DE602005000636T2

DE602005000636T2 - Verfahren zur Auswertung des Knorpelgewebeabbau

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Publication number: DE602005000636T2
Application number: DE602005000636T
Authority: DE
Inventors: Patrick Garnero; Nadine Charni
Original assignee: SYNARC
Current assignee: SYNARC
Priority date: 2004-01-14
Filing date: 2005-01-14
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2025-01-15
Also published as: ATE356358T1; EP1555531A1; EP1555531B1; FR2865034A1; DE602005000636D1; DK1555531T3

Description

Das technische Gebiet der Erfindung ist jenes der biologischen Marker des Abbaus der Knorpelgewebe. Die vorliegende Erfindung betrifft spezieller Verfahren zur Auswertung des Abbaus der Knorpelgewebe und deren Einsatz, insbesondere bei diagnostischen Verfahren eines Verfolgens und einer Bestimmung einer Prognose von Pathologien der Knorpelgewebe.
Die Pathologien der Knorpelgewebe drücken sich insbesondere durch einen Abbau der Knorpelgewebe aus. Das Typ-II-Kollagen ist der Hauptproteinbestandteil der Knorpelgewebe und ist spezifisch für diese Gewebe. Das Typ-II-Kollagen wird synthetisiert durch Chondrocyten in Form von Prokollagen, das N- und C-terminale Propeptide beiderseits des Kollagenkörpers umfaßt. Bei der Spaltung der Propeptide, die natürlich in vivo bei der Reifung des Kollagens geschieht, hat das durch die Chondrocyten sekretierte reife Kollagen als Struktur einen Tripelhelixbereich, der drei α₁-Ketten enthält, welche N- und C-terminalseitig durch drei Telopeptidketten begrenzt sind, die nicht in Tripelhelixform sind. Diese Telopeptide haben eine intermolekulare Verbrückung unter den Kollagenfibrillen zur Funktion.
Der Abbau des Typ-II-Kollagens wird realisiert durch Kollagenasen (MMP1, MMP8 und MMP13) (Billinghurst et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. J.Clin. Invest. 1997, 99: 1534-45). Eine charakteristische Schnittstelle durch die Kollagenasen liegt im Tripelhelixbereich des Typ-II-Kollagens zwischen den Resten 775 und 776, der zwei Fragmente von 3/4 und 1/4 der Länge des intakten Kollagens erzeugt. Diese beiden Fragmente haben ein Molekulargewicht von 75 und 25 kDa (für eine Kette). Antikörper, die den C-Terminus des Fragments Col2-3/4 und den N-Terminus des Fragments Col2-1/4 erkennen, sind entwickelt worden (Hollander et al. Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage detected by a new immunoassay. J.Clin. Invest. 1994, 93: 1722-32). Es ist gezeigt worden, daß das Epitop des Col2-3/4 und nicht das Epitop des Col2-1/4 sich im Kreislauf wiederfanden (Croucher and Hollander. Differential detection of type II collagen N-terminal and C-terminal denaturation epitopes in degrading cartilage. 1999. Mol. Pathol. 52, 323-31). Immunodosierungen zur Detektion des Epitops des Col2-3/4 sind optimiert worden (US-Patent 6132976). Kleinere Fragmente des Typ-II-Kollagens, erzeugt durch aufeinanderfolgende Proteolysen, können leichter in biologischen Flüssigkeiten filtriert werden, spezieller bei der Nierenfiltration.
Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung ist es, Auswertungsverfahren des Abbaus des Typ-II-Kollagens bereitzustellen, die neue Marker seines Abbaus verwenden, und deren Einsatz für die Diagnostik einer Pathologie der Knorpelgewebe, die Nachverfolgung der Entwicklung einer solchen Pathologie, die präsymptomatische Prognose einer solchen Pathologie, die Auswertung der Effizienz einer verabreichten therapeutischen Behandlung zur Bekämpfung einer Pathologie der Knorpelgewebe, die Einschätzung der Toxizität gegenüber Knorpelgeweben einer therapeutischen Behandlung und die Vorbestimmung der Entwicklung einer Pathologie der Knorpelgewebe bei einem Individuum, das von einer solchen Krankheit betroffen ist.
In diesem Zusammenhang haben die Erfinder neue spezifische biologische Marker des Abbaus des Typ-II-Kollagens gezeigt. Diese Marker stammen aus dem Abbau des 3/4-Teils, der im Tripelhelixbereich der α₁-Kette des Typ-II-Kollagens angeordnet ist.
Die Erfinder haben das Interesse der Dosierung solcher Marker in den physiologischen Flüssigkeiten und insbesondere in den Urinen für die Diagnose und die Nachverfolgung insbesondere von Pathologien der Knorpelgewebe gezeigt.
Die vorliegende Erfindung hat insbesondere zur Aufgabe, ein Verfahren zur Einschätzung des Abbaus der Knorpelgewebe eines Individuums aus der in vitro Detektion in einer biologischen Probe, die von dem Individuum kommt, des Gehalts von wenigstens einem Marker, der spezifisch ist für den Abbau der Knorpelgewebe, wobei der (die) spezifische(n) detektierte(n) Marker ein Fragment eines Abbaus von Typ-II-Kollagen ist (sind), die aus dem Abbau der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 der Kette α₁ des Typ-II-Kollagens stammen, welche in dem Tripelhelixbereich angeordnet ist, wobei diese Abbaufragmente wenigstens vier aufeinanderfolgende Aminosäuren umfassen, die in dem Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr. 3 vorliegen, das gegebenenfalls nach der Übersetzung post-translational modifiziert ist und in welchem das 4-Hydroxyprolin gegebenenfalls ersetzt ist durch ein Prolin oder ein 3-Hydroxyprolin.
Die verschiedenen nachfolgend angegebenen Definitionen helfen, die Beschreibung der Erfindung zu verstehen.
Unter spezifischem Marker des Abbaus von Typ-II-Kollagen versteht man ein Proteinfragment aus dem Abbau des Typ-II-Kollagens und dessen Detektion es erlaubt, direkt mit dem Abbauniveau des Typ-II-Kollagens korreliert zu werden.
Unter Pathologien der Knorpelgewebe versteht man Funktionsstörungen, die mit katabolischen Prozessen der Knorpelgewebe, der Wachstumsknorpel und der Bandscheiben verbunden sind. Die mit katabolischen Funktionsstörungen der Knorpelgewebe verbundenen Funktionsstörungen sind zum Beispiel verschiedene Typen von Arthritis wie rheumatoide Polyarthritis, Arthrose, psoriasische Arthritis, Gicht, Yersinien-induzierte Arthritis, Pyrophosphat-Arthritis, septische Arthritis, oder Funktionsstörungen, die verbunden sind mit den Bandscheiben wie degenerative Krankheiten der Bandscheiben oder die Spondarthritiden. Die Funktionsstörungen der Wachstumsknorpel umfassen insbesondere die Kashin-Beck-Krankheit Akromegalie und Nanismus.
Unter Individuum versteht man ein Tier oder vorzugsweise einen Menschen, der geneigt ist, von einer Pathologie der Knorpelgewebe betroffen zu sein, von einer Pathologie der Knorpelgewebe betroffen zu sein, die unter Medikation steht oder gewesen ist, um eine Pathologie zu behandeln, und insbesondere eine Pathologie der Knorpelgewebe.
Unter biologischer Probe versteht man ein Körperflüssigkeit oder ein Gewebefragment, das einem Individuum entnommen ist. Die biologische Probe kann gewählt werden unter Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Schweiß, Lymphflüssigkeit, Tränen, Synovialflüssigkeit, Geweben, Zellen, Gewebe- oder Zellkulturüberständen und vorzugsweise Urin und Serum.
