JP2020165937A - プロテオグリカンの測定方法、評価方法および測定用キット - Google Patents
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Abstract
Description
また、特許文献6の方法では、コアタンパクのG2ドメインを検出するとされているところ、G2ドメインはコアタンパクの中程に位置しており(図1参照)、そのN末側(例えばG1ドメイン等)やC末側(グリコサミノグリカン結合ドメインやEGF様モジュール、G3ドメイン等)が維持されているか否かを検出することはできない。
そのため、最終的な飲食品や化粧料等の製品中に、目的の機能性を維持したプロテオグリカンが、配合時の状態(量や構造等)を保って存在するかについて、簡便に測定することのできる方法が求められている。
前記プロテオグリカン含有組成物からタンパク質を分離し、
前記プロテオグリカンのG1ドメイン、グリコサミノグリカン結合ドメイン、および前記プロテオグリカンのEGF様モジュールを免疫学的に測定する
ことを特徴とするプロテオグリカンの測定方法。
〔2〕 前記プロテオグリカン含有組成物を水性溶媒で抽出し、タンパク質を分離する、〔1〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔3〕 前記プロテオグリカン含有組成物、または〔2〕の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物に、還元・アルキル化処理を行わない、〔1〕または〔2〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔4〕 前記プロテオグリカン含有組成物が飲食品または化粧料である、〔1〕〜〔3〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔5〕 前記免疫学的測定において、前記プロテオグリカンのG3ドメイン(前記EGF様モジュールを除く)を免疫学的に測定する、〔1〕〜〔4〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔6〕 前記免疫学的測定に加え、ヒアルロン酸を用い、前記プロテオグリカンのG1ドメインを測定することを特徴とする〔1〕〜〔5〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔7〕 前記タンパク質の分離において、前記プロテオグリカン含有組成物、または〔2〕の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物を、タンパク質固定用膜にスポットする、〔1〕〜〔6〕に記載のプロテオグリカンの測定方法。
〔8〕 〔1〕〜〔7〕に記載の方法により得られた測定値を指標とすることを特徴とする、前記プロテオグリカン含有組成物におけるプロテオグリカンの評価方法。
〔9〕 プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンを測定するためのキットであって、
前記プロテオグリカンのG1ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのグリコサミノグリカン結合ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのEGF様モジュールを免疫学的に認識するプローブとを備えることを特徴とするプロテオグリカンの測定用キット。
〔10〕 前記プロテオグリカンのG3ドメイン(前記EGF様モジュールを除く)を免疫学的に認識するプローブを備える、〔9〕に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
〔11〕 ヒアルロン酸を備える、〔9〕または〔10〕に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
さらに、本発明の測定用キットは、上記測定方法または評価方法に好適に利用することができる。
〔プロテオグリカンの測定方法,測定用キット〕
本発明の一実施形態に係るプロテオグリカンの測定方法は、プロテオグリカンの複数のドメインまたはモジュール(以下「ドメイン等」と総称することがある。)を免疫学的に測定するものである。また、本発明の他の一実施形態に係るプロテオグリカンの測定用キットは、上記複数のドメイン等を免疫学的に認識するプローブを備えるものである。
プロテオグリカンは、コアタンパクにコンドロイチン硫酸等のグリコサミノグリカン(以下「GAG」と略することがある)が複数本共有結合した複合糖質である。
