KR101609935B1

KR101609935B1 - 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 항암 보조용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101609935B1
Application number: KR1020140085787A
Authority: KR
Inventors: 강세찬; 정용준; 김주환; 권정은; 박대원; 정문원
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2016-04-07
Also published as: KR20160006814A

Abstract

본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 항암보조용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 고련피의 노르말헥산 분획물과 시스플라틴 (cisplatin)의 병용 투여 시 암세포의 TGF-β와 TNF-α를 조절하여 항암 상승효과와 부작용 완화 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 상기 두 물질을 병용 투여함으로서 단독 투여에 비해 TGF-β와 TNF-α를 더 우수하게 조절하여 암세포의 세포증식을 유의하게 억제하며, 시스플라틴에 대한 부작용을 감소시킬 수 있어 기존의 항암제에 대한 암 치료 상승효과 및 부작용 감소 효과를 동시에 나타낼 수 있다.

Description

고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 항암 보조용 약학적 조성물{Composition for adjuvant chemotherapy comprising a n-hexane fraction of Meliae Cortex extract}

본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물과 시스플라틴의 병용투여를 통한 암세포의 TGF-β와 TNF-α 조절 항암 상승효과 및 기존의 항암제의 부작용을 완화시킬 수 있는 신규의 항암 보조용 조성물에 관한 것이다.

암을 포함한 각종 성인병은 식생활 습관의 변화와 평균 수명의 연장으로 증가 추세에 있으며, 이에 따른 치료제 개발 연구가 활발히 진행 중이다. 이 중 암은 세계적으로 심장 질환 다음으로 높은 사망률을 가진 질병으로 최근 우리나라의 경우에도 사망률 순위를 구성비로 보면 암으로 인한 사망률이 매우 높다. 이러한 암의 치료에는 외과적 수술방법 이외에도 화학요법, 방사선 요법 등이 널리 사용되어 왔으나, 이런 치료요법은 암세포뿐 만 아니라 정상 세포에도 영향을 미쳐 소화기관과 골수 조직의 손상, 탈모, 면역력 저하 등 여러 부작용을 일으키는 단점이 있다. 또한 암 확진 후 전이가 된 경우가 많아서 이미 암으로 발전한 후에는 각 종 물리적, 화학적 요법을 동원하여도 완전한 치료가 어렵다.

화학적 요법은 악성종양의 치료를 위해 가장 흔히 사용되는 방법으로 주로 항암제를 사용하며, 항암제는 암세포의 DNA에 직접 작용하여 암세포의 복제, 전사, 번역 과정을 차단하거나, 암세포의 분열을 저해함으로써 증식을 억제한다. 현재 암 치료에 사용되는 항암제는 크게 알킬화제, 대사길항제, 항생물질, 유사분열억제제, 호르몬제 및 기타 제제로 분류되며, 대표적으로 독소루비신 (Doxorubicib), 시스플라틴 (Cisplatin), 5-FU, 닥티노마이신 (Dactinomycin), 도세탁셀 (docetaxel) 등 현재 약 60여종의 다양한 항암제가 사용되고 있다. 그러나 이러한 항암제들은 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포에도 손상을 입히기 때문에 골수 기능 저하, 위장관 점막 손상, 탈모 등 여러 부작용이 나타나는 단점이 있다. 따라서 인체에 안전하고 부작용이 적은 천연물질을 대상으로 종래의 암 세포 성장억제 물질과 동등하거나 또는 상승 효능을 가지는 새로운 물질을 개발할 필요성이 대두되고 있으며, 암 질환의 치료를 위하여 기존의 항암제의 문제점인 부작용 및 효능 감소의 문제점을 극복하면서도 효과적인 항암 활성을 갖는 새로운 암치료 방법의 개발이 시급한 실정이다.

