DE3390431T1

DE3390431T1 - Test für autoimmune rheumatoide Arthritis

Info

Publication number: DE3390431T1
Application number: DE19833390431
Authority: DE
Inventors: Doina Elmhurst Ill. Ganea; Alexander Michel Chicago Ill. Gaspar; John Lyle Chicago Ill. Skosey; Gregory Todd Forest Park Ill. Spear; Marius Constantin Westchester Ill. Teodorescu
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1982-12-30
Filing date: 1983-12-29
Publication date: 1985-05-15
Also published as: GB2142723A; NL8320427A; JPS60501027A; WO1984002778A1; GB2142723B; EP0131041A1; EP0131041A4; GB8421519D0; US4499186A; CH666555A5

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie und schafft eine zuverlässige Methode für die frühe Diagnose und Entdeckung der Rheumatoidarthritis. Weiterhin werden diagnostische Mittel zur Verfügung gestellt in Form eines Probensatzes für die schnelle Bestimmung des Vorhandenseins von rheumatoide Arthritis bei einem Patienten.

Es ist wohlbekannt, daß einige Krankheiten einen autoimmunen, pathogenen Mechanismus haben. Unter diesen befinden sich Rheumatoidarthritis, systemischer Lupus erythematosus und chronisch aktive Hepatitis. Ein allgemeiner Anstieg des Levels an Gammaglobulinen (Antikörpern) begleitet oft einen Anstieg des Levels eines speziellen Antikörpers oder mehrerer Antikörper im Patientenserum. Diese Beobachtungen haben zu dem Vorschlag geführt, daß die polyklonale (allgemeine) Aktivierung von B-Lymphocyten mit dem Krankheitsprozeß verbunden ist und dem Auftauchen eines speziellen Antikörpers sogar vorhergehen könnte. Zum Beispiel können bei der Rheumatoidarthritis die Symptome auftauchen, bevor der charakteristische Antikörper, d. h. der Rheumatoidfaktor, sich entwickelt.

Andererseits ist es von anderen Arthritiden bekannt, daß sie keine systemische autoimmune Basis haben und im allgemeinen als "serumnegativ" beschrieben werden. Diese schließen ein: Reiter's Syndrom, gelenkversteifende Spondylitis, psoriatische Arthritis, Osteo-Arthritis und Gicht.

2 3330431

Bei jeder Autoimmunkrankheit wurde das Vorhandensein von einem oder verschiedenen Antikörperspezifikationen beobachtet, aber es wurde auch das Vorhandensein eines Antikörpers bei der Abwesenheit der Krankheit berichtet, insbesondere bei älteren Patienten. Unter diesen Umständen war die Rolle der Antikörper in einigen Autoimmunkrankheiten immer fraglich, obwohl sie ständig als Krankheitsindikatoren verwendet werden.

Eine andere Tatsache der Autoimmunkrankheiten ist das V Vorhandensein von Immunkomplexen, die unter bestimmten

Bedingungen die Komplementkaskade aktivieren können. Zum Beispiel wird üblicherweise das Serumkomplement beim systemischen Lupus erythematosus aktiviert, aber bei rheumatoider Arthritis ist das sehr unüblich, obwohl Immunkomplexe bei beiden Krankheiten beschrieben wurden. Es wird erwartet, daß die Immunkomplexe das Komplement binden, was zur Aktivierung proteolytischer Enzyme führt.

Neben anderen Proteasen erzeugen zwei Hauptsysteme proteolytische Enzyme: das obenerwähnte Komplementsystem f und das Koagulationssystem. Von den meisten, wenn nicht

von allen der Enzyme dieser zwei Systeme ist es bekannt, daß sie für ihre Funktion Kalziumionen (Ca⁺⁺) benötigen.

Eine andere Eigenschaft der proteolytischen Enzyme, die im Serum gefunden werden, ist ihre Fähigkeit, alpha..-Antitrypsin zu binden, das das Enzym inaktiviert oder alpha^-Macroglobulin (alpha-M) . Das alpha-M ist fähig, Proteasen zu binden, aber die aktive Stelle bleibt frei, um tätig zu werden. Die einzige Einschränkung ist, daß, während das freie Enzym sowohl Substrate mit hohem Molekulargewicht als auch mit niedrigem Molekulargewicht abbauen kann, das Enzym, das an alpha-M gebunden ist, nur Substrate mit niedrigem Molekulargewicht

abbauen kann. Zur selben Zeit sind die freien Enzyme durch Inhibitoren mit großen Molekülen blockiert wie dem Sojabohnentrypsin-Inhibitor (SBTI, Molekulargewicht 21000) ebenso wie durch Inhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht wie Aprotinin, Phenyl-methyl-sulfonylfluorid oder Diisopropyl-phosphofluoridat. Es scheint, daß SBTI einen inhibitorischen Effekt auf alpha₂M-gebundenes Trypsin hat, aber viel weniger effektiv ist als Inhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht.

