JP6263349B2 - 抗アレルギー物質及びその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗アレルギー物質及びその製造方法に関する。

花粉症、アトピー性皮膚炎等に代表されるＩ型アレルギーは、抗原の体内への進入により産生した免疫グロブリン抗体（ＩｇＥ抗体）が肥満細胞（マスト細胞）に結合した後、抗原がＩｇＥ抗体に結合すると、その刺激により、肥満細胞からヒスタミンやロイコトイエン等の伝達物質が放出され、これらの伝達物質に起因して知覚神経の刺激や血管拡張反応が起こり、鼻炎、くしゃみ、皮膚炎等のアレルギー症状が引き起こされるものである。

そして、このＩ型アレルギーを病因とする疾患の予防や治療においては、アレルギー症状を引き起こすヒスタミン等のケミカルメディエーターの放出自体を抑制することが有効であると考えられている。

ここで、近年、眠気等の副作用を伴わない安全な抗アレルギー素材として、シソが注目されており、シソに含まれるポリフェノール類（ロズマリン酸、ルテオリン、アピゲニン、カフェ酸）が抗アレルギー作用を有していることが知られている。

より具体的には、例えば、シソに含まれるロズマリン酸が、ダニ喘息モデルマウスのＴｈ２サイトカイン産生と好酸球性炎症を抑制する旨が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、例えば、シソに含まれるルテオリン及びカフェ酸が、起炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α）の産生を抑制し、ルテオリンが接触性過敏症モデルマウスの病態進展を予防する旨が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。更に、シソに含まれるアピゲニンが、アトピー性皮膚炎モデルマウスの病態進展と高ＩｇＥ産生を抑制する旨が報告されている（例えば、非特許文献３参照）。

また、ウスバサイシン及びケイリンサイシンから得られるフラバノン配糖体と不飽和脂肪酸アミド化合物が、ヒスタミンの遊離を抑制する旨が報告されている（例えば、特許文献１参照）。

また、ローズマリー、タイム及びメリッサからなる群から選ばれたシソ科植物から抽出されるジテルペン化合物とフラボノイド化合物が、ヒアルロニターゼ阻害作用を有する旨が報告されている（例えば、特許文献２参照）。

また、シソ熱水抽出物から得られるポリフェノール類が、肥満細胞脱顆粒阻害活性を有する旨が報告されている（例えば、特許文献３参照）。

また、シソ科植物の種子から抽出される水溶性エキス、甜茶エキス、及びシソ葉エキスが、リポキシゲナーゼ経路を効果的に抑制する旨が報告されている（例えば、特許文献４参照）。

また、シソの実から抽出されるトリヒドロキシフラバノンが、ヒアルロニダーゼ活性を阻害する旨が報告されている（例えば、特許文献５参照）。

また、塩蔵赤シソ葉から抽出されるフェノール類が、花粉症、アトピー性皮膚炎等の症状を改善する旨が報告されている（例えば、特許文献６参照）。

更に、シソ科メンタ属植物の抽出物が、ＩｇＥ産生を抑制する旨が報告されている（例えば、特許文献７参照）。

Sanbongi, C., Takano, H., Osakabe, N., Sasa, N., Natsume, M.,Yanagisawa, R., Inoue, K.I., Sadakane, K.,Ichinose, T., and Yoshikawa, T.（2004） Rosmarinic acid in perilla extract inhibits allergic inflammation induced by mite allergen, in a mouse model. Clin. Exp. Allergy 34,971-977. Ueda, H., Yamazaki, C., and Yamazaki, M.（2002）Luteolin as an anti-inflammatory and anti-allergic constituent of Perilla frutescens. Biol. Pharm. Bull. 25,1197-1202. Yano, S., Umeda, D., Yamashita, S., Yamada, K., and Tachibana, H.（2009） Dietary apigenin attenuates the development of atopic dermatitis-like skin lesions in NC/Nga mice. J. Nutr, Biochem.20,876-881.