상기와 같은 항암제들의 암세포 생장억제 효능 증가와 부작용을 감소시키기 위하여 단일 제제의 항암제를 사용하기 보다는 작용기전이 서로 다른 약제를 사용하는 병용요법 또는 천연물을 이용한 부작용이 없는 새로운 항암제를 개발하는 방법 등이 제시되어 연구되고 있다. 이러한 이유로 최근 식이와 관련된 암의 원인 물질을 검색하는 연구 뿐 아니라 식생활에서 섭취하는 식품 중 항암제로 이용하기 위한 물질 탐색 연구도 활발히 진행되고 있다. 특히 우리나라의 경우 200 여종의 한방 생약제가 암 환자에게 처방되고 있음이 통계적으로 보고되었고 (Hong, 1972; Cha, 1977), 여러 종의 한약재 (Hwang 등, 1982)와 마늘 (Son과 Hwang, 1990), 인삼 (Hwang과 Oh, 1984) 및 도라지 (Lee 등, 1998) 등에서 항암 작용이 있는 것으로 보고되고 있다.

고련피는 멀구슬나무 (Melia azedarach L. var. japonica Makino)의 수피 또는 근피로서 한국, 중국 및 일본이 원산지이다. 고련피는 구충 및 살충작용 (Cespedes 등, 2001), 항말라리아작용 (Ofulla 등, 1995), 피임작용 (Keshri 등, 2003), 항균작용 (Khan 등, 2001)이 있는 것으로 알려져 있으며, 정장약, 조충구제약 및 말라리아열 치료에 이용되고 있다. 또한 고련피 에탄올 추출물은 iNOS를 억제하며, beta-carboline alkaloid류는 Raw264.7 세포주에서 iNOS를 억제하여 항염증작용 (Lee et al., 2000; Kwon et al., 1999)을 나타낸다고 보고되어 있다. 또한, 본 발명자는 고련피 추출물의 항암활성 효과를 동물실험을 통해 보고한 바 있으며 (Kim and Kang, 2009), Takeya 등 (1996a; 1996b)은 고련피의 trichilin-type limonoid류 및 azadirachtin-type limonoid류가 HeLa 및 P388 세포주 에 세포독성을 나타낸다고 보고한 바 있다. 그러나 Takeya 등이 연구한 고련피의 항암성분 및 효능은 고련피 70% 에탄올 추출물의 디클로로메탄 분획물에서 분리한 성분으로 매우 강한 세포독성 효능을 나타내는 특징을 가진다.

세포 증식 억제와 관련된 대표적인 사이토카인인 TGF-β는 배양된 섬유아세포를 종양과 유사한 표현형질로의 변환을 촉진시키는 인자로써, 종양형성을 촉진시키는 역할을 한다. 또한 TNF-α는 생체내에서 단독 혹은 다른 사이토카인과 상호작용하여 몇몇 종양의 혈관조직을 손상시키며, 종양괴사를 유발한다.

이에, 본 발명자들은 종래 알려진 항암제들과 병용투여 시 항암 상승효과가 나타나면서 부작용이 거의 없는 생약 성분을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 기존 항암제 중 여러 가지 암 질환에 사용되고 있는 시스플라틴과 직접적인 항암활성이 없는 고련피 노르말헥산 분획물의 병용투여가 항암 상승효과 및 시스플라틴의 부작용 완화 효과가 있음을 확인하였으며, 상기 약물의 병용투여는 단독투여군 보다 암세포 생장관련 사이토카인인 TGF-β의 생성을 억제하고, 종양괴사 인자인 TNF-α의 생성을 촉진시키므로 항암 보조효과가 우수한 약학적 조성물로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 항암보조용 조성물을 특징으로 하며, 고련피 노르말헥산 분획물은 시스플라틴과 병용투여 시 단독투여군 보다 암세포 생장관련 사이토카인인 TGF-β의 생성을 억제하고, 종양괴사 인자인 TNF-α의 생성을 촉진한다.

따라서, 본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 TGF-β 및 TNF-α 조절 항암 보조용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 항암 보조용 조성물의 제조방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다. 상기 제조방법은, 고련피를 탄소수 1 ~ 4의 알코올로 추출하여 알코올 추출물을 얻는 단계(1);그리고 상기 알코올 추출물을 노르말 헥산으로 분획하여 고련피 분획물을 얻는 단계(2);를 포함한다.