Es wurde in Int. J. Immunopharmac., Vol. 4, Nr. 1, Seiten 1-7 (1982) berichtet, daß ein mit alpha₂M assoziierter Faktor in Kulturen von Kaninchenlymphoidzellen hergestellt wird. Dieser Faktor (oder Lymphokin) hat dann die Fähigkeit, B-Lymphocyten zu aktivieren, d. h. es war ein polyklonaler B-Zellenaktivator (PBA). Sein aktivierender Effekt wurde durch Proteaseinhibitoren mit niedrigem Molekulargewicht blockiert, aber nicht durch SBTI. Dieses PBA verhielt sich wie ein Trypsin-alpha₂M-Komplex. Im nächsten Schritt wurde alpha„M extrahiert aus dem Patientenserum und aus normalem Humanserum und angewendet zur direkten Bestimmung der Aktivität für Tosyl-arginyl-methylester (TAME), Die Absorption bei 247 nm nach 30 Minuten bei 37°C wurde bestimmt. Eine leicht höhere proteolytische Aktivität wurde mit gereinigtem alpha₂M aus Patientenserum beobachtet.

Es bleibt jedoch ein Bedürfnis für die Bestimmung der proteolytischen Aktivität, die mit alpha₂M direkt im menschlichen Blut verbunden ist. Viele Probleme finden sich in einem derartigen Programm. Zum Beispiel gibt es viele Proteasen im Serum, insbesondere vom Koagulationssystem, die alpha₂M binden können; deshalb kann Serum nicht verwendet werden. Falls Ca ⁺-blockierende Mittel

verwendet werden, um Plasma zu erhalten, kann das Enzym nicht funktionell sein. Wenn SBTI verwendet wird um freie Proteasen im Plasma zu blockieren, kann es die Enzymäktivität, die mit alpha₂M verbunden ist, verlangsamen und signifikant verändern. Wenn alpha₂M zuerst an eine feste Phase gebunden wird oder durch einen Antikörper gefällt wird, kann es Proteasen des Komplements oder des Koagulationssystems tragen. Im Stand der Technik wurde keine Technik ohne weiteres vorgeschlagen und tatsächlicher scheint es bei diesem Stand der Technik, daß das Messen von jeglicher bedeutenden Menge an Enzymaktivität nicht möglich wäre, wegen der Schwierigkeiten, Plasma, das für diesen Zweck geeignet ist, zu erhalten.

Frühere Untersuchungen, die teilweise in US-Anmeldung 202,117, eingereicht am 30.10.1980, jetzt US-PS 4,402,934, enthalten sind, identifizierten den Faktor, der als polyklonaler B-Zellen-Aktivator (PBA) bekannt ist, als eine Protease, die mit alpha₂-Makroglobulin (alpha₂M) assoziiert ist, die im Blutplasma vorhanden ist. Ein einfacher, kolorimetrischer Test wurde nun entdeckt, durch den es überraschenderweise möglich wird, Blutplasma direkt in einer Probentechnik zu verwenden, die als einzige fähig ist, das Vorhandensein von rheumatoider Arthritis zu identifizieren. Dies ist insbesondere eine sehr wertvolle Erfindung, da es nun möglich wird, eine beginnende rheumatoider Arthritis zu entdecken, vor dem Auftreten jeglicher physikalischer Symptome. Dies ist insbesondere eine unerwartete Entwicklung, da so viele Proteasen im Blutstrom vorhanden sind.

Blutplasma, das den Kalziumionen-(Ca )Gehalt blockiert hat, wird mit einem Proteasesubstrat gemischt, das eine ausgewählte Aminosäure enthält, vorzugsweise Arginin in

Verbindung mit einem chromogenen Anteil. Der Enzymangriff unter Inkubationsbedingungen setzt das Chromogen frei als Antwort auf die effektive proteolytische Umgebung. Die Chromogenkonzentration wird bestimmt durch Absorptionsmessung bei einer geeigneten Wellenlänge.

Alternativ führt die Immunoadsorption von alpha-M auf einer Oberfläche, die zuerst mit einem Antikörper behandelt wurde, gefolgt vom Kontakt mit dem Proteasesubstrat und Inkubation zu vergleichbaren einzigartigen Ergebnissen.

