DE69727582T2 - Test zur quantifizierung von arthritiszustanden - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue niedermolekulare Proteinfragmente, die Abbauprodukte des oligomeren Knorpelmatrixproteins (COMP) sind, eTween ist ein eingetragenes Warenzeicheninzigartige Antikörper gegen diese Fragmente und Verfahren zur Verwendung solcher Antikörper, um die Schwere der arthritischen Zustände zu messen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Das oligomere Knorpelmatrixprotein (COMP) ist ein Pentamer mit einem Molekulargewicht von 435 000, das Teil der extrazellulären Knorpelmatrix ist. Jedes Monomer mit etwa 87 000 wird von den Knorpelchondrozyten synthetisiert und sekretiert. COMP macht daher etwa 1 Prozent des Nettogewichts des Knorpels aus. COMP hat eine ähnliche Struktur wie die Vertreter der Thrombospondingenfamilie. Sie ähneln sich in den Typ 3 Wiederholungen und der C-terminalen Region. Thrombospondine haben, obwohl sie in der Struktur zu COMP ähnlich sind, Aktivitäten zur Regulation der Migration, des Wachstums und der Proliferation von Zellen (wie der glatten Gefäßmuskulatur) und hemmen das Wachstum von Endothelzellen (Newton et al., (1994), Genomics 24: 435–439).
  • Die physiologische Funktion von COMP ist nicht bekannt, aber das Vorkommen in der Synovialflüssigkeit und dem Serum wurde mit Osteoarthritis (Sharif et al., (1995) 34: 306–310) und rheumatoider Arthritis (Forslind et al., Brit. J. Rheumatology (1992) 31: 593–598) korreliert. Es wurde auch als Marker für den Knorpelumsatz in der Synovialflüssigkeit und dem Blut vorgeschlagen (Saxne und Heinegard D., (1992), Br. J. Rheumatology 31: 583–591). Darüberhinaus enthalten die Synovialflüssigkeiten von rheumatoiden Arthritispatienten, die große Mengen an COMP aufweisen, ein 65 kDa Fragment und möglicherweise (unter reduzierenden Bedingungen) Spuren einer niedermolekularen Spezies (Saxne und Heinegard, D. (1992), Br. J. Rheumatology 31: 583–591). Eine kürzliche Studie hat auch gezeigt, dass der Knorpel wie auch die Synovialflüssigkeit von Patienten mit Osteoarthriris und rheumatoider Arthritis Fragmente im Bereich von 43 kDa, 67–94 kDa und 150–200 kDa aufweisen (P. E. Discesare et al., (1996), J. Orthopaedic Res. 14: 946–955).
  • Ein weiteres Knorpelmatrixprotein, das Knorpelmatrixglycoprotein (CMGP) wurde im Serum von osteoarthritischen Hunden gefunden (Fife und Brandt (1989) J. Clin. Invest. 84: 1432–1439), aber es wurde nicht gezeigt, dass es ein Produkt des Knorpelabbaus ist. Die US 4 778 768 A beschreibt den Zusammenhang von Knorpelschädigung und der Messung von Proteoglycan und Fragmenten. Die Freisetzung der G1 Domäne von Proteoglycan nimmt mit dem Erkrankungsgrad bei rheumatoider Arthritis zu, aber die größere Region der Glycosaminoglycanreichen Region (CS/KDS Domäne) nimmt unter denselben Bedingungen ab (Saxne und Heinegard, (1993) Arthritis Rheum. 35: 385–390). Dies zeigt, dass es bisher nicht absehbar war, ob die Fragmente eines Proteins einen Krankheitszustands vorhersagen können.
  • Aggrecan ist ein Proteoglycan, das im Knorpel vorkommt. Dieses Protein besteht aus Keratansulfat (KS) Seitenketten. Bei Arthritis wurden Aggrecanabbauprodukte in der Synovialflüssigkeit von Patienten gefunden. Eine Art zur Messung von Aggrecanabbauprodukten in der Synovialflüssigkeit und dem Serum ist die Quantifizierung durch einen ELISA mittels Antikörpern, die Keratansulfatseitenketten erkennen (Thonar E J-MA et al., (1995) Acta Orthop. Scand (S266) 66: 103–106). Untersuchungen in mehreren Laboratorien konnten die Brauchbarkeit der Messung des Serum KS bei Arthritispatienten nicht bestätigen.
  • Thrombospondin (450 kDa) ist ein hochmolekulares adhäsives Glycoprotein, das aus drei identischen Monomeren mit einem Molekulargewicht von 150 kDa besteht. Es wird im Knorpel gefunden und wird durch artikuläre Chondrozyten gebildet (Miller und McDevitt (1988), Biochem. Biophys. Res. Comm. 153: 708–714). Es gibt derzeit keine Berichte, die das Vorkommen von Thrombospondin oder dessen Abbauprodukte in der Synovialflüssigkeit von Arthritispatienten dokumentieren.
  • Eine Quantifizierung des Serum-COMP kann einen prognostischen Wert für die rheumatoide Arthritis und Osteoarthritis haben (M. Sharif, T. Saxne, L. Shepstone, J. R. Kirwan, C. J. Elson, D. Heinegard, P. A. Dieppe, Br. J. Rheumatol 34: 4, 306–310, 1995, B. M. Hansson, D. Carey, M. Alini, M. Ionescu, L. C. Rosenberg, A. R. Poole, D. Heinegard, T. Saxne, J. Clin. Invest. 95: 1071–1077, 1995). Jedoch erlauben frühere Tests, die Serum-COMP quantifizieren, keine Bestimmung, ob ein Knorpelabbau in einem Arthritispatienten weiterhin stattfindet.
  • Antigenes KS kommt in erhöhten Mengen in der Synovialflüssigkeit aus humanen Osteoarthritisgelenken vor (Shimozuru et al., Orthop. Trans. 20: 419, 1995). Die Mengen dieses und anderer Marker des Proteoglycankatabolismus sind während der präradiologischen Stadien der Erkrankung am höchsten und tendieren zur Abnahme über die Zeit, speziell in Gelenken, die sekundäre entzündliche Veränderungen oder einen Verlust der artikulären Knorpelmasse zeigen (siehe E. J.-M. A. Thonar et al., Sports medicine & arthroscopy review: chondral injuries (Herausgeber J. T. Andrish) Raven Press, New York 1994: 13–29 als Zusammenfassung). Dies macht die Interpretation der Daten schwierig. Jedoch kann diese Schwierigkeit durch die Messung von zusätzlichen Markern und die Angabe der Ergebnisse als Verhältnisse des einen Markers zum anderen umgangen werden (E. J.-M. A. Thonar et al., Acta Orthop. Scand. (Suppl. 266) 66: 103–106, 1995). Interessanterweise hat ein kürzlicher Bericht behauptet, dass das Verhältnis des antigenen COMP zum antigenen KS in der Synovialflüssigkeit des gleichen Patienten bei der Verfolgung der Veränderungen im makromolekularen Knorpelumsatz brauchbar sein kann (Peterson et al., (1997) Ann. Rheum. Disease 56: 64–67).
