JP2004256426A - 抗腫瘍剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】センダン科(Meliaceae)に属する植物、つまり、センダンの葉、茎、枝、樹皮及び実の乾燥粉砕物、若しくはその水又は酢酸エチル、四塩化炭素、クロロフォルム、ジクルロメタン、メタノール、エタノール、(イソ)プロピルアルコール、ブタノール、アセトン又はDMSOなどの有機溶剤での抽出物を含有する抗腫瘍剤。
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍剤、特に、植物由来の成分を含有し、ヒトの大腸癌、胃癌及び肺癌に対して優れた効果を有する抗腫瘍剤、及び食品に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
医療技術が進歩し、高齢化が更新されている現在において、癌は依然として重大な病気として存在している。もちろん、癌の治療技術も大いに進歩し、合成医薬、漢方、天然物からの抽出物などをベースとする数多くの医薬が開発されている。合成医薬に対して、天然物からの抽出物は副作用の点で優れており、例えば、西洋イチイからタキソールが発見され、抗癌剤の有効成分として用いられている(特開昭63−30478号公報や特開平7−233064号公報など)が、その副作用は依然として大きいものである。
【特許文献1】
特開昭63−30478号公報
【特許文献2】
特開平7−233064号公報
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物成分であって、抗腫瘍活性が高く、副作用が少ない抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
本発明は、又、植物成分を含有する食品を提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明は、植物成分における抗癌物質を探索している過程で、センダン科植物(以下センダン)成分が、in vitroで癌細胞を強く殺傷すること、特に、ヒトの大腸癌、胃癌及び肺癌細胞を殺傷し、かつセンダン抽出物が高い希釈においても癌細胞を殺傷するとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、センダン科植物又はその抽出物を含有することを特徴とする抗腫瘍剤を提供する。
本発明は、又、抗腫瘍剤を調製するためのセンダン科植物又はその抽出物の使用を提供する。
本発明は、又、センダン科植物又はその抽出物を含有する食品を提供する。
【0005】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるセンダン科植物は、センダン科(Meliaceae)に属する植物であって、太い枝先に羽状複葉をもち、円錐花序を有する常緑または落葉の高木が中心であるが、低木や草本状のものも存在している。これらのうち、特に、センダン(Melia Azedarach L.やMelia Azedarach var. subtripinnata)を用いるのが好ましい。本発明では、センダン科植物の葉、茎、枝、樹皮及び実を用いることができる。又、根皮を用いることもできる。センダン科植物自体を抗腫瘍剤の有効成分として使用する場合には、これらを乾燥した後、微細に粉砕して用いるのが好ましい。
【0006】
本発明では、センダン科植物の葉、茎、枝、樹皮及び実を、例えば、乾燥し、粉砕した後、又は未乾燥の生の状態で、水、例えば、蒸留水やイオン交換水で、又は親水性若しくは疎水性有機溶媒で抽出した液自体又はその乾燥物を用いることができる。ここで用いる有機溶媒としては、酢酸エチル、四塩化炭素、クロロフォルム、ジクルロメタン、メタノール、エタノール、(イソ)プロピルアルコール、ブタノール、アセトン又はDMSOがあげらる。ここで親水性溶媒は、含水形態で用いることもできる。使用する水や溶媒の量は任意とすることができるが、5分の1〜5倍量で用いるのがよく、特に約等量で用いるのが好ましい。又、抽出は、60℃以下であるのがよく、さらに室温で行うのが好ましく、特に、ミキサーなどで攪拌しながら行うのがよい。
センダン科植物の抽出物中の有効成分が、分子量10000以下のものであるのが好ましく、より好ましくは、分子量4000〜10000又は3000以下であり、最も好ましくは約5千である。