본 발명에서 항암 보조용 조성물에 포함되는 고련피 노르말헥산 분획물은 세포독성이 거의 나타나지 않는 물질로 항암제와의 병용투여 시 항암 상승효과 및 항암제 부작용 감소의 특징적인 효능을 나타낸다.

본 발명의 고련피 노르말헥산 분획물을 기존 항암제와 병용투여 시 생체내에서 중공섬유 (hollow fiber)내에 이식한 암세포가 항암제 및 고련피 노르말헥산 분획물의 단독투여군 보다 우수하게 암세포의 세포증식을 억제하고 암세포 증식에 관련된 사이토카인인 TGF-β의 생성을 억제하며, 종양괴사 인자인 TNF-α의 생성을 증가시킬 수 있다. 또한, 독성시험에서 항암제 단독투여군 보다 항암제로 인한 부작용을 완화하므로 본 발명의 고련피 노르말헥산 분획물은 항암제 특히 시스플라틴과 병용투여 시 항암활성의 시너지 효과를 나타내며, 시스플라틴의 부작용을 완화시키는 효능이 있다.

도 1은 본 발명의 고련피 노르말헥산 분획물과 시스플라틴 병용투여군의 암 세포 생장억제 상승효과를 생체내에서 A549 폐암 세포주를 이용하여 측정한 것이다.
도 2는 본 발명의 고련피 노르말헥산 분획물과 시스플라틴 병용투여 시 암세포 생장을 조절하는 사이토카인의 생성양상을 A549 폐암 세포주를 이용하여 측정한 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명의 고련피 노르말헥산 분획물을 항암제와 병용투여 시 암 세포의 세포증식을 TGF-β 및 TNF-α 조절을 통해 효과적으로 억제하고, 생체내에서 부작용을 완화함으로써, 항암 보조용 조성물로 사용할 수 있으며, 이에 대하여 본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 항암 보조용 약학적 조성물에 대한 효능과 방법을 제공하는데 특징이 있다.

본 발명에 따른 멀구슬나무 수피 또는 근피의 고련피 노르말헥산 분획물은 기존 항암제와 병용투여 시 TGF-β 및 TNF-α 조절을 통해 암 세포의 세포증식이 효과적으로 억제되고, 기존 항암제의 부작용이 완화됨을 확인하였다.

본 발명의 항암 보조용 조성물을 항암제와 함께 투여하는 경우, 암세포 생장관련 사이토카인인 TGF-β의 생성을 억제하고, 종양괴사 인자인 TNF-α의 생성을 촉진시켜서, TGF-β의 생성량보다 TNF-α의 생성량이 더 많아질 수 있다.

또한, 상기 항암 보조용 조성물을 항암제와 함께 투여하는 경우 암세포 생장관련 사이토카인인 TGF-β의 생성을 억제하고, 종양괴사 인자인 TNF-α의 생성을 촉진시켜서 항암제의 항암효과를 상승시키고 항암제에 의한 부작용을 줄일 수 있으며, 상기 항암 보조용 조성물에 의하여 유도되는 상승된 항암효과에 의하여 항암제의 투여량을 상기 항암 보조용 조성물을 사용하지 않았을 때와 비교하여 1/10 이하로 줄일 수 있다. 상기 항암제로는 시스플라틴일 수 있다.

따라서, 본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 항암 보조용 조성물을 특징으로 한다. 상기 분획물은 탄소수 1 내지 4의 알코올, 노르말헥산 용매로 추출, 분획된 것이거나 상기 용매로 1회 또는 2회 이상 추출, 분획된 것을 의미한다.

한편, 본 발명은, 1) 고련피를 세절하고 탄소수 1 ~ 4의 저급 알코올로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압 농축하여 알코올 추출물을 얻는 단계; 2) 상기 알코올 추출물을 농축한 후 물에 현탁하고, 노르말 헥산으로 분획한 다음 감압 농축하여 분획물을 얻는 단계;를 포함하여 얻어진 고련피 분획물을 포함하는 항암 보조용 조성물의 제조방법을 제공한다. 이를 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 고련피를 세절한 다음 고련피 중량(kg)의 1 ~ 100 배량(L) 바람직하게는 5 ~ 15배량의 탄소수 1 ~ 4의 알코올로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압 농축하여 고련피의 알코올 추출물을 얻는다. 이때, 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등이 바람직하다.