Diese erfindungsgemäße Methode eignet sich insbesondere gut zur Verfügungstellung eines Probensatzes, der ein geeignet gelagertes Substrat, Puffer und Kalziumionen blockierende Zusammensetzungen, Wegwerfküvetten, die für die Probennahme und für spektrophotometrische Messungen geeignet sind, Sammelröhrchen und mit Antikörper beschichtete Festphase enthält. Ein solcher Satz ist billig, von einem geeignet trainierten klinischen Laborassistenten zu bedienen und insbesondere geeignet für den für klinischen Gebrauch, wo viele Tests über einen relativ kurzen Zeitraum die Regel sind.

Grundsätzlich kann das Verfahren der Erfindung beschrieben werden durch folgende Schritte:

(a) Sammeln einer Probe von Patientenblut in Anwesenheit eines stöchiometrischen Überschusses eines Kalziumionen blockierenden Reagenzes, um einen repräsentativen Anteil alpha₂-Makroglobulin im Plasma zu liefern;

(b) Mischen des alpha₂~Makroglobulins mit einem gepufferten, hydrolysierbaren Substrat;

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(c) Inkubieren der Mischung; und

(d) Bestimmen des Hydrolysegrades des Substrates während der Inkubation.

Alternativ kann das Verfahren der Erfindung einen weiteren Schritt des Absetzens des alpha~-Makroglobulins von dem Kalziumionen-blockierten Plasma auf einer Oberfläche, die dafür vor dem Mischen mit dem gepufferten hydrolysierbaren chromogenen Substrat mit einem Antikörper vorbehandelt wurde, einschließen.

Bei der Durchführung der Erfindung kann die Blutprobe, die von dem Patienten oder von einem allgemeinen Spender genommen wurde, angewendet werden, während sie frisch gezogen wird, oder sie kann gelagert werden in gefrorenem Zustand, bis es geeignet ist, die Tests durchzuführen, die oben angegeben sind. Wenn die Probe gelagert wird, muß sie natürlich aufgetaut werden und auf Umgebungstemperatur gebracht werden vor dem weiteren Verfahren.

Das alpha~-Makroglobulin (alpha₂M) ist in dem Plasma enthalten, das gewonnen wird auf einem blockierenden ^- Mittel für Kalziumionen vor der Abtrennung der roten

Blutkörperchen bei der Zentrifugation. Geeignete Blockierungsmittel (oder Komplexierungsmittel) müssen im Plasma löslich sein und schließen üblicherweise Natriumzitrat und Natriumethylendiamin-tetraacetat (EDTA) ein. Ein bevorzugtes Reagenz ist Natriumzitrat.

Die Substratzusammensetzung schließt einen Puffer oder mehrere Puffer ein, die fähig sind, den pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 7 bis 9 zu halten. Bevorzugte Pufferreagenzien schließen ein eine Phosphatsalzlösung (pH 7,2) und den feineren Trispuffer, Tris

(hydroxymethyl)-aminomethan (pH 8,2). Das Substrat umfaßt auch ein Polyamid mit niedrigem Molekulargewicht, das einen chromogenen Anteil einschließt. Bevorzugte Substrate umfassen eine Argininverbindung, von der bevorzugte Beispiele einschließen Carbobenzoxy-valinglycin-arginin-p-nitranilid-acetat (Chromozym) mit Trypsin (Chromozym Try) und Benzoyl-arginin-p-nitranilid (BAPNA). Das Substrat muß hydrolysierbar sein und fähig, ein Chromogen (gefärbte Verbindung) bei der Hydrolyse zu ergeben. Obwohl p-Nitroanilid ein geeignetes und bevorzugtes Chromogen bildet, werden von der Erfindung auch andere, gleich geeignete Chromogene umfaßt. Bei Anwendung von p-Nitroanilid werden die Absorptionsmessungen vorzugsweise bei 380 nm, äquivalent 3800 Angstrom, durchgeführt.

Die Inkubationsperiode, während welcher die proteolytische Aktivität auftritt, kann zwischen etwa einer bis zu etwa 24 Stunden variieren, aber sie ist vorzugsweise zwei Stunden. Die Erfahrung hat gezeigt, daß dies eine adäquate Periode ist, damit effektive Hydrolyse auftritt. Die Inkubationsmischung kann gefroren und gelagert werden vorzugsweise bei -20°, bis zu einer für die Absorptionsmessung geeigneten Zeit da ist.

In einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann jedes geeignete Material mit fester Oberfläche angewendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Sepharosekugeln angewendet. Jeder geeignete Antikörper kann über das ausgewählte Oberflächenmaterial verteilt werden. Jedoch ist Kaninchen-IgG Antihuman-Antikörper eine bevorzugte Wahl.

Die folgenden Daten, Beschreibungen von biologischen Techniken und Testergebnisse sind beispielhaft, ohne Beschränkung des Verfahrens der Erfindung.

