JP5700763B2 - 抗アレルギー剤 - Google Patents

Description

本発明は酸性多糖類を主成分とする抗アレルギー剤に関する。

現在、日本においては国民の２０−３０％が何らかのアレルギー症状を有していると考えられ、身近な花粉症やアトピー性皮膚炎の増加はその一例といえる。このアレルギー症状の増加は大きな社会的問題となっている。
一般的にアレルギーとは、免疫学上４つに分類されるアレルギー反応においてＩ型に分類される即時性のものを言う。Ｉ型アレルギーは、花粉・ダニ・卵・牛乳などに含まれるアレルゲンに接することで、ヒト等において免疫応答が誘導され、アレルギー原因抗体であるＩｇＥが産生されることにより起こる。産生されたＩｇＥは、体中に運搬された後、肥満細胞や好塩基球上に発現しているＦｃ受容体を介して結合する。そして、再び体内に取り込まれたアレルゲンが、このＩｇＥと架橋することにより、肥満細胞あるいは好塩基球に蓄えられていたヒスタミンの遊離とロイコトリエンの産生が促されることで、即時性のアレルギー症状が惹起されることになる。

これまでに、Ｉ型アレルギー症状の緩和・抑制・治療を目的として、様々な薬剤や食品
素材が開発されており、その一つとしてペクチンが挙げられている。
ペクチンの抗アレルギー活性は、動物細胞を用いた試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）や、マウス、ヒト等に摂取させた試験（ｉｎ ｖｉｖｏ）によって示唆、あるいは確認されている。
非特許文献１においては、ペクチンが、抗アレルギー活性の指標として考えられるヒスタミンの遊離を抑制する効果が動物細胞を用いた実験で確認されている。特許文献１では、花粉症患者の静脈血を用いた試験によって、ポリガラクツロン酸がスギ花粉抗原との特異的な抗原抗体反応を阻害し、ヒスタミンの遊離を抑制したことが開示されている。
さらに特許文献２では、ヒト（成人）に対して２２．２ｇ／日のリンゴ由来ペクチン（ペクチン等量として９．９９ｇ／日）を３週間摂取させた結果、血漿中のヒスタミン濃度が低下し、アレルギー性疾病の治療又は予防効果があることが確認されている。
また、非特許文献２では、５％のペクチンを含む餌をラットに２週間投与したところ、血清中のＩｇＥが低下し、リンパ球のＩＦＮ−γが有意に増加することが確認されている。この試験では、体重１ｋｇあたりおよそ７．２ｇ／日となるようにペクチンが投与されている（計算値）。
そして、特許文献３では、マウスに対して抗原を耳に塗布するとともに、エステル化度３５％のペクチン１００ｍｇ／ｋｇに相当する量を水に懸濁して４週間にわたり計９回、ゾンデによって経口投与した結果、抗体であるＩｇＥの産生が抑制されたことやＴｈ１／Ｔｈ２バランスが改善されたことが確認されている。
このように、ペクチンはアレルギーの発症の直接原因である肥満細胞からのヒスタミン遊離抑制作用や、アレルギー発症に関与する抗体の産生を抑制する免疫改善効果を有することが確認されている。
しかしながら、開示されている動物や人への投与試験においては、抗アレルギー効果を発揮するまでには２週間以上を要しており、アレルギーが発症する２週間以上前から摂取しなければ効果が期待できないため、より短時間で効果が現れる物質の開発が要望されている。

本発明者らは、大豆から得られる酸もしくは食塩水可溶性の高分子物質をマウスに経口投与したところ、抗アレルギー活性を発揮することを見出している（特願２００９−１３５７２４）。この製造方法において得られる高分子物質の主体は多糖類であろうと考えられるが、具体的な成分は特定されていなかった。
また醤油に含まれる高分子多糖類が抗アレルギー作用、免疫調節効果を持ち（特許文献４，５）、この物質がガラクツロン酸を含有する酸性多糖類であり、分子量５０，０００以下の画分が強い抗アレルギー活性を示すことが開示されている（非特許文献３，４）が、さらなる成分の特定はされておらず、大豆や醤油等の大豆の発酵処理物から得られる抗アレルギー活性を有する物質において、特に抗アレルギー活性に関与する物質を特定し、さらに強い抗アレルギー活性を有する物質を得ることが望まれていた。

特開平０７−３３０６１７号公報 特開２００４−１０７２９５号公報 特開２００１−２３３７７７号公報 特開２００３−３２７５４０号公報 特開２００７−０８４４８６号公報

Ｙ．Ｓａｗａｂｅ ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１３７，２７４−２７８，１９９２ Ｂ．Ｏ．Ｌｉｍら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．６６３−６６７，１９９７ 日本生物工学会 大会要旨集 ２００７年大会，ｐ１７２ 日本農芸化学会関西支部講演要旨集 第４４２回、Ｐ．５（２００５）

