ES2869525T3 - Método para producir heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante - Google Patents

Abstract

Método de producción de heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante, que comprende: (A) N-desacetilar parcialmente un heparosano para producir un heparosano N-desacetilado, en el que dicha (A) se lleva a cabo de manera que una tasa residual de grupos N-acetilados es 1% a 33%; (B) tratar el heparosano N-desacetilado con heparinasa III para escindir el heparosano N-desacetilado, y (C) sulfatar el heparosano N-desacetilado escindido para producir el heparán sulfato que presenta la actividad anticoagulante.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir un heparán sulfato que presenta actividad anticoagulante. El heparán sulfato que presenta actividad anticoagulante resulta útil en, por ejemplo, el campo médico.

Antecedentes de la técnica

La heparina se ha conocido como un heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante. La heparina es uno de los anticoagulantes y se utiliza para el tratamiento del tromboembolismo y la coagulación intravascular diseminada (CID), y para la prevención de la coagulación sanguínea en la diálisis artificial o en la circulación extracorpórea. En particular, la heparina obtenida con un bajo peso molecular, con un peso molecular medio en peso de entre 4000 y 6000, se ha utilizado crecientemente con mayor frecuencia en los últimos años debido a sus menores efectos secundarios, tales como la hemorragia.

Se ha informado de muchos métodos para producir heparina de bajo peso molecular, y se dividen ampliamente en tres tipos: Un primer método es uno de digestión parcial de heparina extraída de un origen animal utilizando una técnica química, enzimática o física para obtener un bajo peso molecular. Un segundo método es uno de conversión del heparosano obtenido mediante un método de fermentación utilizando una bacteria productora de heparosano, tal como la cepa de Escherichia coli K5 en una sustancia similar a la heparina mediante la utilización de una técnica química o enzimática, seguido de la obtención de un bajo peso molecular con la técnica explicada en el primer método. Un tercer método es uno de obtención de heparina de bajo peso molecular mediante la unión de cadenas sacáridas procedentes de monosacáridos, mediante un método de síntesis química. El primer y segundo métodos comprenden una etapa de obtención bajo peso molecular. Por ejemplo, la descomposición con ácido nitroso, fotólisis y reacción de radicales, y la descomposición por un enzima, tal como la heparinasa, son conocidas como técnicas de obtención un bajo peso molecular.

La heparinasa es un enzima que escinde un sitio de un grupo glucosamina en glucosaminoglicano, tal como la heparina y el heparán sulfato. La heparinasa se divide ampliamente en tres: heparinasas I, II y III, y se ha estudiado la especificidad de sustrato de cada una (documento no de patentes n° 1). Por ejemplo, aunque la heparinasa I y la heparinasa II digieren la heparina, la heparinasa II y la heparinasa III digieren el heparán sulfato. Específicamente, la heparinasa II escinde específicamente un sitio de un residuo glucosamina en un disacárido que presenta un grupo 2-O-sulfato y un grupo 6-O-sulfato, mientras que la heparinasa III escinde específicamente un sitio de un residuo glucosamina en un disacárido que no presenta ningún grupo 2-O-sulfato. En particular, la heparinasa III escinde preferentemente un sitio de un residuo N-acetilglucosamina cadena abajo de un residuo de ácido hexurónico que no presenta ningún grupo 2-O-sulfato. Es decir, la especificidad de sustrato de la heparinasa III es: residuo N-acetilglucosamina (GlcNAc)>>residuo N-glucosamina libre (GlcNH4).

Tal como se ha indicado anteriormente, cada una de las heparinasas I a III presenta una especificidad diferente. Por lo tanto, existe el problema de que, aunque se intente rebajar el peso molecular de la heparina o de una sustancia similar a la heparina que presenta diversas modificaciones aleatorias en su molécula, mediante la utilización de una sola heparinasa, no puede obtenerse un peso molecular uniforme o no puede conseguirse un bajo peso molecular. De esta manera, se han realizado intentos para rebajar el peso molecular de la heparina y sustancias similares a la heparina mediante la utilización de dos o más heparinasas en combinación.

El documento WO-A-2015/050184 (n° EP-A-3054005) da a conocer un método para producir heparina a partir de heparosa sometiendo el heparosano como material de partida a las etapas de (1) N-desacetilación, (2) N-sulfatación, (3) epimerización en C5, (4) 2-O-sulfatación, (5) 6-O-sulfatación y (6) 3-O-sulfatación. El método para producir heparina puede comprender además una etapa de despolimerización. El orden de las etapas no se encuentra particularmente limitado.

W. Chai et al.: "Relative Susceptibilities of the Glucosamine-Glucuronic Acid and N-Acetylglucosamine-Glucuronic Acid Linkages to Heparin Lyase III", Biochemistry, vol. 43, n° 26, páginas 8590 a 8599, 2004, enseña que la heparinasa III escinde los enlaces de GlcN-GlcA pero no escinde los enlaces entre la N-acetilglucosamina (GlNAc) y el ácido glucurónico (GlcA). No se enseña la utilización de heparinasa III para producir heparán sulfato.

El documento WO-A-2012/116048 describe un método para producir heparina que comprende la N-desacetilación parcial y la despolimerización parcial del heparosano simultáneamente mediante el tratamiento del heparosano con NaOH en una única etapa.

J. Wu et al.: "Controllable production of low molecular weight heparins by combinations of heparinase I/II/III", Carbohydrate Polymers, vol. 101, páginas 484 a 492, 2013, enseña la producción controlable de heparinas de bajo peso molecular mediante combinaciones de heparinasa I/II/IN.

Referencias de la técnica anterior

Literatura no de patentes

Documento no de patente n° 1: Wei Z1. et al. J. Biol. Chem. 22 de abril, 2005; 280(16): 15742-8 Exposición de la invención

Problema que debe resolver la invención

Es un objetivo de la presente invención desarrollar una nueva tecnología para controlar el peso molecular del heparán sulfato a fin de proporcionar un método de producción de heparán sulfato con un peso molecular medio deseado.

Medios para resolver el problema

Como resultado del estudio exhaustivo, se ha descubierto en el contexto de la presente invención que el heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular con un peso molecular medio deseado se obtiene rebajando el peso molecular del heparosano con heparinasa IIi tras N-desacetilar parcialmente el heparosano y antes de N-sulfatarlo, y se ha completado la presente invención.

Es decir, la presente invención puede ejemplificarse de la manera siguiente.

[1] Un método para producir un heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante, que comprende: (A) N-desacetilar parcialmente un heparosano para producir un heparosano N-desacetilado, en el que dicho (A) se lleva a cabo de manera que la tasa residual de grupos N-acetilados es de 1% a 33%;

(B) tratar el heparosano N-desacetilado con heparinasa III para escindir el heparosano N-desacetilado, y (C) sulfatar el heparosano N-desacetilado escindido para producir el heparán sulfato que presenta la actividad anticoagulante.

[2] El método según [1], en el que dicha (A) se lleva a cabo de manera que la tasa residual de grupos N-acetilados es de entre 11% y 30%.

[3] El método según [1] o [2], en el que el peso molecular medio en peso de dicho heparán sulfato es de entre 5000 y 100000 en términos de pululano.

[4] El método según cualquiera de entre [1] y [3], en el que el peso molecular medio en peso de dicho heparán sulfato es de entre 8000 y 41000 en términos de pululano.

[5] El método según cualquiera de [1] a [4], en el que dicha (C) comprende una o más etapas seleccionadas de N-sulfatación, epimerización en C5, 2-O-sulfatación, 3-O-sulfatación de residuos de a-D-glucosamina y 6-O-sulfatación de un producido producido mediante dicha (B).

[6] El método según [5], en el que dicha (C) comprende por lo menos la N-sulfatación, la 3-O-sulfatación de residuos de a-D-glucosamina y la 6-O-sulfatación del producido mediante dicha (B).

[7] El método según [5], en el que dicha etapa (C) comprende las etapas de N-sulfatación, epimerización en C5, 2-O-sulfatación, 3-O-sulfatación de residuos de a-D-glucosamina y 6-O-sulfatación de un producido producido mediante dicha etapa (B).

[8] El método según [7], en el que dicha (C) se lleva a cabo en el orden de seguir (C1), (C2) y (C3):

(C1) la N-sulfatación,

(C2) la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación, y

(C3) la 3-O-sulfatación de residuos de a-D-glucosamina y la 6-O-sulfatación.

[9] El método según [8], en el que la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación se llevan a cabo simultáneamente en una parte de un periodo o la totalidad de un periodo en dicha (C2).

[10] El método según [8] o [9], en el que dicha (C3) se lleva a cabo en el orden de 3-O-sulfatación de residuos de a-D-glucosamina y la 6-O-sulfatación.

[11] El método según [8] o [9], en el que dicha (C3) se lleva a cabo en el orden de 6-O-sulfatación y 3-O-sulfatación de residuos de a-D-glucosamina.

[12] El método según cualquiera de [1] a [11], en el que el tratamiento del heparosano N-desacetilado con heparinasa III se lleva a cabo únicamente después de la etapa de N-desacetilar parcialmente el heparosano y antes de la etapa de N-sulfatación del heparosano N-desacetilado tratado con heparinasa III.

Efecto de la invención

La presente invención puede producir eficientemente un heparán sulfato que presenta el peso molecular medio deseado.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa el curso temporal de las tasas residuales de grupos N-acetilados durante la N-desacetilación del heparosano con hidrazina.

La figura 2 representa el curso temporal de las tasas residuales de grupos N-acetilados durante la N-desacetilación del heparosano con NaOH.

La figura 3 representa el curso temporal de rendimientos y pesos moleculares medios durante la digestión del heparosano N-desacetilado que presentaba una tasa residual de grupos N-acetilados de 12.5% con heparinasa III seguido de la N-sulfatación. El eje horizontal representa el tiempo de reacción de reducción del peso molecular utilizando heparinasa III.

La figura 4 representa el curso temporal de rendimientos y pesos moleculares medios durante la digestión de heparosano N-desacetilado que presentaba una tasa residual de grupos N-acetilados de 12.5% con 10 veces la cantidad de heparinasa III seguido de la N-sulfatación. El eje horizontal representa el tiempo de reacción de reducción del peso molecular utilizando heparinasa III.

Forma de realización para poner en práctica la invención

A continuación en la presente memoria se describe en detalle la presente invención.

En la presente invención, un heparán sulfato con el peso molecular medio deseado y que presenta una actividad anticoagulante puede producirse mediante N-desacetilación parcial de heparosano seguida de la obtención de un bajo peso molecular del mismo con heparinasa III y la conversión del producto de bajo peso molecular producido en heparán sulfato que presenta la actividad anticoagulante. Es decir, el método de la presente invención es un método para producir heparán sulfato que presenta actividad anticoagulante, que comprende la etapa de (A) N-desacetilar parcialmente un heparosano para producir un heparosano N-desacetilado, en el que dicha (A) se lleva a cabo de manera que la tasa residual de grupos N-acetilados es de entre 1% y 33%, (B) tratar el heparosano N-desacetilado con heparinasa III para escindir el heparosano N-desacetilado, y (C) sulfatar el heparosano N-desacetilado escindido para producir el heparán sulfato que presenta la actividad anticoagulante. Las etapas (A), (B) y (C) asimismo se denominan "etapa de N-desacetilación", "etapa de obtención de un bajo peso molecular" y "etapa de producción de heparán sulfato", respectivamente. El heparán sulfato obtenido mediante el método de la presente invención puede presentar o no, por ejemplo, la misma estructura que la del heparán sulfato conocido (por ejemplo, heparina).

El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede estar compuesto por un único tipo de cadena sacárida o puede ser una mezcla de múltiples tipos de cadenas sacáridas. El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención se obtiene típicamente en forma de una mezcla de múltiples tipos de cadenas sacáridas. La expresión "mezcla de múltiples tipos de cadena sacárida" se refiere a una combinación de dos o más tipos de cadena sacárida que son de diferente estructura (número de azúcares unidos, peso molecular y tipo y posición de sustituyentes, y similares). En el caso de que el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención esté compuesto de un único tipo de cadena sacárida, cada parámetro que identifica el polisacárido corresponde a ese parámetro en esa cadena sacárida a menos que se especifique lo contrario. En el caso de que el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención sea una mezcla de múltiples tipos de cadena sacárida, cada parámetro que identifica el polisacárido corresponde a un valor promediado de los parámetros en toda la mezcla, a menos que se especifique lo contrario. Lo anterior se aplica a otros polisacáridos, tales como intermediarios tras la producción del polisacárido.

Cada parámetro que identifica el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede determinarse mediante técnicas conocidas utilizadas para la detección e identificación de compuestos, tales como polisacáridos. Entre los ejemplos de dichas técnicas se incluyen un análisis de disacáridos, un análisis de pesos moleculares (por ejemplo, cromatografía de permeación en gel, CPG), cromatografía de exclusión por tamaños acuosa (SEC) utilizando absorbancia de ultravioletas (UV) y de luz visible y un detector de índice de refracción (IR) (método SEC-IR/UV), así como HPLC, CL/EM y RMN. Dichas técnicas pueden utilizarse por sí solas o en combinación, según resulte apropiado. Dichas técnicas pueden seleccionarse apropiadamente según el tipo de parámetro que debe determinarse. Por ejemplo, puede determinarse la estructura de disacárido o el contenido en porcentaje de la misma mediante un análisis de disacáridos. El análisis de disacáridos puede llevarse a cabo mediante un método estándar. El análisis de disacáridos puede llevarse a cabo según las condiciones en un informe anterior (T Imanari, et.al., "High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycanderived oligosaccharides", J. O. Chromato. A, 720, 275-293, 1996). Es decir, por ejemplo, puede cuantificarse una cantidad de disacáridos constituyentes mediante, según se requiera, la descomposición de un polisacárido N-sulfatado en disacáridos insaturados utilizando heparinasa, y la separación y cuantificación de los productos descompuestos. Entre los ejemplos de heparinasa se incluyen heparinasa I, heparinasa II y heparinasa III. La heparinasa puede utilizarse sola o en combinación, según resulte apropiado. La heparinasa que debe utilizarse puede seleccionarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como el tipo de residuo de ácido hexurónico (HexA) contenido en el polisacárido. Por ejemplo, puede utilizarse una combinación de heparinasa II y III para el análisis de disacáridos de un polisacárido que comprende residuos de ácido p-D-glucurónico (GlcA). Además, por ejemplo, puede utilizarse una combinación de heparinasa I y II para el análisis de disacáridos de un polisacárido que comprende residuos de ácido a-L-idurónico (IdoA). Puede cuantificarse la cantidad de cada disacárido constituyente mediante descomposición del polisacárido con un ácido nitroso y separación y cuantificación del producto descompuesto. La separación y cuantificación del producto descompuesto pueden llevarse a cabo mediante métodos conocidos utilizados para la identificación de compuestos, tales como HPLC y CL/EM. Entre las condiciones para el análisis de disacáridos se incluyen específicamente, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. Puede calcularse un contenido en porcentaje de una unidad disacárido diana basándose en la cantidad de cada disacárido constituyente. Al escindir un polisacárido utilizando una heparinasa, tal como heparinasa III, típicamente, un enlace entre C4 y C5 se convierte en un doble enlace en un residuo HexA en un extremo no reducido que resulta a partir del mismo. El residuo IdoA y el residuo GlcA no pueden distinguirse en el residuo HexA que presenta un doble enlace entre C4 y C5. De esta manera, en el caso de que resulte necesario distinguir el residuo IdoA del residuo GlcA, puede llevarse a cabo el análisis de disacáridos mediante una técnica tal como un método de descomposición con ácido nitroso que pueda distinguir el residuo IdoA del residuo GlcA. Asimismo puede determinarse cada parámetro que identifica otros polisacáridos, tales como intermediarios, al producir el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención.

Puede determinarse directamente el peso molecular medio (peso molecular medio en número (Mn) y peso molecular medio en peso (Mw)) utilizando el pululano como estándar, a menos que se indique lo contrario. Alternativamente, puede calcularse el peso molecular medio real del heparán sulfato indirectamente mediante cálculo proporcional basándose en una molécula que presenta un peso molecular medio real conocido (por ejemplo, la enoxaparina sódica). El peso molecular medio del heparán sulfato puede medirse directa o indirectamente, tal como anteriormente, y preferentemente se mide directamente.

El término "ácido hexurónico (HexA)" se utiliza como una expresión inclusiva para ácido p-D-glucurónico (GlcA) y ácido a-L-idurónico (IdoA). La expresión "ácido hexurónico (HexA)", es decir, las expresiones "ácido p-D-glucurónico (GlcA)" y "ácido a-L-idurónico (IdoA)" incluyen todos los posibles derivados según formas de realización del método de la presente invención, a menos que se especifique lo contrario. La expresión "a-D-glucosamina" incluye potencialmente todos los derivados según formas de realización del método de la presente invención, a menos que se especifique lo contrario. En el residuo HexA que presenta el doble enlace entre C-4 y C-5, el residuo IdoA y el residuo GlcA no se distinguen. De esta manera, al calcular cada parámetro que identifica el polisacárido, tal como el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención, se hace referencia a dicho residuo HexA como uno correspondiente al residuo HexA, aunque no correspondiente ni al residuo IdoA ni al residuo GlcA, a menos que se especifique lo contrario.

<1> Heparosano

En el método de la presente invención se utiliza heparosano como una materia prima. El heparosano es un polisacárido compuesto de estructuras repetitivas de un disacárido compuesto de un residuo de ácido glucurónico (GlcA) y un residuo de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) [^4)-p-D-GlcA-(1^4)-a-D-GlcNAc-(1^-]. El heparosano puede producirse mediante, por ejemplo, un método de fermentación utilizando una bacteria con capacidad para producir heparosano (asimismo denominado bacteria productora de heparosano) (documento WO2015/050184).

En la presente invención, la expresión "bacteria con la capacidad de producir heparosano (bacteria productora de heparosano)" se refiere a una bacteria que presenta la capacidad de producir heparosano al cultivarla en un medio y de acumular heparosano en el medio en la medida en que puede recuperarse ese heparosano. La bacteria con la capacidad de producir heparosano puede ser una bacteria que puede acumular heparosano, por ejemplo en una cantidad de 50 mg/l o más, 100 mg/l o más, 200 mg/l o más o 300 mg/l o más en el medio.

El tipo de bacteria no se encuentra particularmente limitado. La bacteria incluye bacterias pertenecientes al género Escherichia. Las bacterias pertenecientes al género Escherichia no se encuentran particularmente limitadas y entre ellas se incluyen bacterias clasificadas en el género Escherichia según la clasificación conocida por expertos en microbiología. Entre las bacterias pertenecientes al género Escherichia se incluyen, por ejemplo, las indicadas en la literatura por Neidhardt et al. (Backmann, B. J., Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, páginas 2460 a 2488, 1996. tabla 1. En: F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C). Entre los ejemplos de las bacterias pertenecientes al género Escherichia se incluyen Escherichia coli. Entre los ejemplos de Escherichia coli se incluyen la cepa de Escherichia coli K-12, tal como la cepa W3110 (ATCC n° 27325) y la cepa MG1655 (ATCC n° 47076); la cepa de Escherichia coli K5 (ATCC n° 23506); la cepa de Escherichia coli B, tal como BL21 (DE3) y las cepas derivadas de las mismas.

Dichas cepas bacterianas pueden adquirirse de la American Type Culture Collection (dirección: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P O. Box 1549, Manassas, vA 20108, Estados Unidos de América). Es decir, se ha proporcionado un número de acceso a cada cepa bacteriana, y la cepa bacteriana puede adquirirse mediante la utilización de dicho número de acceso (ver http://www.atcc.org/). El número de acceso correspondiente a cada cepa bacteriana se ha listado en un catálogo de la American Type Culture Collection. La cepa BL21 (DE3) se encuentra disponible de, por ejemplo, Life Technologies (número de producto C6000-03).