  • Die Identifizierung von neuen Proteinen oder Fragmenten von Proteinen (Abbauprodukte) oder Verhältnisse der unterschiedlichen Proteine oder Fragmente, deren Vorkommen in der Synovialflüssigkeit und/oder dem Blutserum mit einem Krankheitszustand, wie Arthritis (Osteoarthritis oder rheumatoide Arthritis) korreliert werden kann, wäre zur Diagnose und Behandlung solcher Erkrankungen brauchbar. Darüberhinaus würde die Entwicklung von neuen Antikörpern und anderen Molekülen zur Detektion von solchen neuen Proteinen oder Proteinfragmenten leicht zu handhabende Tests zur routinemäßigen Anwendung in der Diagnose und Behandlung von Patienten mit Arthritis erlauben. Bei der Entwicklung neuer Arzneimittel gegen Arthritis besteht ein Bedarf für Tests zur Evaluierung der Wirksamkeit des neuen Arzneimittels auf die Knorpelmatrix und ein Mittel zur Selektion von Patienten für Behandlungstherapien. Die vorliegende Erfindung hat nun neue niedermolekulare Fragmente des COMP Proteins identifiziert, die mit dein Fortschreiten von Arthritis korrelieren, Antikörper, die an diese Fragmente binden und Tests zur Messung der Schwere der Arthritiserkrankungszustände durch die Quantifizierung dieser Fragmente und anderer bekannter COMP Fragmente und Fragmente von Thrombospondin-1 ("TSP-1 "). In den vorliegenden Untersuchungen unter Verwendung des Antipeptid-Antikörpers gegen das Carboxylende von COMP war nicht vorherzusehen, dass spezifische Abbauprodukte, die vom Carboxylende dieses Moleküls stammen oder ein Verhältnis der Abbauprodukte zu KS einen diagnostischen oder prognostischen Wert haben würde. Es zeigt, dass die Menge an COMP sich von der dieser C-terminalen Abbauprodukte unterscheidet und etwas anderes widerspiegelt als das intakte Molekül. Zusätzlich wurde festgestellt, dass der Antikörper die anderen bekannten COMP Fragmente erkennt. Darüberhinaus erkennt dieser Antipeptidantikörper unerwarteterweise das N-terminale 20 kDa Fragment von Rinderthrombospondin und das humane Volllängen TSP-1. Da die N-terminale Sequenz des Thrombospondins vom Rind und vom Menschen identisch sind, dürfte der Antikörper das N-terminale 20 kDa Fragment des humanen TSP-1 erkennen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf eine Gruppe an neuen und neu aufgefundenen niedermolekularen Proteinfragmenten, die C-terminale Abbauprodukte von COMP sind. Eine erste Gruppe, die hierin als "LMW-COMP" Fragmente bezeichnet wird, hat ungefähre Molekulargewichte von 33 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 18 kDa, 16 kDa und 14,4 kDa auf der SDS-PAGE. Vorzugswiese haben die LMW-COMP Fragmente ein Molekulargewicht von etwa 30, 20, 18, 16 oder 14 Kilodalton und am bevorzugtesten ist LMW-COMP die dominierende Spezies an niedermolekularen Abbauprodukten mit einem ungefähren Molekulargewicht auf einer SDS-PAGE Elektrophorese von etwa 20 Kilodalton. Dieses COMP Fragment wird in zunehmenden Mengen gebildet, wenn die Arthritiserkankung immer schwerwiegender wird. Diese neu aufgefundenen C-terminalen COMP Fragmente werden nur von anderen COMP Komponenten unter reduzierenden Bedingungen abgetrennt und daher hängt ihre Abtrennung von Tests ab, worin die Trennung von COMP Fragmenten unter solchen Bedingungen ausgeführt wird. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sind polyklonale und monoklonale Antikörper, die zur Bindung der neuen LMW-COMP Fragmente fähig sind. Die LMW-COMPs werden durch Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper, gegen das Aminosäurepolypeptid erkannt, das mindestens aus den 17 Aminosäuren des Carboxyterminus von COMP besteht. Diese Antikörper detektieren bei einem Western Blot eine weitere Gruppe an C-terminalen COMP Abbaufragmenten, die ein Molekulargewicht von etwa 67 kDa bis etwa 80 kDa und 150 kDa bis 250 kDa aufweisen und auch mit einem weiteren arthritischen Abbauprodukt kreuzreagieren, das ein 20 kDa Fragment von Thrombospondin ist, das vom N-Terminus von TSP-1 stammt. Die LMW-COMP Fragmente, die 67–80 kDa und 220–250 kDa COMP Fragmente und die Thombospondinfragmente werden kollektiv hierin "arthritische Abbauprodukte" oder "ADP" genannt. Daher kann sich der Ausdruck "arthritische Abbauprodukte" oder "ADP" auf alle drei Fragmente, die oben zusammen beschrieben sind, oder auf ein oder mehrere Fragmente alleine beziehen.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform des Testaspekts der Erfindung ist ein Test zur Messung der Menge an LMW-COMP, die gekennzeichnet ist durch
    • (1) Inkubation einer Körperflüssigkeitsprobe, die von einem Arthritispatienten erhalten wurde, unter reduzierenden Bedingungen,
    • (2) Abtrennung von LMW-COMP von anderen COMP Komponenten in der Körperflüssigkeit unter reduzierenden Bedingungen,
    • (3) Inkubation der Körperflüssigkeitsprobe mit einem anti-LMW-COMP Antikörper und
    • (4) Messung der Menge an gebundenem anti-LMW-COMP Antikörper in der Körperflüssigkeitsprobe.
  • Wahlweise kann die Menge an gebundenem anti-LMW-COMP Antikörper in der Körperflüssigkeitsprobe mit der Menge an gebundenem anti-LMW-COMP Antikörper in der Körperflüssigkeitsprobe zu einer unterschiedlichen Zeit während der Diagnose und/oder Behandlung der Arthritis verglichen werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft diagnostische Tests zur Messung des Verhältnisses der Menge an LMW-COMP zur Menge an KS in einer Körperflüssigkeitsprobe, die von einem Patienten stammt, vorzugsweise Synovialflüssigkeit und Serumproben, zur Diagnose und/oder Behandlung von Arthritis.
