DE3001435A1 - Verfahren zur herstellung von fibrinogen oder dessen bestandteilskomponenten - Google Patents

Description

MDNCHEN DR. E. WIEGAND DR. M. KCHLER
DIPL.-ING, C. GERNHARDT

HAMBURG DIPL.-ING. J. GLAESER

WIEGAND NIEMANK KÖHLER GERNHARDT GLAESER

PATE NTANWXLTE

Zugelassen beim Europäischen Patentamt

DIPL.-ING. W. NIEMANN OF COUNSEL

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TELEGRAMME: KARPATENT TELEX : 529068 KARP D

D-8 0 00 MÜNCHEN 2 HERZOG-WILHELM-STR. 16

W. 43617/80 - Ko/Ne

16. Januar 1930

Meito Sangyo Kabushiki Kaisha Nagoya-shi (Japan)

und

Susumu Sasaki Uagoya-shi (Japan)

Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen oder dessen

Bestandteilskompocenten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem Fibrinogen und den Fibrinogenfraktionen und 2 als dessen Bestandteilskomponenten in selektiver und einfacher Weise mit hoher Genauigkeit durch Entfernung von Verunreinigungen unter Einschluss von Coproteinen aus

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einer wässrigen fibrinogenhaltigen Lösung, beispielsweise Plasma, unter Anwendung eines einfachen Arbeitsganges. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen, der Fibrinogenfraktion 1 oder der Fibrinogenfraktion 2 im Plasma in einfacher und rascher Weise mit hoher Genauigkeit und Wiederholbarkeit, so dass für die Diagnose von Leberkrankheiten und durch von Koagulationsstörungen des Blutes eingeleiteten Krankheiten, wie hämorrhagicche Krankheiten, Thromboss und DIC-Syndrom (intravakulares Koagulationssyndrom) wertvolle Informationen erhalten werden.

Die Erfindung betrifft ferner die Anwendung der nach der Abtrennung des Fibrinogens mittels des vorstehenden Verfahrens hinterbliebenen Flüssigkeit als Probe zur Bestimmung von Fibrin und Fibrinogenabbauprodukten, welche als FDP bezeichnet werden.

Ferner befasst sich die Erfindung mit den für die praktische Ausführung der vorstehenden Verfahren erforderlichen Reagentien zur Gewinnung oder zur Bestimmung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten.

Fibrinogen ist ein in normalem Plasma vorliegendes Protein. Unter der Einwirkung des Thrombinenzyms polymerisiert das Fibrinogen zu unlöslichen makromolekularen Fibrinfasern, die eine wichtige Komponente von Blutgerinnseln darstellen. Es stellt ein hauptsächlich in der Leber gebildetes Glucoprotein mit einem Molekulargewicht von etwa 3^0 000 dar. Die Fibrinogenmoleküle bestehen aus drei Polypeptidketten Aa, Bß und γ. Früher wurde Fibrinogen als Einzelprotein betrachtet, jedoch zeigten die

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neueren Arbeiten, dass es aus mindestens zwei Bestandteilskomponenten besteht.

Beispielsweise zeigten Lipinska und Mitarbeiter durch eine SDS-Polyaqylaraid-Gelelektrophorese, dass das Fibrinogen im normalen menschlichen Plasma aus einer hochmolekularen Komponente (Fibrinogenfraktion 1) und einer niedrigmolekularen Komponente (Fibrinogenfraktion 2) besteht und unterstellten die Möglichkeit, dass das Verhältnis zwischen diesen Fraktionen die physiologische Funktion des Fibrinogens beeinflussen würde (I. Lipinska und Mitarbeiter, J. Lab. Clin. Med., Band 84-, (4), Seite 509 bis 516 (1974).

Finlayson und Mitarbeiter stellten fest, dass ein menschliches Fibrinogen mit einer Reinheit von 98 % in zwei Spitzen bei einer Säulenchromatographie auf einer EEAE-Cellulosekolonne aufgetrennt wird (J. S. Finlayson und Mitarbeitern, Biochemistry, Band 2 (1), Seite 42 bis 46 (1963)).

Eine wichtige physiologische Funktion des Fibrinogens liegt darin, welche es bei der Koagulation von Blut ausübt, wie vorstehend dargelegt. Wenn der Blutkoaguliermechanismus zu arbeiten beginnt,, tritt Hydrolysethrombin im Plasma auf und das Fibrinogen wird teil'.veise an seiner spezifischen Stelle durch die Einwirkung des Enzyms zu einem Fibrinmonomeren zersetzt. Da? Fibrinmonomere polymerisiert dann zu Fibrinfasern, die Blutgerinnsel bilden. Anders ausgedrückt, liegt das Wesen der Blutkoagulierung in dbr Umwaud} ung des Fibrinogens in Fibrin. Es ist deshalb sehr signifikant, die Menge und Qualität des Plasmafibri-

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nogens zur Diagnose von Leberkrankheiten und den durch Koaguliertstörungen des Blutes verursachten Krankheiten, wie sie vorstehend als Beispiele angegeben wurden, zu kennen.

Vom Gesichtspunkt der klinischen Medizin ist es günstig, das Fibrinogen leicht und rasch mit hoher Genauigkeit und Eeproduzierbarkeit zu bestimmen.