本実施形態に係る測定方法の対象としては、プロテオグリカンの中でもヒアレクタン(hyalectan)であることが好ましい。ヒアレクタンは、アグリカン(aggrecan)、バーシカン(versican)、ニューロカン(neurocan)およびブレビカン(brevican)を含むスーパーファミリーであり、いずれもヒアルロン酸に結合するN末端側球状ドメイン(G1ドメイン)と、GAG結合ドメインと、レクチン様モジュールおよびEGF様モジュールを有するC末端側球状ドメインとを有する点において共通する。さらに、本実施形態で測定されるプロテオグリカンは、上記の中でもアグリカン(軟骨型プロテオグリカン)であることが好ましい。
図1には、プロテオグリカンの例としてサケアグリカン(GenBank Accession No.: BAJ61837.1)の構造模式図を示している。
図1に示すように、サケアグリカンのコアタンパクは、大まかに3つの球状ドメイン(globular domain)(G1からG3)とグリコサミノグリカン(GAG)結合ドメインとを有し、N末端から順に、G1ドメイン(1〜350アミノ酸)、IGD(interglobular domain)(351〜451アミノ酸)、G2ドメイン(452〜648アミノ酸)、GAG結合ドメイン(649〜1067アミノ酸)、およびG3ドメイン(1068〜1324アミノ酸)を有している。このうち、G1ドメインはヒアルロン酸との結合能を持つことが知られている。また、G3ドメインは、EGF(上皮成長因子)様モジュール(1068〜1104アミノ酸)、レクチン様モジュール(1105〜1236アミノ酸)、および補体制御タンパク様構造(CRP)(1239〜1297アミノ酸)を有する。一方、GAG結合ドメインにおいては、グリコサミノグリカン(軟骨型プロテオグリカンであるアグリカンの場合は主にコンドロイチン硫酸)がセリン残基に共有結合している。
飲食品や化粧料等のプロテオグリカン含有組成物においては、その製造工程等において酸や熱などが課せられる場合があり、またプロテアーゼ等が混入してしまう場合もある。これらの条件においてはプロテオグリカンの糖鎖(グリコサミノグリカン)よりもコアタンパクの方が感受性である。糖鎖はプロテアーゼからコアタンパクを保護している。そのため、プロテオグリカンの品質評価においては、その糖鎖(グリコサミノグリカン)よりもコアタンパクの測定が重要となる。
また、免疫学的に測定するため、プロテオグリカンの機能ドメインに特異的である。そのため、プロテオグリカン含有組成物中にヒアルロン酸などの多糖類や糖質はもちろんのこと、他のタンパク質が共存していても影響を受けにくく、混合物のまま分析することができる。さらに、プロテオグリカン含有組成物が果実エキス等に由来する濃い色素を含む場合であっても、比色法等と異なり免疫学的方法によれば、用いる抗体等と反応しない限り、検出の邪魔にならない。
これらのうち、G1ドメインはプロテオグリカンのN末側に位置し、一方EGF様モジュールはC末側に位置する。そのため、両者を免疫学的に測定することで、プロテオグリカンのN末端領域およびC末端領域の両方が保持されているか否かを評価することができ、プロテオグリカン含有組成物中に含まれるプロテオグリカンの全体構造を総合的に評価することができる。
さらに、プロテオグリカンの生理作用として細胞増殖促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用等が報告されているが、これらの作用はEGF様モジュールによるものと推定されている。そのため、これらの作用を期待して組成物中にプロテオグリカンを配合させる場合には、当該組成物中のプロテオグリカンにおいてEGF様モジュールが保持されているか否かを評価することは、特に重要である。
また、GAG結合ドメインに関し、プロテオグリカンはコアタンパクとグリコサミノグリカン(GAG)との複合体であり、プロテオグリカン分子全体に占める割合の多いGAGはプロテオグリカンの機能に大きく寄与していることから、GAG結合ドメインが保持されているか否かを評価することで、プロテオグリカンの品質をより総合的に評価することが可能となる。
本実施形態においては、プロテオグリカンのドメイン等を測定するにあたり、対象となるドメイン等に特異的に結合するプローブを用いる。対象ドメイン等に特異的に結合するプローブとしては、例えば、対象ドメイン等を免疫学的に認識するプローブ(免疫学的プローブ)を好適に例示することができる。免疫学的プローブとしては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等の抗体を好適に使用することができる。また、免疫学的プローブとして、前述した抗体のみならず、組換え抗体を使用してもよく、Fab、F(ab’)2、Fab’、Fv等の抗体断片を使用してもよい。