Unter Zerstörungsstadium einer Pathologie der Knorpelgewebe versteht man ein Stadium der Pathologie, bei welchem der Abbau der Knorpelgewebe durch Radiographie, Magnetresonanz, Kernmagnetresonanz, Ultraschall, Scanner, Athroskopie, Gewebebiopsie festgestellt werden kann.
Die Erfindung zeigt, daß die Detektion in einer biologischen Probe eines Individuums von bestimmten Abbaufragmenten des Typ-II-Kollagens spezifische Informationen über den Abbauzustand der Knorpelgewebe gibt. Die Erfinder sind insbesondere interessiert an Abbaufragmenten des Teils des Typ-II-Kollagens mit einer SEQ ID Nr.2-Sequenz. Spezifischer sind die Erfinder interessiert an Abbaufragmenten, die wenigstens vier aufeinanderfolgende Aminosäuren umfassen, die in dem Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr.3 vorliegen und in denen 4-Hydroxyprolin gegebenenfalls ersetzt ist durch ein Prolin oder ein 3-Hydroxyprolin. Die Erfindung verwendet insbesondere die Detektion der Abbaufragmente, die die SEQ ID Nr.3-Sequenz vollständig umfassen oder spezieller das Abbaufragment mit SEQ ID Nr.3-Sequenz, genannt Helix-II. Die Abbaufragmente, die die SEQ ID Nr.3-Sequenz umfassen, können definiert werden durch die folgende allgemeine Formel: (Xaa)m-ERGETGP-Hyp-GTS-(Xaa)n, in der Hyp das 4-Hydroxyprolin ist, m und n unabhängig ganze Zahlen zwischen 1 und 10 darstellen und Xaa eine Aminosäure oder ein Aminosäurederivat aus dem Abbau der SEQ ID Nr.2-Sequenz ist. Nach Übersetzung kann das Typ-II-Kollagen Modifikationen bei seiner Reifung unterliegen. Die Aminosäuren der SEQ ID Nr.3 können zum Beispiel post-translationalen Modifikationen unterliegen, wie unter anderem die Citrullinierung (Arginin wird Citrullin), die Hydroxylierung (Prolin wird Hydroxyprolin), die Chlorierung (Arginin oder Lysin oder Tyrosin werden Chlorarginin, Chlorlysin und Chlortyrosin), die Nitrierung (Tyrosin wird Nitrotyrosin), die Glykierung (Oxydation der Lysine durch Knochen)...
In diesem Fall sieht die Erfindung vor, die Abbaufragmente zu detektieren, die wenigstens vier aufeinanderfolgende Aminosäuren des Helix-II-Peptids umfassen, aber wovon eine oder mehrere Aminosäuren post-translational modifiziert worden sind.
Vorteilhaft zielt die Erfindung darauf ab, Abbaufragmente des Typ-II-Kollagens zu detektieren, deren C-Terminus den 4C-terminalen Aminosäuren des Helix-II-Peptids entsprechen, nämlich Hyp-GTS, gegebenenfalls post-translational modifiziert, wobei das C-terminale Serin vorzugsweise nicht post-translational modifiziert ist. Gemäß einer anderen besonderen Ausführungsform zielt die Erfindung darauf ab, Abbaufragmente der SEQ ID Nr. 2 des Typ-II-Kollagens zu detektieren, welche wenigstens 5 aufeinander folgende Aminosäuren des Helix-II-Peptids mit SEQ ID Nr. 3 umfassen, von denen gegebenenfalls eine oder mehrere Aminosäuren post- translational modifiziert worden ist (sind) und in welchen das 4-Hydroxyprolin gegebenenfalls ersetzt ist durch ein 3-Hydroxyprolin oder ein Prolin.
Die Detektionsverfahren der Gegenwart eines Markers, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können quantitative oder qualitative sein. Insbesondere kann die Detektion durchgeführt werden durch eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie-Technik (HPLC), durch UV-Spektroskopie, durch elektrochemische Detektion oder durch proteochemische Analyse oder durch "Microarray". Vorteilhafterweise besteht die Detektion darin, die biologische Probe mit Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Analyten zu kontaktieren, die gegen den zu detektierenden Marker gerichtet sind und dann deren Bindung mit dem Marker durch eine immunologische Technik zu detektieren, vorzugsweise gewählt unter der ELISA-Technik, immunoenzymatische Techniken, Immunofluoreszenztechniken, radioimmunologischen Techniken, chemoimmunologischen Techniken und Proteomanalysetechniken. Diese verschiedenen Detektionstechniken sind dem Fachmann wohlbekannt. Für die immunologischen Techniken wird man sich auf Diamandis et Cristopoulos, Immunoassay, Academic Press, San Diego 1996, insbesondere die Seiten 579 ff. beziehen können. Für die Proteomanalysetechniken wird man sich insbesondere beziehen können auf Urbanowska et al. Development of protein microarray technology to monitor biomarkers of rheumatoid arthritis disease. Cell Biol. Toxicol. 2003 19(3):189-202 und auf Glokler and Angenendt. Protein and antibody microarray technology. Journal of chromatography B, 2003 797(1-2).229-240.
Monoklonale, polyklonale Antikörper oder humanisierte Antikörper umfassen die Fc-, Fab-Fragmente, die chemischen Antikörper oder jedes andere antigen-spezifische Antikörperfragment werden verwendet werden können. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird man für die Detektion der Abbaufragmente Antikörper verwenden können, die an ein Epitop binden, darunter wenigstens vier, vorzugsweise wenigstens fünf Aminosäuren, die zum Abbaufragment gehören, das dem Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr.3-Sequenz entspricht oder zum Helix-II-Peptid, von dem eine oder mehrere Aminosäuren post-translational modifiziert worden sind und vorzugsweise zu einem Epitop, das enthalten ist in der SEQ ID Nr.3-Sequenz, gegebenenfalls post-translational modifiziert. Unter diesem Epitop versteht man den Ort, der auf der Peptidsequenz angeordnet ist, mit welcher der Antikörper binden wird. Ein solches Epitop besteht im allgemeinen aus einer Kette von wenigstens zwei Aminosäuren.
In diesem Zusammenhang hat die vorliegende Erfindung auch Antikörper zur Aufgabe, die ein Epitop binden, das enthalten ist in den Sequenzen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7 oder insbesondere SEQ ID Nr. 9. Die Antikörper, die an ein Epitop binden, das in SEQ ID Nr. 3-Sequenz enthalten ist, sind dennoch bevorzugt. Insbesondere werden vorzugsweise Antikörper verwendet, die sich an ein Epitop binden, dessen C-Terminus besteht aus der Sequenz PGTS oder HypGTS, gegebenenfalls post-translational modifiziert, wobei das C-terminale Serin bevorzugt nicht modifiziert ist. Gemäß einer besonderen Ausführungsform bindet der Antikörper gemäß der Erfindung an ein Epitop mit SEQ ID Nr. 3-Sequenz.
Die Antikörper gemäß der Erfindung können monoklonal sein oder vorzugsweise polyklonal. Die Herstellung dieser Antikörper geschieht gemäß Standardverfahren, die dem Fachmann wohlbekannt sind und insbesondere beschrieben sind durch Harlow und Lane 1988 und Köhler und Milstein 1975 in "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 1975, 256(5517):495-7. Man wird insbesondere zum Beispiel gemäß den klassischen Peptidsynthesen die zu detektierenden Marker bevorzugen, die man an ein "Carrier" genanntes Protein koppeln kann, das vorzugsweise KLH (Keyhole limpet hemocyanine) oder Rinderalbumin oder menschliches Serumalbumin, Ovalbumin, Thyroglobulin oder jedes andere "Carrier"-Protein ist, wie Edestin, Tetanus- oder Choleratoxoid, die Polyaminosäuren wie Poly-D-Lysin-D-Glutaminsäure. Die Kopplung wird über ein Cystein, ein Glutaraldehyd oder ein Carbodiimid beispielsweise durchgeführt werden. Diese gekoppelte Sequenz erlaubt dann die Immunisierung von Maus, Ratte, Kaninchen, Huhn oder jedem anderen Individuum, das die Produktion von Antikörpern erlaubt.
