JPH09216829A - Ｈｓｐ６０ファミリーに属するタンパク質の麦芽抽出物含有合成抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 分子量５７キロダルトンから６８キロダルト
ンまでの間の熱ショックタンパク質（ＨＳＰ６０ファミ
リー）がその発症に関与する自己免疫疾患（例えば、Ｉ
型糖尿病や慢性関節リウマチなど）の患者の生理学的状
態を有効に改善させ、前記病気を効果的に治療すること
ができる、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
合成抑制剤を提供する。 【解決手段】 麦芽抽出物を有効成分として含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、麦芽抽出物を有効
成分として含有する、分子量が５７キロダルトン（ｋ
Ｄ）から６８ｋＤまでの間の熱ショックタンパク質群
（以下、ＨＳＰ６０ファミリーと称する）に属するタン
パク質の合成抑制剤に関する。本発明によるＨＳＰ６０
ファミリーに属するタンパク質の合成抑制剤は、特に、
ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の組織内合成
を抑制することにより、ＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質が発症に関与するものと考えられている自己
免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなど
の病気の患者の生理学的状態を有効に改善させ、Ｉ型糖
尿病や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患を効果的に
治療することができる。

【０００２】

【従来の技術】近年、自己免疫疾患が大きな問題となっ
ている。自己免疫疾患とは、本来ならば自己の身体を構
成する成分に対しては攻撃しないはずの免疫系が、自己
の組織と反応して破壊してしまう病気であり、例えば、
Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどが含まれる。例え
ば、近年わが国では、経済・社会・文化の発達と、生活
水準の向上や生活様式の変化に伴って、糖尿病患者は著
しく増加し、病態も重症化、複雑化してきた。糖尿病学
の進歩によって、患者の予後は改善したとはいえ、特有
な網膜症、腎症及び神経障害が多発し、加えて動脈硬化
も促進され、健康と社会活動に多大な支障をきたしてい
る。糖尿病のうち、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿
病；insulin-dependent diabetes mellitus ；ＩＤＤ
Ｍ）の発生率は、多くの国でこの数十年間に数倍に増加
し、現在生きているヒトの１％は７０才になるまでにＩ
型糖尿病に罹病するものと予想されている。

【０００３】Ｉ型糖尿病は、インスリン産生細胞である
膵臓ランゲルハンス島のβ細胞だけが自己免疫的に破壊
されるためにインスリン欠乏状態となる疾患で、臓器特
異的な自己免疫疾患である（Atkinson, M. A. et al.:
"Sci. Am.", 263 : 42-49, 1990; Todd JA.: "Immunol.
Today", 11: 122-129, 1990)。Ｉ型糖尿病をおこす自
己免疫過程は、非常に厳密に膵臓だけに限られており、
しばしば大人になる前に発症してくることが多い。Ｉ型
糖尿病が臨床的に発症するときには、膵島の炎症（膵島
炎）があり、インスリンを産生しているβ細胞の大半が
特異的に失われる（Atkinson, M. A., et al.: "Sci. A
m.", 263 : 62-67, 1990)。糖尿病の臨床症状は、β細
胞の大部分（おそらく９０％以上）が再生できない程度
にまで破壊された後に初めて現れ、患者の生存はインス
リンの外的供給に依存することになる。即ち、臨床診断
によって発見することができる時期には、この自己免疫
反応が既に不可逆的な損傷を与えており、しかもその多
くは顕著な自覚症状を示さない等、Ｉ型糖尿病は多くの
問題を含んでいる。

【０００４】また、慢性関節リウマチは、関節滑膜を病
変の主座とする慢性炎症性疾患である。病変部位はとき
として関節滑膜のみにとどまらず、全身に及ぶこともま
れではない。関節滑膜に初発した炎症は、やがて滑膜増
殖、更に軟骨及び骨の破壊を起こし、関節組織の破壊が
引き起こされる。その結果、患者は社会的にも家庭的に
も著しく制限を受けるのみならず、経済的負担も無視で
きないものとなる。慢性関節リウマチの患者数は人口の
０．１〜０．３％とされる。これは慢性関節リウマチの
確診例であって、疑診例などや慢性関節リウマチの周辺
疾患を含めると患者数はその１０倍前後にも増えるもの
と思われる。

【０００５】一方、熱ショックタンパク質（heat shock
protein；ＨＳＰ、ストレスタンパク質ともいう）は、
細胞を何らかのストレス、例えば、熱、重金属、薬剤、
アミノ酸類似体、又は低酸素（低濃度酸素）などで刺激
することにより、細胞に発現される一群のタンパク質で
ある。熱ショックタンパク質は、自然界に普遍的に存在
しており、細菌、酵母、植物、昆虫、及びヒトを含む高
等動物により産生される。