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Beispiel 1

Unter Verwendung von Heparin als Antikoagulans wurden Blutproben von 12 Patienten erhalten, bei denen rheumatoide Arthritis (RA) diagnostiziert war, und von 10 normalen Patienten. Plasma wurde durch Zentrifugation gesammelt. Zu jeweils 0,2 ml Plasma, das alpha^-Makroglobulin (alpha₂M) enthielt, wurden 0,2 ml Carbobenzoxy-Val-Gly-Arg-p-nitranilid-acetat (Chromozym Try; 1 mg/ml) zusammen mit Sojabohnentrypsin-Inhibitor (SMTI) (0,1 mg/ml) zugegeben, um die proteolytische Aktivität der freien Enzyme zu blockieren und die Mischung wurde zwei Stunden bei 25⁰C inkubiert. Um die Reaktion zu beenden und die Serumproteine zu entfernen, wurde das Volumen der Mischung verdoppelt mit einer 10%igen Lösung von Trichloressigsäure (TCA). Der gebildete Niederschlag wurde entfernt und die Absorption bei 405 nm wurde in einem Beckman Spektrophotometer bestimmt. Natürlich wäre, wenn ein radiomarkiertes Substrat verwendet worden wäre, die Bestimmung mit einem Radioaktivitätszähler erfolgt. Die Werte, die in Tabelle I gezeigt sind, waren allgemein höher bei der Patientengruppe als bei der normalen Gruppe, aber zwei normale Individuen zeigten Werte, die so hoch waren, wie bei den Patienten mit sehr aktiver Krankheit.

Obwohl eine statistisch bemerkenswerte Differenz zwischen den zwei Gruppen vorhanden war, war der praktische Wert des Tests sehr fraglich. Die hohen normalen Werte waren wahrscheinlich auf die Heparinaktivierten Enzyme, die das Arginin in dem Substrat angriffen, zurückzuführen. Weiterhin wird berichtet, daß Heparin andere Enzyme des Koagulationssystems aktiviert und einen Komplex mit dem Substrat bildet.

Das SBTI schien die nichtspezifische proteolytische Aktivität, die in dem heparinisierten Plasma entwickelt wurde, nicht zu blockieren und half nicht, Unterschiede zwischen Patienten und Normalen zu offenbaren. Weiterhin zeigten die Versuche, daß SBTI die Enzymaktivität,, die mit alpha-M verbunden ist, bemerkenswert verlangsamt.

Parallel wurde jede Probe von heparinisiertem Plasma mit Sepharosekugeln, die mit der IgG-Fraktion von Kaninchen-Antihuman-alpha-M beschichtet waren, inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation bei 25⁰C wurden die Kugeln gewaschen und das Substrat, Chromozym Try, wurde zugegeben (1 mg/ml). Bezugnehmend wieder auf die Tabelle I war ein entscheidender Unterschied zwischen den normalen Spendern und den Patienten, d. h. das Patienten-alpha-M, das an Kugeln immunoadsorbiert war, hatte proteolytische Aktivität, höchstwahrscheinlich dadurch, daß es ein Enzym enthielt. Jedoch wurden auch in diesem System falsche positive Reaktionen gesehen, was zeigt, daß das heparinisierte Plasma nicht geeignet ist.

Beispiel 2

Es wurde ein Versuch gemacht, die alpha-M-assoziierte

2+ Protease direkt in Plasma, in dem Ca blockiert war, nachzuweisen. Der Abbau von Chromozym wurde im ganzen Plasma gemessen, in dem das Blut auf verschiedenen Antikoagulanzien gesammelt war: Heparin, Natriumzitrat oder Natriumethylendiamin-tetraacetat (EDTA), wobei die letzteren beiden verwendet wurden, um Ca zu blockieren. Weiterhin wurde ein Versuch gemacht, um das Vorhandensein von Nitranilid, dem Abbauprodukt des Chromozyms, direkt im Plasma zu bestimmen, ohne die anderen Proteine zu fällen.

Der erste Versuch wvrrde mit Humanplasraa, das auf Zitrat,

2+

zu dem das Ca zugegeben wurde,-erhalten wurde, durchgeführt. Nach dem Gerinnen wurde das Serurtr-entfernt und die Fähigkeit, das Chromozym abzubauen, wurde bestimmt,^, wie im Beispiel 1. Das Serum wurde verdünnt 1:48 mit Puffer und Substrat (83 μg/ml). Die Mischungen wurden über verschiedene Zeiträume inkubiert, von 0 bis 24 Stunden. Parallel wurde das Substrat allein und Serum allein auch inkubiert. Als zusätzliche Kontrolle wurde Trypsin auch mit dem Substrat inkubiert. Die folgenden Beobachtungen wurden gemacht:

1. Die Absorption von p-Nitranilid war maximal bei 380 nm, ob das Serumprotein vorhanden war oder nicht.

2. Das Blockieren des Ca hatte keinen wesentlichen Einfluß auf den Abbau des Substrats.

3. Die spontane proteolytische Aktivität war viel höher, wenn Heparin verwendet wurde anstelle von Citrat.

4. SBTI wurde nicht benötigt als Block für freie

2+
Proteasen, wenn das Ca blockiert war.