特開平４−２６６９８号公報 特開平８−３３３２６７号公報 特開平９−２０６７２号公報 特開平１１−５６２９７号公報 特開２０００−１１６３５６号公報 特開２００３−１８０２８６号公報 特開２００３−２８６１８２号公報

ここで、シソに含まれる成分が抗アレルギー作用を有することは明らかであるが、上記ポリフェノール類を含むシソ中のどの成分がヒスタミン等のケミカルメディエーター放出抑制の主たる活性本体であるのかは特定されていない。

そこで、本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、既知のシソ成分よりも優れた抗アレルギー作用を有する抗アレルギー物質及びその製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明の抗アレルギー物質は、ヒスタミン遊離抑制活性を有し、下記式（１）で表されることを特徴とする。

また、本発明の抗アレルギー物質の製造方法は、下記式（２）で表される抗アレルギー物質を、シソから抽出することを特徴とする。

また、本発明の抗アレルギー物質の製造方法は、シソの溶媒抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分画・精製することにより、下記式（３）で表されるヒスタミン遊離抑制活性を有する物質を得ることを特徴とする。

本発明によれば、既知のシソ成分に比し、ヒスタミン等のケミカルメディエーターの放出を効果的に抑制することができ、優れた抗アレルギー作用を有する抗アレルギー物質を提供することができる。

本発明の実施例に係る赤シソ分画物（メタノール溶出画分）のカラムクロマトグラフィーのチャートである。 本発明の実施例に係る赤シソ分画物（メタノール溶出画分）のカラムクロマトグラフィーのチャートである。 本発明の実施例に係る抗アレルギー物質の質量スペクトルである。 本発明の実施例に係る抗アレルギー物質の質量スペクトルである。 ８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンのフラグメントイオンを説明するための図である。

本発明の抗アレルギー物質は、ヒスタミン遊離抑制活性を有し、下記式（４）で表されるフラバノン（シソフラバノン）である。

より具体的は、このフラバノンは、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノン（8-hyroxy-5,7dimethoxyflavanone）であり、フラボノイドの一種である。

本発明のフラバノンは、上記従来のシソに含まれるポリフェノール類（ロズマリン酸、ルテオリン、アピゲニン、カフェ酸）に比し、ヒスタミン等のケミカルメディエーターの放出を効果的に抑制することができ、優れた抗アレルギー作用を有する。

本発明のフラバノンは、赤シソに含まれている。また、赤シソの種類は、特に限定されず、本発明においては、１種類の赤シソを使用してもよく、２種類以上の赤シソを組み合わせて使用することもできる。

また、シソ抽出物であるフラバノンを得るためのシソの部位は特に限定されないが、本発明においては、特に、葉の部分が好ましい。

また、使用されるシソの形態は、特に限定されず、例えば、原型、切断片、又は粉末等のいずれの形態でも良い。

また、本発明のフラバノンは、赤シソの溶媒抽出物から得られ、赤シソを溶媒で抽出し、得られた溶媒抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分画・精製することにより得ることができる。

＜赤シソの熱水抽出＞
赤シソから有効成分を抽出するための溶媒としては、水、メタノールやエタノール等のアルコール、及びアセトン等が考えられるが、本発明のフラバノンをシソから抽出するための溶媒としては、抽出効率の観点から、熱水を使用することが好ましい。

より具体的には、例えば、赤シソの粉末を沸騰水中に投入し、攪拌しながら有効成分であるフラバノンを溶出させる。次いで、熱水中にフラバノンを溶出させた後、ガーゼ等を使用して抽出残渣を搾取して取り除く。その後、得られた抽出液を濾過し、濾過した抽出液に対して常法により濃縮処理、及び乾燥処理を施すことにより、赤シソの熱水抽出物を得る。

＜カラムクロマトグラフィーによる赤シソ熱水抽出物の分画＞
本発明においては、上述の方法により得られた赤シソ熱水抽出物を逆相カラムクロマトグラフィーにより分画する。より具体的には、ポリマー系カラムを用いた逆相カラムクロマトグラフィーにおいて、メタノールで溶出することにより分画することができる。なお、メタノールで溶出後、濃縮処理を行い、その後、凍結乾燥を行う。

ポリマー系カラムとしては、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ＳＴ／ＤＶＤ）をベースポリマーとして使用したカラム（例えば、三菱化学（株）製、商品名：ＭＣＬゲル ＣＨＰ２０Ｐ）を使用することができる。

＜カラムクロマトグラフィーによる赤シソ分画物の精製＞
本発明においては、上述の方法により得られた赤シソ分画物（メタノール溶出物）を、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）を使用して精製することにより、上記式（４）で表されるフラバノンを得ることができる。

より具体的には、粒子充填型カラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにおいて、アセトニトリルと水の混合溶媒（極性溶媒）を移動相として使用することにより精製（単離）することができる。

