JP6025543B2 - ウェルシュ菌毒素防御剤 - Google Patents

Description

本発明は、植物抽出物を含有するウイルス感染及び細菌毒素防御剤に関する。

インフルエンザウイルスは、ヒトに感染し、風邪に似た症状、発熱を生じさせ、ヒトを死に至らせることもあるウイルスである。また、ロタウイルスは、乳幼児の冬の急性下痢症の最も主要な原因ウイルスである。これらのウイルス感染症は、急性の症状を呈し、発熱を伴うことが多く、重症化することが多いという特徴を有する。

これらのウイルス感染症の治療薬のうち、インフルエンザウイルス感染症治療薬については数種類が上市されているが、ロタウイルス感染症については未だ開発されるに至っていない。また、現在上市されているインフルエンザウイルス感染症治療薬には、神経症状等の副作用の問題がある。

また、細菌の中には、食中毒に代表される中毒症状を発症させる菌が多く存在し、それら中毒症状の多くは菌体内毒素及び菌体外毒素を原因とするものが広く知られている。例えば、カンピロバクター、サルモネラ、腸炎ビブリオ、ウェルシュ菌等が知られている。これらの細菌の毒素による中毒症状は、腹痛、下痢、発熱、吐き気等を主症状とするものがほとんどである。
これらの細菌毒素による中毒症状を予防するには、原因となる細菌の増殖を抑制する、食品等の熱処理等がなされているが、毒素に対する防御作用を有する薬物はほとんど知られていない。

植物抽出物の中から抗ウイルス活性を有する成分を探索する試みは、多くなされており、ホオノキの樹皮（コウボク）の熱水抽出物（コウボクエキス）にインフルエンザウイルス感染阻止作用のあることが知られている（特許文献１）。

特開２０１１−７９８１７号公報

本発明の課題は、安全性の高い植物由来の成分の中からウイルス感染及び細菌毒素防御剤を提供することにある。

そこで、本発明者は、長野県木曽地方から岐阜県の飛騨地方にかけて、食品（朴葉巻き、朴葉寿しなど）の包装材として広く使用されているホオノキの葉（以下、ホオバともいう）に着目し、その抽出物及びその画分についてのウイルス感染阻止作用及び細菌毒素に対する作用を検討したところ、ホオノキの葉の熱水抽出物がホオノキ樹皮の熱水抽出物に比べて強いウイルス感染防御作用及び細菌毒素防御作用を有すること、さらにホオノキの葉の熱水抽出物中のウイルス感染防御の有効成分が、コウボク等に含まれる抗ウイルス成分であるホオノキオールやマグノロール等の低分子画分にあるのではなく、分子量２，０００〜５，０００の画分にあることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次［１］〜［５］を提供するものである。

［１］ホオノキの葉の熱水抽出物を有効成分とするウイルス感染又は細菌毒素防御剤。
［２］有効成分が、ホオノキの葉の熱水抽出物中の分子量２，０００〜５，０００の画分である［１］記載のウイルス感染又は細菌毒素防御剤。
［３］有効成分が、ホオノキの葉の熱水抽出物中の極性有機溶媒溶解性画分である［１］又は［２］記載のウイルス感染又は細菌毒素防御剤。
［４］有効成分が、ホオノキの葉の熱水抽出物の極性有機溶媒溶解性画分中の分子量２，０００〜５，０００の画分である［１］〜［３］のいずれかに記載のウイルス感染細菌毒素防御剤。
［５］ロタウイルス感染防御剤又はウェルシュ菌毒素防御剤である［１］〜［４］のいずれかに記載のウイルス感染防御剤。

本発明によれば、安全性が高く、優れたウイルス又は細菌毒素、特にロタウイルス感染又はウェルシュ菌毒素防御剤が提供できる。特にホオノキの葉の熱水抽出物は、コウボク熱水抽出物に比べて、ウイルスの吸着、侵入、増殖及び放出時の全てにおいて阻害作用が強く、感染防御効果が優れている。