5. Die proteolytische Aktivität in dem mit Zitrat behandelten Plasma stieg nicht an zwischen 0 und Stunden Inkubation, aber stieg danach an; diese

.Aktivität kann durch Einfrieren gehemmt werden.

Wenn das Plasma mit einer festen Phase inkubiert wurde, die Anti-alpha₂M-Antikörper enthielt, wurde gefunden, daß ein großer Teil der proteolytischen Aktivität in dem Serum mit dem alpha-M assoziiert war, wie oben beschrieben. VJieder wurde diese Aktivität nicht beeinträchtigt, wenn Zitrat zugegeben wurde, d. h. in Abwe-

2+
senheit von Ca

Beispiel 3

Der Abbau der Proteasesubstrate wurde an RA-Patienten, normalen Individuen und an Patienten, die Arthritide mit nicht-autoimmunem Ursprung hatten, studiert. Die logische Grundlage war folgende: Sowohl die RA-Patienten als auch die Patienten mit Arthriten mit nicht autoimmunem Ursprung hatten Gelenkentzündungen. Wenn die RA-Patienten proteolytische Aktivität im Plasma hatten und die anderen nicht, wurde diese Aktivität nicht durch die Gelenkentzündung verursacht, d. h. durch die proteolytischen Enzyme, die durch die Entzündungsprozesse in den Gelenken freigesetzt wurden. Deshalb würde der Test die Autoimmunität und nicht die Gelenkentzündung anzeigen.

Blutproben wurden gesammelt auf Natriumzitrat (3,8 mg/ml endgültige Konzentration) und das Plasma wurde innerhalb zwei Stunden bei 25°C gesammelt und bei -20⁰C gelagert. Nach dem Auftauen wurden Aliquots von 0,2 ml verdünnt 1:4 mit Puffer (pH 8,2) und Chromozym Try (0,83 μg/ml/endgültig), Benzoyl-Arg-p-nitranilid (BAPNA) (0,0426 mg/ml/endgültig) oder L-Leu-p-nitranilid (LPN, 0,83 μg/ml/endgültig) wurden zugegeben. Nach zwei Stunden Inkubation bei 25⁰C wurde die Absorption (A) bei 380 nm in einem Beckman Spektrophotometer bestimmt. Die Werte wurden ausgedrückt als A₃₃₀ Einheiten χ 100 χ Verdünnungsfaktor in den Tabellen II und III. Um die spezifische Aktivität zu bestimmen, wurden die A-Werte des Substrats allein und des in Puffer verdünnten Plasmas bestimmt und voneinander abgezogen.

Die mit Chromozym Try bei 8 RA-Patienten erhaltenen Werte lagen im Bereich von 1.464 bis 2.793 und für normale Individuen von 302 bis 1.336. Alle der acht

Patienten mit Gelenkentzündung mit nicht autoimmunem Ursprung (d. h. "serumnegativ") hatten A-Werte, die nahe dem normalen Bereich waren, d. h. von 566 bis 1.387. Wenn 1.387 Einheiten als obere Grenze des normalen betrachtet wird, fielen alle RA-Patienten in den Bereich außerhalb des normalen Bereiches, wenn mit Chromozym getestet wurde.

Beispiel 4

Um zu bestimmen, ob der polyklonale B-Zellenaktivator (PBA) tatsächlich mit dem alpha₂M assoziiert ist, wurde das Plasma mit alpha„M angereichert durch zwei sequentielle Fällungen mit Polyethylenglykol (PEG). Das Plasma wurde auf 4 % PEG eingestellt und der Niederschlag wurde durch Zentrifugation oder Filtration entfernt. Der erste Niederschlag enthielt Enzyme, die verbunden sind mit dem Koagulationsprozeß, wie Thrombin. Als ein Ergebnis fielen die Absorptionswerte von normalem Plasma gemäß der Technik von Beispiel 3 bemerkenswert ab, wie gezeigt in Tabelle IV. Der überstand wurde dann eingestellt auf 12 % PEG und es wurde wieder ein Niederschlag gebildet. Dieser Niederschlag enthielt das meiste des alpha₂M und verschiedene andere Proteine. Die proteolytische Aktivität für Chromozym und BAPNA in dem alpha-M-reichen Niederschlag blieb hoch, d. h. es schien, als ob die Aktivität mit dem alpha_M verbunden war.