【０００６】ＨＳＰは、その種類は多種多様であるが、
分子量の大きさからＨＳＰ９０ファミリー（例えば、９
０ｋＤ又は１１０ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳＰ７０ファ
ミリー（例えば、７０〜７３ｋＤのＨＳＰなど）、ＨＳ
Ｐ６０ファミリー（例えば、５７〜６８ｋＤのＨＳＰな
ど）、低分子ＨＳＰファミリー（例えば、２０ｋＤ、２
５〜２８ｋＤ、又は４７ｋＤのＨＳＰなど）の４ファミ
リーに大別することができる。なお、本明細書において
は、特定分子量を有するＨＳＰを、ＨＳＰとその直後に
記載する数字とによって示すものとし、例えば、分子量
６０ｋＤのＨＳＰを『ＨＳＰ６０』と称するものとす
る。以上のように、ＨＳＰには多くの種類が存在する
が、これらは分子量だけでなく、構造、機能、又は性質
などもそれぞれ異なるものである。ストレスへの応答に
加えて、これらのタンパク質の中には構成的に合成され
るものがあり、正常な環境の下で、タンパク質のフォー
ルディング、アンフォールディング、タンパク質サブユ
ニットの会合、タンパク質の膜輸送のような、必須の生
理的な役割を演じていることが示されている。熱ショッ
クタンパク質としてのこれらの機能は、分子シャペロン
と称される。

【０００７】自己免疫疾患の病因に関して注目されてい
ることのひとつに、分子相同性（molecular mimicry)が
ある。すなわち、自己抗原が微生物などの外来抗原と共
通抗原性をもっている場合、微生物感染によって生成さ
れる抗体や感作リンパ球が交叉反応によって自己の組織
を攻撃してしまう結果、自己免疫疾患が発症するものと
考えられている（Atkinson, M. A. et al.: "Sci. A
m.", 263 : 42-49, 1990;Shinha, A. A. et al.: "Scie
nce", 248 : 1380-1388, 1990)。例えば、細菌のＨＳＰ
６０ファミリーに属するタンパク質は、結核、らい病、
梅毒、在郷軍人病、又はライム病などの主たる抗原であ
り（Young, R. A. et al.: "Cell", 59:5-8, 1989)、
かつ、細菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
は強い免疫原性を有し、及び自己の（宿主であるヒト
の）タンパク質との分子相同性を有するために、感染症
がトリガーとなった分子相同性による自己免疫疾患が発
症するものと考えられている。

【０００８】例えば、糖尿病の患者やその家族の血中に
検出される６４ｋＤタンパク質と反応する抗体（６４ｋ
Ｄ自己抗体）はβ細胞特異的であるし、また糖尿病と診
断される直前によく出現しやすい。すなわち、Ｉ型糖尿
病において発症の原因と考えられている膵島細胞抗原
は、分子量６４ｋＤの糖タンパク質（Baekkeskov, S. e
t al.: "Nature", 298 : 167-169, 1982)である。６４
ｋＤタンパク質に対する抗体はヒトの糖尿病のみならず
（Atkinson, M. A. et al.: "Lancet", 335 : 1357-136
0, 1990)、ＢＢラット（Baekkeskov, S. et al.: "Scie
nce", 224 : 1348-1350, 1984)やＮＯＤマウス（Atkins
on, M. A. et al.: "Diabetes", 37: 1587-1590, 1988)
などのように、自然にＩ型糖尿病を発症し、ヒトのＩ型
糖尿病の多くの特徴を示す、Ｉ型糖尿病のモデル動物に
おいても検出される。Ｉ型糖尿病における膵臓β細胞の
６４ｋＤタンパク質は、サイトカインや熱刺激で誘導さ
れるので、熱ショックタンパク質である可能性がある。

【０００９】Ｉ型糖尿病のモデル動物であるＮＯＤマウ
スにおける膵臓ランゲルハンス島β細胞の６４ｋＤタン
パク質は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）のＨ
ＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する抗体と
免疫学的に交叉反応性を示す自己抗原であることが示さ
れている。このように、ＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質と６４ｋＤタンパク質自己抗原との間に免疫
学的交叉が観察されることにより、膵臓β細胞の６４ｋ
Ｄタンパク質がＨＳＰ６０ファミリーの一員である可能
性があり、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の
エピトープと交叉する自己免疫の機序が、Ｉ型糖尿病の
発症に関与することが示唆されている。また、結核菌の
ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に特異性を有
するＴリンパ球のクローンを移入すると、幼若ＮＯＤマ
ウスにランゲルハンス島炎と高血糖を引き起こす。ま
た、結核菌のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質
を免疫原性のある投与方法、すなわちアジュバントとと
もにＮＯＤマウスに注射すると、糖尿病を早期に発症さ
せ得る（Elias, D. et al.: "Proc. Natl. Acad. Sci.
USA", 87: 1576-1580, 1990)。マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質に対する動物の免
疫反応がＩ型糖尿病を引き起こすというこれらの事実
は、マイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質に対する抗体と交叉反応する抗原に対する免
疫系による攻撃が、β細胞に障害を与えることを示して
いる。

