JP5470612B2 - 糖鎖改変方法および糖鎖改変装置 - Google Patents
糖鎖改変方法および糖鎖改変装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5470612B2 JP5470612B2 JP2008133815A JP2008133815A JP5470612B2 JP 5470612 B2 JP5470612 B2 JP 5470612B2 JP 2008133815 A JP2008133815 A JP 2008133815A JP 2008133815 A JP2008133815 A JP 2008133815A JP 5470612 B2 JP5470612 B2 JP 5470612B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sugar chain
- glycosidase
- column
- reaction
- proteoglycan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
K, Takagaki et al., Biochemistry, 33(21), 6503-6507, 1994. H, Saitoh et al., J. Biol. Chem., 270, 3741-3747, 1995.
また、本発明の糖鎖改変装置は、請求項2記載の通り、糖鎖の加水分解反応を行うための第1のグリコシダーゼ固定化カラムと糖転移反応を行うための第2のグリコシダーゼ固定化カラムが直列に連結されてなるとともに、第2のグリコシダーゼ固定化カラムに糖転移反応を行うための供与体を導入できるように構成されてなり、グリコサミノグリカンおよび/またはプロテオグリカンを含む水溶液を第1のグリコシダーゼ固定化カラムに通液し、グリコシダーゼの作用に基づく糖鎖の加水分解反応をカラム内で行った後、糖鎖の加水分解反応によって得られる生成物を、糖転移反応を行うための供与体となるグリコサミノグリカンおよび/またはプロテオグリカンとともに、第2のグリコシダーゼ固定化カラムに導入し、グリコシダーゼの作用に基づく糖転移反応をカラム内で行うこと、かつ、前記グリコシダーゼがヒアルロニダーゼであることにより糖鎖を改変するためのものであることを特徴とする。
以下、グリコシダーゼ固定化カラムとしてヒアルロニダーゼ固定化カラムを組み込んだ糖鎖改変装置の使用方法の一例について順を追って説明する。
まず、(1)から出発原料(糖鎖改変対象)であるプロテオグリカンを含む水溶液を第1CMにアプライした後、第1CMの出口のコックを閉じ、第1CM内で糖鎖の加水分解反応を所定の条件下(例えば0.1M酢酸ナトリウム緩衝液−0.15M NaCl,pH4.0〜5.5,37℃)で数時間〜一晩行う。この過程により、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン糖鎖は、橋渡し領域の4糖を含む6糖を残して消化され、糖鎖欠損プロテオグリカンと主として4糖からなるグリコサミノグリカン糖鎖の分解断片が第1CM内に生成する。
次に、第1CMの出口のコックを開き、(1)から水を加え、ペリスタポンプを作動させて装置内の流路に反応液が流れるようにすることで、第1CMから流出した反応液に含まれる糖鎖欠損プロテオグリカンと糖鎖分解断片を、限外ろ過膜ユニット(例えばPellicon(商品名) XLデバイス,バイオマックス−5,日本ミリポア社)を循環する過程で分離し(反応液の循環速度は例えば3〜4mL/minが望ましい)、糖鎖分解断片を流路の外に排出するとともに、糖鎖欠損プロテオグリカンを第2CMに導入する。
次に、(2)から糖転移反応を行うための供与体(ドナー)となる長鎖のグリコサミノグリカン(例えばヒアルロン酸であれば150〜250糖、コンドロイチンやコンドロイチン硫酸Aであれば100〜150糖、コンドロイチン硫酸Cであれば50〜100糖が好適である)を第2CMの入口のコックを開いて導入し、糖転移反応を所定の条件下(例えば0.1M Tris−HCl緩衝液,pH7.0,37℃)で数時間〜一晩行う。第2CM内を糖転移反応の至適条件とするために、供与体となるグリコサミノグリカンは、例えば0.2〜1M Tris−HCl緩衝液に溶解して第2CMに導入することが望ましい。この過程により、供与体としたグリコサミノグリカンの糖鎖が加水分解されてその非還元末端側から構成糖が2糖ずつ遊離するとともに、遊離した構成糖が2糖ずつ糖鎖欠損プロテオグリカンが有する6糖からなる糖鎖の非還元末端側に次々に転移して糖鎖が伸長する。所定の反応時間が経過した後、(1)から水を加え、ペリスタポンプを作動させて生成物(糖鎖改変プロテオグリカン)を回収する。
なお、第1CM内での副反応である糖転移反応と第2CM内での副反応である糖鎖の加水分解反応を極力抑制し、第1CM内での糖鎖の加水分解反応と第2CM内での糖転移反応を効率的に行うためには、第2CMの酵素活性は第1CMの酵素活性よりも低いことが望ましい。従って、第1CMとしたカラムを繰り返し利用することで酵素活性が低下したら、新しいカラムに交換するとともに、酵素活性が低下したカラムは第2CMとして使用することで、カラムの有効利用を図ることができる。