Die Antikörper im Sinne der Erfindung werden mit Spezifitäten qualifiziert werden, da sie die Abbaufragmente des Typ-II-Kollagens erkennen, die wenigstens vier aufeinanderfolgende Aminosäuren enthalten, insbesondere wenigstens fünf, die in der dem Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr. 3-Sequenz vorliegen, aber nicht in intaktem Typ-II-Kollagen.
Die vorliegende Erfindung hat auch Kits zur Dosierung eines Abbaufragments des Typ-II-Kollagens zur Aufgabe, die einen Antikörper wie oben definiert umfassen. Die Kits zur Dosierung kombinieren Reagenzien und Anweisungen, um die Dosierung des Abbaufragments durchführen zu können.
Weiterhin ist im Rahmen der Erfindung das Interesse gezeigt worden, die Marker gemäß der Erfindung in den Urinen zu dosieren, für die Verfolgung, die Diagnose, die Prognose von Pathologien der Knorpelgewebe und insbesondere Arthrose, rheumatoide Polyarthridis und Spondylarthritis. Je mehr die Pathologie daher fortgeschritten ist, desto höher ist der Gehalt detektierter Marker, was zu einer Verstärkung des Abbaus des Typ-II-Kollagens und daher der Knorpelgewebe führt. Je mehr das Risiko einer Knorpelzerstörung der Sehnen erhöht ist, desto mehr ist der Gehalt detektierter Marker erhöht.
Genauer hat die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Aufgabe, um eine Pathologie der Knorpelgewebe bei einem Individuum zu diagnostizieren, das ein Verfahren zur Einschätzung wie oben definiert einsetzt. Vorteilhaft wird der Gehalt detektierter spezifischer Marker quantifiziert und verglichen mit einem charakteristischen Referenzgehalt der Abwesenheit einer Pathologie.
Gemäß einem anderen ihrer Gesichtspunkte hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfolgung der Entwicklung einer Pathologie der Knorpelgewebe eines Individuums, das von einer Pathologie der Knorpelgewebe betroffen ist, zur Aufgabe, welches ein Verfahren zur Einschätzung wie oben definiert einsetzt. Vorteilhaft wird der Gehalt detektierter spezifischer Marker quantifiziert und verglichen mit einem Referenzgehalt, der zum Beispiel einem Gehalt entspricht, der für ein vorbestimmtes Stadium der Pathologie erhalten wird.
Gemäß einem anderen ihrer Gesichtspunkte hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Gegenstand, um in präsymptomatischer Weise eine Pathologie der Knorpelgewebe bei einem Individuum zu prognostizieren, das ein Auswertungsverfahren wie oben definiert einsetzt. Vorteilhaft wird der Gehalt detektierter spezifischer Marker quantifiziert und verglichen mit einem Referenzgehalt, der bei Individuen gleichen Alters und gleichen Geschlechts ohne Pathologie oder bei einem vorbestimmten Stadium der Pathologie etabliert ist.
Gemäß einem ihrer weiteren Gesichtspunkte hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufgabe, um die Entwicklung einer Pathologie der Knorpelgewebe bei einem Individuum vorzubestimmen, das von einer solchen Krankheit betroffen ist, unter Einsatz eines Verfahrens zur Auswertung wie oben definiert. Vorteilhaft wird der Gehalt der detektierten spezifischen Marker quantifiziert und verglichen mit einem Referenzgehalt, der einem Schwellengehalt entspricht, der die Abwesenheit der Pathologie darstellt oder ein vorbestimmtes Stadium der Pathologie darstellt.
Gemäß einem ihrer Gesichtspunkte hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Gegenstand, um die Effizienz eines Medikaments zu bestimmen, das einem Individuum verabreicht wird, um eine Pathologie der Knorpelgewebe zu behandeln, unter Einsatz eines Verfahrens zur Auswertung wie oben definiert. Vorteilhaft wird der Gehalt detektierter spezifischer Marker quantifiziert und verglichen mit einem Referenzgehalt, der vor Behandlungsbeginn erhalten wird oder mit einem Gehalt, der bei gesunden Subjekten erhalten wird.
Gemäß einem anderen ihrer Gesichtspunkte hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aufgabe, um die Toxizität gegenüber Knorpelgeweben von einer Behandlung zu bestimmen, die einem Individuum verabreicht wird, unter Einsatz eines wie oben definierten Verfahrens. Vorteilhaft wird der Gehalt detektierter spezifischer Marker quantifiziert und verglichen mit einem Referenzgehalt, der vor Behandlungsbeginn erhalten wird oder mit einem Gehalt bei gesunden Subjekten.
Gemäß einem anderen ihrer Gesichtspunkte hat die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Gegenstand, um die Effizienz von antiresorptiven Behandlungen, insbesondere Biphosphonat, auf den Knorpelgewebeabbau bei einem Individuum einzuschätzen, das ein Verfahren zum Einzuschätzen wie oben definiert einsetzt.
Die durch die Erfinder erhaltenen Ergebnisse haben auch gezeigt, daß die Marker gemäß der Erfindung spezifisch für den Typ-II-Kollagenabbau waren und daß sie in Korrelation mit jenen waren, die erhalten sind mit einem anderen bekannten Marker mit SEQ ID Nr. 4-Sequenz, entwickelt von Nordic Bioscience A/S, genannt CTX-II oder Cartilaps. Die Detektion der Marker gemäß der Erfindung ermöglicht es darüber hinaus, komplementäre Informationen zu jenen zu erhalten, die mit anderen Markern der Sehnen, insbesondere CTX-II erhalten werden. Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es daher vorteilhaft, in der biologischen Probe des Individuums wenigstens zwei spezifische Marker des Typ-II-Kollagenabbaus zu detektieren. Ein Marker gemäß der Erfindung wird darüber hinaus den SEQ ID Nr. 4-Marker oder jeden anderen Abbau- oder Synthesemarker der Knorpelgewebe, insbesondere der Typ-II-Kollagensynthese detektieren, das heißt der C-terminalen Propeptide (genannt PIICP) oder der N-terminalen Propeptide (Formen IIA oder IIB des Typ-II-Prokollagens, genannt PIIANP und PIIBNP, Garnero et al. Uncoupling of type II collagen synthesis and degradation predicts progression of joint damage in patients with knee osteoarthritis. Arthritis Rheum., 2002 46(10):2613-24). Insbesondere wird man in der biologischen Probe des Individuums gleichzeitig das Niveau von Helix-II und das Niveau von CTX-II mit SEQ ID Nr. 4-Sequenz detektieren.
Die METHODEN und ERGEBNISSE betitelten Teile, die hiernach angegeben sind, in Bezug auf die anliegenden Figuren, veranschaulichen die Erfindung.
1 ist die Standardkurve des ELISA, welcher Helix-II dosiert.
2 veranschaulicht die Spezifität der polyklonalen Antikörper, hergestellt gegen Helix-II, im Verhältnis zu anderen synthetischen Peptiden und gegenüber menschlichem intakten und bei 80°C bei 30 Minuten denaturierten Typ-II-Kollagen.
3 zeigt die Korrelation zwischen zwei Abbaumarkern der Knorpelgewebe bei 82 Kontrollsubjekten und 89 Patienten, die von rheumatoider Polyarthritis betroffen sind:

– der Marker der α₁-Kette des Typ-II-Kollagens: Helix-II
– der Marker des C-Telopeptids des Typ-II-Kollagens: CTX-II.

4 zeigt die Konzentration an Helix-II (ng/mmol Urinkreatinin) bei gesunden Erwachsenen Kontrollen (n=85), bei Patienten, die von Kniearthrosen betroffen sind (n=90), und bei Patienten, die von rheumatoider Arthritis betroffen sind (n=89).
5 zeigt das Niveau des Fortschreitens der Zerstörung der Knorpelgewebe in Abhängigkeit der Kombination der Messung von Urinexkretion von Helix-II und CTX-II (n ist die Anzahl der Patienten).
6 zeigt das Mittel der Prozentanteile einer individuellen Veränderung des Uringehalts von Helix-II zwischen der Grundvisite und sechs Monate nach dem Beginn der Behandlung bei den beiden Gruppen von Frauen nach den Wechseljahren, Placebo und Frauen, die mit Alendronat behandelt sind.
7 zeigt die Korrelation zwischen dem natürlichen Logarithmus des Uringehalts von Helix-II (X-Achse) und dem Gelenkspalt der Hüfte, gemessen durch Radiographie (Y-Achse) bei Patienten, die von Hüftarthrose betroffen sind.
8 zeigt eine "Kasten"-Grafik, die Uringehalte von Helix-II bei Patienten zeigt, die von Hüftarthrose (Coxarthrose) betroffen sind, mit einer langsamen oder schnellen Entwicklung von deren Krankheit.
9 zeigt eine immunohistochemische Analyse von Sehnenabschnitten von Patienten, die von Arthrose betroffen sind, markiert mit Helix-II-Antiserum.
A. VERFAHREN
1. Herstellung des synthetischen Peptids
Die Herstellung der synthetischen Peptide kann durchgeführt werden gemäß den weitgehend in der wissenschaftlichen Literatur beschriebenen Techniken. Das Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr. 3-Sequenz, abgeleitet von der α-Helixsequenz der α₁-Kette des Typ-II-Kollagens (Zugangsnummer bei GenBank: P02468) ist hergestellt worden durch die Peptidsynthesetechnik auf einer Feststoffphase unter Verwendung einer reversiblen Blockierung des Amins der Aminosäure durch Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl). Die Reinheit des Peptids ist durch HPLC und durch Massenspektroskopie überprüft worden.
Das als Immunogen dienende Peptid, synthetisiert mit einem N-terminalseitigen zusätzlichen Cystein ist gekoppelt worden von der N-terminalen Seite an ein Trägerprotein, das KLH (keyhole limpet hemocyanine) ist, was ein bessere Immunantwort gegenüber diesem Peptid erlauben wird. Das synthetische Peptid, das vorgesehen ist, auf die Mikroplatten adsorbiert zu werden, ist an das Biotin gekoppelt (Harlow, E., Lane, D. Antibodies: a Laborstory Manual. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laborstory Press. 1988: 72-87).
2. Herstellung der polyklonalen Antikörper
Die Kaninchen unterlagen einer Injektion auf intraperitonealem Wege des an KLH konjugierten Peptids, das mit Freudschen Volladjuvans emulgiert ist. Dieser Vorgang ist dreimal für drei Monate wiederholt worden unter Verwendung desselben Peptids mit dem unvollständigen Freudschen Adjuvans. Nach jeder Injektion ist eine Kaninchenblutprobe entnommen worden. Man hat dieses Blut in 30 Minuten gerinnen lassen und das Ganze für 10 Minuten bei 2500 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, um das Serum zu gewinnen. 10 Tage nach der letzten Injektion sind die Kaninchen geopfert worden und das gesamte Blut ist gewonnen worden. Jede Serumentnahme ist durch die ELISA-Technik in Gegenwart des Peptids mit SEQ ID Nr. 3-Sequenz, gekoppelt an das Biotin, titriert worden. Das Antiserum mit dem besten Titer ist ausgewählt worden für die Optimierung der ELISA-Kompetition (Harlow, E., Lane, D. Antibodies: a Laborstory Manual. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laborstory Press. 1988a: 92-120).
3. Titrierung der Antiseren
Die Titer der Antiseren sind durchgeführt worden unter Adsorbieren des an Biotin konjugierten Peptids, verdünnt mit Beschichtungspuffer auf den avidinierten Platten, zwei Stunden bei Umgebungstemperatur. Nach Waschen werden 100 μl Antiseren, verdünnt zu 1/100 bis 1/1.000.000 zugegeben zu 100 μl Verdünnungspuffer in die Löcher und werden für eine Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Waschen werden 100 μl Puffer von sekundären Antikörpern, gekoppelt an Peroxidase und gerichtet gegen die Kaninchenimmunoglobuline, für eine Stunde bei Raumtemperatur zugegeben. Die Löcher werden gewaschen und 100 ul Substrat (TMB) werden zugegeben. Die Reaktion wird gestoppt mit 100 μl H₂SO₄.
4. ELISA-Kompetition für das α-Helix-Peptid der α₁-Kette des Typ-II-Kollagens
Das an Biotin konjugierte Peptid, verdünnt mit Beschichtungspuffer wird adsorbiert auf avidinierte Platten zwei Stunden bei Umgebungstemperatur. Nach Waschen werden 100 μl Antiserum, verdünnt zum optimalen Titer, zugegeben zu 100 μl Standard (Peptid mit SEQ ID Nr. 3-Sequenz, verdünnt in Puffer) oder 100 μl von zu dosierenden Proben und werden inkubiert für eine Nacht bei 4°C. Nach Waschen werden 100 μl Puffer von Sekundärantikörpern, gekoppelt an Peroxydase und gerichtet gegen die Kaninchenimmunoglobuline zugegeben für eine Stunde bei Umgebungstemperatur. Die Löcher werden gewaschen und 100 μl Substrat (TMB) werden zugegeben. Die Reaktion wird gestoppt mit 100 μl H₂SO₄.
5. Immunohistochemische Analyse von Kniearthroseknorpelabschnitten
Der Knorpel ist von einem Femurgelenkkopf eines von Kniearthrose befallenen Patienten bei der Plazierung einer Prothese erhalten worden. Die verwendete Technik ist inspiriert von dem Artikel von Vankemmelbeke et al. (Vankemmelbeke M, Dekeyser PM, Hollander AP, Buttle DJ, Demeester J. Characterization of helical cleavages in type II collagen generated by matrixins. Biochem J. 1998 Mar 1;330:633-40). Die gefrorenen Knorpelschnitte sind entweder mit Helix-II-Antikörpern oder mit nicht-Immunserum, verdünnt zu 1/1000 für eine Stunde, inkubiert worden und werden dann gespült mit PBS. Anschließend werden die Schnitte für 20 Minuten mit dem biotinylierten Antikörper inkubiert ("Dako LSAB^® 2 system" Dako, Carpinteria, CA) und dann mit PBS gewaschen. Eine Inkubation von 6 Minuten mit DAB (Diaminobenzidin), gefolgt von Waschen mit destilliertem Wasser sind dann durchgeführt worden. Die Färbung der Schnitte ist durchgeführt worden durch aufeinanderfolgende Bäder von Hematoxylin von Mayer (4 Minuten) (Dako, Carpinteria, CA). Schließlich sind die Scheibchen getränkt worden in aufeinanderfolgenden Bädern von 70% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol und zweimal in Toluol unter Stehenlassen für 2 Minuten pro Bad.
6. Patienten, die von rheumatoider Polyarthritis, Arthrose, Pagetkrankheit betroffen sind, und Kontrollsubjekte
Wir haben 89 Patienten ausgewählt, die rheumatoide Polyarthritiskriterien (PR) aufwiesen, definiert durch das American College of Rheumatology (Arnett FC et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for classification of rheumatoid arthritis 1988; 31:315-324). Die Patienten sind Teil einer größeren Multizentrenuntersuchung mit Doppelblindprobe, die die Effizienz von Etanercept und Methotrexat bei 632 Patienten vergleicht, die von einsetzender rheumatoider Polyarthritis betroffen sind (Bathon JM et al. A comparison of etanercept and methotrexate in patients with early rheumatoid arthritis. N Engl J Med 2000; 343: 1586-1593; Garnero P et al. Association of Baseline Levels of Urinary Glucosyl-Galactosyl-Pyridinoline and Type II Collagen C-Telopeptide are associated with Progression of Joint Destruction in Patients with Early Rheumatoid Arthritis. Arthritis Rheum, 2002. 46(1):21-30). Die 89 Patienten hatten ein Alter über 18 Jahren, wiesen keine anderen Krankheiten auf, waren von PR seit wenigstens 3 Jahren betroffen und sind nicht mit Methotrexat behandelt worden. Um die Kandidaten mit hohem Risiko eines Fortschreitens zu Rekrutieren, mußten die Patienten in einer aktiven Krankheitsphase sein, das heißt bei deren Rekrutierung hatten die Patienten mehr als 12 sensible Gelenke und mehr als 10 geschwollene Gelenke. Diese Patienten wiesen auch einen positiven Grad rheumatoiden Faktors auf und auch 3 radiologisch bei den Händen, Handgelenken oder Füßen sichtbare Knochenerosionen. Die durch die Patienten eingenommenen Antirheumatismusbehandlungen wie Hydroxychlorochin und Sulfasalazin sind 4 Wochen vor Beginn der Untersuchung unterbrochen worden. Die Behandlungen mit festen Corticosteroiddosen und nicht-steroiden Antientzündungsmitteln sind zugelassen worden. Die Corticosteroiddosen konnten 10 mg Prednison pro Tag nicht überschreiten. Unter 89 Patienten dieser Untersuchung empfingen 33 eine Methotrexatdosis, die 7,5 bis 20 mg pro Woche für die 8 ersten Wochen der Untersuchung betrug, 28 empfingen 10 mg Etanercept subkutan zweimal pro Woche und 28 Patienten 25 mg für ein Jahr. Die Charakteristiken der Patienten, die betroffen waren von einsetzender PR der Untersuchung sind in der Tabelle 1 dargestellt. Für alle Patienten ist der zweite Urinabschnitt bei der Grundvisite gesammelt worden.
90 Patienten, die von Arthrose betroffen waren, gemäß den ACR-Kriterien und bei einer Zufallsuntersuchung erschienen, sind untersucht worden.
Die Einschlußkriterien sind die folgenden:

– Erwachsene Männer oder Frauen über 50 Jahre.
– Klinische Bestätigung der Kniearthrose seit wenigstens drei Monaten vor der Untersuchung und diagnostiziert gemäß den Kriterien des American College of Rheumatology (ACR).

Die ausgewählten Subjekte hatten als Haupteinschlußkriterien:

– Schmerz in und um das Knie die meiste Zeit.
– morgendliche Steifheit > 30 Minuten
– Knirschen bei aktiven Bewegungen
– Osteophyten des Knies, die radiologisch mit Grad 2 oder 3 bestätigt sind (das heißt > 1 und < 4) gemäß dem Maßstab von Kellgren und Lawrence
– einen normalisierten Punktestand der Gesamtpunkteskala der Western Ontario and MC Master Universities (WOMAC) ≥ 50 mm über einen visuellen Analogmaßstab von 100 mm.