本発明は、従来のペクチン関連の抗アレルギー剤と比べて、短期間で効果を発揮する活性の強い抗アレルギー剤の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、大豆又は醤油等の大豆醗酵物から得られる抗アレルギー活性を有する物質を陰イオン交換樹脂により分画することにより、さらに高い抗アレルギー活性を有する酸性画分が得られることを見出した。また、この酸性画分を分析することにより、１）酸性多糖類を主成分とする、２）ｐＨ２で可溶である、及び３）構成成分としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上である、ことを特徴とする抗アレルギー剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明のような、キシロース／ガラクツロン酸比が高く酸に可溶性のペクチンが、強い抗アレルギー活性を有することは知られていなかった。また、市販の大豆多糖類とは構成糖組成が異なり、シトラス等から得られるペクチンとも酸溶解性や構成糖組成が明らかに異なることから、新たな特徴を有する新規の抗アレルギー剤であることが確認された。

（１）次の１）〜３）の特徴を有する抗アレルギー剤。
１）酸性多糖類を主成分とする
２）ｐＨ２で可溶である
３）構成成分としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上である
（２）ガラクツロン酸を１０％以上含有する上記（１）に記載の抗アレルギー剤。
（３）大豆を原料として得られる上記（１）又は（２）に記載の抗アレルギー剤。
（４）大豆又は大豆種皮を酸性水で抽出して得られる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗アレルギー剤。
（５）大豆の発酵処理物から抽出して得られる上記（１）〜（３）のいずれかに記載の抗アレルギー剤。

本発明の抗アレルギー剤は、従来のペクチンや大豆や醤油等の大豆醗酵物から得られる抗アレルギー剤と異なり、３日等の短期間の経口投与で強い抗アレルギー活性を示すものである。本発明の１）酸性多糖類を主成分とする、２）ｐＨ２で可溶である、及び３）構成成分としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上である、ことを特徴とする新規の抗アレルギー剤の提供により、アレルギー症状に対し、より有用な薬剤の提供が可能となる。

本発明の「抗アレルギー剤」とは、アレルギー症状の発生予防や症状の緩和、治療等に有用な剤のことをいう。
次の１）〜３）の特徴を有するものであれば、本発明の「抗アレルギー剤」に含まれる。
１）酸性多糖類を主成分とする
２）ｐＨ２で可溶である
３）構成成分としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上である

ここで、「酸性多糖類」には、高分子の酸性多糖類であり、１０％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上の高い比率でガラクツロン酸を含むものであればいずれも該当するが、例えば、ペクチン等が挙げられる。
また、「ｐＨ２で可溶である」とは、ｐＨ２の溶液であればいずれの水溶液に可溶であってもよく、ｐＨ２のクエン酸水溶液やＨＣｌ溶液等の溶液が挙げられる。
ガラクツロン酸とキシロースのいずれもを構成成分として含有しており、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上であれば良く、特に０．２以上であって、１．０程度より少ないことが好ましい。

本発明の抗アレルギー剤は、大豆を原料として得られるものであることが好ましく、大豆そのもの、大豆種皮を除いたものや除かれた大豆種皮を酸性水で抽出して得ることもできる。また、蒸煮等により加熱した大豆を用いることもでき、醤油、味噌、納豆等の大豆の醗酵処理物から抽出して得ることもできる。

本発明の抗アレルギー剤は、本発明の「抗アレルギー剤」が製造できる方法であれば、従来知られているいずれの方法、機器等を用いて製造しても良い。例えば、酸性画分を得る際に、分画に用いる樹脂は、陰イオン交換樹脂であればいずれのものも用いることができる。

以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

抗アレルギー剤の製造（１）
粉砕した大豆種皮１部に３％のクエン酸水溶液（約ｐＨ２）９部を加えて９０℃で５時間加熱し、固液分離すると約６部の澄明な液が得られた。これを分画分子量６０００の透析膜により流水中で２０時間透析し、透析内液に２倍量の９５％エタノールを加えて攪拌、静置後、発生した沈殿を遠心分離により集めて乾燥した（試験例１において、試料１とした）。この一部を陰イオン交換樹脂により分画し、陰イオン交換樹脂に吸着した酸性画分を本発明の抗アレルギー剤とした。
この陰イオン交換樹脂による分画はＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−５ＰＷを充填した２１．５×１５０ｍｍカラム（ＴＯＳＯＨ社）を用いたＨＰＬＣ分取によって行った。溶出液として、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）と１Ｍ−酢酸ナトリウムを添加した５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）の直線グラジエントを用いた（流速、濃度勾配を記載する）。非吸着部と吸着部に分画してそれぞれ透析脱塩した後凍結乾燥させた。この操作を繰り返し、試験に必要な量を確保した。
非吸着部を中性画分（試験例１において、試料１−Ｎとした）、吸着部を本発明の抗アレルギー剤である酸性画分（試験例１において、試料１−Ａとした）とした。中性画分と酸性画分の回収量はそれぞれおよそ１：１であった。また、酸性画分の成分及び構成糖の組成を調べ、得られた結果を表１及び表２に示した。