1.2gのウシ精巣性ヒアルロニダーゼ(Type1−S,シグマ社)と、膨潤させる前の乾燥重量で30g(膨潤させた後におけるタンパク質濃度が10mg/mL)のGEヘルスケア社のCNBr活性化セファロース4FFを、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)中、室温で2時間または4℃で18時間かけてカップリングさせ、直径が15mmで長さが10cmのガラス製のカラムに充填することで作製した(充填した担体のベッドボリュームは3.6mLで高さは2cm)。カップリング効率は11.86%で、担体1mL(ベッドボリューム)あたりのヒアルロニダーゼのタンパク質量と力価はそれぞれ1.2mgと534U程度であった。このようにして作製したカラムは使用時まで4℃で保存した。
平衡化緩衝液(0.1M酢酸ナトリウム緩衝液−0.15M NaCl,pH5.0)で平衡化したヒアルロニダーゼ固定化カラムに、出発原料(糖鎖改変対象)であるプロテオグリカンとしてヒト尿中トリプシンインヒビター(UTI:わかもと製薬社)を担体1mL(ベッドボリューム)あたり約10mgアプライし(平衡化緩衝液を溶媒として使用)、37℃で18時間保持して糖鎖の加水分解反応を行って糖鎖を分解させた後、反応液をカラムから排出させ、限外ろ過膜(アミコン社)を用いて精製・濃縮することで、糖鎖欠損プロテオグリカンを得た。
平衡化緩衝液(0.1M Tris−HCl緩衝液,pH7.0)で平衡化したヒアルロニダーゼ固定化カラムに、受容体(アクセプター)としての実施例1で調製した糖鎖欠損プロテオグリカンと供与体(ドナー)としての約200糖からなるヒアルロン酸(紀文フードケミファ社)を同時にアプライした。それぞれのアプライ量は、担体1mL(ベッドボリューム)あたり約15mgと約2mgとした(平衡化緩衝液を溶媒として使用)。4℃で18時間保持して糖転移反応を行って糖鎖を伸長させた後、反応液をカラムから排出させて濃縮することで、糖鎖改変プロテオグリカンを得た。
実施例1で得られた糖鎖欠損プロテオグリカンと実施例2で得られた糖鎖改変プロテオグリカンの純度を、従来法(試験管内で行う反応系)で得られた糖鎖欠損プロテオグリカンと糖鎖改変プロテオグリカンの純度と比較した結果を図2に示す(CBB染色SDS−PAGE:いずれも反応液の状態のもの)。なお、各レーンは以下の通りである。
レーン1:プロテオグリカン
レーン2:実施例1で得られた糖鎖欠損プロテオグリカン
レーン3:実施例2で得られた糖鎖改変プロテオグリカン
レーン4:従来法で得られた糖鎖欠損プロテオグリカン
レーン5:従来法で得られた糖鎖改変プロテオグリカン
レーン6:ヒアルロニダーゼ
図2から明らかなように、本発明の方法によるレーン2とレーン3では、目的生成物のバンド(矢印1)の他にも出発原料由来のバンド(矢印2で示される低分子UTIなど)が認められるが、従来法によるレーン4とレーン5で認められるヒアルロニダーゼのバンドは認められず、本発明の方法によれば、従来法に比較して高い純度で目的生成物を調製できることがわかった。なお、種々の大きさやベッドボリュームのヒアルロニダーゼ固定化カラムを作製して同様の実験を行っても、結果は同じであった。
Claims (2)
- グリコサミノグリカンおよび/またはプロテオグリカンを含む水溶液を、糖鎖の加水分解反応を行うための第1のグリコシダーゼ固定化カラムに通液し、グリコシダーゼの作用に基づく糖鎖の加水分解反応をカラム内で行った後、糖鎖の加水分解反応によって得られる生成物を、糖転移反応を行うための供与体となるグリコサミノグリカンおよび/またはプロテオグリカンとともに、第1のグリコシダーゼ固定化カラムに直列に連結した糖転移反応を行うための第2のグリコシダーゼ固定化カラムに導入し、グリコシダーゼの作用に基づく糖転移反応をカラム内で行うこと、かつ、前記グリコシダーゼがヒアルロニダーゼであることにより糖鎖を改変する方法。
- 糖鎖の加水分解反応を行うための第1のグリコシダーゼ固定化カラムと糖転移反応を行うための第2のグリコシダーゼ固定化カラムが直列に連結されてなるとともに、第2のグリコシダーゼ固定化カラムに糖転移反応を行うための供与体を導入できるように構成されてなり、グリコサミノグリカンおよび/またはプロテオグリカンを含む水溶液を第1のグリコシダーゼ固定化カラムに通液し、グリコシダーゼの作用に基づく糖鎖の加水分解反応をカラム内で行った後、糖鎖の加水分解反応によって得られる生成物を、糖転移反応を行うための供与体となるグリコサミノグリカンおよび/またはプロテオグリカンとともに、第2のグリコシダーゼ固定化カラムに導入し、グリコシダーゼの作用に基づく糖転移反応をカラム内で行うこと、かつ、前記グリコシダーゼがヒアルロニダーゼであることにより糖鎖を改変するための糖鎖改変装置。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008133815A JP5470612B2 (ja) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | 糖鎖改変方法および糖鎖改変装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008133815A JP5470612B2 (ja) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | 糖鎖改変方法および糖鎖改変装置 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009278907A JP2009278907A (ja) | 2009-12-03 |
