JP5344783B2 - サメ軟骨のコンドロイチン硫酸由来の硫酸化八糖 - Google Patents

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Description

本発明は、サメ軟骨のコンドロイチン硫酸由来の新規硫酸化八糖に関する。本発明は特に、糖鎖の構造及び機能の研究解析において、及びその医療等への応用分野において有用な技術を提供するものである。
尚、本明細書並びに図面において使用される主要な略号の意味は以下のとおりである。
PG：プロテオグリカン、GAG：グリコサミノグリカン、CS：コンドロイチン硫酸、mAb：モノクローナル抗体（単クローン抗体）、DPPE：L-α-Dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine、MALDI-TOF/MS：マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析、BSA：ウシ血清アルブミン、PBS：リン酸緩衝液、GlcUA：D-グルクロン酸、GalNAc：N-アセチルD-ガラクトサミン、HexUA：ヘキスロン酸、Δ4,5HexUA（ΔHexUA）：4-deoxy-L-threo-hex-4-enepyranosyluronic acid、HPLC：高速液体クロマトグラフィー、2AB：2-アミノベンズアミド、ΔO：ΔHexUAα1-3GalNAc、ΔC：ΔHexUAα1-3GalNAc(6-O-硫酸)、ΔA：ΔHexUAα1-3GalNAc(4-O-硫酸)、ΔD：ΔHexUA(2-O-硫酸)α1-3GalNAc(4-O-硫酸)、ΔE：ΔHexUAα1-3GalNAc(4,6-O-二硫酸)。
ヘパラン硫酸 (HS) と同様に、コンドロイチン硫酸 (CS) やデルマタン硫酸 (DS) はグリコサミノグリカン (GAG) の一種であり、コアタンパク質に共有結合した形でプロテオグリカン (PG) として合成され（非特許文献1-3）、あらゆる組織の細胞表面や細胞外マトリックスに存在している。さらに、こうしたCS/DS-PGsは、哺乳類の脳の構成成分であり、神経細胞の接着、移動、分化、神経突起形成や軸索誘導などの調節を通して、神経の発生に関与している（非特許文献4-8）。
CSとDSの骨格構造は、それぞれ [-GlcUA-GalNAc-]、[-IdoUA-GalNAc-] (GlcUA、GalNAc、IdoUAはそれぞれグルクロン酸、N-アセチルガラクトサミン、イズロン酸を示す) の二糖繰り返し構造から成る。さらに、これらの構造を様々な割合で有するハイブリッド糖鎖も存在する（非特許文献9）。これらの二糖単位中では様々な組み合わせで、GlcUA/IdoUAの2位やGalNAcの4位、6位が硫酸化修飾を受けている。それらの修飾によってCS、DS、CS/DSハイブリッド糖鎖は特徴的な硫酸化パターンを有し、さらには構造の膨大な多様性を有することになる。
最近の研究によって、脳におけるCS/DSのGlcUA/IdoUAの存在比、硫酸化パターンが個体発生に伴って変化し（非特許文献10-12）、神経突起生成において、異なった構造の糖鎖のサブポプュレーションが異なった役割を担っていることが示されている （非特許文献13-15）。さらに、様々な海産動物由来の多硫酸化CS/DS鎖は、in vitroでマウス海馬ニューロンの神経突起伸長促進活性を有する（非特許文献16-19）。例えば、サメ皮膚から単離されたCS/DSハイブリッド糖鎖は、増殖因子と結合し、神経突起生成活性を有する。これらの知見は、発生段階において出現する異なった構造の糖鎖が増殖因子などの他の分子とそれぞれ特異的・選択的に相互作用し、各発生段階で異なる生理機能を発揮していることを示唆している。
このようにコンドロイチン硫酸などの糖鎖が、その種々の構造に応じてそれぞれ特有の生理機能を有することが近年徐々に明らかにされつつある。コンドロイチン硫酸には、主にCS-A、CS-C、CS-DおよびCS-Eの４種類が知られており、それぞれ、A-ユニット[GlcUAβ1-3GalNAc(4S)]、C-ユニット[GlcUAβ1-3GalNAc(6S)]、D-ユニット[GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)]、およびE-ユニット[GlcUAβ1-3GalNAc(4S,6S)]の二糖単位を他よりも多く含む。これらの二糖単位の配列構成によってＣＳ鎖の構造上の多様性、さらには機能上の多様性が生ずると考えられるが、コンドロイチン硫酸の構造、及びその機能との相関については、現在までごく限られた研究しかなされていない（非特許文献16など）。コンドロイチン硫酸の構造と機能に関する研究を今後もなお一層精力的に進めることは、哺乳類の中枢神経系の形成・発達における糖鎖の役割や、増殖因子等の作用機構における糖鎖の役割を解明する上において非常に重要である。更にその研究成果を利用した創薬、疾病の診断法の開発など医療等への応用も期待される。
The Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz, W. J., ed.), pp. 267-371, Plenum Publishing, New York (1980) Annu. Rev. Biochem. 47, 385-417 (1991) Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 321-349 (2000) Persp. Dev. Neurol. 3, 319-330 (1996) Physiol. Rev. 80, 1267-1290 (2000) Arch. Biochem. Biophys. 374, 24-34 (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 13, 612-620 (2003) Glycoconj. J. 21, 329-341 (2004) IUBMB Life 54, 177-180 (2002) J. Biol. Chem. 272, 31377-31381 (1997) J. Biol. Chem. 279, 9765-9776 (2004) J. Biol. Chem. 278, 35805-35811 (2003) J. Cell Biol. 126, 783-799 (1994) J. Biol. Chem. 273, 28444-28453 (1998) J. Biol. Chem. 280, 9180-9191 (2005) J. Biol. Chem. 273, 3296-3307 (1998) Neurosci. Lett. 269, 125-128 (1999) J. Biol. Chem. 278, 43744-43754 (2003) J. Biol. Chem. 280, 4058-4069 (2005)
本発明は、種々の生物活性をもつコンドロイチン硫酸の構造と機能を解明するための研究用試薬として有用な新規硫酸化オリゴ糖を提供することをその課題とする。新規硫酸化オリゴ糖は、その配列又は構造と相互作用するタンパク質の探索などに有用である。また、複数の新規硫酸化オリゴ糖の構造を決定し、硫酸化オリゴ糖鎖ライブラリーを構築することによって、これらの糖鎖を抗コンドロイチン硫酸抗体のエピトープ解析に利用することができる。
本発明者は、サメ軟骨のコンドロイチン硫酸多糖鎖（CS-C）を出発材料とし、精巣由来のヒアルロニダーゼを用いて断片化して得られた八糖画分を陰イオン交換クロマトグラフィーでさらに分画することによって調製された硫酸化オリゴ糖鎖の構造解析を行った。その結果、従来報告のない１７種類の新規硫酸化八糖の構造を決定すると共に、これらの新規硫酸化八糖が、CS-56、MO-225、2H6およびLY111といった種々の抗コンドロイチン硫酸抗体（単クローン抗体）のエピトープ解析に実際に有用であること等を見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明に係る硫酸化オリゴ糖は、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸から単離され、八糖構造を有する硫酸化オリゴ糖である。本発明の硫酸化オリゴ糖には、二糖単位が以下のように配列された八糖構造を含む１７種類の硫酸化オリゴ糖が含まれる。
（１）C-C-C-O
（２）C-O-A-C
（３）C-O-A-A
（４）C-C-A-C
（５）C-C-A-A
（６）C-A-C-C
（７）D-C-C-C
（８）C-D-C-C
（９）C-D-C-A
（１０）A-D-C-C
（１１）C-C-C-D
（１２）C-D-A-A
（１３）C-C-A-D
（１４）D-C-A-C
（１５）D-A-C-C
（１６）C-A-C-D
（１７）C-E-C-C
ここで、上記O、C、A、D及びEはいずれも二糖単位の略号であり、
Oは、[GlcUAβ1-3GalNAc]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン］、
Cは、[GlcUAβ1-3GalNAc(6S)]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン(6-O-硫酸)］、
Aは、[GlcUAβ1-3GalNAc(4S)]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン(4-O-硫酸)］、