また、本実施形態においては、対象ドメイン等に特異的に結合するものであれば、前述した免疫学的プローブ以外のプローブ(以下「非免疫学的プローブ」ということがある)を用いてもよい。かかるプローブとしては、例えば、プロテオグリカン中の特定のドメイン等に結合する分子(糖鎖、タンパク質、脂質など)を例示することができる。非免疫学的プローブの具体例としては、G1ドメインに結合するヒアルロン酸、G3ドメインに結合する細胞外マトリックス分子(テネイシン(tenascin)、ファイブリン(fibulin))や硫酸化糖脂質などを例示することができる。
この他、G1ドメインに特異的に結合する非免疫学的プローブとして、ヒアルロン酸を用いてもよい。G1ドメインは、ヒアルロン酸と特異的に結合することが知られており、ヒアルロン酸により測定されるG1ドメインは、ヒアルロン酸との結合機能を保持しているということができる。
後述するように、プロテオグリカン含有組成物(またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物)からタンパク質を分離する場合には、コアタンパクに結合していない遊離の糖鎖(GAG等)は除去される。このようなタンパク質分離物に含まれるGAGは、すなわちプロテオグリカン(のGAG結合ドメイン)に結合しているGAGということができるため、タンパク質分離物に含まれるGAGを介して、当該分離物におけるプロテオグリカンのコアタンパク(のGAG結合ドメイン)を検出することができる。
このような免疫学的プローブとしては、例えば、コンドロイチン硫酸A鎖およびC鎖を認識するプローブを例示することができ、そのようなプローブとしては、例えば、CS−56としてSigma-Aldrich社等より入手可能なマウスモノクローナル抗体が挙げられる。
また、コンドロイチン硫酸が結合していたプロテオグリカンをコンドロイチンABCリアーゼにより消化し、得られた消化産物を免疫学的に認識するプローブも、好適に例示することができる。得られた消化産物の非還元末端のヘキスロン酸は、4位と5位の間に二重結合をもつ不飽和ヘキスロン酸(Δ4HexUA)である。上記免疫学的プローブは、コンドロイチン硫酸のうち、コンドロイチンABCリアーゼにより消化されてコアタンパク側に残った分解断片の非還元末端の不飽和二糖構造(切り株(stub))を認識する。このようなプローブとしては、例えば、1−B−5、2−B−6および3−B−3等のマウスモノクローナル抗体が挙げられる。ここで、1−B−5はコンドロイチンの切り株の二糖構造(Δ4GlcUAβ1−3GalNAc,ΔDi0S)を認識し、2−B−6はコンドロイチン硫酸Aの切り株の二糖構造(Δ4GlcUAβ1−3GalNAc(4S),ΔDi4S)を認識し、3−B−3はコンドロイチン硫酸Cの切り株の二糖構造(Δ4GlcUAβ1−3GalNAc(6S),ΔDi6S)を認識する。なお、後述する実施例においては、生化学バイオビジネス社より入手した3−B−3を使用したが、これら3種の抗体はAmsbio社やコスモ・バイオ社等からも入手可能である。
GAGを認識するこれらの免疫学的プローブを用いることで、GAGが保持されているか否か、またGAGの種類など、プロテオグリカンに結合しているGAGについて測定することができる。すなわち、本実施形態に係る測定方法によれば、コアタンパクを分析する方法でありながら、糖鎖分析を行わずに、プロテオグリカンの糖鎖(すなわちGAG)についても評価を行うことができる。
上記測定用キットは、G3ドメイン(EGF様モジュールを除く)を免疫学的に認識するプローブをさらに備えることが特に好ましい。また、上記測定用キットは、非免疫学的プローブとしてのヒアルロン酸(G1ドメインが特異的に結合する)をさらに備えることも好ましい。
本実施形態に係る測定方法の対象となる組成物は、プロテオグリカンを含有するものであれば特に制限されないが、例えば、経口での摂取が可能なものとして、一般食品、健康食品、保健機能食品(特定保健用食品,栄養機能食品,機能性表示食品)などの飲食品;医薬部外品;医薬品;などが挙げられる。また、本実施形態に係る測定方法の対象となる組成物はこれらに限定されず、例えば、化粧料等の経皮組成物;マスク、歯ブラシ、紙おむつ等の衛生・介護用品に用いる組成物;再生医療や人工臓器等の医療系材料;研究試薬;などであっても良い。
本実施形態の対象となるプロテオグリカン含有組成物は、プロテオグリカンの作用や機能性が重視される組成物であることが好ましく、また、当該組成物またはその包装に、プロテオグリカンを含有していることが表示される組成物であることがより好ましく、プロテオグリカン含有組成物は、プロテオグリカンが有する好ましい作用を表示可能であることが特に好ましい。かかる観点からは、本実施形態の対象となる特に好適な組成物として、飲食品や化粧料を挙げることができ、保健機能食品(特定保健用食品,機能性表示食品、栄養機能食品)、化粧料であることが好ましく、保健機能食品であることが特に好ましい。