Um weiterhin zu zeigen, daß das, was gemessen wurde in dem ganzen Plasma, alpha^M-assoziierte Protease war, wurde der folgende Versuch durchgeführt. Plasma wurde

bei 25⁰C inkubiert mit Sepharosekugeln, die mit Kaninchen-IgG-Antihuman-alpha-M beschichtet waren und dreimal gewaschen wurden. Chromozym wurde zugegeben (0,83 mg/ml/endgültig) zu den Kugeln und das Freisetzen des Chromogens wurde bestimmt wie vorher. Wieder wurde, wie in Tabelle III gezeigt, viel mehr proteolytische Aktivität bei dem RA-Patienten-Plasma gefunden, als bei dem normalen Plasma. Als Ergebnis ist das Messen der proteolytischen Aktivität für Substrate, die Arginin im ganzen Plasma enthalten, in dem Niederschlag, der reich ist an alpha~M oder in dem immunoadsorbierten alpha„M ein Indikator für Autoimmunität unabhängig von Gelenkentzündung.

Beispiel 5

Es wurde eine Bestimmung gemacht, ob das alpha₂M von RA-Patienten-Plasma mehr proteolytische Aktivität hat als das alpha₂M von dem Plasma von Patienten mit nichtautoimmunen Arthritiden oder von normalen Spendern. Die mit alpha„M-assoziierte proteolytische Aktivität bei Patienten und normalen Individuen wurde wie folgt verglichen: Plasma von sieben RA-Patienten, fünf Patienten mit "nichtautoimmunen" Arthritiden und fünf normalen Individuen wurde gesammelt auf Natriumeitrat (3,8 mg/ml) und bei -20⁰C gelagert. Sepharosekugeln wurden beschichtet mit Kaninchen-IgG-Antihuman-alpha-M-Antikörpern unter Verwendung von Cyanbromid. Als Kontrolle wurden Kugeln beschichtet mit Kaninchen-Antihuman-Ig-Leichtketten-Antikörpern. Die Kugeln wurden gewaschen und mit Plasma gemischt zwei Stunden bei 25⁰C mit kontinuierlichem Schütteln und dann noch dreimal gewaschen. Zu den gewaschenen Kugeln wurde eine Lösung

von 0,83 mg/ml (endgültige Konzentration) Chromozym zugegeben und die Mischung wurde bei 25°C zwei Stunden lang inkubiert. Die Kugeln wurden zentrifugiert und die überstände wurden gesammelt und bei A₃₈₀ abgelesen. Nach dem Abziehen des spontanen Abbaus des Substrats in Anwesenheit von Anti-Ig-beschichteten Kugeln sind die Werte in Tabelle V gegeben als spezifische alpha-M-assoziierte proteolytische Aktivität. Diese Art von Test zeigt wieder, daß die proteolytische Aktivität im Plasma von Patienten mit RA viel höher ist als in dem Plasma von normalen Kontrollen oder Patienten mit serumnegativen Arthritiden. Somit korreliert die Aktivität wieder mit der Aktivierung des Immunsystems und nicht mit dem Vorhandensein von Gelenkentzündung.

Beste Art und Weise zum Ausführen der Erfindung

Obwohl viele Variationen der identifizierten Parameter zu einer sicheren Diagnose führen können, ist das bevorzugte Verfahren der Methode dieser Erfindung unten aufgeführt.

Plasma wird gesammelt in Röhrchen, die ein Antikoagulans, vorzugsweise Natriumeitrat (0,3 mg/ml Blut) enthalten. Innerhalb von zwei Stunden nach der Sammlung wird das Blut zentrifugiert, das Plasma entfernt und entweder sofort verwendet oder gefroren gelagert bei -25°C, bis es verwendet wird. Von jeder Plasmaprobe werden" 0,1 ml verdünnt mit 0,3 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,2. Von dieser Lösung werden 0,1 ml genommen und mit 0,4 ml 0,5 M Tris/HCl Puffer bei pH 8,2 und 0,1 ml Substrat, das 0,1 mg Chromozym enthält , oder 0,2 ml, das 0,042 mg BAPNA enthält gemischt. Die Mischung wird inkubiert zwei Stunden bei 25⁰C. Höhere oder niedrigere Temperaturen können auch verwendet

werden, aber alle Bedingungen müssen entsprechend eingestellt sein. Als Kontrolle werden zwei andere Mischungen inkubiert; eine, in der das Chromogensubstrat substituiert ist durch ein äquivalentes Volumen an Lösungsmittel und eine, in der das Plasma substituiert ist durch gepufferte Kochsalzlösung.

Nach zwei Stunden Inkubation wird die Absorption (A) bei 380 nm bestimmt in einem Spektrophotometer für alle drei Proben (jede Probe kann dreifach hergestellt werden). Die Absorptionswerte, die mit dem Plasma von Patienten mit RA erhalten wurden, sind bemerkenswert höher als solche, die mit normalem Humanplasma oder Plasma von Patienten mit Arthritiden mit nicht autoimmunem Ursprung erhalten wurden.