La bacteria con capacidad de producir heparosano puede ser una que presenta inherentemente la capacidad de producir heparosano o una modificada para presentar la capacidad de producir heparosano. La bacteria que presenta inherentemente la capacidad de producir heparosano incluye la cepa de Escherichia coli K5 (ATCC n° 23506). La bacteria que presenta la capacidad de producir heparosa puede obtenerse proporcionando la capacidad de producir heparosano a la bacteria, tal como anteriormente. La bacteria que presenta inherentemente la capacidad de producir heparosano puede modificarse para incrementar la capacidad de producir heparosano, y utilizarse.

La capacidad de producir heparosano puede proporcionarse mediante la introducción de un gen codificante de una proteína que participa en la producción de heparosano. La proteína que participa en la producción de heparosano incluye glucosiltransferasa y una proteína portadora de flujo de salida de heparosano. En la presente invención, puede introducirse un gen o pueden introducirse dos o más genes. La introducción del gen puede llevarse a cabo, como es el caso, con una técnica de incremento del número de copia de un gen indicado posteriormente.

El término "glucosiltransferasa" utilizado en la presente memoria se refiere a una proteína que presenta una actividad de catálisis de una reacción en la que se añade N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) y/o ácido glucurónico (GlcA) a un extremo no reducido de una cadena sacárida para extender una cadena de heparosano. Dicha actividad asimismo se denomina "actividad de glucosiltransferasa". Un gen codificante de glucosiltransferasa incluye un gen kfiA, un gen kfiC y un gen pmHSI.

El gen kfiA y el gen kfiC incluyen el gen kfiA y el gen kfiC en la cepa de Escherichia coli K5. Una proteína KfiA codificada por el gen kfiA en la cepa de Escherichia coli K5 añade GlcNAc al extremo no reducido de la cadena sacárida utilizando UDP-GlcNAc como sustrato. Una proteína KfiC codificada por el gen kfiC en la cepa de Escherichia coli K5 añade GlcNAc al extremo no reducido de la cadena sacárida utilizando UDP-GlcA como sustrato. El gen kfiA y el gen kfiC en la cepa de Escherichia coli K5 junto con los genes kfiB y kfiD constituyen el operón KfiABCD (asimismo denominado Región 2). Una secuencia de nucleótidos de una región que incluye el operón KfiABCD en la cepa de Escherichia coli K5 se muestra en la SEC ID n° 1. En la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 1, los genes kfiA, kfiB, kfiC y kfiD corresponden a una secuencia en las posiciones 445 a 1164, una secuencia en las posiciones 1593 a 3284, una secuencia en las posiciones 4576 a 6138, y una secuencia en las posiciones 6180 a 7358, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas KfiA, KfiB, KfiC y KfiD se muestra en las SEC ID n° 2 a n° 5.

El gen pmHS1 incluye el gen pmHS1 en la cepa de Pasteurella multocida tipo D. La proteína PmHS1 codificada por el gen pmHS1 en la cepa de Pasteurella multocida tipo D añade alternativamente GlcNAc y GlcA al extremo no reducido de la cadena sacárida utilizando tanto UDP-GlcNAc como UDP-GlcA a modo de sustratos.

La expresión "proteína portadora de flujo de salida de heparosano" a la que se hace referencia en la presente memoria se refiere a una proteína que presenta una actividad de transporte de la cadena de heparosano hacia fuera de la célula a través de la membrana celular. Dicha actividad asimismo se denominada "actividad de flujo de salida de heparosano". Entre los genes codificantes de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano se incluyen los genes kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsT. Entre los genes kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsT se incluyen los genes kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsT en la cepa de Escherichia coli K5 y en la cepa de Escherichia coli B. Los genes KpsC, kpsD, kpsE y KpsS en dichas cepas junto con los genes kpsF y kpsU constituyen el operón kpsFEDUCS (asimismo denominado Región 1). Además, los genes kpsM y kpsT constituyen un operón kpsMT (asimismo denominado Región 3).

Puede seleccionarse apropiadamente un gen según el tipo de bacteria que se utilizará. Es decir, la capacidad de producir heparosano puede ser proporcionada por una bacteria mediante modificación de la bacteria para que presente ambos genes codificantes de glucosiltransferasa y el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano. Por ejemplo, la cepa de Escherichia coli B presenta el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano, pero no presenta el gen codificante de glucosiltransferasa. De esta manera, la capacidad de producir heparosano puede ser proporcionada a la cepa de Escherichia coli B mediante la introducción del gen codificante de glucosiltransferasa. Además, por ejemplo, la cepa de Escherichia coli K-12 no presenta ni el gen codificante de glucosiltransferasa ni el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano. De esta manera, la capacidad de producir heparosano puede ser proporcionada por una cepa de Escherichia coli K-12 mediante la introducción de tanto el gen codificante de glucosiltransferasa como el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano.

Es decir, entre los ejemplos de bacterias del género Escherichia con capacidad de producir heparosano se incluyen la cepa de Escherichia coli K5; cepas obtenidas mediante la introducción del gen kfiA y el gen kfiC derivados de la cepa de Escherichia coli K5 en la cepa de Escherichia coli B, tal como BL21 (DE3); cepas obtenidas mediante la introducción del gen kifA y el gen kfiC de la cepa de Escherichia coli K5 y los genes kpsC, kpsD, kpsE, kpsM, kpsS y kpsTderivados de la cepa de Escherichia coli K5 o la cepa de Escherichia coli B en la cepa de Escherichia coli K-12, tal como la cepa W3110 y la cepa MG1655, y cepas derivadas de las mismas. Entre los ejemplos de la cepa obtenida mediante la introducción del gen kfiA y el gen kfiC de la cepa de Escherichia coli K5 en la cepa de Escherichia coli B se incluyen específicamente Escherichia coli BL21 (DE3)/pVK9-kfiABCD (documento WO2015/050184).

Además, la bacteria con capacidad de producir heparosano puede modificarse de manera que se potencie la expresión del gen que posee originalmente la bacteria de entre los genes codificantes de la proteína que participa en la producción de heparosano. Es decir, por ejemplo la cepa de Escherichia coli K5 puede modificarse de manera que se potencie la expresión de uno o más genes codificantes de la proteína que participa en la producción de heparosano. Además, por ejemplo la cepa de Escherichia coli B puede modificarse de manera que se potencie la expresión de uno o más genes codificantes de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano.

Además, con la condición de que la capacidad de producir heparosano no resulte perjudicada, pueden realizarse otras modificaciones en la bacteria con capacidad para producir heparosano. Por ejemplo, la bacteria con capacidad de producir heparosano puede modificarse de manera que se potencie la expresión de uno o más genes seleccionados de entre los genes kfiB, kfiD, kpsF y kpsU. Es decir, por ejemplo, en el caso de que se introduzca el gen codificante de glucosiltransferasa, puede introducirse colectivamente la Región 2, y en el caso de que se introduzca el gen codificante de glucosiltransferasa y el gen codificante de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano, pueden introducirse colectivamente las Regiones 1 a 3. El gen kfiB y el gen kfiD incluyen el gen kfiB y el gen kfiD en la cepa de Escherichia coli K5. El gen kpsF y el gen kpsU incluyen el gen kpsF y el gen kpsU en la cepa de Escherichia coli K5 y la cepa de Escherichia coli B.

La bacteria con capacidad de producir heparosano puede modificarse de manera que se potencie la expresión de uno o más genes seleccionados de entre rbsR, rbsK, rbsB, hsrA, glgB, lgX, micF, rcsD, rcsB, ybiX, ybil, ybiJ, ybiC, ybiB, rfaH, nusG, pcoR, pcoS, pcoE, yhcN, yhcO, aaeB, aaeA, aaeX, g1455, alpA, g1453, yrbA, mlaB, mlaC, mlaD, mlaE, mlaF, yrbG, norW, ybjI, ybjJ, ybjK, rybB, yjjY, yjtD, thrL, thrA, thrB, fruA, psuK, ytfT, yjfF, fbp, yagU, paoA, paoB, gsiC, gsiD, yliE, irp2, irp1, bhsA, ycfS, lepB, rnc, era, dapA, gcvR, bcp, hyfA, rpoE, nadB, yfiC, srmB, g1414, g1413, nuoE, nuoF, nuoG, glmZ, hemY, hemX, hemD, rlmL, artQ, artM, artJ, rlmC, ybjO, yejO, yejM, yejL, rpoS, ygbN, ygbM, ygbL, g3798, g3797, g3796, g3795, g3794, g3793, g3792, ryjA, soxR, soxS, yjcC, yjcB, efeU, efeO, slyA, hns, pgm, galF, ugd, glmU, glmS, glmM y rcsA (documento WO2015/050184, Journal of Technical Disclosure n° 2015-501775). Entre dichos genes se incluyen genes en Escherichia coli, tales como la cepa de Escherichia coli K-12 MG1655, la cepa BL21 (DE3) y la cepa K5, y los genes en otras diversas bacterias.

La expresión "la expresión de un gen ha sido potenciada" comprende no sólo incrementar la cantidad de expresión de un gen diana en una cepa bacteriana que expresa originalmente el gen diana, sino asimismo expresar el gen diana en una cepa bacteriana que no expresaba originalmente el gen diana. Es decir, "la expresión de un gen ha sido potenciada" comprende, por ejemplo, introducir un gen diana en una cepa bacteriana que no expresaba originalmente el gen diana y expresar el gen diana. La expresión del gen puede potenciarse mediante, por ejemplo, el incremento del número de copia del gen y el incremento de la transcripción y traducción del gen. El número de copia del gen puede incrementarse mediante la introducción de un vector en el que se ha introducido el gen, o mediante la introducción del gen en un cromosoma del huésped. Un gen para la introducción puede obtenerse mediante clonación a partir de un organismo que presenta el gen o mediante síntesis química. El gen obtenido puede utilizarse en su estado original o con modificaciones apropiadas. La transcripción y traducción de un gen pueden incrementarse mediante modificación de la secuencia reguladora de la expresión del gen, tal como promotores y secuencias SD.

Las secuencias de nucleótidos de los genes utilizados para la modificación de bacterias, tal como proporcionar la capacidad de producir heparosano y secuencias de aminoácidos codificadas por dichos genes pueden obtenerse de bases de datos públicas, tales como NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y referencias tales como el documento WO2015/050184 y Journal of Technical Disclosure n° 2015-501775.

Los genes utilizados para la modificación de bacterias, tal como proporcionar la capacidad de producir heparosano, no se encuentran limitados a los genes ejemplificados anteriormente y los genes que presentan una secuencia de nucleótidos conocida, y pueden ser variantes de los mismos con la condición de que el gen codifique una proteína que mantenga la función original. La variante incluye homólogos y genes modificados artificialmente de los genes conocidos. La expresión "mantener la función original" se refiere a una variante de una proteína que presenta una actividad de glucosiltransferasa en el caso de la función de la glucosiltransferasa y una variante de una proteína que presenta una actividad de portador de flujo de salida de heparosano en el caso de la función de la proteína portadora de flujo de salida de heparosano. Por ejemplo, los genes utilizados para la modificación de bacterias, tales como proporcionar la capacidad de producir heparosano, pueden ser genes codificantes de proteínas que presentan una secuencia de aminoácidos que presenta una o varias (por ejemplo, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, preferentemente 1 a 20, más preferentemente 1 a 10, todavía más preferentemente 1 a 5, particularmente preferentemente 1 a 3) sustituciones, deleciones, inserciones o adiciones de aminoácidos en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos de una proteína conocida. Por ejemplo, los genes utilizados para la modificación de bacterias, tal como proporcionar la capacidad de producir heparosano, pueden ser genes codificantes de proteínas que presentan una identidad de, por ejemplo, 50% o superior, 65% o superior, 80% o superior, preferentemente de 90% o superior, más preferentemente de 95% o superior, todavía más preferentemente de 97% o superior, y particularmente preferentemente de 99% o superior, respecto a la secuencia de aminoácidos de la proteína conocida. La descripción de dichas variantes puede aplicarse a otras proteínas, tales como la heparinasa III y los genes codificantes de las mismas.

El heparosano se acumula en el medio mediante el cultivo de una bacteria productora de heparosano. Las condiciones de cultivo para la bacteria productora de heparosano no se encuentran particularmente limitadas con la condición de que se obtenga la cantidad deseada de heparosano. Las condiciones de cultivo de la bacteria productora de heparosa pueden configurarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como la configuración del sistema de expresión y el tipo de huésped para el gen que participa en la producción de heparosano. El cultivo puede llevarse a cabo aeróbicamente, por ejemplo utilizando un medio líquido que contiene diversos ingredientes orgánicos e ingredientes inorgánicos, tales como una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y nutrición de trazas, a una temperatura de entre 30°C y 37°C, durante 16 a 72 horas (documento WO2015/050184).

El heparosano puede someterse a una etapa de N-desacetilación, incluyéndolo en una solución de cultivo, o puede recuperarse a partir de la solución de cultivo seguido de la etapa de N-desacetilación. El procedimiento de recuperación del heparosano a partir de la solución de cultivo no se encuentra particularmente limitado. El procedimiento para recuperar el heparosano incluye técnicas conocidas utilizadas para la separación y purificación de un compuesto, tal como un método de tratamiento con una membrana y un método de precipitación. Por ejemplo, el heparosano en el sobrenadante de cultivo puede precipitarse y recuperarse mediante separación del sobrenadante a partir de la solución de cultivo, añadiendo después un solvente orgánico miscible en agua, tal como etanol o metanol (documento WO2015/050184). Una cantidad del solvente orgánico para la adición puede ser de 2.5 a 3.5 veces la cantidad del sobrenadante. El heparosano puede someterse apropiadamente a tratamiento, tal como purificación, dilución, concentración, secado y disolución, seguido de someterlo a la etapa de N-desacetilación. La purificación puede llevarse a cabo en un grado deseado. Dichos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.

<2> Etapa de N-desacetilación

La etapa de N-desacetilación es una etapa en la que el heparosano se N-desacetila parcialmente para producir un heparosano N-desacetilado, en el que la tasa residual de grupos N-acetilados es de 1% a 33%. El heparosano parcialmente N-desacetilado se produce mediante una etapa de N-desacetilación. Un producto de la etapa de N-desacetilación (heparosano parcialmente N-desacetilado) asimismo se denomina "heparosano N-desacetilado". La expresión "el heparosano se N-desacetila parcialmente" se refiere a heparosano N-desacetilado de manera que se mantiene una parte de los grupos N-acetilos del heparosano. Al permitir que una parte de los grupos N-acetilo del heparosano se conserve, un sitio de un residuo de glucosamina con el grupo N-acetilo puede escindirse preferentemente en una etapa de rebaja del peso molecular, de manera que puede producirse eficientemente un heparán sulfato que presenta el peso molecular medio deseado. El grado de la N-desacetilación se lleva a cabo de manera que la tasa residual de grupo N-acetilo sea de 1% a 33%, por ejemplo de 1.5% a 33%, de 3% a 33%, de 5% a 33%, de 7% a 33%, de 9% a 33%, o de 11% a 33%, de 30% o menos, de 25% o menos, de 20% o menos, o de 17% o menos, o una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa residual del grupo N-acetilo puede ser, por ejemplo de 7% a 33%, de 7% a 30% o de 11% a 17%. Por ejemplo, la tasa residual del grupo N-acetilo de 7% a 30% corresponde aproximadamente a un estado en el que los grupos N-acetilo se encuentran presentes a una tasa de un grupo N-acetilo por cada 6 a 28 residuos sacáridos (uno por cada 3 a 14 unidades como unidad disacárida). Además, por ejemplo, la tasa residual del grupo N-acetilo de 11% a 17% corresponde aproximadamente a un estado en el que los grupos N-acetilo se encuentran presentes a una tasa de un grupo N-acetilo por cada 12 a 18 residuos sacáridos (uno por cada 6 a 9 unidades como unidad disacárida). Puede confirmarse un grado de N-desacetilación (es decir, tasa residual de grupos N-acetilo), por ejemplo mediante análisis de disacáridos. Es decir, la tasa residual de grupos N-acetilo puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacárido que presenta el grupo N-acetilado respecto a la cantidad total de unidades disacáridas en el caso de que el polisacárido se someta al análisis de disacáridos.

Los grupos N-acetilo residuales pueden eliminarse apropiadamente después de la etapa de obtención de un bajo peso molecular. Por ejemplo, puede llevarse a cabo una N-desacetilación adicional, o puede llevarse a cabo una N-desacetilación y N-sulfatación adicionales en cualquier tiempo después de la etapa de obtención de un bajo peso molecular. Es decir, el grupo N-acetilado puede mantenerse o no en el polisacárido finalmente obtenido del método de la presente invención. La tasa residual de grupos N-acetilados en el heparán sulfato de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 0% o más, de 1% o más, de 1.5% o más, de 3% o más, de 5% o más, de 7% o más, de 9% o más o de 11% o más, de 33% o menos, de 30% o menos, de 25% o menos, de 20% o menos o de 17% o menos, o una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa residual del grupo N-acetilado en el polisacárido del método de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 0% a 33%, de 1% a 33%, de 7% a 33%, de 7% a 30%, o de 11% a 17%.

El procedimiento para llevar a cabo la etapa de N-desacetilación no se encuentra particularmente limitado con la condición de que se obtenga el grado deseado de N-desacetilación. La etapa de N-desacetilación puede llevarse a cabo químicamente utilizando un agente de desacetilación. Entre los ejemplos de agente de N-desacetilación se incluyen sustancias básicas, tales como sales de metal alcalino, sales de metal alcalino-térreo e hidrazina. Entre los ejemplos de sales de metal alcalino se incluyen hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido de litio, hidróxido de rubidio e hidróxido de cesio. Entre los ejemplos de sales de metal alcalino-térreo se incluyen hidróxido de berilio, hidróxido de magnesio, hidróxido de calcio, hidróxido de estroncio e hidróxido de bario.

Como condiciones para la N-desacetilación utilizando hidróxido sódico, por ejemplo, puede hacerse referencia a condiciones de las que se informa anteriormente (Kuberan B. et al., "Chemoenzymatic Synthesis of Classical and Non-classical Anticoagulant Heparan Sulfate Polysaccharides." J. Biol. Chem., 278 (52): 52613-52621, 2003 y el documento US2011281820A1). Es decir, la N-desacetilación puede llevarse a cabo mediante disolución de heparosano en una solución acuosa de sodio hidrógeno y calentamiento de la misma. Puede configurarse apropiadamente la concentración, la temperatura de reacción y el periodo de tiempo de reacción de cada componente en su sistema de reacción de manera que se obtenga el grado deseado de N-desacetilación. La concentración de heparosano puede ser, por ejemplo, de entre 0.05% (p/v) y 50% (p/v). La concentración de hidróxido sódico puede ser, por ejemplo, de entre 1 M y 5 M. La temperatura de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 40°C y 80°C. El periodo de tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 5 minutos y 30 horas.

Como condiciones para la N-desacetilación con hidrazina, por ejemplo, puede hacerse referencia a las condiciones de las que anteriormente se informa ([1] Glycobiology, 10:159-171, 2000, [2] Carbohydrate Research, 290:87-96, 1996, [3] Biochem. J. 217:187-197, 1984). Además, entre las condiciones de N-desacetilación utilizando hidrazina se incluyen específicamente, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. Es decir, la N-acetilación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante disolución de heparosano en una solución acuosa de hidrazina que contiene ácido sulfúrico o sulfato de hidrazina, sustituyendo la fase gaseosa por un gas inerte, tal como nitrógeno, y sometiéndola a calentamiento. La hidrazina incluye anhidrato de hidrazina y monohidrato de hidrazina. Por ejemplo, el monohidrato de hidrazina puede utilizarse directamente o mediante dilución apropiada en forma de una solución acuosa de hidrazina. Tras el calentamiento, la reacción puede detenerse con enfriamiento con hielo. A continuación, el extremo de la cadena sacárida puede reducirse con yodo. Puede configurarse apropiadamente la concentración, la temperatura de reacción y el periodo de tiempo de reacción de cada componente en su sistema de reacción de manera que se obtenga el grado deseado de N-desacetilación. La concentración de heparosano puede ser, por ejemplo, de entre 0.05% (p/v) y 50% (p/v). La concentración de hidrazina puede ser, por ejemplo, de entre 10% (p/v) y 70% (p/v). La concentración de ácido sulfúrico o sulfato de hidrazina puede ser, por ejemplo, de entre 0.01 M y 0.1 M. La temperatura de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 60°C y 118°C. El periodo de tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 5 minutos y 20 horas. Específicamente, por ejemplo, en el caso de que la N-desacetilación se lleve a cabo bajo las condiciones indicadas en los ejemplos, el periodo de tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 4 y 5 horas.