かかる方法において測定標準とするための精製プロテオグリカンは、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、さらにはイオン交換クロマトグラフィーに続けてゲルろ過クロマトグラフィーを行うことにより得られる画分であって、ウロン酸(カルバゾール法等により定量可能)およびタンパク質(280nmの吸光度、Bradford法等により定量可能)の両者が検出される画分として得ることができる。
上記プロテオグリカン含有組成物は、当該組成物が水溶液(例えば、飲料;化粧水・乳液等)である場合は、基本的には、そのまま免疫学的測定に供することができる。ただし、当該プロテオグリカン含有組成物が、茶系飲料や果汁飲料のように不溶物を含む水溶液である場合には、フィルター等により不溶物を除去してもよい。この場合、さらにフィルターを通す前の試料と通した後の試料とで本実施形態の測定を行うこともまた好ましい。
一方、プロテオグリカン含有組成物が固形あるいはゲル状の組成物である場合は、当該組成物を水性溶媒にて抽出することが好ましい。なお、本実施形態における「抽出」は、組成物が水性溶媒等に完全に溶解する態様も包含し、類義語も同様である。
ただし、植物由来物を高濃度に含有する組成物は、植物に由来する成分(ポリフェノール等)が一般的な免疫学的測定に対し阻害的に寄与する場合がある。植物由来物を高濃度に含有する組成物としては、例えば、果汁・野菜汁入り飲料、茶系飲料、コーヒー飲料、果実酒などが例示される。これらについて本実施形態の測定対象とする場合は、ポリビニルポリピロリドン等により前処理してから測定を行うことも好ましい。
水性溶媒としては、水、生理食塩水、緩衝液等を適宜用いることができる。緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液を用いればよく、さらに、NaClやBSA等の血清アルブミンを含んでいてもよい。水性溶媒の中では水を用いることが特に好ましい。
抽出操作は、例えば、必要に応じてブレンダー、ホモジナイザー、フードカッター等を用いてプロテオグリカン含有組成物をホモジナイズし、水性溶媒を添加し、4℃、10分〜24時間程度、静置または振盪することにより行なうことができる。また、プロテアーゼインヒビター存在下、4℃、72時間程度かけて抽出しても問題ない。なお、油脂を含む組成物の場合、液体はそのまま、クリーム状のものや固形のものは上記水性溶媒にて抽出(可溶化)した後、油相、水相に分離して、水相について分析を実施してもよい。
ただし、測定の対象となるプロテオグリカン含有組成物によっては、効率的な抽出のために、グアニジン塩酸塩や尿素等の変性剤;ドデシル硫酸ナトリウム(Sodium dodecyl sulfate,SDS)、Tween20等の界面活性剤;などを、抽出のための上記水性溶媒に加えても良く、残渣がある場合はこれを除くために0.45nmメッシュのフィルターを使用してもよい。また、必要に応じてさらなる精製を行っても良い。
しかし、本実施形態においては、還元・アルキル化処理を行わなくてもよい。本実施形態によれば、還元・アルキル化処理を行わなくとも免疫学的測定を行うことができるため、還元・アルキル化処理を省略することで、より一層簡便に測定を行うことができる。また、例えば、還元・アルキル化処理を行った場合、一部のタンパク質が不溶化することがある。このように、還元・アルキル化をはじめとする前処理においては、試料のロスあるいは変質が起こる場合もあり、前処理のステップは少ない方が結果の精度、信頼度が高く、望ましい。
なお、還元・アルキル化処理を行わない場合において、還元処理またはアルキル化処理の一方のみ(例えば、還元処理のみ)を行う態様を排除するものではないが、簡便性を向上させる観点から、どちらも行わないことがより一層好ましい。
本実施形態においては、上記のようにして得られたプロテオグリカン含有組成物(またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物)から、タンパク質を分離することが好ましい。プロテオグリカンをはじめとするタンパク質を分離することで、組成物に含まれる色素などの他の成分が、後述する免疫学的測定において結果に悪影響を及ぼす可能性を低減することができる。
さらに、GAGに結合するプローブを用いてGAG結合ドメインを検出する場合には、コアタンパク(のGAG結合ドメイン)から遊離した糖鎖(GAG等)と分離することで、GAG結合ドメインのより正確な検出および定量が可能となる。