【００１０】また、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質は、慢性関節リウマチの動物モデルであるラット
のアジュバント関節炎や、ヒトのリウマチ関節炎に関連
していることが知られている。例えば、慢性関節リウマ
チの場合、細菌の菌体タンパク質である熱ショックタン
パク質のなかでもＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパ
ク質は、関節軟骨に存在するプロテオグリカンと分子相
同性をもっていることが明らかとなっている。ラットの
アジュバント関節炎ではＨＳＰ６０ファミリーに属する
タンパク質反応性Ｔリンパ球の関与が示されている（"C
urr. Top. Microbiol. Immunol.", 145 : 27-83, 198
9)。この疾患は、放射線照射を受けた免疫学的に無防備
の（ｎａｔｉｖｅ）ラットに、結核菌のＨＳＰ６０ファ
ミリーに属するタンパク質に対して反応性のＴリンパ球
のクローンを移入することにより、前記ラットに移すこ
とができることが見出された（"Science", 219 : 56-5
8, 1983; "Nature", 331: 171-173, 1988)。このＴリ
ンパ球は同時に関節のプロテオグリカンとも交叉反応性
を示す（"Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 82: 5117-512
0, 1985)。このＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク
質で誘導される調節性Ｔリンパ球は、溶連菌やプリステ
インによる関節炎でも認められている。従って、アジュ
バント関節炎は、抗ＨＳＰ６０ファミリーに属するタン
パク質Ｔリンパ球により引き起こされる自己免疫疾患の
ようである。また、ヒトの若年性関節リウマチでもＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質反応性Ｔリンパ球
の関与が考えられている。

【００１１】また、慢性関節リウマチの患者の滑液中か
らマイコバクテリア由来のＨＳＰ６０ファミリーに属す
るタンパク質に対して、特異的に反応するＴリンパ球が
取り出されている（"Lancet", II: 478-480, 1988; "Na
ture", 339 : 226, 1989; "Annu. Rev. Immunol.", 1
1: 637, 1993)。このように、マイコバクテリアのＨＳ
Ｐ６０ファミリーに属するタンパク質と交叉反応性を示
すタンパク質が高濃度に慢性関節リウマチの軟骨／パン
ヌス接合部に認められるのに対し、正常な組織や他の疾
患による慢性の炎症を呈する組織においては認められな
い（"Scand. J. Immunol.", 31: 283-288, 1990)。更
に、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質に対する
抗体がヒト及びラットの慢性関節リウマチで検出される
（Kaufmann,S. H. E., et al.: "Immunol. Today", 11:
129-136, 1990)ことからも、慢性関節リウマチの病因
がマイコバクテリアのＨＳＰ６０ファミリーに属するタ
ンパク質と構造の類似した自己抗原に対する自己免疫で
あるという可能性がある。従ってＨＳＰ６０ファミリー
に属するタンパク質に対する免疫応答の存在はラット及
びヒトの両方の関節炎に関連している。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記事
情に鑑み、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自己免
疫疾患の患者の生理学的状態を有効に改善することがで
き、それらの自己免疫疾患を効果的に治療することので
きる方法を開発するために、ＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質に対して合成抑制作用を示す化合物に関
して種々検討を重ねてきた。その結果、本発明者らは、
意外にも、麦芽抽出物が、病態を示す組織の細胞におけ
るＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の合成を特
異的に抑制することを見出した。すなわち、麦芽抽出物
を投与することによって、細胞内でのＨＳＰ６０ファミ
リーに属するタンパク質の合成が抑制され、従って、Ｉ
型糖尿病や慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療
が可能であることを見出したのである。本発明はこうし
た知見に基づくものであり、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウ
マチなどの自己免疫疾患を効果的に治療することのでき
る、ＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の合成抑
制剤を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、麦芽
抽出物を有効成分として含有することを特徴とする、分
子量５７キロダルトンから６８キロダルトンまでの間の
熱ショックタンパク質（すなわち、ＨＳＰ６０ファミリ
ーに属するタンパク質）の合成抑制剤に関する。本明細
書において、「ＨＳＰ６０ファミリー」とは、前記のと
おり、分子量が５７ｋＤ〜６８ｋＤの熱ショックタンパ
ク質群を意味する。また、ＨＳＰ６０ファミリーに属す
るタンパク質としては、例えば、ＨＳＰ６０（すなわ
ち、分子量６０ｋＤの熱ショックタンパク質）、ＨＳＰ
５８（すなわち、分子量５８ｋＤの熱ショックタンパク
質）、ＨＳＰ６５（すなわち、分子量６５ｋＤの熱ショ
ックタンパク質）、又はＧｒｏＥＬ（すなわち、原核生
物、例えば、大腸菌などの分子量約６４ｋＤの熱ショッ
クタンパク質）などを挙げることができる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。本発明の合成抑制剤の有効成分として含有される
麦芽抽出物は、特に限定されず、例えば、市販の麦芽抽
出物（ＭＡＬＴ ＥＸＴＲＡＣＴ）をそのまま、あるい
は好ましくは市販の麦芽抽出物（ＭＡＬＴ ＥＸＴＲＡ
ＣＴ）を透析等の手段により低分子画分を除去したもの
を用いることができる。