상기 추출물을 농축하여 엑기스 150 ~ 300 g을 얻고 이를 증류수 0.5 ~ 3L 에 현탁한 후, 0.3 ~ 3배량, 바람직하게는 현탁액과 각각 동일 량의 노르말헥산으로 분획한 다음 감압 농축하여 노르말헥산 분획물 30 ~ 100 g을 얻는다.

이렇게 얻어진 고련피 노르말헥산 분획물은 기존 항암제와 병용투여 시 대장암, 간암, 폐암 세포주를 이용한 암 세포 증식에서 효과적으로 암 세포 증식을 억제하였고, 동물 독성 시험에서 항암제에 의한 독성을 완화하였다.

따라서, 고련피 노르말헥산 분획물은 기존 항암제와 병용투여 시 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하고, 이에 따른 항암제의 부작용을 완화함으로써 효과적인 암 예방 및 치료 보조제로 적용될 수 있다.

또한, 건강식품이란, 상기 노르말헥산 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캅셀화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있어 항암보조제로 섭취가 가능하다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 고련피 추출물의 제조

고련피를 약재상으로부터 구입하여 세절하고 세절한 고련피 2.5 kg를 80 % 에탄올 7 ~ 20 L로 실온에서 3 ~ 5회 반복 추출하여 고련피 추출물 209 g(수율: 8.4%)을 얻었다.

제조예 2: 고련피 추출물의 분획물 제조

상기에서 얻어진 추출물을 증류수에 현탁한 후, 각각 동일 량의 노르말헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트와 노르말부탄올로 차례로 분획한 다음 감압 농축하여 노르말 헥산 분획물 (17 g)을 얻었다.

실시예 1 : 암 세포의 증식억제 효과측정

고련피 추출물 및 분획물에 의한 암 세포 증식억제 효과 측정은 MTT 방법 (Denizot와 Rita, 1986)을 변형하여 분석하였다. 대장암 세포주 HCT-15, 간암 세포주 Sk-hep-1 및 폐암 세포주 A549를 1×10⁴ cells/well의 농도가 되도록 96-well microplate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 24시간 후 고련피 추출물, 분획물을 100, 50, 25, 12.5 및 6.25 ㎍/ml 농도가 되게 세포에 처리하고, 양성대조군으로 시스플라틴을 사용하여 비교하였다. 24 시간 후, MTT (5 mg/ml) 용액을 각 well당 10 ㎕씩 넣고 세포 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 대장암 세포 (HCT-15), 간암 세포 (Sk-hep-1) 및 폐암 세포 (A549)에 고련피 추출물 및 분획물을 처리하였을 때 디클로로메탄 분획물과 에틸아세테이트 분획물에서 매우 강한 암 세포 증식억제 효능이 나타났으나, 노르말헥산 분획물에서는 간암 세포주를 제외한 암 세포에서 증식억제 효능이 나타나지 않았으며, 그 결과로 볼 때 고련피 노르말헥산 분획물은 세포독성이 나타나지 않음을 알 수 있다(표 1, 고련피 추출물 및 분획물의 암 세포 증식억제 효능 참조).

Samples	IC_{50 (㎍/ml)}
Samples	HCT-15	Sk-hep-1	A549
EtOH extract	87.9 ± 1.73	65.4 ± 1.98	> 100
n-Hexane fr.	> 100	91.1 ± 2.63	> 100
CH2Cl2 fr.	40.6 ± 1.05	38.4 ± 0.31	51.5 ± 0.87
EtOAc fr.	20.4 ± 0.38	11.5 ± 0.27	22.7 ± 0.84
n-BuOH fr.	> 100	> 100	> 100
H2O fr.	> 100	> 100	> 100
Cisplatin (μM)	8.4 ± 2.31	12.4 ± 0.24	16.7 ± 0.25