JP5470612B2 true JP5470612B2 (ja) | 2014-04-16 |
Family
ID=41450070
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008133815A Active JP5470612B2 (ja) | 2008-05-22 | 2008-05-22 | 糖鎖改変方法および糖鎖改変装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5470612B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011252115A (ja) * | 2010-06-03 | 2011-12-15 | Hirosaki Univ | ハイブリッド糖鎖の製造方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6688498B2 (ja) * | 2014-10-16 | 2020-04-28 | 地方独立行政法人青森県産業技術センター | プロテオグリカンの分解方法及び分解物 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6193948A (ja) * | 1984-10-13 | 1986-05-12 | Shimadzu Corp | スクロ−スセンサ |
JPS61124399A (ja) * | 1984-11-19 | 1986-06-12 | Shimadzu Corp | 糖類の分析方法及び装置 |
JPH0632614B2 (ja) * | 1986-11-14 | 1994-05-02 | サントリー株式会社 | 固定化微生物およびその利用 |
JP2606859B2 (ja) * | 1987-06-12 | 1997-05-07 | 明治乳業株式会社 | 固定化酵素カラムによるオリゴ糖の製造方法とその装置 |
JP3071669B2 (ja) * | 1995-07-04 | 2000-07-31 | 工業技術院長 | 抗アレルギー物質、その製造方法、抗アレルギー剤及び機能性食品 |
JP3072321B2 (ja) * | 1997-06-13 | 2000-07-31 | 工業技術院長 | 抗hiv活性物質およびその製造方法 |
DE60230594D1 (de) * | 2001-02-26 | 2009-02-12 | Toyo Boseki | Fusionsprotein mit beta-1,2-n-acetylglucosaminyl-transferase-ii-aktivität und herstellungsverfahren dafür |
JP2005278592A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Hitachi High-Technologies Corp | 糖鎖精製装置 |
JP4763997B2 (ja) * | 2004-11-08 | 2011-08-31 | 電気化学工業株式会社 | 構造明確なコンドロイチン4−硫酸及びその製造法 |
JP5344783B2 (ja) * | 2005-06-06 | 2013-11-20 | 独立行政法人科学技術振興機構 | サメ軟骨のコンドロイチン硫酸由来の硫酸化八糖 |
JP5344787B2 (ja) * | 2006-02-24 | 2013-11-20 | 独立行政法人科学技術振興機構 | イカ軟骨のコンドロイチン硫酸由来の硫酸化八糖及び十糖 |
-
2008
- 2008-05-22 JP JP2008133815A patent/JP5470612B2/ja active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011252115A (ja) * | 2010-06-03 | 2011-12-15 | Hirosaki Univ | ハイブリッド糖鎖の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2009278907A (ja) | 2009-12-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2340888T3 (es) | Metodo enzimatico para procudir alfa-d-glucosilglicerol (2-0-gliceril-alfa-d-glucopiranosida). | |
Aarstad et al. | Alginate sequencing: an analysis of block distribution in alginates using specific alginate degrading enzymes | |