Dは、[GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)]、即ち、［グルクロン酸β1(2-O-硫酸)−3N-アセチルガラクトサミン(6-O-硫酸)］、
Eは、[GlcUAβ1-3GalNAc(4S,6S)]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン(4-O-硫酸, 6-O-硫酸)］、の二糖構造をそれぞれ意味する。
後述の実施例に示すように、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸から単離された本発明の硫酸化オリゴ糖は、その配列又は構造の相違に応じて、抗コンドロイチン硫酸抗体（CS-56、MO-225、2H6およびLY111）と異なる反応性を示し、有用な抗糖鎖抗体のエピトープ構造の解析に利用できることが分かった。
このように、本発明の硫酸化オリゴ糖は、生体内に実際に存在し、複数の抗コンドロイチン硫酸抗体によって互いに異なるパターンで認識されることが示された硫酸化オリゴ糖であり、その構造をもとに、当該オリゴ糖の化学合成、酵素による合成などが可能となる。さらに、当該オリゴ糖に蛍光タグなどを結合させた種々の誘導体の合成や、タンパク質、脂質、核酸など他の分子との複合体の合成が可能である。これらの合成物は、当該オリゴ糖と相互作用する物質を探索するためのプローブとして利用することができる。例えば後述のように、本発明の硫酸化オリゴ糖を脂質と結合させてニトロセルロース膜上に固定し、当該オリゴ糖に結合する物質を高感度にハイスループットで検出するプローブとして利用できる。このようなプローブは、コンドロイチン硫酸を含めた糖鎖全般の構造及び機能の研究解析において有用であり、グライコミクス、糖鎖生物学、糖鎖工学など糖鎖研究の諸分野において有用な研究ツールを提供するものである。
また、本発明の硫酸化オリゴ糖は、医療等への応用分野において有用な技術を提供することができる。例えば、種々の機能性タンパク質との結合解析を通じて得られた糖鎖の機能に関する研究成果を利用した創薬、疾病の診断法の開発などが挙げられる。本発明者は先に、他の硫酸化オリゴ糖が、繊維芽細胞増殖因子2（FGF2）、プレイオトロフィン（PTN）、ミッドカイン（MK）、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）および脳由来神経栄養因子（BDNF）といった各種増殖因子・神経栄養因子と相互作用し、その活性調節に利用し得ることを見出している（特願２００５−８０７２４号参照）。これらの知見は、本発明の硫酸化オリゴ糖もまた、増殖因子、神経栄養因子、サイトカインなど種々の機能性タンパク質との相互作用（結合）解析に利用できるだけでなく、当該硫酸化オリゴ糖と相互作用する機能性タンパク質の機能調節に利用し得ること、換言すれば、それらのタンパク質と混合して、いわば機能性タンパク質の活性調節結合剤として利用できることを示している。
本発明の硫酸化オリゴ糖は、上述のように、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸から単離精製することができる。例えば、市販のサメ軟骨由来CS-C鎖を材料に、まずヒアルロニダーゼなどの酵素を用いて断片化する。さらに後述の実施例に示すように、ゲルろ過クロマトグラフィー、陰イオン交換ＨＰＬＣなどで複数回分画することによって単離精製することができる。分画操作は、所望の純度が得られるまで必要な回数行えばよい。分画方法も特に制限されるものではなく、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、又はこれらのＨＰＬＣシステム等を用いたカラムクロマトグラフィーによって行うことが可能であり、複数のカラムを組み合わせて多段階の分画・精製を行うことが望ましい。
このように、本発明の硫酸化オリゴ糖は、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸から作製可能であるが、本発明の硫酸化オリゴ糖の作製方法としては当該方法に制限されるものではない。例えば、サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸以外の天然物由来糖鎖から単離精製してもよいし、上述のように、糖鎖合成技術を用いて化学合成や、酵素による合成を行ってもよいし、合成した糖鎖や天然物由来糖鎖を化学的に硫酸化することによって、本発明の硫酸化オリゴ糖を作製してもよい。
なお、本発明の硫酸化オリゴ糖は、新規の「八糖構造」を有するものであればよく、これよりも長い糖鎖のオリゴ糖や多糖であってもよい。糖鎖の長さについては、新規の「八糖構造」を機能ドメインやエピトープ構造などとして含むものであれば特に制限されるものではなく、八糖構造のどちらか一方にさらに二糖をもつ十糖や、両側にそれぞれ二糖がひとつずつ伸びた十二糖でもよく、さらに、より長い多糖鎖であっても、それぞれの八糖がもつ立体構造（コンフォメーション）と類似したドメインを含んでいればよい。好ましい糖鎖の長さは８−１５０糖であり、８−１００糖がより好ましく、８−５０糖がさらに好ましく、８−２０糖がより一層好ましい。
また上述のように、本発明の硫酸化オリゴ糖は、天然多糖又は天然多糖由来のオリゴ糖に限らず、人工合成多糖であってもよい。さらに、この人工合成多糖は、新規の「八糖構造」を化学的に模倣して、新規の「八糖構造」と構造は相違するが、機能上及び用途上は共通する類似構造を含む多糖やオリゴ糖を合成したものであってもよい。例えば、八糖構造の片方あるいは両端にアグリコンを結合させたものや、四つの二糖単位のいずれかを人工のリンカー又はスペーサー（１又は複数の連続したメチレン基（-CH2-）からなる炭化水素基など）に置換して八糖の機能ドメインのコンフォメーションを持たせたものでもよい。
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
［1］実験方法
［1-1］実験材料
サメ軟骨由来CS-C (super special grade)、CS二糖標準品、Proteus vulgaris由来コンドロイチナーゼABC (EC 4.2.2.4)、Flavobacterium heparinum由来コンドロイチナーゼAC-I (EC 4.2.2.5)、Arthrobacter aurescens由来コンドロイチナーゼAC-II (EC 4.2.2.4)、モノクローナル抗体CS-56、MO-225、2H6およびLY111は生化学工業株式会社 (東京、日本) より購入した。ヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ (EC 3.2.1.35) およびゲンチジン酸はSigma社より購入した。Bio-Gel P-10樹脂およびニトロセルロース膜 (Trans-BlotTM Transfer membrane, 0.45 μm) はBio-Rad Laboratories (CA) より購入した。ウシアルブミン (Fr V, chemical grade) はSerological Proteins社 (Kankakee, IL) より購入した。ペルオキシダーゼを結合したAffiPureヤギ抗マウスIgG+IgM (H+L) 抗体は、Jackson ImmunoReseach Laboratories社 (West Grove, PA) よりそれぞれ購入した。(Arg-Gly)15 ペプチドはペプチド研究所 (大阪) で合成したものを用いた。
Superdex 200のカラムを用いたゲルろ過法で決定したところ、材料に用いたサメ軟骨由来CS-Cの平均分子量は約77,000であり、約２００糖の長さと判断された。
［1-2］CS-Cのヒアルロニダーゼ分解によるオリゴ糖画分の調製
市販品のサメ軟骨由来のCS-C (100 mg) を全量2. 0 ml中で、最終濃度として50 mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0、150 mM NaClになるように混合し、10 mg (約15,000国際単位) のヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼを用いて37 ℃で分解した (1国際単位は1分間にヒアルロン酸を74 μg加水分解する量に相当する)。サンプルを徹底的に分解するのに要する時間は約18時間であるが、36時間かけて完全に分解した。タンパク質は30％のトリクロロ酢酸を0.42 ml加えて沈殿させ、2,500 rpmで10分間遠心し、取り除いた。その上清を回収し、沈殿に5％のトリクロロ酢酸を0.5 ml加えて、洗浄した。回収して、合わせた上清のトリクロロ酢酸をエーテルで除去し、1M Na2CO3で中和した。そのサンプルを10％エタノールを含む1M NaCl溶出液を用いて、Bio-Gel P-10カラム (1.6 x 95 cm) で分画した。カルボニル基が吸収する210 nmの波長で溶出画分をモニターした。画分IからIXまで分離し、プールした (図１)。それらの画分をSephadex G-25 (fine) カラム (1.5 x 46 cm) で溶出液として蒸留水を用い、脱塩した。モニターには210 nmの波長を用いた。オリゴ糖に相当する画分をプールし、乾固した後GlcUAを標準品としてカルバゾール反応で定量した。
［1-3］陰イオン交換HPLCによる推定八糖画分の細分画