Was die Kontrollen betrifft, sind die Referenzwerte der biologischen Marker bei 82 gesunden Subjekten erhalten worden, die 26 bis 90 Jahre alt sind (66% Frauen mittleren Alters, 55 ± 15 Jahre). Alle diese Individuen waren gesund und waren von keiner Krankheit betroffen und nahmen keine Behandlung, die den Metabolismus der Knochen oder des Gelenks beeinträchtigen konnte, einschließlich substitutiver Hormonbehandlung für Frauen nach den Wechseljahren.
Tabelle 1: Merkmale der Patienten mit einsetzender rheumatoider Polyarthritis

* Der radiologische Sharp-Gesamtpunktestand variiert von 0 bis 398; ein hoher Punktestand stellt eine größere Zerstörung der Knorpelgewebe dar.

Patienten, die von der Paget-Knochenkrankheit betroffen sind
25 Patienten (5 Frauen, 20 Männer; mittleres Alter: 70 ± 7 Jahre) sind ausgewählt worden. Die Diagnose der Paget-Knochenkrankheit ist durchgeführt worden durch Röntgenstrahlung und durch Knochenszintigraphie und alle Patienten haben im Serum eine Aktivität der alkalinen Phosphatase zweimal über der Obergrenze von jener, die bei normalen Erwachsenen erhalten wird. Keiner der Patienten ist mit Calcitonin für drei der Untersuchung vorangehende Jahre behandelt worden und mit Bisphosphonaten für 6 der Untersuchung vorangehende Monate.
7. Auswertung der Aktivität der Krankheit bei der Referenzvisite
Die Auswertung des Krankheitsstadiums bei den Patienten, die von PR betroffen sind, umfasste ein vollständiges Auszählen der sensiblen und geschwollenen Gelenke (71 Gelenke sind überprüft worden; die Hüfte und der Hals und sind allein für deren Empfindlichkeit überprüft worden). Die Gelenke sind als sensibel bzw. empfindlich klassifiziert worden, wenn ein Schmerz bei Druck oder Bewegung der Gelenke auftrat. Die Gelenke sind als geschwollen klassifiziert worden, wenn man die Gegenwart von geschwollenem weichen Gewebe bemerkt. Alle Auswertungen der Gelenke sind durch zwei unabhängige und speziell für die Untersuchung ausgebildete Forscher durchgeführt worden. Der klinische Selbstbewertungsfragebogen (Health Assessment Questionnaire, HAQ, Fries JF et al. The dimensions of health assessment questionnaire, disability and pain scores. J. Rheumatol 1982; 9:789-793) ist für alle Patienten gesammelt worden. Die anderen Anzeichen der Krankheitsaktivität umfassten die Auswertung durch den Patienten und durch den Arzt (Maßstab, der von 0 für am besten bis 10 für am schlechtesten geht), die Auswertung des Schmerzes durch den Patienten (Maßstab, der von 0 für am besten bis 10 für am schlechtesten geht) und des Serumgehalts des C-reaktiven Proteins (CRP).
8. Messung des Uringehalts von CTXII
CTXII (beschrieben durch Christgau et al. Bone 2001) im Urin ist gemessen worden durch eine ELISA-Kompetition (Cartilaps, Nordic Bioscience, Herlev, Dänemark). Ein monoklonaler Antikörper ist erzeugt worden bei der Maus und ist gerichtet gegen die Sequenz EKGPDP des C-Telopeptids des menschlichen Typ-II-Kollagens (Garnero et al., 2002 supra; Garnero et al. Association of Baseline Levels of Markers of Bone and Cartilage Degradation are associated with Longterm Progression of Joint Damage in Patients with Early Rheumatoid Arthritis: the Cobra Study. Arthritis Rheum., 2002a 46(11):2847-56; Garnero et al. Uncoupling of type II collagen synthesis and degradation predicts progression of joint damage in patients with knee osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2002b 46(10): 2613-24; Christgau et al. Collagen type II C-telopeptide fragments as an index of cartilage degradation. Bone 2001; 29:209-215). Diese Sequenz ist spezifisch für Typ-II-Kollagen und liegt nicht bei anderen Kollagenen wie Typ-I-Kollagen und bei Strukturproteinen vor. Die inter- und intra-Versuchs-Variationskoeffizienten (CVs) sind jeweils unter 8 und 10 %.
9. Radiologische Bewertung der Patienten
Vor- und Nachradiographieren der Hände, Handgelenke und Füße sind gemacht worden bei der Referenzvisite bei 6 Monaten und 12 Monaten bei allen Patienten, die von PR betroffen sind. Die Radiographien dieser 89 Patienten sind analysiert worden durch zwei unabhängige Radiologen (Bathon et al., 2000 supra). Es sind zwei spezialisierte Mediziner, die für das Auszählverfahren ausgebildet worden sind und beim Auszählen blind vorgehen, ohne die von den Patienten eingenommene Behandlung zu kennen, noch die Visite, bei der die Radiographie genommen worden ist. Das Mittel der Auszählungen der beiden Radiographien ist verwendet worden, um die Gelenkzwischenraumverschmälerung, die Knochenerosion und den Sharp-Gesamtpunktestand abzuschätzen, der die Summe der Zwischenraumverschmälerung und der Knochenerosion ist. Das Mittel des Fortschrittgrades pro Patient (Sharp-Einheit/Jahr) ist erhalten worden durch lineare Regression von drei Beobachtungen zum selben Zeitpunkt.
10. Statistische Analysen
Alle Daten sind ausgedrückt im Mittel ± Standardabweichung (DS). Aufgrund der Tatsache, daß die klinischen und radiologischen Anzeichen und Gehalt spezifischer Marker des Abbaus von Typ-II-Kollagen gemäß der Erfindung oder gemäß dem Stand der Technik nicht normal verteilt sind, sind die Korrelationen durch den nichtparametrischen Spearman-Rangkoeffizienten abgeschätzt worden. Der Fortschritt der Zerstörung des Gelenks ist definiert worden durch eine Erhöhung des radiographischen Sharp-Punktestandes um 0,5 Einheiten pro Jahr oder eher wie dies vorher beschrieben worden ist (Garnero et al., 2002 supra; Garnero et al., 2002a supra). Relative Risiken des Fortschreitens der Zerstörung des Gelenks in Abhängigkeit der Markergehalte gemäß der Erfindung oder gemäß dem Stand der Technik sind eingeschätzt worden durch logarithmische Regressionsanalysen nach Einstellung der Behandlungsaufnahme.
Alle statistischen Analysen sind durchgeführt worden unter Verwendung von SAS (SAS institute Inc, Cary, NC) (SAS Institute Inc. SAS STAT Users's Guide, Version 6, 4th Ed, Vol 1 und 2, Cary, NC SAS Institute, Inc.).
B: ERGEBNISSE
Beispiel 1: ELISA-Kompetition für das Helix-II-Peptid der α₁-Kette des Typ-II-Kollagens
Die Herstellungsverfahren der Peptide, der Antiseren sowie das ELISA-Kompetitionsverfahren sind oben beschrieben.
Eine Standard- oder Eichkurve ist erhalten worden auf einem semilogarithmischen Graphen, indem die acht Standards (von 0,25 bis 40 μg/l) dosiert werden mit H12-Antiserum, ausgewählt für seinen Titer (1). Die Werte sind in Prozentanteilen von B0 ausgedrückt, welcher der Wert des Standards 0 (ohne Peptid) ist. Die Helix-II-Peptidkonzentration in den Proben wird erhalten durch Extrapolieren der Eichkurve.
Die Grenzdetektion dieses Versuchs ist bestimmt worden für die Berechnung des Mittels von 32 Bestimmungen des Standards 0, bei welchem man dreimal die Standardabweichung abzieht. Die Grenzdetektion ist 0,2 μg/l.
Beispiel 2: Charakterisierung der Spezifität des Anti-Helix-II-Antiserums.
Das ausgewählte Antiserum ist getestet worden gegenüber verschiedenen Peptiden gemäß dem ELISA-Verfahren, das oben beschrieben ist, um seine Spezifität zu überprüfen. Die getesteten Peptide sind: das Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr. 3-Sequenz (das inhomogene Peptid), das Peptid mit SEQ ID Nr. 9-Sequenz (Helix-II, wo Hydroxyprolin durch Prolin ersetzt worden ist), das Peptid mit SEQ ID Nr. 5-Sequenz, das dem inhomogenen Peptid entspricht mit einer Aminosäure, die zusätzlich am C-Terminus aminiert ist, das Peptid mit SEQ ID Nr. 10-Sequenz, das dem inhomogenen Peptid entspricht mit einer Aminosäure, die wenigstens auf der C-terminalen Seite aminiert ist, das Peptid mit SEQ ID Nr. 11-Sequenz, entsprechend dem inhomogenen Peptid mit zwei Säuren, die wenigstens auf der C-terminalen Seiten aminiert sind, die Peptide mit SEQ ID Nr. 8- und SEQ ID Nr. 12-Sequenzen, die der homologen Sequenzjeweils in dem menschlichen Typ I und Typ III Kollagenen entspricht. Wie dies die 2 zeigt, werden allein die Peptide mit SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 9-Sequenzen erkannt durch das Helix-II-Antiserum, aber mit weniger Affinität für die SEQ ID Nr. 9-Sequenz. Die Spezifität des Antiserums ist daher teilweise abhängig von der Gegenwart von Hydroxyprolin, das in der SEQ ID Nr. 3-Sequenz enthalten ist. Alle anderen Peptide sowie das intakte und durch Hitze denaturierte Typ-II-Kollagen sind nicht in der Lage, mit dem auf der Platte adsorbierten Helix-II-Peptid in Kompetition zu treten. Daher detektiert das H12-Antiserum ein Neoepitop, das aus dem Abbau der α_l-Kette des Typ-II-Kollagens kommt.
Beispiel 3: Analytische Charakteristika des ELISA
Die analytischen Leistungsfähigkeiten des ELISA sind überprüft worden, indem durchgeführt wird:

– Verdünnungstests: eine Urinprobe ist rein und verdünnt dosiert worden (Tabelle
2).
– Überzugstests: man hat eine bekannte Menge Helix-II-Peptid zu den Urinproben zugegeben (Tabelle 3).
– intra- und inter-Versuchspräzisionstests: man mißt 32 Mal dieselbe Probe (intra-Versuch) oder man mißt dieselbe Probe bei 10 unterschiedlichen Handhabungen (inter-Versuch), um die Variabilität der erhaltenen Werte zu überprüfen (Tabelle 4).

Tabelle 2: Verdünnungstests von zwei Urinproben in der Helix-II-ELISA-Dosierung
Tabelle 3: Standardpeptidüberzug in der ELISA-Dosierung des Helix-II-Peptids
Tabelle 4: Präzision der Messung des Helix-II-Peptids, intra- und inter-Versuch in drei Urinproben
Wie die Tabelle 5 zeigt, bleibt den Helix-II-Gehalt nach 24 Stunden Inkubation bei Umgebungstemperatur und bei 4°C stabil (obwohl ein Urin bei den sechs Getesteten eine Verminderung von 19 % zeigt). Ähnlich beeinträchtigen vier wiederholte Gefrier- und Auftauzyklen nicht signifikant den Helix-II-Gehalt. Diese Ergebnisse zeigen eine sehr gute Stabilität der Helix-II-Konzentration in den Urinen an.
Tabelle 5: Stabilität des Helix-II-Gehalts bei Umgebungstemperatur, bei 4°C und nach wiederholten Gefrier-Auftauzyklen.
Die Daten in Klammern zeigen die Gehalte von Helix-II an, ausgedrückt in prozentualer Änderung im Verhältnis zu den Anfangsgehalten.

ND: nicht verfügbar

Beispiel 4: Lineare Korrelation unter zwei spezifischen Markern des Abbaus der Knorpelgewebe: Helix-II und CTX-II
Die Urinexkretion des Helix-II-Markers ist gemessen worden durch ELISA (oben präzisiertes Protokoll) und ist verglichen worden mit der gemessenen CTX-II- Urinexkretion, ebenfalls durch ELISA (Cartilaps ELISA, Nordic Bioscience A/S). Jeder dieser Marker ist gemessen worden bei:

– 82 Kontrollsubjekten
– 89 Patienten, die von rheumatoider Polyarthritis betroffen sind.

Die Ergebnisse (3) zeigen, daß der Helix-II-Marker signifikant mit einem bekannten spezifischen Marker der Pathologie korreliert oder dem Abbau der Knorpelgewebe, dem CTX-II oder Cartilaps (r=0,66, p<0,0001).
Beispiel 5: Auswertung des Helix-II-Gehalts bei Patienten, die von Kniearthrose, von rheumatoider Polyarthritis betroffen sind und Kontrollen.
Urine von Kontrollpersonen sowie von Patienten, die von Kniearthrose und von rheumatoider Arthritis betroffen sind, sind gesammelt worden und an Helix-II dosiert worden, wie in dem Protokoll (Absatz A.4) beschrieben. Die Konzentration an Helix-II-Peptid (ng/mmol urinäres Kreatinin) für verschiedene Populationen ist dargestellt in der 4: bei gesunden Erwachsenen Kontrollen (n=85), bei Patienten, die von Kniearthrose betroffen sind (n=90) und bei Patienten, die von rheumatoider Polyarthritis betroffen sind (n=89). Alle Werte sind korrigiert worden durch das urinäre Kreatinin. Die horizontalen Linien stellen das Mittel von Helix-II/Kreatinin in jeder Gruppe dar. Die Werte von Signifikanz und Differenz unter den Gruppen (p) sind auf dem Graphen dargestellt.
In der 4 stellt die durchgezogene horizontale Linie das mittlere Niveau jeder Gruppe dar. Gepunktete Linien stellen den oberen Grenzwert der gesunden Kontrollen (95%) dar.
Die Werte von p sind statistisch signifikant unter den Gruppen (nicht-parametrischer Rangtest von Mann-Whitney (Rank)). Das Helix-II-Gehalt der von Arthrose und rheumatoider Polyarthritis betroffenen Patienten ist verglichen worden mit jenem der gesunden Subjekte ähnlichen Alters und Geschlechts.
Tabelle 6: Uringehalt von Helix-II bei Patienten, die betroffen sind von Kniearthrose und rheumatoider Arthritis und Paget-Krankheit des Knochen und bei den gesunden Kontrollen

*p<0,0005 gegen Kniearthrose

Die Tabelle 6 zeigt, daß es keinen signifikanten Unterschied zwischen dem Helix-II-Gehalt der Patienten gibt, die von der Paget-Knochenkrankheit betroffen sind, und den gesunden Kontrollen. Diese Ergebnisse zeigen an, daß Helix-II in den Urinen nicht vom Knochenabbau kommt, da die Paget-Knochenkrankheit sich durch einen sehr hohen Abbau der Knochen kennzeichnet.
Beispiel 6: Vergleich der beiden Marker des Gelenkabbaus, Helix-II und CTX-II Tabelle 7: Korrelation zwischen den Grundgehalte von CTX-II und Helix-II und Fortschritt der Gelenkzerstörung bei 89 Patienten mit kürzlich aufgetretener Polyarthritis

*p=0,002, **p=0,007, ***p=0,05

Wenn die biologischen Marker des Abbaus des Typ-II-Kollagens (Helix-II und CTX-II (Cartilaps) urinär) sowie das Fortschreiten der Gelenkzerstörung, eingeschätzt durch die Änderungen der unterschiedlichen Sharp-Punktestände über ein Jahr ausgewertet werden, ist eine Korrelation (r von Spearman), signifikant beobachtet worden unter den erhöhten Gehalten von Helix-II und dem schnelleren Fortschreiten der Knochenerosion und der gesamten Zerstörung. Für CTX-II ist die Zuordnung geringer und nur für den Sharp-Gesamtpunktestand beobachtet worden.
Die signifikante Gelenkzerstörung (> 0,5 Einheiten/Jahr) der Patienten, die Markergehalte im oberen Drittel im Verhältnis zu den anderen Patienten zeigen, ist in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Zuordnung zwischen den Grundgehalte der Marker des Knorpels (CTX-II und Helix-II) und dem Risiko eines Fortschreitens der Gelenkzerstörung, eingeschätzt durch die radiologischen Änderungen des Sharp-Gesamtpunktestands über ein Jahr.

Alle relativen Risiken sind angepaßt worden für jede Behandlungsgruppe.

Das klinische Interesse der biologischen Marker als Vorhersagefaktoren des Fortschreitens ist kombiniert mit der Identifizierung eines Schwellenwerts, der es dem Klinikarzt erlaubt, Patienten mit hohem Risiko eines Fortschreitens zu identifizieren. Bei der obigen Untersuchung ist gezeigt worden, daß die Patienten, die zur Grundzeit einen Gehalt an Helix-II im oberen Drittel der Population hatten (33% der Population mit den höchsten Niveaus), im Mittel ein relatives Risiko eines Fortschreitens einer Gelenkzerstörung, 6,9-mal höher als die Patienten hatten, die Gehalte in den zwei unteren Dritteln hatten. In überraschender Weise ist dieses erhöhte Risiko eines Fortschreitens für die hohen Helix-II-Gehalte teilweise unabhängig vom Niveau anderer Risikofaktoren und insbesondere vom Niveau anfänglicher Gelenkzerstörung (eingeschätzt durch den Sharp-Punktestand) und dem systemischen Entzündungsniveau, eingeschätzt durch die Serumkonzentration des C-reaktiven Proteins (CRP). Für CTX-II ist die Zuordnung auch signifikant, dennoch mit einem relativ geringeren und nicht signifikanten Risiko nach Anpassung mit CRP. Die relativen Risiken sind berechnet worden durch logarithmische Regression.
Wie die 5 zeigt, erlaubt die Kombination der Messung der Urinexkretion von Helix-II und CTX-II eine bessere Identifizierung der Patienten mit kürzlich aufgetretener Polyarthritis mit schnellem Fortschreiten. In dieser Untersuchung sind die 87 PR-Patienten getrennt worden in vier Gruppen auf Basis von deren Anfangsgehalt an Helix-II und CTX-II unter Verwendung als Schwellenwert für jeden Marker, des oberen Drittels (viel Helix-II und CTX-II). Die Patienten, deren Gehalte von Helix-II und CTX-II im oberen Drittel sind, haben ein hohes Fortschreiten der Gelenkzerstörung, bewertet durch die Änderung des Sharp-Gesamtpunktestandes, die viel größer ist als bei den Patienten, die entweder hohe Helix-II-Gehalte oder hohe CTX-II-Gehalte zeigen. Diese Ergebnisse bestätigen daher, daß die Urindosis von Helix-II Zerstörungsmechanismen widerspiegelt, die unabhängig von CTX-II in PR sind. Die Kombination dieser beiden Marker verbessert die Vorhersage der Gelenkzerstörung.
Beispiel 7: Wirkung der Behandlung durch Alendronat (10 mg/Tag) auf die Urinexkretion von Helix-II bei Frauen nach den Wechseljahren mit Osteoporose. Tabelle 9: Mittelwerte von Urin-Helix-II, erhalten bei der Basisvisite und sechs Monate nach Beginn der Behandlung in der Placebo-Gruppe und der mit Alendronat behandelten Gruppe.

*p<0,01 im Verhältnis zur Zeit 0 und zu den Gehalten in der Placebo-Gruppe.

34 Frauen nach den Wechseljahren sind ausgewählt worden zufallsmäßig ausgehend von einer größeren klinischen Untersuchung, die insgesamt 500 Frauen umfaßt, die selbst zufällig waren. Um bei dieser Untersuchung zufällig zu sein, müssen die Frauen 60 bis 90 Jahre alt sein und deren Knochenmineraldichte der Wirbelsäule oder der Hüfte muß kleiner als wenigstens 2,5 Mal der mittleren Standardabweichung sein, die bei jungen gesunden Frauen erhalten wird (das heißt mit einer Osteoporose gemäß den WHO-Kriterien). Diese Osteoporose-Patienten werden zufallsmäßig in zwei Gruppen, jener des Placebos und jener des Alendronats (10 mg/Tag) und werden für 6 Monate behandelt.
Der zweite Urinabschnitt des Morgens ist frisch bei der Basisvisite und 6 Monate nach Beginn der Behandlung entnommen worden, um den Helix-II-Uringehalt zu messen. Die Tabelle 9 zeigt die Mittelwerte von Urin-Helix-II an, erhalten bei der Basisvisite und 6 Monate nach Beginn der Behandlung bei den beiden Gruppen. Die 6 zeigt das Mittel der prozentualen individuellen Änderung zwischen der Grundvisite und 6 Monate nach Beginn der Behandlung bei den beiden Gruppen, Placebo und mit Alendronat behandelte Frauen an. Das Alendronat bei einer Dosis von 10 mg/Tag erzeugt eine signifikante Verminderung des Helix-II-Gehalts bei 6 Monaten im Vergleich mit der Basisvisite und mit der Verminderung, die bei Frauen beobachtet wird, die ein Placebo empfangen.
Diese Daten sind in Übereinstimmung mit den Daten, die erhalten werden bei dem Arthrosetiermodell, das eine "Chondroprotektor"-Wirkung des Alendronats zeigt (Hayami T, Pickarski M, Wesolowski GA, McLane J, Bone A, Destefano J, Rodan GA, Duong le T. The role of subchondral bone remodeling in osteoarthritis: reduction of cartilage degeneration and prevention of osteophyte formation by alendronate in the rat anterior cruciate ligament transection model. Arthritis Rheum. 2004 Apr; 50(4):1193-206).
Beispiel 8: Der Urin-Helix-II-Gehalt ist erhöht bei Patienten, die von einer Arthrose der Hüfte mit schneller Zerstörung betroffen sind.
Der Kontrolluntersuchungsfall gruppiert 40 Patienten (23 Frauen, 17 Männer, mittleren Alters: 64 Jahre (± 12 Jahre)), welche die Kriterien des American College of Rheumatology von einfacher Arthrose der Hüfte zeigen. Diese Patienten kamen zur Beratung für einen Schmerz der Hüfte zwischen 1996 und 1999. Zwei Radiographien der Hüfte sind bei einem Jahr Intervall bei diesen Patienten durchgeführt worden und die Urinproben sind gesammelt worden bei der zweiten Radiographie, um den Helix-II-Gehalt zu messen. 12 dieser Patienten zeigten die Kriterien eines schnellen Fortschreitens der Hüftarthrose und 28 sind ausgewählt worden aufgrund von deren langsamem Fortschreiten der Verschmälerung des Zwischenraums des Hüftgelenks.
Das schnelle Fortschreiten der Hüftarthrose ist definiert worden durch die fünf folgenden Kriterien:

– einen großen Schmerz der Hüfte
– Symptome nach wenigstens zwei Jahren
– ein Fortschreiten der Verschmälerung des Zwischenraums des Hüftgelenks über 1 mm pro Jahr
– ein Erythrocytensedimentationsgehalt < 20 mm/erste Stunde
– und eine Abwesenheit von Entzündung oder Kristallen, die die Beeinträchtigung des Gelenks gemäß den Kriterien induzieren, die vorgeschlagen sind durch Lequesne und Ray (Lequesne M, Ray G. La coxopathie destructice rapide idiopathique. Rev Rhum 1989; 56:115-119).