ロタウイルス感染に及ぼす、ホオノキの樹皮及びホオバ熱水抽出物の阻害作用を示す。 ホオバ熱水抽出物のロタウイルス下痢症発症に及ばす作用を示す。 ホオバ熱水抽出物の溶媒可溶性画分のロタウイルス侵入に及ぼす作用を示す。 ホオバ熱水抽出物の酢酸エチル画分の限外ろ過分画物がロタウイルス侵入に及ぼす作用を示す。 ホオバ熱水抽出物のメタノール画分の限外ろ過分画物がロタウイルス侵入に及ぼす作用を示す。 ホオバ熱水抽出物のウェルシュ菌毒素に対する防御作用を示す。

本発明のウイルス感染細菌毒素防御剤の有効成分は、ホオノキの葉の熱水抽出物である。前記特許文献１には、ホオノキの樹皮（コウボク）熱水抽出物にインフルエンザウイルス感染防御作用があることが記載されているが、ホオノキの葉の熱水抽出物にウイルスに対してどのような作用があるかは記載されていない。

ホオバとしては、モクレン科モクレン属の落葉高木であるホオノキ（Magnolia obovata）の葉であればよく、幼葉、成葉、老葉のいずれの時期のものでもよい。当該ホオバは、生のまま使用してもよく、乾燥させてから使用してもよい。

抽出に用いる熱水としては、５０〜１００℃の水であればよく、抽出効率の点で６０〜１００℃の水が好ましい。また、抽出手段としては、ホオバを熱水に浸漬させる方法、水蒸気蒸留等の蒸留法、ソックスレー抽出器を用いる方法などが挙げられるが、浸漬法が簡便である。抽出に用いる熱水の量は、ホオバの乾燥重量１質量部に対して５〜２０質量部、さらに１０〜１５質量部が好ましい。抽出時間は１０分〜５時間が好ましく、３０分〜３時間がより好ましい。

ホオバの熱水抽出物は、そのまま使用してもよいが、濃縮液として、又は濃縮して粉末として使用してもよい。

ホオバの熱水抽出物には、低分子量の成分から高分子量の成分まで多くの成分が含まれるが、本発明のウイルス感染防御剤としては、分子量２，０００〜５，０００の画分を用いるのが、抗ウイルス効果の点でより好ましい。かかる分子量２，０００〜５，０００の画分に抗ウイルス効果があることは、特許文献１のタンニン、リグナン類等が有効である旨の記載を考慮すると意外である。分子量２，０００〜５，０００の画分は限外ろ過膜で分画するのが好ましい。

また、ホオバ熱水抽出物のうち、極性有機溶媒に溶解する画分に、より高い抗ウイルス作用が認められる。極性有機溶媒としては、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等の低級アルコール；エチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール；酢酸エチル等のエステル；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテルが挙げられ、このうち低級アルコール及びエステルがより好ましく、メタノール、エタノール、酢酸エチルがさらに好ましい。これらの極性有機溶媒画分の採取は、オクデシルシリル化シリカゲルカラム例えばSep-Pak Ｃ１８カラム（ウォーターズ社）によって行うことができる。

また、ホオバ熱水抽出物のうち、抗ウイルス作用の点から、極性有機溶媒画分中の分子量２，０００〜５，０００の画分（限外ろ過）がさらに好ましい。より具体的には、ホオバ熱水抽出物のうちの低級アルコール又はエステル溶解性画分中の分子量２，０００〜５，０００画分がさらに好ましい。