El heparosano N-desacetilado se produce llevando a cabo la N-desacetilación de esta manera. El heparosano N-desacetilado puede someterse a la etapa de obtención de un bajo peso molecular, mientras se encuentra contenido en la solución de reacción en la etapa de N-desacetilación o puede recuperarse a partir de la solución de reacción, seguido de una etapa de obtención de un bajo peso molecular. El procedimiento de recuperación del heparosano N-desacetilado a partir de la solución de reacción no se encuentra particularmente limitado. El procedimiento para recuperar el heparosano N-desacetilado incluye técnicas conocidas utilizadas para la separación y purificación de un compuesto, tal como un método de tratamiento con una membrana y un método de precipitación. El heparosano N-desacetilado puede someterse apropiadamente a tratamiento, tal como purificación, neutralización, desalación, dilución, concentración, secado y disolución, seguido de someterlo a la etapa de obtención de un bajo peso molecular. La purificación puede llevarse a cabo en un grado deseado. Dichos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.

<3> Etapa de obtención de bajo peso molecular

La etapa de obtención de bajo peso molecular es una etapa en la que el heparosano N-desacetilado se escinde con heparinasa III para producir moléculas pequeñas. El heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular se produce mediante la etapa de obtención de un bajo peso molecular. Un producto de la etapa de obtención de bajo peso molecular (heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular) asimismo se denomina "heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular". Un grado de obtención de bajo peso molecular no se encuentra particularmente limitado con la condición de que pueda producirse un heparán sulfato con un peso molecular deseado. La etapa de obtención de un bajo peso molecular puede llevarse a cabo por ejemplo de manera que el peso molecular medio de heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular se convierte, por ejemplo, en un peso molecular medio en número (Mn) de entre 1000 y 150000, preferentemente de entre 8000 y 60000 y un peso molecular medio en peso (Mw) de entre 2000 y 300000, preferentemente de entre 10000 y 100000 como valor medido mediante CPG utilizando pululano como estándar.

El grado de obtención de un bajo peso molecular puede confirmarse, por ejemplo, mediante medición de su peso molecular. La medición del peso molecular puede llevarse a cabo mediante un método estándar. Entre los métodos para medir el peso molecular se incluyen la cromatografía de permeación en gel (CPG) y la cromatografía de exclusión por tamaño acuosa (SEC) utilizando un detector de absorbancia de ultravioleta (UV) y de luz visible y un detector de índice de refracción (IR) (método de SEC-IR/UV, según la Farmacopea europea (FE)). Específicamente, entre las condiciones para medir el peso molecular mediante CPG se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. El peso molecular medio en número (Mn) del heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido puede ser, por ejemplo, de entre 1000 y 150000, de entre 3000 y 36000, o de entre 4000 y 26000, o de entre 5000 y 36000, o de entre 12000 y 26000 como valor medido mediante CPG utilizando el pululano como estándar. El peso molecular medio en peso (Mw) del heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido puede ser, por ejemplo, de entre 2000 y 300000, de entre 5000 y 60000, de entre 6000 y 70000, o de entre 9000 y 35000, o puede ser de entre 7000 y 60000, o de entre 17000 y 35000, como valor medido mediante CPG utilizando el pululano como estándar. El peso molecular puede medirse para confirmar el grado de obtención de un bajo peso molecular tras llevar a cabo una parte o todas las etapas de producción de heparán sulfato, tales como la etapa de sulfatación indicada posteriormente. En el caso de que el peso molecular se mida después de llevar a cabo una parte o todas las etapas de producción de heparán sulfato, puede considerarse la variación del peso molecular dependiendo de la etapa llevada a cabo. En el caso de que se mida el peso molecular de un producto después de llevar a cabo una parte o la totalidad de las etapas de producción de heparán sulfato, el peso molecular medio en número (Mn) del producto puede ser de entre 1000 y 150000, de entre 2000 y 100000, de entre 4000 y 80000, de entre 7000 y 42000 o de entre 15000 y 30000, y el peso molecular medio en peso (Mw) del producto puede ser de entre 2000 y 300000, de entre 5000 y 150000, de entre 5000 y 100000, de entre 8000 y 70000, de entre 8000 y 41000, o de entre 21000 y 41000 como valores medidos mediante CPG utilizando pululano como estándar. El valor de peso molecular medido mediante un método de SEC-IR/UV según la FE corresponde al valor obtenido mediante división del valor de peso molecular medido mediante CPG en términos de pululano y el factor de conversión 3.75, que es un valor obtenido dividiendo el valor 16215 de enoxaparina sódica medido mediante CPG por el valor 4325 de enoxaparina sódica medido mediante el método de SEC-IR/UV según la FE.

"Heparinasa III" se refiere a un enzima (típicamente EC 4.2.2.8) que escinde un sitio de residuo glucosamina N-sulfatado o N-desacetilado de un glucosaminoglicano, tal como heparosano. La heparinasa III para la utilización en la presente invención no se encuentra particularmente limitada con la condición de que pueda escindir preferentemente un sitio de un residuo glucosamina que presenta un grupo N-acetilo en el heparosano N-desacetilado. La expresión "que escinde preferentemente el sitio del residuo de glucosamina que presenta el grupo N-acetilo" se refiere a la escisión del sitio del residuo de glucosamina que presenta el grupo N-acetilo más preferentemente que el sitio del residuo de glucosamina que no presenta grupo N-acetilo. La expresión "que escinde preferentemente el sitio del residuo de glucosamina que presenta el grupo N-acetilo" puede significar que el sitio del residuo de glucosamina que presenta el grupo N-acetilo se escinde, pero el sitio del residuo de glucosamina que no presenta ningún grupo N-acetilo no se escinde sustancialmente. La expresión "que escinde el sitio del residuo de glucosamina" se refiere a la escisión del enlace a-1,4-glucósido entre el residuo de glucosamina y un residuo de ácido glucurónico (GlcA) cadena abajo del mismo (en un lado del extremo reducido).

El origen de la heparinasa III no se encuentra particularmente limitado, y la heparinasa puede derivar de cualquiera de los microorganismos, animales y plantas. Como heparinasa III pueden utilizarse variantes tales como homólogos y enzimas artificialmente modificados de la heparinasa III conocida. Específicamente, la heparinasa III incluye la heparinasa III bacteriana derivada de Flavobacterium heparinum, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides eggerthii, y similares. Una secuencia de nucleótidos de un gen hepC codificante de la heparinasa III en Flavobacterium heparinum ATCC 13125 y una secuencia de aminoácidos de la heparinasa III (HepC) se muestran en las SEC ID n° 16 y n° 17, respectivamente.

La heparinasa III puede producirse permitiendo que un huésped que presenta un gen codificante de heparinasa III (gen de heparinasa III) exprese el gen. El huésped que presenta el gen de heparinasa III asimismo se denomina huésped que presenta heparinasa III. El huésped que presenta el gen de heparinasa III puede ser uno que inherentemente presenta el gen de heparinasa III o uno modificado para presentar el gen de heparinasa III. El huésped que presenta inherentemente el gen de heparinasa III incluye las bacterias anteriormente indicadas a partir de las que se deriva la heparinasa III. El huésped modificado para presentar el gen de heparinasa III incluye un huésped en el que se ha introducido el gen de heparinasa III. El huésped en el que se introduce el gen de heparinasa III no se encuentra particularmente limitado con la condición de que pueda expresar heparinasa III funcional. El huésped incluye bacterias, actinomicetos, levaduras, hongos, células vegetales, células de insecto y células animales. Entre las bacterianas se incluyen bacterias Enterobacteriaceae y el grupo de bacterias corineformes. Entre las bacterias Enterobacteriaceae se incluyen las bacterias del género Escherichia, tales como Escherichia coli. El grupo de bacterias corineformes incluye las bacterias del género Corynebacterium, tales como Corynebacterium glutamicum. El huésped que presenta inherentemente el gen de la heparinasa III puede modificarse para potenciar la expresión del gen de heparinasa III y utilizarse. El gen de la heparinasa III puede expresarse y obtenerse un cultivo que contiene heparinasa III mediante el cultivo del huésped que presenta el gen de heparinasa III. Las condiciones del cultivo del huésped pueden configurarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como la constitución de un sistema de expresión del gen de heparinasa III y un tipo de huésped.

La heparinasa III asimismo puede producirse mediante expresión del gen de heparinasa III en un sistema de síntesis de proteínas libre de células.

Además, puede utilizarse un producto disponible comercialmente como heparinasa III.

La heparinasa III contenida en la solución de cultivo y similar puede utilizarse directamente o puede utilizarse la heparinasas III después de recuperarla de la solución de cultivo y similar. Es decir, puede utilizarse heparinasa III purificada (enzima purificado), o puede utilizarse cualquier fracción que contenga heparinasa III como heparinasa III. La recuperación de la heparinasa III puede llevarse a cabo mediante una técnica conocida de separación y purificación de proteínas. La heparinasa III puede purificarse en un grado deseado. La heparinasa III puede utilizarse en un estado libre o en un estado en el que el enzima se encuentra inmovilizado en una fase sólida, tal como una resina. La fracción que contiene heparinasa III no se encuentra particularmente limitada con la condición de que la heparinasa III se encuentre contenido para poder actuar sobre el heparosano N-desacetilado. La fracción que contiene heparinasa III incluye un cultivo de un huésped que presenta el gen de heparinasa III, una célula microbiana recogida del cultivo (célula microbiana en cultivo), un producto fragmentado de la célula microbiana, un producto lisado de la célula microbiana, un producto extraído de la célula microbiana (solución de extracto libre de células), una célula microbiana tratada, tal como una célula microbiana inmovilizada obtenida mediante inmovilización de la célula microbiana en un portador, tal como acrilamida o carragenano, un sobrenadante de cultivo recogido del cultivo, y un producto parcialmente purificado a partir del mismo (producto purificado en bruto). Cada una de dichas fracciones puede utilizarse sola o en combinación con heparinasa III purificada.

La etapa de obtención de un bajo peso molecular puede llevarse a cabo permitiendo que la heparinasa III actúe sobre el heparosano N-desacetilado. Específicamente, dejar que la heparinasa III actúe sobre el heparosano N-desacetilado puede conseguirse permitiendo que la heparinasa III y el heparosano N-desacetilado coexistan en una solución de reacción. Es decir, la etapa de obtención de un bajo peso molecular puede llevarse a cabo en una solución de reacción apropiada. La etapa de obtención de un bajo peso molecular puede llevarse a cabo mediante un sistema por lotes o en un sistema de columna. En el sistema por lotes, por ejemplo, la etapa de obtención de un bajo peso molecular puede llevarse a cabo mediante la mezcla de heparinasa III y heparosano N-desacetilado en la solución de reacción en un recipiente de reacción. La etapa de obtención de bajo peso molecular puede llevarse a cabo con un periodo de reposo o llevarse a cabo bajo mezcla o agitación. En el sistema de columna, por ejemplo, la etapa de obtención de un bajo peso molecular puede llevarse a cabo pasando una solución de reacción que contiene heparosano N-desacetilado por una columna empaquetada con células microbianas inmovilizadas o un enzima inmovilizado. La solución de reacción incluye un medio acuoso (solvente acuoso), tal como agua y tampones acuosos.

La solución de reacción puede contener, en caso necesario, un componente diferente del heparosano N-desacetilado además del heparosano N-desacetilado. Entre los componentes aparte del heparosano N-desacetilado se incluyen iones metálicos y agentes tamponadores del pH. Puede configurarse apropiadamente el tipo y concentración de los componentes contenidos en la solución de reacción según diversas condiciones, tales como la naturaleza de la heparinasa III que se utilizará.

Las condiciones (pH de la solución de reacción, temperatura de reacción, periodo de tiempo de reacción, concentración de cada componente y similares) no se encuentran particularmente limitadas con la condición de que se obtenga el grado deseado de obtención de bajo peso molecular. Es decir, las condiciones de reacción pueden configurarse apropiadamente de manera que se obtenga el grado deseado de reducción del peso molecular. Específicamente, entre las condiciones de reacción se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. La concentración de heparosano N-desacetilado en la solución de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 0.05% (p/v) y 50% (p/v). La concentración de heparinasa III en la solución de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 6.3 UI/l y 6.3*104 UI/l o de entre 6.3*101 UI/l y 6.3*103 UI/l. El valor del pH de la solución de reacción típicamente puede ser, por ejemplo, de entre 6.0 y 10.0, preferentemente de entre 6.5 y 9.0. La temperatura de reacción puede ser típicamente, por ejemplo, de entre 15°C y 50°C, preferentemente de entre 15°C y 45°C, más preferentemente de entre 20°C y 40°C. El periodo de tiempo de reacción puede ser típicamente, por ejemplo, de entre 5 minutos y 20 horas, preferentemente de entre 10 minutos y 10 horas. Específicamente, por ejemplo, en el caso de que la N-desacetilación se lleve a cabo bajo las condiciones indicadas en los ejemplos, el periodo de tiempo de reacción puede ser, por ejemplo, de entre 5 y 10 horas. En el caso del sistema de columna, una velocidad de paso de líquido de la solución de reacción puede ser, por ejemplo, una velocidad para que el periodo de tiempo de reacción se encuentre dentro del periodo de tiempo de reacción ejemplificado anteriormente.

La actividad de la heparinasa III puede medirse, por ejemplo, basándose en la producción de un ácido hexurónico insaturado de una manera dependiente del enzima y un sustrato en una reacción enzimática llevada a cabo a pH 7.0 y 37°C utilizando heparosano como sustrato. La producción del ácido hexurónico insaturado puede medirse como un incremento de la absorbancia a 232 nm. La cantidad del enzima que produce 1 pmol por minuto de ácido hexurónico insaturado se define como una unidad internacional (UI).

La heparinasa III, el heparosano N-desacetilado y los demás componentes pueden suministrarse adicionalmente solos o en cualquier combinación a la solución de reacción en un procedimiento de la etapa de obtención de bajo peso molecular. Dichos componentes pueden suministrarse una vez o múltiples veces, o pueden suministrarse continuamente.

Además, las condiciones de reacción pueden ser uniformes desde el inicio hasta el final de la etapa de obtención de bajo peso molecular o pueden modificarse durante el procedimiento de la etapa de obtención de bajo peso molecular. La expresión "las condiciones de reacción se modifican durante el procedimiento de la etapa de obtención de bajo peso molecular" incluye no sólo que las condiciones de reacción se modifican temporalmente, sino asimismo que las condiciones de reacción se modifican espacialmente. La expresión "las condiciones de reacción se modifican espacialmente" se refiere, por ejemplo, a que las condiciones de reacción, tales como la temperatura de reacción y la concentración de enzima y similares, son diferentes según la posición en el camino de flujo al llevar a cabo la etapa de obtención de bajo peso molecular en el sistema de columna.

El heparosano N-desacetilado de bajo peso molecular se produce llevan a cabo la etapa de obtención de un bajo peso molecular de esta manera. El heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido en la solución de reacción de la etapa de obtención de bajo peso molecular puede someterse directamente a una etapa de producción de heparán sulfato o puede recuperarse a partir de la solución de reacción y después someterse a la etapa de producción de heparán sulfato. El procedimiento de recuperación del heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido no se encuentra particularmente limitado. El procedimiento para recuperar el heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido incluye técnicas conocidas utilizadas para la separación y purificación de un compuesto, tal como el método de tratamiento con una membrana y el método de precipitación. El heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido puede someterse apropiadamente a tratamientos, tales como purificación, dilución, concentración, secado y disolución, y después someterlo a la etapa de producción de heparán sulfato. La purificación puede llevarse a cabo en un grado deseado. Dichos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.

<4> Etapa de producción de heparán sulfato

La etapa de producción de heparán sulfato es una etapa de producción del polisacárido de la presente invención a partir de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido. La etapa de producción de heparán sulfato puede comprender una o más, por ejemplo todas, las etapas seleccionadas de entre las etapas de N-sulfatación, epimerización en C5, 2-O-sulfatación, 3-O-sulfatación de residuos de GlcN, y 6-O-sulfatación del heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido. Los tipos de etapa incluidos en la etapa de producción de heparán sulfato no se encuentran particularmente limitados. Es decir, los tipos de etapa incluidos en la etapa de producción de heparán sulfato pueden configurarse apropiadamente según la estructura del polisacárido deseada. La etapa de producción de heparán sulfato puede comprender, por ejemplo, por lo menos la etapa de sulfatación (N-sulfatación, 3-O-sulfatación de residuos de GlcN o 6-O-sulfatación).

El orden de realización de las etapas respectivas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato no se encuentra particularmente limitado. El orden de realización de las etapas respectivas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato pueden configurarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como el procedimiento para la realización de las etapas respectivas y la especificidad de sustrato de los enzimas utilizados en las etapas respectivas. Cada una de las etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato puede llevarse a cabo por separado o no. Es decir, una parte o todas las etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato pueden llevarse a cabo simultáneamente en una parte o todo el periodo de tiempo.

La etapa de producción de heparán sulfato puede llevarse a cabo en el orden de las etapas C1 y C3 a continuación.

(C1) N-sulfatación

(C3) 3-O-sulfatación de residuos de GlcN y 6-O-sulfatación.

La etapa de producción de heparán sulfato puede llevarse a cabo en el orden de las etapas C1, C2 y C3 a continuación.

(C1) N-sulfatación

(C2) epimerización en C5 y 2-O-sulfatación

(C3) 3-O-sulfatación de residuos de GlcN y 6-O-sulfatación.

La etapa C2 puede llevarse a cabo en el orden de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación, o puede llevarse a cabo en el orden de 2-O-sulfatación y epimerización en C5. En la etapa C2, la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación pueden llevarse a cabo simultáneamente en una parte o todo el periodo de tiempo de reacción.

La etapa C3 puede llevarse a cabo en el orden de 3-O-sulfatación de residuos de GlcN y 6-O-sulfatación, o puede llevarse a cabo en el orden de 6-O-sulfatación y 3-O-sulfatación de residuos de GlcN.

A continuación en la presente memoria, a menos que se especifique lo contrario, se explica cada etapa sobre la premisa de que la etapa de producción de heparán sulfato se lleva a cabo en el orden de N-sulfatación, epimerización en C5, 2-O-sulfatación, 3-O-sulfatación de residuos de GlcN y 6-O-sulfatación. En el caso de que el tipo de etapas incluidas en la etapa de producción de heparán sulfato y el orden de realización de las etapas respectivas sean diferentes de lo anteriormente indicado, la explicación puede leerse apropiadamente dependiendo del tipo de etapa seleccionada y el orden configurado de realización de las etapas.