Bio-Gel P-10カラムによるゲルろ過によって得られた推定八糖画分VIIをアミン結合シリカPA-03カラムを用いた陰イオン交換HPLCでさらに細分画した。測定条件としては、90分間で0.2から1 Mに至るNaH2PO4の濃度勾配で、流速1ml/min、室温を用い、検出は210 nmで行った。分離した各々のピークの画分を回収し、カルバゾール反応で定量した。
［1-4］オリゴ糖の酵素分解
二糖組成を決定するため、各々の画分を全量30 μlの50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0の中で、5 mIUのコンドロイチナーゼAC-IIと37 ℃で反応させた。反応停止のため1分間煮沸した。そのサンプルを乾固し、Anal. Biochem. 269, 367-378 (1999)記載の方法に従い、不飽和二糖を2-アミノベンズアミド (2AB) で蛍光標識した。誘導化された二糖をWhatman 3MM paperを用いたペーパークロマトグラフィーで精製した。展開溶媒としてはブタノール:エタノール:水 (4:1:1 v/v/v) を含む溶液を用いた。精製した各画分を流速1 ml/min、NaH2PO4の濃度勾配でアミン結合シリカPA-03カラム (4.6 x 250 mm; YMC社、京都、日本) を用いたHPLCにより分画した。溶出ピークは標準品との溶出位置の比較により同定した。
八糖の配列の解析には、コンドロイチナーゼABC、AC-I、AC-IIによる酵素学的解析とHPLCとの併用により行った。各々の八糖の二糖配列単位の配列を決定するためのシークエンシングのストラテジーを図７に図示した。各々の八糖300 pmolを還元末端のアミノ化によって2ABで誘導体化した。上述した方法に従い、ペーパークロマトグラフィーにより2AB試薬を除去した後、2AB誘導体化八糖をそれぞれコンドロイチナーゼABC、AC-I、AC-IIを用いて分解した。これらの分解物の一定量について、二糖が2ABでラベル化されたものか還元末端由来の不飽和ウロン酸 (ΔHexUA) をもつ四糖が2AB化されたものかを区別するためにHPLCで解析した。一方で、分解物の残りをさらに2ABでラベル化し、ペーパークロマトグラフィーで精製後、非還元末端由来か糖鎖内部の二糖単位に由来するかを決定するため、HPLCにより解析した。還元末端および糖鎖内部由来の二糖と四糖とはΔHexUAをもつのに対し、非還元末端由来の二糖はGlcUAを有している。
［1-5］マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型質量分析(DE MALDI-TOF MS)
八糖のDE MALDI-TOF/MS解析はリニアモードで、Voyager DE-RP-Pro (PerSeptive Biosystems、Framingham、MA) を用いて解析した。ゲンチジン酸を水に1 mg/mlの濃度で溶かし、マトリックスとした。硫酸化オリゴ糖の負電荷を遮へいするために、合成ペプチド(Arg-Gly)15を用いた。(Arg-Gly)15 (10 pmol/μl) の水溶液をまず10 pmolの八糖と混合し、1 μlのマトリックス溶液と混合した。その混合液をプローブ表面にのせ風乾し、スペクトルを測定した。
［1-6］脂質結合オリゴ糖の調製とニトロセルロース膜への固相化
各々の八糖画分を後述のように、L-α-dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine (DPPE) で脂質誘導体とした。2.5 μlの水に八糖画分 (0.5 nmol) を溶かし、クロロホルム:メタノール (1:1, v/v) 溶液中1 mMのDPPE (10 μl) と混合した。クロロホルム:メタノール (1:1, v/v) 溶液を37.5 μl加えた後、その混合液を1分間超音波処理し、0.16 Mのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを5 μl加えた。反応溶液を60 ℃で10分間超音波処理し、さらに60 ℃で10-12時間反応させた。反応溶液中の八糖: DPPE : NaCNBH3のモル比は1:10:800であった。そのサンプルを乾固し、クロロホルム:メタノール:水 (25:25:8, v/v/v) で再溶解した。脂質結合八糖をニトロセルロース膜にLinomat V (Camag社、スイス) を用いて噴霧した。噴霧速度は70 μl/秒、バンドが2 mmの幅になるように、脂質結合八糖 (2.5、5、10 pmol) をアプライした。
［1-7］ニトロセルロース膜へ固相化したDPPE誘導化CS-C八糖とCS-56、MO-225、LY111、2H6との相互作用の検出
特に明記していないときは、全ての工程を室温で行った。脂質結合オリゴ糖を固相化した膜を1% BSAを含むPBSで1時間ブロッキングを行い、1％ BSA/PBSで希釈した抗体をのせ、湿気たチャンバー内で1時間反応させた。次のように、抗体を1％ BSA/PBSで希釈して用いた。即ち、CS-56およびMO-225は200倍、2H6は1,00倍、LY111は1,000倍である。その膜を1％ BSA/PBSで3回洗浄し、ペルオキシダーゼを結合したAffiPureヤギ抗マウスIgG+IgM (1% BSA/PBSで3,000倍希釈) で1時間反応させた。各々の抗体の結合能をその製品説明書の指示に従い、3, 3’-ジアミノベンジヂン溶液で検出した。
［2］結果
本発明者は以前、CS-A、CS-B、CS-C、CS-D、CS-E、CS-HおよびCS-Kを含む様々なCSバリアントから三糖〜八糖を単離したが (Trends Glycosci. Glycotechnol. 12, 321-349 (2000)参照)、本実施例では以下のように、サメ軟骨由来CS-Cを出発物質として新規硫酸化八糖を単離し、その構造を決定すると共に、これらの新規硫酸化八糖がmAb CS-56やMO-225などの抗体のエピトープ解析に有用であることを明らかにした。
［2-1］CS-Cからの八糖の調製および同定
哺乳類のヒアルロニダーゼでサメ軟骨由来CS-Cを分解すると、バクテリアのコンドロイチナーゼが不飽和二糖やオリゴ糖を産生するのとは対照的に、飽和の偶数オリゴ糖を産生する。本実施例では市販のサメ軟骨由来のCS-Cをヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼで徹底的に分解し、その分解物を前記実験方法に示した方法に従い、Bio-Gel P-10カラムを用いたゲルろ過によって、サイズの違いで分画し、分離した画分を画分IからIXと命名した (図１)。画分80-90に溶出した大きなピークは、主に多分トリクロロ酢酸のNa塩によると考えられる。画分III-IXはCS-Dのヒアルロニダーゼ分解物のクロマトグラムのデータを基に、それぞれ十六糖から四糖の偶数のオリゴ糖フラグメントを含んでいると考えられた。このうち、八糖を含んでいると予想された画分VII (2 mg) を図２に示すように、アミン結合シリカカラムで陰イオン交換HPLCによって画分VIIa−VIIiに細分画した。各々の画分をSephadex G-25カラムを用いたゲルろ過で脱塩し、カルバゾール反応で定量した。HPLCと脱塩によって分画した八糖の全回収率は〜90%であった。単離したオリゴ糖画分の収率を下記表１にまとめた。
前記実験方法で述べたように、各々のオリゴ糖画分の精製度は、2ABで蛍光標識した後、陰イオン交換HPLCで確認した。画分VIIb、VIIh、VIIiを除く他の全ての画分はシークエンシングをするのに十分な純度であった (表１)。画分VIIbは少量で純度も低かったので、解析には用いなかった。画分VIIhは再クロマトグラフィーによって、画分VIIh1およびh2に精製したところ、モル比が27:73であった。各々2ABで標識し、純度を確かめた。画分VIIh1はシークエンシングできるくらいに高純度であった (〜91%の純度)。一方、画分VIIh2はかなり不均一だったので、図３Ｃに示すように低い塩の濃度勾配により再度クロマトグラフィーを行い、画分VIIh2.1、VIIh2.2、VIIh2.3、VIIh2.4を得た (拡大挿図を参照)。主要な画分VIIh2.2は2ABで標識後、陰イオン交換HPLCにより、少なくとも二種類の構成成分を同程度含んでいることが分かった。画分VIIh2.2のシークエンシングは混合物のまま用いた。画分VIIiは再クロマトグラフィーによって画分VIIi1、VIIi2、VIIi3に分離した (図３Ｂ)。モル比は71: 24:5であった。2AB誘導化VIIi1およびVIIi2の純度はそれぞれ83および94%であった (表１)。そこで、それらをシークエンシングに用いた。画分VIIi3は少量だったので同定できなかった。このようにして、11の画分を得て (表１)、後述するようにシークエンスを解析した。
［表１：単離したCS-Cオリゴ糖の二糖組成］各々の八糖画分をコンドロイチナーゼAC-IIで分解し、生成した二糖を2ABで蛍光標識後、アミン結合シリカPA-03カラムを用いて陰イオン交換HPLCで解析した。各々のピークの同定は2AB化二糖標準品の溶出位置と比較した。
［注］
a) 各々の画分の八糖の量はカルバゾール法で定量した。
b) 各々の画分の純度は2ABで蛍光標識後、アミン結合シリカカラムを用いて陰イオン交換HPLCでピーク面積を基に決定した。
c) 二糖のモル比のパーセンテージはコンドロイチナーゼAC-IIによる分解後、アミン結合シリカカラムで得られたピーク総面積から計算した。
d) 斜文字で記した二糖単位は、各々の画分中に含まれるマイナー成分の消化によって生じた二糖を示す。
［2-2］画分VIIi2のシークエンシング