ホオバ熱水抽出物は、後記の実施例に示すように、優れたウイルス感染防御作用及び細菌毒素防御作用、特に優れたロタウイルス感染防御作用及びウェルシュ菌毒素防御作用を有する。ウイルスの感染ステージには、細胞への吸着、細胞への侵入、細胞内での増殖及び細胞からウイルス粒子の放出の４ステージが存在するが、ホオバ熱水抽出物は当該吸着、侵入、増殖及び放出時の細胞培養系への添加による比較条件において、ホオノキの樹皮の熱水抽出物に比べて顕著に優れている。
また、ホオバ熱水抽出物は、経口投与においてもロタウイルスによる下痢症の発症を有意に抑制し、経口投与でも有効である。さらに、ホオバ熱水抽出物のうち、極性有機溶媒溶解性画分及び分子量２，０００〜５，０００の画分は、ホオバ熱水抽出物全体に比べてウイルス感染防御活性が強力である。
従って、ホオバ熱水抽出物は、インフルエンザウイルス又はロタウイルスの感染防御剤、及びウェルシュ菌、カンピロバクター、腸炎ビブリオ、サルモネラ等の細菌毒素防御剤として有用である。

本発明のウイルス感染細菌毒素防御剤は、経口投与又は非経口投与のいずれでも使用できるが、経口投与が望ましい。投与に関しては、有効成分であるホオバ熱水抽出物を投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。

本発明のウイルス感染又は細菌毒素防御剤の有効成分であるホオバ熱水抽出物を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その好適な投与量はホオバ熱水抽出物については乾燥重量で１日当たり１ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは１０ｍｇ〜１ｇである。

このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。

また、本発明のウイルス感染又は細菌毒素防御剤は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、ホオバ熱水抽出物をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。この飲食品は、ウイルス感染症に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的にホオバ熱水抽出物を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物用の飼料も含まれる。

以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。

実施例１
ホオバを乾燥して細断し、ホオバ２０ｇに対し、２００mLの超純水を加え、１００℃で１時間抽出した。得られた水相を凍結乾燥した。

実施例２
サルロタウイルスＳＡ−１１株（グループＡ、タイプIII）をサル胎児由来腎細胞株ＭＡ１０４に感染させ、ウイルス感染ステージにおける阻害作用を試験した。検体としては、ホオバ熱水抽出物及びホオノキ樹皮熱水抽出物を用いた。ホオバ熱水抽出物は、実施例１における幼葉のものを用いた。ホオノキ樹皮熱水抽出物は、ホオバを樹皮に代える以外は、実施例１と同様にして抽出したものを用いた。

ＭＡ１０４細胞２．５×１０⁵cells／mLを改良イーグル基礎培地に接種し、９６ウェル細胞培養プレート（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて３７℃で２４時間培養した。これにサルロタウイルスＳＡ−１１株を１．３×１０⁵ＴＣＩＤ₅₀接種した。検体は、ウイルス添加培養開始時（吸着時）、１時間後（侵入時）、９時間後（増殖時）、１７時間後（放出時）にそれぞれ添加した。７２時間培養後に培養液を除去し、リン酸緩衝生理食塩水に１５０μｇ／mLに調製したニュートラルレッドを用いて細胞を２時間染色した。その後染色液を除去洗浄後に脱染色溶液（１％酢酸、５０％エタノール）を１５０μL／wellで添加して３０分の脱色の後、上清の５７０nmにおける吸光度を測定して細胞変性を数値化し、阻害活性を測定した。

その結果を図１に示す。図１中のＩＣ₅₀値は、５０％阻害濃度であり、量は熱水抽出物の乾燥重量である。図１から、ホオバ熱水抽出物は、ホオノキ樹皮熱水抽出物に比べて、吸着時、侵入時、増殖時及び放出時の添加による比較試験のいずれにおいても、ロタウイルスの感染阻害効果が強かった。

実施例３
ＢＡＬＢ／ｃ系乳仔マウス（７日齢、ｎ＝１４）を用いてロタウイルス下痢症モデルに対する、ホオバ熱水抽出物の経口投与による効果を検討した。
ロタウイルス１．３×１０⁵ＴＣＩＤ₅₀及びホオバ熱水抽出物（１mg／mL）をそれぞれ１：１で懸濁し、室温下で１時間静置し、４０μLを経口投与した。経口投与した日から７日間毎日下痢状態を観察し、累積下痢症発症率を計算し、Ｆｉｓｈｅｒ検定法による統計処理を行った。