なお、アセトニトリルと水の混合比率は、特に限定されないが、移動相の極性を高めて、フラバノンの単離を容易にするとの観点から、アセトニトリル／水の混合比率をアセトニトリル：水＝３０：７０に設定することが好ましい。

また、粒子充填型カラムとしては、例えば、高純度シリカゲル（金属不純物が極めて少ないシリカゲル）が充填されたカラム（例えば、関東化学製、商品名：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ）を使用することができる。

また、本発明の抗アレルギー物質は、飲食品に配合して使用することができる。飲食品としては、例えば、茶、ジュース、コーヒー、紅茶等の飲料、うどん、そば等の麺類、飴、ガム、チョコレート等の菓子類、及びサプリメント等の健康食品等が挙げられ、これらの飲食品に本発明の抗アレルギー物質を配合することにより、抗アレルギー作用を有する飲食品を提供することができる。

なお、本発明の抗アレルギー物質を飲食品に配合する場合の配合量としては、ヒスタミン等のケミカルメディエーターの放出を十分に抑制するとの観点から、飲食品１００質量部に対して０．０３７５〜０．０５質量部であることが好ましい。

また、本発明の抗アレルギー物質は、薬品（医薬品、医薬部外品、動物用医薬品を含む）に配合して使用することができる。

この場合、抗アレルギー物質の投与方法は特に限定されず、例えば、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の形態により経口投与することができる。また、点滴等の注射や皮下、経皮等の非経口投与であってもよい。

また、投与量は、上述の投与方法や、患者の年齢、病状等により異なるが、例えば、大人では、１日当たり３０００ｍｇを投与することができる。なお、薬品における抗アレルギー物質の配合量は、上述の投与量に応じて、適宜変更することができる。

また、本発明の抗アレルギー物質は、化粧品に配合して使用することもできる。化粧品としては、例えば、化粧水、乳液、石鹸、洗顔料、ファンデーション、香水、口紅、シャンプー、リンス、パック等が挙げられ、これらの化粧品に本発明の抗アレルギー物質を配合することにより、抗アレルギー作用を有する化粧品を提供することができる。

以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。なお、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、これらの実施例を本発明の趣旨に基づいて変形、変更することが可能であり、それらを本発明の範囲から除外するものではない。

（実施例１）
（赤シソの熱水抽出）
赤ジソ粉末（三島食品／天日干し）３００ｇを、２Ｌの沸騰水を使用して、１時間、攪拌抽出した。次いで、ガーゼを用いて抽出残渣を搾取した。そして、本抽出を２回繰り返した後、得られた抽出液を濾紙（アドバンテック製、商品名：FILTER PAPER 2）を使用して濾過し、濾過した抽出液に対して、エバポレーターによる濃縮処理、及び凍結乾燥処理を施すことにより、赤シソの熱水抽出物を得た。

（カラムクロマトグラフィーによる赤シソ熱水抽出物の分画）
次いで、得られた赤シソ熱水抽出物を逆相カラムクロマトグラフィーにより分画した。ポリマー系カラムとして、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体（ＳＴ／ＤＶＤ）をベースポリマーとするカラム（三菱化学製、商品名：ＭＣＬゲル ＣＨＰ２０Ｐ）を使用し、本担体を５０％メタノールにより、１時間以上膨潤させてクロマトカラム（ＳＩＢＡＴＡ製、商品名：ＳＰＣクロマトカラム）に２０ｃｍ／分（１４１ｍｌ）充填した後、これをカラム体積の５倍量（７０７ｍｌ）の超純水により洗浄した。

そして、上述の赤ジソ熱水抽出サンプル３０gを、６００ｍｌの超純水で溶解したものをサンプルとし、このサンプルを本カラムに供して、水（カラム体積の７倍量：９９０ｍｌ）、メタノール（カラム体積の４倍量：５６５ｍｌ）、及びアセトン（カラム体積の４倍量：５６５ｍｌ）の順に溶出させた。そして、各溶出画分を、エバポレーターで部分的に濃縮した後、凍結乾燥した。

（細胞培養）
ラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３（ヒューマンサイエンス振興財団）を抗生物質（１００Ｕ／ｍｌ penicillin、１００μｇ／ｍｌ streptomycin、ＧＩＢＣＯ製）含有ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ製）、及び１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２環境下で培養した。なお、継代の際には、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＧＩＢＣＯ製）を使用して、１００×２０ｍｍの組織培養皿（ＦＡＬＣＯＮ製、商品名：３５３００３）を洗浄後、Trypsin-EDTA（ＧＩＢＣＯ製、商品名：２５３００−０５４）を使用して細胞を剥がし、再度、１０％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地に懸濁して、新しいプレートに播種した。