単離した全ての画分のシークエンシングを図７で示した方法で行った。まず、mAb CS-56およびMO-225に反応性を示す配列を含む、画分VIIi2の主要構成成分のシークエンシングの方法の詳細を以下に示す。HPLCによる推定ではみかけの純度が94%であったが、酵素分解によってより多くのマイナー成分が不純物として含まれていることが分かった (表１)。それでも、主要構成成分の配列の決定は以下に示すように可能であった。
画分VIIi2に含まれる主要化合物の糖組成と硫酸基の数を決定するために、硫酸化糖鎖と結合するペプチド(Arg-Gly)15を用いて複合体を形成させてMALDI-TOF/MSを行った。検出した八糖の分子量は、プロトン化ペプチド/八糖複合体 (m/z 5152.17) からプロトン化ペプチド (m/z 3220) のm/zの値を差し引いた結果、1932.17であった。この値は五個の硫酸基を有する八糖に相当する (表２)。コンドロイチナーゼAC-IIで分解後、生じた二糖の還元末端を2ABで標識し、二糖組成を分析した。その分解物の陰イオン交換HPLCによる解析では、C [GlcUA-GalNAc(6S)]、ΔA [ΔHexUA-GalNAc(4S)]、ΔC [ΔHexUA-GalNAc(6S)]、ΔD [HexUA(2S)-GalNAc(6S)] (ΔHexUAは4,5-ヘキスロン酸を表す) が主要な構成成分で、そのモル比は1.0 : 1.3 : 1.1 : 1.1 (表１) であった。これはMALDI-TOF/MS解析で得られた結果と一致した。従って、画分VIIi2の主要な構成成分は、1つのA-ユニットおよびD-ユニットと2つのC-ユニットから成る。C-ユニットの一方は非還元末端に位置し、他方は糖鎖の内部あるいは還元末端に位置する。これらの主要な二糖ユニットに加えて、D (3.3%) およびΔE (5.8%) が少量検出された (表１)。これはおそらく非還元末端側にD-ユニットを含むマイナー成分や、糖鎖の内部あるいは還元末端側にE-ユニットを含むマイナー成分に由来すると考えられた。
［表２：CS-C八糖のMALDI-TOF/MS解析、及びその推定構成糖と硫酸基の数］各々の八糖画分 (10 pmol) を等モルの合成ペプチド(Arg-Gly)15と混合し、次にマトリックスであるゲンチジン酸と混合し、ポジティブイオンモードでスペクトラムを測定した。
［注］
a) 八糖と合成ペプチド(Arg-Gly)15との1 : 1で結合した複合体プロトンのm/z値。
b) 1 : 1で結合した複合体プロトンのm/z値からプロトン化したペプチドの値を差し引いて得られた八糖の質量。
c) 推定構造から算出された理論上の質量。
d) 1 : 1で結合した複合体プロトンからはシグナルが得られなかった。
配列を決定するため、まず画分VIIi2オリゴ糖の還元末端を2ABで標識し、2AB誘導体とし、誘導体試薬を除くためにペーパークロマトグラフィーで精製した。精製した2AB化VIIi2画分をコンドロイチナーゼAC-IIで分解し、陰イオン交換HPLCを行ったところ、還元末端由来の主要な2AB化生成物はΔC (86.2%) であった。また、少量ながら2AB化ΔA (8.9%) も検出された。これは還元末端にA-ユニットを有するマイナー成分に由来することを示している。さらに、図４Ｃ、Ｅ、Ｆ中の星印で示すところに2AB化ΔA-D-C六糖も検出された (表３)。これはおそらく主要八糖が完全に分解されなかったものである。
［表３：2ABで標識した八糖をコンドロイチナーゼAC-II、ABCあるいはAC-Iで分解し、生成した還元末端の二糖、四糖および六糖］各々の八糖画分の還元末端を2ABで標識し、コンドロイチナーゼABC、AC-IあるいはAC-IIでそれぞれ分解した。還元末端の配列を決定するために、各々の分解物をアミン結合シリカカラムを用いて陰イオン交換HPLCで解析した。
［注］
a) 太字で記した二糖あるいは四糖は各々の分解によって生じた主要成分を示す。
2AB化VIIi2のコンドロイチナーゼABCによる分解物は、還元末端由来の2AB化ΔD-C四糖の溶出位置に総ピーク面積の70.7%に相当する主要なピークが検出された。さらに全四糖のうち、21.6および7.7%を占めるΔC-C-2ABおよびΔC-A-2ABのピークがマイナー成分として検出された (図４Ａ、表３)。このことは画分VIIi2の純度が約70%で、その他に少なくとも2種類の五硫酸化八糖を含んでいることを示している。
2AB化VIIi2のコンドロイチナーゼAC-Iで消化した時の生成物の主要なピークは、後述するように2AB化六糖ΔA-D-Cで、総ピーク面積の77.4%であった (図４Ｂ)。また、マイナーなピークΔC-C-2AB (14.1%) とΔC-A-2AB (8.5%) も含んでいた。コンドロイチナーゼAC-Iは、“D”二糖単位が結合したガラクトサミド結合を切断することはできないので、おそらく四糖-2ABよりむしろ六糖-2ABの生成をもたらす。これらの結果によって、画分VIIi2の純度はおよそ70%であること、還元末端の主要単位はC-ユニットであるので、画分VIIi2の主要化合物はC-A-D-C配列を有する八糖であることが分かる。また、これらの結果は、画分VIIi2の全八糖のうちそれぞれ14-20%と8-9%を占める、少なくとも還元末端側に各々C-CとC-A四糖配列を有する他の2種類の八糖が存在することも示している (表４)。
［表４：2AB化八糖をコンドロイチナーゼAC-IIおよびAC-Iで分解し、生じた二糖および四糖］各々の八糖画分の還元末端を2ABで標識し、コンドロイチナーゼAC-IIあるいはAC-Iでそれぞれ分解した。還元末端の二糖単位を決定するため、その分解物をさらに2ABで標識し、2AB化試薬を除去・精製し、アミン結合シリカカラムを用いて陰イオン交換HPLCで解析した。
［注］
a) 太字で記した二糖あるいは四糖は各々の分解によって生じた主要成分を示す。
これらの結果は以下のように確認した。2AB化VIIi2画分をコンドロイチナーゼAC-II、ABC、AC-Iを用いて分解し、各々の分解物の一部をもとの八糖の非還元末端と糖鎖内部由来の二糖を標識するためにさらに2AB化した。そして、2AB化された二糖とオリゴ糖をペーパークロマトグラフィーで精製後、陰イオン交換HPLCで解析した (図７)。コンドロイチナーゼAC-Iによる分解で2AB化C-ユニットと2AB化された推定六糖のピークが、1.2 : 1のピーク面積の割合で得られた (図４Ｅ)。また、画分VIIi2に少量含まれる混合物のピークもわずかながら得られた (表４)。このことから、上述のように、画分VIIi2の主成分はC-A-D-C八糖配列を有すると決定した。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物を2AB化したものからは、2AB化されたC、ΔC、ΔAおよびΔDのピークが、1 : 2 : 0.5 : 0.4のピーク面積の割合で得られた (図４Ｆ、表４)。また、マイナー成分から、少量ながら二、四、六糖由来のピークも得られた (図４Ｆ、表４)。二糖のモル比は他の八糖構造由来の成分も含んでいるが、主に主要な八糖配列の構成成分を反映しているであろう。コンドロイチナーゼABCによる分解物をさらに2AB化したものからは、2AB化されたC、ΔAおよびΔD-Cのピークが、1.0 : 0.8 : 1.6のピーク面積の割合で得られた (図４Ｄ)。また、少量ながらマイナー成分由来のピークも得られた。このことは、コンドロイチナーゼAC-Iでは分解できない2AB化推定六糖がΔA-D-C配列を有しており、コンドロイチナーゼABCはΔAとΔD-Cに分解できることを示している。最近明らかになったことであるが、コンドロイチナーゼABC消化に通常用いる緩衝液が存在すると2AB化の効率が低下するために、推定八糖配列C-A-D-Cの正確なモル比を求めることはできなかった。従って本実施例においては、コンドロイチナーゼABCによる分解のデータは二次的証拠とした。以上をまとめると、画分VIIi2の主要化合物の配列は、全八糖の70%を占め、C-A-D-C [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)]である。下記表５は、シークエンシング解析の結果、VIIi2および他のフラクションに含まれる八糖構造の各割合をまとめたものである。
［表５：サメ軟骨から単離した新規な推定八糖配列］
［注］
a) 括弧内の数字は各々の画分中に含まれるその配列の割合（％）を表す。
b) 不飽和C-C-C-Cなどの配列は文献J. Biol. Chem. 273, 3296-3307 (1998)において報告されている。
画分VIIi2の14〜22%あるいは8〜9%含まれる少量の五硫酸化八糖は、その還元側にC-CあるいはC-Aという四糖構造を有している。それらは5個の硫酸基を有しており (表２)、非還元末端にCまたはD-ユニットを含んでいるので、非還元末端の四糖はC-E、C-D、D-CまたはD-Aのいずれかの配列を有していると考えられる。それゆえ、二種類の八糖はそれらの配列とC-CあるいはC-Aが結合したものである。しかし、C-D-C-C (VIIgおよびVIIi)、D-C-C-C (VIIg)、D-C-C-A (VIIi1) はより前の溶出画分に検出されたので、これらの可能性はない。むしろ、非還元末端にCとD-ユニットをもつことを考慮すると、少なくともC-E-C-Cと画分VIIi1の主要な構成成分として存在するD-C-C-Aが画分VIIi2の中にも存在しているだろう。C-E-C-Aが存在する可能性もある。