La N-sulfatación es una etapa de sulfatación de un grupo amino en el heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido. La N-sulfatación puede llevarse a cabo químicamente utilizando un reactivo de sulfatación. El reactivo de sulfatación incluye complejo de trióxido de azufre, tal como complejo de trióxido de azufre-piridina (PySO3) y complejo de trióxido de azufre-trimetilamina (TMASO3). Las condiciones de reacción para la N-sulfatación pueden ser apropiadamente configuradas por el experto en la materia. Como condiciones para la N-sulfatación, puede hacerse referencia a condiciones de las que se informa anteriormente (Kuberan B. et al., "Chemoenzymatic Synthesis of Classical and Non-classical Anticoagulant Heparan Sulfate Polysaccharides", J. Biol. Chem., 278 (52): 52613-52621,2003; documento US8227449B2 (24 de julio, 2012). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la N-sulfatación se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. El grado de N-sulfatación no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que se obtenga un heparán sulfato que presente la naturaleza deseada. La N-sulfatación puede llevarse a cabo, por ejemplo, para que la tasa de N-sulfatación del polisacárido se encuentre dentro del intervalo siguiente. La tasa de N-sulfatación del polisacárido puede ser, por ejemplo, de 60% o superior, de 70% o superior, o de 80% o superior; puede ser de 100% o inferior, de 95% o inferior, o de 90% o inferior, o puede ser una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa de N-sulfatación del polisacárido puede ser, por ejemplo, de entre 70% y 100%, o de entre 80% y 95%. Además, la N-sulfatación puede llevarse a cabo, por ejemplo, de manera que 90% o más, 95% o más, 99% o más, o la totalidad de los residuos de glucosamina N-desacetilada se encuentren N-sulfatados. El grado de N-sulfatación (es decir, la tasa de N-sulfatación) puede confirmarse mediante el análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de N-sulfatación puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacáridas que presenta el grupo N-sulfatado respecto a la cantidad total de unidades disacáridas en el caso de que el polisacárido se someta al análisis de disacáridos.

La epimerización en C5 es una etapa de isomerización del residuo de ácido glucurónico (GlcAc) en el producto N-sulfatado a residuo de ácido idurónico (IdoA) La epimerización en C5 puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de C5 epimerasa. La C5 epimerasa no se encuentran particularmente limitada con la condición de que pueda catalizar la isomerización del residuo de ácido glucurónico (GlcA) a residuo de ácido idurónico (IdoA). Además, dependiendo del orden de la epimerización en C5 y las demás etapas, la C5 epimerasa que presenta una adecuada especificidad de sustrato puede seleccionarse y utilizarse. La C5 epimerasa puede derivar de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. Por ejemplo, como C5 epimerasa puede utilizarse la C5 epimerasa humana. Además, como C5 epimerasa pueden utilizarse variantes tales como homólogos y enzimas artificialmente modificados de la C5 epimerasa conocida. La descripción de los métodos de producción y aspectos de utilización para la heparinasa III puede aplicarse a métodos de producción y aspectos de utilización de la C5 epimerasa. Las condiciones de reacción para la C5 epimerización pueden ser apropiadamente configuradas por el experto en la materia. Como condiciones de reacción para la C5 epimerización, puede hacerse referencia a las condiciones de las que anteriormente se informa (Chen J, et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate", J. Biol. Chem. 280(52): 42817-25, 30 de dic., 2005). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la C5 epimerización se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. El grado de la C5 epimerización no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que se obtenga un heparán sulfato (polisacárido de la presente invención) que presente la naturaleza deseada. La C5 epimerización puede llevarse a cabo, por ejemplo, para que la tasa de epimerización del polisacárido se encuentre dentro del intervalo siguiente. La tasa de epimerización en el polisacárido puede ser, por ejemplo, de 0% o más, de 10% o más, de 20% o más, de 30% o más, de 40% o más, o de 50% o más; puede ser de 100% o menos, de 90% o menos, de 80% o menos, de 70% o menos o de 60% o menos, o una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa de epimerización del polisacárido puede ser, por ejemplo, de entre 0% y 70%, de entre 20% y 70% o de entre 30% y 60%. La "tasa de epimerización" a la que se hace referencia en la presente memoria es un porcentaje (proporción molar) de la cantidad de residuos de IdoA respecto a la cantidad total de residuos de HexA. En este caso, el "residuo de HexA" tras el cálculo de la tasa de epimerización se refiere al residuo de IdoA y el residuo de GlcA con la condición de que se excluya el residuo de HexA con un doble enlace entre C4 y C5. El grado de C5 epimerización (es decir, la tasa de epimerización) puede confirmarse mediante análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de epimerización puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacárido que presenta el residuo IdoA respecto a la cantidad total de unidades disacáridas con el residuo de IdoA o el residuo de GlcA en el caso de que el polisacárido se someta al análisis de disacáridos.

La 2-O-sulfatación es una etapa de sulfatación de la posición 2-O en el residuo de IdoA en el producto mediante C5 epimerización. La 2-O-sulfatación puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de un enzima de 2-O-sulfatación (2-OST). 2-OST no se encuentra particularmente limitado con la condición de que pueda catalizar la sulfatación del grupo hidroxi en la posición 2 del residuo de IdoA. 2-OST puede además ser capaz de catalizar la sulfatación del grupo hidroxi en la posición 2 del residuo de GlcA. 2-OST puede ser capaz además de catalizar la sulfatación del grupo hidroxi en la posición 2 del residuo de HexA, en el que el enlace entre C4 y C5 es un doble enlace. Además, 2-OST con una adecuada especificidad de sustrato puede seleccionarse y utilizarse dependiendo del orden de 2-O-sulfatación y las demás etapas. 2-OST puede derivar de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. Por ejemplo, puede el 2-OST puede utilizarse 2-OST de hámster. Además, como 2-OST pueden utilizarse variantes, tales como homólogos y enzimas artificialmente modificados de la 2-OST conocida. La descripción de los métodos de producción y aspectos de utilización de la heparinasa III puede aplicarse a métodos de producción y aspectos de utilización de la 2-OST Las condiciones de reacción para la 2-O-sulfatación pueden ser apropiadamente configuradas por el experto en la materia. Como condiciones de reacción para la 2-O-sulfatación, puede hacerse referencia a condiciones de las que anteriormente se informa (Chen J. et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate", J. Biol. Chem. 280(52): 42817-25, 30 de dic., 2005). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la 2-O-sulfatación se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. El grado de 2-O-sulfatación no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que se obtenga un heparán sulfato que presente la naturaleza deseada. El residuo de GlcA además del residuo de IdoA puede someterse a 2-O-sulfatación. La 2-O-sulfatación puede llevarse a cabo, por ejemplo, para que la tasa de 2-O-sulfatación del polisacárido se encuentre dentro del intervalo siguiente. En el polisacárido, cada uno de la tasa de 2-O-sulfatación de residuos de HexA (término inclusivo para residuos de IdoA y residuos de GlcA), la tasa de 2-O-sulfatación de residuos de IdoA y la tasa de 2-O-sulfatación de residuos de GlcA, puede ser, por ejemplo, de 0% o superior, de 5% o superior, de 10% o superior, de 15% o superior, de 20% o superior, de 30% o superior, de 40% o superio, de 50% o superior, de 60% o superior, de 70% o superior, de 80% o superior, o de 90% o superior; puede ser de 100% o inferior, de 95% o inferior, de 90% o inferior, de 855 o inferior, de 80% o inferior, de 70% o inferior, de 60% o inferior, de 50% o inferior, de 40% o inferior, o de 30% o inferior, o puede ser una combinación consistente de los mismos. Específicamente, en el polisacárido, la tasa de 2-O-sulfatación de residuos de HexA puede ser, por ejemplo, de entre 0% y 80%, de entre 10% y 70% o de entre 15% y 70%. Específicamente, en el polisacárido, la tasa de 2-O-sulfatación de residuos de IdoA puede ser, por ejemplo, de entre 0% y 100%, de entre 15% y 100% o de entre 30% y 100%. Específicamente, en el polisacárido, la tasa de 2-O-sulfatación de residuos de GlcA puede ser, por ejemplo, de entre 0% y 50%, de entre 0% y 40% o de entre 0% y 30%. La expresión "tasa de 2-O-sulfatación de los residuos de HexA" a la que se hace referencia en la presente memoria es un porcentaje (proporción molar) de una cantidad de residuos de HexA 2-O-sulfatados respecto a la cantidad total de residuos de HexA. La expresión "tasa de 2-O-sulfatación de los residuos de IdoA" a la que se hace referencia en la presente memoria es un porcentaje (proporción molar) de una cantidad de residuos de IdoA 2-O-sulfatados respecto a la cantidad total de residuos de IdoA. La expresión "tasa de 2-O-sulfatación de los residuos de GlcA" a la que se hace referencia en la presente memoria es un porcentaje (proporción molar) de una cantidad de residuos de GlcA 2-O-sulfatados respecto a la cantidad total de residuos de GlcA. El grado de 2-O-sulfatación (es decir, la tasa de 2-O-sulfatación) puede confirmarse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de 2-O-sulfatación de residuos de HexA puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacárido que presenta el residuo HexA 2-O-sulfatado respecto a la cantidad total de unidades disacáridas en el caso de que el polisacárido se someta al análisis de disacáridos. Además, la tasa de 2-O-sulfatación de los residuos de IdoA puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacárido que presenta el residuo de IdoA 2-O-sulfatado respecto a la cantidad total de unidades disacáridas que presenta el residuo de IdoA en el caso de que el polisacárido se someta al análisis de disacáridos. Además, la tasa de 2-O-sulfatación de los residuos de GlcA puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacárido que presenta el residuo de GlcA 2-O-sulfatado respecto a la cantidad total de unidades disacáridas que presenta el residuo de GlcA en el caso de que el polisacárido se someta al análisis de disacáridos.

La isomerización del residuo de GlcA al residuo IdoA por la C5 epimerasa es una reacción equilibrada reversible. Es decir, en el caso de que se lleve a cabo la epimerización en C5 utilizando la C5 epimerasa, una parte de los residuos de IdoA producidos mediante la epimerización en C5 puede convertirse nuevamente en los residuos de GlcA. Por otra parte, un residuo de ácido hexurónico (HexA) 2-O-sulfatado no es un sustrato de la C5 epimerasa en general. De esta manera, por ejemplo, mediante la realización acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación, el residuo de IdoA producido mediante la epimerización en C5 puede 2-O-sulfatarse secuencialmente; de esta manera, puede evitarse la conversión del residuo de IdoA nuevamente en residuo de GlcA. Por lo tanto, la tasa de epimerización en C5 puede potenciarse llevando a cabo la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación de manera acoplada. De esta manera, la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación pueden llevarse a cabo simultáneamente en una parte o durante todo el periodo de tiempo de reacción. Por ejemplo, la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación pueden llevarse a cabo colectivamente al permitir que coexista un producto de N-sulfatación, C5 epimerasa y 2-OST en el sistema de reacción. Específicamente, entre las condiciones para una reacción acoplada de la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación se incluyen las condiciones indicadas en los ejemplos.

La 6-O-sulfatación es una etapa de sulfatación de la posición 6-O de un residuo de glucosamina N-sulfatado (GIcNS) en un producto producido mediante la 2-O-sulfatación.

La 6-O-sulfatación puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de, por ejemplo, un enzima de 6-O-sulfatación (6-OST). 6-OST no se encuentra particularmente limitado con la condición de que pueda catalizar la sulfatación del grupo hidroxi en la posición 6 de la glucosamina N-sulfatada. Además, 6-OST con una adecuada especificidad de sustrato puede seleccionarse y utilizarse dependiendo del orden de 6-O-sulfatación y las demás etapas. 6-OST puede derivar de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. 6-OST incluye 6-OST-1,6-OST-2 y 6-OST-3. Por ejemplo, como 6-OST puede utilizarse 6-OST-1 de hámster y 6-OST-3 de ratón. Además, como 6-OST pueden utilizarse variantes, tales como homólogos y enzimas artificialmente modificados de la 6-OST conocida. La descripción de los métodos de producción y aspectos de utilización de la heparinasa III puede aplicarse a métodos de producción y aspectos de utilización de la 6-OST Las condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación pueden ser apropiadamente configuradas por el experto en la materia. Como condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación, puede hacerse referencia a condiciones de las que se informa anteriormente (Chen J. et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate", J. Biol. Chem. 280(52): 42817-25, 30 de dic., 2005).

La 6-O-sulfatación asimismo puede llevarse a cabo químicamente mediante la utilización de un reactivo de sulfatación. El reactivo de sulfatación incluye complejo de trióxido de azufre, tal como complejo de trióxido de azufre-piridina (PySO3) y complejo de trióxido de azufre-trimetilamina (TMASO3). Las condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación pueden ser apropiadamente configuradas por el experto en la materia. Como condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación utilizando el reactivo de sulfatación, puede hacerse referencia a las condiciones de las que se informa anteriormente (documento US8227449B2 (24 de julio, 2012)). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación que utiliza el reactivo de sulfatación se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. La 6-O-sulfatación que utiliza el reactivo de sulfatación puede llevarse a cabo en un solvente orgánico, tal como N,N-dimetilformamida (DMF). Una temperatura de reacción en la 6-O-sulfatación puede ser, por ejemplo de entre -20°C y 5°C, preferentemente de entre -20°C y 0°C. La cantidad del reactivo de sulfatación utilizada para la 6-O-sulfatación puede ser, por ejemplo, de entre 1.5 y 10 equivalentes molares, preferentemente de entre 2 y 5 equivalentes molares respecto a la cantidad de un grupo hidroxilo que es la diana de la 6-O-sulfatación.

El grado de 6-O-sulfatación no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que se obtenga un heparán sulfato que presente la naturaleza deseada. La 6-O-sulfatación puede llevarse a cabo, por ejemplo, para que la tasa de 6-O-sulfatación del polisacárido se encuentre dentro del intervalo siguiente. La tasa de 6-O-sulfatación del polisacárido puede ser, por ejemplo, de 50% o superior, de 60% o superior, de 70% o superior, de 80% o superior, o de 90% o superior; puede ser de 100% o inferior, o de 95% o inferior, o puede ser una combinación de los mismos. Específicamente, la tasa de 6-O-sulfatación del polisacárido puede ser, por ejemplo, de entre 50% y 100%, de entre 60% y 100%, o de entre 70% y 100%. La expresión "tasa de 6-O-sulfatación" a la que se hace referencia en la presente memoria es un porcentaje (proporción molar) de una cantidad de residuos de glucosamina 6-O-sulfatada respecto a la cantidad total de residuos de glucosamina. El grado de 6-O-sulfatación (es decir, la tasa de 6-O-sulfatación) puede confirmarse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de 6-O-sulfatación puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacárido que presenta el residuo GlcN 6-O-sulfatado respecto a la cantidad total de unidades disacáridas en el caso de que el polisacárido se someta a análisis de disacáridos.

La 3-O-sulfatación de residuos de GlcN es una etapa de sulfatación de grupos hidroxi en la posición 3 de los residuos de glucosamina que están N-sulfatados y 6-O-sulfatados en un producto mediante la 6-O-sulfatación. La 3-O-sulfatación de residuos de GlcN puede llevarse a cabo enzimáticamente mediante la utilización de un enzima de 3-O-sulfatación (3-OST). 3-OST no se encuentra particularmente limitado con la condición de que pueda catalizar la sulfatación del grupo hidroxi en la posición 3 del residuo de glucosamina 6-O-sulfatado N-sulfatado. Puede utilizarse 3-OST con una adecuada especificidad de sustrato dependiendo del orden de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN y las demás etapas. 3-OST puede derivar de cualquiera de entre animales, plantas, microorganismos y similares. 3-OST incluye 3-OST-1, 3-OST-2, 3-OST-3, 3-o St-4 y 3-OST-5. Por ejemplo, como 3-OST puede utilizarse 3-OST-1 de ratón. Además, como 3-OST pueden utilizarse variantes, tales como homólogos y enzimas artificialmente modificados de la 3-OST conocida. La descripción de los métodos de producción y aspectos de utilización de la heparinasa III puede aplicarse a métodos de producción y aspectos de utilización de la 3-OST. Las condiciones de reacción para la 3-O-sulfatación pueden ser apropiadamente configuradas por el experto en la materia. Como condiciones de reacción para la 6-O-sulfatación de los residuos de GlcN, puede hacerse referencia a condiciones de las que se informa anteriormente (Chen J. et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate", J. Biol. Chem. 280(52): 42817-25, 30 de dic., 2005). Específicamente, entre las condiciones de reacción para la 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN se incluyen, por ejemplo, las condiciones indicadas en los ejemplos. El grado de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN no se encuentra particularmente limitado, con la condición de que se obtenga una heparina que presente la naturaleza deseada. Puede llevarse a cabo la 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN, por ejemplo, para que la tasa de 3-O-sulfatación de los residuos e GlcN en el polisacárido se encuentre dentro del intervalo siguiente. La tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN en el polisacárido puede ser, por ejemplo, de 0% o superior, de 1% o superior, de 2% o superior, de 5% o superior, de 10% o superior, o de 13% o superior; o puede ser de 45% o inferior, de 40% o inferior, de 33% o inferior, de 20% o inferior, de 10% o inferior, de 6% o inferior o de 4% o inferior, o puede ser una combinación consistente de los mismos. La tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN en el polisacárido puede ser, por ejemplo, de entre 0.5% y 10%, de entre 1% y 6% o de entre 2% y 4%, o puede ser de entre 13% y 45%, de entre 13% y 40%, o de entre 13% y 33%. La expresión "tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN" a la que se hace referencia en la presente memoria es un porcentaje (proporción molar) de una cantidad de residuos de glucosamina 3-O-sulfatada respecto a la cantidad total de residuos de glucosamina. El grado de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN (es decir, la tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN) puede confirmarse mediante, por ejemplo, análisis de disacáridos. Es decir, la tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN puede calcularse como porcentaje (proporción molar) de una cantidad de unidades disacárido que presenta el residuo de GlcN 3-O-sulfatado respecto a la cantidad total de unidades disacáridas en el caso de que el polisacárido se someta a análisis de disacáridos.

El producto en cada etapa contenido en la solución de reacción de cada etapa puede someterse directamente a una etapa posterior, o puede recuperarse a partir de la solución de reacción y después someterse a la siguiente etapa. El procedimiento de recuperación de cada producto a partir de la solución de reacción no se encuentra particularmente limitado. El procedimiento para recuperar cada producto incluye técnicas conocidas utilizadas para la separación y purificación del compuesto, tal como un método de tratamiento con una membrana y un método de precipitación. El producto en cada etapa puede someterse apropiadamente a los tratamientos, tales como la purificación, dilución, concentración, secado, disolución e inactivación del enzima, y después someterse a la etapa siguiente. La purificación puede llevarse a cabo en el grado deseado. Dichos tratamientos pueden llevarse a cabo solos o en combinación, según resulte apropiado.