これらの中でも、上記プロテオグリカン含有組成物(またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物)を、タンパク質固定用膜にスポットする、いわゆるドットブロット法は特に好適な方法である。タンパク質固定用膜としては、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜、ニトロセルロース膜等を用いることができるが、洗浄にメタノールを用いることができ、固定用膜に吸着したタンパク質以外の成分を洗浄できる点から、PVDF膜を用いることがより望ましい。また、プロテオグリカン含有組成物等を、スロットブロッターを接続したアスピレーター等により吸引しながらスポットしてもよく、この場合スポットした試料の面積を一定に保つことができ結果の信頼度が高まるため、より好ましい。このように構成することで、プロテオグリカンをはじめとするタンパク質が膜に吸着・固定される一方、糖鎖(さらには、コンドロイチンABCリアーゼ処理を行っている場合は、コアタンパクをもたない糖鎖側の分解産物等)のほか、組成物に含まれる色素などの成分は膜に吸着しないため、これらを簡便に除去することができ、タンパク質を簡便に分離することができる。
以上のようにして得られたタンパク質分離物は、免疫学的測定に供することで、プロテオグリカンの各機能ドメイン等を測定することができる。免疫学的検出法としては、例えば、ELISA法等の酵素免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)、化学発光免疫測定法(CIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、免疫比濁法(TIA)、ラテックス凝集法、イムノクロマト法等が挙げられ、いずれを採用しても良い。ここで、上記タンパク質の分離において、膜やマイクロプレート等の担体を用いる場合には、担体に固定されたタンパク質をそのまま検出可能であり、簡便であることから、ELISA法等の酵素免疫測定法(EIA)、放射性免疫測定法(RIA)、化学発光免疫測定法(CIA)、蛍光免疫測定法(FIA)などを特に好ましく採用できる。
本実施形態においては、上記免疫学的測定に加え、非免疫学的プローブを用いてプロテオグリカンの各機能ドメイン等を測定することも好ましい。
好ましい非免疫学的プローブとして、ヒアルロン酸を例示することができる。プロテオグリカンのG1ドメインはヒアルロン酸と特異的に結合するため、ヒアルロン酸を用いて測定することにより、測定対象組成物中のプロテオグリカン(のG1ドメイン)が、ヒアルロン酸との結合機能を保持しているか否かを評価することができる。プロテオグリカンに結合したヒアルロン酸は、例えば、標識したヒアルロン酸結合タンパク質(HABP)等を介して検出することができる。
非免疫学的測定は、免疫学的測定と同様に、プロテオグリカン含有組成物(またはプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物)から、タンパク質を分離したタンパク質分離物に対して行うことが好ましく、タンパク質の分離は、簡便性の観点から、タンパク質を固定可能な担体(膜、マイクロプレート等)を用いることが特に好ましい。
本実施形態に係るプロテオグリカンの評価方法は、プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンを評価するものであって、前述した実施形態に係る測定方法にて得られた測定値を指標とするものである。
すなわち、前述した測定方法により、プロテオグリカン含有組成物において、プロテオグリカンの複数のドメイン等の測定値が得られている。かかる測定値を指標とすることにより、当該組成物においてそれぞれの機能ドメイン等が保持されているか否か、さらには各機能ドメインの割合などを総合的に評価することができる。例えば、G1ドメイン、GAG結合ドメイン、およびEGF様モジュールを全て測定することで、さらにはG3ドメイン(EGF様モジュールを除く)についても併せて測定することで、各機能ドメインの保持状況や割合などを総合的に評価することができる。
一方、プロテオグリカンを断片化させる等により特定の機能ドメイン等を欠失させることで、当該プロテオグリカンの作用または機能性が発揮される場合には、プロテオグリカン含有組成物において特定の機能ドメイン等が欠失しているか否かを評価することにより、当該組成物におけるプロテオグリカンの品質を評価することも可能である。
さらに、本実施形態によれば、原料としてのプロテオグリカンが、処方設計のとおり確かに配合されているか否かのチェックなどにも使用することができる。
超遠心やクロマトグラフィー等の煩雑な操作や、超遠心機、HPLC、質量分析計、電子顕微鏡、原子間力顕微鏡等の特別の装置を必要とすることなく、さらにはプロテオグリカンの取り扱いに関するノウハウ等も特段必要とせず、非常に簡便に測定・評価することができるため、プロテオグリカンの取り扱いに慣れていない製造業種の開発部門や成分分析部門においても広く利用可能であり、第一段階の簡便な測定方法・品質評価法として期待される。
これに対し、本実施形態によれば、免疫学的測定によりプロテオグリカン特異的に測定あるいは評価することができ、糖質・糖鎖、色素等が含まれ得る組成物であっても、プロテオグリカンを特異的に測定・評価することができる。
これに対し、本実施形態によれば、プロテオグリカンのコアタンパクにおける複数の機能ドメイン等に着目して測定・評価するため、プロテオグリカンの品質を簡便に評価することができる。本実施形態における測定や品質評価の対象は、全体構造が保持されたプロテオグリカンを使用した組成物であってもよく、断片化プロテオグリカンを使用した組成物であっても良い。
プロテオグリカンの各機能ドメイン等を免疫学的に認識するプローブとして、それぞれに示す抗体を用いた。
EGF様モジュール
サケ軟骨プロテオグリカン(アグリカン)(GenBank Accession No.: BAJ61837.1)のEGF様モジュール中のアミノ酸配列のペプチド(1069RDLCEPNQCGTGTCSVQDGI1088(配列番号3))を合成し、そのN末端側にウシチオグロブリンを連結して、ウサギに免疫し、ポリクローナル抗体を得た(Carbohydr. Polym. 103, 538-49 (2014)参照)。なお、ポリクローナル抗体は3種得られており(No.1〜3)、以下の試験においてはかかる3種のウサギポリクローナル抗体を用いた。
G1ドメイン
12/21/1−C−6(Developmental Studies Hybridoma Bank, the University of Iowa, USAより入手したマウスモノクローナル抗体)を用いた。
GAG結合ドメイン
CS−56(マウスモノクローナル抗体,Sigma-Aldrich社より入手)、および3−B−3(マウスモノクローナル抗体,生化学バイオビジネス社より入手)を用いた。
G3ドメイン(EGF様モジュール以外の領域)
JSCCDG(ウサギポリクローナル抗体,Affinity BioReagents, Golden, CO, USAより入手)を用いた。
ヒアルロン酸結合試験においては、非免疫学的プローブとしてヒアルロン酸(分子量100万〜140万,フードケミファ社製)を用いた。
また、プロテオグリカンに結合したヒアルロン酸の検出には、ビオチン化したヒアルロン酸結合タンパク質(HABP)(ビオチン化HABP,生化学バイオビジネス社製,製品番号:400763)、およびペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(DAKO社製)を用いた。
なお、ヒアルロン酸結合試験の陽性対照として、ビオチン化されていないHABP(生化学バイオビジネス社,製品番号:400762)を用いた。
還元アルキル化処理あるいは非処理の試料(プロテオグリカン含有熱水抽出物)をPVDF膜にスポットし、ドットブロット法によりプロテオグリカンのコアタンパクの各種ドメインを認識する抗体との反応性について検量線を作成した。この検量線を用いて、被検試料(食品サンプル)中に含まれる抗体と反応するプロテオグリカンの定量を行った。
なお、還元アルキル化処理は、4Mグアニジン塩酸−100mMジチオスレイトールにて、窒素ガス存在下、42℃2時間の還元処理を行った後、150mMヨードアセトアミドにて室温(20−25℃)3時間のアルキル化処理を行った。
吸光度280nmの測定に基づく1錠の溶解液の総タンパク量は、1)35.244mg、2)26.344mg、3)36.846mgであった。
被験試料と同様の処理を施したプロテオグリカン非添加のコントロール粉末の溶解液は、比較する錠剤の溶解液と同じ容量を分析に供した。
精製前(熱水抽出物)のタンパク量とCL-4B精製後のタンパク量(ウロン酸およびタンパク質の両者が検出される画分におけるタンパク量の合計)との対比により、熱水抽出物中に含まれるプロテオグリカンの割合は3.78%と算出された。また、精製前のウロン酸量とCL-4B精製後のウロン酸量との対比により、熱水抽出物中からのプロテオグリカンの回収率は86.1%と算出された。後述する試験例においてはプロテオグリカン画分のうち高分子量の画分を陽性対照として用いた。
各0.2μg(Bradford法により定量)のプロテオグリカン含有熱水抽出物を含む食品試料をPVDF膜にスポットし、5%スキムミルク-TBSにてブロッキング(室温(20−25℃),1h)、1%BSA-TBSにて希釈したヒアルロン酸(最終濃度は0.067%(分子量100万〜140万))とインキュベート(室温,一晩)、1%BSA-TBSにて希釈した0.1μg/mLビオチン化HABPにてインキュベート(室温,遮光,一晩)、1%BSA-TBSにて1/1000希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンにてインキュベート(室温,1h)を順次行い、最終的な検出はECL(発光)システムによった。
EGF様モジュールについて
サケ軟骨プロテオグリカン(GenBank Accession No.: BAJ61837.1)のEGF様モジュールをウサギに免疫して得られた3種のポリクローナル抗体(No.1〜3)を用いてドットブロット法によりプロテオグリカンを検出した。
還元アルキル化処理あり(+)、なし(-)のプロテオグリカン含有熱水抽出物をPVDF膜にブロットし、抗EGF様モジュール抗体No.1〜3を用いて検出した。抗体No.3を用いて検出した結果を図2Aに、得られた測定値に基づき検量線を作成した結果を図2Bに、それぞれ示す。なお、抗体No.3の結果のみを示しているが、抗体No.1および抗体No.2についても同様の結果が得られている。
抗EGF様モジュール抗体No.3(ならびにNo.1および2)を用いた場合、還元アルカリ化処理を省いても良好な検量線を作成することができ、プロテオグリカンを簡便に検出できることが明らかとなった。
なお、プロテオグリカン量は、プロテオグリカン含有サンプルの各々のシグナル強度からプロテオグリカン非添加のコントロールのシグナル強度を差し引いた値より計算した。プロテオグリカン熱水抽出物の検量線より抽出物換算量を算出し、当該抽出物に含まれるプロテオグリカンの割合(3.78%)より、各サンプルにおけるプロテオグリカン量を算出した。
(12/21/1−C−6)
G1ドメインについても、抗G1ドメイン抗体(12/21/1−C−6)を用い、前述した抗EGF様モジュール抗体と同様に、ドットブロット法にて検出した。他の抗体と同様にプロテオグリカン含有熱水抽出物0.02〜2μgを検出した結果を図4Aに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図4Bに、それぞれ示す。
抗G1抗体を用いて評価する場合、還元アルキル化処理を行う場合は低用量でも充分に検出可能であるが、還元アルキル化処理を行わない場合、このタンパク量の範囲(0.02〜2μg)では検出は難しく、より多くの試料を要すると考えられた。
図5AおよびBに示すように、抗G1ドメイン抗体を用いて還元アルキル化処理を行わないサンプルを検出する場合であっても、スポットするタンパク量を増やすことで、良好に検出することができた。そして、図5Cに示すように、保存前後のサンプルを対比することで、保存工程においてプロテオグリカンのG1ドメインが保持されているか否かを評価できることが確認された。
G1ドメインについて、ヒアルロン酸を用い、ドットブロット法にて検出した。ヒアルロン酸は、分子量100万〜140万のものを用いた。なお、還元アルキル化処理は行わずに試験を実施した。
プロテオグリカン含有熱水抽出物(還元アルキル化処理なし)0.02〜2μgをスポットし検出して検量線を作成するとともに、抗G1ドメイン抗体(12/21/1−C−6)での試験と同じ組成物(a)〜(i)の9種についても、それぞれ遠心(5,000r.p.m.,10分)後の上清を0.45μmフィルターに通し、得られた各組成物について、プロテオグリカン含有熱水抽出物を0.2μg添加した直後のサンプルと、あらかじめ調製後4℃1週間保存したサンプルと、プロテオグリカン含有熱水抽出物を添加しないサンプルとを、PVDF膜にスポットした。
結果を図6に示す。検出した結果を図6Aに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図6Bに、得られた検量線に基づきサンプル中のプロテオグリカン含有熱水抽出物のタンパク量を算出した結果を図6Cに、それぞれ示す。
G1ドメインは、ヒアルロン酸と特異的に結合することから、本試験で検出されるG1ドメインは、ヒアルロン酸との結合機能を保持しているということができる。
図6Cに示すように、保存前後のサンプルを対比することで、保存工程においてプロテオグリカンのG1ドメインの機能(ヒアルロン酸との結合能/結合活性)が保持されているか否かを評価できることが確認された。
(CS−56)
GAG結合ドメインについて、さらに、当該ドメインに結合した糖鎖を認識する抗体(CS−56)を用い、ドットブロット法にて検出した。検出した結果を図7に示す。
CS−56を用いて評価する場合、還元アルキル化処理を行う方が感度に優れているが、還元アルキル化処理を省略しても充分な検量線を作成できると認められた。