  • Beschreibung der Figuren
  • Die 1 zeigt eine Western Blot Analyse von Synovialflüsigkeit aus Patienten mit unterschiedlichen arthritischen Zuständen mittels Kaninchen-anti-H741 Antikörper. Spur 5 – Moderate RA, Spur 4 – Pseudogicht, Spur 3 – Gichtartige Arthritis, Spur 2 – Pseudogicht, Spur 1 – Niedermolekulare Marker: 97,4 kDa, 66,3 kDa, 45 kDa, 31 kDa, 21,5 kDa.
  • Die 2 zeigt eine Western Blot Analyse der Synovialflüssigkeit von Patienten mit unterschiedlichen arthritischen Zuständen mittels Kaninchen-anti-H741 Antikörper. Spur 1 – Immunblot der Synovialflüssigkeit von einem psoriatischen Arthritispatienten (Patient Nr. 1 9) in Gegenwart eines fünfzigfachen molaren Überschusses des Peptids H741, Spur 2 – Synovialflüssigkeit von Patient Nr. 19, Spur 3 – Schwere Osteoarthritis/rheumatoide Arthritis (Probe Nr. 96020), Spur 4 – Moderate RA, Spur 5 – Moderate RA, Spur 6 – Niedermolekulare Marker: 97,4 kDa, 66,3 kDa, 45 kDa, 31 kDa, 21,5 kDa und 14,4 kDa.
  • Die 3 ist eine schematische Darstellung einer monomeren Untereinheit des humanen COMP: Humanes COMP besteht aus einer N-terminalen Domäne, einer Interkettenverbindungsregion, EGF und TSP ähnlichen Wiederholungsdomänen und einer C-terminalen Domäne. Ein syntlietisches Heptadecapeptid des C-terminalen COMP wurde zur Antikörperherstellung verwendet.
  • Die 4 ist ein Vergleich von immunreaktiven Fragmenten, die in Synovialflüssigkeit durch Kaninchen-anti-human COMP und durch Kaninchen Antipeptidantikörper H741 detektiert wurden: 5 μl Synovialflüssigkeit pro Spur werden auf einem 10% SDS-PAGE Gel unter reduzierenden Bedingungen aufgetragen und elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und einzelne Spuren werden in Streifen geschnitten. Die Spur 2 wird mittels eines polyklonalen Antikörpers gegen COMP analysiert, Die Spur 3 wird mittels des Antipeptidantikörpers H741 analysiert und die Spur 4 wird mittels eines unbestimmten in Kaninchen erzeugten Antikörpers analysiert. Die Lage der Molekulargewichtsmarker ist links gezeigt.
  • Die 5 ist eine Western Analyse der Synovialflüssigkeit von rheumatoiden (RA) und osteoarkhritischen Patienten (OA) mittels des Antikörpers H741: 5 μl Synovialflüssigkeit pro Spur werden auf ein 4–20% SDS-PAGE Gel unter reduzierenden (A) und nicht-reduzierenden (B) Bedingungen aufgetragen. Die Gele werden auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und mittels des Antikörpers H741 analysiert (2,5 μg/ml). Spur 1: Patient mit milder RA, Spur 3: Patient mit schwerer OA, Spur 5: Patient mit moderater RA, Spur 7: Patient mit schwerer OA.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Geeignete Körperflüssigkeiten umfassen alle Körperflüssigkeiten, die von einem arthritischen Patienten erhalten werden. Beispiele für solche geeigneten Körperflüssigkeiten umfassen Blut, Serum, Speichel, Urin, Synovialflüssigkeit usw. Die bevorzugten Körperflüssigkeiten sind Synovialflüssigkeit, Blutserum und Urin, wobei Synovialflüssigkeit und Serum am bevorzugtesten sind. Synovialflüssigkeit hat mit der höchsten Wahrscheinlichkeit die größten Mengen an LMW-COMP. Arthritispatienten sind die, welche durch einen Arzt diese Diagnose erhalten haben oder die die Symptome aufweisen, die mit Arthritis assoziiert sind. Arthritis umfasst sowohl Osteoarthritis als auch rheumatoide Arthritis. LMW-COMP kann auch zusammen mit einem Knorpelabbau als Ergebnis eines traumatisierten Gelenks oder einer Knochenverletzung gefunden werden. Dies umfasst Knochenbruch, abgerissener Knorpel, Gelenksdislokation und dergleichen.
  • LMW-COMP können aus COMP und anderen COMP Abbauprodukten mittels bekannter Trenntechniken isoliert oder abgetrennt werden. Diese umfassen Gelfiltrationschromatographie, Elektrophorese und selektive Fällung. Es ist wichtig, dass die Trenntechnik zur Abtrennung der 14–33 Kilodalton großen Fragmente unter reduzierenden Bedingungen ausgeführt wird. Scheinbar haben LMW-COMP zumindest eine Disulfidbindung mit sich selbst oder mit einem anderen Teil des COMP Proteins, so dass die Reduktion der Bindungen das LMW-COMP befreit und es abgetrennt und delektiert werden kann. Reduzierende Bedingungen umfassen typischerweise eine Lösung der Körperflüssigkeit, zu der ein Reduktionsmittel gegeben wurde. Geeignete Reduktionsmittel umfassen die in der Technik zur Reduktion von Disulfidbindungen bekannten. Bevorzugte Reduktionsmittel umfassen Dithothreit (DTT), β-Mercatoethanol, Cystein und Ascorbinsäure. Das Reduktionsmittel wird in einer Konzentration verwendet, die ausreicht, um die Reduktion der Disulfidbindungen zu erleichtern, das heißt einer Konzentration, die mindestens ein 1 : 1 Verhältnis von Disulfidbindungen : Reduktionsmittel erlaubt. Typischerweise sind 0,1–100 mM Reduktionsmittel ausreichend und die Inkubation mit dem Reduktionsmittel findet für etwa 30 Sekunden bis etwa 30 Minuten und bei einer Temperatur von etwa 25–45°C statt. Vorzugsweise findet die Inkubation für etwa 5 Minuten und etwa 37°C statt. Nach einer Exposition der Körperflüssigkeitslösung gegenüber einem Reduktionsmittel für die gewünschte Zeit während der Abtrennung kann überschüssiges Reduktionsmittel unter Verwendung einer das Reduktionsmittel inaktivierenden Substanz inaktiviert werden, wie Iodacetamid oder n-Ethylmaleinimid. Dieser Inaktivierungsschritt ist besonders wichtig, wenn der ELISA Test als Detektions- oder Messtechnik verwendet wird. Die Konzentration der das Reduktionsmittel inaktivierenden Substanz ist im Überschuss zur Konzentration des vorher zur Körperflüssigkeit zugegebenen Reduktionsmittels, vorzugsweise mindestens etwa doppelt so hoch. Daher beträgt die Konzentration der das Reduktionsmittel inaktivierenden Substanz mindestens 2 mM wenn die Konzentration des Reduktionsmittels in der Körperflüssigkeit 1 mM beträgt. Wahlweise kann die Körperflüssigkeitslösung mit einer Substanz behandelt werden, um die Viskosität der Körperflüssigkeit zu reduzieren (ein Viskositätserniedriger). Die ist besonders brauchbar, wenn die Körperflüssigkeit Synovialflüssigkeit ist und die Detektion von LMW-COMP durch Western Blot erfolgt. Protease freie Streptomyces Hyaluronidase ist eine geeignete Viskositätserniedrigende Substanz und andere sind in der Technik bekannt. Eine weitere optionale Behandlung der Körperflüssigkeit ist die selektive Fällung von Proteinen in der Körperflüssigkeit, um die niedermolekularen Fragmente von COMP zu erhöhen. Die selektive Fällung kann beispielsweise unter Verwendung von 30% Ammoniumsulfat oder 20% Polyethylenglycol ausgeführt werden.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet neu hergestellte Antikörper gegen LMW-COMP als Detektionstechnik. Diese Antikörper reagieren mit dem 67–80 kDa Fragment und dem 150–200 kDa Fragment und mit dem N-terminalen Ende von TSP-1 kreuz. Dies ist unerwartet, da wie oben erwähnt die Aminosäuresequenz von C-terminalen COMP und von N-terminalen TSP-1 vollkommen unterschiedlich sind. Das 67–80 Kilodalton COMP Fragment, das an sich bekannt ist, ist unter nicht-reduzierenden Bedingungen dominant und besitzt das C-terminale Ende des Volllängen COMP Fragments und findet sich in der Synovialflüssigkeit und bei humanem osteoarthritischem Knorpel in Kultur. Dies wird unter Verwendung von humanem Knorpel gezeigt, der mit Matrixmetalloproteinasen (MMPs) verdaut wird, wonach eine Quantifizierung des 67–80 kDa Fragments im Medium erfolgt.