실시예 2 : 항암제 병용투여를 통한 암세포 생장억제 상승효과 측정

고련피 추출물 및 분획물과 기존 항암제인 시스플라틴과 독소루비신의 병용투여를 통한 암세포 생장억제 상승효과 측정 MTT 방법 (Denizot와 Rita, 1986)을 변형하여 측정하였으며, 대장암 세포주 HCT-15, 간암 세포주 Sk-hep-1 및 폐암 세포주 A549를 1×10⁴ cells/well의 농도가 되도록 96-well microplate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ 세포배양기에서 배양하였다. 24시간 후 각각의 세포에 대한 시스플라틴의 IC₆₀ (μM)농도를 계산하여 (HCT-15 : 3.2, Sk-hep-1 : 7.8, A549 : 12.8), 각각의 세포에 처리한 후 고련피 추출물, 분획물을 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 ㎍/ml 농도가 되게 세포에 처리하였다. 24 시간 후, MTT (5 mg/ml) 용액을 각 well당 10 ㎕씩 넣고 세포 배양기에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 550 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 대장암 세포 (HCT-15), 간암 세포 (Sk-hep-1) 및 폐암 세포 (A549)에 항암제 (시스플라틴) 처리 후 고련피 추출물 및 분획물을 처리하였을 때 디클로로메탄 분획물과 에틸아세테이트 분획물에서 매우 강한 암 세포 증식억제 효능이 나타났으나, 고련피 추출물 및 분획물 단독 처리군에 비해 암 세포 생장억제 활성이 더 낮아진 것을 알 수 있다 [표 2 참조]. 그러나 고련피 노르말헥산 분획물에서는 모든 세포주에서 암 세포 증식억제 효능이 나타났으며, 고련피 노르말헥산 분획물 단독 처리군에 비해 암 세포 생장억제 활성이 더 높아진 것을 확인할 수 있었다 [표 1 참조]. 이 결과로 미루어볼 때 고련피 노르말헥산 분획물은 그 자체로는 항암효능이 나타나진 않으나, 항암제와 함께 처리할 경우, 항암 상승효과로 인해 암 세포 생장억제 효능이 나타난 것을 알 수 있다.

Samples	IC₅₀ (㎍/ml)
Samples	HCT-15	Sk-hep-1	A549
EtOH extract	86.5 ±0.94	67.6 ±2.70	> 100
n-Hexane fr.	96.9 ±1.52	85.1 ±2.81	95.2 ±1.20
CH₂Cl₂ fr.	43.5 ±0.68	48.2 ±1.03	84.6 ±0.60
EtOAc fr.	23.0 ±1.09	27.9 ±1.85	54.8 ±2.02
n-BuOH fr.	> 100	> 100	> 100
H₂O fr.	> 100	> 100	> 100

실시예 3 : Hollow Fiber (HF) assay

Hollow fiber (HF) assay는 암세포의 증식율 변화를 생체내 (in vivo)에서 단기간에 확인할 수 있는 방법으로 전이암 및 고형암 모델 실험을 수행하기 전 실시할 경우, MTT나 sulforhodamine B(SRB) assay와 같은 in vitro 연구 결과보다 높은 신뢰도를 가지는 시험 방법이다.