El heparán sulfato con el peso molecular medio deseado se produce llevando a cabo la etapa de producción de heparán sulfato de esta manera. El peso molecular medio en número (Mn) del polisacárido de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 1000 o superior, de 1500 o superior, de 2000 o superior, de 2500 o superior, de 3000 o superior, de 3500 o superior, de 4000 o superior, de 4500 o superior, de 5000 o superior, de 5500 o superior, de 6000 o superior, de 6500 o superior, de 7000 o superior, de 8000 o superior, de 10000 o superior, de 12000 o superior, de 15000 o superior, o de 18000 o superior; puede ser de 150000 o inferior, de 130000 o inferior, de 120000 o inferior, de 110000 o inferior, de 100000 o inferior, de 90000 o inferior, de 80000 o inferior, de 70000 o inferior, de 60000 o inferior, de 50000 o inferior, de 45000 o inferior, de 43000 o inferior, de 40000 o inferior, de 35000 o inferior, de 30000 o inferior, de 25000 o inferior, de 20000 o inferior, de 18000 o inferior, de 15000 o inferior, o de 12000 o inferior, o puede ser una combinación de los mismos como valor medido mediante CPG utilizando pululano como estándar. Específicamente, el peso molecular medio en número (Mn) del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede ser, por ejemplo, de entre 1000 y 150000, de entre 2000 y 100000, de entre 4000 y 80000, de entre 8000 y 60000, de entre 18000 y 43000 o de entre 15000 y 3000 como valor medido mediante CPG utilizando el pululano como estándar. El peso molecular medio en peso (Mw) del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 2000 o superior, de 2500 o superior, de 3000 o superior, de 3500 o superior, de 4000 o superior, de 4500 o superior, de 5000 o superior, de 5500 o superior, de 6000 o superior, de 6500 o superior, de 7000 o superior, de 7500 o superior, de 8000 o superior, de 8500 o superior, de 9000 o superior, de 10000 o superior, de 12000 o superior, de 15000 o superior, de 21000 o superior, de 25000 o superior; puede ser de 200000 o inferior, de 170000 o inferior, de 160000 o inferior, de 150000 o inferior, de 140000 o inferior, de 130000 o inferior, de 120000 o inferior, de 110000 o inferior, de 100000 o inferior, de 90000 o inferior, de 85000 o inferior, de 80000 o inferior, de 75000 o inferior, de 70000 o inferior, de 65000 o inferior, de 60000 o inferior, de 55000 o inferior, de 50000 o inferior, de 45000 o inferior, de 41000 o inferior, de 40000 o inferior, de 35000 o inferior, de 30000 o inferior, de 25000 o inferior, de 20000 o inferior, de 18000 o inferior, de 15000 o inferior, o de 12000 o inferior, o puede ser una combinación de los mismos como valor medido mediante CPG utilizando pululano como estándar. Específicamente, el peso molecular medio en peso (Mw) del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede ser, por ejemplo, de entre 2000 y 120000, de entre 10000 y 100000, de entre 25000 y 60000, de entre 5000 y 60000, o de entre 8000 y 41000 como valor medido mediante CPG utilizando el pululano como estándar. El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede recuperarse apropiadamente a partir de la solución de reacción. El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede recuperarse mediante la técnica conocida utilizada para la separación y purificación del compuesto. Entre los ejemplos de dicha técnica se incluyen un método de resina de intercambio iónico, un método de tratamiento con membrana, un método de precipitación y un método de cristalización. Dichas técnicas pueden utilizarse en combinación, según resulte apropiado. El polisacárido recuperado que se ha obtenido mediante el método de la presente invención puede comprender componentes tales como agua y componentes utilizados al producir el polisacárido. Es decir, el polisacárido puede proporcionarse, por ejemplo, en forma de una mezcla.

El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede purificarse en el grado deseado. El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede configurarse apropiadamente según diversas condiciones, tales como aspectos de utilización. Por ejemplo, el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede proporcionarse como uno purificado en un grado farmacológicamente aceptable para la formación de un compuesto y la utilización como un principio activo de una composición farmacéutica. Específicamente, la pureza del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 30% (p/p) o superior, de 50% (p/p) o superior, de 70% (p/p) o superior, de 80% (p/p) o superior, de 90% (p/p) o superior o de 95% (p/p) o superior.

El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención presenta una actividad anticoagulante. La actividad anticoagulante se refiere específicamente a actividad anticoágulo sanguíneo. La actividad anticoagulante incluye actividad de antifactor Xa y actividad de antifactor IIa. El polisacárido de la presente invención puede presentar, por ejemplo, por lo menos la actividad antifactor Xa. La actividad antifactor Xa del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 100 UI/mg o superior, de 200 UI/mg o superior, de 300 UI/mg o superior o de 400 UI/mg o superior. Además, la actividad antifactor Xa del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención particularmente no presenta límite superior y puede ser, por ejemplo, de 5000 UI/mg o inferior, de 2000 UI/mg o inferior o de 1000 UI/mg o inferior. Además, el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede presentar una elevada proporción de actividad de antifactor Xa/actividad de antifactor IIa. La proporción de actividad de antifactor Xa/actividad de antifactor IIa del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede ser, por ejemplo, de 1.0 o superior, de 1.5 o superior, de 2 o superior o de 2.5 o superior. Además, la proporción de actividad de antifactor Xa/actividad de antifactor IIa del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención particularmente no presenta límite superior y puede ser, por ejemplo, de 50 o inferior, de 20 o inferior o de 10 o inferior. Tanto la actividad de antifactor X como la actividad de antifactor IIa pueden medirse mediante métodos estándares. Entre los métodos para medir la actividad de antifactor Xa y la actividad de antifactor IIa se incluyen, por ejemplo, los métodos indicados en los ejemplos.

El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede ser una forma libre, una sal o una mezcla de los mismos. Es decir, la expresión "polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención (por ejemplo, heparán sulfato)" se refiere a una forma libre del polisacárido, o una sal del mismo, o una mezcla del mismo, a menos que se especifique lo contrario. Es decir, cualquier grupo funcional presente en el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención y capaz de formar una sal puede ser una forma libre, puede formar una sal o puede ser una combinación de los mismos, a menos que se especifique lo contrario. El grupo funcional presente en el polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención y capaz de formar una sal incluye un grupo sulfato (-SO3H) y un grupo carboxilo (-COOH) en el residuo de HexA y un grupo sulfato (-SO3H) y un grupo amino (-NH2) en el residuo de GlcN. Es decir, por ejemplo, la expresión "grupo sulfato" denota una forma libre del grupo sulfato, o el grupo sulfato que ha formado una sal, o una combinación de los mismos, a menos que se especifique lo contrario. Dicha explicación del grupo sulfato puede aplicarse asimismo a otros grupos funcionales capaces de formar una sal. Entre las sales se incluyen sales farmacológicamente aceptables. Las sales farmacológicamente aceptables pueden seleccionarse apropiadamente dependiendo de diversas condiciones, tales como aspectos de utilización del polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención. Entre las sales farmacológicamente aceptables se incluyen las siguientes. Entre las sales para ácidos grupos, tales como el grupo sulfato, se incluyen específicamente sales amónicas, sales con un metal alcalino, tal como sales de sodio, potasio y litio, sales con un metal alcalinotérreo, tales como sales de calcio, magnesio y aluminio, sales con amina orgánica, tales como trietilamina, etanolamina, morfolina, pirrolidina, piperidina, piperazina y diciclohexilamina, y sales con un aminoácido básico, tal como arginina y lisina. Preferentemente, la sal se selecciona de entre una sal amónica, una sal sódica, una sal de litio y una sal de calcio. Además, por ejemplo, entre las sales de grupos básicos, tales como grupos amino, se incluyen específicamente sales con un ácido inorgánico, tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y ácido bromhídrico, sales con un ácido carboxílico orgánico, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido tánico, ácido butírico, ácido hibéncico, ácido pamoico, ácido enántico, ácido decanoico, ácido teóclico, ácido salicílico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido mandélico, ácido málico o similares, y sales con un ácido sulfónico orgánico, tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico y ácido p-toluenosulfónico. Como la sal, puede utilizarse una sal sola, o pueden utilizarse dos o más sales en combinación.

El polisacárido obtenido mediante el método de la presente invención puede utilizarse para la prevención, mejora y/o tratamiento de síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea. Entre los síntomas atribuidos a la coagulación sanguínea se incluyen la coagulación intravascular diseminada (CID), el embolismo trombótico (trombosis venosa, infarto de miocardio, embolismo pulmonar, embolismo cerebral, embolismo trombótico arterial de una extremidad, embolismo trombótico durante y después de una operación, y similares), coagulación sanguínea en la diálisis artificial y coagulación sanguínea en la circulación extracorpórea.

Ejemplos

A continuación en la presente memoria, la presente invención se explica más específicamente basándose en los ejemplos.

Ejemplo 1 : preparación de heparosano

(1) Fermentación de heparosano

Se obtuvo una solución de cultivo que contenía heparosano utilizando la bacteria productora de heparosano (cepa de Escherichia coli BL21 (DE3)/pVK9-kfiABCD) y las condiciones de cultivo indicadas en el ejemplo 1 del documento WO2015/050184.

(2) Purificación del heparosano

Se recogió el sobrenadante de cultivo a partir de la solución de cultivo mediante centrifugación. A fin de eliminar los ingredientes del medio, se lavó 1 ml del sobrenadante de cultivo con agua Milli-Q utilizando una membrana de UF y se concentró hasta 250 pl. A 250 pl de la solución concentrada con la membrana de UF, se añadieron 500 pl de etanol al 100% y se precipitó el heparosano mediante centrifugación. El precipitado resultante se secó al aire para obtener el heparosano. Asimismo a partir del sobrenadante de cultivo restante, se purificó el heparosano mediante el mismo procedimiento. Se obtuvo un total de 10 g de heparosano.

Ejemplo 2: N-desacetilación del heparosano

1) A 1.22 g de heparosano, se le añadieron 61 ml de hidrazina-^O y 4.7 ml de ácido sulfúrico 1 N, y tras sustituir la fase gaseosa por nitrógeno, la mezcla se calentó a 100°C y se hizo reaccionar durante 4.75 horas.

2) Tras detener la reacción mediante enfriamiento con hielo, se añadieron 61 ml de solución acuosa de NaCl al 16% y 610 ml de MeOOH y la mezcla se centrifugó. Se separó el sobrenadante. El precipitado resultante se disolvió en 50 ml de H2O y después se desaló y se concentró utilizando una membrana de UF Amicon (de 3 kDa).

3) A la solución concentrada resultante se le añadió dos veces el volumen de H2O y el volumen equivalente de NaHCO3 1 M y después la solución de I20.2 M/KI 0.4 M se añadió gota a gota hasta obtener un color amarillo. Después, se añadió gota a gota hidrazina-^O para reducir el exceso de yodo a ion yodo y después se desaló la solución y se concentró utilizando una membrana de UF Amicon (de 3 kDa) nuevamente. La solución concentrada se secó bajo presión reducida, obteniendo heparosano N-desacetilado. La tasa residual de grupos acetilos en el heparosano N-desacetilado obtenido era de 14.9% (indicada posteriormente).

Ejemplo 3: obtención de bajo peso molecular de heparosano N-desacetilado (1) Preparación de heparinasa III

<Construcción de plásmido de expresión génica de hepC derivado de Flavobacterium heparinum>

El gen hepC codificante de heparinasa III derivado de Flavobacterium heparinum se clonó en un vector pMIV-Pnlp0 (solicitud de patente US de publicación 20050196846) para construir el plásmido de expresión del gen hepC, pMIV-Pnlp0-hepC. El plásmido pMIV-Pnlp0-ter incluye un potente promotor nlp0 (Pnlp0) y un terminador rrnB, y puede funcionar como una unidad de expresión mediante la inserción de un gen objetivo entre el promotor y el terminador. "Pnlp0" representa un promotor para el gen nlpD de tipo salvaje derivado de Escherichia coli K-12.

Se muestran los detalles de la construcción del plásmido de expresión posteriormente. Se obtuvo un fragmento de ADN que comprendía aproximadamente 300 pb de una región de promotor (Pnlp0) para el gen nlpD mediante PCR con el ADN cromosómico de Escherichia coli MG1655 como molde utilizando el cebador P1 (SEC ID n° 6) y el cebador P2 (SEC ID n° 7). Se diseñaron sitios para los enzimas de restricción SalI y PaeI en cada extremo 5' de dichos cebadores. Los ciclos de PCR fueron los siguientes. En primer lugar, 95°C durante 3 minutos, seguido de dos ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos, seguido de 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 55°C durante 20 segundos y 72°C durante 15 segundos, y finalmente 72°C durante 5 minutos. Un fragmento resultante se trató con SalI y PaeI y se insertó en el sitio Sal-PaeI de pMIV-5JS (solicitud publicada de patente japonesa 2008-99668) a fin de obtener el plásmido pMIV-Pnlp0. La secuencia de nucleótidos del fragmento PaeI-SalI del promotor Pnlp0 se insertó en dicho plásmido pMIV-Pnlp0, tal como se muestra en la SEC ID n° 8.

Después, el fragmento de ADN (SEC ID n° 11) que comprendía aproximadamente 300 pb de una región de terminador del gen rrnB se obtuvo mediante PCR con el ADN cromosómico de MG1655 como molde utilizando el cebador P3 (SEC ID n° 9) y el cebador P4 (SEC ID n° 10). Se diseñaron sitios para los enzimas de restricción XbaI y BamHI en cada extremo 5' de dichos cebadores. Los ciclos de PCR fueron los siguientes. En primer lugar, 95°C durante 3 minutos, seguido de dos ciclos de 95°C durante 60 segundos, 50°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos, seguido de 25 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 55°C durante 20 segundos y 72°C durante 15 segundos, y finalmente 72°C durante 5 minutos. El fragmento resultante se trató con XbaI y BamHI y se insertó en el sitio XbaI-BamHI de pMIV-Pnlp0, obteniendo el plásmido pMIV-Pnlp0-ter.

Después, se sintetizó artificialmente una cadena de ADN que comprendía el ORF del gen hepC derivado de Flavobacterium heparinum (ATCC n° 13125) (Su H. et. al., Appl. Environ. Microbiol. 62: 2723-2734, 1996). Se amplificó un fragmento de ADN del gen hepC mediante PCR con dicha cadena de ADN como molde utilizando el cebador P5 (SEC ID n° 12) y el cebador P6 (SEC ID n° 13). Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) en la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 8 minutos, y finalmente mantenimiento a 4°C. Además, se obtuvo un fragmento de ADN de pMIV-PnlpO mediante PCR con pMIV-PnlpO como ADN molde utilizando oligonucleótidos de un cebador 7 (SEC ID n° l4 ) y un cebador 8 (SEC ID n° 15) como cebadores. Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) en la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 6 minutos, y finalmente el mantenimiento a 4°C. Los dos fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit de clonación HC In-Fusion (marca comercial registrada) (Clontech) para construir el plásmido de expresión del gen hepC, pMIV-Pnlp0-hepC. Una secuencia de nucleótidos de un gen hepC clonado y una secuencia de aminoácidos de la heparinasa III (HepC) codificada por la misma se muestran en las SEC ID n° 16 y n° 17, respectivamente.

<Construcción de cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) que expresa gen hepC y preparación de solución de enzima heparinasa III>

Se introdujo el plásmido de expresión del gen hepC, pMIV-Pnlp0-hepC, en la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) (Life Technologies) mediante electroporación (Cell; 80 pl, 200 O, 25 pF, 1.8 kV, cubeta de 0.1 ml), obteniendo la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3)/pMIV-Pnlp0-hepC como cepa productora de heparinasa III. Dicha cepa se precultivó en medio LB con adición de 25 pg/ml de cloranfenicol a 37°C durante la noche. Después, la solución de cultivo se inoculó en 300 ml de medio LB en un matraz de Sakaguchi a una concentración final de 2% v/v. El cultivo bajo agitación se llevó a cabo a 37°C durante 4 horas y se detuvo el cultivo. Tras la centrifugación, las células microbianas se lavaron dos veces con NaCl al 0.85% y se suspendieron en 30 ml de tampón HEPES 50 mM (pH 7.0). La suspensión se sometió a disrupción mediante sonicación para romper las células microbianas. La solución de células microbianas rotas se centrifugó para preparar una solución de enzima heparinasa III como sobrenadante (solución de extracto libre de células).

(2) Obtención de bajo peso molecular mediante reacción de la heparinasa III

Se disolvió el 1 g de heparosano N-desacetilado con una tasa residual de grupos N-acetilo de 14.9% obtenido en el ejemplo 2 y 2 ml de solución de heparinasa III 31.3 mUI/pl en 100 ml de solución tampón de Tris (pH 8.0) que contenía NaCl 100 mM y CaCh 1.5 mM y se hicieron reaccionar a 37°C durante 5.3 horas. A la solución de reacción se le añadieron 100 ml de solución acuosa de NaCl al 16% y 900 ml de EtOH y se mezclaron y centrifugaron para eliminar el sobrenadante y obtener heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido.

Ejemplo 4: N-sulfatación de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido

1) El 1 g de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido obtenido en el ejemplo 3 se disolvió en 50 ml de agua MilliQ y se añadieron al mismo 50 ml de una solución acuosa de 20 mg/ml de NaHCO3/20 mg/ml de trimetilaminaSO3, y la mezcla se hizo reaccionar a 55°C durante la noche.

2) A la mezcla se le añadió 1 l de EtOH, que se centrifugó para eliminar el sobrenadante, obteniendo heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado.

3) El heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado obtenido se disolvió en agua MilliQ hasta 500 pl y se llevó a cabo el análisis de disacáridos para calcular el rendimiento respecto al heparosano N-desacetilado. Además, se sometió a CPG para calcular la distribución de pesos moleculares. Se muestran los procedimientos a continuación:

<Análisis de disacáridos>

El análisis de disacáridos del heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado se llevó a cabo según las condiciones de las que se informa anteriormente (T Imanari, et. al., "High-performance liquid chromatographic analysis of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides", J. O. Chromato. A, 720, 275-293, 1996). Es decir, se cuantificó la cantidad de cada disacárido constituyente mediante descomposición del heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado en disacáridos insaturados, utilizando las heparinasas II y III y analizando cada producto descompuesto, mediante HPLC.

De manera similar, se llevó a cabo el análisis de disacáridos del heparosano N-desacetilado. El análisis de disacáridos del heparosano N-desacetilado se llevó a cabo después de N-sulfatar el heparosano N-desacetilado. Es decir, se cuantificó la cantidad de cada disacárido constituyente mediante N-sulfatación del heparosano N-desacetilado, a continuación descomponiéndolo en disacáridos insaturados, utilizando las heparinasas II y III y analizando cada producto descompuesto, mediante HPLC. La N-sulfatación de heparosano N-desacetilado se llevó a cabo tal como con la N-sulfatación del heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido.

El análisis de disacáridos se llevó a cabo específicamente mediante el procedimiento siguiente.

1) Se mezclaron 0.2 U de heparinasa II (Sigma), 0.02 a 0.03 mUI de heparinasa III, 5 |jg de una muestra de polisacárido y 10 j l de tampón para la digestión enzimática (CH3COONa 100 mM, (CH3COO)2Ca 10 mM, pH 7.0) y se diluyeron con agua Milli-Q hasta alcanzar 100 j l de volumen medido para la utilización como solución de reacción.

2) La solución de reacción se hizo reaccionar a 37°C durante 16 horas o más y posteriormente se sometió a ebullición a 100°C durante 2 minutos para detener la reacción.

3) Se eliminaron las impurezas con un filtro de 0.45 jm , obteniendo una solución que a continuación se utilizó como muestra para el análisis de disacáridos.

4) El análisis se llevó a cabo con una columna Inertsil ODS-3 de 150 mm x 2.1 mm con 5 jm de tamaño de partícula bajo las condiciones de 50°C, caudal de 0.25 ml/min y longitud de onda para la detección de 230 nm, y utilizando una composición de eluyente de acetonitrilo al 4% y tributilamina 1.2 mM como solución A y acetonitrilo al 4% y CsCl 0.1 M como solución B, en un gradiente de 1% a 90% de solución B.

Se calculó el rendimiento a partir de la suma de cantidades de disacáridos constituyentes producidos a partir de cada muestra de polisacárido. Es decir, se calculó el rendimiento como porcentaje (proporción molar) de la cantidad total de disacáridos producida a partir del heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado respecto a la cantidad total de disacáridos producida a partir de heparosano N-desacetilado. Además, en ese tiempo, se confirmó que 99% o más de los grupos amino producidos por N-acetilación se encontraba N-sulfatado en el heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado.

Además, se calculó la tasa residual de grupos N-acetilo en el heparosano N-desacetilado basándose en la cantidad de cada disacárido constituyente producido a partir de heparosano N-desacetilado. Es decir, se calculó la tasa residual de grupos acetilo como el porcentaje (proporción molar) de la cantidad de disacáridos que presentaba el grupo acetilo respecto a la cantidad total de disacáridos. La tasa residual de grupos acetilos era de 14.9%.