同様の方法で、画分VIIa、c、d、e、f、g、h1、h2.2およびi1についても配列決定を行った。表３に、各々の画分の八糖の還元末端からコンドロイチナーゼAC-II、ABC、AC-Iを用いて二、四、六糖を切り出し、検出された配列をまとめた。還元末端から不飽和四糖を生じた画分VIIh1およびVIIh2.2以外は、2AB化八糖をコンドロイチナーゼAC-IIで分解すると、還元末端から不飽和二糖が得られた。対照的に、2AB化八糖をコンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iで分解すると、全ての八糖画分から不飽和四糖が得られ、画分VIIi1およびVIIi2からは六糖が得られた。従ってこれらの結果は、コンドロイチナーゼABCが2AB化四糖を二糖に分解できず、コンドロイチナーゼAC-IIはできるという従来の知見とよく一致する。本実施例ではさらに、コンドロイチナーゼAC-Iは2AB化四糖を2つの二糖に分解できないということと、コンドロイチナーゼAC-IIは還元末端に2ABが結合した“D”-ユニットを含む四糖を2つの二糖に分解できないことが明らかとなった。
［2-3］画分VIIaのシークエンシング
コンドロイチナーゼAC-IIによる分解で生じた二糖の組成分析を行ったところ、C、ΔOおよびΔCが、1.0 : 0.76 : 2.0モル比で得られた (表１)。従って、画分VIIaの主要構成成分は1つのO-ユニットと3つのC-ユニットから成る。C-ユニットのうち1つは非還元末端に位置している。しかし、理由は定かではないが、画分VIIaのMALDI-TOF/MS解析では、ペプチド/オリゴ糖のいかなるシグナルも観察されなかった (表２)。そこで、配列決定のためにまず、画分VIIaを2AB誘導体にした。精製した2AB化合物のコンドロイチナーゼAC-IIによる分解物は、還元末端由来の2AB化ΔOが主要な構造であった (表３)。2AB化VIIaのコンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iによる分解では、還元末端由来の2AB化ΔC-Oに相当する四糖が主要な構造であった (表３)。2AB化VIIaの還元末端からは微量のA-A (9%) あるいはA-C (11%) 四糖も得られたので、画分VIIaの純度はおよそ80%であった (表３)。コンドロイチナーゼAC-II分解物を2AB化し、HPLCを行ったところ、非還元末端から2AB化C-ユニットと糖鎖内部から2AB化ΔCが得られた。加えて、還元末端から主に2AB化ΔOが得られ、また一部糖鎖内部からも得られた。ピーク面積の比はC : ΔC : ΔO = 1.0 : 2.1 : 1.3であった (表４)。コンドロイチナーゼAC-Iによる分解物を2AB化し、HPLCで分析したところ、2AB化CとΔCに加えて還元末端から2AB化されたΔC-Oと推定される四糖が得られ、それらのピーク面積比は1.0 : 0.91 : 1.1であった (表４)。
コンドロイチナーゼAC-IIあるいはAC-Iによる分解物を2AB化して検出された少量の成分はおそらくマイナー成分由来であり、表４に示した。これらの結果を基に、画分VIIaの80〜81%を占める主要構成成分の配列は、C-C-C-O [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc] (表５) と決定した。この画分が対称的なピークを与えることから (図１)、この画分の成分はどれも3つの硫酸基を有すると考えられること、二糖組成の特徴、還元末端にC-ユニットが存在すること、還元末端にA-AあるいはA-C四糖を有するということから、二種類の微量八糖はC-O-A-A (8〜9%) および C-O-A-C (11%) という配列であると考えられる。
［2-4］画分VIIcのシークエンシング
MALDI-TOF/MSの解析から平均分子量は1854.46であった。これは四硫酸化八糖に相当する (表２)。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物の二糖組成の分析では、CおよびΔCのモル比が、1 : 2.3であった (表１)。これは画分VIIcの主要な成分が4つのC-ユニットから成ることを示している。2AB化VIIc画分をコンドロイチナーゼAC-II、ABCあるいはAC-Iで分解すると、それぞれの分解物から2AB化されたΔC、ΔC-CあるいはΔC-Cが得られた(表３)。これらの結果はVIIcの主要な成分の配列がC-C-C-C [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)] であることを示している (表５)。C-ユニットを豊富に有するCS-Cから単離された主要な配列がC-C-C-Cであるのは、自然なことといえる。
［2-5］画分VIIdのシークエンシング
MALDI-TOF/MSの解析から四硫酸化八糖であった (表２)。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物の二糖組成の分析ではC、ΔCおよびΔAのモル比が、1.0 : 1.9 : 0.81であった (表１)。2AB化VIId画分をコンドロイチナーゼAC-IIで分解すると、2AB化ΔC (96%) が得られた (表３)。しかし、コンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iで分解すると、主要な四糖生成物としてΔA-C-2AB (75-78%) が得られ、少量の生成物としてΔC-C-2AB (22-25%) が得られた (表３)。また、画分VIIdの純度は70.6 %であった。これらの結果は画分VIIdのおよそ70%がC-C-A-C [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)] の配列を有する主要な構成成分であることを示している (表５)。少量の成分 (22〜25%) は以下の知見に基づいて、C-C-C-C配列と考えられる。即ち、（１）還元末端側の配列はC-Cである、（２）非還元末端はC-ユニットである、（３）内部はC-あるいはA-ユニットである、（４）C-A-C-Cは画分VIIfで検出され (後述)、二糖組成分析においてC-ユニットよりもΔA-ユニットは少なかったので、この配列ではない (表１)。C-C-C-Cは画分VIIcの近くに溶出されるので、おそらく混入したのであろう。表４で示された結果はこのことを支持する。理由は分からないが、観察された不飽和六糖 (表４) はおそらく、もとの八糖が完全には分解されなかったために生じたのであろう。
［2-6］画分VIIeのシークエンシング
MALDI-TOF/MSの解析から画分VIIeの主要な成分は四硫酸化八糖であることが分かる (表２)。コンドロイチナーゼAC-II分解物の二糖組成の分析ではC、ΔCおよびΔAのモル比が、1.0 : 1.7 : 0.86であった (表１)。このことは非還元末端がC-ユニットで、還元末端側の六糖配列中に2つのC-ユニットと1つのA-ユニットがあることを示している。配列決定のために、2AB化したVIIeをコンドロイチナーゼAC-IIで分解し、陰イオン交換HPLCで解析したところ、2AB化ΔAが検出された。しかし、2AB化したVIIe画分をコンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iで分解すると、還元末端由来の主要な四糖として2AB化ΔC-A (94%) と少量の2AB化ΔA-C (6%) が得られた (表３)。2AB化VIIe画分のコンドロイチナーゼAC-II分解物の2AB誘導体としては、2AB化されたC、ΔCおよびΔAユニットのピークが1.0 : 1.5 : 0.95の面積比で得られた。これらの結果はC-C-C-A配列が主要な構成成分であることを示している。2AB化VIIe画分のコンドロイチナーゼAC-Iによる分解物の2AB誘導体としては、2AB化されたC、ΔCおよびΔC-Aのピークが、0.58 : 0.45 : 1.0の面積比で得られた (表４)。このCおよびΔCの割合が低いのは、マイナー成分の八糖のせいか、もしくは新しく産生されたCおよびΔC二糖の2AB化効率が低いため (前記［2-2］欄参照) である可能性があるが、配列を推定するのに問題はないであろう。これらの結果をもとに、画分VIIeの主要な構成成分は、少なくともC-C-C-A [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S)] であると結論した (表５)。還元末端側にA-Cという四糖を有するマイナー成分 (6%) は、表３および表４に示す組成と分離プロファイル (図２) に基づき、C-C-A-C配列と考えられる。これは画分VIIdの主要構成成分が混入したと考えられる。
［2-7］画分VIIfのシークエンシング