  • Die so hergestellten Antikörper können zur Detektion von LMW-COMP beispielsweise durch Western Blot oder ELISA verwendet werden, die beide in der Technik gut bekannt sind. Aufgrund der Empfindlichkeit von Antikörpern gegenüber reduzierenden Mitteln kann es erforderlich sein, überschüssiges Reduktionsmittel, das zur Freisetzung von LMW-COMP verwendet wurde, mit einer das Reduktionsmittel inaktivierenden Substanz vor dem Aussetzen oder der Inkubation der Körperflüssigkeit gegenüber einem anti-LMW-COMP Antikörper zu inaktivieren.
  • Die Antikörper gegenüber LMW-COMP können auf eine Vielzahl an Wegen erhalten werden. Das isolierte LMW-COMP kann als Immunogen zur Erzeugung von Antikörpern in einem Testtier verwendet werden. Falls die Antikörper in Mäusen erzeugt werden, können monoklonale Antikörper mittels bekannter Techniken hergestellt werden. Darüberhinaus können chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper auch vom Fachmann hergestellt werden. Andererseits können polyklonale Antikörper, die in Tieren erzeugt wurden, verwendet werden. Ebenfalls können anstatt des Volllängen LMW-COMP als Immunogen kürzere Fragmente des LMW-COMP, wie die C-terminale Peptidsequenz, wie auch synthetische Peptide mit einer einem Teil des LMW-COMP entsprechenden Sequenz verwendet werden. Bevorzugte synthetische Peptide stammen vorzugsweise aus der C-terminalen Region von COMP. Bevorzugte synthetische Peptide sind die Peptide H741 und H669, die die angegebenen Reste aus dem Volllängen COMP enthalten.
  • Cys741-Asn-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu-Thr-His-Gln-Leu-Arg-Gln-Ala757-COOH (H741) (SEQ ID Nr. 1) Lys669-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Trp-Lys-Asp-Lys-Lys-Ser-Tyr683-CONH2 (H669) (SEQ ID Nr. 2)
  • Die entstehenden Antikörper werden jeweils als Antikörper H741 und Antikörper H669 bezeichnet und die sie produzierenden Zellen werden jeweils als Hybridom H741 und H669 bezeichnet.
  • Weiter bevorzugte synthetische Peptide stammen aus der C-terminalen Region von Ratten COMP und von der C-terminalen Region von Rinder COMP.
  • Ratte-NH2-Cys737-Asn-Asp-Tlir-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu-Arg-His-Arg-Leu-Arg-Arg-Ala,55COOH (SEQ ID Nr. 3) Ratte) und Rind-NH2-Cys-Asn-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu-Ala-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-AlaCOOH (SEQ ID Nr. 4) (HRind).
  • Die entstehenden Antikörper werden ähnlich jeweils als Antikörper HRatte und Antikörper HRind bezeichnet und die sie bildenden Zellen werden jeweils als Hybridom HRatte und HRind bezeichnet. Es ist wichtig zu erwähnen, dass die gegen die oben beschriebenen Peptide erzeugten Antikörper nach einem Western Blot alle ADP Fragmente delektieren. Ein Antikörper, der COMP nicht erkennt, ist unfähig, diese ADP Fragmente zu delektieren. Diese Beobachtungen legen nahe, dass diese Proteine, nämlich die ADP Fragmente, in der Synovialflüssigkeit die Abbauprodukte von COMP sein könnten. Darüberhinaus wurde festgestellt, dass der Antikörper gegen das C-terminale Peptid ADP Fragmente erkennt, die in einer Western Analyse durch einen polyklonalen Antikörper gegen COMP nicht erkannt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Tests ist die Körperflüssigkeit Synovialflüssigkeit oder Serum. Bevorzugte Reduktionsbedingungen sind Dithiothreit oder Mercaptoethanol mit etwa 1 mM für etwa 5 Minuten bei 37°C. Der bevorzugte anti-LMW-COMP Antikörper wird in Kaninchen gebildet, die mit dem Peptid H741 sensibilisiert wurden. Das bevorzugte Verfahren zur Messung der Menge an gebundenem anti-LMW COMP Antikörper ist Western Blot nach einer Elektrophorese. Wenn ein Western Blot als Messtechnik verwendet wird, ist es gewöhnlich ratsam, das überschüssige Reduktionsmittel mit einer das Reduktionsmittel inaktivierenden Substanz vor der Inkubation der Körperflüssigkeitsprobe mit einem anti-LMW-COMP Antikörper zu inaktivieren.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch einen Kit zur Durchführung des Testaspekts der Erfindung. Ein solcher Kit umfasst eine Lösung oder ein Gemisch aus einem oder mehreren LMW-COMP mit einem ungefähren Molekulargewicht von 33 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 18 kDa, 16 kDa oder 14,4 kDa und/oder einem anti-LMW-COMP Antikörper. Der Kit kann zusätzlich Gläschen oder Gefäße für die Inkubation einer Körperflüssigkeitsprobe, einem Viskositätsverringerer, einer das Reduktionsmittel inaktivierenden Substanz und/oder Trennmaterialien enthalten.