<Análisis de GPC>

Se sometió a filtración en gel mediante HPLC (análisis de CPG) el heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado y el heparán sulfato (disuelto a 1 mg/ml en agua MilliQ). Como columna se utilizó GS520 (Shodex, Asahipak GS-520HQ, 7.5 mm*300 mm, tamaño de partícula de 7 jm ); se utilizó una solución acuosa de dihidrogenofosfato potásico 100 mM como un eluyente y el análisis se llevó a cabo a un caudal de 0.6 ml/min, a una temperatura de la columna de 40°C y a una longitud de onda para la detección de 200 nm. Se calcularon los pesos moleculares medios (Mn y Mw) utilizando un juego de marcadores de peso molecular de pululano (Shodex, intervalo de pesos moleculares STANDARD P-82 de 5900 a 708000) como estándar.

Ejemplo 5: reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación

(1) Expresión y purificación de C5 epimerasa

La proteína de fusión del sitio catalítico de la 5-epimerasa derivada de ser humano (Gln29 a Asn617) y proteína de unión a maltosa (PUM) (PUM-C5 epimerasa) se utilizó como C5 epimerasa. De esta manera, la secuencia de nucleótidos codificante de dicho sitio catalítico se clonó en el vector pMAL-c2x (New England Biolabs) para construir el plásmido de expresión de PUM-C5 epimerasa pMAL-c2x-PUM-C5epi. Según el vector pMAL-c2x, el gen clonado se expresó en forma de una proteína de fusión con PUM.

Se muestran los detalles de la construcción del plásmido de expresión a continuación. En referencia al informe de Jin-ping Li et al. (Li J. et. al., Jour. Biol. Chem. 272: 28158-28163, 1997), se preparó ADNc de C5 epimerasa de origen humano mediante síntesis génica artificial (Thermo Fisher Scientific). Se obtuvo un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa (Gln29 a Asn617) mediante PCR con dicho ADNc como molde y utilizando C5-epi fw (SEC ID n° 18) y C5-epi rv (s Ec ID n° 19) como cebadores. Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) en la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 2 minutos, y finalmente mantenimiento a 4°C. Además, se obtuvo un fragmento de ADN de pMAL-c2x mediante PCR con pMAL-c2x (SEC ID n° 20, New England Biolabs) como ADN molde utilizando oligonucleótidos de SEC ID n° 21 y n° 22 como cebadores. Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa PrimeStar en la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 6 minutos, y finalmente mantenimiento a 4°C. Los dos fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit de clonación HD In-Fusion (marca comercial registrada) (Clontech) para construir el plásmido de expresión de PUM-C5 epimerasa, pMAL-c2X-PUM-C5epi, en el que la secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa se fusionó con el gen de PUM originalmente incluido en pMAL-c2x. La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción de C5 epimerasa (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa) y la secuencia de aminoácido codificada de esta manera se muestran en las SEC ID n° 23 y n° 24, respectivamente.

El plásmido de expresión de PUM-C5 epimerasa, pMAL-c2X-PUM-C5epi y el plásmido de expresión de chaperonina, pGro7 (TaKaRa) se introdujeron en la cepa de Escherichia coli Origami B (DE3) mediante electroporación (Cell; 80 |jL, 200 O, 25 jF, 1.8 kV, cubeta de 0.1 ml), obteniendo la cepa Origami B(DE3)/pMAL-c2x-MBP-c5epi/pGro7. Dicha cepa se inoculó en medio LB (peptona al 0.1% (p/v), extracto de levadura al 0.5% (p/v), NaCl al 1.0% (p/v)) con adición de 100 jg/ml de ampicilina y 25 jg/ml de cloranfenicol y se precultivó a 37°C durante la noche. A continuación, la solución de cultivo resultante se inoculó a una concentración final de 1% en 100 ml del medio LB en un matraz de Sakaguchi. Tras el cultivo bajo agitación a 37°C durante 3 horas, se añadió al mismo isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Nacalai Tesque) a una concentración final de 0.5 mM y arabinosa (Wako Pure Chemical) a una concentración final de 0.2%, y se continuó el cultivo a 22°C durante la noche.

Tras centrifugar la solución de cultivo, se recogieron las células microbianas, se lavaron una vez con una solución de lavado (Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, NaCl 200 mM) y se suspendieron en la solución de lavado. Se añadió FastBreak (Promega) a la suspensión resultante, que a continuación se incubó a 30°C durante 10 minutos a una hora, y después se centrifugó a 9,100 g durante 10 minutos. El sobrenadante resultante se utilizó como solución de extracción de células microbianas.

(2) Expresión y purificación de enzima de 2-O-sulfatación (2-OST)

La proteína de fusión (PUM-2-OST) del sitio catalítico (Arg51 a Asn356) del mutante de 2-OST derivado de hámster chino con sustitución del residuo tirosina en la posición 94 por residuo de isoleucina con proteína de unión a maltosa (PUm) se utilizó como enzima de 2-O-sulfatación (2-OST). De esta manera, se clonó una secuencia de nucleótidos codificante de dicho sitio catalítico en un vector pMAL-c2x (New England Biolabs) para construir el vector de expresión de PUM-2-OST, pMAL-c2x-PUM-2OST.

Se muestran los detalles de la construcción del plásmido de expresión a continuación. En referencia al informe de Kobayashi et al. (Kobayashi M. et. al., Jour. Biol. Chem. (272): 13980-13985, 1997), el ADNc del mutante de 2-OST derivado de hámster chino con sustitución del residuo de tirosina en la posición 94 por un residuo de isoleucina se produjo mediante síntesis génica artificial (Thermo Fisher Scientific). Se obtuvo un fragmento de ADN que comprendía una secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Arg51 a Asn356) del mutante de 2-OST mediante PCR con dicho ADNc como molde utilizando 2-OST fw (SEC iD n° 25) y 2-OST rv (SEC ID n° 26) como cebadores. Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa PrimeStar (TaKaRa) en la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 2 minutos, y finalmente mantenimiento a 4°C. Además, se obtuvo un fragmento de ADN de pMAL-c2x mediante PCR con pMAL-c2x como ADN de molde utilizando oligonucleótidos de SEC ID n° 21 y n° 22 como cebadores. Se llevó a cabo la PCR utilizando la polimerasa PrimeStar en la composición de reacción indicada en el protocolo. El ciclo de PCR fue el siguiente. En primer lugar, 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 98°C durante 5 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 6 minutos, y finalmente mantenimiento a 4°C. Los dos fragmentos de ADN resultantes se ligaron utilizando el kit de clonación HD In-Fusion (marca comercial registrada) (Clontech) para construir el plásmido de expresión de PUM-2-OST, pMAL-c2X-PUM-2OST, en el que la secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico del mutante de 2-OST se fusionó con el gen de PUM originalmente incluido en pMAL-c2x. La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción de 2-OST (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico del mutante de 2-OST) y la secuencia de aminoácido codificada de esta manera se muestran en las SEC ID n° 27 y n° 28, respectivamente.

El plásmido de expresión de PUM-2OST, pMAL-c2x-MBP-2OST, y el plásmido de expresión de chaperonina, pGro7 (TaKaRa), se introdujeron en la cepa de Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) siguiendo la misma técnica que en el ejemplo 5(1) para obtener la cepa Origami B(DE3)/pMAL-c2x-MBP-2OST/pGro7. Dicha cepa se inoculó en medio LB con 100 jg/m l de ampicilina y 25 jg/m l de cloranfenicol y se precultivó a 37°C durante la noche. A continuación, la solución de cultivo resultante se inoculó a una concentración final de 1% en 100 ml del medio LB en un matraz de Sakaguchi. Tras el cultivo bajo agitación a 37°C durante 3 horas, se añadió al mismo isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) (Nacalai Tesque) a una concentración final de 0.5 mM y arabinosa (Wako Pure Chemical) a una concentración final de 0.2%, y se continuó el cultivo a 22°C durante la noche.

Se preparó PUM-2-OST purificado a partir de la solución de cultivo mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, la solución de cultivo se centrifugó para recoger las células microbianas. A continuación, las células microbianas se rompieron mediante sonicación, obteniendo una solución de extracto de células microbianas. A continuación, se mezcló la solución de extracto de células microbianas con resina de amilosa (New England Biolabs) equilibrada con Tris 20 mM (pH 7.5) y NaCl 200 mM para adsorber PUM-2-OST a la resina. Después, se lavó la resina con el tampón de equilibrio en una cantidad de 4 veces la resina y se añadió el tampón de equilibrio al que se había añadido maltosa 10 mM (tampón de elución). Las fracciones que contenían PUM-2-OST se fraccionaron para la utilización como PUM-2-OST purificado.

(3) Reacciones enzimáticas (reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación)

La epimerización en C5 y 2-O-sulfatación se llevaron a cabo utilizando la solución de extracto de células microbianas de PUM-C5 epimerasa preparada y PUM-2-OST purificado. A 703 ml de una solución mixta de 166 mg de heparosano de peso molecular reducido N-sulfatada obtenido en el ejemplo 4, MES 50 mM (pH 7.0), NaCl 100 mM y PAPS 1 mM, se le añadieron 108 ml de la solución de extracto de las células microbianas que expresaban C5 epimerasa a una concentración final de 0.9 mg/ml y 16.9 ml de PUM-2-OST purificado a una concentración final de 0.5 mg/ml a fin de preparar una solución de reacción en una cantidad total de 828 ml. Dicha solución de reacción se hizo reaccionar a 37°C durante 24 horas.

(4) Cuantificación de la tasa de conversión

Se cuantificó la tasa de conversión (tasa de epimerización en C5 y tasa de 2-O-sulfatación) mediante un análisis de la composición de disacáridos utilizando la descomposición con ácido nitroso.

<Reactivos>

NaNO2 (CAS n° 7632-00-0, MW: 69.01)

Ácido cítrico (CAS n° 77-92-9, MW: 192.1)

2,4-dinitrofenilhidrazina (CAS n° 119-26-6, MW: 198.1), producto hidratado al 50% (abreviatura: DNPH) Heparina (fabricada por Aldrich)

<Solución de ensayo>

Solución estándar de heparina: 1 mg/ml

solución acuosa de NaNO2: se disolvieron 49.5 mg del reactivo en 1 ml de H2O.

Solución acuosa de ácido cítrico: se disolvieron 384.2 mg del reactivo en 1 ml de H2O.

solución de DNPH: se disolvieron 20.4 mg (hidratados al 50%) del reactivo en 1 ml de acetonitrilo.

<Condiciones del análisis de CL-EM>

<Condiciones de la LC>

Columna: ODS Z-CLUE 3 pm 2.0 mm*250 mm fabricada por Sumika Chemical Analysis Service Temperatura de horno de columna: 50°C

Caudal de eluyente: 0.3 ml/min

Detección: UV 365 nm

Cantidad de inyección: 5 pl

Composición del eluyente: solución A: HCOONH450 mM (pH 4.5) solución B: MeCN

Tabla 1. Condiciones del gradiente para la CL

<Condiciones de la EM>

Método de ionización: ionización por electropulverización (ESI (+/-))

Temperatura de DL: 250°C

Bloque térmico: 250°C

Caudal de gas de nebulización: 1.5 l/min

Caudal de gas seco: 15 l/min

Tabla 2

Procedimiento de análisis y resultados>

Los 20 |jl de la solución de estándar de heparina, 20 |jl de la solución acuosa de tampón de citrato y 10 |jl de la solución acuosa de NaNO2 se añadieron en este orden a un microtubo de 1.5 ml (Eppendorf) y la solución mixta se sometió a agitación a 65°C durante 2 horas (1000 rpm), obteniendo una solución de descomposición de ácido nitroso. A 40 j l de la solución de descomposición con ácido nitroso resultante, se le añadieron 20 j l de la solución de DNPH y se sometieron a agitación a 45°C durante 2 horas (1000 rpm), obteniendo una solución de derivatización. La composición de la solución de derivatización resultante se analizó mediante CL-EM. Se calculó el factor de conversión [superficie-pureza de 1 mg*IdoA(2S)-GlcN (NS6S)/valor de superficie de IdoA(2S)-GlcN(NS6S)] a partir del pico de IdoA(2S)-GlcN(NS6S) obtenido mediante análisis de la solución estándar de heparina. Se calculó la concentración a partir del valor de la superficie de cada derivado de disacárido en una solución de la invención. Las estructuras de disacárido calculadas y la proporción de las mismas se muestran en la tabla 3. En la tabla, se omitieron los datos de picos no identificados que se creía que incluían derivados de disacárido y similares que presentaban el grupo N-acetilo, y se fijó en 100% la cantidad total de GlcA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS), GlcA-GlcN(NS) y IdoA-GlcN(NS). La tasa de epimerización en C5 (la suma de las tasas de IdoA(2S)-GlcN(NS) and IdoA-GlcN(NS)) y la tasa de 2-O-sulfatación (la suma de las tasas de GlcA(2S)-GlcN(NS) and IdoA(2S)-GlcN(NS)) se confirmó que eran de 58% y 65%, respectivamente.

Tabla 3. Composición de disacáridos en el producto de reacción mediante reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.

Ejemplo 6: 6-O-sulfatación

Los 30 ml de la solución de reacción enzimática (solución de reacción después de la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación) obtenidos en el ejemplo 5 se centrifugaron (7000G, 30 minutos) y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0.45 jim. La solución filtrada (27.3 g) se aplicó en 15 g de una resina de intercambio aniónico débil (DIAION WA-30, fabricada por Mitsubishi Chemical, ajustada preliminarmente a pH 5.5 con NaH2PO425.6 mM) empaquetada en una columna (número de modelo XK26) fabricada por Pharmacia para adsorber componentes de polisacárido en la resina y se pasaron por la columna 480 ml de una solución de lavado (NaCl 0.5 mM NaH2PO4 25.6 mM (pH 5.5)) (caudal: 6.4 ml/min). Después, se pasaron 230 ml de un eluyente (NaCl 2 M NaH2PO425.6 mM (pH 5.5)) por la columna (caudal: 6.4 ml/min) para obtener el eluyente que contenía los componentes de polisacárido. El eluyente obtenido se cargó en Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que a continuación se centrifugó (4000G). Además, se añadieron 100 ml de agua a una solución concentrada resultante, que a continuación se centrifugó nuevamente. Se repitió dicha manipulación de lavado tres veces para obtener 11 g de una solución concentrada lavada.

<Intercambio iónico>

Los 11 g de la solución concentrada lavada se pasaron por 3 ml de resina de intercambio catiónico fuerte (DIAION UBK550, fabricada por Mitsubishi Chemical, intercambiada preliminarmente en tipo H con ácido clorhídrico 1 M) (pH 2.25) y después se neutralizó (pH 8.36) mediante la adición de 1.8 ml de solución mixta de 2.36 g de tributilamina/10 j l con etanol. Se liofilizó la solución neutralizada obtenida.

<Reacción de 6-O-sulfatación>

Bajo flujo de gas argón, se añadieron 1.92 ml de DMF y 76.4 mg (0.48 mmoles) de un complejo de trióxido azufre-piridina a una cantidad total del liofilizado, y la mezcla se sometió a agitación a -10°C durante 48 horas. Tras la reacción, se añadieron 2.8 ml de una solución acuosa de acetato de Na 5 M y 31 ml de agua y se sometieron a agitación a temperatura ambiente durante 1 hora para detener la reacción. La solución con la reacción parada se filtró a través de un filtro de 0.2 jim y su filtrado se cargó en Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que a continuación se centrifugó (4000G). Además, se añadieron 20 ml de agua a una solución concentrada resultante, que a continuación se centrifugó nuevamente. Se repitió dicha manipulación dos veces, obteniendo 3.92 g de una solución concentrada lavada. La solución concentrada lavada que se había obtenido se muestreó y se sometió al análisis de disacáridos mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Como resultado, se confirmó que un producto de reacción (polisacárido) en una cantidad de 76.5 mg en términos de cantidad de unidad de disacárido se encontraba contenida en 3.92 g de solución concentrada lavada.

Ejemplo 7: reacción de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN

(1) Preparación de cepa que expresa el enzima de 3-O-sulfatación (3-OST)

La secuencia de aminoácidos de 3-OST-1 derivado de ratón (NCBI - ID de proteína: NP_034604: SEC ID n° 29) se obtuvo de la base de datos KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). El fragmento de ADN que comprendía la secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de 3-OST-1 (Gly48 a His311) y optimizado basándose en el uso de los codones en Escherichia coli (SEC ID n° 30) se sintetizó en referencia a un informe anterior (Edavettal S. C. et al., J. Biol. Chem. 279 (24) 25789-97, 2004). El fragmento de ADN resultante se insertó en el sitio EcoRI-SalI del vector pETDuet-1 (Novagen) para construir el plásmido de expresión de 3-OST-1, pETDuet-3-OST-1. Según dicho plásmido, se expresa 3-OST-1 con la etiqueta de His añadida a lado N-terminal, y de esta manera, resulta posible purificar 3-OST-1 utilizando dicha etiqueta de His. Dicho plásmido de expresión se introdujo en la cepa de Escherichia coli BL21 (DE3) según la misma técnica que en el ejemplo 5(1), obteniendo la cepa expresante de 3-OST-1, pETDuet-3-OST-1/BL21 (DE3).

(2) Expresión y purificación de 3-OST-1

La cepa de Escherichia coli pETDuet-3-OST-1/BL21 (DE3) se inoculó en medio LB-agar (peptona al 1.0% (p/v), extracto de levadura al 0.5% (p/v), NaCl al 1.0% (p/v), agar al 1.5% (p/v)) que contenía 100 pg/ml de ampicilina y se cultivó estáticamente a 37°C durante la noche. A continuación, se suspendieron 20 pl de las células microbianas cultivadas en el medio de agar, en 1 ml de medio LB y se añadieron 50 pl del mismo a 50 ml de medio Overnight Express TB (Merck, que contiene 100 pg/ml de ampicilina) en un matraz de Sakaguchi. Las células microbianas en 16 matraces de Sakaguchi se cultivaron bajo agitación a 120 oscilaciones/min a 22°C durante 24 a 26 horas y después se recolectaron mediante centrifugación (4°C, 8,000 rpm, 5 minutos). Las células microbianas obtenidas en forma de un sedimento se suspendieron en 160 ml de un tampón de equilibrio (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7.0) y se centrifugaron (4°C, 8,000 rpm, 5 minutos) nuevamente para lavar las células microbianas. Tras repetir dicha manipulación de lavado dos veces, las células microbianas obtenidas en forma de un sedimento se resuspendieron en 160 ml del tampón de equilibrio, que a continuación se sometió a disrupción con sonicación (190W, 20 minutos) bajo enfriamiento con hielo. La solución de células rotas se centrifugó (4°C, 8,000 rpm, 10 minutos) y se utilizó el sobrenadante resultante como solución de extracto libre de células.

La solución de extracto libre de células resultante se aplicó a una columna compuesta de tres columnas unidas HisTALON Superflow Cartridge de 5 ml (fabricadas por Clontech) equilibradas preliminarmente con el tampón de equilibrio para adsorber 3-OST-1. La columna se lavó con tampón de lavado (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, pH 7.0) y después se eluyó 3-OST-1 con tampón de elución (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 150 mM, pH 7.0), obteniendo fracciones activas de 3-OST-1. El tampón en la fracción activa obtenida se intercambió por un tampón (fosfato sódico 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7.0) utilizando una columna de PD-10 (fabricada por GE Healthcare) según el protocolo. La solución de enzima tras el intercambio de tampón se utilizó como 3-OST-1 purificado en los experimentos siguientes.

(3) Reacción enzimática (reacción de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN)

Se preparó solución mixta en una cantidad de 326.5 ml que contenía la cantidad total del producto de reacción obtenido en el ejemplo 6, HEPES 50 mM (pH 7.5) y PAPS 221 pM. Los 56 ml de 3-OST-1 purificado se añadieron a una concentración final de 234 mg/l a dicha solución mixta preliminarmente calentada a 37°C en un baño de agua para preparar una solución de reacción en una cantidad total de 382.5 ml y se inició la reacción. Se continuó la reacción bajo agitación suave y tras 24 horas, el enzima se inactivó mediante calentamiento a 90°C durante 20 minutos.