Hobbs et al. | Glycan‐metabolizing enzymes in microbe–host interactions: the Streptococcus pneumoniae paradigm | |
KR101465805B1 (ko) | 유전자 조작법에 의한 덱스트란수크라제 dsr-s의 신규변이체의 제조 | |
ES2869525T3 (es) | Método para producir heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante | |
Santos-Moriano et al. | Continuous production of chitooligosaccharides by an immobilized enzyme in a dual-reactor system | |
JP2019213532A (ja) | ガラクト−オリゴサッカライドの製造 | |
US20210155720A1 (en) | Method for Preparing Hyaluronan Odd-numbered Oligosaccharides by Double Enzyme Hydrolysis | |
WO2008035372A3 (en) | Efficient process for purification of high molecular weight hyaluronic acid | |
CN103228781B (zh) | 软骨素的生物技术制备 | |
JP4237752B2 (ja) | 糖鎖アスパラギン誘導体の製造方法 | |
EP2428578B1 (en) | Glucuronic acid-containing glucan, process for production of same, and use of same | |
JP5470612B2 (ja) | 糖鎖改変方法および糖鎖改変装置 | |
ES2947291T3 (es) | Heparán sulfato que presenta una elevada tasa de 3-O-sulfatación en los residuos de glucosamina | |
Liu et al. | Recombinant expression of a chitosanase and its application in chitosan oligosaccharide production | |
US20070141678A1 (en) | Processes for purifying oligosaccharides | |
CN114616340A (zh) | 合成抗凝血多糖的方法 | |
Wu et al. | Characterization and mechanism of action of Microbacterium imperiale glucan 1, 4-α-maltotriohydrolase | |
Bielicki et al. | Human liver N-acetylgalactosamine 6-sulphatase. Purification and characterization | |
JP5896355B2 (ja) | アルギン酸リアーゼ | |
Il'ina et al. | Enzymatic hydrolysis of α-chitin | |
JP5610428B2 (ja) | ハイブリッド糖鎖の製造方法 | |
JPS6121102A (ja) | キトサンオリゴ糖の製造法 | |
JPH066064B2 (ja) | ジフルクトース・ジアンヒドリドの製造方法 | |
JPS623795A (ja) | 分枝状シクロデキストリンの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110309 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130430 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130624 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130726 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131112 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131203 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131224 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140115 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5470612 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |