DE69534619T2

DE69534619T2 - Verfahren zur bestimmung von normalem aglycan, bestimmungssatz und verfahren zur beurteilung von informationen bezüglich der gelenke

Info

Publication number: DE69534619T2
Application number: DE69534619T
Authority: DE
Inventors: Satosi Musashimurayama-shi MIYAUTI; Katuyuki Musashimurayama-shi HORIE
Original assignee: Seikagaku Corp
Current assignee: Seikagaku Corp
Priority date: 1994-02-19
Filing date: 1995-02-17
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2015-02-18
Also published as: US5948692A; WO1995022765A1; ATE310247T1; AU1717795A; EP0745850A1; AU705059B2; JP3694894B2; DE69534619D1; EP0745850B1; EP0745850A4

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf eine Technik, die auf wirkungsvolle Weise die Menge und Qualität der in die Synovialflüssigkeit abgegebenen Bestandteile der Knorpelmatrix als wichtige Informationsquelle über den Metabolismus der Matrix nutzt. Die Erfindung bezieht sich auf die biochemische Diagnose von Gelenkerkrankungen auf dem Gebiet der Orthopädie. Konkret gesprochen bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren und auf eine Messausrüstung bzw. Mess-Kit zur Bestimmung von normalem Aggrecan und auf ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen über das Gelenk.
Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das nur normales, in der Probe vorhandenes Aggrecan ermittelt bzw. nachweist, auf eine Messausrüstung (measurement kit), die für die Bestimmung verwendet wird, und auf ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen über das Gelenk, mit dem beurteilt werden kann, ob das Gelenk erkrankt oder normal ist, und das, basierend auf der Abwesenheit oder dem Vorhandensein eines signifikanten Unterschiedes zwischen der Menge des normalen Aggrecan und der des gesamten Proteoglycans in der Probe und den entsprechenden Mengen in einer Synovialflüssigkeit, die aus einem normalen Gelenk erhalten wurde, die Art des kranken Gelenkes bestimmen kann.
In der Erfindung ist mit dem Begriff "normales Aggrecan" Aggrecan gemeint, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist gut bekannt, dass in einem normalen Gelenkknorpel zwischen der Synthese und dem Abbau der Knorpelmatrix ein gutes Gleichgewicht aufrechterhalten wird, wohingegen in einem krankhaften Gelenkknorpel der Abbau der Knorpelmatrix ungeachtet der Art der Läsion bzw. Schädigung beschleunigt abläuft. Abbauprodukte der Knorpelmatrix werden zunächst in die Synovialflüssigkeit abgegeben, dann in das Blut verteilt und metabolisiert. Somit ist die Menge und Qualität eines jeden Bestandteils der Knorpelmatrix, der in die Synovialflüssigkeit abgegeben wird, eine wichtige Quelle der Information über den Metabolismus der Matrix. Proteoglycan, der Hauptbestandteil der Knorpelmatrix, ist dadurch gekennzeichnet, dass es geeignet ist, mit Hyaluronan ein Aggregat zu bilden, um zusammen mit dem Typ II-Kollagen in der Knorpelmatrix die riesige Masse der Matrixstruktur aufzubauen. Die Menge und Qualität des Aggrecans, des Hauptproteoglycans in der Knorpelmatrix, und seiner Zuckerkette, Glycosaminoglycan, ist ein Anhaltspunkt, um zu entscheiden, ob der Abbau der Knorpelmatrix beschleunigt erfolgt.
Ein herkömmliches Verfahren zum Nachweis bzw. Bestimmung von normalem Aggrecan besteht in der Messung der Menge des Hyaluronan-Aggrecan-Aggregats, das mittels Ultrazentrifugation (Heinegard, D., et al., J. Biol. Chem., 249, 4250 (1974)) und Gelchromatografie (Iwata, H., Shin Seikagaku Jikken Koza, Bd. 3, Kohlenhydrate II, S. 452–455, 15. April 1991, von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha herausgegeben) isoliert wird. Das Verfahren ist zeitaufwändig und erfordert eine große Probenmenge. Kalpaxis, D. L. (Int. J. Biochem. 17, S. 61–66, (1989)) offenbart eine Untersuchung über Aggrecan, in der aggregierte und deaggregierte Formen voneinander getrennt werden.
Deshalb ist nun ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan erforderlich; d.h. ein Verfahren, das eine kürzere Zeitdauer und eine kleinere Probenmenge erfordert. Es besteht auch Bedarf nach einem Verfahren, das die quantitative Beziehung zwischen einer Änderung des normalen Aggrecans und dem pathologischen Zustand eines Gelenkes klärt, um als Grundlage einer Arthritis-Diagnose oder der Entscheidung für einen therapeutischen Plan zu beurteilen, ob es sich um ein krankes oder normales Gelenk handelt, und die Art des kranken Gelenkes zu identifizieren.
Wie vorstehend beschrieben ist Proteoglycan in der Synovialflüssigkeit als Markermolekül für eine Arthritisdiagnose nützlich, obwohl bei einigen Arthritisarten die Konzentration des Proteoglycans kleiner als diejenige beim normalen Gelenk ist; somit weist eine erhöhte Konzentration an Proteoglycan nicht immer darauf hin, dass das Gelenk erkrankt ist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung beabsichtigt ein Verfahren zur Bestimmung eines neuen Markermoleküls für die Unterscheidung eines pathologischen Gelenks von einem normalen Gelenk zur Verfügung zu stellen. Darüberhinaus beabsichtigt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Markermoleküls, das verschiedene Arthritisarten mit unterschiedlichen Charakteristiken unterscheiden kann, zur Verfügung zu stellen.
Genauer gesagt beabsichtigt die Erfindung ein praktisches und sehr empfindliches Verfahren und eine Messausrüstung für den Nachweis von normalem Aggrecan in einer Probe, insbesondere in Körperflüssigkeiten, zur Verfügung zu stellen, und sie beabsichtigt ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen bezüglich des Gelenks unter Anwendung des Verfahrens und der Ausrüstung zur Verfügung zu stellen.
Noch genauer beabsichtigt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von normalem Aggrecan, das nur normales, in der Probe vorhandenes Aggrecan nachweisen kann, eine Ausrüstung für den Nachweis, und ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen bezüglich eines Gelenks zur Verfügung zu stellen, mit dem basierend auf der Abwesenheit oder dem Vorhandensein eines signifikanten Unterschiedes zwischen der Menge des normalen Aggrecans und der des gesamten Proteoglycans in der Probe und den Mengen in der Synovialflüssigkeit, die aus einem normalen Gelenk erhalten wurde, beurteilt werden kann, ob das Gelenk krankhaft oder normal ist.
Außerdem beabsichtigt die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen bezüglich eines Gelenks zur Verfügung zu stellen, das verschiedene Arten von kranken Gelenken unterscheiden kann.
Ein Bestandteil, der für den Knorpel spezifisch ist und die Empfindlichkeit des Metabolismus der Matrix widerspiegelt, ist als Markermolekül eines kranken Gelenkes nützlich. Aggrecan, das Hauptproteoglycan in der Knorpelmatrix, und seine Zuckerkette; Glycosaminoglycane (manchmal nachstehend als GAGs abgekürzt) befinden sich unter den Bestandteilen der Knorpelmatrix, die die Eigenschaften aufweisen, die für die Markermoleküle erforderlich sind.
Proteoglycan wird nachstehend charakterisiert:
Proteoglycan ist ein allgemeiner Ausdruck, der auf Substanzen angewandt wird, die aus einem Protein, genannt Kernprotein, und Glycosaminoglycanen bestehen, die kovalent an das Protein gebunden sind, und im Bindegewebe, der Zellmembran und ähnlichem auftreten, und jeweils eine eigene einzigartige Funktion aufweisen.
Das Hauptproteoglycan in dem Knorpel wird Aggrecan genannt, bei dessen Glycosaminoglycan-Ketten es sich um Chondroitinsulfat und Keratansulfat handelt.
Das Molekulargewicht des Kernproteins von normalem Aggrecan liegt in einem Bereich von 200.000 bis 300.000 und enthält zwei kugelförmige Domänen an der terminalen Aminogruppe (G1 und G2-Domänen der endständigen Position) und eine kugelförmige Domäne an der terminalen Carboxylgruppe (G3-Domäne). In der Knorpelmatrix ist normales Aggrecan an der G1-Domäne an Hyaluronan gebunden und bildet ein riesiges Aggregat. Dieses Aggregat wird durch das Vorhandensein eines Glycoproteins, das sogenannte Verknüpfungsprotein (link protein) stabilisiert (Molekulargewicht: 40.000 bis 50.000), das sowohl an normales Aggrecan als auch an Hyaluronan gebunden sein kann. Es existiert ein GAGs-gebundener Bereich zwischen den G2- und G3-Domänen, in dem eine Anzahl Chondroitinsulfat- und Keratansulfat-Reste als auch N- oder O-gebundene Oligosaccharide gebunden sind.
Chondroitinsulfat besteht aus Wiederholungseinheiten eines Dissaccharids, das aus N-Acetylgalactosamin und Glucuronsäure besteht, und es sind mehrere Disaccharidstrukturen mit unterschiedlichen Positionen des Sulfatrestes bekannt; wobei der Sulfatrest in ungefähr 90% des menschlichen Aggrecans an der 6-Position des N-Acetylgalactosamins (C6S) gebunden ist, und Strukturen, in denen der Sulfatrest an der 4-Position (C4S) gebunden ist, und Strukturen ohne Sulfatrest (C0S) werden in dieser Reihenfolge mit abnehmender Häufigkeit gefunden. Diese Strukturen treten nicht getrennt in verschiedenen Molekülen des Chondroitinsulfats auf, sondern werden in demselben Chondroitinsulfatmolekül gefunden.
Keratansulfat besteht aus Wiederholungseinheiten eines Disaccharids, das aus N-Acetylglucosamin und Galactose besteht. Zwei Strukturtypen sind bekannt: eine Monosulfatstruktur, die den Sulfatrest an der 6-Position des N-Acetylglucosamins enthält, und eine Disulfatstruktur, die die Sulfatreste an der 6-Position des N-Acetylglucosamins und derjenigen der Galactose enthält. Die Disulfatstruktur tritt im Aggrecan häufiger auf.
Da das Chondroitinsulfat wie vorstehend beschrieben eine Carboxylgruppe und eine Sulfatgruppe enthält, und das Keratansulfat eine Sulfatgruppe enthält, kann das Aggrecan eine große Menge an Wasser zurückhalten. Außerdem tritt wegen der gegenseitigen Abstoßung dieser negativen Ladungen die Tendenz auf, dass die Glycosaminoglycankette eine lockere Spulenform annimmt. Bei dem Aggrecan handelt es sich, selbst wenn es alleine auftritt, um ein hydratisiertes Molekül, das wegen der Eigenschaften seiner Glycosaminoglycankette einen großen Raum einnimmt, und in der Knorpelmatrix mit Hyaluronan, begleitet von dem Verknüpfungsprotein, aggregiert und ein riesiges hydratisiertes Gel bildet. Dieses Aggregat füllt den Zwischenraum des Typ II-Kollagenskeletts, so dass der Knorpel als charakteristischer elastischer Körper fungieren kann.
Es wurde berichtet, das die mit Arthritis verbundene Knorpelzerstörung mit dem Abbau von Aggrecan beginnt, und dass die Abspaltung von Aggrecan ungeachtet der Art der Arthritis hauptsächlich in dem Bereich zwischen den G1- und G2-Domänen stattfindet. Abgebautes Aggrecan, dem das G1 entzogen wurde, ist ungeeignet, Hyaluronan in der Matrix zu binden, und weist deshalb die Voraussetzungen auf, aus dem aufgelockerten Knorpel in die Synovialflüssigkeit abgegeben zu werden. Somit ist die Menge und Qualität des Aggrecans und seiner Abbauprodukte eine wichtige Quelle der Information über die Knorpelzerstörung.
Hyaluronan wird nachstehend charakterisiert:
Hyaluronan ist ein Glycosaminoglycan, das aus Wiederholungseinheiten eines Disaccharids besteht, das aus N-Acetylglucosamin und Glucuronsäure besteht, und obwohl seine Konzentration in der Knorpelmatrix gering ist, kommt ihm bei der Bildung von Proteoglycanaggregat, wie vorstehend beschrieben, eine wichtige Funktion zu. In der Synovialflüssigkeit bildet es einen Hauptbestandteil, der in einer Konzentration von 2 bis 3 mg/ml vorhanden ist, und von den Synovialzellen produziert wird. Das Molekulargewicht des Hyaluronans in der Synovialflüssigkeit ist groß, nämlich mehrere Millionen, so dass das Hyaluronan einen größeren Raum als die anderen Bestandteile einnimmt und eine große Menge an Wasser im Inneren des Moleküls zurückhält. Bei der in der Synovialflüssigkeit vorliegenden Konzentration überlappen die Hyaluronanmoleküle miteinander, was zu der Viskosität beiträgt, die für die Synovialflüssigkeit notwendig ist. D.h. das Molekulargewicht und die Konzentration des Hyaluronans in der Synovialflüssigkeit stehen in enger Beziehung zu der charakteristischen Viskosität der Synovialflüssigkeit.
Unter diesen Gesichtspunkten wurde die Beziehung zwischen der Konzentration an Aggrecan oder Glycosaminoglycan in einer Körperflüssigkeit, wie der Synovialflüssigkeit und das Blut, und die Art der Gelenkerkrankung untersucht. Die Konzentration solch eines Markermoleküls in der Synovialflüssigkeit ist bei einigen Arthritisarten merklich erhöht, wie Gicht-Arthritis oder traumatischer Arthritis (TA), wo die Knorpelzerstörung rasch voranschreitet, wohingegen die Änderung der Konzentration des Markermoleküls in der Synovialflüssigkeit oder dem Blut bei anderen Arten von Arthritis, wie Osteoarthritis (OA) und rheumatoide Arthritis, nicht sehr ausgeprägt ist, wo die Knorpelzerstörung langsam voranschreitet, so dass die Bestandteile der Knorpelmatrix allmählich freigesetzt werden.
Dies kann wie nachstehend erklärt werden:
Die Konzentration und die gesamte Menge (Konzentration multipliziert mit der Menge der Synovialflüssigkeit) eines Markermoleküls in der Synovialflüssigkeit variiert nicht nur entsprechend dem Ausmaß der Knorpelzerstörung, sondern auch entsprechend der Knorpelmenge, der Geschwindigkeit der Beseitigung der Abbauprodukte aus der Gelenkhöhle, und der Menge der Plasmabestandteile, die in die Synovialflüssigkeit transportiert wurden. Ein extremes Beispiel ist der Fall der rheumatoiden Arthritis in der Endstufe, in der wenig Gelenkknorpel existiert. Es verwundert nicht, dass die Konzentration des Aggrecan oder Glycosaminoglycans in der Synovialflüssigkeit in solch einem Fall kleiner als diejenige in der Synovialflüssigkeit in einem normalen Gelenk ist.
Um die Wirkung dieser Faktoren auszuschließen und den Krankheitszustand der Arthritis so genau wie möglich zu erkennen, ist es wesentlich, das Ausmaß des Abbaus oder der Denaturierung der Markermoleküle in der Synovialflüssigkeit oder im Serum zu ermitteln. Die Erfinder fanden, dass ein normales Gelenk und ein krankes Gelenk basierend auf dem Anteil von normalen Aggrecan, das geeignet ist, mit Hyaluronan ein Aggregat zu bilden, im Vergleich zu demjenigen anderer Proteoglycane, voneinander unterschieden werden können, und dass die Art der Arthritis basierend auf einen Vergleich des Anteils von normalem Aggrecan zu demjenigen anderer Proteoglycane identifiziert werden kann.
Normales Aggrecan, das die Hyaluronan-Bindungsregion (G1-Domäne) enthält, bildet mit Hyaluronan in der Synovialflüssigkeit ein Aggregat, und diese Eignung zur Bildung eines Aggregats ist ein nützlicher Hinweis auf das Ausmaß des Abbaus oder der Denaturierung von Aggrecan, da der Anteil an normalem Aggrecan (aggregierende Form) im gesamten Proteoglycan kaum von einem anderen Faktor als dem Abbau des Aggrecans beeinflusst wird. Die Erfinder fanden ebenfalls ein praktisches und genaues Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das geeignet ist, mit Hyaluronan ein Aggregat zu bilden.
Die Erfindung nutzt, basierend auf der Tatsache, dass der Anteil des normalen Aggrecans in dem gesamten Proteoglycan von kaum einem anderen Faktor als dem Aggrecan-Abbau beeinflusst wird, und der Tatsache, dass normales Aggrecan, das die Hyaluronanbindungsregion enthält, auch in der Synovialflüssigkeit mit Hyaluronan ein Aggregat bilden kann, die Eignung des Aggrecans zur Bildung eines Aggregats als Nachweisansatz.
Als erstes stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das Hyaluronan binden kann, zur Verfügung. Das Machweisverfahren in der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass nur normales Aggrecan nach der Abtrennung von normalem Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist, von Proteoglycanen, die zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet sind, nachgewiesen wird.
Die vorstehend erwähnte Abtrennung von normalem Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist, von Proteoglycanen, die zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet sind, besteht aus dem nachstehend beschriebenen Verfahren A und dem nachstehend beschriebenen Verfahren B.
Verfahren A: ein Verfahren zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenem Hyaluronan als auch von freiem Hyaluronan in der Probe der Körperflüssigkeit.
Verfahren B: ein Verfahren zur Abtrennung von normalem Aggrecan von anderen Proteoglycanen als dem normalen Aggrecan, wobei die in dem Verfahren A behandelte Probe in Kontakt mit einer festen Phase gebracht, die geeignet ist, normales Aggrecan zu binden oder zu absorbieren, so dass nur normales Aggrecan in der Probe an die feste Phase gebunden oder von der festen Phase adsorbiert werden kann.
Die Entfernung des Hyaluronans in der Probe in dem Verfahren A ist notwendig, da das Nachweisverfahren in der Erfindung auf der Eignung zur Hyaluronanbindung von normalem Aggrecan beruht, das in der Probe an Hyaluronan bindet. Für die Entfernung des Hyaluronans in der Probe werden Enzyme, die das Hyaluronan spezifisch abbauen können, oder Mittel zur Denaturierung von Proteinen verwendet.
Enzyme, die Hyaluronan abbauen können, schließen hyaluronan-abbauende Hyaluronidasen und die Chondroitinase ABC ("Tosa Kogaku", S. 282–315, 1. August 1992, von Sangyo Chosakai Kabushiki Kaisha veröffentlicht) ein.
Hyaluronidasen schließen ein Enzym, das aus einem Streptomyces-Mikroorganismus stammt (z.B. Streptomyces hyalurolyticus) (EC4.2.2.1), ein Enzym, das aus dem Echten Blutegel (EC3.2.1.36) stammt, ein Enzym, das aus dem Rinderhoden stammt (EC3.2.1.35), und ein Enzym ein, das aus einem Streptococcus-Mikroorganismus (z.B. Streptococcus dysgalactie) stammt, die alle im Handel von Seikagaku Corporation erhältlich sind.
Chondroitinase ABC (EC4.2.2.4) wird durch ein Enzym veranschaulicht, das aus einem Proteus-Mikroorganismus stammt (z.B. Proteus vulgaris) (von Seikagaku Corporation vermarktet). Mittel zur Denaturierung von Proteinen schließen 4 M Guanidinhydrochlorid und 7 M Harnstoff ein.
Für die Bedingungen der Behandlung in dem Verfahren A gibt es keine Einschränkungen, obwohl die Behandlung, wenn ein Enzym verwendet wird, unter Bedingungen erfolgt, die die optimale Temperatur und den optimalen pH-Wert für das Enzym berücksichtigen. Die Verwendung von Hyaluronidase ist für die anschließende Behandlung bevorzugt.
Wenn ein Mittel zur Denaturierung von Proteinen verwendet wird, kann ein zusätzliches Verfahren zur Abtrennung von normalem Aggrecan von Hyaluronan, wie eine Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unter Verwendung von Cäsiumchlorid oder Glycerol oder einer anderen Substanz, oder ein anderes geeignetes Verfahren (siehe Zoku Seikagaku Jikken Koza, Bd. 1, Approach on Complex Carbohydrates, Glycolipid and Proteoglycan, 16. Januar 1986, von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha, S. 253–263) erforderlich sein. Wenn Harnstoff als Mittel zur Denaturierung von Proteinen verwendet wird, kann als optionales Verfahren eine Anionenaustauschchromatografie (siehe dort, S. 265–275) angewandt werden. Anschließend wird die so abgetrennte Fraktion an normalem Aggrecan einer Verdünnung oder Dialyse zur Verringerung der Konzentration des gleichzeitig vorhandenen Mittels zur Denaturierung von Proteinen unterzogen, oder das Mittel zur Denaturierung von Proteinen wird entfernt. Eine Verringerung der Konzentration unter einen Wert von 0,4 M für das Guanidinhydrochlorid und unter einen Wert von 1,0 M für den Harnstoff reicht aus, um im Verfahren B normales Aggrecan an die feste Phase zu binden.
Die in dem Verfahren B verwendete feste Phase sollte geeignet sein, normales Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist, spezifisch zu binden oder zu adsorbieren. Solch eine feste Phase wird beispielhaft durch eine feste Phase wiedergegeben, auf der Hyaluronan immobilisiert worden ist. Genauer gesagt kann Hyaluronan mittels eines allgemeinen Verfahrens zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms, wie einem kovalenten Bindungsverfahren, einem physikalischen Adsorptionsverfahren und ähnlichem [siehe "Koteika Koso", 20. März 1975, von Kodansha Kabushiki Kaisha veröffentlicht, S. 9–75] immobilisiert werden.
Beispielsweise kann Hyaluronan durch eine kovalente Bindung zwischen den funktionellen Gruppen des Hyaluronans (Hydroxylgruppen und Carboxylgruppen) und denjenigen der festen Phase (Hydroxylgruppen, Carboxylgruppen, Aminogruppen und ähnliches) in Gegenwart eines Kondensationsmittels (z.B. eines wasserlöslichen Carbodiimids (WSC), wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, oder Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder ähnlichem) immobilisiert werden. Als die feste Phase sind Träger bevorzugt, die aus Polystyrol, Cellulose, Glas und ähnlichem mit funktionellen Gruppen, wie einer Aminogruppe, bestehen (Mikroplatte für den immunologischen Nachweis, für Chromatografie verwendeter Träger und ähnliches). Eine Mikroplatte für den immunologischen Nachweis ist in Hinblick auf eine einfache Praktikabilität und die hohe Empfindlichkeit bevorzugter.
In dem Verfahren B wird die Probe, die wie in dem Verfahren A beschrieben behandelt wurde, zunächst in Kontakt mit der vorstehend. erwähnten festen Phase gebracht, gefolgt von einer Abtrennung der Probe von der festen Phase (Dekantation, Filtration, Zentrifugation und ähnliches) und einem, falls erforderlich, Waschen, so dass andere Proteoglycane als normales Aggrecan von der festen Phase entfernt werden, und normales Aggrecan, das an die feste Phase gebunden wurde, wird nachgewiesen.
Es ist bevorzugt, dass gleichzeitig ein Reagens zur Stabilisierung der Bindung oder Adsorption von normalem Aggrecan an Hyaluronan verwendet wird, wenn die Probe in Kontakt mit der vorstehend erwähnten festen Phase gebracht wird. Die Reagentien zur Stabilisierung schließen ein Verknüpfungsprotein und ähnliches ein, das bevorzugt in einer Konzentration von 100 ng/ml bis 100 μg/ml vorhanden ist.
Ein mittels eines Verfahrens vom Stand der Technik erhaltenes Verknüpfungsprotein kann verwendet werden: solch ein Ver fahren vom Stand der Technik wird beispielhaft durch eine Cäsiumchlorid-Sedimentationsgleichgewichtszentrigfugation veranschaulicht, die in Zoku Seikagaku Jikken Koza, Bd. 4, Approach on Complex Carbohydrates, II, S. 253–263, 16. Januar 1986, von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht, beschrieben ist.
Die Abtrennung des vorstehend erwähnten, normalen Aggrecans, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist, von Proteoglycanen, die zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet sind, erfolgt auch durch eine auf dem Unterschied im Molekulargewicht beruhende Abtrennung des Aggregats von normalem Aggrecan, das in der Probe an Hyaluronan gebunden wurde, von den Proteoglycanen, die zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet sind. Für die auf dem Unterschied im Molekulargewicht basierende Abtrennung kann ein Filtergerät, das mit einem Membranfilter ausgestattet ist, und das Aggregat aus dem an Hyaluronan gebundenen normalem Aggrecan mittels Filtration gewinnen kann, oder eine Gerät für die Gelfiltration verwendet werden.
Wenn es sich bei der Probe um Synovialflüssigkeit handelt, die aus einem Gelenk gewonnen wurde, das untersucht werden soll, ist normales Aggrecan in der Probe an Hyaluronan gebunden und bildet ein riesiges Molekül mit einem Molekulargewicht von einigen Millionen oder mehr. Solch ein riesiges Molekül kann auf einem Membranfilter mit geeigneter Porengröße (0,1 bis 0,45 μm, bevorzugt ungefähr 0,2 μm) zurückgehalten werden, wohingegen Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist, den Membranfilter passiert. Verschiedene Membranfilter können zu diesem Zweck verwendet werden, und Membranfilter mit wenig nicht-spezifischer Adsorption, wie diejenigen, die aus Teflon gefertigt sind, sind bevorzugt.
Solch ein Membranfilter wird in einem geeigneten Filtergerät angeordnet, wo die Probe einer Druckfiltration oder einer Zentrifugalfiltration unterzogen wird. Wenn es sich bei der Probe um eine andere Körperflüssigkeit als die Synovialflüssigkeit handelt, ist eine Zugabe von Hyaluronan mit einem Molekulargewicht von einigen Hunderttausend zu der Probe zur Bildung eines Aggregats aus normalem Aggrecan, das an Hyaluronan gebunden ist (nachstehend manchmal als Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat bezeichnet) erforderlich.
In dem Nachweisverfahren der Erfindung wird so abgetrenntes, normales Aggrecan mittels einer Maßnahme zur Bestimmung von Proteoglycan nachgewiesen. Bei der Maßnahme, die zum Nachweis von Proteoglycan eingesetzt wird, handelt es sich um Maßnahmen zum spezifischen Nachweis von Keratansulfat oder Chondroitinsulfat, das an normales Aggrecan oder an das Kernprotein von normalem Aggrecan gebunden ist.
