JP3071669B2 - 抗アレルギー物質、その製造方法、抗アレルギー剤及び機能性食品 - Google Patents
抗アレルギー物質、その製造方法、抗アレルギー剤及び機能性食品Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、シソ沸騰水抽出物から
得られる肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する抗アレルギー
物質、及びシソ熱水抽出物からの抗アレルギー物質の製
造方法、並びに抗アレルギー物質を含む抗アレルギー
剤、及び機能性食品に関し、本発明の抗アレルギー物質
は、アレルギーの治療、予防に有用である。
得られる肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する抗アレルギー
物質、及びシソ熱水抽出物からの抗アレルギー物質の製
造方法、並びに抗アレルギー物質を含む抗アレルギー
剤、及び機能性食品に関し、本発明の抗アレルギー物質
は、アレルギーの治療、予防に有用である。
【０００２】
【従来の技術】アレルギー性疾患は抗原抗体反応の形式
によりＩ型〜IV型の４つの型に分類されている。しかし
現在では通常アレルギー性疾患といえば、Ｉ型アレルギ
ーであるアレルギー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、
花粉症、アトピー性皮膚炎などを指すことが多い。
によりＩ型〜IV型の４つの型に分類されている。しかし
現在では通常アレルギー性疾患といえば、Ｉ型アレルギ
ーであるアレルギー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎、
花粉症、アトピー性皮膚炎などを指すことが多い。
【０００３】アレルギーの発生機序としては３つの段階
に分けられる。第一段階として花粉・ハウスダスト等の
抗原が器官粘膜に付着してＩｇＥ抗体の産生を起こす。
第二段階として抗原に感作された肥満細胞からヒスタミ
ン等の化学伝達物質が脱顆粒により遊離される。第三段
階として前記第二段階で遊離されたヒスタミン等の化学
物質が器官に作用してアレルギー症状を惹起する。
に分けられる。第一段階として花粉・ハウスダスト等の
抗原が器官粘膜に付着してＩｇＥ抗体の産生を起こす。
第二段階として抗原に感作された肥満細胞からヒスタミ
ン等の化学伝達物質が脱顆粒により遊離される。第三段
階として前記第二段階で遊離されたヒスタミン等の化学
物質が器官に作用してアレルギー症状を惹起する。
【０００４】前記アレルギー疾患の治療においては抗ヒ
スタミン剤、ステロイド剤、脱顆粒阻害剤などが用いら
れている。これらの治療剤の作用機序の概略としては、
抗ヒスタミン剤は第三段階であるヒスタミンの作用の阻
害、ステロイド剤は主に第一段階である抗体産生の抑
制、また脱顆粒阻害剤は第二段階である肥満細胞からの
脱顆粒を阻害することが知られている。
スタミン剤、ステロイド剤、脱顆粒阻害剤などが用いら
れている。これらの治療剤の作用機序の概略としては、
抗ヒスタミン剤は第三段階であるヒスタミンの作用の阻
害、ステロイド剤は主に第一段階である抗体産生の抑
制、また脱顆粒阻害剤は第二段階である肥満細胞からの
脱顆粒を阻害することが知られている。
【０００５】ところで、ヒアルロニダーゼ阻害活性は、
肥満細胞からのヒスタミン遊離に対する阻害効果を示す
機構の一つであることが掛川らの「J.Pharm.Dyn., 7,S-
96(1984)」で示されている。また、ヒアルロニダーゼ阻
害活性と肥満細胞からの脱顆粒阻害について相関関係が
あるということが掛川らの「Chem.Pharm.Bull.33(11)50
79-5082(1985) 」においてタンニンを用いた試験で明ら
かにされている。
肥満細胞からのヒスタミン遊離に対する阻害効果を示す
機構の一つであることが掛川らの「J.Pharm.Dyn., 7,S-
96(1984)」で示されている。また、ヒアルロニダーゼ阻
害活性と肥満細胞からの脱顆粒阻害について相関関係が
あるということが掛川らの「Chem.Pharm.Bull.33(11)50
79-5082(1985) 」においてタンニンを用いた試験で明ら
かにされている。
【０００６】前記従来の抗アレルギー剤は、常用する場
合も多くなること、また幼児に投与するケースも多いこ
とから、副作用が少なく安全な治療薬が従来から求めら
れている。そこでこれまでさまざまな植物において抗ア
レルギー作用成分の探索が行われ、なかでもシソ科植物
に含まれる成分に抗アレルギー効果があることが既に確
認されている。
合も多くなること、また幼児に投与するケースも多いこ
とから、副作用が少なく安全な治療薬が従来から求めら
れている。そこでこれまでさまざまな植物において抗ア
レルギー作用成分の探索が行われ、なかでもシソ科植物
に含まれる成分に抗アレルギー効果があることが既に確
認されている。
【０００７】例えば、特開平６−２９３６５２号公報
は、シソ茎葉部を有機溶剤を用いて抽出したものがＩ型
アレルギー抑制効果を有することを開示している。特開
平１−１０２０２７号公報は、シソ葉からのカルスを誘
導し、組織培養して得たカルスを乾燥したものを１０℃
で５０％エタノール水を用いて抽出し、濃縮乾固した抽
出物を得、この抽出物には肥満細胞脱顆粒抑制活性があ
ることを開示している。特開平６−６２７９５号公報
は、シソ葉を水、アルコール等の溶剤で抽出して溶剤を
蒸発乾固して得たシソ葉抽出物と、α−リノレン酸、エ
イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸から選ばれる
脂肪酸を構成脂肪酸として含む油脂とを食品に含有させ
た抗アレルギー食品を開示している。特開平４−７９８
５２号公報は、シソ科植物の茎葉を摩砕し、有機溶剤に
て抽出した後、溶剤を除去したものをアレルギー改善食
品とすることを開示している。
は、シソ茎葉部を有機溶剤を用いて抽出したものがＩ型
アレルギー抑制効果を有することを開示している。特開
平１−１０２０２７号公報は、シソ葉からのカルスを誘
導し、組織培養して得たカルスを乾燥したものを１０℃
で５０％エタノール水を用いて抽出し、濃縮乾固した抽
出物を得、この抽出物には肥満細胞脱顆粒抑制活性があ
ることを開示している。特開平６−６２７９５号公報
は、シソ葉を水、アルコール等の溶剤で抽出して溶剤を
蒸発乾固して得たシソ葉抽出物と、α−リノレン酸、エ
イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸から選ばれる
脂肪酸を構成脂肪酸として含む油脂とを食品に含有させ
た抗アレルギー食品を開示している。特開平４−７９８
５２号公報は、シソ科植物の茎葉を摩砕し、有機溶剤に
て抽出した後、溶剤を除去したものをアレルギー改善食
品とすることを開示している。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記各
従来技術に示されている抗アレルギー作用を有するシソ
抽出物は、シソ植物を溶剤で抽出し、溶剤を蒸発乾固し
たものであり、シソ植物中のどのような成分が抗アレル
ギー作用を有するのか、その特定には至っていない。そ
こで、本発明は、シソ植物中に含まれる抗アレルギー作
用を有する物質を精製し、その成分を特定化し、その特
定化された抗アレルギー物質及びその製造方法を提供す
ること、その抗アレルギー物質を含む抗アレルギー剤、
並びにその抗アレルギー物質を添加した機能性食品を提
供することを目的とする。
従来技術に示されている抗アレルギー作用を有するシソ
抽出物は、シソ植物を溶剤で抽出し、溶剤を蒸発乾固し
たものであり、シソ植物中のどのような成分が抗アレル
ギー作用を有するのか、その特定には至っていない。そ
こで、本発明は、シソ植物中に含まれる抗アレルギー作
用を有する物質を精製し、その成分を特定化し、その特
定化された抗アレルギー物質及びその製造方法を提供す
ること、その抗アレルギー物質を含む抗アレルギー剤、
並びにその抗アレルギー物質を添加した機能性食品を提
供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記したように、肥満細
胞脱顆粒阻害活性とヒアルロニダーゼ阻害活性とは関連
があることが知られているので、ヒアルロニダーゼ阻害
活性を測定することは肥満細胞脱顆粒阻害活性物質の検
索に有用である。そこで本発明者らは、ヒアルロニダー
ゼ阻害活性を指標として検索した結果、肥満細胞からの
脱顆粒に対する阻害活性を示す成分をシソ葉の沸騰水抽
出物より決定し、本発明を完成させた。
胞脱顆粒阻害活性とヒアルロニダーゼ阻害活性とは関連
があることが知られているので、ヒアルロニダーゼ阻害
活性を測定することは肥満細胞脱顆粒阻害活性物質の検
索に有用である。そこで本発明者らは、ヒアルロニダー
ゼ阻害活性を指標として検索した結果、肥満細胞からの
脱顆粒に対する阻害活性を示す成分をシソ葉の沸騰水抽
出物より決定し、本発明を完成させた。
【００１０】すなわち、本発明の一番目の抗アレルギー