【００１５】また、麦芽を糖化した後、濾別し、濾過残
渣を水若しくは親水性溶媒又はそれらの混合液で抽出
し、抽出液から低分子画分を除去して得られる麦芽抽出
物を用いることが好ましい。この場合、麦芽糖化物濾過
残渣の水若しくは親水性溶媒又はそれらの混合物による
抽出を、アルカリ条件下で実施し、得られた抽出液を中
和して沈殿する物質を除去し、得られる上清から低分子
画分を除去して得られる麦芽抽出物を用いることがより
好ましい。また、水若しくは親水性溶媒又はそれらの混
合物で抽出した後、得られた抽出液をｐＨ３〜５に調整
し、沈殿するタンパク質を除去し、得られた上清を中和
して沈殿する物質を更に除去し、得られる上清から低分
子画分を除去して得られる麦芽抽出物を用いることが更
に好ましい。また、麦芽糖化物濾過残渣の水若しくは親
水性溶媒又はそれらの混合液による抽出を、アルカリ条
件下で実施し、得られた抽出液をｐＨ３〜５に調整し、
沈殿するタンパク質を除去し、得られた上清を中和して
沈殿する物質を更に除去し、得られる上清から低分子画
分を除去して得られる麦芽抽出物を用いることが特に好
ましい。

【００１６】特には、麦芽を糖化した後に濾過し、麦芽
糖化物濾過残渣を水若しくは親水性溶媒又はそれらの混
合液で抽出して得られる抽出液、あるいは場合により、
更に前記の中和処理又は前記の酸性化・中和処理（酸性
化処理に続く中和処理）を行って得られる抽出液から、
低分子画分を除去して得られる麦芽由来の生理活性物質
であって、（ｉ）分子量約１００００以上であり、（i
i）赤外吸収スペクトルで３６００〜３２００ｃｍ^-1及
び１７００〜１６００ｃｍ^-1に吸収があり、（iii ）プ
ロトン核磁気共鳴スペクトルで、０．５〜６．０ｐｐｍ
及び６．０〜８．５ｐｐｍにピークがあり、（iv）紫外
吸収スペクトルで、２００〜２５０ｎｍ及び２５０〜３
５０ｎｍに吸収があり、（ｖ）フェノール硫酸呈色反応
が陽性であり、（vi）銅フォーリン呈色反応が陽性であ
る、麦芽由来の生理活性物質（以下、麦芽由来生理活性
物質と称する）を用いることが好ましい。

【００１７】本発明では、前記の麦芽抽出物を調製する
ための麦芽（ｍａｌｔ）として、例えば、イネ科の穀類
種子を発芽させてつくったものを用いることができ、こ
れらの種子には、例えば、大麦、小麦、ライ麦、エン
麦、ハダカ麦、トウモロコシ等がある。これらの麦芽を
そのまま、あるいは粉砕し、更に必要な場合には澱粉を
加え、温水を加え、糖化を行う。こうして得られた麦芽
糖化物を濾過する。ここで得られる麦芽糖化物濾液は、
一般に麦汁としてビール原料に利用されている。また、
もう一方の麦芽糖化物濾過残渣は、従来から家畜飼料と
して用いられていたが、本発明ではこの麦芽糖化物濾過
残渣を、麦芽抽出物の原料として用いることができる。

【００１８】続いて、前記の麦芽糖化物濾過残渣を、常
温若しくは加熱された水、常温若しくは加熱されたアル
カリ水溶液、常温若しくは加熱された親水性溶媒、常温
若しくは加熱された水と親水性溶媒との混合液、又は常
温若しくは加熱されたアルカリ水溶液と親水性溶媒との
混合液で抽出し、抽出物を得ることができる。抽出用の
親水性溶媒としては、親水性有機溶媒、例えば、低級ア
ルコール（例えば、メチルアルコール若しくはエチルア
ルコール）又はケトン類（例えば、アセトン）を用いる
ことができる。抽出は、例えば、乾燥又は湿潤の麦芽糖
化物濾過残渣１００重量部に対し、水、温熱アルカリ水
溶液、又は親水性溶媒１０〜１，０００，０００重量部
を加え、数時間〜１昼夜程度実施するのが好ましい。こ
の際、攪拌処理又は超音波処理を行ったり、あるいは界
面活性剤を添加して、抽出効果を高めることができる。

【００１９】また、前記の抽出をアルカリ条件下（好ま
しくはｐＨ１０〜１４）で実施し、得られる抽出液を中
和（例えば、ｐＨ６．５〜７．５）して、生ずる沈殿を
除くことが好ましい。例えば、０．４５〜０．５５Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液で抽出すると、麦芽糖化物濾過残
渣の品質を変えることなく、抽出効率を高め、しかも得
られる抽出物の水溶液に対する溶解性を高めることがで
きる。また、水若しくは親水性溶媒又はそれらの混合液
で抽出した後に、得られる抽出液を、無機酸（例えば、
塩酸）又は有機酸（例えば、シュウ酸）によって酸性
（例えば、ｐＨ３〜５）にしてタンパク質を沈殿させて
除去してから、得られる上清を前記と同様に中和して生
じる沈殿物を更に除去してもよい。更には、前記の抽出
をアルカリ条件下（好ましくはｐＨ１０〜１４）で実施
し、得られる抽出液を、無機酸（例えば、塩酸）、又は
有機酸（例えば、シュウ酸）によって酸性（例えば、ｐ
Ｈ３〜５）にしてタンパク質を沈殿させて除去してか
ら、得られる上清を前記と同様に中和して生じる沈殿物
を更に除去してもよい。

【００２０】前記の抽出工程により、あるいは場合によ
り、更に前記の中和処理又は前記の酸性化・中和処理
（酸性化処理に続く中和処理）を行った後に、得られる
抽出物をそのまま本発明による合成抑制剤の有効成分と
して用いることもできるが、得られた抽出物から、例え
ば、透析、塩析、限外濾過、逆浸透処理、ゲル濾過、又
は有機溶媒による沈殿処理等の手段により、低分子画分
を除去して得られた生成物を用いることが好ましい。特
に、分子量１０，０００未満の画分を除去することが好
ましい。得られた麦芽抽出物は、そのまま使用してもよ
いし、更に濃縮して使用してもよい。また、これを凍結
乾燥、又は噴霧乾燥等粉末化して使用してもよい。

【００２１】本発明の合成抑制剤は、麦芽抽出物を、そ
れ単独で、又は好ましくは製剤学的若しくは獣医学的に
許容することのできる通常の担体と共に、動物、好まし
くは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。
投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細
粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョ
ン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口
剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与の
クリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げること
ができる。これらの経口剤は、例えば、ゼラチン、アル
ギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳
糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロ
ース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タル
ク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコー
ル、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸
アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性
剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、
香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防
止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
例えば、麦芽抽出物（特には前記の麦芽由来生理活性物
質）１重量部と乳糖９９重量部とを混合して充填したカ
プセル剤などである。

【００２２】非経口投与方法としては、注射（皮下、静
脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなか
で、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の
調製においては、有効成分としての麦芽抽出物の他に、
例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶
剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、
ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補
助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤等を任
意に用いることができる。具体的に一例を示すと、麦芽
抽出物（特には前記の麦芽由来生理活性物質）１０ｍｇ
とマンニトール５０ｍｇとを蒸留水に溶解して１０ｍｌ
とし、常法で除菌した後、２ｍｌづつを注射用小瓶に分
注し、又はそのまま凍結乾燥して注射剤とする。使用に
際して、生理食塩水で希釈して注射液とする。また、本
発明の合成抑制剤は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放
性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明
の合成抑制剤をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレット
に取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外
科的に移植することができる。本発明の合成抑制剤は、
これに限定されるものではないが、麦芽抽出物（特には
前記の麦芽由来生理活性物質）を、０．０１〜９９重量
％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有すること
ができる。

【００２３】本発明の合成抑制剤を用いる場合の投与量
は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程
度、又は投与方法などにより異なり、特に制限はない
が、麦芽抽出物（特には前記の麦芽由来生理活性物質）
量として通常成人１人当り１ｍｇ〜１０ｇ程度を、１日
１〜４回程度にわけて、経口的に又は非経口的に投与す
る。更に、用途も医薬品に限定されるものではなく、種
々の用途、例えば、機能性食品や健康食品として飲食物
の形で与えることも可能である。本発明の合成抑制剤
は、マウスを用いる経口投与法によって急性毒性試験を
行ったが、毒性は全く認められなかった。

【００２４】

【作用】上記したように、本発明の合成抑制剤に含有さ
れる麦芽抽出物は、細胞内のＨＳＰ６０ファミリーに属
するタンパク質の合成を特異的に抑制する作用があるの
で、前記麦芽抽出物を投与すると細胞でのＨＳＰ６０フ
ァミリーに属するタンパク質の生合成が特異的に減少す
る。従って、前記麦芽抽出物は、ＨＳＰ６０ファミリー
に属するタンパク質がその発症に関連する自己免疫疾
患、例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなどの予防
及び治療に使用することができる。

【００２５】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１：麦芽抽出物の調製 本発明の合成抑制剤の有効成分として含有される麦芽抽
出物は、特公平７−２０９８８号公報の実施例１に記載
されている方法に従って調製した。すなわち、大麦１０
ｋｇを発芽させ、でんぷんを加え、糖化し、濾過後乾燥
した。得られた糖化残渣の一部１００ｇを、０．５Ｎ水
酸化ナトリウム水溶液４リットルに入れ、沸騰水溶液中
で３時間抽出し、１Ｎ塩酸でｐＨ４．０にし、２４時間
静置した後、６，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行
って、沈殿を除去した。得られた上清を１Ｎ水酸化ナト
リウム水溶液でｐＨ７．０に中和し、再び６，０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離を行い、得られた上清を減圧濃
縮した後、透析用セルロースチューブ（三光純薬、カタ
ログ番号ＵＣ３６−３２−１０００）を用いて流水透析
を行ったところ、分子量１０，０００未満の低分子化合
物が除去されていた。得られた濃縮溶液を凍結乾燥し、
麦芽抽出物の乾燥物２３ｇを得た。

【００２６】前記の麦芽抽出物の乾燥物の、ＧＰＣ−Ｌ
ａｌｌｓ法により測定した重量平均分子量は、２０９，
０００であった。この麦芽抽出物の乾燥物のゲルクロマ
トグラフィー〔充填剤：セルロファインＧＬＣ−２００
０−Ｃカラム：直径２．５ｃｍ×高さ４５ｃｍ、分取３
ｍｌ／１フラクション、検出方法：フェノール硫酸呈色
（４９０ｎｍ）、試料：３０ｍｇ／３ｍｌで注入〕の溶
出曲線（クロマトグラム）を図１に示す。このクロマト
グラムから、分子量１０，０００以下のものが除去され
ていることが確認された。また、ＫＢｒ錠剤法により、
日本分光Ａ２０２型で前記麦芽抽出物の乾燥物の赤外吸
収スペクトルを測定した結果を図２に示す。３６００〜
３２００ｃｍ^-1及び１７００〜１６００ｃｍ^-1に吸収が
確認された。更に、３−（トリメチルシリル）−１−プ
ロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）を内部標準物質
として、ＪＥＯＬ ＪＭＮ−ＧＳＸ５００型スペクトロ
メーターを用いて、５００ＭＨｚで前記麦芽抽出物の乾
燥物のプロトン核磁気共鳴スペクトルを測定した結果
を、図３に示す。０．５〜６．０ｐｐｍと６．０〜８．
５ｐｐｍとにピークが確認された。更に、前記麦芽抽出
物の乾燥物の水溶液を、多目的記録用スペクトロメータ
ー（島津Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｒｅｃｏｒｄｉｎ
ｇ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ＭＰＳ−２
０００）を用いて、紫外−可視吸収スペクトルを測定し
た結果を、図４に示す。２００〜２５０ｎｍ及び２５０
〜３５０ｎｍに吸収が認められた。また、前記麦芽抽出
物の乾燥物のフェノール硫酸呈色反応は、陽性であっ
て、糖の存在を示した。更に、前記麦芽抽出物の乾燥物
の銅フォーリン呈色反応も、陽性であって、タンパク質
の存在を示した。

【００２７】実施例２：ヒト培養癌細胞のＨＳＰ発現量
の測定 （１）ヒト培養癌細胞の培養 ヒト腎癌細胞株ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１
１）を、１０％非働化ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地中
で、５％二酸化炭素条件下で、熱ショック処理時以外
は、３７℃で培養した。