D.h. die Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan (nachstehend als "Nachweisverfahren 1" bezeichnet) zur Verfügung, das aus den nachstehend beschriebenen Verfahren A, B und C besteht.
Nachweisverfahren 1

Verfahren A: ein Verfahren zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von Hyaluronan, das an normales Aggrecan gebunden ist, als auch von freiem Hyaluronan in der Probe.
Verfahren B: ein Verfahren zur Abtrennung von normalem Aggrecan von anderen Proteoglycanen als dem normalen Aggrecan, wobei die in dem Verfahren A behandelte Probe in Kontakt mit einer festen Phase gebracht wird, die geeignet ist, normales Aggrecan zu binden oder zu adsorbieren, so dass nur normales Aggrecan in der Probe an die feste Phase gebunden oder adsorbiert werden kann, und
Verfahren C: ein Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das an die feste Phase gebunden oder adsorbiert ist.

Es ist bevorzugt, gleichzeitig ein Reagens zur Stabilisierung der Adsorption von normalem Aggrecan an die feste Phase zu verwenden, wenn die Probe in Kontakt mit der festen Phase in dem Verfahren B gebracht wird.
Normales Aggrecan wird auf der festen Phase mittels der Hyaluronan-Bindungsregion (G1-Domäne) an Hyaluronan gebunden. Normales Aggrecan, das mittels Hyaluronan an die feste Phase gebunden oder darauf adsorbiert ist, wird mittels verschiedener Maßnahmen zum Nachweis von Proteoglycan nachgewiesen. Zum Beispiel wird es durch Anfärben des an normalem Aggrecan gebundenen, sulfatisierten Glycosaminoglycans mit einem Farbstoff, wie 1,9-Dimethylmethylenblau, nachgewiesen. Es wird auch durch eine immunologische Quantifizierung (Immunoassay) oder eine immunologische Färbung (staining) mit einem Antikörper, der spezifisch gegen sulfatisiertes Glycosaminoglycan gerichtet ist, das an normalem Aggrecan gebunden ist, wie Chondroitinsulfat oder Keratansulfat, oder mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatografie nachgewiesen. Es können auch Antikörper verwendet werden, die gegen das Kernprotein von normalem Aggrecan gerichtet sind.
Mit der Erfindung wird eine quantitative Bestimmung von normalem Aggrecan beabsichtigt, das noch mindestens die Hyaluronan-Bindungsregion (G1-Domäne), die G2-Domäne und Glycosaminoglycan besitzt. Deshalb ist zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das mittels der Hyaluronan-Bindungsregion an die feste Phase gebunden oder darauf adsorbiert ist, ein Verfahren zum Nachweis von Glycosaminoglycan, wie Keratansulfat oder Chondroitinsulfat, bevorzugt. Die Verwendung eines gegen Chondroitinsulfat oder Keratansulfat gerichteten Antikörpers ist bevorzugt, um eine einfache Praktikabilität und eine ausreichende Empfindlichkeit zu gewährleisten.
Als Antikörper, der gegen Chondroitinsulfat oder Keratansulfat gerichtet ist, kann jeder spezifisch gegen solch ein sulfatisiertes Glycosaminglycan, das an normalem Aggrecan gebunden ist, gerichtete Antikörper verwendet werden.
Verschiedene gegen Chondroitinsulfat gerichtete monoklonale Antikörper sind bekannt, einige davon sind allgemein verfügbar (Shin Seikagaku Jikken Koza, Bd. 3, Carbohydrates II, S. 385–391, 15. April 1991, von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht; Antikörper mit den Namen CS-56, MO-225, MC21C, S54C, 3B3).
Darunter ist MO-225 ("Anti-Chondroitinsulfat (Typ-D)") im Handel von Seikagaku Corporation erhältlich (veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung (KOKAI TOKKYO KOHO) Nr. 137695/88).
Gegen Keratansulfat gerichtete monoklonale Antikörper sind bekannt und allgemein erhältlich (Shin Seikagaku Jikken Koza, Bd. 3, Carbohydrates II, S. 391–393, 15. April 1991, von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht; Antikörper mit dem Namen 1/20/5D4 oder 5D4). Der Antikörper 5D4 ist im Handel von Seikagaku Corporation erhältlich (J. Biol. Chem., 258, 8848 (1983), veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung (KOKAI TOKKYO KOHO) Nr. 224065/85).
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis von normalem Aggrecan zur Verfügung, das wie nachstehend beschrieben aus dem Verfahren A und dem Verfahren B besteht (nachstehend als "Nachweisverfahren 2" bezeichnet).
Nachweisverfahren 2

Verfahren A: ein auf dem Unterschied des Molekulargewichts basierendes Verfahren zur Abtrennung des Aggregats von normalem Aggrecan, das an Hyaluronan gebunden ist, von Proteoglycan, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist, in der Probe.
Verfahren B: ein Verfahren zur Bestimmung des Hyaluronan-Aggrecan-Aggregats, das auf dem Membran-Filter gewonnen wurde.

Das vorstehend erwähnte Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat, das von dem Membranfilter zurückgehalten worden war, wurde mit verschiedenen Maßnahmen nachgewiesen. Beispielsweise wird sulfatisiertes Glycosaminoglycan mit 1,9-Dimethylmethylenblau auf ähnliche Weise wie vorstehend beschrieben nachgewiesen.
Sulfatisiertes Glycosaminoglycan, wie Chondroitinsulfat oder Keratansulfat, wird auch unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers oder mittels Hochleistungsflüssigchromatografie nachgewiesen. Außerdem kann auch ein gegen das Kernprotein von normalem Aggrecan gerichteter Antikörper verwendet werden.
Die Erfindung beabsichtigt, normales Aggrecan, das mindestens die Hyaluronan-Bindungsregion (G1-Domäne), die G2-Domäne und Glycosaminoglycan besitzt, quantitativ zu bestimmen. Deshalb ist zum Nachweis von normalem Aggrecan, das mittels der Hyaluronan-Bindungsregion an der festen Phase gebunden oder adsorbiert ist, ein Verfahren zum Nachweis von Glycosaminoglycan bevorzugt. Die Verwendung eines gegen Chondroitinsulfat oder Keratansulfat gerichteten Antikörpers ist bevorzugt, um eine einfache Praktikabilität und eine ausreichende Empfindlichkeit zu gewährleisten.
Für die Probe gibt es keine Einschränkungen, aber bevorzugt handelt es dabei um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden Gelenk.
Nachstehend wird das Verfahren erklärt, das in der Erfindung unter Verwendung eines gegen Chondroitinsulfat oder Keratansulfat gerichteten Antikörpers zum Nachweis von normalem Aggrecan, das mittels der Hyualuronan-Bindungsregion an die feste Phase gebunden oder darauf adsorbiert ist, eingesetzt wird.
Das Kernprotein von normalem Aggrecan weist die Hyaluronan-Bindungsregion auf, die Hyaluronan spezifisch und reversibel bindet. Keratansulfat ist ein Glycosaminoglycan, das an mehreren Stellen kovalent an das Kernprotein von normalem Aggrecan gebunden ist und konzentriert in der KS-reichen Region nahe der Hyaluronan-Bindungsregion vorliegt.
Verschiedene Verfahren für einen Immunassay unter Verwendung der vorstehend erwähnten Antikörper, um Chondroitinsulfat und Keratansulfat in einer biologischen Probe quantitativ zu bestimmen, sind bekannt.
In der Literatur "Quantification of Keratan Sulfate in Blood as a Marker of Cartilage Catabolism in the Arthritis and Rheumatism" (Thonar et al, 1985, Bd. 28, S. 1367–1376) ist ein Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay-Immuntest (ELISA) unter Verwendung eines Anti-Keratansulfat-spezifischen monoklonalen Antikörpers für die quantitative Bestimmung von Keratansulfat in Serum menschlicher Erwachsener beschrieben.
Das vorstehend erwähnte Verfahren für die quantitative Bestimmung von Keratansulfat wird nachstehend an Hand eines Beispiels erklärt.
Verfahren a: Hyaluronan wird an eine feste Phase gebunden, um eine hyaluronan-immobilisierte feste Phase herzustellen,
Verfahren b: die in einem Verfahren zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenen Hyaluronan oder von freiem Hyaluronan in der Probe behandelte Probe und das Verknüpfungsprotein werden in Kontakt mit der festen Phase gebracht, die in dem Verfahren a erhalten wurde, gefolgt von einer Inkubation, so dass freies normales Aggrecan an Hyaluronan gebunden wird, das an die vorstehend erwähnte feste Phase gebunden wurde,
Verfahren c: das Produkt des Verfahrens b wird so in Kontakt mit einem keratansulfat-reaktiven Antikörper gebracht, dass der Antikörper an das Keratansulfat von normalem Aggrecan gebunden wird, das an Hyaluronan gebunden wurde, das an die vorstehend erwähnte feste Phase gebunden worden war,
Verfahren d: der vorstehend erwähnte Antikörper, der an das vorstehend erwähnte Keratansulfat gebunden wurde, wird nachgewiesen, und
Verfahren e: die Menge des an dem vorstehend erwähnten Keratansulfat gebundenen Antikörpers wird in die Menge an normalem Aggrecan in der Probe umgerechnet.