ウロン酸はｍ−ヒドロキシジフェニル法（Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｔｚらの方法）でガラクツロン酸に換算した。中性糖（ラムノース、フコース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、グルコース、マンノース）はＴＦＡ分解後、糖アルコールアセテート誘導体としてＧＣＭＳにより定量した。これらの方法により測定したガラクツロン酸及び中性糖を合わせて構成糖質量として、この質量に対する各構成糖の割合を構成糖組成とした。
タンパク含量はブラッドフォードでＢＳＡ換算した、エステル化度はＮａＯＨ加水分解後のメタノールをＧＬＣにより定量することにより測定した。灰分含量は６００℃で４時間灰化して測定した。脂質はエチルエーテル抽出法で測定した。炭水化物は１００−（水分＋タンパク質＋脂質＋灰分）とした。その結果、酸性画分の構成成分のほとんどが炭水化物であり、分画分子量が６０００以上と大きく、陰イオン交換樹脂に吸着することから、主成分が酸性多糖類であることが示唆された。

［試験例］

試料の分析及び抗アレルギー活性の検定
実施例１において得られた試料１、試料１−Ｎ及び試料１−Ａの抗アレルギー活性をＰＣＡ反応抑制効果によって検定した。塩化ピクリルをハプテン（免疫原性を欠き、反応原性のみをもつ抗原）とし、Ｌａｖａｕｄらの方法を一部改変して行った。本方法によれば、飼育期間中のＩｇＥ抗体産生等の免疫指標変化に影響されることなく、アレルギー反応を見ることができる。
すなわち、１週間予備飼育した７週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア（株））６匹を１群とし、標準粉末飼料ＣＥ−２（日本クレア（株））に対し０．１％又は０．２％（ｗ／ｗ）となるように各種試料に混合した飼料を３又は４日間自由摂取させた後、ＰＣＡ反応抑制効果試験を行った。標準粉末飼料ＣＥ−２のみを与えた群を対照とした。

試料１−Ｎ、１−Ａの他、比較として市販のペクチン及び大豆多糖類を用いた。ポリガラクツロン酸（和光純薬工業社）、ＬＭ１２−１（ＧＥＮＵペクチン、三晶社）、ＨＭ（ＧＥＮＵペクチン、三晶社）、レモン製ペクチン（和光純薬工業社）、リンゴ製ペクチン（和光純薬工業社）及び大豆多糖類（ＳＭ−７００、三栄源社）を用いた。

ＰＣＡ反応抑制効果の試験は以下のように行った。
すなわち、２μｇのａｎｔｉ−ＴＮＰ ＩｇＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎブランド、日本ベクトン・ディッキンソン社）を含む０．１％ＢＳＡ（ナカライテスク社）入りリン酸緩衝液１００μＬを、マウス尾静脈に注射し、３０分間放置後、シックネスゲージ（尾崎製作所）を用いて耳の厚さを測定した（反応前耳厚とした）。０．８％塩化ピクリルを含むアセトン：オリーブオイル混合液（１：１（ｖ／ｖ））２０μＬをマウスの耳に塗布し、２時間放置後、シックネスゲージを用いて耳の厚さを再度測定した（反応後耳厚とした）。反応前後の耳厚の差を耳の腫れとし、各群６匹ずつの結果を統計的に検定して抗アレルギー効果を評価し、危険率５％以下で有意なときを＋、危険率１％以下で有意なときを＋＋、また、統計的有意差がないときを−として、表３に示した。
酸への溶解性は、試料２０ｍｇを少量のイソプロパノールに分散し、ｐＨ２のＨＣｌ溶液１ｍｌを加えて、２５℃の水中で超音波５分攪拌後目視によって判定した。判定結果は、澄明に溶解したものを＋、少量の不溶物や曇りがあるものを±、明らかに濁りや沈殿があるものを−として表３に示した。