Die üblichen in der klinischen-Anwendung eingesetzten Bestimmungsmethoden beruhen Jedoch auf der Annahme, dass das Fibrinogen ein Einzelprotein ist und es erfolgten keine Bemühungen, die JSinzelmengen der Fibrinogenfraktionen 1 und 2 zu erkennen. Keines der üblicherweise klinisch angewandten Bestimmungsverfahren ist geeignet, die Mengen der Einzeltcomponenten cn Fibrinogen festzustellen. Ferner haben die üblichen Verfahren der Bestimmung weitere Fehler und können kaum aur Erfüllung des vorstehenden Bedarfes angewandt werden. Beispielsweise ist ein langer Zeitraum zur Bestimmung erforderlich. Weil auch Fibrinogen mit dem Gehalt ziemlich grosser Mengen an Verunreinigungen bestimmt wird, ist der Bestimraungsfehler gross und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit dieser Verfahren sind niedrig. Ferner kann bei uiesen Verfahren nicht Gebrauch von einem automatischen Analysierer gemacht werden, wie er betriebsmässig vorteilhaft eingesetzt wird. Darüberhinaus ist die Arbeit bei diesen Verfahren kompliziert.

Beispielsweise hat die bisher als Standardmethode zur Bestimmung angewandte Folin-Lovry-Methode den Nachteil, dass ihre Ausführung kompliziert ist und ein so langer Zeitraum wie etwa 3 Stunden erforderlich ist. Ein anderer

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Fehler liegt darirr* dass das Fragment Γ, welches ein Abbauprodukt von Fibrin und Fibrinogen darstellt, gleichfalls als Fibrinogen bestimmt wird. Die Thrombinzeitmethode kann relativ rasch zur Bestimmung angewandt werden, doch nimmt bei einer Blutprobe, die nicht zu vernachlässigende Mengen an Anti-Thrombin enthalten, der Bestimmungsirrtum zu und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Versuches werden verringert. Ein nephelometrisches Ammoniumsulfatverfahren kann zu einer relativ raschen Bestimmung ausgeführt werden, jedoch ergibt sich dabei die Bestimmung beträchtlicher Mengen von nicht-gerinnbaren Proteinen als Fibrinogen, so dass eine schlechte Genauigkeit und Reproduzierbarkeit verursacht wird. Ferner haben die üblichen Verfahren, ausgenommen das nephelcmetrische Verfahren unter Ausnutzung einer immunolopp.sehen Reaktion, den Fehler, dass automatische Analysatoren nicht eingesetzt werden können.

Andererseits ist es bekannt, dass Aminocarbonsäuren, wie Glycin, ß-Alanin, γ-Aminobuttersäure und £-Aminocapronsäure Fibrinogen ausfällen. Beispielsweise beschrieben Kazal und Mitarbeiter, dass Fibrinogen mit Gerinnbarkeit (Prozentsatz eines durch Thrombin gerinnbaren Proteins, bezogen auf Gesamtproteine) von 94-,4- % erhalten wird, wenn ~ Bariumsulfat zu menschlichem Plasma zur vorhergehenden Entfernung des Prothrombine zugesetzt wird, Glycinpulver zu der überstehenden Flüssigkeit zur Ausfällung des Fibrinogens zugegeben wird, dieses in einer wässrigen Lösung von Natriumeitrat mit einem pH-Wert von 7Λ gelöst wird und dann die Ausfällung mit Glycin einige Male wiederholt wird (L. A. Kazal und Mitarbeiter, PSEBM, Band 113, Seite 989 bis 994- (1963))· Ein derartiges Verfahren ist jedoch ungeeignet zur Anwendung für die Bestimmung von Plasmafibrinogen, da unter diesen Bedingungen das gesamte oder ein grosser

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Teil des Fibrinogens in der Versuchsprobe nicht ausgefällt werden kann. Zur fraktionierten Bestimmung der Fibrinogenfraktionen 1 und 2 steht das vorstehende Verfahren von Lipinska und Mitarbeiter, beruhend auf der SDS-PoIyacrylamid-Gelelektrophorese, zur Verfügung. Es ist jedoch eine grosse Erfahrung für dessen praktische Ausführung erforderlich und 2 oder 3 Tage sind notwendig, bis das Ergebnis erhalten wird. Ein derartiges Verfahren karn kaum auf dem Gebiet der klinischen Versuche eingesetzt werden, bei. denen 'Schnelligkeit und Üinfachheit erforderlich sind.

Im Eahmen der vorü egenden Erfindung wurden Untersuchungen zur Vermeidung oder Überwindung der zahlreichen Fehler oder Nachteile der bekannten Verfahren unternommen und ein Verfahren entwickelt, das leicht und selektiv fraktions/eise ein Hochreines Fibrinogen, die Fibrinogenfraktion 1 oder die Fibrinogenfraktion 2 mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit aus fibrinogenhaltigen wässrigen Lösungen, wie Plasma, ergibt.

Im Eahmen der Untersuchungen wurde gefunden, dass eine komplizierte Beziehung zwischen der Ausfal]barkeit des ifibrinogens und der Kettenlänge und Konzentration der Aminocarbonsäure, der Ionenstärke des Systems, dem pH-Wert des Systems und dgl. besteht. Bei den Untersuchungen wurde gefunden, dass bei Kontaktierung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

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worin η eine positive Zahl, vorzugsweise 1, 2 oder 3 ist, mit einer fibrinogenhaltigen Masse in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerungsmittels praktisch das gesamte darin enthaltene Fibrinogen praktisch

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quantitativ in der praktischen Anwendung ausgefällt werden kann, ohne dass irgendeine wesentliche Mitausfällung von anderen Proteinen als Fibrinogen erfolgt.