Industrielle Anwendbarkeit

Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere gut geeignet, einen Probensatz zur Verfügung zu stellen, der ein geeignet gelagertes Substrat, Puffer und Kalziumionen-blockierende Zusammensetzungen, Wegwerfküvetten, die zur Probendurchführung und für spektrophotometrische Messungen geeignet sind, Sammelröhrchen und Antikörper beschichtete Festphase enthält. Ein derartiger Satz ist billig, in den Händen eines geeignet geübten klinischen Laborassistenten anwendbar und insbesondere geeignet für klinische Verwendung, wo zahlreiche Tests über eine relativ kurze Zeitdauer die Regel sind.

J Λ

-ISf-Tabelle

Der Abbau von Chromozym durch Plasma, das auf Heparin und Sojabohnen-Trypsininhibitor gesammelt wurde und durch alpha₂M, das an immunoabsorbierende Sepharosekugeln gebunden ist.

Absorption bei 405 nm (Einheiten/dl)

Patient Diagnose gesamtes Plasma Sepharosekugeln

oder Spender

1 Kheumatoid- 166 + 2* 128 + 11 arthritis

2 149 + 7

3 47+7 63+5

4 65+5 112+8

5 252+8 149+8

6 39+1 74+4

7 60+1 63+1

8 90+3 85+4

9 46+4 71+6

10 74+3 68+7

11 75 + 1 67 + 4

12 67+1 67+2

13 normal 50+5 57+4

14 40+1 53+2

15 44+2 51+5

16 58 + 4 55 + 2

17 53+1 50+1

18 56+6 31+0

19 41+1 70+7

20 56 + 6 40 + 4

21 34+4 35+3

22 51 + 2 48 + 4 * Standardfehler

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τα» -

Tabelle

II

Abbau von zwei Proteasesubstraten durch Plasma von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA).

Patient + Standardfehler)

abgebautes Substrat

Chromozym Try ΒΑΡΝΑ

10 11 12 13 14 15 16 17 18

2788	+ 51	667	+ 1
2793	+ 143	667	± ¹
1807	+ 114	457	± ¹⁵
1713	+ 64	417	+ 23
1757	± ⁿⁱ	405	± ³
1728	+ 10	501	+ 1
1670	+ 48	397	+ 1
1944	+ 88	371	± ¹⁰
1464	+ 60	501	+ 1
2433	+ 143	413	+ 27
1791	+ 189	158	+ 7
1996	+ 63	653	± ¹⁰
1708	+ 63	643	± ⁹
2354	+ 116	614	+ 12
1803	+ 186	370	+ 16
2093	± ⁴¹	313	± ⁴¹
2054	+ 100	480	+ 29
1721	+ 41	385	+ 10

Mittelwert Bereich

C. Try 1.805

C. Try 1.464-2.793 438 ΒΑΡΝΑ 158-667

Tabelle III

Abbau von zwei Proteasesubstraten durch Plasma von Patienten mit nichtautoimmunen Arthritiden oder normalen Spendern.

+ Standardfehler)

abgebautes Substrat

Patient	Diagnose	Chromozym Try	Bereich Chromozym Try 566-1.387	BARIA
oder			Mittelwert Chromozym Try 722
Spender			Rereich Chromoz¹
1	Gicht	566 + 59	m Try 302-1.336	114 + 21
2	Gicht	1051 + 135	346 + 15
3	Osteo-Arthritis	1279 + 170	318 + 7
4	psoriartische	792 + 149	192 + 9
	Arthritis
5	Osteo-Arthritis	1378 + 180	371 + 25
6	Osteo-Arthritis	1003 + 133	65 + 10
7	Osteo-Arthritis	1342 + 75	362 + 13
8	Osteo-Arthritis	715 + 116	384 + 64
1	Normal	742 + 30	197 + 5
2		888 + 19	163 + 32
3		701 + 2	334 + 2
4		529 + 140	82 + 7
5		302 + 73	84 + 1
6		553 + 23	175 + 6
7		430 + 66	97 + 14
8		912 + 82	89+1
9		1336 + 32	156 + 8
10		918 + 111	336 + 7
Patienten: Mittelwert Chromozym Try 1.027	355
	ΒΑΡΝΑ 65-384
Normal:	ΒΑΡΝΑ 160
	ΒΑΡΝΑ 82-336

- a* - 14

Tabelle IV

Der Abbau von Chromozym durch Plasmaproteine, die mit verschiedenen Konzentrationen von Polyethylenglykol gefällt wurden.