物質は、シソ沸騰水抽出物から得られ、肥満細胞脱顆粒
阻害活性を有し、糖及びアミノ酸を構成要素として含む
分子量１３，５００、比旋光度〔α〕 D （０．２５、Ｈ
2 Ｏ）＝−０．４、褐色物質（抗アレルギー物質Ｉとい
う）であることを特徴とする。
物質は、シソ沸騰水抽出物から得られ、肥満細胞脱顆粒
阻害活性を有し、糖及びアミノ酸を構成要素として含む
分子量１３，５００、比旋光度〔α〕 D （０．２５、Ｈ
2 Ｏ）＝−０．４、褐色物質（抗アレルギー物質Ｉとい
う）であることを特徴とする。
【００１１】本発明の上記抗アレルギー物質Ｉとは別の
抗アレルギー物質は、シソ沸騰水抽出物から得られ、肥
満細胞脱顆粒阻害活性を有するポリフェノール類であっ
て、次の２種類に分別することができ、一方は、ＤＥＡ
Ｅ陰イオンカラムを用いたカラムクロマトグラフィーに
より５０％アセトンで溶出することができ（本方法によ
り溶出された物質を抗アレルギー物質IIという）、他方
は、ＤＥＡＥ陰イオンカラムを用いたカラムクロマトグ
ラフィーにより０．１Ｎ ＨＣｌを含む５０％アセトン
で溶出することができる（本方法により溶出された物質
を抗アレルギー物質III という）。
抗アレルギー物質は、シソ沸騰水抽出物から得られ、肥
満細胞脱顆粒阻害活性を有するポリフェノール類であっ
て、次の２種類に分別することができ、一方は、ＤＥＡ
Ｅ陰イオンカラムを用いたカラムクロマトグラフィーに
より５０％アセトンで溶出することができ（本方法によ
り溶出された物質を抗アレルギー物質IIという）、他方
は、ＤＥＡＥ陰イオンカラムを用いたカラムクロマトグ
ラフィーにより０．１Ｎ ＨＣｌを含む５０％アセトン
で溶出することができる（本方法により溶出された物質
を抗アレルギー物質III という）。
【００１２】本発明の抗アレルギー物質の製造方法は、
シソ葉を沸騰水で抽出し、固液を分離し、得られた水溶
液を沈澱剤により沈澱させ、得られた沈澱物より水溶性
成分を溶出させ、さらに得られた溶出成分を１種又は２
種以上のカラムクロマトグラフィーにより分別・精製し
て肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する物質を得ることを特
徴とする。
シソ葉を沸騰水で抽出し、固液を分離し、得られた水溶
液を沈澱剤により沈澱させ、得られた沈澱物より水溶性
成分を溶出させ、さらに得られた溶出成分を１種又は２
種以上のカラムクロマトグラフィーにより分別・精製し
て肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する物質を得ることを特
徴とする。
【００１３】本発明の抗アレルギー剤は、前記各精製段
階で分別される抗アレルギー物質を製剤化したことを特
徴とする。
階で分別される抗アレルギー物質を製剤化したことを特
徴とする。
【００１４】本発明の機能性食品は、前記各精製段階で
分別される抗アレルギー物質を食品に添加して抗アレル
ギー機能を食品に付与したことを特徴とする。
分別される抗アレルギー物質を食品に添加して抗アレル
ギー機能を食品に付与したことを特徴とする。
【００１５】以下に本発明をさらに詳細に説明する。
【００１６】本発明の抗アレルギー物質の製造原料とな
るシソは、シソ科の植物及びその近縁植物であり、例え
ば、青チリメンシソ、赤チリメンシソ、シソ科近縁植物
については、カキオドシ、キダンソウ、ウツボグサ、ハ
ッカ、メハジキ、エゴマ、カタメンジソ、ナギナタコウ
ジュ、ヒキオコシ、コガネバナ、セージ、タイム、バジ
ル、ミント、ラベンダー、オレガノ、セボリ、レモンパ
ーム、ローズマリー、キャットニップ、ヒソップ、ベル
ガモット等を挙げることができる。これらの原料の葉、
茎、種子が使用され、生の植物でも乾燥された植物でも
利用できるが、乾燥されたものは保存性に富む点におい
て、便利な原料である。
るシソは、シソ科の植物及びその近縁植物であり、例え
ば、青チリメンシソ、赤チリメンシソ、シソ科近縁植物
については、カキオドシ、キダンソウ、ウツボグサ、ハ
ッカ、メハジキ、エゴマ、カタメンジソ、ナギナタコウ
ジュ、ヒキオコシ、コガネバナ、セージ、タイム、バジ
ル、ミント、ラベンダー、オレガノ、セボリ、レモンパ
ーム、ローズマリー、キャットニップ、ヒソップ、ベル
ガモット等を挙げることができる。これらの原料の葉、
茎、種子が使用され、生の植物でも乾燥された植物でも
利用できるが、乾燥されたものは保存性に富む点におい
て、便利な原料である。
【００１７】これらのシソから、有効成分を取得する方
法において、最初にシソ葉に対して沸騰水で抽出するこ
とが抽出効率を上げるために必須である。本発明におい
て沸騰水抽出する方法は、適宜の条件下で行うことがで
きるが、一般的には、例えば、乾燥したシソ葉に水を加
え、１５分間程度煮沸処理することによって行われる。
法において、最初にシソ葉に対して沸騰水で抽出するこ
とが抽出効率を上げるために必須である。本発明におい
て沸騰水抽出する方法は、適宜の条件下で行うことがで
きるが、一般的には、例えば、乾燥したシソ葉に水を加
え、１５分間程度煮沸処理することによって行われる。
【００１８】上記の煮沸処理で得られた沸騰水抽出液か
らのさらなる有効成分の分離、精製は、通常の天然物か
らの分離・精製手段に準じて行うことができる。例え
ば、沸騰水抽出終了後、濾過、遠心分離等により固、液
を分離し、得られる水溶液をセチルピリジニウムクロラ
イドなどの沈澱剤を用いることによって沈澱させ、その
沈澱物中より水溶性成分を溶出させ、カラムクロマトグ
ラフィー〔例えば、ＤＥＡＥイオン交換樹脂（東ソー
製）を用いたカラムクロマトグラフィー等〕を用いるこ
とができる。このカラムクロマトグラフィーにより前記
した溶出方法により抗アレルギー物質Ｉ、II、III を得
ることができる。
らのさらなる有効成分の分離、精製は、通常の天然物か
らの分離・精製手段に準じて行うことができる。例え
ば、沸騰水抽出終了後、濾過、遠心分離等により固、液
を分離し、得られる水溶液をセチルピリジニウムクロラ
イドなどの沈澱剤を用いることによって沈澱させ、その
沈澱物中より水溶性成分を溶出させ、カラムクロマトグ
ラフィー〔例えば、ＤＥＡＥイオン交換樹脂（東ソー
製）を用いたカラムクロマトグラフィー等〕を用いるこ
とができる。このカラムクロマトグラフィーにより前記
した溶出方法により抗アレルギー物質Ｉ、II、III を得
ることができる。
【００１９】本発明の抗アレルギー物質Ｉ、II、III を
さらに精製するには、ヒアルロニダーゼを固定化した担
体を作成し、この担体を使用したアフィニテークロマト
グラフィーにより効率よく精製することができることを
本発明者は見いだした。
さらに精製するには、ヒアルロニダーゼを固定化した担
体を作成し、この担体を使用したアフィニテークロマト
グラフィーにより効率よく精製することができることを
本発明者は見いだした。
【００２０】本発明によって得られた抗アレルギー物質
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩは、肥満細胞脱顆粒阻害作用を有して
おり、医薬品、或いは食品に添加した機能性食品として
利用される。本発明の抗アレルギー物質Ｉ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉを医薬品、或いは機能性食品に利用するには、抗アレ
ルギー物質Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの分別された、どのような
精製段階のものも使用することが可能である。例えば、
機能性食品においては、抗アレルギー物質Ｉ、ＩＩ、Ｉ
ＩＩの各種精製段階の１種又は２種以上を各種食品、例
えば、紅茶、清涼飲料水、ジュース、あめ、澱粉質食
品、各種加工食品等に添加することによって肥満細胞脱
顆粒阻害作用が付加された機能性食品を得ることができ
る。本発明による抗アレルギー物質は、アレルギー性気
管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚
炎等のＩ型アレルギーを予防、又は治療することを目的
とした抗アレルギー剤として用いることができる。本発
明の抗アレルギー剤には、各種精製段階の抗アレルギー
物質Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ自体を有効成分として製剤化して
もよいし、これらの抗アレルギー物質と両立する他の抗
アレルギー剤またはその他の医薬と共存させた形態で製
剤化して用いることができる。
Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩは、肥満細胞脱顆粒阻害作用を有して
おり、医薬品、或いは食品に添加した機能性食品として
利用される。本発明の抗アレルギー物質Ｉ、ＩＩ、ＩＩ
Ｉを医薬品、或いは機能性食品に利用するには、抗アレ
ルギー物質Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの分別された、どのような
精製段階のものも使用することが可能である。例えば、