Es wurde auch gefunden, dass bei Einstellung der Ionenstärke des Systems mit dem Ionenstärkesteuerungsmittel die Fibrinogenfraktionen 1 und 2 als Bestandteile des Fibrinogens fraktioniert aufgetrennt und gewonnen werden könD^n und dass bei Anwendung des neu entwickelten Verfahrens zur Herstellung von Fibrinogen und den Fibrinogenfraktionen 1 oder 2 ein Verfahren zur Bestimmung dieser Komponenten in einer Blutprobe in einfacher und rascher Weise mit hoher Genauigkeit und Reproduzierbarkeit erhalten wird, so dass es möglich wird, Informationen für die Diagnose von Leberkrankheiten oder durch Koagulationsstörungen des Blutes verursachte Krankheiten mit hoher Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Schnelligkeit zu erhalten.

Es wurde auch gefunden, dass der nach der Entfernung des Fibrinogens hinterbliebene Rückstand eine bessere Probe zur Bestimmung von FDP im Blut als die üblichen ist, so dass die vorliegende Erfindung einen wesentlichen Beitrag auf aem medizinischen Gebiet gana allgemein unter Einfluss der physiologischen, pathologischen und therapeutischen Bereiche erbringt.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht deshalb in einem Verfahren zur Abtrennung von hochreinem Fibrinogen oder dessen Bestandteilen aus einer wässrigen fibrinogenhaltigen Lösung, wie Plasma, rasch und selektiv mittels eines einfachen Arbeitsganges.

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Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren unter Ausnutzung des vorstehend abgehandelten Verfahrens zur Bestimmung der Menge an Fibrinogen oder dessen Bestandteilen im Blut mit hoher Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Schnelligkeit, wobei die Mengen für die Diagnose von Leberkrankheiten und durch Koagulationsstörungen des Blutes verursachte Krankheiten wertvolle Info rmati onen 1 ief em.

Eine t/eitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Anwendung des nach der Entfernung des Fibrinogens hinterbliebenen Rückstandes aus ciea vorstehenden Verfahren als Probe zur Bestimmung von FDP im Blut.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in einem zur Abtrennung oder Bestimmung des Fibrinogens oder dessen Bestandteilen aus oder in einer fibrinogenhaltigen wässrigen Lösung verwendeten Reagens.

Die vorstehenden Aufgaben und weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.

Gemäss der Erfindung wird mindestens eine Aminocarbonsäure der Formel (1) mit einer fibrinogenhaltigen Masse in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerung smittels zur Abtrennung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilen kontaktiert.

Gemäss einer Ausbildungsform zur Erzielung von Fibrinogen nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine wässrige Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel (I) mit einer fibrinogenhaltigen wässrigen Lösung,

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vjie Plasma, in Gegenwart eines Ionenstärke Steuerungsmittels kontaktiert, welches von der Art ist und in solcher Menge vorliegt, dass die Ionenstärke des Systems auf 1 bis etwa 2,2, vorzugsweise etwa 1,1 bis etwa 2, stärker bevorzugt etwa 1,2 bis etwa 1,8, eingestellt wird. Der hier verwendete Ausdruck "Ionenstärke des Systems" bezeichnet die Ionenstärke auf der Basis sämtlicher Bestandteile des Systems ausser der Aminocarbonsäure, beispielsweise die wässrige Lösung mit dem Gehalt an Fibrinogen, Ionen&tärkesteuerungsraittel, pH-Steuei'ungsmitüei, antiseptischen Mitteln, Stabilisatoren und dgl. Durch Sammlung des dabei gebildeten unlöslichen Materials wird ein hochreinc-.s Fibrinogen leicht und selektiv erhalten.

Gemäss einer Ausbildungsform zur Erzielung der Fibrinogenfraktion 1 nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine wässrige Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel (I) mit einer fibrinogenhalti^en wässrigen Lösung, z. B. Plasma, in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerungsmittels kontaktiert, welches von der Art ist und in solcher Menge vorliegt, dass die Ionenstärke des Systems auf etwa 0,02 bis weniger als 1, vorzugsweise auf etwa 0,03 bis etwa 0,9? stärker bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 0,55, eingestellt wird_;und das gebildete unlösliche Material gesammelt, wodurch eine hochreine Fibrinogenfraktion 1 leicht und selektiv erhalten wird.

Geraäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung zur Erzielung der Fibrinogenfraktion 2 nach dem erfindungsgemässen Verfahren wird die Ionenstärke des nach der Abtrennung der Fibrinogenfraktion 1 als das bei der vorstehenden Ausführungsform zur Herstellung der Fibrinogen-

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fraktion 1 gebildeten unlöslichen Material erhaltenen Rückstandes auf 1 bis etwa 2,2, vorzugsweise 1,1 bis etwa 2, stärker bevorzugt etwa 1,2 bis etwa 1,8, durch. Anwendung eines Ionenstärkesteuerungsmittels von der Art und in solcher Menge eingestellt, dass die Ionenstärke des Systems in den vorstehenden Bereich kommt _t und das erhaltene unlösliche Material wird gesammelt, wodurch eine hochreine Fibrinogenfraktion 2 leicht und selektiv erhalten wird.