【００２８】（２）麦芽抽出物処理及び熱ショック処理 播種２日後の前記ヒト腎癌細胞株ＡＣＨＮの培地中に、
実施例１で得られた麦芽抽出物を、最終濃度１ｍｇ／ｍ
ｌとなるように添加し、２４時間培養した。その後、４
５℃にて１５分間熱ショック処理をしてから、３７℃に
て終夜培養した。対照試験は、実施例１で得られた麦芽
抽出物を添加しないこと以外は前記と同様に実施した。

【００２９】（３）ヒト培養癌細胞でのＨＳＰ発現量の
測定 前項（２）で処理した各細胞を、以下に示す方法により
ホモジナイズし、ＨＳＰ発現量をウェスタンブロット法
にて測定した。すなわち、前項（２）で処理した細胞
を、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：ＫＣｌ＝０．２ｇ／
ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ＝０．２ｇ／ｌ，ＮａＣｌ＝８ｇ／
ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ （無水）＝１．１５ｇ／ｌ；以下、
ＰＢＳ（−）と称する〕で洗浄した後、ライシスバッフ
ァー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）〔１．０％ＮＰ−４
０、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ−ＥＤＴＡ、２ｍＭ−Ｎ−エ
チルマレイミド、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフル
オリド、２μｇ／ｍｌロイペプチン及び２μｇ／ｍｌペ
プスタチン〕１ｍｌを加え、氷上で２０分間静置した。
その後、４℃で１２０００ｒｐｍにて、２０分間、遠心
を行った。遠心後の上清１０μｌをＰＢＳ（−）７９０
μｌに加え、更にプロテインアッセイ染色液（Dye Reag
ent Concentrate : バイオラッド，カタログ番号500-00
06）２００μｌを加えた。５分間、室温にて静置した
後、５９５ｎｍで吸光度を測定してタンパク質定量を行
った。

【００３０】タンパク質定量を行った試料を用いて、Ｌ
ａｅｍｍｌｉのバッファー系（Laemmli, N. K., "Natur
e", 283 : pp. 249-256, 1970)にて、等量のタンパク質
を含むライセートのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行った。電気泳動後、ブロッティング及びそれに
続くブロッキングを行った。すなわち、タンパク質転写
装置（Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell：バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-3946）を用いて、室温
にて１００Ｖにて、０．４５μｍニトロセルロース膜
（Schleicher & Schuell，カタログ番号401196）にゲル
を密着させ、３時間ブロッティングを行った。ブロッテ
ィングバッファーとしては、０．０２５Ｍトリス及び
０．１９２ＭグリシンよりなりｐＨ８．５に調整された
トリスグリシンバッファー（Tris Gly Running and Blo
tting Buffer；Enprotech, 米国マサチューセッツ州，
カタログ番号 SA100034)にメチルアルコールを２０％に
なるように加えて調製したバッファーを用いた。ブロッ
ティング後、ニトロセルロース膜を１０％スキムミルク
（雪印乳業）−ＰＢＳ（−）溶液に室温にて３０分間、
インキュベートし非特異的結合をブロックした。

【００３１】ブロッキング後、ニトロセルロース膜の上
で、抗ヒトＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体（Stre
ssGen, Victoria, B.C., Canada, カタログ番号 SPA-8
06）により、１次抗体反応を行った。この抗ヒトＨＳＰ
６０マウスモノクローナル抗体は、大腸菌を用いるリコ
ンビナントＤＮＡ法により作製したヒトＨＳＰ６０を免
疫原として作製した抗体であり（"J. Exp. Med." 175
, 1805-1810, 1992)、哺乳類ＨＳＰ６０（霊長類ＨＳ
Ｐ６０、マウスＨＳＰ６０、ラットＨＳＰ６０、及びハ
ムスターＨＳＰ６０）と特異的に反応する（"J. Exp. M
ed." 175 , 1805-1810, 1992)。この抗ヒトＨＳＰ６０
マウスモノクローナル抗体が認識するエピトープは、ヒ
トＨＳＰ６０アミノ酸配列の第３８３番目〜第４４７番
目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列中に局在する
（"J. Exp. Med." 175 , 1805-1810,1992)。１次抗体
反応後、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、溶液を取り替えて
２回の洗浄をスロー・ロッキング・シェイカーによって
行い、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（バ
イオ・ラッド，カタログ番号170-6531）溶液で１５分間
ずつ、溶液を取り替えて４回の洗浄を行った。最終的
に、ＰＢＳ（−）で５分間ずつ、２回の洗浄を行った。