Die 28 anderen Patienten haben ein langsames Fortschreiten der Arthrose der Hüfte, definiert durch einen Verlust des Gelenkzwischenraums < 0,20 mm während eines Jahres.
Die 7 ist eine Korrelation unter dem natürlichen Logarithmus des Uringehalts von Helix-II (X-Achse) und des Gelenkzwischenraums der Hüfte, gemessen durch Radiographie (Y-Achse) bei Patienten, die von Hüftarthrose betroffen sind.
Die 8 ist ein "Kasten"-Graph, der die Uringehalte von Helix-II bei Patienten zeigt, die von Hüftarthrose (Coxarthrose) betroffen sind mit einer langsamen oder schnellen Entwicklung von deren Krankheit. Von oben nach unten zeigt der "Kasten" den 25., 50. (Mittel) und 75. Teil der Werte von Helix-II, während die Grenzen der Linien beiderseits des "Kastens" den 10. und 90. Teil jeweils anzeigen.
Die Patienten mit einer Coxarthrose mit schneller Zerstörung haben einen mittleren Gehalt von Helix-II, über 69% im Verhältnis zu Patienten mit wenig entwickelter Coarthrose (p=0,003, durch einen nicht paarweisen und nicht parametrischen Test von Mann-Witney). Wenn alle Patienten, die von Coxarthrose betroffen sind, gruppiert werden, wird eine Erhöhung des Helix-II-Gehalts verbunden mit der Verminderung des Gelenkzwischenraums der Hüfte (r = –0,49, p = 0,017), gemessen durch Radiographie.
Beispiel 9
Wenn die Knorpelabschnitte des Arthrosepatienten inkubiert werden in Gegenwart von Helix-II-Antiserum, 9, die eine immunohistochemische Analyse von Knorpelschnitten von Patienten zeigt, die von Arthrose betroffen sind, erschien eine Färbung auf der fibrillären Oberfläche des Knorpels, während auf demselben Knorpel ein Abschnitt einer nicht betroffenen Zone keine Färbung zeigte. Die Kontrollknorpelabschnitte, inkubiert mit dem nicht-Immunserum, zeigen ein leichtes Grundrauschen. Diese Experimente legen nahe, daß der Helix-II-Marker spezifisch für den Abbau des osteoarthritischen Knorpels ist.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Einschätzung des Abbaus der Knorpelgewebe eines Individuums aus der In-vitro-Detektion in einer biologischen Probe, die von dem Individuum kommt, des Gehalts von wenigstens einem Marker, der spezifisch ist für den Abbau der Knorpelgewebe, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen detektierten Marker Fragmente eines Abbaus von Typ-II-Kollagen sind, die aus dem Abbau der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 der Kette α₁ des Typ-II-Kollagens stammen, welche in dem Tripelhelixbereich angeordnet ist, wobei diese Abbaufragmente wenigstens vier aufeinanderfolgende Aminosäuren umfassen, die in dem Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr. 3 vorliegen, das gegebenenfalls posttranslational modifiziert ist und in welchem das 4-Hydroxyprolin gegebenenfalls ersetzt ist durch ein Prolin oder ein 3-Hydroxyprolin.
Verfahren zur Einschätzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifischen detektierten Marker Abbaufragmente des Typ-II-Kollagens sind, die aus dem Abbau der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 der α₁-Kette des Typ-II-Kollagens stammen, welche in dem Tripelhelixbereich angeordnet ist, wobei diese Abbaufragmente wenigstens vier aufeinanderfolgende Aminosäuren umfassen, die in dem Helix-II-Peptid mit SEQ ID Nr. 3 vorliegen, das gegebenenfalls posttranslational modifiziert ist.
Verfahren zur Einschätzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gehalt von Abbaufragmenten der SEQ ID Nr. 2 des Typ-II-Kollagens detektiert, deren C-terminaler Teil besteht aus vier C-terminalen Aminosäuren des Helix-II-Peptids, nämlich Hyp-GTS, die gegebenenfalls posttranslational modifiziert sind, wobei das C-terminale Serin vorzugsweise nicht posttranslational modifiziert ist.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gehalt von Abbaufragmenten der SEQ ID Nr. 2 des Typ-II-Kollagens detektiert, welche wenigstens fünf aufeinanderfolgende Aminosäuren des Helix-II-Peptids mit SEQ ID Nr. 3 umfassen, von denen gegebenenfalls eine oder mehrere Aminosäuren posttranslational modifiziert worden ist (sind) und in welchem das 4-Hydroxyprolin gegebenenfalls ersetzt ist durch ein 3-Hydroxyprolin oder ein Prolin.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gehalt von wenigstens einem Abbaufragment des Typ-II-Kollagens detektiert, dessen Sequenz die SEQ ID Nr. 3 umfaßt.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Gehalt von Helix-II mit der Sequenz SEQ ID Nr. 3 detektiert.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion durchgeführt wird durch eine Hochleistungsflüssigchromatographietechnik (HPLC), durch Fluoreszenz, durch UV-Spektroskopie, durch elektrochemische Detektion oder durch proteomische Analysetechniken.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion darin besteht, die biologische Probe mit Antikörpern, Antikörperfragmenten oder Analyten zu kontaktieren, die gegen den zu detektierenden Marker gerichtet sind, und dann deren Bindung mit dem Marker durch eine immunologische Technik zu detektieren, die vorzugsweise gewählt ist unter der ELISA-Technik, den immunoenzymatischen Techniken, den Immunofluoreszenztechniken, den Radioimmunologietechniken, den Chemoimmunologietechniken oder den Proteomanalysetechniken.
Verfahren zur Einschätzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe kontaktiert wird mit polyklonalen Antikörpern.
Verfahren zur Einschätzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe kontaktiert wird mit monoklonalen Antikörpern.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe gewählt wird unter Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Schweiß, Lymphflüssigkeit, Tränen, Synovialflüssigkeit, Geweben, Zellen oder Überständen von Gewebe- oder Zellkulturen des Individuums.
Verfahren zur Einschätzung des Abbaus der Knorpelgewebe eines Individuums aus der In-vitro-Detektion in einer biologischen Probe des Individuums der Gegenwart von Abbaufragmenten des Typ-II-Kollagens, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologische Probe mit Antikörpern kontaktiert, die sich an ein Epitop binden, das in der Sequenz SEQ ID Nr. 3 enthalten ist.
Verfahren zur Einschätzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Antikörper polyklonal sind.
Verfahren zur Einschätzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Antikörper monoklonal sind.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung Antikörper/Epitop detektiert wird durch eine immunologische Technik, die gewählt ist unter der ELISA-Technik, den immunoenzymatischen Techniken, den Immunofluoreszenztechniken, den Radioimmunoiogietechniken, den Chemo-Immunologietechniken und den Proteomanalysetechniken.
Verfahren zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe gewählt wird unter Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Schweiß, Lymphflüssigkeit, Tränen, Synovialflüssigkeit, Geweben, Zellen oder Überständen von Gewebe- oder Zellkulturen des Individuums.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Pathologie von Knorpelgeweben bei einem Individuum unter Einsatz eines Verfahrens zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt detektierter spezifischer Marker quantifiziert und verglichen wird mit einem Referenzgehalt, der charakteristisch für die Pathologieabwesenheit ist.
Verfahren zum Verfolgen der Entwicklung einer Pathologie der Knorpelgewebe eines Individuums, das von einer Knorpelgewebepathologie betroffen ist, unter Einsatz eines Verfahrens zur Einschätzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt detektierter spezifischer Marker quantifiziert und verglichen wird mit einem Referenzgehalt, der zum Beispiel dem Gehalt entspricht, der erhalten wird für ein vorbestimmtes Stadium der Pathologie.
Verfahren zum Prognostizieren in pre-symptomatischer Weise von einer Pathologie der Knorpelgewebe bei einem Individuum unter Einsatz eines Bewertungsverfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt spezifischer detektierter Marker quantifiziert und verglichen wird mit einem Referenzgehalt, der etabliert ist bei Individuen selben Alters und selben Geschlechts ohne Pathologie oder bei einem vorbestimmten Stadium der Pathologie.
Verfahren, um die Entwicklung einer Pathologie der Knorpelgewebe bei einem Individuum vorzubestimmen, das eine solche Krankheit betroffen ist, unter Einsatz eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt der spezifischen detektieren Marker quantifiziert und verglichen wird mit einem Referenzgehalt, der einem Gehalt entspricht, der die Abwesenheit der Pathologie darstellt oder ein vorbestimmtes Stadium der Pathologie darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man in der biologischen Probe des Individuums wenigstens zwei spezifische Marker des Abbaus von Typ-II-Kollagen detektiert.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man in der biologischen Probe des Individuums gleichzeitig den Gehalt von Helix-II und den Gehalt von CTX-II mit Sequenz SEQ ID Nr. 4 detektiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Pathologie der Knorpelgewebe ein entzündliches Rheuma, eine metabolische Arthropatie, ein degeneratives Rheuma, eine rheumatoide Polyarthritis, eine Spondyarthropathie oder Arthrose ist.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Pathologie der Knorpelgewebe die rheumatoide Polyarthritis ist.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Pathologie der Knorpelgewebe Arthrose ist.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Pathologie der Knorpelgewebe Spondylarthritis ist.
Antikörper, der sich an ein Epitop bindet, von dem wenigstens vier, vorzugsweise wenigstens fünf Aminosäuren zu dem Abbaufragment gehören, das dem Helix-II-Peptid mit Sequenz SEQ ID Nr. 3 oder zum Helix-II-Peptid, von dem eine oder mehrere Aminosäuren posttranslational modifiziert worden sind, und vorzugsweise einem Epitop, das in der Sequenz SEQ ID Nr. 3 enthalten ist, entsprechen.
Antikörper nach Anspruch 31, der sich an ein Epitop bindet, dessen C-terminaler Teil besteht aus PGTS oder Hyp-GTS, gegebenenfalls posttranslational modifiziert, wobei das C-terminale Serin vorzugsweise nicht modifiziert ist.
Antikörper, der sich an ein Epitop bindet, das in den Sequenzen SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7 oder SEQ ID Nr. 9 enthalten ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 31 bis 33, der sich an ein Epitop bindet, dessen Sequenz SEQ ID Nr. 3 entspricht.
Antikörper nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß er polyklonal ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.
Dosierkit eines Abbaufragments des Typ-II-Kollagens, umfassend einen Antikörper nach einem der Ansprüche 31 bis 36.