본 실시예에서는 고련피 노르말헥산 분획물을 기존 항암제인 시스플라틴과 병용투여하여 마우스 체내에서 암 세포 생장억제 상승효과를 HF assay 방법(Bridges 등, 2006)을 변형하여 실시하였으며, 본 실시예에서는 고련피에 대한 세포독성이 적은 A549 폐암 세포주를 각각 1 x 10⁵ cells/㎖의 농도가 되도록 계수하여 implant membrane 내에 loading한 후 sealing하였다. 이식 전에 membrane을 6-well plate에 넣어 정상 조건하에서 12 시간 동안 in vitro 배양한 후 누드 마우스의 복강과 피하 조직에 각각 이식하였다. 이식 후 3일 이후부터 고련피 노르말헥산 분획물을 50, 100 및 200 mg/kg로 경구투여 하였으며, 시스플라틴은 2일 간격으로 4 mg/kg 농도로 꼬리정맥에 투여하였고, 총 7일 동안 투여를 실시하였다. 시험 종료 후 누드마우스 내 membrane을 옮겨 37℃에서 30분간 안정화시켰으며, MTT 용액이 들어있는 배지 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 2.5% protamine sulfate가 들어있는 saline으로 membrane을 세척하고 4℃에서 O/N 반응시킨 다음 saline을 제거하고 다시 2.5% protamine sulfate/saline을 2㎖ 첨가한 뒤 4℃에서 4시간 동안 반응시켰다. Membrane은 24-well plate로 옮긴 후, membrane을 반으로 자르고, O/N 건조시켰으며, DMSO를 250 ㎕ 넣은 다음 실온에서 4시간 동안 흔들어준 후 microplate reader를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 고련피 노르말헥산 분획물 단독 투여군에서는 암 세포 생장억제 효과가 나타나지 않았으며, 시스플라틴 단독 투여군에서도 35% 정도의 약한 암세포 생장억제 효과가 관찰되었다. 그러나 시스플라틴 (4 mg/kg, i.v)과 고련피 노르말헥산 분획물 (50, 100 및 200 mg/kg, p.o)의 병용투여군에서는 매우 우수한 암 세포 생장억제 효과가 나타났으며, 특히 고련피 노르말헥산 분획물 200 mg/kg에서는 60% 이상의 억제효과가 관찰되었다 [도 1].

실시예 4 : 28일 반복투여 독성시험

본 실시예는 고련피 노르말헥산 분획물과 시스플라틴의 병용투여로 인해 나타나는 생체내 부작용 완화효과를 알아보기 위해 실시하였다. 항암제 부작용 완화효과 시험은 5주령 SD 랫드를 이용하여, 고련피 노르말헥산 분획물 단독 투여군 (50, 100 및 200 mg/kg, p.o), 시스플라틴 단독 투여군 (4 mg/kg, i.v), 시스플라틴 ( 4 mg/kg, i.v)과 고련피 노르말헥산 분획물의 병용투여군 (50, 100 및 200 mg/kg, p.o)으로 나누어 실험하였다. 총 28일 동안 반복투여하였으며, 28일 후 랫드의 혈액을 채취한 후 생화학적 검사 및 혈액검사를 실시하였다.

그 결과 시스플라틴 단독 투여군에 비해 고련피 노르말헥산 분획물과 시스플라틴 병용투여군에서 AST, ALT, Creatinine 및 BUN 수치가 정상군 (비투여군)과 비슷한 양상을 나타내었으며, 이와같이 고련피 노르말헥산 분획물은 항암제로 인한 간독성 및 신장독성을 보호하는 효과를 가지고 있다. [표 3]

또한 혈액지표에서는 시스플라틴 단독 투여군에 비해 고련피 노르말헥산 분획물과 시스플라틴 병용투여군에서 백혈구, 림프구의 수치가 정상군 (비투여군)과 비슷한 양상을 나타내었으며, 이와같이 고련피 노르말헥산 분획물은 항암제로 인한 부작용을 완화시키는 효과를 가지고 있다. [표 4]

Dose (mg/kg b.w)	TBILI (mg/dL)	AST (U/L)	ALT (U/L)	CREAT (mg/dL)	BUN (mg/dL)
Control	2.2±.53	28.0±.77	15.7±.69	0.9±.09	11.2±.56
50	2.5±.58	31.0±.90	19.5±.62	0.9±.10	10.1±.52
100	2.7±.82	29.5±.52	20.3±.80	0.8±.29	12.8±.30
200	3.0±.02	33.8±.89	19.4±.65	1.0±.09	15.7±.92
Cisplatin	2.7±.55	39.1±.82^**	22.2±.81^*	1.3±.16^**	22.0±.95^**
Cisplatin 50	2.7±.49	37.7±.14^**	21.1±.44^*	1.2±.36^*	21.3±.52^**
Cisplatin 100	2.7±.52	35.0±.60^*	20.5±.67^*	1.1±.31	19.7±.59^**
Cisplatin 200	2.5±.31	30.5±.74^##	19.6±.32	1.0±.28	12.5±.82^##

*Significantly different from the control at p<0.05. **Significantly different from the control at p<0.01.##Significantly different from the cisplatin only at p<0.01.