Der Anti-Keratansulfat-Antikörper, der in dem Verfahren c an die feste Phase (Mikroplatte und ähnliches) gebunden worden war, kann in dem Verfahren d unter Verwendung eines zweiten Antikörpers nachgewiesen werden, der gegenüber dem nachzuweisenden Antikörper reaktiv ist und mit einer geeigneten Markierungssubstanz, wie einem Enzym, einem Radioisotop, einer fluoreszierenden Substanz, Biotin, Avidin und ähnlichem, markiert worden ist.
Wenn der erste Antikörper beispielsweise ein monoklonaler Anti-Keratansulfat-Antikörper der Maus ist, kann der markierte zweite Antikörper ein Anti-Mausimmunoglobin-Antikörper sein, der an eine Markierungssubstanz gebunden ist. Beispielsweise sind diese zweiten Antikörper, die spezifisch gegen Immunoglobuline verschiedener Tierarten gerichtet sind und mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), 7-Amino-4-methylcumarin-3-acetat (AMCA), Biotin oder ähnlichem markiert wurden, von Jackson Co. im Handel leicht von Seikagaku Corporation erhältlich.
Wenn der zweite Antikörper ein peroxidase-markierter Antikörper ist, wird die Bindung zwischen dem ersten Antikörper, der an der festen Phase gebunden ist, und dem zweiten Antikörper üblicherweise mittels einer Farbreaktion mit Peroxidase nachgewiesen.
D.h. Wasserstoffperoxid, das Substrat der Peroxidase, und eine färbende Substanz (o-Phenylendiamin, 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) werden für diese Umsetzung verwendet, in der die Farbintensität der Menge der. Peroxidase proportional ist, die an die feste Phase gebunden ist, und die Extinktion wird bei einer Wellenlänge bestimmt, die für die verwendete färbende Substanz geeignet ist. Wenn es sich bei der festen Phase um eine Mikroplatte handelt, wird die Extinktion mit einem Mikroplatten-Leser [z.B. Wellreader SK601 (Seikagaku Corporation), MR600 (Dynatec Co.) und ähnliches] ermittelt.
Das vorstehend erwähnte Nachweisverfahren unter Verwendung des Anti-Keratansulfat-Antikörpers ist auch für einen Nachweis unter Verwendung des Anti-Chondroitinsulfat-Antikörpers einsetzbar.
Die Erfindung stellt Messausrüstungen zur Verfügung, die in dem Nachweisverfahren für normales Aggrecan verwendet werden. Solche Ausrüstungen werden beispielhaft durch eine Ausrüstung veranschaulicht, die in dem vorstehend beschriebenen Nachweisverfahren 1 (nachstehend als "Messausrüstung 1" abgekürzt) eingesetzt wird und aus den Reagentien A, B und C mit der nachstehenden Zusammensetzung besteht.
Messausrüstung 1

A: Ein Reagens zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenem Hyaluronan als auch von freiem Hyaluronan in der Probe,
B: eine feste Phase zur spezifischen Bindung oder Adsorption von normalem Aggrecan, und
C: ein Reagens zum Nachweis von normalem Aggrecan, das an die in B beschriebene feste Phase gebunden oder adsorbiert ist.

In der Messausrüstung 1 kann zur Stabilisierung der Bindung zwischen normalem Aggrecan und Hyaluronan oder zur Stabilisierung der Adsorption ein zusätzliches Reagens verwendet werden.
Das vorstehend erwähnte B ist eine feste Phase, um normales Aggrecan in der Probe dadurch zu binden oder adsorbieren, dass die mit dem vorstehend erwähnten A behandelte Probe in Kontakt mit der festen Phase gebracht wird, die geeignet ist, normales Aggrecan zu binden oder zu adsorbieren. Bei der festen Phase kann es sich um Mikroplatten und Träger für die Chromatografie handeln, in denen Hyaluronan kovalent gebunden oder physikalisch adsorbiert wurde, so dass normales Aggrecan in der Probe, das geeignet ist, Hyaluronan zu binden, selektiv gebunden oder adsorbiert werden kann. Mikroplatten für einen Immunassay, wie diejenigen für den Enzyme-Linked-Immunosorbend-Assay-Immuntest (ELISA), sind in Hinblick auf eine einfache Praktikabilität und eine hohe Empfindlichkeit erwünscht.
Die vorstehend erwähnten Reagentien zur Stabilisierung schließen ein Verknüpfungsprotein und ähnliches ein.
Das vorstehend erwähnte Reagens C ist ein Reagens zum spezifischen Nachweis von an normalem Aggrecan oder an das Kernprotein von normalem Aggrecan gebundenem Keratansulfat oder Chondroitinsulfat.
Die Erfindung stellt eine Messausrüstung zur Verfügung, die in dem Nachweisverfahren 2 (nachstehend als "Mess-Kit 2" abgekürzt) verwendet wird, und aus dem nachstehend beschriebenen Gerät A und dem nachstehend beschriebenen Reagens B besteht.
Messausrüstung 2

Gerät A: ein Gerät, das zu einer auf dem Molekulargewicht beruhenden Fraktionierung zur Trennung des Aggregats aus an Hyaluronan gebundenem normalem Aggrecan von Proteoglycan, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist, geeignet ist, und
Reagens B: ein Reagens zum Nachweis von normalem Aggrecan, das in Form eines Aggregats aus Hyaluronan und normalem Aggrecan abgetrennt wurde.

Bei dem vorstehend erwähnten Gerät A handelt es sich um ein Filtergerät, das mit einem Membranfilter ausgestattet ist, mit dem das Aggregat aus an Hyaluronan gebundenem normalem Aggrecan gewonnen werden kann.
Bei dem vorstehend erwähnten Reagens B handelt es sich um ein Reagens zum spezifischen Nachweis von an normalem Aggrecan oder dem Kernprotein von normalem Aggrecan gebundenem Keratansulfat oder Chondroitinsulfat.
Bei der Probe handelt es sich bevorzugt um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden Gelenk.
Das Gerät A besteht aus einem Membranfilter und einem Filtergerät zur Gewinnung von in der Probe an Hyaluronan gebundenem normalem Aggrecan (Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat) auf dem Membranfilter. Normales Aggrecan in der Probe ist an Hyaluronan gebunden und bildet ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht von einigen Millionen oder mehr. Dieses Makromolekül kann auf einem Membranfilter mit geeigneter Porengröße (0,1 bis 0,45 μm, bevorzugt ungefähr 0,2 μm) zurückgehalten werden, wohingegen Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist, den Membranfilter passiert. Verschiedene Arten von Membranfilter können zu diesem Zweck verwendet werden, und diejenigen mit geringer nicht-spezifischer Adsorption, wie diejenigen, die aus Teflon gefertigt sind, sind bevorzugt. Solch ein Membranfilter wird in einem geeigneten Filtergerät angeordnet und eine Probe wird unter geeignetem Druck oder mittels Zentrifugalkraft durch den Membranfilter filtriert. Zur Filtration einer anderen Körperflüssigkeit als der Synovialflüssigkeit ist eine Zugabe von Hyaluronan mit einem Molekulargewicht von einigen Hunderttausend oder mehr zu der Probe erforderlich, damit sich ein Hyaluronan-Aggrecan-Aggregat bilden kann.
Die Erfindung stellt dadurch, dass sie die vorstehend erwähnten Nachweisverfahren und Messausrüstungen verwendet, ein Verfahren zur Beurteilung von Informationen über ein Gelenk zur Verfügung. Wenn es sich bei der Probe um Synovialflüssigkeit handelt, liefert die Erfindung Informationen über den Metabolismus der Gelenkknorpelmatrix.
Die in normaler Synovialflüssigkeit auftretenden Proteoglycane, in denen normales Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist, ungefähr 38% ausmacht, werden nicht in großem Ausmaß abgebaut. Im Krankheitszustand, wie bei Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis macht normales Aggrecan, das zur Aggregatbildung geeignet ist, nur ungefähr 18% der Proteoglycane in der Synovialflüssigkeit aus. Der Unterschied im Prozentsatz spiegelt genau den Unterschied im Ausmaß des Abbaus der Knorpelmatrix wieder.