結果を図２に示す。図２から、ホオバ熱水抽出物は、経口投与でロタウイルス下痢症の発症を抑制する効果を示した。

実施例４
Sep-Pak Ｃ１８カラム（ウォーターズ社）をメタノール１００mL及び０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水１００mLでプレコンディションした。これに、実施例１で得たホオバ熱水抽出物５００mgを０．１％ＴＦＡ水溶液１００mLに溶解した液を添加した。次いで酢酸エチル１００mLを加えて、さらにメタノール１００mLを添加し、各画分を得た。ＴＦＡ水画分３９７mg、酢酸エチル画分５７mg、メタノール画分４６mgをそれぞれ得た。

得られた各画分を用いて、実施例２と同様にして、ロタウイルス侵入に及ぼす作用を検討した。その結果を図３に示す。
図３より、ホオバ熱水抽出物のうち、酢酸エチル及びメタノール溶出画分に強いロタウイルス感染防御作用が認められた。

実施例５
実施例４で得た酢酸エチル画分及びメタノール画分を限外ろ過膜ビバスピンシリーズ（日本ジェネティクス社）に付し、各分子量画分を得た。得られた分子量画分を用いて、実施例２と同様にして、ロタウイルス侵入に及ぼす作用を検討した。その結果を図４（酢酸エチル画分）及び図５（メタノール画分）に示す。
図４及び図５より、ホオバ熱水抽出物のうち、分子量２，０００〜５，０００の画分に強いロタウイルス感染防御作用が認められた。

実施例６
ヒト結腸細胞株Ｃａｃｏ−２を、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）で生育させた培養系を準備し、ＩＭＤＭ培地（pH４．０）中でＣＰＥ（和光純薬社製）と朴葉熱水抽出物（実施例１）を１時間作用させた混合物（ＣＰＥの終濃度０．５μg／mL、朴葉熱水抽出物の終濃度１mg／mL）、ならびに比較対照としてＩＭＤＭ培地（pH４．０）に０．５μg／mLになるよう調製したＣＰＥ溶液のみを１００μL加え、３７℃で３０分間作用させた。その後培養上製を除去し、細胞をハンクス平衡緩衝塩溶液で洗浄した後、リン酸緩衝生理食塩水に１５０μg／mLに調製したニュートラルレッドを用いて細胞を２時間染色した。その後染色液を除去洗浄後に脱染色溶液（１％酢酸、５０％エタノール）を１５０μL／wellで添加して３０分の脱色の後、上清の５７０nmにおける吸光度を測定して細胞変性を数値化し、阻害活性を測定した。
その結果を図６に示す。図６中の縦軸はＣＰＥ無添加の状態で同様の処理を行ったニュートラルレッド染色結果を生存率１００％換算した際の相対パーセンテージを示したものである。pH５．０において、ＣＰＥによる細胞傷害が２０％まで低下するのに対し、ＣＰＥと朴葉熱水抽出物を１時間作用させた混合物を添加したものでは生存率が５５％まで回復し、スチューデントのｔ検定で有意（ｐ＜０．０１）な抑制効果が観察された。

Claims (4)

1. ホオノキの葉の熱水抽出物を有効成分とするウェルシュ菌毒素防御剤。
2. 有効成分が、ホオノキの葉の熱水抽出物中の分子量２，０００〜５，０００の画分であ
   る請求項１記載のウェルシュ菌毒素防御剤。
3. 有効成分が、ホオノキの葉の熱水抽出物中の極性有機溶媒溶解性画分である請求項１又
   は２記載のウェルシュ菌毒素防御剤。
4. 有効成分が、ホオノキの葉の熱水抽出物の極性有機溶媒溶解性画分中の分子量２，００
   ０〜５，０００の画分である請求項１〜３のいずれか１項記載のウェルシュ菌毒素防御剤。