Dose (mg/kg b.w)	WBC (K/uL)	LY (K/uL)	MO (K/uL)	EO (K/uL)	RBC (M/dL)
Control	11.7±3.87	6.75±3.29	0.7±0.08	0.4±0.18	9.6±3.37
50	13.1±5.71	6.8±4.25	0.7±0.23	0.4±0.16	10.8±2.80
100	12.4±3.89	6.0±2.99	0.7±0.23	0.5±0.17	7.8±3.40
200	12.2±3.11	5.8±2.37	0.7±0.23	0.5±0.14	8.0±4.45
Cisplatin	6.5±2.56^**	3.9±1.71^*	0.7±0.22	0.4±0.11	10.9±4.73
Cisplatin 50	7.1±3.47^*	4.0±2.36	0.7±0.23	0.4±0.11	9.8±3.81
Cisplatin 100	10.1±2.68^#	6.6±2.41	0.6±0.24	0.4±0.11	12.0±3.36
Cisplatin 200	11.1±3.56^##	5.0±2.23	0.6±0.23	0.4±0.11	9.6±3.80

* Significantly different from the control at p<0.05. **Significantly different from the control at p<0.01.#Significantly different from the cisplatin only at p<0.05. ##Significantly different from the cisplatin only at p<0.01. LY, lymphocytes; MO, monocytes; EO, eosinophils.

실시예 5 : 항암제 병용투여를 통한 암세포 생장관련 사이토카인 억제 측정

본 발명의 고련피 노르말헥산 분획물과 항암제의 병용투여 시 암세포 생장억제 정도를 사이토카인 수준에서 알아보기 위해 암세포 생장에서의 대표적인 사이토카인인 TGF-β와 TNF-α의 생성량을 측정하였다.

폐암세포인 A549 세포를 5×10⁶ cells/well 농도로 6 well plate에 분주한 후 24시간 동안 배양하였으며, cisplatin는 IC₅₀ 농도인 20 μM, 고련피 노르말 헥산 분획물은 독성이 나타나지 않은 최고 농도인 100 ㎍/ml을 처리하였다. 세포배양 상등액을 수집하여 실험에 사용하였으며, TGF-β과 TNF-α 사이토카인의 생성량은 ELISA kit를 구입하여 측정하였고, 프로토콜에 준하여 실험한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

TGF-β가 과도하게 발현되는 암세포의 경우, 이로 인해 세포성장을 촉진시키며, TNF-α는 항암활성을 가지고 있어 암세포 타겟 대식세포에 활성화 신호를 전달한다. 도 2에서 고련피 노르말 헥산 분획물은 단독 처리 시 대조군과 비슷한 양상을 나타내었으나, cisplatin과 병용투여 시 cisplatin 단독 투여군 보다 TGF-β 생성량을 억제하였으며, 반대로 TNF-α의 생성량을 증가시켰다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

고련피 노르말헥산 분획물을 포함하여 시스플라틴의 항암효과를 상승시키고 부작용을 저하시키는, 항암 보조용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 고련피 노르말헥산 분획물은 고련피 에탄올 추출물의 노르말헥산 분획물인, 항암 보조용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 고련피 노르말헥산 분획물은 TGF-β와 TNF-α를 조절하여 항암 상승효과를 나타내고, 상기 시스플라틴의 간독성과 신장독성을 완화하는 것인, 항암 보조용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 고련피 노르말헥산 분획물은 대장암, 폐암, 간암에서 항암 상승효과를 나타내는, 항암 보조용 조성물.
고련피를 탄소수 1 ~ 4의 알코올로 추출하여 알코올 추출물을 얻는 단계(1);그리고
상기 알코올 추출물을 노르말 헥산으로 분획하여 고련피 분획물을 얻는 단계(2);를 포함하는, 제 1항에 따른 항암 보조용 조성물의 제조방법.