MALDI-TOF/MSの解析から、画分VIIeの主要な成分は、三硫酸化八糖であることが分かる (表２)。コンドロイチナーゼAC-II分解物の二糖の組成分析では、C、ΔCおよびΔAのモル比が1.0 : 1.2 : 1.6であった (表１)。これは非還元末端がC-ユニットで、還元末端側の六糖配列中にもう1つのC-ユニットと2つのA-ユニットがあることを示している。配列決定のために、2AB化したVIIfをコンドロイチナーゼAC-IIで分解し、陰イオン交換HPLCで解析したところ、還元末端側に由来する2AB化ΔAが得られた。2AB化したVIIe画分をコンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iで分解すると、還元末端由来の主要な四糖として2AB化ΔA-A (88.5%) と少量の2AB化ΔC-C (11.5%) が得られた (表３)。2AB化VIIf画分のコンドロイチナーゼAC-II分解物の2AB誘導体をイオン交換HPLCで解析すると、非還元末端側から2AB化C、糖鎖内部から2AB化ΔC、還元末端側と糖鎖内部から2AB化ΔAのピークが得られ、それらのピーク面積比はC : ΔC : ΔA = 1.0 : 1.2 : 1.9であった (表４)。2AB化VIIf画分のコンドロイチナーゼAC-Iによる分解物の2AB誘導体をイオン交換HPLCで解析すると、2AB化されたC、ΔCおよびΔA-Aのピークが1.0 : 0.92 : 1.1の面積比で得られた (表４)。これらの結果をもとに、画分VIIfの主要な構成成分 (88.5%) はC-C-A-A [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S)] であると決定した (表５)。還元末端側にC-C四糖を有する画分VIIf中のマイナー成分 (11.5%) は、非還元末端側がC-ユニット (表４) であるのでC-A-C-C配列である。
［2-8］画分VIIgのシークエンシング
MALDI-TOF/MSの解析から、画分VIIgの主要な成分は五硫酸化八糖であることが分かる (表２)。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物の二糖の組成分析では、主要な二糖としてDおよびΔC、また少量のCおよびΔAが得られ、D、CおよびAの合計を1.00としたときのD、ΔC、C、ΔAのモル比が0.61 : 1.98 : 0.34 : 0.27であった (表１)。このことはD-C-C-C配列が主要八糖 (61%) で、非還元末端にC-ユニットをもつ少なくとも1つのマイナーな配列 (34%以下) を含んでいることを示している。2AB化したVIIgをコンドロイチナーゼAC-IIで分解し、HPLC解析を行ったところ、ΔC-2AB (86.5%) およびΔA-2AB (13.5%) が検出された。しかし、コンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iで分解すると、主要四糖としてΔC-C-2AB (91-92%) およびマイナーな四糖としてΔC-A-2AB (9-10%) が検出された (表３)。これらの結果は上述したD-C-C-C配列と一致する。2AB化VIIgをコンドロイチナーゼAC-IIで分解し、さらに生成物を2AB化すると、非還元末端から2AB化されたD-ユニット、C-ユニットおよびA-ユニットが20.1 : 9.4 : 2.0 すなわち64 : 30 : 6のモル比で検出され、糖鎖内部と還元末端からは2AB化されたΔCおよびΔAが58.9 : 9.6のモル比で検出された。DおよびΔCのピーク面積比は1.0 : 2.9であり、これは推定主要配列と一致した。2ABで標識した画分VIIgのコンドロイチナーゼAC-Iによる分解物を2AB誘導体化した場合には、2AB化されたD、ΔCおよびΔC-Cが主要成分で、そのピーク面積比が1.0 : 1.0 : 1.0だった。また、少量ではあるが2AB化されたCおよびAも検出され、D : C : Aのピーク面積比は26.6 : 11.6 : 2.3すなわち65 : 29 : 6だった (表４)。従って、画分VIIgの純度は61-65%で、主要構成成分はD-C-C-C [GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)] という構造である (表５)。
上述した知見から、9〜10%含まれている少量の八糖は5つの硫酸基を有しており、非還元末端にC-ユニットと糖鎖内部にジ硫酸化D-ユニットをもつので、1つの配列はC-D-C-Aと考えられる。非還元末端側の推定C-D配列はコンドロイチナーゼAC-IあるいはAC-IIでは二糖には切断されないので、検出されなかったのだろう。また、C-D-C-C (10-19%) およびA-D-C-C (6%) の存在も考えられる。後者の配列は隣接する画分VIIh2.2中に二番目の主要な成分として見出されたので、この配列はこれら両者の画分中に見出されるのだろう。一方、画分VIIi1中に見出されるD-C-C-AおよびD-A-C-Cという配列は、画分VIIgにはないと考えられる (後述)。2つのA-ユニットがあれば、HPLC解析でその成分は遅れて溶出するはずなので、D-A-C-A配列もまた画分VIIh2.2には存在しないだろう。
［2-9］画分VIIh1のシークエンシング
MALDI-TOF/MSの解析から画分VIIh1の主要な成分は、五硫酸化八糖である (表2)。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物の二糖組成の分析ではC、ΔC、ΔDおよびΔAのモル比が、1.00 : 2.72 : 1.58 : 0.31であった (表１)。配列を決定するため、2AB化VIIh1をコンドロイチナーゼAC-II、ABCあるいはAC-Iで分解し、これらの分解物を陰イオン交換HPLCで解析すると、主要な四糖として2AB-ΔC-D (82-89%) が検出され、マイナーな四糖としては、ΔA-A (9-11%) とΔC-C (2-6%) の2AB誘導体が検出された (表３)。上述した他の画分の還元末端の四糖とは異なり、2AB化ΔC-DにはコンドロイチナーゼAC-IIが作用しない。コンドロイチナーゼAC-IIあるいはAC-Iによる分解物の2AB化とHPLC解析により、非還元末端由来の2AB化C-ユニットと糖鎖内部由来の2AB化ΔCと還元末端由来のΔC-D-2ABが、コンドロイチナーゼAC-IIとAC-Iによる分解物からそれぞれ、1.00 : 1.18 : 1.34あるいは1.00 : 0.93 : 1.07のピーク面積比で検出された。これらの結果をもとに、VIIh1の主要な成分の配列はC-C-C-D [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)] であると決定した (表５)。2種類のマイナーな八糖はC-D-A-A (9-11%) とC-D-C-C (2-6%) である。これらの八糖は全部で5つの硫酸基をもつので、両者の配列中の非還元末端から二番目の二糖としてD-ユニットが存在すると考えられる。また、画分VIIh1中の全オリゴ糖の成分のうち、95%以上が非還元末端にC-ユニットをもつことから、これらの八糖の非還元末端はC-ユニットであるからである (表４)。
［2-10］画分VIIh2.2のシークエンシング
上述した他の画分とは異なり、2ABで標識し、陰イオン交換HPLCで分離できなかった画分VIIh2.2は、少なくとも2種類の主要な成分を0.8 : 1.0のモル比で有する混合物である。画分VIIh2.2の主要構成成分は、MALDI-TOF/MSの解析から五硫酸化八糖であることが分かる (表３)。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物の二糖組成の分析では、C、AおよびDの合計を1.00としたとき、C、A、D、ΔC、ΔAおよびΔDのモル比が0.52 : 0.31 : 0.17 : 1.15 : 0.33 : 0.64であった (表１)。これは少なくとも、非還元末端にC-、A-あるいはD-ユニットを含む3種類の八糖が52 : 31 : 17のモル比で存在することを示している。2AB化VIIh2.2のコンドロイチナーゼAC-IIによる分解物の陰イオン交換HPLCによる解析で、還元末端由来のΔC-2ABとΔA-D-2ABが1.1 : 1.0のモル比で検出された。しかし、コンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iによる分解物では、2AB化されたΔA-D、ΔC-CあるいはΔA-Cという四糖が50-52 : 37-39 : 11のモル比で検出された。従って、モル比でC-X-A-D、A-X-C-CおよびD-X-A-Cの配列をもつ3種の異なる配列が存在すると考えられる (表３)。2AB化VIIh2.2画分のコンドロイチナーゼAC-IIによる分解物をさらに2AB標識した場合には、2AB化C、AおよびDが58 : 26 : 16のモル比で検出された。これは上述の二糖分析の結果とも大筋で一致している (表４)。2AB化VIIh2.2画分のコンドロイチナーゼAC-Iによる分解物をさらに2AB標識した場合には、2AB化されたΔA-D、ΔC-CおよびΔA-Cが53: 36 : 11のモル比で検出された。これは上述の四糖のモル比の計算結果とよく一致する。注目すべきことに、コンドロイチナーゼABCによる分解で生じたAおよびΔDの比率は似ていたが、コンドロイチナーゼAC-Iによる分解では、これらは生じなかった。これは八糖中に存在するAユニットとDユニットがコンドロイチナーゼAC-I-抵抗性のA-D四糖配列を形成しているからだと考えられる。これらの知見から、VIIh2.2の2つの主要な成分の配列はC-C-A-D [GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)] とA-D-C-C [GlcUAβ1-3GalNAc(4S)β1-4GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)] と決定した (表５)。第三の八糖配列は糖鎖内部にA-ユニットよりC-ユニットである可能性が高い (表１、４) ことから、D-A-A-C配列というよりはむしろD-C-A-C配列であると考えられた。