水又は溶媒抽出物は、そのままの液体状態で使用することもできるが、乾燥し、粉末、顆粒などの固形状で用いることもできる。
【0007】
尚、センダン科植物又はその抽出物を含有する抗腫瘍剤とする場合、これらに加えて、医薬上許容される各種の製剤用物質、例えば、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、潤滑剤、滑走剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、可溶化剤等を補助剤として含むことができる。具体的には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及びその他の糖類、タルク、ミルク蛋白、ゼラチン、澱粉、セルロース及びその誘導体、動物及び植物油、ポリエチレングリコール、グリセロールなどがあげられる。
【0008】
本発明の抗腫瘍剤は、経口投与によるのが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の抗腫瘍剤は、体重1Kg当たり、0.25〜2g程度の量で用いるのがよい。
又、センダン科植物又はその抽出物を含有する食品とする場合、健康食品や抗腫瘍活性を有する機能食品とすることができる。食品中のセンダン科植物又はその抽出物は、特に限定されないが、0.01〜5質量%程度含有させるのがよい。
【0009】
【発明の効果】
本発明によれば、センダン科植物又はその抽出物を有効成分として含有することにより、抗腫瘍活性が高く、副作用が少ない抗腫瘍剤が提供される。センダン抽出粗画成分は高い希釈においても大腸癌細胞を殺傷し、その力価は対照に用いた抗癌剤のマイトマイシンCよりも10,000倍以上も高いことが示された。一方、抗癌物質の探索に用いたヒトの胃癌および肺癌細胞に対し、本成分は対照に用いたマイトマイシンとほぼ同じ抗癌作用を有することも示された。
このように本発明によれば、各種腫瘍、特に、大腸癌、胃癌および肺癌に対して優れた抗腫瘍剤が提供される。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【0010】
【実施例】
実施例1
植物成分の抽出
沖縄県名護市郊外で自生しているセンダン(Melia Azedarach L.)の実、葉、枝、幹皮及び根皮の部分を採集して無乾燥の生の状態で秤量し、包丁でほぼ数ミリ程度の幅になるよう細切した。これに等重量の蒸留水を加えた上で市販の大型ミキサーを用いて毎分10,000回転で10分間処理した。この混合物を15〜50ml容量のプラスチック遠心管に分注し、ベックマンの遠心機(GS−15R)を用いて毎分5,000回転で60分間遠心した。これをセンダンの粗画総成分として、さらにザルトルウスのミニザルト(0.45μm)で濾過滅菌後試験に供した。蒸留水による成分抽出に加え、クロロフォルム、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、アセトン、ブタノール、エタノール、メタノール、ジクロロメタン、ベンゼン、エーテルの溶媒等も抽出実験に使用した。
【0011】
比較対照
比較対照として、すでに抗癌剤として広く使用されている市販のマイトマイシンC(協和発酵)を1ml当たり1mgになるよう−PBSに溶解させた。又、蒸留水で抽出する方法でスベリヒユ科(Portulacaceae)のマツバボタン(Portulaca pilosa L. ssp. grandiflora Geesink)についても粗画成分を抽出し、比較対照として検査に供した。
細胞と培養
ヒトの大腸癌細胞(HT−29)、胃癌細胞(MKN1)及び肺癌細胞(A549)は(財)癌研究会癌化学療法センター分子薬理部の矢守隆夫博士から分与を受け、それぞれの細胞を、5%ウシ胎児血清を含む市販のRPMI−1640(GIBCO)の培地を用い5cm2フラスコ(イワキ)中で継代維持した。
評価用細胞の培養
直径100mmプラスチックシャーレ(イワキ)に上記HT−29、MKN1及びA549細胞を、5%ウシ胎児血清を含むRPMI−1640培地で培養し、2日後に細胞をマイナス燐酸緩衝食塩水(−PBS)で洗滌、これにトリプシン−EDTA(GIBCO)を加えて細胞を分散、次いで5%ウシ胎児血清を含むRPMI−1640に浮遊させ細胞数を算定した。上記3種の細胞濃度は105/mlと定め、96穴(ウェル)の細胞培養用プラスチックプレート(イワキ)の1ウェルにつき0.1mlずつ分注した。例えば、各プレートのA列とH列、番号プレート1列と2列には培地のみ、2番から11番、B列からG列までに各試験用細胞を分注して、37℃で24時間培養した。
【0012】
評価方法
被検体センダン及びマツバボタン成分と比較対照のマイトマイシンCを血清の入っていないGIBCOのMinimum Essential Medium(MEM)で10−1から10−8、あるいは、10−1から10−4まで希釈し、各ウェルに100μlずつ分注した。各検体につき2列のウェルを用意し、B、C列の11番から8番目に被検体の10−1、10−2、10−3、10−4希釈液を、さらに2番、3番、4番、5番ウェルに10−5、10−6、10−7、10−8希釈液を添加、6番と7番目のウェルには培地のみを分注してそれぞれの被検体の対照とした。同様な手順に沿って、DとE列、FとG列に被検体の希釈液シリーズを配した。被検体を分注して2日間培養後、各ウェルに50%のトリクロロ酢酸(TCA)を50μl加えて4℃で1時間静置した。次に水道水を200μl加えて回洗滌してプレートを乾燥、それぞれのウェルにスルフォローダミン染色液を50μl加えて10分間静置、続いて1%酢酸を100μlずつ加えて5回洗滌してプレートを乾燥させた。最後に、各プレートに10mMのトリス(Tris[hidroxymethyl]aminomethane)液150μlを加えて毎分750回転で5分間振り、525nmの波長で吸光度を測定した。細胞の生存率は次のように算定した。
細胞の生存率 = 100×(各希釈点の被検体の平均吸光度−各希点に対応する培地対照の平均の吸光度)/(細胞対照の平均吸光度−各希釈点に対応する培地対照の平均の吸光度)
センダン成分の大腸癌(HT−29)、胃癌(MKN1)及び肺癌(A549)細胞に対する殺傷効果についての結果をまとめて表−1に示す。
【0013】
【表1】
【0014】
表−1から、センダンの葉由来の原液を10−8倍に希釈しても大腸癌はほぼ70%の致死率を見せており、比較対照のマイトマイシンCの実に10万倍以上の高い殺傷効果を奏することがわかる。
50%以上の致死率の値を算定するため、原液を100倍に希釈し、さらに10−1から10−8に希釈して再試験を実施した結果、106.3の50%致死率も示してあるが、センダン成分の高い大腸癌(HT−29)に対する殺傷効果が改めて実証されていることがわかる。
尚、センダンの葉成分の被検体の大腸癌に対する致死効果は希釈が進むに従って減少し、希釈と殺傷効果との間には用量反応曲線が成立した。一方、このセンダン成分の肺癌(A549)及び胃癌(MKN1)に対する殺傷効果は低いながらも確認され、肺癌細胞に対する50%致死率は101.9、さらに後者の胃癌細胞に対する細胞致死率も102.8であることが確認された。以上の結果から、センダン成分の中には大腸癌細胞を特異的に破壊する物質のあることが明らかとなり、また、その選択性の高い作用様式が他の正常細胞に対する副作用の小さいことが示唆された。同時に、センダン樹木成分の実、葉、枝、幹皮及び根皮にも大腸癌に対する強い殺傷効果があることがわかる。また、抽出効率に差はあるが、大腸癌、胃癌及び肺癌細胞に対する殺傷効果は、酢酸エチル、イソプロピルアルコール、アセトン、ブタノール、エタノール及びメタノール等の溶媒で抽出したセンダンの実、葉、枝、幹皮及び根皮の成分にも確認されている。
【0015】
さらに、それぞれの癌細胞に対する殺傷効果を比較するため、50%の癌細胞を殺傷する値を被検体の最高希釈倍数で概算し、その結果も表1に示してある。これによると、比較対照として用いた抗癌剤マイトマイシンCの上記3種の癌細胞(HT−29, MKN1, A549)に対する殺傷効果はlog10でおよそ1.8から3.6の範囲の致死率で、この効果はセンダン成分に比べて小さいことがわかる。一方、比較対照として評価されたマツバボタンの成分は大腸癌、胃癌及び肺癌細胞に対する50%致死率は101以下で、その殺傷効果はほとんどないことがわかる。
以上のことから、センダン樹木の実、葉、枝、幹皮及び根皮には大腸癌、胃癌または肺癌細胞を致死させる成分が含まれることが明らかである。従って、センダン科植物又はその抽出物を含有させることにより、癌の予防と治療に必要な健康食品、健康飲料、健康菓子類等を提供することができ、又、注射剤や錠剤などの形態の抗癌剤として用いることができる。
【0016】
熱安定性試験
濾過滅菌したセンダン粗画総成分を各試験管に1mlずつ分注、それぞれの成分をウォーターバス(温浴)中で40℃、60℃、70℃、80℃、90℃及び100℃で30分間加熱して、細胞の生存率についての評価試験に供した。センダン成分を40℃から100℃までの間を4点に分けて加熱、その後の大腸癌細胞への殺傷効果を調べた結果をまとめて表―2に示す。
【0017】
【表2】
【0018】
表−2の結果から、40℃の加熱での抗癌活性はほとんど変化せず、50%細胞致死率の値は108以上の希釈点にあることが分かる。60℃の50%細胞致死率はおよそ107.7、70℃以上でもほぼ同じ値となっていた。これに対し、80℃では105.8の50%致死率があり、90℃ではさらに減少し、その値は105.1近くにあることが示された。以上のことから、センダン成分中に含まれる抗大腸癌物質は80℃から緩やかに活失する傾向が認められたが、90℃あるいは100℃の加熱でも105近くの細胞致死率を示し、本成分は加熱に対しても比較的安定な物質を含んでいることが示唆された。
【0019】
分子量の予備測定
センダン成分中に存在する大腸癌を特異的に殺傷する物質の分子量を予測するため、遠心濃縮器を用いて成分を予備的に粗分画して抗癌活性を調べた。
まず、遠心濃縮器(ビバスピン20)の0.2μmの膜を用いて毎分5,000回転で50分間遠心(ベックマンGS−15R遠心機)してセンダン粗画総成分を濾過濃縮し、ビバスピン(VS206:分子量1,000,000)、ビバスピン(VS205:分子量300,000)、ビバスピン6(VS064:分子量100,000)、ビバスピン2(VS013:分子量50,000)、ビバスピン2(VS012:分子量30,000)、ビバスピン2(VS010:分子量10,000)及びビバスピン2(VS021:分子量5,000)中でベックマンGS−15R遠心機を用いて、毎分5,000回転60分間で遠心濃縮後、細胞の生存率についての評価試験に供した。結果をまとめて表―3に示す。
【0020】
【表3】
【0021】
表−3より、粗分画する前の220μmの濾過膜に通過によって得られたセンダン成分の50%細胞致死率は105.7付近にあり、これを基礎にしても、分子サイズ分別膜を通過してきた成分の抗癌活性は依然として高く、分子サイズ1,000,000から10,000までの50%細胞致死率はおよそ105.8から108以上の間にあることがわかる。この時のマイトマイシンCの細胞殺傷効果は103を越えた付近にあり、センダン成分の抗癌活性が非常に高いことがわかる。ところが、分子サイズ5,000の物質を分別する濾過膜を使用した検体について調べてみると、大腸癌細胞に対する生存率は依然として高かったが、胃癌と肺癌に対する殺傷効果は消失していることがわかった。この原因が、センダン成分中に含まれる抗癌因子が複数存在し、大腸癌に対する殺傷因子が分子量5,000以下と小さく、残り2種の癌細胞に作用する癌細胞殺傷因子が分子量5,000以上のより大きい分子であることが示唆された。以上の結果から、センダン科植物成分中に含まれる単一、あるいは複数の抗大腸癌活性物質の分子サイズは5,000前後のものであると想定した。
Claims (8)
- センダン科植物又はその抽出物を含有することを特徴とする抗腫瘍剤。
- センダン科植物の抽出物が、センダン科植物の葉、実、枝又樹皮の水性抽出物である請求項1記載の抗腫瘍剤。
- センダン科植物の抽出物が、センダン科植物の葉、実、枝又樹皮の有機溶剤抽出物である請求項1記載の抗腫瘍剤。
- 有機溶剤が、酢酸エチル、四塩化炭素、クロロフォルム、ジクルロメタン、メタノール、エタノール、(イソ)プロピルアルコール、ブタノール、アセトン又はDMSOである請求項3記載の抗腫瘍剤。
- センダン科植物の抽出物中の有効成分が、分子量10000以下のものである請求項1〜4のいずれか1項記載の抗腫瘍剤。
- 大腸癌、胃癌又は肺癌を治療するためのものである請求項1〜5のいずれか1項記載の抗腫瘍剤。
- 抗腫瘍剤を調製するためのセンダン科植物又はその抽出物の使用。
- センダン科植物又はその抽出物を含有する食品。
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091217 |
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A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20100506 |