(4) Cuantificación de la tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN

El análisis de la composición de disacáridos del producto de reacción se llevó a cabo mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Las estructuras de disacárido calculados y sus tasas se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Composición de disacáridos de los productos de reacción antes y después de la reacción de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN

Ejemplo 8: purificación del producto de reacción

Los 371 g de la solución de reacción enzimática (solución de reacción después de la reacción de 3-O-sulfatación en residuos de GlcN) obtenidos en el ejemplo 7 se centrifugaron (8000G, 30 minutos) y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0.45 |jm. Dicho filtrado se cargó en Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que a continuación se centrifugó (4000G). Además, se añadieron 20 ml de agua a una solución concentrada resultante, que a continuación se centrifugó nuevamente. Se repitió dicha manipulación de lavado tres veces para obtener 11,6 g de una solución concentrada lavada. La solución concentrada lavada se aplicó en 7,5 g de una resina de intercambio aniónico débil (DIAION WA-30, fabricada por Mitsubishi Chemical, ajustada preliminarmente a pH 5.5 con NaH2PO425.6 mM) empaquetada en una columna (número de modelo XK16) fabricada por Pharmacia para adsorber componentes de polisacárido en la resina y se pasaron por la columna 500 ml de una solución de lavado (NaCl 0.5 mM NaH2PO425.6 mM (pH 5.5)) (caudal: 3.0 ml/min). Después, se pasaron 500 ml de un eluyente (NaCl 2 M NaH2PO425.6 mM (pH 5.5)) por la columna (caudal: 3.0 ml/min) para obtener el eluyente que contenía los componentes de polisacárido. Se cargaron 171 g del eluyente obtenido en Amicon-50K (fabricado por Merck Millipore), que a continuación se centrifugó (4000G). La solución permeada resultante se cargó adicionalmente en Amicon-3K (fabricado por Merck Millipore), que a continuación se centrifugó (4000G). Además, se añadieron 100 ml de agua a una solución concentrada resultante, que a continuación se centrifugó nuevamente. Se repitió dicha manipulación de lavado tres veces para obtener 8.58 g de una solución concentrada lavada. La solución concentrada lavada que se había obtenido se liofilizó, obteniendo 41 mg de polisacárido purificado.

Ejemplo 9: análisis de calidad del polisacárido purificado

Los elementos mostrados en la tabla 5 se midieron para el polisacárido purificado obtenido en el ejemplo 8. Los métodos de medición se describen posteriormente. Se muestran los resultados en la tabla 5.

Tabla 5. Calidad del polisacárido purificado

Ejemplo 10: Preparación de polisacárido sulfatado que presenta una estructura diferente

Se prepararon múltiples tipos de polisacáridos sulfatados que presentaban parámetros diferentes, tales como la tasa de epimerización, la tasa de 2-O-sulfatación y la tasa de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN, y se evaluaron para actividad anticoagulante.

(1) Reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación

Se preparó un total de 100 ml de una solución de reacción que presentaba la misma composición de la solución de reacción que en el ejemplo 5(3) y se hizo reaccionar a 37°C durante 0 hora, 4 horas y 8 horas. Se analizó una composición de disacáridos contenida en el producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Las estructuras de disacárido calculadas y sus tasas se muestran en la tabla 6. En la tabla, se omitieron los datos de picos no identificados que se creía que incluían derivados de disacárido y similares que presentaban el grupo N-acetilo, y se fijó en 100% la cantidad total de GlcA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS), GlcA-GlcN(NS) y IdoA-GlcN(NS).

Tabla 6. Composición de disacáridos en el producto de reacción mediante reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.

(2) Reacción de 6-O-sulfatación

Se purificaron cada 100 ml de la solución de reacción enzimática obtenida (solución de reacción después de la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación) y se 6-O-sulfataron siguiendo los mismos procedimientos tal como en el ejemplo 6, obteniendo una solución concentrada lavada. Se muestreó la solución concentrada lavada resultante y la composición de disacáridos en la muestra se analizó mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Como resultado, se confirmó que cada muestra contenía un producto de reacción (polisacárido) en una cantidad de aproximadamente 80 |jg en términos de cantidad de unidad de disacárido en la solución concentrada lavada.

(3) Reacción de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN

Para el producto de reacción obtenido de la reacción de 6-O-sulfatación, se preparó una solución de reacción en una cantidad total de 300 j l en la misma composición de solución de reacción que en el ejemplo 7 y se hizo reaccionar a 37°C durante 24 horas. La composición de disacáridos del producto de reacción se analizó mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Las estructuras de disacárido calculadas y la proporción de las mismas se muestran en la tabla 7. En la tabla, para las muestras durante 4 horas y 8 horas, se omitieron los datos de picos no identificados, y se fijó la cantidad total de unidades de disacárido en la tabla en 100%.

Tabla 7. Composición de disacáridos de los productos de reacción mediante reacción de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN

En la tabla, el tiempo representa un tiempo de reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación. (4) Actividad anticoagulante del polisacárido purificado

Los productos de reacción de la reacción de 3-O-sulfatación de los residuos de GlcN se purificaron según el mismo procedimiento que en el ejemplo 8 y se midieron para actividad anticoagulante. Se muestran los resultados en la tabla 8.

Tabla 8. Calidad de los polisacáridos purificados

En la tabla, el tiempo representa un tiempo de reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación. <Métodos de medición>

Los elementos respectivos en los ejemplos 9 y 10 se midieron siguiendo los procedimientos mostrados posteriormente.

<Antifactor Xa>

Kit utilizado: Test Team Heparin S (fabricado por Shimizu Medical)

Preparación de estándar de heparina de bajo peso molecular: preparación estándar de la Farmacopea japonesa (fabricada por Pharmaceutical and Medical Device Regulatory Science Society of Japan, Antifactor Xa: 1750 UI)

Instrumentos utilizados:

mezclador e incubador: Thermomixer compacto (fabricado por Eppendorf)

espectrómetro de absorción de UV: PD-303S (fabricado por APEL)

celda de UV: celda cuadrada acrílica (longitud de recorrido de luz: 10 mm)

Preparación de reactivos

Solución de sustrato: un vial de un agente de sustrato se disolvió en 20 ml de agua MilliQ.

Solución antitrombina III: se disolvió un vial de un agente antitrombina III en 10 ml de agua MilliQ.

Solución de factor Xa: se disolvió un vial de un agente factor Xa en 10 ml de agua MilliQ.

Tampón: se utilizó directamente un vial proporcionado.

Plasma normal: se disolvió un vial de un producto de plasma normal en 0.1 ml de agua MilliQ.

Solución de parada de reacción: se añadió agua MilliQ a 20 ml de ácido acético glacial (grado especial) para generar un volumen total de 40 ml.

Solución estándar de heparina:

solución de heparina diluida primaria (35 UI/ml): se disolvieron 1750 UI de heparina en 50 ml de agua MilliQ.

Solución de heparina diluida secundaria (0.175 UI/ml): a 100 pl de la solución de heparina diluida primaria, se le añadieron con precisión 900 pl del tampón y se mezclaron. Además, se añadieron con precisión 950 pl del tampón y se mezclaron con 50 pl de dicha mezcla.

Solución de estándar de heparina: la solución de heparina diluida secundaria se diluyó y se mezcló tal como se muestra en la tabla 9.

Tabla 9. Serie de dilución

Preparación de especímenes (muestras de medición)

El polisacárido purificado se diluyó o disolvió con agua MilliQ de manera que la concentración de sustrato fuese de 2 pg/ml, a fin de obtener la solución diluida A.

Tabla 10

Procedimiento de medición

Se recogieron con precisión 200 pl de un espécimen en un microtubo para la medición y un espécimen blanco, respectivamente, y se incubaron y se sometieron a agitación a 37°C durante 4 minutos. Se añadieron los 100 pl de solución de factor Xa al microtubo para la medición, se mezclaron a fondo, se dejaron en reposo durante 30 segundos y después se incubaron a 37°C durante exactamente 30 segundos. Al microtubo para la medición, se le añadieron 200 pl de una solución de sustrato incubada preliminarmente a 37°C, se mezclaron a fondo, se dejaron en reposo durante 30 segundos y después se incubaron a 37°C durante exactamente 180 segundos. Se añadieron los 300 pl de una solución de parada de reacción a cada microtubo y se mezclaron inmediatamente. Se dispensaron 800 pl de la solución de reacción en una celda de UV y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm. De manera similar, se llevó a cabo la medición para las soluciones de estándar de heparina en la serie de dilución y se calculó una curva estándar a partir de las soluciones de estándares de heparina. Se obtuvo una actividad de antifactor Xa en el espécimen basándose en la curva estándar. Se definió como 1 UI/ml la concentración a la que se inhibía la coagulación de 1 ml de sangre durante 1 hora.

<Antifactor IIa>

Reactivo y kit utilizados

Solución de cloruro cálcico para medir el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) (0.025 moles/l, GMY-300A) fabricado por Sysmex.

Kit de tiempo de tromboplastina parcial activada FSL GAC-200A fabricado por Sysmex.

Plasma de control normal Dade Citrol nivel 1, GCA-110A, fabricado por Systemx.

Preparación de estándar de heparina de bajo peso molecular: preparación estándar de la Farmacopea japonesa (fabricada por Pharmaceutical and Medical Device Regulatory Science Society of Japan, Antifactor IIa: 670 UI)

Instrumento utilizado

aparato de medición semiautomática de la coagulación sanguínea (CA-104, fabricado por Sysmex) Procedimiento de medición

A una cubeta se le añadieron 10 pl de la solución estándar (serie de dilución de preparación estándar de heparina de bajo peso molecular) o una solución de la invención (solución de polisacárido purificado), 50 pl de actina y 50 pl del plasma de control; la cubeta se insertó inmediatamente en una unidad de detección y se cerró la puerta de protección de la luz. Tras someter a agitación durante 3 minutos, se añadieron 50 pl de una solución de cloruro cálcico desde una unidad de introducción. Se visualizó automáticamente un tiempo de coagulación. Se obtuvo una actividad antifactor IIa en la solución de la invención basada en la curva estándar calculada a partir de las soluciones estándar. Se definió como 1 Ul/ml la concentración a la que se inhibía la coagulación de 1 ml de sangre durante 1 hora.

<Método LPS>

Instrumento utilizado: Toxinometer ET-6000 (fabricado por Wako Pure Chemical)

Reactivos utilizados: reactivo de lisado (Limulus ES-11 Single Test Wako)

LPS estándar (JPSE10000)

Soluciones estándares de Lp S (EU/ml): 0.01, 0.1 y 1

Procedimientos de medición

En un ES-11 Single Test Wako, se distribuyeron 20 pl de una solución estándar de LPS o una solución de la invención (solución de polisacárido purificado), que se sometió a agitación utilizando un mezclador durante 5 segundos. Tras confirmar que no había burbujas de aire grandes en el tubo, se introdujo un éster en la posición 1 del Toxinometer (se inicia automáticamente la medición). Se obtuvo el tiempo para que la transmitancia alcanzase el 94.9% y se obtuvo la concentración de LPS en la solución de la invención basándose en la curva estándar calculada a partir de las soluciones estándar de LPS.

<Análisis de proteínas>

Instrumento utilizado:

Lector de placas (SPECTRA NAX190, fabricado por Molecular Devices)

Reactivos utilizados:

Solución de NaOH/Na2CO3: se disolvieron 2 g de NaOH y 10 g de Na2CO3 en agua hasta que el volumen total fuese de 500 ml.

Solución de sulfato de cobre/tartrato de Na: se disolvieron 2.5 g de pentahidrato de sulfato de cobre y 5,96 g de dihidrato de tartrato sódico en agua hasta que el volumen total fuese de 500 ml.

Solución alcalina de sulfato de cobre: se mezclaron 5 ml de la solución de NaOH/Na2CO3 y 1 ml de la solución de sulfato de cobre/tartrato de Na (recién preparada)

Solución acuosa de Folin: el reactivo de Folin fabricado por Aldrich (F9252-100 ml) se diluyó dos veces con agua.

Solución estándar de albúmina: se utilizó la solución estándar (2 mg/ml) fabricada por Thermo Scientific y se diluyó a 0.125, 0.25, 0.5 y 1 mg/ml.

Procedimiento de medición

En un microtubo de 1.5 ml se dispensaron 20 |jl de la solución estándar de albúmina o la solución de la invención (solución de polisacárido purificado) y 300 j l de la solución alcalina de sulfato de cobre; la mezcla se sometió a agitación con un mezclador y a continuación se dejó en reposo durante 10 minutos. Además, se añadieron 30 j l de la solución acuosa Folin y la mezcla se sometió a agitación y a continuación se dejó en reposo durante 30 minutos. Se introdujeron 300 j l de la solución resultante de color revelado en una placa de 96 pocillos y se obtuvo la absorbancia a 750 nm. Se obtuvo la concentración de proteína en la solución de la invención basándose en la curva estándar calculada a partir de las soluciones estándar de albúmina.

<Análisis de disacáridos>

Se analizó la composición de disacáridos mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5 para calcular la contenido en porcentaje de GlcA-GlcN(NS3S6S).

<Medición del peso molecular medio>

Se llevó a cabo el análisis de GPC utilizando marcadores de peso molecular de pululano como estándar siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 4 para calcular los pesos moleculares medios (Mn y Mw).

Ejemplo 11: control de la obtención de bajo peso molecular mediante N-desacetilación parcial del heparosano

(1) N-desacetilación del heparosano

1) A 100 mg de heparosano, se le añadieron 5 ml de hidrazina-^O y 385 j l de ácido sulfúrico 1 N, y tras sustituir la fase gaseosa por nitrógeno, la mezcla se calentó a 100°C y se hizo reaccionar durante 0 a 4.75 horas.

2) Tras detener la reacción mediante enfriamiento con hielo, se añadieron 5 ml de solución acuosa de NaCl al 16% y 50 ml de MeOOH y la mezcla se centrifugó. Se separó el sobrenadante. El precipitado resultante se disolvió en 50 ml de H2O y después se desaló y se concentró utilizando una membrana de UF Amicon (de 3 kDa).

3) A la solución concentrada resultante se le añadió dos veces el volumen de H2O y el volumen equivalente de NaHCO3 1 M y después la solución de I20.2 M/KI 0.4 M se añadió gota a gota hasta obtener un color amarillo. A continuación, se añadió gota a gota hidrazina-^O para reducir el exceso de yodo a ion yodo y después se desaló la mezcla y se concentró nuevamente utilizando una membrana de UF Amicon (de 3 kDa) nuevamente. La solución concentrada se secó bajo presión reducida, obteniendo heparosano N-desacetilado.

4) Una parte del heparosano N-desacetilado obtenido se N-sulfató y después se analizó mediante análisis de disacáridos para obtener la tasa residual de grupos N-acetilados. Se muestran los procedimientos a continuación.

<N-sulfatación>

Los 20 mg del heparosano N-desacetilado se disolvieron en 1 ml de agua MilliQ y se añadió a los mismos 1 ml de una solución de 20 mg/ml de NaHCO3/20 mg/ml de trimetilaminaSO3.

La solución se hizo reaccionar a 55°C durante la noche y se añadieron 5.7 ml de MeOH a la solución reaccionada, que a continuación se centrifugó para precipitar el heparosano N-sulfatado. El sedimento resultante se secó al aire, proporcionando heparosano N-sulfatado.

<Análisis de disacáridos>

El análisis de disacáridos se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 4.

El curso temporal de las tasas residuales de los grupos N-acetilados se muestra en la figura 1. En el heparosano N-desacetilado, 4.75 horas después de iniciar la reacción de N-desacetilación, se confirmó que se mantenían grupos N-acetilados en 12.5% de los esqueletos de glucosamina.

<Obtención de bajo peso molecular del heparosano N-desacetilado>

1) Los 5 mg de heparosano N-desacetilado obtenidos en el ejemplo 4 y que presentaban una tasa residual de grupos N-acetilados de 12.5% y 10 |jl de heparinasa III 31.3 mUI/pl se disolvieron en 500 |jl de solución tamponada con Tris (pH 8.0) que contenía NaCl 100 mM y CaCh 1.5 mM y la mezcla se hizo reaccionar a 37°C durante un periodo de tiempo de entre 0 y 21 horas.

2) A la solución de reacción se le añadieron 500 j l de solución acuosa de NaCl al 16% y 4.5 ml de EtOH y se mezclaron; se centrifugó la solución y se eliminó el sobrenadante, obteniendo heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido.

3) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido

1) El heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido obtenido en el ejemplo 11(2) se disolvió en 200 j l de agua MilliQ y se añadieron a los mismos 200 j l de una solución acuosa de 20 mg/ml de NaHCO3/20 mg/ml de trimetilaminaSO3. La solución se hizo reaccionar a 55°C durante la noche.

2) Se añadieron los 4.5 ml de EtOH y se mezclaron, y la mezcla se centrifugó para eliminar el sobrenadante, obteniendo heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado.

3) El heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado obtenido se disolvió en 500 j l de agua MilliQ y se llevó a cabo el análisis de disacáridos para obtener su rendimiento respecto al heparosano N-desacetilado. Asimismo se llevó a cabo el análisis de CPG para obtener la distribución de pesos moleculares. Se muestran los procedimientos a continuación.

<Análisis de disacáridos>

El análisis de disacáridos se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 4. Asimismo en este tiempo se confirmó que 99% o más de los grupos amino producidos mediante N-desacetilación se encontraban N-sulfatados en el heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado.

<Análisis de CPG>

El análisis de CPG se llevó a cabo bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 4.

Los rendimientos y curso temporal de los pesos moleculares medios se muestran en la tabla 11 y en la figura 3. Como resultado de la representación gráfica de Mn y Mw en escala logarítmica, Mn y Mw se reducen linealmente durante 4.8 horas y 5.3 horas, respectivamente, y posteriormente resultaron constantes o mostraron un ligero decrecimiento. Los pesos moleculares medios, al resultar constante o mostrar un ligero decrecimiento los pesos moleculares, se encontraban comprendidos dentro del intervalo de los valores diana (en un caso, pesos moleculares según el análisis de CpG: 15000<Mn<30000, 21000<Mw<41000). De esta manera, se encontró que el sitio del residuo de glucosamina que presentaba el grupo N-acetilado era selectivamente escindido, tal como se había supuesto (reconocimiento de sustrato por la heparinasa III: NAc>>NH2). Además, el rendimiento siempre tendió a decrecer. De esta manera, se demostró que la reacción de obtención de un bajo peso molecular se detuvo a las 5.3 horas al resultar constante o mostrar un ligero decrecimiento el Mw bajo estas condiciones, minimizando de esta manera la reducción de los rendimientos y obteniendo unos con el peso molecular diana.

Tabla 11

Ejemplo 12: acortamiento del tiempo de reacción de obtención de un bajo peso molecular con una cantidad incrementada de heparinasa III

El heparosano N-desacetilado con una tasa residual de grupos N-acetilados de 12.5% obtenido en el ejemplo 4 se sometió a la reducción del peso molecular y a la N-sulfatación para preparar heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado. Las condiciones para la obtención de un bajo peso molecular y la N-sulfatación son las mismas que las condiciones en el ejemplo 11, excepto en que la cantidad de heparinasa III que debía utilizarse era 10 veces la cantidad en el ejemplo 11 (se utilizaron 10 j l de solución de heparinasa III 313 mUI/jl en lugar de 10 j l de solución de heparinasa III 31.3 mUI/jl). Para el heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado, los rendimientos y la distribución de pesos moleculares se obtuvo con las mismas técnicas que en el ejemplo 11. Los rendimientos y curso temporal de los pesos moleculares medios se muestran en la tabla 12 y en la figura 4. Se observó un exceso de reducción del peso molecular en el punto temporal de 2.5 horas. Lo anterior se cree que se debe a que el sitio del residuo de glucosamina que no presenta ningún grupo N-acetilado (residuo de glucosamina N-desacetilado) asimismo empezó a ser descompuesto por la heparinasa III. De esta manera, se cree que existe un tiempo de reacción óptimo de reducción del peso molecular entre 0.4 y 2.5 horas bajo dichas condiciones. Se demostró que el tiempo de reacción de reducción del peso molecular podía acortarse con una cantidad incrementada de heparinasa III. Tal como se ha indicado anteriormente, puede seleccionarse apropiadamente un tiempo de reacción adecuado según la cantidad de heparinasa III que deba utilizarse.