  • Es wird ein Immuntest mittels Antikörper gegen die C-terminale 17 Aminosäuren lange Sequenz (SEQ ID Nr. 1) von COMP entwickelt und es wird antigenes COMP in der humanen Synovialflüssigkeit von Arthritispatienten quantifiziert. Wenn die antigenen Gehalte an COMP in der Synovialflüssigkeit von einem arthritischen Patienten bei verschiedenen Stadien der Erkrankung mit den Gehalten an Proteoglycan (gemessen durch KS ELISA) in denselben Synovialflüssigkeiten verglichen werden, wird ein bestimmtes COMP Antigengehalt/KS Verhältnis für Patienten in jeder Erkrankungsgruppe erhalten. Daher ist die Messung des COMP Gehalts mittels dieses vom C-Terminus abgeleiteten Antikörpers gegen COMP zur Diagnose und zur Überwachung von arthritischen Patienten brauchbar.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Test zum Messen eines zusätzlichen Markers des Knorpelabbaus beschrieben und die Ergebnisse werden als Verhältnis von einem Marker zum anderen angegeben. In diesem Test wird LMW-COMP wie oben beschrieben gemessen. Die Menge an KS, ein Glycosaminoglycan, das vorwiegend im Proteoglycan des Knorpels vorkommt, wird dann mittels an sich bekannter Verfahren bestimmt (G. V. Campion et al., Arthritis und Rheum. 34(10): 1254–1259 (1991)). Die LMW-COMP Werte werden dann mit KS Werten zur Messung des Verhältnisses an LMW-COMP zu KS Wert verglichen. Dieses Verhältnis zeigt die Stufe des arthritischen Zustands an und ein Ziel der chondroprotektiven Therapie ist es, die Zunahme im Verhältnis von LMW-COMP zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere Körperflüssigkeitsproben auf die Menge an COMP und LMW-COMP und KS getestet und es wird jeweils ein Mittelwert errechnet. Die Mittelwerte werden dann verwendet, um das Verhältnis dieser Fragmente zueinander zu bestimmen.
  • Die vorliegende Erfindung ist zur Messung von LMW-COMP bei der Prognose, Diagnose und Behandlung von arthritischen Erkrankungen brauchbar. Als Maß für die Schwere eines arthritischen Zustands erlaubt die vorliegende Erfindung es Klinikärzten, die Behandlung und die Verabreichung von Pharmazeutika bei der Behandlung der Arthritis zu optimieren. Der Vergleich der Menge an LMW-COMP vor oder früh in der Behandlung mit den Spiegeln während oder nach der Behandlung erlaubt es dem Klinikarzt, die Wirksamkeit der Behandlung zu Verfolgen und die Verabreichung von Pharmazeutika oder eine andere Behandlung anzupassen. Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um das Stadium eines Arthritiszustands durch das verfolgen der Spiegel an LMW-COMP über einen Zeitraum zu diagnostizieren. Die Veränderungen in den LMW-COMP Spiegeln können anzeigen, ob ein arthritischer zustand zunimmt, abnimmt oder sich stabilisiert. Diese Information kann es auch erlauben, einen besseren Behandlungsverlauf zu entwerfen und zu verabreichen.
  • Die LMW-COMPs der Erfindung sind als Molekularmarker bei der Diagnose von arthritischen Zuständen brauchbar. Beispielsweise können isolierte LMW-COMP Fragmente parallel auf einem Elektrophoresegel oder einer Gelfiltrationssäule mit ADP aus einer Probe als Indikation der Verteilung der COMP Fragmente in der Probe gefahren werden. In diesem Fall kann die Probe eine Körperflüssigkeitsprobe sein oder sie kann von einer Zellkultur oder einer Gewebekultur stammen, insbesondere einer Zellkultur oder einer Gewebekultur, die COMP bildet (beispielsweise Chondrozyten und dergleichen).
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Herstellung des Antipeptid-Antikörpers gegen synthetische Peptide die von der C-terminalen Region von COMP stammen
  • Jedes der synthetischen Peptide, die eine Sequenz aufweisen, die den Resten in humanem COMP Polypeptid entsprechen, welche mit Cys741-Asn-Asp-Thr-Ile-Pro-Glu-Asp-Tyr-Glu-Thr-His-Gln-Leu-Arg-Gln-Ala757-COOH (SEQ ID Nr. 1) (H741) beginnen, werden an Pfeilschwanzkrebs (Keyhole-Limpet) Hämocyanin über das N-terminale Cystein gebunden und die Antikörper in Kaninchen werden mittels vorher etablierter Verfahren hergestellt (Briand et al (1995) J. Immunol. Methods 78: 59–69). Der Antikörper wird mittels Sepharosepeptidaffinitätssäulen gereinigt. Das zweite synthetische Peptid von humanem COMP, nämlich Lys669-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Trp-Lys-Asp-Lys-Lys-Ser-Tyr683-CONH2 (SEQ ID Nr. 2) (H669), wird an KLH über das Glutaraldehydverfahren (Brind et al., (1985) J. Immunol. Methods 78: 59–69) gekuppelt und die Kaninchenantikörper werden wie oben beschrieben hergestellt.
  • Monoklonale Antikörper werden mittels der H741 und H669 Peptide gemäß etablierter Verfahren (Köhler und Milstein (1975), Nature 256: 495–497, Yelton und Sharff (1981) Ann. Rev. Biochem. 50: 657–680) hergestellt. Die entstehenden Antikörper werden jeweils als Antikörper H741 und H669 bezeichnet und die Zellen, die sie bilden, werden jeweils als Hybridom H741 und H669 bezeichnet. Darüberhinaus können auch chimäre und humanisierte Antikörper vom Fachmann hergestellt werden.
  • Beispiel 2
  • Identifizierung eines niedermolekularen Fragments von COMP als Abbauprodukt von COMP
  • Mit 10 μl Hyaluronidase von Streptomyces behandelte Synovialflüssigkeit wird mit 10 μl SDS Probenpuffer gemischt, worin 10% Mercaptoethanol enthalten sind. Die Proben werden für 4 Minuten gekocht und 15 μl werden auf ein 14% SDS-PAGE aufgetragen. Nach der Elektrophorese werden die Proteine elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran überführt (100 Volt, 2 Stunden bei 4°C). Die Nitrocellulosemembran wird mit 0,2% Ponesau S Rotfarbstoff (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) in 1% Essigsäure gefärbt, um die Proteinmarker zu visualisieren. Die Marker werden mit grün gefärbtem Stift markiert und der Blot wird ausgiebig mit PBS gewaschen und mit 2% BSA in PBS bei 4°C für 18 Stunden geblockt. Der Blot wird mit Kaninchenantikörper H741 entwickelt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Die 1 und 2 zeigen die verschiedenen LMW-COMP Fragmente, die erhalten werden, mit scheinbaren Molekulargewichten von etwa 30, 20, 18, 16 und 14 Kilodalton. Die vorwiegendste Spezies scheint ein Molekulargewicht von etwa 20 Kilodalton zu haben.