機能性食品においては、抗アレルギー物質Ｉ、ＩＩ、Ｉ
ＩＩの各種精製段階の１種又は２種以上を各種食品、例
えば、紅茶、清涼飲料水、ジュース、あめ、澱粉質食
品、各種加工食品等に添加することによって肥満細胞脱
顆粒阻害作用が付加された機能性食品を得ることができ
る。本発明による抗アレルギー物質は、アレルギー性気
管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、アトピー性皮膚
炎等のＩ型アレルギーを予防、又は治療することを目的
とした抗アレルギー剤として用いることができる。本発
明の抗アレルギー剤には、各種精製段階の抗アレルギー
物質Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ自体を有効成分として製剤化して
もよいし、これらの抗アレルギー物質と両立する他の抗
アレルギー剤またはその他の医薬と共存させた形態で製
剤化して用いることができる。
【００２１】投与する方法は、経口又は非経口投与によ
る製剤のいずれをも選ぶことができる。具体的な製剤と
しては、注射（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下注
射、点滴等）剤、座薬、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル
剤、クリーム剤、パップ剤等を挙げることができる。ま
た、これら製剤に用いられる担体としては、経口、非経
口に適した有機又は無機の不活性な担体が用いられる。
具体的には、例えば乳糖、でんぷん、植物性又は動物性
の脂肪及び油脂等が挙げられる。製剤中の担体に対する
本発明の抗アレルギー物質の割合は、０．１〜１００％
の間で変化させることができる。また、この組成物中に
は、製剤上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、
崩壊剤、湿潤剤等の添加剤を含有させることができる。
る製剤のいずれをも選ぶことができる。具体的な製剤と
しては、注射（例えば、静脈注射、筋肉注射、皮下注
射、点滴等）剤、座薬、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル
剤、クリーム剤、パップ剤等を挙げることができる。ま
た、これら製剤に用いられる担体としては、経口、非経
口に適した有機又は無機の不活性な担体が用いられる。
具体的には、例えば乳糖、でんぷん、植物性又は動物性
の脂肪及び油脂等が挙げられる。製剤中の担体に対する
本発明の抗アレルギー物質の割合は、０．１〜１００％
の間で変化させることができる。また、この組成物中に
は、製剤上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、
崩壊剤、湿潤剤等の添加剤を含有させることができる。
【００２２】経口用液体製剤としては、内用水剤、懸濁
剤、乳剤、シロップ剤等のいずれの形態であってもよ
く、またその組成物中には添加剤、保存剤を含有するこ
とができる。
剤、乳剤、シロップ剤等のいずれの形態であってもよ
く、またその組成物中には添加剤、保存剤を含有するこ
とができる。
【００２３】本発明の抗アレルギー剤の投与量は、年
令、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、肥満細胞脱顆粒阻害物質の有
効量と適切な希釈剤、及び薬理学的に使用できる担体の
組成物として投与される。投与される有効量は、０．５
μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、一日一回から数
回に分けて投与される。
令、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、肥満細胞脱顆粒阻害物質の有
効量と適切な希釈剤、及び薬理学的に使用できる担体の
組成物として投与される。投与される有効量は、０．５
μｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、一日一回から数
回に分けて投与される。
【００２４】分子量：抗アレルギー物質Ｉ、II及びIII
の各々を限外濾過膜法（アミコン社製セントリプレッ
プ）により分子量を測定すると、それぞれ分子量１０万
のフィルターを通過するが、分子量１万のフィルターは
通過しないので、抗アレルギー物質Ｉ、II及びIII は、
それぞれ１万以上１０万以下の分子量であると確認され
る。さらに、抗アレルギー物質Ｉについて、ポリアクリ
ルアミドゲルによる電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＡ）で
分子量を測定すると、１３，５００に単一のバンド観察
される。よって、抗アレルギー物質Ｉの分子量は、１
３，５００とされる。
の各々を限外濾過膜法（アミコン社製セントリプレッ
プ）により分子量を測定すると、それぞれ分子量１０万
のフィルターを通過するが、分子量１万のフィルターは
通過しないので、抗アレルギー物質Ｉ、II及びIII は、
それぞれ１万以上１０万以下の分子量であると確認され
る。さらに、抗アレルギー物質Ｉについて、ポリアクリ
ルアミドゲルによる電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＡ）で
分子量を測定すると、１３，５００に単一のバンド観察
される。よって、抗アレルギー物質Ｉの分子量は、１
３，５００とされる。
【００２５】前記ＳＤＳ−ＰＡＧＡによる分子量の決定
は、還元条件下で以下のように行う。サンプルを９５
℃、５分間熱処理することによって変性させ、サンプル
バッファーとして、０．０６Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）、１．７１％ＳＤＳ、６％グリセロール、
０．１Ｍジチオスライトール、０．００２％ＢＰＢ（ブ
ロモフェノールブルーの略語）の組成からなるバッファ
ーを用い、５ｍＡで６０分間通電した後、８−１０ｍＡ
で１５０分間泳動する。泳動後は、銀染色によりタンパ
ク質を、またＰＡＳ染色により多糖類を染色し、タンパ
ク質の標準分子量マーカーを同時に泳動することによっ
て、分子量を求める。
は、還元条件下で以下のように行う。サンプルを９５
℃、５分間熱処理することによって変性させ、サンプル
バッファーとして、０．０６Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ６．８）、１．７１％ＳＤＳ、６％グリセロール、
０．１Ｍジチオスライトール、０．００２％ＢＰＢ（ブ
ロモフェノールブルーの略語）の組成からなるバッファ
ーを用い、５ｍＡで６０分間通電した後、８−１０ｍＡ
で１５０分間泳動する。泳動後は、銀染色によりタンパ
ク質を、またＰＡＳ染色により多糖類を染色し、タンパ
ク質の標準分子量マーカーを同時に泳動することによっ
て、分子量を求める。
【００２６】溶解性：抗アレルギー物質Ｉは水及びメタ
ノールに易溶である。
ノールに易溶である。
【００２７】抗アレルギー物質II及びIII は、何れも水
にわずかに溶ける。
にわずかに溶ける。
【００２８】抗アレルギー物質Ｉ、II及びIII は、何れ
も中性酢酸エチルで抽出されない。抗アレルギー物質
Ｉ、II及びIII は、何れも中性ｎ−ブタノールでは抽出
されない。
も中性酢酸エチルで抽出されない。抗アレルギー物質
Ｉ、II及びIII は、何れも中性ｎ−ブタノールでは抽出
されない。
【００２９】各種イオン交換クロマトグラフィーにおけ
る吸着特性：抗アレルギー物質Ｉ、II及びIII は、何れ
もＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着する。抗アレルギ
ー物質Ｉ、II及びIII は、何れもカルボキシメチルセル
ロース陽イオン交換樹脂（以下、ＣＭ陽イオン交換樹脂
という）に吸着しないことから、酸性物質である。前記
ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着されている抗アレル
ギー物質Ｉは１Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出され、また前記
ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着されている抗アレル
ギー物質IIは50％アセトン溶液で溶出され、また前記Ｄ
ＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着されている抗アレルギ
ー物質III は０．１Ｎ ＨＣｌ含有５０％アセトン溶液
により溶出される。
る吸着特性：抗アレルギー物質Ｉ、II及びIII は、何れ
もＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着する。抗アレルギ
ー物質Ｉ、II及びIII は、何れもカルボキシメチルセル
ロース陽イオン交換樹脂（以下、ＣＭ陽イオン交換樹脂
という）に吸着しないことから、酸性物質である。前記
ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着されている抗アレル
ギー物質Ｉは１Ｍ ＮａＣｌ溶液で溶出され、また前記
ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着されている抗アレル
ギー物質IIは50％アセトン溶液で溶出され、また前記Ｄ
ＥＡＥ陰イオン交換カラムに吸着されている抗アレルギ
ー物質III は０．１Ｎ ＨＣｌ含有５０％アセトン溶液
により溶出される。
【００３０】熱安定性：抗アレルギー物質Ｉ、II及びII
I は、何れも１００℃３０分間の熱処理で安定であり、
この熱処理で肥満細胞脱顆粒阻害活性は失活しない。
I は、何れも１００℃３０分間の熱処理で安定であり、
この熱処理で肥満細胞脱顆粒阻害活性は失活しない。
【００３１】酵素処理安定性：抗アレルギー物質Ｉ、II
及びIII は、何れも３０℃、１５分間のトリプシン処理
で肥満細胞脱顆粒阻害活性は失活しない。
及びIII は、何れも３０℃、１５分間のトリプシン処理
で肥満細胞脱顆粒阻害活性は失活しない。
【００３２】呈色反応：抗アレルギー物質Ｉは、フェノ
ール−硫酸法による呈色反応が陽性であるので、糖を含
むことが示される。
ール−硫酸法による呈色反応が陽性であるので、糖を含
むことが示される。
【００３３】抗アレルギー物質Ｉは、カルバゾール−硫
酸法により陽性を示すので、上記各性質を考慮すると抗
アレルギー物質Ｉに含まれる糖はウロン酸を含む糖であ
ることが分かる。
酸法により陽性を示すので、上記各性質を考慮すると抗
アレルギー物質Ｉに含まれる糖はウロン酸を含む糖であ
ることが分かる。
【００３４】抗アレルギー物質II及びIII は、ポリクラ
ールＡＴで処理すると、沈澱するので、上記各性質を考
慮するとポリフェノール類であることが分かる。
ールＡＴで処理すると、沈澱するので、上記各性質を考
慮するとポリフェノール類であることが分かる。
【００３５】物質の色：精製抗アレルギー物質Ｉ（下記
の実施例５で得られたもの）は褐色である。
の実施例５で得られたもの）は褐色である。
【００３６】比旋光度：精製抗アレルギー物質Ｉ（下記
の実施例５で得られたもの）について〔α〕D＝−０．
４（０．２５，Ｈ2 Ｏ）紫外線吸収スペクトル ：精製抗アレルギー物質Ｉ（下記
の実施例５で得られたもの）の紫外線吸収スペクトルの
チャートを図１に示す。
の実施例５で得られたもの）について〔α〕D＝−０．
４（０．２５，Ｈ2 Ｏ）紫外線吸収スペクトル ：精製抗アレルギー物質Ｉ（下記
の実施例５で得られたもの）の紫外線吸収スペクトルの
チャートを図１に示す。
【００３７】赤外線吸収スペクトル：精製抗アレルギー
物質Ｉ（下記の実施例５で得られたもの）の赤外線吸収
スペクトルのチャートを図２に示す。
物質Ｉ（下記の実施例５で得られたもの）の赤外線吸収
スペクトルのチャートを図２に示す。
【００３８】アミノ酸組成：抗アレルギー物質Ｉを６Ｎ
−ＨＣｌ、１１０℃、２４時間加水分解した後のアミノ
酸分析の結果を下記の表１に示す。なお、本分析ではト
リプトファンは検出できない。
−ＨＣｌ、１１０℃、２４時間加水分解した後のアミノ
酸分析の結果を下記の表１に示す。なお、本分析ではト
リプトファンは検出できない。
【００３９】
【表１】
【００４０】糖組成：抗アレルギー物質Ｉを２Ｎ−ＨＣ
ｌ、１００℃、４時間加水分解した後の糖組成分析の結
果を下記の表２に示す。
ｌ、１００℃、４時間加水分解した後の糖組成分析の結
果を下記の表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】ＬＤ50 ：精製抗アレルギー物質Ｉ（下記の
実施例５で得られたもの）、抗アレルギー物質II（下記
の実施例１で得られたもの）、 抗アレルギー物質III
（下記の実施例１で得られたもの）のＬＤ50はそれぞれ
２ｇ／Ｋｇ以上である。
実施例５で得られたもの）、抗アレルギー物質II（下記
の実施例１で得られたもの）、 抗アレルギー物質III
（下記の実施例１で得られたもの）のＬＤ50はそれぞれ
２ｇ／Ｋｇ以上である。
【００４３】
【実施例】〔実施例１〕シソ葉からの抗アレルギー物質Ｉ（ＤＥＡＥ画分Ｉ）、
抗アレルギー物質II（ＤＥＡＥ画分II）、及び抗アレル
ギー物質III （ＤＥＡＥ画分III)の製造 乾燥したシソ葉１００ｇに水１リットルを加え、１５分
間煮沸した。次に、この沸騰水抽出液を冷却後、減圧下
で吸引濾過し、固・液を分離した。得られた水溶液５０
０ｍｌにセチルピリジニウムクロライドを添加し、３０
℃１２時間放置することによって沈澱が形成した。得ら
れた沈澱物を、１５％エタノール１００ｍｌで洗浄し、
１０，０００回転、２０分間の遠心分離により試薬を除
去した後、沈澱物に５０ｍｌの水を添加し、水溶性有効
成分を溶出させた。
抗アレルギー物質II（ＤＥＡＥ画分II）、及び抗アレル
ギー物質III （ＤＥＡＥ画分III)の製造 乾燥したシソ葉１００ｇに水１リットルを加え、１５分
間煮沸した。次に、この沸騰水抽出液を冷却後、減圧下
で吸引濾過し、固・液を分離した。得られた水溶液５０
０ｍｌにセチルピリジニウムクロライドを添加し、３０
℃１２時間放置することによって沈澱が形成した。得ら
れた沈澱物を、１５％エタノール１００ｍｌで洗浄し、
１０，０００回転、２０分間の遠心分離により試薬を除
去した後、沈澱物に５０ｍｌの水を添加し、水溶性有効
成分を溶出させた。
【００４４】得られた溶出液を５０ｍＭホウ酸緩衝液
（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−Toyopearl カラ
ム（東ソー株式会社製）に充填し、同緩衝液で洗浄した
後、溶出液として１Ｍ ＮａＣｌ溶液、０．１Ｎ ＨＣ
ｌ溶液、５０％アセトン溶液、０．１Ｎ ＨＣｌ含有５
０％アセトン溶液により順次溶出した。回収したそれぞ
れの画分（ＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ
画分III ）を減圧乾固し、粗抗アレルギー物質Ｉ、抗ア
レルギー物質II、抗アレルギー物質III とした。
（ｐＨ７．４）で平衡化したＤＥＡＥ−Toyopearl カラ
ム（東ソー株式会社製）に充填し、同緩衝液で洗浄した
後、溶出液として１Ｍ ＮａＣｌ溶液、０．１Ｎ ＨＣ
ｌ溶液、５０％アセトン溶液、０．１Ｎ ＨＣｌ含有５
０％アセトン溶液により順次溶出した。回収したそれぞ
れの画分（ＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ
画分III ）を減圧乾固し、粗抗アレルギー物質Ｉ、抗ア
レルギー物質II、抗アレルギー物質III とした。
【００４５】〔実施例２〕ヒアルロニダーゼ阻害活性の測定 ： 前記実施例１で得られたシソ沸騰水抽出液、ＤＥＡＥ画
分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ画分III の各ヒアルロ
ニダーゼ阻害活性を、沢辺らの「衛生化学、36(4) 、31
4-319(1990) 」に記載の方法に準じて、以下に示す方法
で測定した。
分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ画分III の各ヒアルロ
ニダーゼ阻害活性を、沢辺らの「衛生化学、36(4) 、31
4-319(1990) 」に記載の方法に準じて、以下に示す方法
で測定した。
【００４６】ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ（シグマ社
製）２．８３ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．
０）１ｍｌに溶解した液０．１５ｍｌと緩衝液（０．１
Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）に溶解した０．３Ｍ ＮａＣｌ溶
液０．２ｍｌとを混合し、３７℃、２０分間保温した。
その反応液に各種被検液０．１ｍｌを加え、３７℃、２
０分間保温した。さらに雄鶏のとさか由来ヒアルロン酸
カリウム塩（シグマ社製）１．８３ｍｇを緩衝液（０．
１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）１ｍｌに溶解した液０．２ｍｌ
を加え、３７℃、２０分間保温した。続いて０．４Ｎ
ＮａＯＨ１．８３ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ
４．０）１ｍｌに溶解した液０．２ｍｌを加え、３７
℃、２０分間保温した後、５８５ｎｍにおける吸光度を
測定した。
製）２．８３ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．
０）１ｍｌに溶解した液０．１５ｍｌと緩衝液（０．１
Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）に溶解した０．３Ｍ ＮａＣｌ溶
液０．２ｍｌとを混合し、３７℃、２０分間保温した。