In einer Alternativausfuhrungsform zur Herstellung der Fibrinogenfraktion 1 wird zunächst das Fibrinogen entsprechend der vorstehenden Ausführungsform zur Erzielung Fihrinogens abgetrennt und erneut in einem wässrigen \",Medium, wie tfss-, Phosphatpuffer oder physiologischer 'V Salzlösung, gelöst und die Lösung wird als fibrinogenhaltige wässrige Lösung eingesetzt. Durch Behandlung des nach der Abtrennung der Fibrinogenfraktion 1 bei dieser Alternativausfuhrungsform Hinterbliebenen Rückstandes entsprechend der vorstehenden Ausführungsform zur Herstellung der Fibrinogenfraktion 2 wird dann auch die Fibrinogenfraktion 2 erhalten.

Gewünsehtenfalls kann in sämtlichen der vorstehenden Ausführung, sf or men die gebildete unlösliche Komponente abgetrennt und erneut in dem wässrigen Medium gelöst werden und die Lösung erneut einer Ausfällungsbehandlung unterworfen werden. Diese Behandlung kann mehrmals wiederholt werden. Derartige Reinigungsmassnahmen können nur angewandc werden, falls eine weitere Reinigung notwendig ist, da sogar ohne derartige Reinigungsaassnahmen das erfindungsgemäss erhaltene Produkt eine ausreichend hohe Reinheit besitzt.

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Bei der praktischen Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens kann eine vorhergehend hergestellte wässrige Lösung des Eeagens, die mindestens eine Iminocarbonsäure der Formel (I) und ein Ionenstärkesteuerungsmittel enthält, eingesetzt werden. Es ist auch möglich, das Reagens in fester Form zu verwenden oder pulverförmiges Fibrinogen zu einer wässrigen Lösung des Eeagens bei der vorstehenden Alternativausführungsform zur Erzielung der Fibrinogenfraktion 1 zuzusetzen.

Es ist deshalb selbstverständlich, dass die Kontaktierung mindestens einer Aminocarbonsäure der Forirel (λ) mit de.r fibrinogenhaltigen Masse in einem wässrigen Medium in Gegenwart des lonenstärkeSteuerungsmittels beim erfindungsgemässen Verfahren nicht nur die vorstehenden Ausführungsformen umfasst, sondern auch eine Ausführungsform, bei der diese zu kontaktierenden Bestandteile in Form einer wässrigen Lösung vor der Kontaktierung hergestellt werden. Es werden also kurz sämtliche Ausführungsformen umfasst, bei denen die vorstehende Aminocarbonsäure, Jas Fibrinogen und das Ionenstärkesteuerungsmittel einander als Lösung in einem wässrigen Medium kontaktieren können.

Verschiedene Beispiele für die Abtrennung des Fibrinogens oder seiner Bestandteile aus dem Plasma gemäss der Erfindung sind schematisch in der Fig. 16 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt.

Wie aos Fig. 16 ersichtlich ist, erlaubt das erfindungsgemässe Verfahren eine selektive und leichte Abtrennung praktisch des gesamten Fibrinogens und der Fibrinogenfraktionen 1 oder 2 in hoher Reinheit aus dem Plasma und unter Ausnutzung dieses Verfahrens ergibt sich ein Ver-

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fahren zur Bestimmung von Fibrinogen und der Fibrinogenfraktionen 1 oder 2.

Die beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzte Aminocarbonsäure wird durch die allgemeine Formel

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worin η eine positive Zahl, vorzugsweise 1, 2 oder 3i ist, wiedergegeben. Falls η den Wert 1 hat, handalt es sich um Glycin; falls η den Wert 2 hat, handelt es sich um ß-Alanin und falls η den Wert 3 hat, üsndelt es sich um γ-Aminobuttersäure. Verbindungen der Formel (I), worin η den Wert 1 oder 2 hat, werden bevorzugt.

Die Kontaktierung wird üblicherweise bei Raumtemperatur ausgeführt. Gewünsehtenfalls kann sie jedoch auch unter Kühlen oder Erhitzen ausgeführt werden und Temperaturen im Bere:
werden.

im Bereich von etwa 10 bis etwa 40° C können angewandt

Wasserlösliche Elektrolyse mit der Fähigkeit zur Steuerung der Ionenstärke ohne nachteilige Effekte, wie Denaturie^ung oder Zersetzung der Plasmaproteine, können in weitem Umfang als Ionenstärke steuerungsmittel beim erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden. Beispiele für bevorzugte Ionenstärkesteuerungsmittel umfassen Alkalisalze und Ammoniumsalze von anorganischen oder organischen Säuren, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumacetat, Kaliumacetat, Ammoniuaacetat, Katriumcitrat, Kaliumeitrat, Ammoniumeitrat, Kaliumphosphat (einbasisch),

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Natriumphosphat (zweibasisch) und Ammoniumphosphat. Säuresalze von Alkanolarainen, wie Äthanolaminhydrochlorid, können gleichfalls eingesetzt werden. Diese als Beispiele aufgeführten Elektrolyse können sowohl einzeln als auch als Gemische von zwei oder mehreren verwendet werden. Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Ammoniumsulfat werden als Ionenstärkesteuerungsmittel zur Anwendung im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugt.