Tabla 12

Ejemplo 13: reducción del peso molecular del heparosano N-sulfatado que presenta una tasa residual elevada de grupos acetilo

(1) N-desacetilación del heparosano

1) A 120 mg de heparosano se le añadieron 6 ml de NaOH 2 M y la mezcla se calentó a 48°C y se hizo reaccionar durante 4.1 horas.

2) Tras detener la reacción mediante la adición de 12 ml de HCl 6 N, se añadieron 45 ml de MeOH; a continuación, la mezcla se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. El sedimento resultante se disolvió en 8 ml de NaHCO3 0.25 M y después la solución se desaló y se concentró utilizando una membrana Amicon UF (3 kDa) para obtener 6 ml de solución de heparosano N-desacetilado. La tasa residual de grupos acetilos en el heparosano N-desacetilado obtenido era de 27.6% (indicada posteriormente).

2) Obtención de bajo peso molecular mediante reacción de la heparinasa III

Los 6 ml de la solución de heparosano N-desacetilado que presentaban 27.6% de tasa residual de grupos N-acetilo obtenida en (1), anteriormente, y 221 pl de solución de heparinasa III 10 mUI/pl se mezclaron con 0.6 ml de solución tampón de Tris (pH 8.0) que contenía NaCl 1 M y CaCh 15 mM; después se añadió agua MilliQ a lo anterior, llevando el volumen total a 12 ml, y la mezcla se hizo reaccionar a 37°C durante 8 horas. A la solución de reacción se le añadieron 86 ml de EtOH y se mezclaron; se centrifugó la solución y se eliminó el sobrenadante, obteniendo heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido.

3) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido

1) La cantidad total de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido obtenida en (2), anteriormente, se disolvió en 6 ml de agua MilliQ; se añadieron a lo anterior 6 ml de una solución acuosa de 20 mg/ml de NaHCO3/20 mg/ml de trimetilaminaSO3, y la mezcla se hizo reaccionar a 55°C durante la noche.

2) Se añadieron los 86 ml de EtOH a lo anterior y se mezclaron, y la mezcla se centrifugó y se eliminó el sobrenadante, obteniendo heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado.

3) Los pesos moleculares medios del heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado obtenidos se calcularon siguiendo las mismas técnicas que en el ejemplo 4.

Ejemplo 14: control del peso molecular del heparosano N-sulfato de peso molecular reducido según la tasa residual de grupos N-acetilo

(1) N-desacetilación del heparosano

El heparosano se sometió a una reacción de N-desacetilación de la misma manera que en el ejemplo 13 y se obtuvo heparosano N-desacetilado con una tasa residual de grupos N-acetilo de entre 2.6% y 29.6% mediante el control del tiempo de reacción.

2) Obtención de bajo peso molecular mediante reacción de la heparinasa III

El heparosano N-desacetilado obtenido en (1), anteriormente, se hizo reaccionar con heparinasa III bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 13, obteniendo heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido. (3) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido

El heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido obtenido en (2), anteriormente, se sometió a una reacción de N-sulfatación bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 13, obteniendo heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido.

4) Resumen de pesos moleculares medios

Los pesos moleculares medios del heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado obtenido se calcularon siguiendo la misma técnica que en el ejemplo 4. Los rendimientos y pesos moleculares medios resultantes (en términos de pululano) se muestran en la tabla 13.

A partir de los resultados en la tabla 13 se mostró que podía controlarse el peso molecular para reducirlo mediante el incremento de la tasa residual de grupos N-acetilo.

Tabla 13

Ejemplo 15: preparación de heparosano N-sulfatado de peso molecular reducido para el examen de la diferencia de actividad debido a diferencias de peso molecular

Debido a que la cantidad residual de grupos N-acetilo afecta a la actividad del heparán sulfato, con el fin de examinar el efecto de la diferencia de pesos moleculares sobre la actividad, se prepararon muestras de heparosano N-sulfato de peso molecular reducido con la misma cantidad residual de grupos N-acetilo y diferente peso molecular. Se controló el peso molecular con el tiempo de reacción para la reacción de obtención de bajo peso molecular.

(1) N-desacetilación del heparosano

El heparosano se sometió a una reacción de N-desacetilación de la misma manera que en el ejemplo 13, obteniendo heparosano N-desacetilado con una tasa residual de grupos N-acetilo de 29.4%.

(2) Obtención de bajo peso molecular mediante reacción de la heparinasa III

La reducción del peso molecular del heparosano N-desacetilado obtenido en (1), anteriormente, se hizo reaccionar con heparinasa III bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 13. Se controló el peso molecular mediante modificación de la cantidad aditiva de oxígeno y el tiempo de reacción hasta obtener cuatro tipos de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido.

(3) N-sulfatación de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido

Los cuatro tipos de heparosano N-desacetilado de peso molecular reducido obtenidos en (2), anteriormente, se sometieron a una reacción de N-sulfatación bajo las mismas condiciones que en el ejemplo 13, obteniendo heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado. (4) Los rendimientos y la distribución de pesos moleculares del heparosano de peso molecular reducido N-sulfatado obtenido se calcularon siguiendo las mismas técnicas que en el ejemplo 4.

Tabla 14

Ejemplo 16: preparación de polisacáridos sulfatados que presentan diferente peso molecular

(1) Expresión y purificación de C5 epimerasa

Como C5 epimerasa, se utilizó la proteína de fusión (PUM*-C5 epimerasa (G101)) del sitio catalítico de la C5 epimerasa de origen humano (Gly101 a Asn617) y la proteína de unión a maltosa con sustitución de tres aminoácidos en el extremo C-terminal (PUM*, informe anterior (Rob J. Center, et. al., "Cristallization of a trimeric human T cell leukemia virus type 1 gp21 ectodomain fragment as a chimera with maltose-binding protein", Protein Science, 7, 1612-1619, 1998)).

Se muestran los detalles de la construcción del plásmido de expresión a continuación. En primer lugar, se obtuvo un fragmento de ADN de la región C-terminal de PUM* mediante PCR con pMAL-c2X (SEC ID n° 20, New England BioLabs) como ADN molde utilizando los oligonucleótidos de SEC ID n° 31 y n° 32 como cebadores. En la reacción de PCR anteriormente indicada, se añadió un sitio de reconocimiento para el enzima BgllI al extremo 5' y se añadieron sitios de reconocimiento para los enzimas de restricción HindlII, BamHI, SacI, Xhol y Notl al extremo 3'. El plásmido de ADN pMAL-c2x y el fragmento de ADN de la región C-terminal de PUM* se escindieron con BgllI e HindlII y se ligaron, obteniendo el plásmido pMAL-PUM* La secuencia de nucleótidos del plásmido pMAL-PUM* se muestra en la SEC ID n° 33.

Se obtuvo un fragmento de la C5 epimerasa (G101) mediante PCR con el plásmido pMAL-c2X-PUM-C5epi preparado en el ejemplo 5 como ADN molde utilizando los oligonucleótidos de SEC ID n° 34 y n° 35 como cebadores. En dicha PCR, se añadió un sitio de reconocimiento para el enzima de restricción NotI al extremo 5' y se añadió un sitio de reconocimiento para el enzima de restricción XhoI al extremo 3'. Se escindieron el plásmido de ADN pMAL-c2x-MBP-C5epi y el fragmento de ADN de la C5 epimerasa (G101) con NotI y XhoI y se ligaron, obteniendo el plásmido pMAL-MBP*-C5epi (G101). La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Gly101 a Asn617) de la C5 epimerasa) y la secuencia de aminoácidos codificada de esta manera se muestran en las SEC ID n° 36 y n° 37, respectivamente. El plásmido de expresión pMAL-PUM*-C5epi (G101) y el plásmido de expresión de chaperonina, pGro7 (TaKaRa), se introdujeron en la cepa de Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) siguiendo el mismo método que en el ejemplo 5, obteniendo la cepa Origami B(DE3)/pMAL-PUM*-C5epi (G101)/pGro7. Se preparó una solución de extracto de células microbianas utilizando dicha cepa siguiendo el mismo método que en el ejemplo 5.

(2) Expresión y purificación de enzima de 2-O-sulfatación (2-OST)

Como enzima de 2-O-sulfatación, se utilizó una proteína de fusión del sitio catalítico (Asp68 a Asn356) del mutante de 2-OST derivado de hámster chino con sustitución del residuo tirosina en la posición 94 por isoleucina y PUM* (PUM*-2-OST (D68)).

Se muestran los detalles de la construcción del plásmido de expresión a continuación. Se obtuvo un fragmento de ADN de 2-OST (D68) mediante PCR con el plásmido pMAL-c2X-PUM-MBP-2OST preparado en el ejemplo 5 como ADN molde utilizando los oligonucleótidos de SEC ID n° 38 y n° 39 como cebadores. En dicha PCR, se añadieron los sitios de reconocimiento para los enzimas de restricción NotI y XhoI al extremo 5' y al extremo 3', respectivamente. El ADN del plásmido pMAL-c2x-MBP-2OST y el fragmento de ADN de 2-OST (D68) se escindieron con NotI y XhoI y se ligaron, obteniendo el plásmido pMAL-MBP*-2OST (D68). La secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Asp68 a Asn356) de 2-OST) y la secuencia de aminoácido codificada de esta manera se muestran en las SEC ID n° 40 y n° 41, respectivamente. El plásmido de expresión de PUM*-2-OST (D68), pMAL-PUM*-2OST (D68), y el plásmido de expresión de chaperonina, pGro7 (TaKaRa), se introdujeron en la cepa de Escherichia coli Origami B (DE3) (Novagen) siguiendo el mismo método que en el ejemplo 5, obteniendo la cepa Origami B(DE3)/pMAL-PUM*-2OST (D68)/pGro7. Se preparó proteína 2-OST purificada utilizando dicha cepa siguiendo el mismo método que en el ejemplo 5.

(3) Reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación

A 68.9 ml de una solución mixta que contenía 14 mg de heparosano N-sulfatado n° 1, n° 2 o n° 3 preparado en el ejemplo 15, se le añadió MES 50 mM (pH 7.0), NaCl 100 mM y PAPS 0.5 mM como composición de solución de reacción, se añadieron 0.7 ml de la solución de extracto de las células microbianas que expresaban C5 epimerasa a una concentración final de 0.09 mg/ml y 0.4 ml de proteína 2-OST purificada a una concentración final de 0.07 mg/ml a fin de preparar una solución de reacción en un volumen total de 70 ml, que a continuación se hizo reaccionar a 37°C durante 10 horas.

Se analizó la composición de disacáridos contenida en el producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Las estructuras de disacárido calculadas y la proporción de las mismas se muestran en la tabla 15. En la tabla, se omitieron los datos de picos no identificados que se creía que incluían derivados de disacárido y similares que presentaban el grupo N-acetilo, y se fijó en 100% la cantidad total de GlcA(2S)-GlcN(NS), IdoA(2S)-GlcN(NS), GlcA-GlcN(NS) y IdoA-GlcN(NS).

Tabla 15. Contenido en porcentaje (%) de la composición de disacáridos en el producto de reacción mediante reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación.

(4) Reacción de epimerización en C5

A 5.4 ml de una solución mixta que contenía 14 mg de heparosano N-sulfatado n° 1, n° 2 o n° 3 preparada en el ejemplo 15, MES 50 mM (pH 7.0) y NaCl 100 mM como composición de solución de reacción, se le añadieron 0.6 ml de la solución de extracto de las células microbianas que expresaban C5 epimerasa a una concentración final de 1.0 mg/ml a fin de preparar una solución de reacción en un volumen total de 5 ml, que a continuación se hizo reaccionar a 37°C durante 24 horas. Se utilizó la misma C5 epimerasa que la utilizada en el ejemplo 16(1). Se analizó la composición de disacáridos contenida en el producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Las estructuras de disacárido calculados y sus tasas se muestran en la tabla 16.

Tabla 16. Contenido en porcentaje (%) de la composición de disacáridos en el producto de reacción mediante reacción de epimerización en C5

(5) Reacción de 6-O-sulfatación

Se purificaron las soluciones de reacción enzimática obtenidas n° 4 a n° 9 (soluciones de reacción después de la reacción acoplada de epimerización en C5 y 2-O-sulfatación, o las soluciones de reacción después de únicamente la reacción de epimerización en C5) y se 6-O-sulfataron siguiendo los mismos procedimientos que en el ejemplo 6, obteniendo soluciones concentradas lavadas.

(6) Reacción de 3-O-sulfatación

Se preparó una solución de reacción en la misma composición de solución de reacción que en el ejemplo 7 y en una cantidad total de 300 pl, incluyendo cada una 80 pg del producto de reacción obtenido de la reacción de 6-O-sulfatación y se hizo reaccionar a 37°C durante 24 horas. Se analizó la composición de disacáridos contenida en el producto de reacción mediante descomposición con ácido nitroso siguiendo el mismo procedimiento que en el ejemplo 5. Las estructuras de disacárido calculadas y la proporción de las mismas se muestran en la tabla 17. En la tabla, se omitieron los datos de los picos no identificados, y se fijó la cantidad total de unidades de disacárido mostradas en la tabla en 100%.

Tabla 17. Composición de disacáridos de los productos de reacción mediante reacción de 3-O-sulfatación

(7) Actividad anticoagulante de los polisacáridos purificados

Los productos de reacción de la reacción de 3-O-sulfatación se purificaron según el mismo procedimiento que en el ejemplo 8 y se midió su actividad anticoagulante. Se muestran los resultados en la tabla 18.

Tabla 18. Calidad de los polisacáridos purificados

Explicación del listado de secuencias

SEC ID n° 1 Secuencia de nucleótidos del operón kfiABCD de la cepa de Escherichia coli K5

SEC ID n° 2 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiA de la cepa de Escherichia coli K5

SEC ID n° 3 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiB de la cepa de Escherichia coli K5

SEC ID n° 4 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiC de la cepa de Escherichia coli K5

SEC ID n° 5 Secuencia de aminoácidos de la proteína KfiD de la cepa de Escherichia coli K5

SEC ID n° 6 y n° 7 Cebadores

SEC ID n° 8 Secuencia de nucleótidos del fragmento PaeI-SalI, que incluía el promotor de tipo salvaje nlpD (Pnlp0)

SEC ID n° 9 y n° 10 Cebadores

SEC ID n° 11 Secuencia de nucleótidos del terminador rrnB

SEC ID n° 12 a n° 15 Cebadores

SEC ID n° 16 Secuencia de nucleótidos del gen hepC de Flavobacterium heparinum ATCC 13125

SEC ID n° 17 Secuencia de aminoácidos de la proteína HepC de Flavobacterium heparinum ATCC 13125 SEC ID n° 18 y n° 19 Cebadores

SEC ID n° 20 pMAL-c2x

SEQ ID n° 21 y n° 22 Cebadores

SEC ID n° 23 Secuencia de nucleótidos del fragmento insertado de C5 epimerasa (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico de la C5 epimerasa de origen humano)

SEC ID n° 24 Secuencia de aminoácidos del sitio catalítico de la C5 epimerasa de origen humano

SEC ID n° 25 y n° 26 Cebadores

SEC ID n° 27 Secuencia de nucleótidos de fragmento insertado de 2-OST (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico del mutante de 2-OST derivado de hámster chino)

SEC ID n° 28 Secuencia de aminoácidos del sitio catalítico del mutante de 2-OST derivado de hámster chino SEC ID n° 29 Secuencia de aminoácidos de 3-OST-1 derivado de ratón

SEC ID n° 30 Secuencia de nucleótidos optimizada para el uso de los codones en Escherichia coli y codificante del sitio catalítico (Gly48 a His311) de 3-OST-1 derivado de los cebadores de ratón SEC ID n° 31 y n° 32 SEC ID n° 33 pMAL-PUM*

SEC ID n° 34 y n° 35 Cebadores

SEC ID n° 36 Secuencia de nucleótidos del fragmento insertado de la C5 epimerasa (G101) (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Gly101 a Asn617) de la C5 epimerasa de origen humano) SEC ID n° 37 Secuencia de aminoácidos del sitio catalítico (Gly101 a Asn617) de la C5 epimerasa de origen humano SEC ID n° 38 y n° 39 Cebadores

SEC ID n° 40 Secuencia de nucleótidos del fragmento insertado de 2-OST (D68) (secuencia de nucleótidos codificante del sitio catalítico (Asp68 a Asn356) del mutante de 2-OST derivado de hámster chino)

SEC ID n° 41 Secuencia de aminoácidos del sitio catalítico (Asp68 a Asn356) del mutante de 2-OST derivado de hámster chino

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Método de producción de heparán sulfato que presenta una actividad anticoagulante, que comprende:

(A) N-desacetilar parcialmente un heparosano para producir un heparosano N-desacetilado, en el que dicha (A) se lleva a cabo de manera que una tasa residual de grupos N-acetilados es 1% a 33%;

(B) tratar el heparosano N-desacetilado con heparinasa III para escindir el heparosano N-desacetilado, y (C) sulfatar el heparosano N-desacetilado escindido para producir el heparán sulfato que presenta la actividad anticoagulante.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha (A) se lleva a cabo de manera que una tasa residual de grupos N-acetilados es 11% a 30%.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que un peso molecular medio en peso de dicho heparán sulfato es 5000 a 100000 en términos de pululano.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un peso molecular medio en peso de dicho heparán sulfato es 8000 a 41000 en términos de pululano.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha (C) comprende una o más etapas seleccionadas de entre N-sulfatación, epimerización en C5, 2-O-sulfatación, 3-O-sulfatación en residuos de a-D-glucosamina y 6-O-sulfatación de un producto producido mediante dicha (B).

6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha (C) comprende por lo menos la N-sulfatación, la 3-O-sulfatación en residuos de a-D-glucosamina y la 6-O-sulfatación del producto producido mediante dicha (B).

7. Método según la reivindicación 5, en el que dicha etapa (C) comprende las etapas de la N-sulfatación, la epimerización en C5, la 2-O-sulfatación, la 3-O-sulfatación en residuos de a-D-glucosamina y la 6-O-sulfatación del producto producido mediante dicha etapa (B).

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha (C) se lleva a cabo en un orden de las (C1), (C2) y (C3) siguientes:

(C1) la N-sulfatación,

(C2) la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación, y

(C3) la 3-O-sulfatación en residuos de a-D-glucosamina y la 6-O-sulfatación.

9. Método según la reivindicación 8, en el que la epimerización en C5 y la 2-O-sulfatación se llevan a cabo simultáneamente en una parte de un periodo o en todo un periodo en dicha (C2).

10. Método según la reivindicación 8 o 9, en el que dicha (C3) se lleva a cabo en un orden de la 3-O-sulfatación en residuos de a-D-glucosamina y la 6-O-sulfatación.

11. Método según la reivindicación 8 o 9, en el que dicha (C3) se lleva a cabo en un orden de la 6-O-sulfatación y la 3-O-sulfatación en residuos de a-D-glucosamina.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el tratamiento del heparosano N-desacetilado con heparinasa III se lleva a cabo únicamente después de la etapa de N-desacetilar parcialmente el heparosano y antes de la etapa de N-sulfatar el heparosano N-desacetilado tratado con heparinasa III.