その反応液に各種被検液０．１ｍｌを加え、３７℃、２
０分間保温した。さらに雄鶏のとさか由来ヒアルロン酸
カリウム塩（シグマ社製）１．８３ｍｇを緩衝液（０．
１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）１ｍｌに溶解した液０．２ｍｌ
を加え、３７℃、２０分間保温した。続いて０．４Ｎ
ＮａＯＨ１．８３ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ
４．０）１ｍｌに溶解した液０．２ｍｌを加え、３７
℃、２０分間保温した後、５８５ｎｍにおける吸光度を
測定した。
【００４７】前記実施例１で得られたシソ沸騰水抽出
液、ＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ画分II
I 、を用いてヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した結果
を、縦軸にヒアルロニダーゼ阻害率、横軸に各画分をと
って、図３に示した。図３中、（１）の矢印は１Ｍ Ｎ
ａＣｌ溶液の注入時期、（２）の矢印は０．１Ｎ ＨＣ
ｌ溶液の注入時期、（３）の矢印は５０％アセトン溶液
の注入時期、（４）の矢印は０．１Ｎ ＨＣｌ含有５０
％アセトン溶液の注入時期を示す。
液、ＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ画分II
I 、を用いてヒアルロニダーゼ阻害活性を測定した結果
を、縦軸にヒアルロニダーゼ阻害率、横軸に各画分をと
って、図３に示した。図３中、（１）の矢印は１Ｍ Ｎ
ａＣｌ溶液の注入時期、（２）の矢印は０．１Ｎ ＨＣ
ｌ溶液の注入時期、（３）の矢印は５０％アセトン溶液
の注入時期、（４）の矢印は０．１Ｎ ＨＣｌ含有５０
％アセトン溶液の注入時期を示す。
【００４８】〔実施例３〕肥満細胞脱顆粒阻害活性の測定 前記実施例１における、シソ沸騰水抽出液、並びにＤＥ
ＡＥ−Toyopearl カラム（東ソー株式会社製）から溶出
されるＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、及びＤＥＡＥ
画分III の各肥満細胞脱顆粒阻害活性を、以下に示す方
法で測定した。
ＡＥ−Toyopearl カラム（東ソー株式会社製）から溶出
されるＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、及びＤＥＡＥ
画分III の各肥満細胞脱顆粒阻害活性を、以下に示す方
法で測定した。
【００４９】最初に、ラット腹腔肥満細胞の調製を、中
込らの方法〔中込和哉他、Journalof Antibiolics４３
巻、５号、４６２−４６９頁、１９９０年）に準じて次
のように行った。即ち、ウイスター系ラット腹腔内に、
Tyrode液２０ｍｌを注入し、ピペットで腹水を取り出し
た。採取した腹水は４℃、１００ｘｇ、１２分間遠心分
離し、沈澱した細胞を集めた。この細胞をTyrode液２ｍ
ｌに懸濁させ、比重１．０６８に調整した牛血清アルブ
ミン（略語：ＢＳＡ）生理食塩水４ｍｌに重層し、４
℃、１００ｘｇ、１２分間遠心分離した後、沈澱した肥
満細胞を集めた。抗ＤＮＰマウスモノクローナルＩｇＥ
抗体を３７℃、１時間反応することにより、ＩｇＥを肥
満細胞に結合させ、感作状態とした。Tyrode液で数回洗
浄した後、０．２％ＢＳＡを含むTyrode液に肥満細胞が
１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁させて調
製し、ＩｇＥ感作肥満細胞懸濁液を得た。
込らの方法〔中込和哉他、Journalof Antibiolics４３
巻、５号、４６２−４６９頁、１９９０年）に準じて次
のように行った。即ち、ウイスター系ラット腹腔内に、
Tyrode液２０ｍｌを注入し、ピペットで腹水を取り出し
た。採取した腹水は４℃、１００ｘｇ、１２分間遠心分
離し、沈澱した細胞を集めた。この細胞をTyrode液２ｍ
ｌに懸濁させ、比重１．０６８に調整した牛血清アルブ
ミン（略語：ＢＳＡ）生理食塩水４ｍｌに重層し、４
℃、１００ｘｇ、１２分間遠心分離した後、沈澱した肥
満細胞を集めた。抗ＤＮＰマウスモノクローナルＩｇＥ
抗体を３７℃、１時間反応することにより、ＩｇＥを肥
満細胞に結合させ、感作状態とした。Tyrode液で数回洗
浄した後、０．２％ＢＳＡを含むTyrode液に肥満細胞が
１×１０6 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁させて調
製し、ＩｇＥ感作肥満細胞懸濁液を得た。
【００５０】前記工程で得られたＩｇＥ感作肥満細胞懸
濁液に、前記実施例１における、シソ沸騰水抽出液、及
びＤＥＡＥ−Toyopearl カラム（東ソー株式会社製）か
ら溶出されるＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、及びＤ
ＥＡＥ画分III を被験液として加え、３７℃、５分間イ
ンキュベートした後、脱顆粒誘発剤とし抗原（ＤＮＰ−
ＢＳＡ）（２００ｎｇ／ｍｌ）＋フォスファチジルセリ
ン（１０μｇ／ｍｌ）ＰＢＳ（−）溶液を添加し、再度
３７℃、１０分間インキュベートした。１５００ｘｇ、
５分間の遠心での上清中に含まれるヒスタミン量を、オ
ルトフタルアルデヒド（略語：ＯＰＡ）でポストカラム
ラベルすることにより、ＨＰＬＣで定量した。ヒスタミ
ン遊離阻害活性は、脱顆粒誘発剤により遊離されるヒス
タミン量に対する阻害率として表し、下記の式（１）に
より求めた。
濁液に、前記実施例１における、シソ沸騰水抽出液、及
びＤＥＡＥ−Toyopearl カラム（東ソー株式会社製）か
ら溶出されるＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II、及びＤ
ＥＡＥ画分III を被験液として加え、３７℃、５分間イ
ンキュベートした後、脱顆粒誘発剤とし抗原（ＤＮＰ−
ＢＳＡ）（２００ｎｇ／ｍｌ）＋フォスファチジルセリ
ン（１０μｇ／ｍｌ）ＰＢＳ（−）溶液を添加し、再度
３７℃、１０分間インキュベートした。１５００ｘｇ、
５分間の遠心での上清中に含まれるヒスタミン量を、オ
ルトフタルアルデヒド（略語：ＯＰＡ）でポストカラム
ラベルすることにより、ＨＰＬＣで定量した。ヒスタミ
ン遊離阻害活性は、脱顆粒誘発剤により遊離されるヒス
タミン量に対する阻害率として表し、下記の式（１）に
より求めた。
【００５１】 ヒスタミン遊離阻害率（％）＝ 〔１−（Ｈｓ−Ｈｂ）／（Ｈｉ−Ｈｂ）〕×１００ 式（１） Ｈｂ：細胞をＰＢＳとのみインキュベートした時に遊離
されるヒスタミン量 Ｈｉ：細胞を被検液の非存在下に脱顆粒誘発剤とインキ
ュベートした時に遊離されるヒスタミン量 Ｈｓ：細胞を被検液の存在下に脱顆粒誘発剤とインキュ
ベートした時に遊離されるヒスタミン量
されるヒスタミン量 Ｈｉ：細胞を被検液の非存在下に脱顆粒誘発剤とインキ
ュベートした時に遊離されるヒスタミン量 Ｈｓ：細胞を被検液の存在下に脱顆粒誘発剤とインキュ
ベートした時に遊離されるヒスタミン量
【００５２】得られた結果について、ＤＥＡＥ−Toyope
arl カラム（東ソー株式会社製）から順次排出されるフ
ラクションナンバーを横軸にとり、各フラクションの肥
満細胞脱顆粒阻害率を縦軸にとったグラフを図４に示
す。なお、図４中、Ｆｒ．１はＤＥＡＥ画分Ｉ、Ｆｒ．
２はＤＥＡＥ画分II、Ｆｒ．３はＤＥＡＥ画分III を示
し、（１）の矢印は１Ｍ ＮａＣｌ溶液の注入時期、
（２）の矢印は０．１ＮＨＣｌ溶液の注入時期、（３）
の矢印は５０％アセトン溶液の注入時期、（４）の矢印
は０．１Ｎ ＨＣｌ含有５０％アセトン溶液の注入時期
を示す。図４によれば、ＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分
II、ＤＥＡＥ画分III は、シソ沸騰水抽出液に比べて遊
離ヒスタミン量が少なく、即ち高い肥満細胞脱顆粒阻害
活性があることがわかる。
arl カラム（東ソー株式会社製）から順次排出されるフ
ラクションナンバーを横軸にとり、各フラクションの肥
満細胞脱顆粒阻害率を縦軸にとったグラフを図４に示
す。なお、図４中、Ｆｒ．１はＤＥＡＥ画分Ｉ、Ｆｒ．
２はＤＥＡＥ画分II、Ｆｒ．３はＤＥＡＥ画分III を示
し、（１）の矢印は１Ｍ ＮａＣｌ溶液の注入時期、
（２）の矢印は０．１ＮＨＣｌ溶液の注入時期、（３）
の矢印は５０％アセトン溶液の注入時期、（４）の矢印
は０．１Ｎ ＨＣｌ含有５０％アセトン溶液の注入時期
を示す。図４によれば、ＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分
II、ＤＥＡＥ画分III は、シソ沸騰水抽出液に比べて遊
離ヒスタミン量が少なく、即ち高い肥満細胞脱顆粒阻害
活性があることがわかる。
【００５３】前記実施例１における沸騰水抽出物、ＤＥ
ＡＥ−Toyopearl カラム（東ソー株式会社製）から溶出
されるＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II及びＤＥＡＥ画
分III について、前記実施例２に基づきヒアルロニダー
ゼ阻害活性を、また本実施例に３基づき肥満細胞脱顆粒
阻害活性を測定し、その結果を下記の表３に示す。
ＡＥ−Toyopearl カラム（東ソー株式会社製）から溶出
されるＤＥＡＥ画分Ｉ、ＤＥＡＥ画分II及びＤＥＡＥ画
分III について、前記実施例２に基づきヒアルロニダー
ゼ阻害活性を、また本実施例に３基づき肥満細胞脱顆粒
阻害活性を測定し、その結果を下記の表３に示す。
【００５４】
【表３】
【００５５】また、物質精製の度合いを示すものとし
て、上記画分の体積当りのヒアルロニダーゼ阻害率を下
記の表４に示す。
て、上記画分の体積当りのヒアルロニダーゼ阻害率を下
記の表４に示す。
【００５６】
【表４】
【００５７】表３及び表４によれば、本発明のシソから
得られた肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する物質は、その
ヒアルロニダーゼ阻害率及び肥満細胞脱顆粒阻害率が従
来報告されているように、ほぼ相関していることがわか
る。また、本発明の精製法により、肥満細胞脱顆粒阻害
活性が高まることが理解される。
得られた肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する物質は、その
ヒアルロニダーゼ阻害率及び肥満細胞脱顆粒阻害率が従
来報告されているように、ほぼ相関していることがわか
る。また、本発明の精製法により、肥満細胞脱顆粒阻害
活性が高まることが理解される。
【００５８】〔実施例４〕水抽出と沸騰水抽出との比較 乾燥したシソ葉を４℃の水で１８時間撹拌し、減圧下で
吸引濾過し、固・液を分離した。得られた水溶液５００
ｍｌにセチルピリジニウムクロライドを添加し、３０℃
１２時間放置することによって沈澱物が生じた。その沈
澱物を、１５％エタノール１００ｍｌで洗浄し、１０，
０００回転、２０分間の遠心分離により試薬を除去した
後、沈澱物に５０ｍｌの水を添加し、水溶性有効成分を
溶出させて水抽出濾液とした。
吸引濾過し、固・液を分離した。得られた水溶液５００
ｍｌにセチルピリジニウムクロライドを添加し、３０℃
１２時間放置することによって沈澱物が生じた。その沈
澱物を、１５％エタノール１００ｍｌで洗浄し、１０，
０００回転、２０分間の遠心分離により試薬を除去した
後、沈澱物に５０ｍｌの水を添加し、水溶性有効成分を
溶出させて水抽出濾液とした。
【００５９】一方、乾燥したシソ葉を１００℃の水で３
０分間煮沸した後、得られた沸騰水抽出液を冷却し、次
いで減圧下で吸引濾過し、固・液を分離した。以下の工
程は前記水抽出の場合と同様にして水溶性有効成分を溶
出して沸騰水抽出濾液とした。
０分間煮沸した後、得られた沸騰水抽出液を冷却し、次
いで減圧下で吸引濾過し、固・液を分離した。以下の工
程は前記水抽出の場合と同様にして水溶性有効成分を溶
出して沸騰水抽出濾液とした。
【００６０】前記工程で得られた水抽出濾液及び沸騰水
抽出濾液について各々ヒアルロニダーゼ阻害活性を、沢
辺らの「衛生化学、３６（４）、３１４−３１９（１９
９０）」に記載の方法に準じて、以下に示す方法で測定
した。
抽出濾液について各々ヒアルロニダーゼ阻害活性を、沢
辺らの「衛生化学、３６（４）、３１４−３１９（１９
９０）」に記載の方法に準じて、以下に示す方法で測定
した。
【００６１】ウシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ（シグマ社
製）２．８３ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．
０）１ｍｌに溶解した液０．１５ｍｌと、緩衝液（０．
１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）に溶解した０．３Ｍ ＮａＣｌ
溶液０．２ｍｌとを混合し、３７℃、２０分間保温し
た。その反応液を２つの容器中に用意し、各々の反応液
に対して前記水抽出濾液及び沸騰水抽出濾液の１種のみ
加え、３７℃、２０分間保温した。さらに雄鶏のとさか
由来のヒアルロン酸カリウム塩（シグマ社製）１．８３
ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）１ｍｌに溶
解した液０．２ｍｌを加え、３７℃、２０分間保温し
た。
製）２．８３ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．
０）１ｍｌに溶解した液０．１５ｍｌと、緩衝液（０．
１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）に溶解した０．３Ｍ ＮａＣｌ
溶液０．２ｍｌとを混合し、３７℃、２０分間保温し
た。その反応液を２つの容器中に用意し、各々の反応液
に対して前記水抽出濾液及び沸騰水抽出濾液の１種のみ
加え、３７℃、２０分間保温した。さらに雄鶏のとさか
由来のヒアルロン酸カリウム塩（シグマ社製）１．８３
ｍｇを緩衝液（０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０）１ｍｌに溶
解した液０．２ｍｌを加え、３７℃、２０分間保温し
た。
【００６２】続いて、０．４Ｎ ＮａＯＨ０．１ｍｌ及
びｐＨ９．１に調整した０．８Ｎほう酸溶液０．１ｍｌ
を加え、３分間沸騰湯浴中で反応させた。これにｐ−Ｄ
ＢＡ溶液（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１ｇ、
１０Ｎ塩酸１．２５ｍｌ、酢酸９８．７５ｍｌを混合し
た溶液）３ｍｌを加え混合し、３７℃、２０分間保温し
た後、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。
びｐＨ９．１に調整した０．８Ｎほう酸溶液０．１ｍｌ
を加え、３分間沸騰湯浴中で反応させた。これにｐ−Ｄ
ＢＡ溶液（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１ｇ、
１０Ｎ塩酸１．２５ｍｌ、酢酸９８．７５ｍｌを混合し
た溶液）３ｍｌを加え混合し、３７℃、２０分間保温し
た後、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００６３】得られた各吸光度からヒアルロニダーゼの
阻害率を計算した結果、水抽出濾液のヒアルロニダーゼ
阻害率は４２．３％であるのに対して、沸騰水抽出濾液
のヒアルロニダーゼ阻害率は７３．７％であった。とこ
ろで、シソに含まれている肥満細胞脱顆粒阻害成分のヒ
アルロニダーゼ阻害活性と肥満細胞脱顆粒阻害活性は相
関しているので、沸騰水抽出の方が水抽出よりも、肥満
細胞脱顆粒阻害成分の抽出に有利であることが分かる。
阻害率を計算した結果、水抽出濾液のヒアルロニダーゼ
阻害率は４２．３％であるのに対して、沸騰水抽出濾液
のヒアルロニダーゼ阻害率は７３．７％であった。とこ
ろで、シソに含まれている肥満細胞脱顆粒阻害成分のヒ
アルロニダーゼ阻害活性と肥満細胞脱顆粒阻害活性は相
関しているので、沸騰水抽出の方が水抽出よりも、肥満
細胞脱顆粒阻害成分の抽出に有利であることが分かる。
【００６４】〔実施例５〕抗アレルギー物質Ｉ（ＤＥＡＥ画分Ｉ）の精製 精製工程１：前記実施例１におけるＤＥＡＥ画分Ｉをセ
ントリプレップ（アミコン社製）で濃縮した後、等量の
メタノールを添加して５０％メタノール溶液に溶解した
抗アレルギー物質Ｉ溶液を作製した。得られた溶液をシ
リカゲルカラムにかけ、次いで５０％メタノール溶液で
展開すると、肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する活性物質
が溶離した。
ントリプレップ（アミコン社製）で濃縮した後、等量の
メタノールを添加して５０％メタノール溶液に溶解した
抗アレルギー物質Ｉ溶液を作製した。得られた溶液をシ
リカゲルカラムにかけ、次いで５０％メタノール溶液で
展開すると、肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する活性物質
が溶離した。
【００６５】精製工程２：前記精製工程１で精製された
活性物質を、エバポレータで減圧下に濃縮し、０．０１
％の３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモ
ニオール〕−１−プロパンスルフォネート（略語：ＣＨ
ＡＰＳ）水溶液を溶出液とする、セルロファインＧＣ−
７００（チッソ株式会社製）を用いたゲルろ過カラムク
ロマトグラフィーを行った。ＣＨＡＰＳ水溶液で溶出す
ると、精製された活性物質が溶離された。
活性物質を、エバポレータで減圧下に濃縮し、０．０１
％の３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモ
ニオール〕−１−プロパンスルフォネート（略語：ＣＨ
ＡＰＳ）水溶液を溶出液とする、セルロファインＧＣ−
７００（チッソ株式会社製）を用いたゲルろ過カラムク
ロマトグラフィーを行った。ＣＨＡＰＳ水溶液で溶出す
ると、精製された活性物質が溶離された。
【００６６】精製工程３：前記精製工程２で得られた活
性物質について、さらに、肥満細胞脱顆粒阻害活性を高
めるために、次のようにしてアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製した。
性物質について、さらに、肥満細胞脱顆粒阻害活性を高
めるために、次のようにしてアフィニティークロマトグ
ラフィーにより精製した。
【００６７】このアフィニティークロマトグラフィーに
用いた担体は次のようにして製造した。ＡＦ−トレシル
トヨパール〔東ソー株式会社製の親水性ビニルポリマー
を基材としたゲル濾過用充填剤であるトヨパールＨＷ６
５（商品名）にトレシルクロライドを導入した活性担
体〕２ｇを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 含有０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ７．８）溶液（Ａ溶液という）２０ｍｌに
懸濁し、同溶液で洗浄した後、ヒアルロニダーゼ１９４
ｍｇを５ｍｌのＡ溶液に溶解した溶液を添加し、４℃で
２４時間穏やかに振とうさせた。次いで、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ溶液１００ｍｌで洗浄し、続いて０．１Ｍトリス
・塩酸緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐＨ８．
０）でさらに洗浄し、続いて０．１Ｍトリス・塩酸緩衝
液（０．５ＭＮａＣｌ含有）（ｐＨ８．０）で更に洗浄
し、同溶液４０ｍｌを添加し、４℃で４時間穏やかに振
とうさせることによって、ヒアルロニダーゼ固定化−ト
レシルトヨパール担体を製造した。
用いた担体は次のようにして製造した。ＡＦ−トレシル
トヨパール〔東ソー株式会社製の親水性ビニルポリマー
を基材としたゲル濾過用充填剤であるトヨパールＨＷ６
５（商品名）にトレシルクロライドを導入した活性担
体〕２ｇを、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 含有０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ７．８）溶液（Ａ溶液という）２０ｍｌに
懸濁し、同溶液で洗浄した後、ヒアルロニダーゼ１９４
ｍｇを５ｍｌのＡ溶液に溶解した溶液を添加し、４℃で
２４時間穏やかに振とうさせた。次いで、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ溶液１００ｍｌで洗浄し、続いて０．１Ｍトリス
・塩酸緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐＨ８．
０）でさらに洗浄し、続いて０．１Ｍトリス・塩酸緩衝
液（０．５ＭＮａＣｌ含有）（ｐＨ８．０）で更に洗浄
し、同溶液４０ｍｌを添加し、４℃で４時間穏やかに振
とうさせることによって、ヒアルロニダーゼ固定化−ト
レシルトヨパール担体を製造した。
【００６８】得られたヒアルロニダーゼ固定化−トレシ
ルトヨパール担体を、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で緩衝化した後、この固定化
担体に前記精製工程２のセルロファインＧＣ−７００
（チッソ株式会社製）を用いたゲルろ過カラムクロマト
グラフィーにより得られた活性物質を添加し、次いで同
緩衝液で洗浄した後、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で活性物質を溶出し
た。得られた活性物質を水に対して十分透析した後、エ
バポレータで減圧下に濃縮乾固することにより、精製抗
アレルギー物質Ｉを得た。
ルトヨパール担体を、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で緩衝化した後、この固定化
担体に前記精製工程２のセルロファインＧＣ−７００
（チッソ株式会社製）を用いたゲルろ過カラムクロマト
グラフィーにより得られた活性物質を添加し、次いで同
緩衝液で洗浄した後、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で活性物質を溶出し
た。得られた活性物質を水に対して十分透析した後、エ
バポレータで減圧下に濃縮乾固することにより、精製抗
アレルギー物質Ｉを得た。
【００６９】得られた精製抗アレルギー物質Ｉの濃度に
対する肥満細胞脱顆粒阻害効果を図５に示す。図５中の
縦軸の阻害率は前記実施例４において定義されるもので
ある。
対する肥満細胞脱顆粒阻害効果を図５に示す。図５中の
縦軸の阻害率は前記実施例４において定義されるもので
ある。
【００７０】〔実施例６〕ティーバックの製造 市販の紅茶葉を粉砕し、この粉砕物に対して前記実施例
５で得られた精製抗アレルギー物質Ｉを３重量％になる
ように添加してよく混合した。これらの３種類の混合物
をティーバックに詰め、精製抗アレルギー物質Ｉが添加
されたティーバックを得た。このティーバックを熱湯で
滲出することによって、精製抗アレルギー物質Ｉが紅茶
に溶出混合し、肥満細胞脱顆粒阻害活性が付与された紅
茶を得ることができた。
５で得られた精製抗アレルギー物質Ｉを３重量％になる
ように添加してよく混合した。これらの３種類の混合物
をティーバックに詰め、精製抗アレルギー物質Ｉが添加
されたティーバックを得た。このティーバックを熱湯で
滲出することによって、精製抗アレルギー物質Ｉが紅茶
に溶出混合し、肥満細胞脱顆粒阻害活性が付与された紅
茶を得ることができた。
【００７１】〔実施例７〕オレンジジュースの製造 市販のオレンジジュース１Ｋｇを３つ用意した。各々の
オレンジジュースに対して前記実施例５で得られた精製
抗アレルギー物質Ｉ、並びに前記実施例１で得られた抗
アレルギー物質II、抗アレルギー物質III の１種を３重
量％になるよう添加してよく混合し、肥満細胞脱顆粒阻
害活性が付与された３種のオレンジジュースを得た。
オレンジジュースに対して前記実施例５で得られた精製
抗アレルギー物質Ｉ、並びに前記実施例１で得られた抗
アレルギー物質II、抗アレルギー物質III の１種を３重
量％になるよう添加してよく混合し、肥満細胞脱顆粒阻
害活性が付与された３種のオレンジジュースを得た。
【００７２】
【発明の効果】本発明によるシソ沸騰水抽出物から得ら
れた抗アレルギー物質（抗アレルギー物質Ｉ、抗アレル
ギー物質II、抗アレルギー物質III ）は、本明細書記載
の優れた肥満細胞脱顆粒阻害活性を示す。これらの物質
は、摂取許容量が高く、医薬品、もしくは前記物質が添
加された機能性食品として有用である。
れた抗アレルギー物質（抗アレルギー物質Ｉ、抗アレル
ギー物質II、抗アレルギー物質III ）は、本明細書記載
の優れた肥満細胞脱顆粒阻害活性を示す。これらの物質
は、摂取許容量が高く、医薬品、もしくは前記物質が添
加された機能性食品として有用である。
【００７３】本発明による抗アレルギー物質の製造方法
は、シソ葉を沸騰水で抽出し、さらに有効成分を１種ま
たは２種以上のカラムクロマトグラフィーにより分別・
精製しているので、肥満細胞脱顆粒阻害活性を高めるこ
とができる。
は、シソ葉を沸騰水で抽出し、さらに有効成分を１種ま
たは２種以上のカラムクロマトグラフィーにより分別・
精製しているので、肥満細胞脱顆粒阻害活性を高めるこ
とができる。
【００７４】本発明による抗アレルギー物質の製造方法
は、前記製造方法に加えてヒアルロニダーゼ固定化担体
を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精
製しているので、肥満細胞脱顆粒阻害活性を高めること
ができる。
は、前記製造方法に加えてヒアルロニダーゼ固定化担体
を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精
製しているので、肥満細胞脱顆粒阻害活性を高めること
ができる。
【図１】精製抗アレルギー物質Ｉの紫外線吸収スペクト
ルのチャートを示す。
ルのチャートを示す。
【図２】精製抗アレルギー物質Ｉの赤外線吸収スペクト
ルのチャートを示す。
ルのチャートを示す。
【図３】実施例１で得られたシソ沸騰水抽出液、ＤＥＡ
ＥＩ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ画分III、を用いてヒ
アルロニダーゼ阻害活性を測定した結果を示すグラフ。
ＥＩ、ＤＥＡＥ画分II、ＤＥＡＥ画分III、を用いてヒ
アルロニダーゼ阻害活性を測定した結果を示すグラフ。
【図４】ＤＥＡＥ−Toyopearl カラム（東ソー株式会社
製）から順次排出されるフラクションナンバー〔ＤＥＡ
Ｅ画分Ｉ（抗アレルギー物質Ｉ）、ＤＥＡＥ画分II（抗
アレルギー物質II）、ＤＥＡＥ画分III （抗アレルギー
物質III ）〕を横軸にし、各フラクションの肥満細胞脱
顆粒阻害率を縦軸にした結果を示すグラフ。
製）から順次排出されるフラクションナンバー〔ＤＥＡ
Ｅ画分Ｉ（抗アレルギー物質Ｉ）、ＤＥＡＥ画分II（抗
アレルギー物質II）、ＤＥＡＥ画分III （抗アレルギー
物質III ）〕を横軸にし、各フラクションの肥満細胞脱
顆粒阻害率を縦軸にした結果を示すグラフ。
【図５】実施例５で得られた精製抗アレルギー物質Ｉの
濃度に対する肥満細胞脱顆粒阻害効果を示すグラフ。
濃度に対する肥満細胞脱顆粒阻害効果を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｇ 17/00 Ｃ０７Ｇ 17/00 Ｚ (72)発明者 中込 和哉 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 浅田 真弘 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 杉江 牧子 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 冨塚 登 茨城県つくば市東１丁目１番３ 工業技 術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者 福森 保則 北海道札幌市中央区北４条西１丁目３番 地 ホクレン農業協同組合連合会内 審査官 榎本 佳予子 (56)参考文献 特開 平６−62795（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−128933（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−161219（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−73365（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 35/78 A23L 1/30 B01D 15/08 C07G 17/00
Claims (7)
- 【請求項１】 シソ沸騰水抽出物から得られ、肥満細胞
脱顆粒阻害活性を有し、糖及びアミノ酸を構成要素とし
て含む分子量１３，５００、比旋光度〔α〕 D （０．２
５、Ｈ 2 Ｏ）＝−０．４、褐色の物質であることを特徴
とする抗アレルギー物質。 - 【請求項２】 シソ沸騰水抽出物から得られ、肥満細胞
脱顆粒阻害活性を有するポリフェノール類であって、該
ポリフェノール類がＤＥＡＥ陰イオンカラムクロマトグ
ラフィーにより５０％アセトンで溶出して得られたもの
であることを特徴とする抗アレルギー物質。 - 【請求項３】 シソ沸騰水抽出物から得られ、肥満細胞
脱顆粒阻害活性を有するポリフェノール類であって、該
ポリフェノール類がＤＥＡＥ陰イオンカラムクロマトグ
ラフィーにより０．１Ｎ ＨＣｌを含む５０％アセトン
で溶出して得られたものであることを特徴とする抗アレ
ルギー物質。 - 【請求項４】 シソ葉を沸騰水で抽出し、固液を分離
し、得られた水溶液をセチルピリジニウムクロライドに
より沈澱させ、得られた沈澱物より水溶性成分を溶出さ
せ、さらに得られた溶出成分を１種又は２種以上のＤＥ
ＡＥ陰イオンカラムクロマトグラフィーにより分別・精
製して請求項１、２又は３記載の肥満細胞脱顆粒阻害活
性を有する物質を得ることを特徴とする抗アレルギー物
質の製造方法。 - 【請求項５】 前記ＤＥＡＥ陰イオンカラムクロマトグ
ラフィーにより分別・精製して肥満細胞脱顆粒阻害活性
を有する物質を得た後に、得られた各物質をヒアルロニ
ダーゼを固定化した担体を使用したアフィニテークロマ
トグラフィーにより精製することを特徴とする請求項４
記載の抗アレルギー物質の製造方法。 - 【請求項６】 請求項１、２及び／又は３記載の抗アレ
ルギー物質を含む抗アレルギー剤。 - 【請求項７】 請求項５の製造方法によって得られた請
求項１、２及び／又は３記載の抗アレルギー物質を食品
に添加して抗アレルギー機能を付与したことを特徴とす
る機能性食品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7191145A JP3071669B2 (ja) | 1995-07-04 | 1995-07-04 | 抗アレルギー物質、その製造方法、抗アレルギー剤及び機能性食品 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7191145A JP3071669B2 (ja) | 1995-07-04 | 1995-07-04 | 抗アレルギー物質、その製造方法、抗アレルギー剤及び機能性食品 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0920672A JPH0920672A (ja) | 1997-01-21 |
| JP3071669B2 true JP3071669B2 (ja) | 2000-07-31 |
Family
ID=16269648
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7191145A Expired - Lifetime JP3071669B2 (ja) | 1995-07-04 | 1995-07-04 | 抗アレルギー物質、その製造方法、抗アレルギー剤及び機能性食品 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3071669B2 (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0987189A (ja) * | 1995-09-19 | 1997-03-31 | Ichimaru Pharcos Co Ltd | エンメイソウ、ボタンピ、シソ、アルニカ含有抗アレルギー剤 |
| JP2002212026A (ja) * | 2001-01-18 | 2002-07-31 | Oriza Yuka Kk | 美肌用皮膚外用剤 |
| KR100454752B1 (ko) * | 2001-01-19 | 2004-11-03 | 학교법인 호서학원 | 아토피성 피부염 치료용 기능성 식품 |
| JP4441177B2 (ja) * | 2001-02-01 | 2010-03-31 | 明治製菓株式会社 | フェノール類含有シソ科植物エキスの製造法及びその用途 |
| JP4524465B2 (ja) * | 2001-12-07 | 2010-08-18 | 雪印乳業株式会社 | 抗アレルギー剤 |
| US6811796B2 (en) | 2002-04-22 | 2004-11-02 | Matsuura Yakugyo Co., Ltd. | Preventive or therapeutic agent for pollen allergy, allergic rhinitis, atopic dermatitis, asthma or urticaria, or health food for prevention or improvement or reduction of symptoms thereof |
| KR100512403B1 (ko) * | 2002-05-23 | 2005-09-07 | 송도원 | 차조기 추출액의 제조방법 |
| KR100506955B1 (ko) * | 2002-05-23 | 2005-08-11 | 송도원 | 참깨 추출액의 제조방법 |
| KR100832667B1 (ko) | 2004-02-05 | 2008-05-27 | 액세스 비지니스 그룹 인터내셔날 엘엘씨 | 항알레르기 조성물 및 관련 방법 |
| WO2006049258A1 (ja) * | 2004-11-04 | 2006-05-11 | University Of Tsukuba | 発酵茶から抽出された高分子ポリフェノール、ミトコンドリア病治療剤、糖尿病予防・治療剤、並びに飲食物 |
| JP5470612B2 (ja) * | 2008-05-22 | 2014-04-16 | 国立大学法人弘前大学 | 糖鎖改変方法および糖鎖改変装置 |
| JP6263349B2 (ja) * | 2013-08-27 | 2018-01-17 | 国立大学法人広島大学 | 抗アレルギー物質及びその製造方法 |
| CN109091910A (zh) * | 2018-08-16 | 2018-12-28 | 福建农林大学 | 一种利用低压液相纯化紫苏黄酮的方法 |
| CN110755476B (zh) * | 2019-12-11 | 2022-01-25 | 中北大学 | 一种紫苏叶中抗过敏成分的分离纯化方法 |
-
1995
- 1995-07-04 JP JP7191145A patent/JP3071669B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0920672A (ja) | 1997-01-21 |
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