（脱顆粒抑制試験）
対数増殖期にあるＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４ウェルプレートに３.５×１０^５セル／５００μｌ／ウェル播種して、８時間、前培養した。その後、１００ｎｇ／ｍｌのＩｇＥ抗体（Monoclonal Mouse IgE anti-DNP）を加えて、１６時間、感作し、ＩｇＥ抗体をラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３に結合させた。

次に、細胞をSiraganian buffer（１１９ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、０．４ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ ＰＩＰＥＳ、４０ｍＭ水酸化ナトリウム、ｐＨ７．２）で洗浄し、その後、Reagent buffer（グルコース５.６ｍＭ、塩化カリウム１ｍＭ、０.１%ＢＳＡ含有Siraganian buffer）を２００μｌ/ウェルとなるように添加した。

次に、上述の水、メタノール、及びアセトンで溶出した、各赤シソ熱水抽出物のサンプルを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用して、０．５６％の濃度に調整し、各サンプルを５０μｌ／ウェル加えて、３０分間、培養した。

その後、１μｇ／ｍｌのＤＮＰ−ＢＳＡ（コスモバイオ製、商品名：ＬＧ−００１７）を２５μｌ／ｍｌ添加して脱顆粒反応を惹起させ、３０分後に培養上清を回収するとともに、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２７５μｌ／ウェル加え、細胞内のヒスタミンを全て遊離させた。その後、本培養上清および細胞溶解液中のヒスタミンを、ヒスタミン比色定量ELISAキット（OXFORD BIOMEDICAL RESERCH製、商品名：ＥＡ３１）を用いて定量した。

なお、上述の水、メタノール、及びアセトンで溶出した、各赤シソ熱水抽出物のサンプルを加えず、ＩｇＥ抗体とアレルゲン（Allergen）であるＤＮＰ−ＢＳＡを加えたもの（ＩｇＥ＋Ａｇ）、及びカラムクロマトグラフィーによる分画を行う前の赤シソ熱水抽出物についても、同様に、ヒスタミンを定量した。

なお、統計的有意性を分析する手法として、スチューデントのｔ検定（unpaired Student’s t-test）を使用し、上述のＩｇＥ＋Ａｇに対して、有意水準（Ｐ値）が０.０５未満（即ち、Ｐ＜０．０５）の場合を、統計学的に有意な差異があるものと評価した。以上の結果を表１に示す。

表１に示すように、赤シソ熱水抽出物において、ヒスタミンの遊離が抑制されており、Ｉ型アレルギー反応抑制活性を有することが判る。

また、カラムクロマトグラフィーによる水溶出画分・メタノール溶出画分およびアセトン溶出画分のうち、メタノール溶出画分において、優れたヒスタミン遊離抑制活性が認められ、メタノール溶出画分にヒスタミン遊離抑制活性因子が濃縮されていることが判る。

（カラムクロマトグラフィーによる赤シソ分画物（メタノール溶出画分）の精製）
次に、上述のメタノール溶出画分を、更に、メタノールで５０ｍｇ／ｍｌに調製したサンプルを準備し、このサンプルを０．２０μｍの親水性フィルター（アドバンテック製、商品名：DISMIC-13HP PTFE）を使用して濾過し、これを高純度シリカゲルが充填されたカラム（関東化学製、商品名：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ）とガードカラム（関東化学製、商品名：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ ＲＰ−１８ ＧＰ用ガードカラム）を使用して、逆相ＨＰＬＣにより分画した。

なお、移動相として、超純水で調製した４０％（即ち、アセトニトリル：水＝４０：６０）のアセトニトリル（ＳＩＧＭＡ製、商品名：０１−０６４５）にトリフルオロ酢酸（ＳＩＧＭＡ製、商品名：３０２０３１）を０.０１％加えた溶液を用いた。

また、分画条件を流速２.３６ｍｌ／ｍｉｎ、４０℃とし、２１０ｎｍ、２５０ｎｍ、２８０ｎｍ及び３１０ｎｍの４つの吸収波長のおける吸光度を測定した。また、カラム保持時間は３０分間とした。得られたチャートを図１に示す。