表３に示したように、抗アレルギー活性は試料１−Ａ（酸性画分）が最も強く試料への混合率０．１％で投与３日後には効果が現れた。一方、試料１−Ｎ（中性画分）は抗アレルギー活性がなかった。
試料１は、試料への混入率０．２％で投与した場合に、投与４日後に抗アレルギー活性が見られたものの、試料１−Ａ（酸性画分）のような強い活性はみられなかった。分析結果からは、キシロース／ガラクツロン酸比は高いが、キシロースを含みガラクツロン酸を含有しない中性画分と、キシロース及びガラクツロン酸の双方を含有する酸性画分との混合物であることが理解できた。
比較として用いた市販のペクチン及びポリガラクツロン酸の抗アレルギー活性は４日間の投与でも見られなかった。キシロース含量はいずれも低くキシロース／ガラクツロン酸比は０．１以下であった。
また、大豆多糖類は酸には溶解するが、抗アレルギー活性は見られなかった。キシロース／ガラクツロン酸比は０．１４であった。
従って、１）酸性多糖類を主成分とする、２）ｐＨ２で可溶である、及び３）構成成分としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上である、という特徴を有する試料１−Ａ（酸性画分）が、本発明の抗アレルギー剤として有用であることが確認された。

抗アレルギー剤の製造（２）
醤油（ヒガシマル醤油株式会社）を脱塩した後、３倍量のエタノールを添加して発生した沈殿物を乾燥して醤油高分子物質を得た（試料２）。これをｐＨ２の水に分散させ、遠心分離によって酸可溶性物質と酸不溶性物質に分けた。さらに酸可溶性物質を実施例１と同様の方法で陰イオン交換樹脂にＤＥＡＥカラムにより分画すると、その９５％以上が酸性画分として得られた。得られた酸性画分を脱塩後乾燥させたものを酸性画分（試料２１Ａ）とし、さらに、酸性画分（試料２１−Ａ）の一部をビバスピン（サルトリウス）を用いて分子量分画し、１万以上、１−０．５、０．５万以下の３画分に分けた。
これらの各試料について、試験例１と同様に分析及び抗アレルギー活性の測定を行い、各試料の特性及び抗アレルギー活性を表４に示した。いずれの試料も乾物あたりのタンパク質が１％以下、灰分４〜６％、脂質０％で、炭水化物含量は９３〜９５％であった。

表４に示したように、試料２１Ａ（酸可溶性物質）は試料２（対照）に比べて明らかに活性が強かった。また、試料２１Ａの分子量分画物の内、分子量１万以上及び １−０．５万の画分の活性が強かった。
試料２１Ａの分子量０．５万以下の画分は活性が低かったことから、強い抗アレルギー活性を示すためには、ガラクツロン酸も一定量以上含有することが必要であることが確認できた。その量は構成糖質重量あたり、１０％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは２０％以上であった。

抗アレルギー剤の製造（３）
脱脂大豆と丸大豆を用いて定法通り製造した醤油諸味を圧搾、ろ過して得られた生醤油を脱塩した後、２倍量のエタノールを添加して発生した沈殿を採取した。この沈殿物に６５％エタノールを添加して洗浄した後乾燥させた（試料３）。これをｐＨ２の水溶液に分散させた後ろ過し、澄明な液を採取して乾燥させた。この一部を実施例１と同様の方法で分画して酸性画分（試料３Ａ）を得た。これらの試料について、試験例１と同様に分析及び、抗アレルギー活性の測定を行い、各試料の構成成分を表５に、特性及び抗アレルギー活性を表６に示した。

表６に示したように、試料３Ａは対照品（試料３）に比べて抗アレルギー活性が明らかに増強していることが確認できた。

結果
実施例１〜３及び試験例において示されたように、本発明において強い抗アレルギー活性が見られた画分はいずれも１）酸性多糖類を主成分とする、２）ｐＨ ２で可溶である、３）構成成分としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸比が０．２以上である物であった。

本発明により、１）酸性多糖類を主成分とする、２）ｐＨ２で可溶である、及び３）構成成分としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上である、ことを特徴とする新規の抗アレルギー剤を提供することにより、従来の大豆や醤油等の大豆醗酵物から得られる抗アレルギー剤よりも強い抗アレルギー活性を示す薬剤の提供が可能となる。

Claims (3)

1. 次の（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法によって得られる酸性画分を含む、次の１）または２）の特徴を有する抗アレルギー剤。
   １）ｐＨ２で可溶である
   ２）酸性画分の構成糖としてガラクツロン酸とキシロースを含有し、キシロース／ガラクツロン酸の重量比が０．２以上である
   （１）大豆又は大豆種皮を酸性水で抽出して得られた液を透析（分画分子量６０００）し、透析内液のエタノール沈殿物を陰イオン交換樹脂で分画して酸性画分を得る。
   （２）大豆の発酵処理物のエタノール沈殿物を酸性水に分散させて得た酸可溶性画分を陰イオン交換樹脂で分画して酸性画分を得る。
   （３）大豆の発酵処理物のエタノール沈殿物を酸性水に分散させ、ろ過して得た液を分画分子量６０００の透析膜で透析（分画分子量６０００）し、分画することで酸性画分を得る。
2. ガラクツロン酸を１０％以上含有する請求項１に記載の抗アレルギー剤。
3. 大豆の発酵処理物が醤油である請求項１または２に記載の抗アレルギー剤。