Plasma- Diagnose spender

Einheiten/dl

0 % PEG 4 % PEG 12,5 % PEG überstand

1	RA*	2.371	648	148	270
2	RA	1.828	348	185	883
3	RA	1.488	248	237	111
4	RA	1.920	344	243	830
5	Normal	739	254	47	560

* RA: Rheumatoide Arthritis.

Tabelle V

Abbau von Chromozym durch alpha„M und Plasma von Patien ten mit RA, normalen Spendern, Patienten mit nicht-auto immunen Arthritiden.

Plasma	Diagnose	A₀₀-. Einheiten/Ml	Kugeln"
Spender		JoU	1209
	RA^b	gesamtes Plasma	996
1	RA	2788	888
2	RA	2794	1142
3	RA	1754	228
4	RA	2433	457
5	RA	1058	650
6	RA	1451	230
7	Gicht	1446	274
8	Gicht	566	294
9	OA^C	1051	216
10	OA	1387	100
11	OA	1003	321
12	Normal	715	201
13	Normal	529	362
14	Normal	553	428
15	Normal	430	196
16	Normal	912
17	918

^a Das Plasma wurde inkubiert bei 25⁰C eine Stunde lang mit Sepharosekugeln, die mit Anti-alpha^M-Antikörpern beschichtet waren.

RA: Rheumatoidarthritis
^c OA: Osteoarthritis

Mittelwerte für Kugeln: RA 796

nicht-autoimmun 223 Normal 302

Claims

Patentansprüche

1. Verbessertes Verfahren zur Diagnose von rheumatoider- Arthritis und damit verbundener Autoimmunkrankheiten bei einem Patienten, dadurch gekennzeichnet,

daß man

(a) eine Probe von Patientenblut in Anwesenheit eines stochiometrischen Überschusses eines Kalziumionen-blockierenden Reagenzes sammelt, um einen repräsentativen Anteil von alpha^- Makroglobulin im Plasma zu schaffen;

(b) das alpha^-Makroglobulin mit einem gepufferten, hydrolysierbaren Substrat mischt;

(c) die Mischung inkübiert; und

(d) den Hydrolysegrad des Substrats während der Inkubation bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das Plasma von den roten Blutkörperchen vor dem Mischen mit dem gepufferten Substrat abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat ein gepuffertes, hydrolysierbares Chromogensubstrat ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Plasma abgetrennt wird von den roten Blutkörperchen, das Plasma danach mit einem gepufferten, hydrolysierbaren chromogenen Substrat gemischt wird und die

Menge von freigesetztem Chromogen in der Mischung durch Hydrolyse während der Inkubation durch spektrophotometrische Absorption bei einer ausgewählten Wellenlänge gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man alpha--Makroglobulin aus Kalziumionen-blockiertem Plasma an einer Oberfläche, die dazu vor dem Mischen mit dem gepufferten hydrolysierbaren Substrat mit einem Antikörper vorbehandelt wurde, absetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Kalziumionen-blockierende Reagenz Natriumeitrat ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das Kalziumionen-blockierende Reagenz Natriumethylendiamin-tetraacetat ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer aus einer Phosphatkochsalzlösung besteht, die etwa einem pH von 7,2 hat.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß der Puffer zusätzlich Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan enthält und daß die Lösung bei einem pH von etwa 8,2 gehalten wird.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß das Chromogensubstrat Arginin und Chromozym oder BAPNA enthält.

2 ^s*

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Inkubation bei 25⁰C zwei Stunden lang durchgeführt
wird und die Mischung danach bei etwa -20⁰C vor
der Analyse gelagert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß die ausgewählte Wellenlänge 380 Nanometer ist.

13. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche für die Ablagerung von alpha₂-Makroglobulin Sepharosekugeln umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß der Antikörper aus Kaninchen-IgG-Antihuman-alpha^-M-Antikörpern besteht.

15. Diagnosekit zur Probe auf proteolytische Aktivität von Chromogensubstraten in Anwesenheit von alpha₉-Makroglobulin als Determinante für rheumatoide
Arthritis bei einem Patienten, dadurch gekennzeichnet,

daß es enthält:

(a) abgepackte Natriumzitratlösung zur Aufnahme von Blut, das alpha^-Makroglobulin enthält;

(b) getrennt abgepacktes hydrolysierbares Substrat; und

(c) getrennt abgepackte Küvetten, die Pufferlösung enthalten und für die Inkubation und die Verwendung in der Analyse geeignet sind.

16. Diagnosekit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß es zusätzlich abgepackte Aliquots von Sepharosekugeln, die mit Kaninchen-IgG-Antihuman-alpha₂-M-Antikörpern beschichtet sind, enthält.

17. Diagnosekit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die Küvetten geeignet sind für die Einführung in ein Spektrophotometer.