Die absolute Menge und der Prozentsatz von normalem Aggrecan und anderen Proteoglycanen wurde in Synovialflüssigkeit von normalen Subjekten und von Patienten mit Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis und traumatischer Arthritis (TA) bestimmt: die so erhaltenen Werte stellen auf charakteristische Weise den Krankheitszustand dar, und deshalb wird vermutet, dass diese Moleküle nützliche biochemische diagnostische Marker für den Krankheitszustand sind. Genauer gesagt sind die Konzentration von normalem Aggrecan und der Prozentsatz an normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan nützlich zur Unterscheidung von normalen Gelenken von kranken Gelenken, zum Verständnis der Krankheitszustände, wie der Art der Gelenkkrankheit, und der Erstellung der Prognose und der Beurteilung der Wirksamkeit der Therapien.
Nachstehend wird die Beziehung zwischen Arthritis und Glycosaminoglycan und den Proteoglycanen in der Synovialflüssigkeit und im Serum beschrieben.
Wie vorstehend beschrieben, werden Abbauprodukte von Proteoglycan aus der Knorpelmatrix in die Synovialflüssigkeit und dann ins Blut freigesetzt, wenn der Knorpel durch die Arthritis zerstört wird. Neueren Berichten zufolge über Glycosaminoglycan, einem Proteoglycan, dessen Menge sich mit dem Fortschreiten der Arthritis verändert, bestehen die Markermoleküle, die nachgewiesen werden, aus Keratansulfat, Chondroitinsulfat und sulfatisiertem Glycosaminoglycan (S-GAG), das die Summe der ersten beiden darstellt, und auch aus Proteoglycanfragmenten. Nachstehend sind die Veränderungen der Markermoleküle, d.h. Keratansulfat, Chondroitinsulfat, S-GAG und Proteoglycanfragmente, dargestellt.
1. Keratansulfat
Ein spezifischer monoklonaler Antikörper ist im Handel erhältlich, so dass dieses Markermolekül ausgiebig mittels ELISA oder einem Radioimmunassay (RIA) untersucht wurde. Seine Konzentration in der Synovialflüssigkeit nimmt deutlich bei Gicht oder reaktiver Arthritis zu. Seine Konzentration im Blut soll laut einigen Berichten bei der Osteoarthritis (OA) und der rheumatoiden Arthritis (RA) zunehmen oder laut anderen Berichten nur wenig Änderung zeigen.
2. Chondroitinsulfat
Über das Ergebnis einer Bestimmung von ungesättigten Disacchariden mittels HPLC, die durch Digestion bzw. Aufschließen mit Chondroitinase ABC erzeugt wurden, wurde berichtet. Die Konzentration von C6S unter den Chondroitinsulfat-Isomeren ist, ähnlich wie die Konzentration des Keratansulfats, bei der traumatischen Arthritis bemerkenswert hoch, was vermutlich die rapide Zerstörung des Knorpels widerspiegelt. Die C4S-Konzentration in der Synovialflüssigkeit ist bei der rheumatoiden Arthritis höher als bei der Osteoarthritis, und das C6S/C4S-Verhältnis ist bei der rheumatoiden Arthritis kleiner als bei der Osteoarthritis und der traumatischen Arthritis. C4S kann aus der Synovialmembran oder dem Serum stammen, was möglicherweise eine Synovitis bei der rheumatoiden Arthritis widerspiegelt.
3. Sulfatisiertes Glycosaminoglycan (S-GAG)
Es kann wohl angenommen werden, dass seine Konzentration die Summe aus der Konzentration des Chondroitinsulfats und derjenigen des Keratansulfats in der Synovialflüssigkeit wiedergibt. Die Konzentration wird praktischerweise mit einem Farbstoff (1,9-Dimethylmethylenblau: DMB) ermittelt, mit dem die S-GAG-Konzentration spezifisch bestimmt werden kann. Die Konzentration in der Synovialflüssigkeit ist bei Gicht und reaktiver Arthritis merklich erhöht, bei der Osteoarthritis oder der rheumatoiden Arthritis jedoch hingegen nicht bemerkbar erhöht.
4. Proteoglycanfragmente
Die Konzentration eines jeden Fragments wird mit einem Antikörper, der für jedes Aggrecan-Fragment spezifisch ist, zur Klärung des Metabolismus, des Abbaus und des Freisetzungsmechanismus des Aggrecans ermittelt. Die Konzentration des glycosaminoglycan-reichen Fragments in der Synovialflüssigkeit kann sich auf gleiche Weise wie diejenige des S-GAG ändern. Die Konzentration der hyaluronan-bindenden Region ist auf der Anfangsstufe der rheumatoiden Arthritis niedrig und nimmt mit dem Fortschreiten der Krankheit zu. Es wird angenommen, dass dies auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die hyaluronan-bindende Region in der Gelenkmatrix auf der Anfangsstufe der Knorpelzerstörung erhalten bleibt.
5. Zusammenfassung
Bei der Gicht oder der traumatischen Arthritis, bei der die Knorpelzerstörung rasch voranschreitet, werden deutlich erhöhte Konzentrationen der vorstehend erwähnten Markermoleküle in der Synovialflüssigkeit beobachtet. Bei der Osteoarthritis oder der rheumatoiden Arthiritis, bei der die Knorpelzerstörung langsam voranschreitet, ändern sich die Konzentrationen der Markermoleküle in der Synovialflüssigkeit oder dem Serum nicht sehr deutlich, da die Knorpelbestandteile nur allmählich bzw. langsam freigesetzt werden.
Um den Arthritiszustand so genau wie möglich zu verstehen, ist es erforderlich, das Ausmaß des Abbaus oder der Degeneration der Markermoleküle in der Synovialflüssigkeit oder im Serum zu kennen.
Das Verfahren zur Beurteilung der Informationen über ein Gelenk in der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Information über die Menge an normalem Aggrecan in der Probe erhalten wird, und die so ermittelte Information wird dann als Information von einem kranken Gelenk beurteilt, falls ein deutlicher Unterschied beobachtet wird, und sie wird dann als Information von einem normalen Gelenk beurteilt, falls kein deutlicher Unterschied gefunden wird, wenn die Information mit der vorher erhaltenen Information über die Menge des normalen Aggrecan und der Menge des gesamten Proteoglycans in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk verglichen wird.
Die Informationen über die Menge an normalem Aggrecan in der Probe wird durch die Bestimmung der Konzentration von normalem Aggrecan in der Probe mittels des vorstehend erwähnten "Nachweisverfahrens 1" oder des vorstehend erwähnten "Nachweisverfahrens 2" und die zusätzliche Bestimmung der Konzentration des gesamten Proteoglycans erhalten, so dass der Prozentsatz von normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan berechnet werden kann.
Das Auftreten des vorstehend erwähnten deutlichen Unterschieds bedeutet, dass der berechnete Prozentsatz an normalem Aggrecan am gesamten Proteoglycan in der Probe merklich niedriger als der vorher ermittelte Prozentsatz an normalem Aggrecan am gesamten Proteoglycan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk ist.
Wenn solch ein deutlicher Unterschied gefunden wird, wird angenommen, dass diese Information auf einen Krankheitszustand hinweist, der aus der Gruppe von Krankheiten ausgewählt ist, die Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, traumatische Arthritis und Gicht einschließt.
Die vorstehend erwähnte Information über die Menge an normalem Aggrecan in der Probe wird durch die Bestimmung der Konzentration von normalem Aggrecan in der Probe mittels des vorstehend erwähnten Nachweisverfahrens 1 oder des vorstehend erwähnten Nachweisverfahrens 2 und zusätzlich durch die Bestimmung der Konzentration des gesamten Proteoglycans in der Probe, gefolgt von der Berechnung der Konzentration des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan aus dem Unterschied zwischen der Konzentration des gesamten Proteoglycans und derjenigen des normalen Aggrecans, ermittelt.
Das Auftreten des vorstehend erwähnten deutlichen Unterschieds bedeutet, dass die Konzentration an normalem Aggrecan in der Probe merklich geringer als die vorher ermittelte Konzentration an normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk ist und dass gleichzeitig die Konzentration des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan in der Probe sich nicht merklich von der vorher ermittelten Konzentration des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk unterscheidet. Das Auftreten eines merklichen Unterschieds wird als Hinweis auf eine Osteoarthritis, eine rheumatoide Arthritis und ähnliches angesehen, bei der die Knorpelzerstörung langsam voranschreitet, und das Fehlen eines merklichen Unterschieds wird als Hinweis auf ein normales Gelenk betrachtet.
Der vorstehend erwähnte deutliche Unterschied wird bei verschiedenen Zuständen beobachtet. Beispielsweise wird in Fällen, in denen die Konzentration von normalem Aggrecan in der Probe sich nicht von der zuvor ermittelten Konzentration von normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk unterscheidet und gleichzeitig die Konzentration des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan in der Probe deutlich höher als die vorher ermittelte Konzentration des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk ist, ein merklicher Unterschied gefunden. Das Auftreten des vorstehend erwähnten deutlichen Unterschieds wird als Information über eine Art von Arthritis angesehen, bei der die Knorpelzerstörung rasch voranschreitet, wie traumatischer Arthritis oder Gicht, während die Abwesenheit eines deutlichen Unterschieds als Information über ein normales Gelenk betrachtet wird.
Bei der vorstehend erwähnten Probe handelt es sich bevorzugt um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden Gelenk.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird besser unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele beschrieben. Die Erfindung ist in keinster Weise auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Es wird ein Beispiel für die Bestimmung der Konzentration von normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit mittels des Nachweisverfahrens 1 beschrieben.
(1) Ein Verfahren zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenem Hyaluronan oder von freiem Hyaluronan in der Probe
Ungefähr 10 mg Synovialflüssigkeit einer normalen Versuchsperson oder eines Patienten mit Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis oder traumatischer Arthritis wurden genau eingewogen und 10fach mit destilliertem Wasser verdünnt. Zu 80 μl der verdünnten Flüssigkeit wurden 5 TRU (Turbidity Reducing Unit – Trbungsreduktionseinheit)/50 μl Hyaluronidase, die von einem Streptomyces sp.-Mikroorganismus stammte (Seikagaku Corporation), 80 μl eines 100 mM Natriumacetatpuffers (pH-Wert: 6,0) und 80 μl einer Lösung eines Proteaseinhibitors (100 mM 6-Aminocapronsäure, 10 mM Natriumethylendiamintetraacetat, 10 mM N-Ethylmaleimid, 10 mM Phenylmethansulfonylfluorid) gegeben, gefolgt von einer 2stündigen Digestion bei 40°C. Mittels dieser Behandlung wurde Hyaluronan in der Probe zu Tetra- oder Hexasacchariden abgebaut, die die Eignung zur Bindung von normalem Aggrecan verloren hatten.
(2) Ein Verfahren, in dem die wie vorstehend beschrieben behandelte Probe in Kontakt mit einer festen Phase gebracht wird, die zur Bindung oder zur Adsorption von normalem Aggrecan geeignet ist, so dass normales Aggrecan in der Probe an die feste Phase gebunden wird oder von der festen Phase adsorbiert wird
Zu der behandelten Probe wurde eine geeignete Menge eines Hyaluronidase-Inhibitors (Quecksilberchlorid, Kaliumhexacyanoferrat(III), und ähnliches) gegeben und ein Teil der so behandelten Probe wurden auf eine Platte gegeben, die 96 Vertiefungen bzw. Löcher aufwies (96-well plate, Mikroplatte), und an die Hyaluronan kovalent gebunden worden war. In diesem Beispiel wurde eine Aminoplatte verwendet, die von Sumitomo Bakelite Co. hergestellt worden war, und an die Hyaluronan unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbo diimid kovalent gebunden worden war. Nach einer 4stündigen Inkubation bei 15°C wurde die Platte ausreichend mit einem Lochplatten-Reinigungsgerät gewaschen.
(3) Ein Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das an die feste Phase gebunden ist oder von der festen Phase adsorbiert wurde.
Eine Lösung eines monoklonalen Anti-Keratansulfat-Antikörpers (Klon-Name: 5D4, Unterklasse IgG_I, von Seikagaku Corporation hergestellt) wurde auf die Lochplatte gegeben und zwei Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Die Lochplatte wurde gewaschen, es wurde peroxidase-markierter Anti-Maus-IgG-Antikörper (von Seikagaku Corporation hergestellt) zugegeben, und die Lochplatte wurde weitere zwei Stunden bei 4°C stehen gelassen. Nach dem Waschen und dem Anfärben mit o-Phenylendiamin entsprechend dem herkömmlichen Verfahren wurde die Extinktion mit einem Lochplatten-Leser (Well-reader SK60) (Seikagaku Corporation) ermittelt. Die Konzentration an normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit wurde aus einer unabhängig unter Verwendung von Rinderaggrecan (von Seikagaku Corporation hergestellt) erstellten Kalibrierungskurve berechnet.
Die Zugabe von 1 μg eines Verknüpfungsproteins, das getrennt vorbereitet worden war, zu der Probe, wenn die Probe in Kontakt mit der vorstehend erwähnten festen Phase gebracht wurde, mittels eines Verfahrens, das dem vorstehend beschriebenen Verfahren gleicht, lieferte Ergebnisse, die denjenigen glichen, die nachstehend beschrieben sind. Die Vorbereitung des verwendeten Verknüpfungsproteins erfolgte mittels der in Zoku Seikagaku Jikken Koza, Bd. 4, Approach on Complex Carbohydrates II, S. 253–263, 16. Jan. 1986, von Tokyo Kagaku Dojin Kabushiki Kaisha veröffentlicht, beschriebenen Cäsiumchlorid-Sedimentationsgleichgewichtszentrigfugation.
(4) Ergebnisse
Tabelle 1 listet die Konzentration von normalem Aggrecan, die Konzentration von anderem Proteoglycan (PG) als normalem Aggrecan, und den Prozentsatz an normalem Aggrecan im ge samten Proteoglycan in der menschlichen Synovialflüssigkeit auf, die mittels der vorstehend erwähnten Verfahren bestimmt wurden.
Die Konzentration des gesamten Proteoglycans wurde unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Keratansulfat-Antikörpers und von Rinderaggrecan als Standard, entsprechend einem früher berichteten Verfahren (Ratcliffe, A., et al.: Ann. Rheum. Dis., 47, 826 (1988)) bestimmt. Die Konzentration an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan wurde durch Subtraktion der Konzentration von normalem Aggrecan von derjenigen des gesamten Proteoglycans berechnet. Tabelle 1

Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung
Ein Signifikanztest erfolgte bei einem Unterschied zu den Normalwerten
*: p < 0,05
**: P < 0,01

Obwohl die Anzahl der Versuchspersonen klein war, nämlich 4 bis 10 betrug, war der Prozentsatz an normalem Aggrecan in kranken Gelenken deutlich geringer, was darauf hindeutet, dass Aggrecan in diesen Gelenken abgebaut worden war. Die Konzentration an normalem Aggrecan war bei Osteoarthritis (OA) oder rheumatoider Arthritis (RA) deutlich niedriger, unterschied sich aber nicht bei der traumatischen Arthritis (TA) im Vergleich zu normalen Versuchspersonen. Die Konzentration an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan war bei traumatischer Arthritis (TA) jedoch charakteristisch erhöht. Somit ermöglicht die Bestimmung der Konzentration und des Prozentsatzes von normalem Aggrecan eine Unterscheidung der Gelenkerkrankung und liefert Informationen über die Knorpelzerstörung.
Die Konzentration an C6S, das als Markermolekül angesehen wird, war bei traumatischer Arthritis deutlich höher als bei normalen Versuchspersonen, obwohl sie sich bei der Osteoarthritis nicht von der normaler Versuchspersonen unterschied und bei der rheumatoiden Arthritis eher niedriger war.
Mittels des Nachweisverfahrens 2 wurden bei den gleichen Proben ebenfalls ähnliche Ergebnisse erhalten.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die Erfindung ist für die biochemische Diagnose von Gelenkerkrankungen auf dem Gebiet der Orthopädie nützlich. Die Bestimmung der Konzentration von normalem Aggrecan und des Prozentsatzes an normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan ist für die Unterscheidung zwischen einem normalen Gelenk und einem kranken Gelenk, zum Verständnis der Krankheitszustände, wie der Art der Gelenkerkrankung und der Erstellung der Prognose, als auch für die Beurteilung der Wirkung der Therapien nützlich.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Abtrennung von normalem Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist, von jeglichem Proteoglycan in der Probe der Körperflüssigkeit, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist, nur die Menge des normalen Aggrecans in der Probe der Körperflüssigkeit bestimmt wird, wobei die Abtrennung von normalem Aggrecan, das zur Bindung von Hyaluronan geeignet ist, von jeglichem Proteoglycan in der Probe der Körperflüssigkeit, das zur Bindung von Hyaluronan ungeeignet ist, die nachstehenden Verfahren A und B umfasst: Verfahren A: ein Verfahren zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenem Hyaluronan als auch von freiem Hyaluronan in der Probe der Körperflüssigkeit. Verfahren B: ein Verfahren zur Abtrennung von normalem Aggrecan von anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan, wobei die in dem Verfahren A behandelte Probe der Körperflüssigkeit in Kontakt mit einer festen Phase gebracht wird, die zur Bindung oder Adsorption von normalem Aggrecan geeignet ist, so dass nur normales Aggrecan in der Probe der Körperflüssigkeit an die feste Phase gebunden oder an der festen Phase adsorbiert werden kann.
Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zur Bestimmung von nur normalem Aggrecan ein Verfahren zur Bestimmung von abgetrenntem normalen Aggrecan mittels einer Maßnahme zur Bestimmung von Proteoglycan umfaßt, bei der es sich um eine Maßnahme zur spezifischen Bestimmung von an Proteoglycan oder dem Kernprotein von Proteoglycan gebundenem Keratansulfat oder Chondroitinsulfat handelt.
Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Maßnahme zur Bestimmung von Proteoglycan aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer immunologischen Quantifizierung; einer immunologischen Färbung mit einem Antikörper, der spezifisch gegen an normales Aggrecan gebundenes sulfatisiertes Glycosaminoglycan gerichtet ist, wie Chondroitinsulfat oder Keratinsulfat; und gegen das Kernprotein von normalem Aggrecan gerichteten Antikörpern besteht.
Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Probe der Körperflüssigkeit um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden Gelenk handelt.
Messausrüstung für die Bestimmung von normalem Aggrecan, die geeigneterweise für das Verfahren zur Bestimmung von normalem Aggrecan nach Anspruch 1 eingesetzt wird, und die nachstehenden Reagentien A, B und C umfasst: A: ein Reagens zum Abbau oder zur Entfernung sowohl von an normalem Aggrecan gebundenem Hyaluronan als auch von freiem Hyaluronan in der Probe der Körperflüssigkeit, B: eine feste Phase zur spezifischen Bindung oder Adsorption von normalem Aggrecan, und C: ein Reagens zur Bestimmung von normalem Aggrecan, das an die im vorstehenden B beschriebene feste Phase gebunden oder adsorbiert ist.
Messausrüstung für die Bestimmung von normalem Aggrecan nach Anspruch 5, in der das Reagens C ein Reagens zur spezifischen Bestimmung von an dem normalen Aggrecan oder dem Kernprotein von normalem Aggrecan gebundenem Keratansulfat oder Chondroitinsulfat ist.
Messausrüstung für die Bestimmung von normalem Aggrecan nach einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei es sich bei der Probe der Körperflüssigkeit um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden Gelenk handelt.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk, wobei Information über die Menge an normalem Aggrecan und die Menge an dem gesamten Proteoglycan in einer Probe einer Körperflüssigkeit ermittelt wird, und die so ermittelte Information als Information gewertet wird, die von einem erkrankten Gelenk stammt, falls ein statistisch signifikanter Unterschied festgestellt wird, und als Information gewertet wird, die von einem normalen Gelenk stammt, falls kein statistisch signifikanter Unterschied gefunden wird, wenn die Information mit der zuvor erhaltenen Information über die Menge an normalem Aggrecan und die Menge an dem gesamten Proteoglycan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk verglichen wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Ermittlung von Information über die Menge an normalem Aggrecan und die Menge des gesamten Proteoglycans in der Probe der Körperflüssigkeit in der Bestimmung der Konzentration des normalen Aggrecans in der Probe der Körperflüssigkeit und auch der Konzentration des gesamten Proteoglycans in der Probe der Körperflüssigkeit mittels des Verfahrens zur Bestimmung von normalem Aggrecan nach Anspruch 1 und der Berechnung des Prozentsatzes von normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan besteht.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftreten des statistisch signifikanten Unterschieds bedeutet, dass der berechnete Prozentsatz von normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan in der Probe der Körperflüssigkeit statistisch signifikant niedriger als der vorher ermittelte Prozentsatz von normalem Aggrecan im gesamten Proteoglycan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk ist.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein statistisch signifikant niedrigerer Prozentsatz als eine Information angesehen wird, die von einem erkrankten Gelenk mit einer Krankheit stammt, die aus der Gruppe von Krankheiten ausgewählt ist, die aus Osteoarthritis, rheumatoider Arthritis, traumatischer Arthritis und Gicht besteht.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftreten des statistisch signifikanten Unterschieds bedeutet, dass die Konzentration an normalem Aggrecan in der Probe der Körperflüssigkeit statistisch signifikant niedriger als die vorher ermittelte Konzentration an normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk ist, und dass die Konzentration an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan in der Probe der Körperflüssigkeit sich nicht statistisch signifikant von der vorher ermittelten Konzentration an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk unterscheidet.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Information als Hinweis auf eine Art von Arthritis angesehen wird, in der die Knorpelzerstörung langsam voranschreitet, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in der Konzentration an normalem Aggrecan auftritt.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Auftreten des statistisch signifikanten Unterschieds bedeutet, dass die Konzentration an normalem Aggrecan in der Probe der Körperflüssigkeit sich nicht statistisch signifikant von der vorher ermittelten Konzentration an normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk unterscheidet, und dass die Konzentration an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan in der Probe der Körperflüssigkeit statistisch signifikant höher als die vorher ermittelte Konzentration an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan in der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk ist.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Information als Hinweis auf eine Art von Arthritis angesehen wird, in der die Knorpelzerstörung rasch voranschreitet, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in der Konzentration an anderem Proteoglycan als normalem Aggrecan auftritt.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Probe der Körperflüssigkeit um Synovialflüssigkeit aus dem zu untersuchenden Gelenk handelt.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 8, das die nachstehenden Schritte umfasst: a) Bereitstellung von Synovialflüssigkeit, die aus einem Gelenk erhalten wurde, das in Verdacht steht, an Arthritis zu leiden; b) Bestimmung des normalen Aggrecans in der Synovialflüssigkeit unter Anwendung des Bestimmungsverfahrens nach Anspruch 2; c) Bestimmung der Konzentration A des normalen Aggrecans in der Synovialflüssigkeit; d) Bestimmung der Konzentration B des gesamten Proteoglycans, das sowohl normales Aggrecan als auch anderes Proteoglycan einschließt, in der Synovialflüssigkeit; e) Berechnung des Verhältnisses aus der Konzentration A des normalem Aggrecans, die in Schritt c) erhalten wurde, zu der Konzentration B des gesamten Proteoglycans, die in Schritt d) erhalten wurde, d.h. von A/B; und f) Bestimmung als eine Arthritis, wenn das Verhältnis A/B im Vergleich mit dem entsprechenden Wert, der unter Heranziehung der Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk gemessen wurde, statistisch signifikant abnimmt.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 8, das die nachstehenden Schritte umfasst: a) Bereitstellung von Synovialflüssigkeit, die aus einem Gelenk erhalten wurde, das in Verdacht steht, an Arthritis zu leiden; b) Bestimmung des normalen Aggrecans in der Synovialflüssigkeit unter Anwendung des Bestimmungsverfahrens nach Anspruch 2; c) Bestimmung der Konzentration A des normalen Aggrecans in der Synovialflüssigkeit; d) Bestimmung der Konzentration B des gesamten Proteoglycans, das sowohl normales Aggrecan als auch anderes Proteoglycan einschließt, in der Synovialflüssigkeit; e) Berechnung des Unterschiedes, d.h. der Konzentration B-A, zwischen der Konzentration B des gesamten Proteoglycans, die in Schritt d) erhalten wurde, und der Konzentration A des normalen Aggrecans, die in Schritt c) erhalten wurde; f) Vergleich der Konzentration A des normalen Aggrecans und der Konzentration B-A des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan mit den entsprechenden Werten A' und B'-A', die jeweils den Werten A und B-A entsprechen und unter Heranziehung von Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk gemessen wurden; und g) Bestimmung als eine Arthritis, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied der Konzentration A oder der Konzentration B-A von der Konzentration A' oder der Konzentration B'-A' auftritt.
Verfahren zur Beurteilung von Information über ein Gelenk nach Anspruch 8, bei dem es sich um ein Diagnoseverfahren für Arthritis handelt, und das die nachstehenden Schritte umfasst: a) Bereitstellung von Synovialflüssigkeit, die aus einem Gelenk erhalten wurde, das in Verdacht steht, an Arthritis zu leiden; b) Bestimmung des normalen Aggrecans in der Synovialflüssigkeit unter Anwendung des Bestimmungsverfahrens nach Anspruch 2; c) Bestimmung der Konzentration A des normalen Aggrecans in der Synovialflüssigkeit; d) Bestimmung der Konzentration B des gesamten Proteoglycans, das sowohl normales Aggrecan als auch anderes Proteoglycan einschließt, in der Synovialflüssigkeit; e) Berechnung des Unterschiedes, d.h. der Konzentration B-A, zwischen der Konzentration B des gesamten Proteoglycans, die in Schritt d) erhalten wurde, und der Konzentration A des normalen Aggrecans, die in Schritt c) erhalten wurde; f) Vergleich der Konzentration A des normalen Aggrecans und der Konzentration B-A des anderen Proteoglycans als normales Aggrecan mit den entsprechenden Werten A' und B'-A', die jeweils den Werten A und B-A entsprechen und unter Heranziehung von Synovialflüssigkeit aus einem normalen Gelenk gemessen wurden; und g) Bestimmung als eine Arthritis mit langsam voranschreitender Knorpelzerstörung, wenn die Konzentration A statistisch signifikant niedrig ist, aber kein statistisch signifikanter Unterschied in der Konzentration B-A auftritt; und h) Bestimmung als eine Arthritis mit rasch voranschreitender Knorpelzerstörung, wenn kein statistisch signifikanter Unterschied in der Konzentration A auftritt, aber die Konzentration B-A statistisch signifikant hoch ist.