Das Icrienstärkesteuerungsmittel kann in Form eines vorhergehend hergestellten Salzes verwendet werden. Alternativ kann das Salz in situ ic System ausgebildet xverden, worin die fibrinogenhaltige Masse mit der Aminocarbonsäure kontaktiert wird, so dass die Anwesenheit des Ionenstärkesteuerungsmittels im System erreicht wird.

Bei der Kontaktierung der angegebenen Amino carbon- -C\, säure mit dem Fibrinogen in Gegenwart des Ionenstärke-- ■'^c / Steuerungsmittels im wässrigen Medium -wird es bevorzugt, -';■ ;"■ die Konzentration der Aminocarbonsäure und äep pH- /^ >y' Wertes des Systems auf geeignete Bereiche zusätzlich zur' ^:J// Einstellung der Ionenstärke des Systems mit dem Steuerungsmittel auf die für die gewünschte Ausführungsform geeigneten Bereiche einzustellen. Der pH-Wert des Systems wird auf etwa 5 bis etwa 8, vorzugsweise etwa 5,5 bis etwa 7,5, stärker bevorzugt etwa 5,7 bis etwa 7,5, eingeregelt.

Säuren, Alkalien und Puffer können für diese pH-Werteinstellung angewandt werden. Beispiele umfassen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure und Zitronensäure, Alkalien, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumhydrogencarbonat und

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Natriumcarbonat, und Puffer, wie Essigsäure-Natriumacetat, Phosphorsäure-Natriumphosphat, Zitronensäure-Natriumcitrat /v. und Salzsäure-Barbitalnatrium. Diese pH-Steuerungsmittel / ' können in geeigneter Weise kombiniert werden, um sie als Bestandteile' aöi¹-Ausbildung dejr Ionenstärke'-Äe-e-Steuerungsmittels anzuwenden.

Die Konzentration der Aminocarbonsäure wird in geeigr.eter Weise entsprechend der Art der Amino carbon säure variiert. Bevorzugt werden etwa 1,5 bis etwa 3 M, stärker bevorzugt etwa 1,7 bis etv/a 2,7 M, insbesondere etwa 1,9 bis et'-ta 2,5 M, bezogen auf das Volumen des Systems.

Die Ionenstärke des Systems beim erfindungsgemässen Verfahren, die Konzentration der Aminocarbonsäure im System und der pH-Wert des Systems wurden unter Anwendung von normalem menschlichen Plasma als Versuchsprobe, Natriumchlorid als Ionenstärkesteuerungsmittel und Glycin als Aminocarbonsäure untersucht.

Die Fig. 1. der beiliegenden Zeichnungen zeigt die Beziehung zwischen Fibrinogengehalt der ausgefällten Proteine und die Ionenstärke eines Systems mit einem pH-Wert von 6,2 und einer Glycinkonzentration von £%1 M, wobei die Ionenstärke des Systems mit Natriumchlorid als Ionenstärke steuerungsmittel variiert wurde.

Die Fig. 2 ist ein Densitograjim der ausgefällten Proteine, bestimmt durch SDS-Polyacrylsmid-Gelelektrophorese in dsm in Verbindung mit Fig. 1 beschriebenen System, jedoch ohne Anwendung des Ionenstärkesteuerungsmittel s, d. h. einer Ionenstärke von 0, angegeben.

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Fig. 3 zeigt ein ähnliches Densitograram wie in Fig. 2, das bei einer Ionenstärke von 0,2 in dem in Verbindung mit Fig. 1 beschriebenen System bestimmt wurde.

Fig. 4 zeigt ein ähnliches Densitogramtn wie in Fig. 2, welches mit dem nach der Abtrennung der Fibrinogenfraktion 1 (*A, in der Figur) hinterbliobenen Rückstand in dem in Verbindung mit Fig. 3 beschriebenen System bestimmt wurde, wobei die I^renstärke des Rückstandes auf 1,4 mit Natriumchlorid eingestellt wurde.

Die Fig. 5 zeigt ein ähnliches Densitogramm wie in Fig. 2, welches mit dem in Verbindung mit Fig. 1 beschriebenen System bei einer Ionenstärke von 1,4 bestimmt wurde.

Es ist aus Fig. 1 ersichtlich, dass, falls das Plasma mit Glycin in Abviesenheit eines Ionen stärke Steuerungsmittels wie bei dem bekannten Verfahren kontaktiert wird, der Fibrinogengehalt im erhaltenen Niederschlag einen so niedrigen Wert wie etwa 55 % besitzt und dase der Niederschlag durch nicht-gerinnbare Proteine stark verunreinigt ist.

Wie weiterhin aus Fig. 1 ersichtlich, nimmt, falls die Ionenstärke des Systems 2,2 überschreitet, der Fibrinogengehalt im Niederschlag wiederum erheblich ab. Beispielsweise ist bei einer Ionenstärke von 2,5 der Fibrinogengehalt im Niederschlag so niedrig wie etwa 50 %, was eine starke Verunreinigung durch gerinnbare Proteine zeigt. Daraus ist ersichtlich, dass die Ionenstärke des Systems vorteilhafterweise bis zu etwa 2, bevorzugt bis zu 1,8, beträgt.