また、カラム保持時間が０〜１０分、１０〜２０分、及び２０〜３０分の３つの画分の各々について、上記の脱顆粒抑制試験と同様の試験を行い、ヒスタミンの定量を行った。以上の結果を表２に示す。

なお、上述の脱顆粒抑制試験の場合と同様に、スチューデントのｔ検定（unpaired Student’s t-test）を使用し、表１に記載のＩｇＥ＋Ａｇに対して、有意水準（Ｐ値）が０.０５未満（即ち、Ｐ＜０．０５）の場合を、統計学的に有意な差異があるものと評価した。

表２に示すように、図1のクロマトグラフィーチャートにおけるカラム保持時間が１０〜２０分の画分に、ヒスタミン遊離抑制活性の本体が含まれていることが判る。

次に、上述のカラム保持時間が１０〜２０分の画分について、更なる分画精製を行った。より具体的には、上述の移動相を、超純水で調製した３０％（即ち、アセトニトリル：水＝３０：７０）のアセトニトリル（ＳＩＧＭＡ製、商品名：０１−０６４５）にトリフルオロ酢酸（ＳＩＧＭＡ製、商品名：３３０７６）を０.０１％加えた溶液に変更し、上述と同様にして、分画条件を流速２.３６ｍｌ／ｍｉｎ、４０℃とし、２１０ｎｍ、２５０ｎｍ、２８０ｎｍ及び３１０ｎｍの４つの吸収波長のおける吸光度を測定した。得られたチャートを図２に示す。

図２に示すように、カラム保持時間が１０〜２０分の画分について８つのピークが認められた。

次に、この８つのピークを分取して、上記の脱顆粒抑制試験と同様の試験を行うことにより、各ピークにおけるヒスタミンの定量を行い、各ピークにおけるヒスタミン遊離抑制活性を確認した。以上の結果を表３に示す。

表３に示すように、図２に示すピーク１〜８のうち、ピーク５における画分が最も低値であり、優れたヒスタミン遊離抑制活性を有することが判る。

（赤シソ由来新規Ｉ型アレルギー抑制因子の構造決定）
（質量分析）
まず、ＨＰＬＣにより分取した上記ピーク５のサンプルを、クロロホルム（ＳＩＧＭＡ製、商品名０５−３４００）を用いて溶解し、次に、その一部をＨＰＬＣ用メタノール（ＳＩＧＭＡ製、商品名：１９−２４７０）で十分に希釈したものをサンプルとして使用した。なお、質量測定には、質量分析計（Thermo Fisher Scientific製、商品名：LTQ Orbitrap XL）を使用し、イオン化にはＥＳＩ法またはＡＰＣＩ法を用いた。以上の結果を、図３に示す。

図３に示すように、質量数が３２３．０９ｍ／ｚにおいて、特異的な分子イオンピークが観察され、このピークを組成演算に供した結果、Ｃ_１７Ｈ_１６Ｏ_５（イオン式：［Ｃ_１７Ｈ_１６Ｏ_５＋Ｎａ^＋］^＋）の組成式が得られた。

次に、タンデム型質量分析計（Thermo Fisher Scientific製、商品名：LTQ Orbitrap XL）を使用して、ピーク５における分子イオン（質量数：３２３.０９ｍ／ｚ）をＭＳ／ＭＳ分析に供したところ、図４に示すように、質量数が２１９.０２ｍ／ｚ、組成式がＣ_９Ｈ_８Ｏ_５の単一ピークが認められた。

そして、本分子イオンピークは、図５に例示するフラボノイド類の逆Diels-Alder反応により生成されるフラグメントイオンの質量数と完全に一致した。即ち、ピーク５（Ｃ_１７Ｈ_１６Ｏ_５）におけるＭＳ／ＭＳ質量数は、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノン（例示化合物）の逆Diels-Alder反応によって生じるフラグメントイオン（Ｃ_９Ｈ_８Ｏ_５）の質量数と一致することが判った。

また、以上の結果と、植物代謝産物データベース（KNApSAcK）とを照合した結果からも、本分子が上記例示化合物のようなジメトキシフェノール環を有するフラバノン等である可能性が示唆された。

（ＮＭＲ測定）
次いで、上記ピーク５のサンプルを、核磁気共鳴法（^１ＨＮＭＲ、及び^１３ＣＮＭＲ）を用いて解析した。得られたスペクトルデータを以下に示す。

¹H NMR (500MHz, CDCl₃):
5.49(dd,1H,J=13,2.8Hz),2.85(dd,1H,J=17,3.Hz),3.10(dd,1H,J=17,13Hz),6.19(s,1H),7.26-7.48(m,1H),3.98(s,3H),3.92(s,3H).
¹C NMR (125MHz, CDCl₃):
80.0(d), 45.8(t), 189.2(s), 105.9(d), 152.5(s), 89.8(d), 155.0(s), 127.7(s), 149.4(s), 138.4(s), 126.3(d), 128.9(d), 128.8(d), 56.2(q), 56.4(q).

なお、本実施例における核磁気共鳴法（^１ＨＮＭＲ、及び^１３ＣＮＭＲ）の測定では、測定装置として、Ｌaｍｂｄａ５００（日本電子製）を使用した。また、内部基準として重クロロホルムを使用し、この重クロロホルム０．４ｍｌにサンプルを溶解することにより行った。

そして、ピーク５から得られた両ＮＭＲスペクトルデータ、及び、隣り合った炭素に結合する水素同士の相関（ＣＯＳＹ）、炭素の級数測定（ＤＥＰＴ）、炭素と水素の相関（ＨＭＱＣ）、炭素と水素のロングレンジ相関（ＨＭＢＣ）、及び水素間の空間距離測定（ＮＯＥ）等の諸解析の結果から、上記ピーク５の分子が、上記式（４）に示す８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンであることを確認した。

なお、本構造の有機合成標品のＮＭＲ解析データが、上記ピーク５のＮＭＲ解析データと完全に一致することを確認し、上記ピーク５の分子が８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンであることが確証された。

（ヒスタミン遊離抑制活性試験）
次に、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンと、シソ由来既知抗炎症成分（ロズマリン酸、ルテオリン、アピゲニン、カフェ酸）のヒスタミン遊離抑制活性を比較検討した。

より具体的には、対数増殖期にあるＲＢＬ−２Ｈ３細胞を２４ウェルプレートに３.５×１０^５セル／５００μｌ／ウェル播種して、８時間、前培養した。その後、１００ｎｇ／ｍｌのＩｇＥ抗体（Monoclonal Mouse IgE anti-DNP）を加えて、１６時間、感作し、ＩｇＥ抗体をラット好塩基球細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３に結合させた。

次に、細胞をSiraganian buffer（１１９ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、０．４ｍＭ塩化マグネシウム、２５ｍＭ ＰＩＰＥＳ、４０ｍＭ水酸化ナトリウム、ｐＨ７．２）で洗浄し、その後、Reagent buffer（グルコース５.６ｍＭ、塩化カリウム１ｍＭ、０.１%ＢＳＡ含有Siraganian buffer）を２００μｌ/ウェルとなるように添加した。

次に、合成標品の８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノン、ロズマリン酸、ルテオリン、アピゲニン、カフェ酸を、ＤＭＳＯを使用して、０．５６％の終濃度になるよう調整し、各サンプルを５０μl／ウェル加えて、３０分間、培養した。

その後、１μｇ／ｍｌのＤＮＰ−ＢＳＡ（コスモバイオ製、商品名：ＬＧ−００１７）を２５μｌ／ｍｌ添加して脱顆粒反応を惹起させ、３０分後に培養上清を回収するとともに、０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２７５μｌ／ウェル加え、細胞内のヒスタミンを全て遊離させた。その後、本培養上清および細胞溶解液中のヒスタミンを、ヒスタミン比色定量ELISAキット（OXFORD BIOMEDICAL RESERCH製、商品名：ＥＡ３１）を用いて定量した。

なお、上述の被験物質を加えず、ＩｇＥ抗体とアレルゲン（Allergen）であるＤＮＰ−ＢＳＡを加えたもの（ＩｇＥ＋Ａｇ）についても、同様に、ヒスタミンを定量した。

また、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンは、東京化成工業に化学合成受託したものを使用した。また、シソ由来既知抗炎症成分としては、カフェ酸（東京化成工業製、商品名：Ｃ０００２）、ロズマリン酸（和光純薬製、商品名：１８８０２６９３）、ルテオリン（EXTRASYNTHESE製、商品名：ＳＳＸ００５２）、及びアピゲニン（EXTRASYNTHESE製、商品名：ＳＳＶ００５１）の精製標品を使用した。