［2-11］画分VIIi1のシークエンシング
MALDI-TOF/MSの解析から、画分VIIi1の主要な成分は五硫酸化八糖であることが分かる (表２)。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物を2ABで標識し、分析した二糖組成では、2AB化 DおよびCの合計を1.00としたとき、D、C、ΔC、ΔAおよびΔDのモル比は0.70 : 0.30 : 1.54 : 0.83 : 0.28であった (表１)。このことは、D-あるいはC-ユニットを非還元末端に7 : 3のモル比でもつ八糖が少なくとも2種類存在することを示している。
2AB化VIIi2画分のコンドロイチナーゼAC-IIによる分解物からは、還元末端に由来する2AB化ΔA、ΔC、ΔC-AおよびΔC-Dが65 : 19 : 12 : 4のモル比で検出された。これは、A、CあるいはDを還元末端にもつ3種類の成分が少なくとも65-78 : 18 : 4のモル比で存在することを示している。さらに、コンドロイチナーゼABCあるいはAC-Iによる分解物からは、還元末端由来の2AB化されたΔC-A、ΔC-C、ΔC-DおよびΔD-C四糖が62-76 : 5-10 : 3-4 : 8のモル比で検出された。このことは、この割合で、還元末端側にC-A配列 (主要成分) とC-C、C-DおよびD-C配列 (マイナー成分) (表３) をもつ八糖が存在することを示している。コンドロイチナーゼAC-IIによる分解物を2AB化し、陰イオン交換HPLCで解析すると、主要生成物として非還元末端から2AB化“D”-ユニットと糖鎖内部に由来する2AB化ΔCが検出された。加えて、還元末端から2AB化ΔA-2ABと主要構成成分である2AB化ΔC、ΔAおよびDが2.3 : 1.5 : 1.0のピーク面積比で検出された。2AB化VIIi1のコンドロイチナーゼAC-Iによる分解物をさらに2AB誘導体化すると、2AB化ΔC、DおよびΔC-Aが1.2 : 1.0 : 2.0のピーク面積比で検出された (表４)。これらの結果から、VIIi1の主要な成分の配列はD-C-C-A [GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(6S)β1-4GlcUAβ1-3GalNAc(4S)] であると決定した (表５)。
マイナーな配列は以下のように推定した。全部で5つの硫酸基を持つが、D-C-C-CやC-D-C-Cのような配列は画分VIIgで見出されており除外できるので、C-C配列を有する一つの配列はおそらくD-A-C-Cである。5つの硫酸基を持ち、非還元末端がC-ユニットであるので、還元末端側にD-C配列を有する一つの配列はおそらくC-A-D-Cである。この配列は画分VIIi2の主要構成成分であり、画分VIIi1に混入したと考えるのが妥当である。C-C-D-C配列の可能性もありそうに見えるが、A-ユニットをもたない配列はHPLCでより前に溶出する (表５) ので除外できる。還元側にC-D配列をもつ八糖はC-A-C-D配列であろう。なぜなら、もう一つの候補配列であるC-C-C-Dは画分VIIh1の主要構成成分であり、画分VIIi2には見られないので、除外できるからである。
［2-12］構造決定した八糖のCS-56、MO-225、2H6およびLY111に対する反応性
構造決定したCS-C八糖と抗CS抗体との相互作用をオリゴ糖マイクロアレイ法を用いて解析した (Nat. Biotechnol. 20, 1011-1017 (2002))。脂質と結合させたオリゴ糖は、ニトロセルロース膜上に添付してリガンドを高感度にハイスループットで検出するためのプローブにできる。本実施例では、広く使われている市販の抗CS単クローン抗体 (CS-56、MO-225、2H6およびLY111) を用いた。
mAb CS-56は、砂嚢線維芽細胞の腹側膜を抗原として作製され、主にCS-AとCS-Cを認識する (Cell 38, 811-822 (1984))。MO-225は、ニワトリ胎仔四肢原基のPG-Mを抗原として作製され、D-ユニットを含む配列を主に認識する (J. Biol. Chem. 262, 4146-4152 (1987))。2H6は、出生後10日のラット脳から精製した可溶性CS-PGを抗原として作製され (Neuroscience 60, 145-157 (1994))、CS-A、CS-CおよびCS-Dと反応する。LY111は、CS-Aを含むニワトリタイプIXコラーゲンを抗原として作製され (J. Biol. Chem. 267, 9391-9397 (1992))、CS-AおよびCS-Dを認識する。最近、CS-56やMO-225がA-D配列を含むような配列を認識することを見出し (Glycobiology 15, 593-603 (2005))、本実施例を行うに至った。CS-56は八糖あるいはそれ以上のオリゴ糖と反応するが、MO-225は六糖あるいはそれ以上のオリゴ糖と反応する。本実施例では、まず、2H6とLY111がCS-C由来の六糖あるいはそれ以上のオリゴ糖と反応することを明らかにした (図６)。
固相化した各々の八糖画分とこれらのmAbとの反応性を、3つの異なる八糖の量 (10、5および2.5 pmol) で調べた。これらの画分は100%の純度ではないが (表５)、後述するように、反応する八糖配列を決定することができた。CS-56は固相化したサンプルを10、5および2.5 pmolと変化させて調べたところ (図５のA1-3)、2.5 pmolからわずかに反応し (図５のA3)、2つの画分、VIIh2.2 (主要成分: C-C-A-D + A-D-C-C) と VIIi2 (主要成分: C-A-D-C) を認識した。画分VIIh2.2とVIIi2中の共通のオリゴ糖配列はA-D-CとC-A-Dであるが、調べた他の画分にはそのような配列は存在しない。従って、CS-56はA-D-CあるいはC-A-D配列を特異的に認識すると判断した。A-D-C配列の認識は、CS-56がA-D四糖配列が共通して含まれる様々な不飽和八糖配列に対して、ΔC-A-D-C、ΔA-A-D-C、ΔA-A-D-AおよびΔC-A-D-Aの順序で反応するという最近の知見 (Glycobiology 15, 593-603 (2005)) とよく一致する。
MO-225は、調べた全てのオリゴ糖量で画分VIIi2 (C-A-D-C) と特異的に反応した。画分VIIh2.2 (主成分: C-C-A-D + A-D-C-C) とVIIi1 (主成分: D-C-C-A) のより多い量 (10および5 pmol) では、弱い反応性が見られた (図５のB1およびB2)。画分VIIh2.2とVIIi2に共通に見出されるA-D-CとC-A-D配列は、最近報告(Glycobiology 15, 593-603 (2005)) したように、MO-225がA-Dを含む配列を認識することと一致する。MO-225と画分VIIi1との反応性は、おそらくA-D配列を含まない主要構成成分D-C-C-Aとの反応である。しかし、A-D配列を含むマイナー成分と反応している可能性もある。画分VIIi1は62〜76%の純度で、夾雑物として近傍の画分VIIh2.2とVIIi2を含んでいるので (図２、３Ｂおよび３Ｃ)、画分VIIi1とMO-225との反応性はそのせいとも考えられる。実際に、D-ユニットがコンドロイチナーゼAC-Iによる消化物中には見られず、コンドロイチナーゼABCによる分解物中に検出され、コンドロイチナーゼABC分解物と比較して、コンドロイチナーゼAC-I分解物中のA-ユニットの減少が見られる (表４) という事実によっても、画分VIIi1中に少量含まれるA-D配列の存在は支持される。なぜならば、A-D配列はコンドロイチナーゼABCでは消化されるが、AC-Iでは消化されないからである。MO-225と画分VIIi2との反応性は、画分VIIi2が2.5 pmolのときも強かった (図５)。これは、不飽和C-A-D-Cと強く反応するという従来の知見と一致する。MO-225はA-D配列だけでなく、E-D配列も認識すると報告されているが、画分VIIi2は5つの硫酸基を持ち、E-D配列は含んでいないと考えられる。
2H6とCS-C八糖との反応性は画分bとf以外の全ての画分と10 pmolで、交差反応を示した (図５のC1)。C-C-A-CとC-C-C-C配列を含む画分VIIdのみ、サンプルの量が5 pmolに減少しても強く反応し (図５のC2)、2.5 pmolの量においても反応した (図５のC3)。2H6の10 pmolでの複数の配列の認識は、おそらく2H6が六糖あるいはそれ以上の多糖に結合するからと考えられる (図６)。また、2H6は、陽性反応を示す八糖に共通のC-C配列を含む六糖の立体構造を認識していると考えられる (下記表６)。従って、画分VIIの弱い反応性はおそらく、主要成分であるC-A-D-Cではなく、マイナー成分であるC-E-C-CやD-C-C-Aとの反応だろう。
同様にLY111もまた高濃度であれば多様な配列と交差反応する。LY111と10 pmolの画分VIIb、VIId、およびVIIfとはそれぞれ強く反応するが、多くの他の画分とはわずかにしか反応しなかった (図５のD1)。5 pmolのオリゴ糖に量を減らしても、LY111は画分VIIb、VIIdおよびVIIfと強く反応したが、その他の画分の反応性はほとんど消失した (図５のD2)。2.5 pmolのときは、画分VIIfのみと反応した。画分VIIdの主要成分の配列はC-C-A-Cで、画分VIIfの主要成分はC-C-A-Aである。しかし、マイナー成分である画分VIIbの配列は決めることができなかった (図２)。画分VIIdとVIIfの構成成分に共通の配列は、C-C-Aである。そのような配列は画分VIIe、VIIh2.2よびVIIi1にも存在しているが、LY111はこれらの画分を認識しない。このことはC-C-AがLY111のエピトープ配列でないことを示している。むしろ、画分VIIdとVIIf中の主要成分の還元側のC-A-CやC-A-Aがよく似た立体構造をとり、認識されていると考えられる。その反応性はC-A-CよりC-A-Aのほうが強い (図５のD3)。