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Aus Fig. 2 ist ersichtlich, dass der vorstehend bei einer Ionenstärke von O gebildete sehr unreine Niederschlag die Fibrinogenfraktinen 1 und 2 (die durch ψ ^ und y₂ bezeichnet sind) zusammen mit nicht-gerinnbaren Proteinen (die durch G in der Zeicnnung bezeichnet sind) enthält. Im Gegensatz hierzu kann gemäss einer Ausbildungsform der Erfindung die Fibrinogenfraktion 1 in hoher Reinheit selektiv erhalten werden, wie aus Fig. 3 ersichtlich, und die Fibrinogenfräktion 2 kann selektiv nach einer weiteren Ausführungsform gemäss der Erfindung in hoher Reinheit erhalten werden, wie aus Fig. 4- ersichtlich. Es ist auch aus Fig. 5 ersichtlich, dass gemäss einer weiteren Ausbildungsform der Erfindung selektiv das Fibrinogen in hoher Reinheit erhalten werden kann.

Die Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen dem Gehalt der Fibrinogenfraktion^ 1 und dem pH-Wert des Systems, bestimmt bei einer Ionenstärke von 0,2 wie in Fig» 3, wobei der pH-Wert des Systems variiert wurde.

Fig. 7 ist eine ähnliche graphische Darstellung wie Fig. 6, die die Beziehung zwischen dem Gehalt der Fibrinogenfraktion 2 und dem pH-Vert des Systems zeigt, welcher in der gleichen Weise- wie in Fig. 4- bestimmt wurde.

Die Fig. 8 ist eine ähnliche graphische Darstellung wie die Fig. 6, welche die Beziehung zwischen dem Gehalt an Fibrinogen (Fraktionen 1 und 2) und dem pH-Wert des Systemes zeigt, welcner in der gleichen Weise wie in Fig. 5 unter Variierung des pH-Wertes des Systems ermittelt wurde.

Es zeigt sich aus den in den Fig. 6 bis 8 aufgeführten

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Ergebnissen, dass es geeignet ist, den pH-Wert des Systems auf etwa 5 bis etwa 8, vorzugsweise etwa 5,5 bis etwa 7»5, besonders bevorzugt etwa 5*£ bis etwa 7*5> einzustellen.

Die Fig. 9 der beiliegenden Zeichnungen zeigt die Beziehung zwischen der Menge der ausgefällten Fibrinogenfraktion 1 und der Konzentration des Glycins, welche in der gleichen Weise wie im Fall der Fig. 3 durch Variierung der Konzentration des Glycins bei einem pH-Wert von 6,6 und einer Ionenstärke von 0,1 ermittelt wurde.

Die Fig. 10 zeigt üie Beziehung zwischen der Menge der ausgefällten Fibrinogenfraktion 2 und der Konzentration des Glycins, welche in der gleichen Weise wie im Fall der Fig. 4- durch Variierung der Konzentration des Glycins bei einer Ionenstärke von 1,6 bestimmt wurde.

Aus den in üen Fig. 9 und 10 gebrachten Ergebnissen ist ersichtlich, dass bevorzugt solche Bedingungen angewandt werden, dass die Aminocarbonsäurekpnzentration im System etwa 1,5 bis etwa 3 M, vorzugsweise etv/a 1,7 bis etwa 2,7 M, beträgt.

Wie vorstehend.anhand der beiliegenden Fig. 1 bis abgehandelt, wird die fibrinogenhaltige Masse mit mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel (I) in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines Ionenstärke Steuerungsmittels mit einer Ionenstärke eines spezifischen Bereiches kontaktiert, welcher von der Art des Fibrinogens oder von dessen Bestandteilskomponenten, die zu bestimmen sind, abhängig ist. Bevorzugt wird die Kontaktierung so aubgeführt, dass das System die vorstehenden Erfordernisse für den pH-Wert und/oder die Aminocarbonsäurekonzentration erfüllt.

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Erfindungsgemäss ergibt sich durch Ausnützung des vorstehenden Verfahrens zur Erzielung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten ein Verfahren zur Bestimmung des Ifibrinogens oder dessen Bestandteilskomponenten mit hoher Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Schnelligkeit, welches für die Diagnose von Leberkrankheiten und den durch Koagukationsstörungen des Blutes verursachten Krankheiten wertvoll ist. Einige Ausführungsformen dieses Bestimmungsverfahrens werden im folgenden eingegeben:

Ausbildungsform (A)

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenfraktion 1 im Plasma, welches umfasst

(i) Kontaktierung des Plasmas mit einer wässrigen Lösung mindestens einer Amino carbonsäure der allgemeinen Formel (1) in Gegenwart eines lonenstärkeSteuerungsmittels, welches zur Einstellung der lonenstärke des Systems auf etwa 0,02 bis weniger als 1 fähig ist, und

(ii) Bestimmung des aus der Fibrinogenfraktion Λ im Plasma aufgebauten erhaltenen unlöslichen Materials mittels eines nephelometrischen Verfahrens oder Abtrennung des unlöslichen Materials und Bestimmung des unlöslichen Materials nach einem bekannten Fibrinogenbestimmungsverfahren, wie dem Thrombinzeitverfahren, oder nach einem bekannten Proteinbestimmungsverfahren, wie dem Folin-Lowry-Verfahren, oder Modifikationen hiervon»

Ausbildungsform (B)

Ein Verfahren zur Bestimmung des Fibrinogens im Plasma, welches umfasst

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(i) Inberührungbringen von Plasma mit einer wäßrigen Lösung von wenigstens einer Aminocarbonsäure der Formel (I) in Gegenwart eines Ionenstärke-Steuerungsmittels, das zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf i bis etwa 2,2 fähig ist, und

(ii) Bestimmung des sich, ergebenden unlöslichen Materials, bestehend aus Fibrinogen, in dem Pl3sma,nach einem nephelometrischen Verfahren, oder Abtrennen des unlöslichen Materials und Bestimmung desselben nach einer bekannten librinogenbestimmungsmeth.cG.fc., wie z.B. nach dem Ihrombin-Zeit-Verfahren, oder einem bekannten Protein-Bestimmungsverfahren, wie dem Eolin-Lowry-Verfahren oder dessen Modifikation.