また、上述の脱顆粒抑制試験の場合と同様に、スチューデントのｔ検定（unpaired Student’s t-test）を使用し、ＩｇＥ＋Ａｇに対する有意水準（Ｐ値）が０.０５未満（即ち、Ｐ＜０．０５）の場合を、統計学的に有意な差異があるものと評価した。以上の結果を表４に示す。

表４に示すように、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンは、シソ由来既知抗炎症成分（ロズマリン酸、ルテオリン、アピゲニン、カフェ酸）に比し、低濃度であっても、優れたヒスタミン遊離抑制活性を有することが判る。また、本結果から、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンが、シソ由来の新規なＩ型アレルギー抑制因子であることが判る。

（赤シソ由来新規Ｉ型アレルギー抑制因子の経口投与試験）
ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、５週齢：日本チャールズ・リバー製）を特定病原体不在環境下で、２２℃±３℃、及び１２時間ごとの明暗サイクルにて飼育した。なお、食餌はγ線照射飼料ＣＲＦ−１（オリエンタル酵母製）、水は滅菌蒸留水を自由に摂取させた。

また、飼育１日目と７日目に、１００μｇのスギ花粉（東京環境アレルギー研究所）を１ｍｇの水酸化アルミニウムゲル（Thermo Fisher Scientific製）と共に、１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した状態で腹腔内投与した。

なお、免疫対照群として、１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水に１００μｇのスギ花粉と１ｍｇの水酸化アルミニウムを懸濁したものを腹腔内投与した群を設けた。また、非免疫対照群として、１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水に１ｍｇの水酸化アルミニウムのみを懸濁したものを投与した群を設けた。

また、この花粉症モデルマウスに対して、１日目のスギ花粉腹腔内免疫の直後から、毎日、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノン５μｍｏｌを１５０μｌの５％エタノール含有リン酸緩衝生理食塩水で希釈したものを経口投与した。また、比較例として、ロズマリン酸（和光純薬製、商品名：１８８０２６９３）５μｍｏｌを１５０μｌの５％エタノール含有リン酸緩衝生理食塩水で希釈したもの、及びアピゲニン（EXTRASYNTHESE製、商品名：ＳＳＶ００５１）５μｍｏｌを１５０μｌの５％エタノール含有リン酸緩衝生理食塩水で希釈したものを経口投与した。一方、上記の免疫対照群および非免疫対照群には被験物質を含まない１５０μｌの５％エタノール含有リン酸緩衝生理食塩水を経口投与した。

そして、飼育１７日目から２４日目まで、スギ花粉懸濁液（スギ花粉０．５ｍｇを２０ μｌのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁したもの）を毎日、経鼻内投与し、２４日目のスギ花粉投与後、５分間におけるくしゃみ行動回数を定量した。以上の結果を、表５に示す。

なお、上述の脱顆粒抑制試験の場合と同様に、スチューデントのｔ検定（unpaired Student’s t-test）を使用し、免疫対照に対する有意水準（Ｐ値）が０.０５未満（即ち、Ｐ＜０．００５）の場合を、統計学的に有意な差異があるものと評価した。

表５に示すように、８−ヒドロキシ−５，７−ジメトキシフラバノンの経口投与により花粉症病態（くしゃみ症状）の進展が有意に抑制されていることが判る。

一方、シソの既知抗アレルギー成分であるアピゲニンとロズマリン酸には、有意な花粉症抑制効果が認められないことが判る。

以上の結果から、シソフラバノンはin vivoにおいても、既知シソ抗炎症成分よりも優れたＩ型アレルギー抑制効果を発揮し得ることが判る。

本発明の活用例としては、抗アレルギー作用を有するシソ成分を含有する抗アレルギー物質及びその製造方法が挙げられる。

Claims (5)

1. 下記式（１）で表される抗アレルギー物質を、シソから抽出することを特徴とする前記抗アレルギー物質の製造方法。
   

   
2. シソの溶媒抽出物をカラムクロマトグラフィーにより分画・精製することにより、下記式（２）で表されるヒスタミン遊離抑制活性を有する抗アレルギー物質を得ることを特徴とする前記抗アレルギー物質の製造方法。
   

   
3. 前記溶媒が熱水であることを特徴とする請求項２に記載の抗アレルギー物質の製造方法。
4. 前記カラムクロマトグラフィーが、逆相カラムクロマトグラフィーであることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の抗アレルギー物質の製造方法。
5. 前記シソが赤シソであることを特徴とする請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗アレルギー物質の製造方法。

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