei das N-terminale Fragment pro-CNP
(1–80)
(SEQ ID NO: 1) des C-Typ-natriuretischen
Propeptids 1–126
(Swiss-Prot: P23582) als Indikatorpeptid in vitro in der Körperflüssigkeit
eines Patienten nachgewiesen wird.
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Resultate
von unter Dialysebehandlung stehenden Patienten zeigen eindeutig,
dass das proCNP-Niveau deutlich bei Patienten erhöht ist,
welche an chronischer Nierenfehlfunktion leiden. Dies wird auch
noch dadurch gestützt,
dass proCNP in sogenannten Hemofiltraten von Dialysepatienten aufgefunden
wird (siehe auch Schulz-Knappe et al J. Chromatogr. A776 (1997)
125–132),
wie dies in 3 illustriert ist.
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Folgende
Konzentrationen wurden gefunden:
CNP3: 1,7 pmol/l
CNP1:
12,4 pmol/l Hemofiltrat.
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Hemofiltrate
wurden deshalb verwendet, weil sie nahezu unbeschränkt vorliegen
und überdies
die Peptidhormonkonzentrationen jener von menschlichem Plasma sehr ähnlich sind
(Schulz-Knappe et al Eur. J. Med. Res. (1995/96) 1: 223–236).
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Demgemäß können die
Immunoassays zur Beobachtung von chronischer Nierenfehlfunktion
eingesetzt werden.
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Obwohl
derzeit wenig dokumentiert, kann humanes proCNP (1–80) (SEQ
ID NO: 1) auch als diagnostisches Werkzeug zur Risikoabwägung für die Entwicklung
von Arteriosklerose eingesetzt werden (Naruka T. et al, Circulation
1996, 94: 3103–8).
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Die
Körperflüssigkeit,
an welcher der Immunoassay ausgeführt wird, kann jegliche Körperflüssigkeit
sein, in welcher menschliches proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) vorhanden
ist; es wird aber üblicherweise
Plasma-Serum oder Harn verwendet werden. In einigen Fällen kann
es angezeigt sein, die Peptide zu extrahieren oder die Probe vor
der Durchführung des
Assays anderweitig zu behandeln.
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Das
menschliche proCNP (1–80)
(SEQ ID. NO: 1) Peptid oder ein Antigen oder immunogenes Fragment
davon kann mit in der Wissenschaft gut bekannten Techniken durch
Synthese aus den sie bildenden Aminosäuren zusammengestellt oder
durch das Zusammensetzen von vorsynthetisierten Aminosäureblöcken gebildet
werden. Rekombinante Expression von Peptiden ist natürlich eine
andere, sehr passende Methode zur Erzeugung des Antigens für die Immunisierung.
Wo markiertes Material notwendig ist, kann die Markierung durch
Standardtechniken eingebracht werden.
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Zum
Zweck der Herstellung von Antikörpern kann
das menschliche proCNP (1–80)
(SEQ. ID NO: 1) oder ein antigenes Fragment davon an ein immunogenes
Protein oder Peptide, wie es Stand der Technik ist, konjugiert werden.
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Die
Antikörper
können
durch Injizierung von proCNP-Antigen gemäß der Erfindung in ein Wirtstier hergestellt
werden, u. zw. vorteilhafterweise durch ein Konjugat mit einem immunogenen
Protein wie vorstehend beschrieben. Geeignete Wirtstiere sind z. B.
ein Schaf, um entweder ein Serum, welches polyklonale Antikörper enthält, oder
z. B. eine Maus oder ein Kaninchen, um Milzzellen für die Umwandlung
zu Hybridomas oder immortalisierten Zelllinien zu gewinnen und damit
monoklonale Antikörper
herzustellen.
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Beispiel 1: Produktion von polyklonalen
oder monoklonalen Antikörpern
gegen CNP (1–80)
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Konjugation:
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3
synthetisierte Fragmente aus proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1), proCNP
(1–19),
proCNP (29–50)
und proCNP (51–79)
wurden durch die Fa. Pichem GmbH, in Graz (Österreich) synthetisiert und an
ein passendes Trägerprotein
konjugiert (z. B. Thyroglobulin).
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Immunisierung:
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Schafe wurden verwendet. Die Schafe erhielten 2 mg des entsprechenden
Antigens, das mit nicht ulcerativem Freund'schem Adjuvans (Guildhay, GB) und BOG
(bacillus Calmette Guerlin) gemischt ist.
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Screening:
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Mikrotiterplatten
wurden mit synthetischen proCNP Peptidsequenzen (1 μg/ml) beschichtet.
Probeblut wurde in Phosphatpuffer mit 3%igem BSA 1: 1000/10000/100000
verdünnt,
und die Bindung eines Antikörpers
wurde durch Zusatz von Antischaf IgG-Peroxidase-Konjugat, gefolgt
von Substratzugabe (TMB) nachgewiesen.
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Monoklonale
Antikörper
können
analog hergestellt werden, wobei Mäuse oder Kaninchen als Wirtstiere
verwendet werden und Hybridomas nach im Stand der Technik bekannten
Verfahren hergestellt werden.
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Beispiel 2: Immunoassay für proCNP
(1–80)
(SEQ ID NO: 1) oder immunreaktive Fragmente davon.
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Die
Antikörper
können
in verschiedenen Arten von Immunoassay für proCNP (1–80) (SEQ ID NO: 1) oder immunreaktiven
Fragmenten davon verwendet werden. Diese sind u. a.
- (a) Radioimniunoassay (RIA);
- (b) Enzymimmunoassay (EIA);
- (c) Enzym-gebundenes Immunosorbentassay (ELISA) einschließlich "Sandwich"-Typ Methoden, die
auf Mikrotiterplatten oder Membranen ausgeführt werden;
- (d) verschiedene trockenchemische Teststreifenimmunoassays.
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Nachfolgend
ist ein Beispiel basierend auf einem kompetitiven Enzymimmunoassay
wiedergegeben. Mikrotiterplatten werden mit Schafantikörpern vorbeschichtet.
Dann wird der spezifische proCNP Antikörper zugesetzt und für drei bis
fünf Stunden oder über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ dazu können Platten, die mit proCNP
vorbeschichtet sind und mit Karion F (Merk, Nr. 2993) stabilisiert
sind, verwendet werden.
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200 μl der Probe
oder des Standards zusammen mit 50 μl eines Tracers (Biotin-markiertes proCNP
(1–80)
oder ein Fragment davon) wird in die Vertiefungen eingegeben und
3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden
gewaschen und mit 200 μl
von Streptavidin-Peroxidase von Southern Biotechnology (SB-7100-05)
inkubiert. Nach einem letzten Waschschritt und Zusatz von Substrat
(Tetramethylenbenzidin, TMB) bildet sich eine Farbe aus, die umgekehrt
proportional zu der proCNP-Konzentration der Probe ist und in einem
Mikrotiterplattenphotometer gemessen wird. Ein Beispiel einer Standardkurve
für proCNP
(1–19)
und proCNP (51–79),
die mit dieser Art von Assay erhalten wurden, ist in 2 wiedergegeben.
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