Ausführungsrorm (C)

Ein Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenfraktion 2 im Plasma, welches umfaßt

(i) Einstellung der Ionenstärke des nach der Abtrennung des unlöslichen Materials bei der Ausführungsform (A) zurückbleibenden Rückstandes (i) auf etwa 1,1 bis etwa 1,6. mit einem Ionenstärke-Steuerungsmittel, und

(ii) Bestimmung des sich ergebenden unlöslicbsn Materials, bestehend aus der Fibrinogenfraktion 2 in dem Plasma, nach einem hephelometrischen Verfahren, oder Abtrennung des unlöslichen Materials und Bestimmung desselben nach einer bekannten Fibrinogen-Bestimmungsmethode, beispielsweise nach der QZhrombin-Zeit-I'Iethcde oder nach einer bekannten Protein-Bestimmungsmethode, wie z.B. der Folin-Lowry-Methode oder deren Modifikation.

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Bei den Ausbildungsformen (A), (B) und (G) kann das zu bestimmende unlösliche Material in der gleichen Weise wie vorstehend hinsichtlich des Verfahrens zur Erzielung des Pibrinogens oder dessen Bestandteilskomp_nenten gebildet werden. Wenn das unlösliche Material nicht-gerinnbare Proteine enthält, ist es möglich, eine korrigierte Menge an Fibrinogen oder dessen Be stan«? teil skomponenten experimentell in Abhängigkeit von den vorhandenen nicht-gerinnbaren Proteinen einzustellen und den gemessenen Wert an unlöslichem Material er.-uprecheni dem experimentell festgestellten korrigierten Wert zu korrigieren. Beispielsweise kann das erhaltene unlösliche Material suspendiert im wässrigen Medium mittels eines nephelometrisehen Verfahrens bestimmt werden. Oder es wird, wie vorstehend abgehandelt, das unlösliche Material abgetrennt und gewonnen und dann nach einem bekannten Fibrinogenbestimmungsverfahren, wie dem Thrombinzeitverfahrenjoder einem bekannten Proteinbestimmungsverfahren, wie dem Folin-Lowry-Verfahren oder Modifikationen hiervon bestimmt.

Das nephelometrische Verfahren kann in folgender Weise ausgeführt werden. Zum Beispiel wird eine das erhaltene unlösliche Material enthaltende Lösung einer zur Messung der Trübung der Lösung geeigneten Vorrichtung,beispielsweise ein Spektrophotometer, ausgesetzt und die Absorption der trüben Lösung wird vorzugsweise bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen. Gewücschtenfalls kann, um die Bestimmung mit guter Genauigkeit auszuführen, die Lösung mit Wasser, einem Puffer, physiologischer Salzlösung und dgl. vor der Bestimmung verdünnt werden.

Da. das Ausmass der Trübung mit der Menge des Fibrinogen s, der Fibrinogenfraktion 1 oder der Fibrinogenfraktion

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im Plasma in Beziehung steht, wird die Trübung einer trüben Lösung, die durch eine Arbeitsweise in der gleichen Weise wie vorstehend unter Anwendung eines Standardplasmas erhalten wurde, gemessen und eine Eichkurve aufgestellt. Die Menge an Fibrinogen, Fibrinogenfraktion 1 oder Fibrinogenfraktion 2 im Plasma kann leicht durch eine Untersuchung der gemessenen Trübung gegenüber der Eichkurve erhalten werden.

Beispiele für bekannte Proteinbestimmungsverfahren umfassen das Folin-Lowry-Verfahren, ein Gewichtsverfahren oder ein absorptiometrischen Ultraviolettverfahren.

Falls die vorstehende Folin-Lowry-Methode angewandt wird, kann die Bestimmung in folgender Weise ausgeführt werden.

Das erhaltene unlösliche Material wird nach einem gewöhnlichen Feststoff-Flüssigkeits-Trennvex'fahren, wie Zentrifugalabtrennung oder Filtration, abgetrennt und gewonnen. Das unlösliche Material wird in einer alkalischen Lösung gelöst und der Tyrosingehalt der Lösung wird nach dem Folin-Lowry-Verfahren (Lowry, I.H. und Mitarbeiter, J. Biol. Chera., Band 193, Seite 265 bis 275 (1951)), welches ein kolorimetrisches Verfahren darstellt, gemessen und Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten werden bestimmt. Gewünscht en falls können vor der Auflösung des abgetrennten unlöslichen Materials in der alkalischen Lösung die in der wässrigen an dem unlöslichen Material anhaftenden Lösung gelösten nicht-gerinnbaren Proteine nach der Feststoff-Üüssigkeits-Trennung durch ein Reinigungsverfahren entfernt werden, beispielsweise durch Wäsche mit einer wässrigen Lösung der zur Erzielung des unlöslichen Materials eingesetzten Aminocarbonsäure oder durch Auflösung des unlöslichen

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Materials erneut in einem wässrigen Medium und Einwirkung von Thrombin auf die Lösung zur selektiven Ausfällung und Abtrennung des Fibrinogens oder dessen Bestandteilskomponenten.