［表６：mAb CS-56、MO-225、2H6およびLY111が認識する八糖配列］
［注］
a) 文献J. Biol. Chem. 273, 3296-3307 (1998)において報告されている糖鎖。
b) 点線で記した配列は抗体で強く認識された。
c) 太下線のA-D四糖配列はCS-56およびMO-225によって認識された配列に共通のものである。
d) 太下線のない配列は、10 pmolのオリゴ糖では認識されたが、5 pmolでは認識されなかった。
e) 反応性未確認。
本実施例において調べた抗体の特異性を比較すると、CS-56とMO-225は配列中のC-やA-ユニットに加えてD-ユニットが必要であり、どちらの抗体もD-ユニットのない八糖は認識しない。対照的に、2H6やLY111はA-やC-ユニットをより認識するが、これらの抗体が認識するのにD-ユニットは必要ではない。抗体の特異性の研究から、各々の抗体は多様性に富んだ配列を認識することが示唆された。また、インタクトなCS鎖中の多様な一次配列が有している共通の高次構造が、エピトープとして重要であることを示している。
以上のように、本発明の硫酸化オリゴ糖は、コンドロイチン硫酸を含めた糖鎖全般の構造及び機能の研究解析に有用な試薬として利用することができる。さらに、各種増殖因子、神経栄養因子、又はサイトカインなどの他の機能性タンパク質と相互作用する可能性を有することから、プローブとして、あるいは有用な生理活性調節剤として利用することができる。例えば、これら機能性タンパク質の機能を調節するために、それらのタンパク質と混合して、いわば機能性タンパク質の活性調節結合剤として利用することができる。
サメ軟骨由来のCS-Cのヒアルロニダーゼ分解生成物のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す図である。市販のサメ軟骨由来のCS-Cを前述した方法に従い、ヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼで徹底的に分解した。その分解物を1M NaCl/10%エタノール溶出液を用いて、Bio-Gel P-10カラム (1.6 x 95 cm) で分画し、2 mlずつの画分を集めた。210 nmの波長で溶出画分をモニターし、水平バーで示したところをプールした。これまでの研究結果（Glycoconj. J. 13, 609-619 (1996)）などから、画分IXからIIIにかけて四糖から十六糖に相当すると判断した。画分IIとIは十四糖より大きい画分である。V0：空隙容量、Vt：総容積。 陰イオン交換HPLCによるCS-C八糖画分の細分画の結果を示す図である。サイズ分画で得られた八糖画分（図１）を、アミン結合シリカPA-03カラムを用いて、点線で示すように、90分間で0.2から1 Mに至るNaH2PO4の濃度勾配で細分画した。星印で示した画分をさらに細分画した (図３)。 陰イオン交換HPLCによるVIIhおよびVIIiの細分画の結果を示す図である。アミン結合シリカPA-03カラムを用いて、点線で示すようなNaH2PO4の濃度勾配で画分VIIhとVIIiを細分画した。(A) 90分間で0.2から1 Mに至るNaH2PO4の濃度勾配でVIIhをVIIh1およびVIIh2に細分画した。(B) 90分間で0.2から1 Mに至るNaH2PO4の濃度勾配でVIIiをVIIi1、VIIi2およびVIIi3に細分画した。(C) 180分間で0.2から1 Mに至るNaH2PO4の濃度勾配でVIIh2をVIIh2.1、2.2、2.3および2.4に細分画した。挿図は細分画したピークの拡大図である。 陰イオン交換HPLCによるVIIi2の細分画の結果を示す図である。2ABで誘導体化した画分VIIi2をコンドロイチナーゼABC (A)、AC-I (B) あるいはAC-II (C) で分解し、アミン結合シリカPA-03カラムを用いて陰イオン交換HPLCで解析した。(A) のコンドロイチナーゼABCによる分解物、(B) のコンドロイチナーゼAC-Iによる分解物、(C) のコンドロイチナーゼAC-IIによる分解物をさらに2ABで標識し、同じカラムを用いてHPLCで解析した。それらの結果をパネル(D)、(E) および(F) にそれぞれ示した。2AB化二糖標準品の溶出位置を数字の矢印で記した。1：ΔDi-0S、2：Di-6S、3：ΔDi-6S、4：Di-4S、5：ΔDi-4S、6：ΔDi-diSD、7：ΔDi-diSE、8：ΔDi-triSである。また、2AB化四糖標準品の溶出位置をアルファベットの矢印で記した。a：ΔC-O、b：ΔC-C、c：ΔA-C、d：ΔC-A、e：ΔA-A、f：ΔD-C、g：ΔA-D、h：ΔC-Dである。パネル(C)、(E) および(F) 中の星印のピークは、2AB化ΔA-D-C六糖の溶出位置を示す。 構造決定した八糖のCS-56、MO-225、2H6およびLY111に対する反応性を検討した結果を示す図である。サメ軟骨CS-C由来の構造決定した八糖をDPPEで脂質誘導体とし、1、2および3のパネルに示すようにニトロセルロース膜上に固相化し、前述した方法に従い、八糖画分の脂質誘導体とCS-56 (A)、MO-225 (B)、2H6 (C) およびLY111 (D) との反応性を調べた。用いた画分中に含まれる構造決定した主要な八糖は、次のとおりである。a：C-C-C-O、b：配列未決定、c：C-C-C-C、d：C-C-A-C、e：C-C-C-A、f：C-C-A-A、g：D-C-C-C、h1：C-C-C-D、h2.2：C-C-A-D + A-D-C-C、i1：D-C-C-A、i2：C-A-D-C、N. C.：脂質誘導体にしていない八糖をネガティブコントロールとした。 CS-Cオリゴ糖の2H6およびLY111に対する反応性を検討した結果を示す図である。異なった構造を含むCS-C 4-mer、6-mer、8-merおよび10-merの各々の混合物 (図１) をDPPEで脂質誘導体とし、それぞれ25 pmolをニトロセルロース膜上に固相化した。2H6とLY111が結合する最小オリゴ糖サイズを決定するために、それらの交差反応性を調べた。 CS-C八糖のエキソ-シークエンシングのストラテジーを示す図である。各々の八糖画分 (300 pmol) の還元末端を2ABで標識し、ペーパークロマトグラフィーで過剰な2AB溶液を除去した後、2ABで誘導体化した八糖画分を各々コンドロイチナーゼABC、AC-IあるいはAC-IIで分解した。還元末端の二糖を同定するために、2ABで標識した不飽和二糖あるいは不飽和四糖分解生成物の一部を陰イオン交換HPLCで解析した (ステップ1)。一方、各々の分解生成物の残りをさらに2ABで標識し、ペーパークロマトグラフィーで精製後、非還元末端と糖鎖内部の二糖単位を同定するため、陰イオン交換HPLCで解析した (ステップ2)。

Claims (3)

  1. サメ軟骨由来のコンドロイチン硫酸をヒアルロニダーゼ処理後、ゲル濾過カラム、次いで陰イオン交換カラムを用いて分画することにより得られた、以下の（１）〜（１７）のいずれかの八糖構造の硫酸化オリゴ糖を含む画分。
    （１）C-C-C-O
    （２）C-O-A-C
    （３）C-O-A-A
    （４）C-C-A-C
    （５）C-C-A-A
    （６）C-A-C-C
    （７）D-C-C-C
    （８）C-D-C-C
    （９）C-D-C-A
    （１０）A-D-C-C
    （１１）C-C-C-D
    （１２）C-D-A-A
    （１３）C-C-A-D
    （１４）D-C-A-C
    （１５）D-A-C-C
    （１６）C-A-C-D
    （１７）C-E-C-C
    （ただし、Oは、[GlcUAβ1-3GalNAc]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン］、Cは、[GlcUAβ1-3GalNAc(6S)]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン(6-O-硫酸)］、Aは、[GlcUAβ1-3GalNAc(4S)]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン(4-O-硫酸)］、Dは、[GlcUA(2S)β1-3GalNAc(6S)]、即ち、［グルクロン酸β1(2-O-硫酸)−3N-アセチルガラクトサミン(6-O-硫酸)］、Eは、[GlcUAβ1-3GalNAc(4S,6S)]、即ち、［グルクロン酸β1−3N-アセチルガラクトサミン(4-O-硫酸, 6-O-硫酸)］、の二糖構造をそれぞれ意味する。）
  2. 請求項１記載の硫酸化オリゴ糖の画分の、当該硫酸化オリゴ糖と相互作用する物質の探索のための使用。
  3. 請求項１記載の硫酸化オリゴ糖の画分から調製した、当該硫酸化オリゴ糖と相互作用する物質の探索に用いられるプローブ。
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