【００３２】洗浄終了後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
マウスＩｇＧ抗体（CAPPEL，カタログ番号55550)を、２
％スキムミルクを含むＰＢＳ（−）溶液で５０００倍に
希釈して調製した抗体溶液５ｍｌを用いて、２時間、２
次抗体反応を行った。反応終了後、ニトロセルロース膜
に関して、ＰＢＳ（−）溶液で５分間ずつ溶液を変えて
２回、更にＰＢＳ（−）−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０溶液
で１５分間ずつ溶液を変えて５回の洗浄をスロー・ロッ
キング・シェイカーにより行った。最後にＰＢＳ（−）
溶液で５分間ずつ２回の洗浄を行った。余分なＰＢＳ
（−）溶液を除去した後、ウェスタンブロッティング検
出試薬（ECL Western blotting detectionreagent；Ame
rsham，カタログ番号RPN2106)をニトロセルロース膜上
に振りかけ、１分間インキュベートした後、余分な検出
試薬を除去し、ニトロセルロース膜をラップに包み、反
応面をＸ線フィルム（コダック X-OMAT, AR, カタログ
番号165 1454）に密着させて露光し、現像してＨＳＰ６
０の有無の検討を行った。

【００３３】対照試験、すなわち、麦芽抽出物を添加し
なかった腎癌細胞株ＡＣＨＮでは、分子量約６０ｋＤの
バンドが一本検出された。なお、分子量は、前記抗ヒト
ＨＳＰ６０マウスモノクローナル抗体との結合、及び分
子量マーカー（卵白オバルブミン及びウシ血清アルブミ
ン）により決定した。麦芽抽出物を添加した腎癌細胞株
ＡＣＨＮでは、相当するバンドが極めて薄いバンドであ
った。すなわち、麦芽抽出物は、ＨＳＰ６０の発現を抑
制する合成抑制剤の活性を有するものと結論することが
できる。

【００３４】

【発明の効果】以上詳述したように、麦芽抽出物は、細
胞内のＨＳＰ６０ファミリーに属するタンパク質の発現
を抑制する合成抑制剤の活性を有する。従って、麦芽抽
出物を投与することにより、例えば、ＨＳＰ６０ファミ
リーに属するタンパク質が発症に関与する自己免疫疾患
（例えば、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチなど）の患者
の生理学的状態を有効に改善させ、前記病気を効果的に
治療することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物のクロ
マトグラムを例示したものである。

【図２】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物の赤外
吸収スペクトルを例示したものである。

【図３】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物の ¹Ｈ
核磁気共鳴スペクトルを例示したものである。

【図４】実施例１で得られた麦芽抽出物の乾燥物の紫外
−可視吸収スペクトルを例示したものである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 麦芽抽出物を有効成分として含有するこ
   とを特徴とする、分子量５７キロダルトンから６８キロ
   ダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑制
   剤。
2. 【請求項２】 麦芽抽出物が、麦芽を糖化し、得られた
   麦芽糖化物を濾過し、得られた麦芽糖化物濾過残渣を水
   若しくは親水性溶媒又はそれらの混合液で抽出し、得ら
   れた抽出液から分子量１０，０００未満の低分子化合物
   画分を除去して得られる生成物である、請求項１に記載
   の分子量５７キロダルトンから６８キロダルトンまでの
   間の熱ショックタンパク質の合成抑制剤。
3. 【請求項３】 麦芽糖化物濾過残渣の水若しくは親水性
   溶媒又はそれらの混合液による抽出を、アルカリ条件下
   で実施し、得られた抽出液を中和して沈殿する物質を除
   去し、得られた上清から分子量１０，０００未満の低分
   子化合物画分を除去する、請求項２に記載の分子量５７
   キロダルトンから６８キロダルトンまでの間の熱ショッ
   クタンパク質の合成抑制剤。
4. 【請求項４】 水若しくは親水性溶媒又はそれらの混合
   液による抽出によって得られた抽出液をｐＨ３〜５に調
   整し、沈殿するタンパク質を除去し、得られた上清を中
   和して沈殿する物質を更に除去し、得られた上清から分
   子量１０，０００未満の低分子化合物画分を除去する、
   請求項２に記載の分子量５７キロダルトンから６８キロ
   ダルトンまでの間の熱ショックタンパク質の合成抑制
   剤。
5. 【請求項５】 麦芽糖化物濾過残渣の水若しくは親水性
   溶媒又はそれらの混合液による抽出を、アルカリ条件下
   で実施する、請求項２又は４に記載の分子量５７キロダ
   ルトンから６８キロダルトンまでの間の熱ショックタン
   パク質の合成抑制剤。