  • Beispiel 3
  • Analyse der humanen Synovialflüssigkeit für COMP Fragmente durch Western Immunblots
  • Humane Synovialflüssigkeiten werden in EDTA gesammelt und Serumproben werden aus Plasma hergestellt und bis zur Verwendung eingefroren. Für eine Western Blot Analyse wird die Synovialflüssigkeit mit Hyaluronidase (Saxne und Heinegard (1992) Br. J. Rheumatol. 31: 583–591) in Gegenwart von 1 μl 10 mg/ml PMSF (Phenylmethansulfonsäure) in Arzneimittelisopropan für 2 Stunden bei 56°C behandelt und bis zur Verwendung eingefroren. Für einen ELISA Test werden die Synovialflüssigkeiten oder Serumproben mit 2 mM Iodacetamid (Aldrich Chemicals) oder 2 mM N-Ethylmaleimid (Aldrich Chem.) behandelt. Die Synovialflüssigkeiten oder Se rumproben werden selektiv mit 30% Ammoniuinsulfat oder 20% PEG zur Anreicherung von niedermolekularen Fragmenten von COMP gefällt und dann bei –20°C gelagert.
  • Urin wird gewonnen, zentrifugiert und bis zur Verwendung eingefroren.
  • 20 μl humane Synovialflüssigkeit wird 1 : 1 mit SDS-PAGE Auftragspuffer (Novex, San Diego, CA) gemischt, worin 10% Mercaptoethanol enthalten sind. Die Proben werden für 4 Minuten gekocht und 15 μl werden pro Spur auf ein 14% oder 4–12% Gradienten SDS-PAGE Tris-Gly-Gel (Novex, CA) aufgetragen. Ein getrennter Satz dieser Proben wird auch für eine Analyse unter nicht-reduzierenden Bedingungen präpariert. Es werden Molekulargewichtsmarker verwendet, um das Molekulargewicht von unbekannten Banden zu lokalisieren. Nach der Elektrophorese werden die Proben elektrophoretisch auf ein Nitrocellulosepapier überführt. Das Papier wird mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mM Natriumphosphat und 0,15 M NaCl bei pH 7,5 (PBS) für 18 Stunden bei 4°C behandelt.
  • Das Nitrocellulosepapier wird mit PBS gewaschen (10 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl bei pH 7,2). 5 μl affinitätsgereinigter Antikörper (3,6 mg/ml Proteinkonzentration in der Stammlösung) wird in 7 ml ELISA Verdünnungspuffer (20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween-20, 0,1% Thimersol, 0,1% Rinderserumalbumin) verdünnt und die Nitrocellulosemembran wird mit der Lösung überschichtet. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wird die Membran viermal (5 Minuten pro Waschschritt) mit ELISA Verdünnungspuffer ohne Albumin gewaschen. Die Membran wird dann mit 1 mg monoklonalem Antikörper gegen Kaninchen-IgG, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist (Sigma Immunchemicals, USA) in 1 ml ELISA Verdünnungspuffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wird fünfmal mit ELISA Verdünnungspuffer ohne Albumin und zweimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung bei pH 7,5 gewaschen. Der gebundene Antikörper wird dann mittels ECL oder ECF Substrat (Amersham Co.) detektiert. Die Fragmente werden mittels eines Molecular Dynamics Densitometers quantifiziert (Sunnyvale, CA). Dieselbe Nitrocellulosemembran wird dann mittels TMB Substrat (Promega, Madison, WI) sichtbar gemacht.
  • Beispiel 4
  • Ouantifizierung von COMP Fragmentierung durch ELISA Test
  • Es werden mehrere ELISA Techniken zur Messung der Fragmentierung des COMP Proteins verwendet.
  • 1. ELISA Kompetitionstest
  • Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wird mit 0,1 ml/Vertiefung an 50 ng/ml Antigen (syntlietisches Peptid H741 ohne des N-terminalen Cysteins) in PBS für 48 bis 72 h bei 4°C beschichtet. Die Vertiefungen werden mit 300 μl/Vertiefung an 2% Rinderseruinalbumin (BSA) in PBS für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die Vertiefungen werden zweimal mit ELISA Waschpuffer (20 mM Tris bei pH 7,5, worin 0,15 M NaCl, 0,1 % Tween-20, 0,1% Thimersol enthalten sind) gewaschen und zu jeder Vertiefung werden 50 μl an biologischer Flüssigkeit (Synovialflüssigkeit, Serum oder Urin) 1 : 10, 1 : 20 oder 1 : 40 im Testpuffer (ELISA Waschpuffer, worin 0,1% BSA enthalten sind) verdünnt, wonach eine Zugabe von 50 μl/Vertiefung an Kaninchen-anti-COMP Peptidantikörper mit 0,7 μg/ml im Testpuffer erfolgt. Um die Konzentration des antigenen Materials in der biologischen Flüssigkeit zu bestimmen, wird eine Standardkurve mittels Standards (Lösungen mit bekannter Konzentration des Antigens) erstellt. Die Standards werden im Testpuffer unter Bildung von Endkonzentrationen von 1,5 nM, 4,6 nM, 11,5 nM, 34 nM, 46 nM, 115 nm und 463 nM hergestellt. Es wird dann zweifach durch die Zugabe von 50 μl/Vertiefung, gefolgt von einem Mischen mit 50 μl/Vertiefung des Kaninchen-anti-COMP Peptidantikörpers gete stet. Alle Proben, Standards und Synovialflüssigskeitsproben werden bei RT für 2 Stunden inkubiert, die Platte wird dreimal mit ELISA Waschpuffer gewaschen, wonach eine Zugabe von 100 μg/Vertiefung an Ziege-anti-Kaninchen IgG Antikörper erfolgt, der an alkalische Posphatase gekuppelt ist (Calbiochem, San Diego, CA) und durch die Verdünnung der Stammlösung 1 : 3000 im Testpuffer präpariert wurde. Nach 1 Stunde bei RT wird die Platte dreimal mit dem ELISA Waschpuffer gewaschen und der gebundene Antikörper wird durch die Zugabe von 100 μl/Vertiefung an p-Nitrophenylphosphatsubstratlösung (Sigma St. Louis, MO) und dem Messen der optischen Dichte (OD) bei 405 nm detektiert. Ein logisches Modell mit 4 Parametern der Gleichung y = (A – D)/(1 + (x/C)B) + D, worin y = OD405 nm x = nM H741, wird zur Erstellung einer Standardkurve verwendet. Die Konzentration des Antigens in der Synovialflüssigkeit wird dann mittels des Graphs auf einem Molecular Devices Mikrotiterplattenlesegerät extrapoliert, das an einem Macintosh Computer angeschlossen ist.