GAG結合ドメインについて、さらに、当該ドメインに結合した糖鎖の切り株を認識する抗体(3−B−3)を用い、ドットブロット法にて検出した。なお、本抗体の試験においては、あらかじめコンドロイチンABCリアーゼにて消化したサンプルを用いた。コンドロイチンABCリアーゼ消化産物は、コンドロイチン硫酸鎖のうち非還元末端のグルクロン酸の4位と5位の間に二重結合をもつ不飽和オリゴ糖構造がコアタンパク側に残り、かかる末端の不飽和二糖構造(切り株)を上記3−B−3が認識する。
本試験により検出した結果を図9Aに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図9Bに、それぞれ示す。
3−B−3を用いて評価する場合、還元アルキル化処理を省略することでむしろ良好に検出することができると認められた。なお、コンドロイチンABCリアーゼ処理の手間は生じるが、還元アルキル化処理と比較すると簡便である。
G3ドメイン(EGF様モジュール以外)についても、抗G3ドメイン抗体(JSCCDG)を用い、ドットブロット法にて検出した。検出した結果を図11Aに、得られた結果に基づき検量線を作成した結果を図11Bに、それぞれ示す。
抗G3抗体を用いて評価する場合、還元アルカリ化処理を省いても良好な検量線を作成することができ、プロテオグリカンを簡便に検出できることが明らかとなった。
煩雑な操作や特別の装置を必要とすることなく、さらにはプロテオグリカンの取り扱いに関するノウハウ等も特段必要とせず、非常に簡便に測定・評価することができるため、プロテオグリカンの取り扱いに慣れていない製造業種の開発部門や成分分析部門においても広く利用可能であり、第一段階の簡便な測定方法・品質評価法として期待される。
Claims (11)
- プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンの測定方法であって、
前記プロテオグリカン含有組成物からタンパク質を分離し、
前記プロテオグリカンのG1ドメイン、グリコサミノグリカン結合ドメイン、および前記プロテオグリカンのEGF様モジュールを免疫学的に測定する
ことを特徴とするプロテオグリカンの測定方法。 - 前記プロテオグリカン含有組成物を水性溶媒で抽出し、タンパク質を分離する、請求項1に記載のプロテオグリカンの測定方法。
- 前記プロテオグリカン含有組成物、または請求項2の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物に、還元・アルキル化処理を行わない、請求項1または2に記載のプロテオグリカンの測定方法。
- 前記プロテオグリカン含有組成物が飲食品または化粧料である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のプロテオグリカンの測定方法。
- 前記免疫学的測定において、前記プロテオグリカンのG3ドメイン(前記EGF様モジュールを除く)を免疫学的に測定する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロテオグリカンの測定方法。
- 前記免疫学的測定に加え、ヒアルロン酸を用い、前記プロテオグリカンのG1ドメインを測定することを特徴とする請求項1〜5に記載のプロテオグリカンの測定方法。
- 前記タンパク質の分離において、前記プロテオグリカン含有組成物、または請求項2の方法で得られたプロテオグリカン含有組成物の水性溶媒抽出物を、タンパク質固定用膜にスポットする、請求項1〜6のいずれか一項に記載のプロテオグリカンの測定方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法により得られた測定値を指標とすることを特徴とする、前記プロテオグリカン含有組成物におけるプロテオグリカンの評価方法。
- プロテオグリカン含有組成物に含まれるプロテオグリカンを測定するためのキットであって、
前記プロテオグリカンのG1ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのグリコサミノグリカン結合ドメインを免疫学的に認識するプローブと、前記プロテオグリカンのEGF様モジュールを免疫学的に認識するプローブとを備えることを特徴とするプロテオグリカンの測定用キット。 - 前記プロテオグリカンのG3ドメイン(前記EGF様モジュールを除く)を免疫学的に認識するプローブを備える、請求項9に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
- ヒアルロン酸を備える、請求項9または10に記載のプロテオグリカンの測定用キット。
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