  • Ergebnisse
  • Das H741 COMP Antigen wird in mehreren Synovialflüssigkeiten von arthritischen Patienten erfolgreich quantifiziert. Die folgende Tabelle 1 fasst die Feststellungen zusammen.
  • Tabelle 1
    Figure 00100001
  • Die Daten zeigen deutlich, dass der ELISA Test quantitative Unterschiede zwischen den COMP Fragmenten bei den Patienten in verschiedenen Stufen des Krankheitsfortscliritts identifiziert.
  • 2. ELISA Sandwichtest
  • Die Mikrotiterplatten werden mit 1 μg/Vertiefung von Kaninchen-anti-Peptid H741 Antikörper im Kalten für 18 Stunden beschichtet. Die Vertiefungen werden mit 300 μl 2% BSA in PBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Es werden mehrere Verdünnungen von Synovialflüssigkeit oder Serum oder Urin in ELISA Waschpuffer (20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween-20, 0,1% Thmiersol) hergestellt, worin 0,1% BSA enthalten sind. 100 μl hiervon werden zu Mikrotiterplatten gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben werden mit ELISA Waschpuffer (viermal) gewaschen. 100 μl Antikörper, vorzugsweise monoklonaler Antikörper, gegen humanes COMP oder gegen Peptid H669 oder ein Antikörper gegen das isolierte 67–80 kDa COMP Fragment, der an alkalische Phosphatase gekuppelt ist, werden zu den Vertiefungen mit 1 μg/Vertiefung gegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Später werden die Vertiefungen dreimal mit dem ELISA Waschpuffer gewaschen und gebundener Antikörper wird wie vorher beschrieben quantifiziert. Es wird eine Standardkurve mittels gereinigtem COMP Abbauprodukt mit einem Molekulargewicht von etwa 20 kDa verwendet, um den Gehalt der unbekannten Probe zu quantifizieren.
  • Humane Synovialflüssigkeit oder Serum wird auf gesamtes nicht-abgebautes COMP durch ein vorher veröffentlichtes ELISA Verfahren analysiert (Saxne und Heinegard (1992), Br. J. Rheumatol 31: 583–591).
  • Beispiel 5
  • Quantifizierung von COMP Fragmenten bei Patienten mit arthritischen Erkrankungen
  • In diesem Beispiel wird die Synovialflüssigkeit als Quelle der COMP Fragmente verwendet und es wird ein anti-Peptidantikörper H741 in der Analyse verwendet. Das oben in den Beispielen 3 und 4 beschriebene Verfahren kann in der Analyse von COMP und dessen Fragmenten im Serum und möglicherweise der Fragmente (ausschließlich) im Urin angewendet werden.
  • Zuerst wird das Fragmentierungsmuster von COMP aus Synovialflüssigkeit nach einer Elektrophorese auf 14% SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen, gefolgt von einem Western Blot mit Kaninchen-anti-Peptidantikörper H741 Antikörpern bestimmt. In Abhängigkeit der Probe detektiert der Antikörper nur unter reduzierenden Bedingungen mehrere Banden, die bei scheinbaren Molekulargewichten von 33 kDa, 30 kDa, 20 kDa, 18 kDa, 16 kDa und 14,4 kDa auftreten. Die Menge an immunreaktivem Material wird durch Messen des Volumens jeder Bande durch Densitometrie quantifiziert. Das 94 Kilodaltonprotein ist das intakte COMP. Wie in Tabelle 2 gezeigt, gilt bei Osteoporose je schwerer die Erkrankung ist, desto größer ist die Anzahl an Fragmenten. Bei rheumatoider Arthritis ist das 20 kDa Fragment mit der Schwere der Erkankung erhöht. Dies zeigt dass der Typ und das Ausmaß der COMP Fragmentierung das Stadium des arthritischen Prozesses zeigen. Die LMW-COMP Marker sind nicht auf Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis bei gichtartigen arthritischen Zuständen beschänkt und die psoriatische Arthritis zeigt ein höheres Ausmaß an diesen Fragmenten. Tabelle 2
    Figure 00110001
    • –
    nicht messbar
  • Zweitens wird das gesamte antigene COMP durch die Zugabe aller Volumenanteile jedes des fragmentierten, immunreaktiven COMP quantifiziert (siehe Beispiele 3 und 5 oben). Das gesamte COMP wird durch COMP ELISA (Saxne und Heinegard (1992), Br. J. Rheumatology 31: 583–591) quantifiziert.
  • Eine Tabelle, die ein Verhältnis an fragmentiertem COMP zu gesamtem COMP umfasst, erlaubt eine Untersuchung des Ausmaßes an Knorpelabbau. In Tabelle 3 wird das insgesamt fragmentierte COMP, das durch Volumenmessungen gemessen wird, zur Erstellung eines solchen Verhältnisses verwendet.
  • Tabelle 3
    Figure 00120001
  • Auf der Grundlage der oben gezeigten Ergebnisse scheinen die Schwere der Erkrankung und der Typ der Erkrankung (psoriatisch arthritisch) ein größeres Verhältnis des fragmentierten COMP zum Gesamt-COMP und eine größere Anzahl an Fragmenten zu erzeugen. Dies legt nahe, dass die extrazelluläre Matrix des Knorpels einem signifikanten Abbau unterzogen wird. Daher ist es ein Ziel der Therapie, die Anzahl an COMP Fragmenten in der Synovialflüssigkeit (oder dem Serum/Urin) zu verringern und das Verhältnis von fragmentiertem COMP zu gesamtem COMP zu verringern. Das Verhältnis der COMP Fragmente zu anderen Komponenten der Synovialflüssigkeit ist auch ein Mittel um den Erkrankungsprozess zu evaluieren.
  • Beispiel 6
  • Evaluierung des arthritischen Zustands, der antiarthritischen Mittel und der chondroprotektiven Mittel
  • 1. Rheumatoide Arthritis
  • Die autoimmune Arthritis wird in Kaninchen durch Standardprotokolle induziert (Pettipher et al. (1988) Br. J. Pharmacol. 95: 169–176). Die Synovialflüssigkeit wird in mehreren Intervallen entnommen, während die Erkrankung fortschreitet. Die Synovialflüssigkeit wird mittels eines Antikörpers gegen das C-terminale COMP Peptid, das in Schafen erzeugt wurde, durch Western Blot oder ELISA analysiert.
  • 2. Osteoarthritis
  • Osteoarthritis wird in Kaninchenknien durch einen operativen Eingriff erzeugt (Colombo et al. (1983) Arthritis Rheum. 26: 875–886). Die Synovialflüssigkeit, das Serum und der Urin werden in mehreren Intervallen entnommen, während die Erkrankung fortschreitet. Die Analyse des COMP Fragments wird ausgeführt, wie dies in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist.
  • 3. Verhältnis des LMW-COMP Werts zum KS Wert
  • Die Synovialflüssigkeiten aus Beispiel 4.1 werden auf KS getestet. Die mittleren KS Werte (μg/ml) werden mittels etablierter Verfahren von G. V. Campion et al., Arthritis Rheum. 34 (10): 1254–1259, (1991) bestimmt und die mittleren COMP Fragmentwerte, die gemäß dem Verfahren von Beispiel 4.1 erhalten werden, werden mit den KS Gehalten verglichen, um das Verhältis des mittleren COMP Fragmentwerts pro mittlerem KS Wert zu bestimmen. Wie im folgenden in Tabelle 4 gezeigt, scheint der KS Gehalt unter den Gruppen ähnlich zu sein, jedoch verändert sich das Verhältnis des COMP Fragments zu KS, wenn die Erkrankung von mild über moderat zu schwer fortschreitet.
  • Tabelle 4
    Figure 00130001
  • Das Vollängen-COMP/KS Verhältnis ist bezüglich des Erkrankungsstadiums weniger sensitiv, als das LMW-COMP/KS Verhältnis.
  • Beispiel 7
  • Evaluierung der anti-arthritischen Mittel und chondroprotektiven Mittel beim Menschen
  • Es wird Synovialflüssigkeit von Patienten mit entweder Osteoarthritis oder rheumatoider Arthritis erhalten. Eine 20 μl umfassende Probe Synovialflüssigkeit wird mit Hyaluronidase behandelt, erhitzt und dann entweder mit einem nicht-reduzierenden Puffer oder einem reduzierenden Puffer behandelt und anschließend auf einem SDS Gel gefahren, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Vorkommen von COMP und des niedermolekularen COMP Fragments wird mittels des geeigneten Antikörpers gemessen, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Tabelle 5 zeigt die Behandlung der Arthritisbedingungen, die weniger des LMW-COMP Fragments bilden, wenn die Behandlung mit einer starken antiarthritischen Verbindung erfolgt, wie Methotrexat oder Piroxicam.
  • Tabelle 5
    Figure 00140001
  • Die progressive Behandlung von arthritischen Zuständen wird durch die Ausführung eines Tests zur Messung der Menge an COMP Fragment während der Diagnose oder vor der Behandlung und dem Vergleich hiervon mit der Menge an COMP Fragment zu verschiedenen Zeitpunkten während des Behandlungsverlaufs verfolgt und gemessen. Auf diese Weise können niedergelassene Ärzte und Klinikärzte die Verabreichung von antiarhritischen Mitteln einstellen, um die Behandlung und Linderung des arthritischen Zustands zu optimieren.
  • Sequenzliste
    Figure 00150001
  • Figure 00160001

Claims (10)

  1. Test zur Messung der Menge an niedermolekularen Proteinfragmenten, die C-terminale Abbauprodukte von COMP sind und die Molekulargewichte im Bereich von etwa 14 bis etwa 33 Kilodalton gemäß SDS-PAGE (LMW-COMP) aufweisen, gekennzeichnet durch (1) Inkubation einer Körperflüssigkeitsprobe, die von einem Arthritispatienten erhalten wurde, unter reduzierenden Bedingungen, (2) Abtrennung von LMW-COMP von anderen COMP Komponenten in der Körperflüssigkeit unter reduzierenden Bedingungen, (3) Inkubation der Körperflüssigkeitsprobe mit einem anti-LMW-COMP Antikörper und (4) Messung der Menge an gebundenem anti-LMW-COMP Antikörper in der Körperflüssigkeitsprobe.
  2. Test nach Anspruch 1, worin die reduzierenden Bedingungen eine Lösung eines Reduktionsmittels sind, ausgewählt aus Dithiothreit und Mercaptoethanol.
  3. Test nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin der anti-LMW-COMP Antikörper ein Antikörper gegen ein synthetisches Peptid ist, ausgewählt aus dem Peptid der SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 oder SEQ ID Nr. 4.
  4. Test nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Messung der Menge an gebundenem anti-LMW-COMP Antikörper in der Körperflüssigkeitsprobe durch Western Blot oder ELISA erfolgt.
  5. Test nach Anspruch 2, worin die Körperflüssigkeit vor dem Schritt (4) einer Substanz ausgesetzt wird, die das Reduktionsmittel inaktiviert.
  6. Isoliertes LMW-COMP Protein, das ein niedermolekulares Proteinfragment umfasst, welches ein C-terminales Abbauprodukt von COMP ist und ein ungefähres Molekulargewicht von 33 kD, 30 kD, 20 kD, 18 kD, 16 kD oder 14,4 kD gemäß SDS-PAGE aufweist.
  7. Antikörper, der an ein niedermolekulares Proteinfragment bindet, das ein C-terminales Abbauprodukt von COMP ist, das ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20 kD gemäß SDS-PAGE aufweist.
  8. Kit zur Verwendung in einem Test nach Anspruch 1, der eine Lösung eines niedermolekularen Fragments enthält, das ein C-terminales Abbauprodukt von COMP ist und ein ungefähres Molekulargewicht von 33 kD, 30 kD, 20 kD, 18 kD, 16 kD oder 14,4 kD gemäß SDS-PAGE aufweist.
  9. Kit nach Anspruch 8, der ferner einen Antikörper umfasst, der an ein niedermolekulares Proteinfragment bindet, das ein C-terminales Abbauprodukt von COMP ist und ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 14 bis etwa 33 kD gemäß SDS-PAGE aufweist.
  10. Test zur Messung des Verhältnisses von niedermolekularen Proteinfragmenten, die C-terminale Abbauprodukte von COMP sind und Molekulargewichte im Bereich von etwa 14 bis etwa 33 kD gemäß SDS-PAGE (LMW-COMP) aufweisen, zu KS, gekennzeichnet durch (1) Messung der Menge an LMW-COMP in einer Körperflüssigkeitsprobe von einem Arthritispatienten gemäß Anspruch 1, (2) Messung der Menge an KS in der Körperflüssigkeitsprobe, und (3) Bestimmung des Verhältnisses von LMW-COMP zu KS.
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