Das Gewichtsverfahren kann in folgender Weise ausgeführt werden. Zum Beispiel wird das unlösliche Material in der gleichen Weise wie beim FoIiE-Lowry-Verfahren abgetrennt und gewonnen und dann vorzugsweise unter Anwendung solcher Massnahmen, wie Filtration unter verringertem Druck, wird das flüssige an dem unlöslichen Material anhaftende Material so vollständig als möglich entfernt. Dann wird es zu einem konstanten Gewicht nach einem gewöhnlichen Verfahren zur Trocknung der Proteine getrocknete * Durch Bestimmung des Gewichtes des getrockneten Materials mit einer geeigneten Wägevorrichtung wird der Gehalt an Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten bestimmt. Wenn es unmöglich ist, die Trocknung vollständig auszuführen, wird der Wassergehalt des getrockneten Materials nach einem geeigneten Wassergehalt sme ssverfahren, wie dem Trockengewichtverringerungsverfahren oder dem Karl Fischer-Verfahren^gernessen und das Gewicht des getrockneten Produktes kann als wasserfreies Material unter Berücksichtigung des gemessenen Wassergehaltes berechnet v/erden. Falls andere Materialien als Wasser, beispielsweise die Aminocarbonsäure, im getrockneten Material verbleibt, werden die Mengen derartiger verbliebener" Materialien nach geeignetem Verfahren ermittelt und der Gehalt an Fibrinogen oder dessen Komponenten kann durch Subtraktion der Mengen dieser verbliebenen Materialien von der Menge des getrockneten Materials ermittelt werden.

Das absorptiometrische Ultraviolettverfahren kann in

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folgender Weise ausgeführt werden. Zum Beispiel wird das unlösliche Material in der gleichen Weise wie im Fall des Folin-Lowry-Verfahrens abgetrennt und gewonnen und dann in einem wässrigen Medium gelöst. Dann wird die Absorption im Ultraviolettbereich der Lösung gemessen. Die Absorption wird bevorzugt bei einer Wellenlänge von 280 nm bestimmt. Vor dem vorstehenden Verfahren können die an dem abgetrennten unlöslichen Material anhaftenden _} in der wässrigen Lösung gelösten nicht-gerincbaren Proteine wie im Fall des Folin-Lowry-Verfahrens entfernt werden.

■ Das Thrombinzextverfahren und das nephelometrische Fibrinverfahren sind ebenfalls als Verfahren zur Bestimmung des Fibrinogens zu erwähnen.

Das -rhrombinzeitvorfahren kann in folgender Weise ausgeübt werden. Das unlösliche Material wird beispielsweise nach dem gleichen Verfahren wie beim Folin-Lowry-Verfahren abgetrennt und gewonnen und dann erneut in einem wässrigen Madium gelöst. Dann wird die Lösung dem Clauss-Throrabin-Zeitverfahren (Clauss, A: Acta Haemat., Band 17, Seite 237 bis 246 (1957)) zur Bestimmung des Gehaltes «ua Fibrinogen, Fibrinogenfraktion 1 oder Fibrinogenfraktion 2 unterworfen. Zur Bestimmung der Throrabinzeit können sämtliche Verfahren, zur Messung der Blutkoegulierzeit angewandt werden.

Die Fibrinnephelometrie kann in folgender Weise ausgeführt werden. Das erhaltene unlösliche Material wird beispielsweise in der gleichen Weiae wie beim Folin-Lowry-Verfahren abgetrennt und gewonnen und in einem wässrigen Medium gelöst. Die Lösung wird nach dem Verfahren von Ellis

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und Mitarbeiter unter Anwendung von Thrombin (Ellis, B. C. und Mitarbeiter, J. Lab. Clin. Med., Band 58, Seite ^77 bis 488 (1961)) oder dem Verfahren von Hershgold und Mitrbeiter unter Anwendung von Eeptilase (Bezeichnung eines "Produktes der AbbotrbCo.) (Hershgold, E. J. und Mitarbeiter, J. C. P., Band 63, Seite 231 bis 236 (1975) behandelt.

Geraäss der Erfindung kann der nach der Abtrennung von Fibrinogen oder dessen Bestanöteilskomponenten hinterbliebene Eü..,kstand als Probe zur Bestimmung von FDP im Plasma verwendet werden.

Die Bedeutung und der Effekt von FDP sind nachfolgend beschrieben.

FDP bezeichnet einen allgemeinen Ausdruck für Abbauprodukte des Fibrins und des Fibrinogens, die durch fibrinolytische Einwiricung von Plasmin gebildet wurden. Es wird behauptet, dass diese Abbauprodukte einen wichtigen Einfluss auf das DIC-Syndrom, Thrombose oder hämorrhagische Krankheiten, welche auf eine Störung des Koagulations-Fibrinolysesystems des Blutes zurückzuführen sind, bakterielle Infektionen, Krebs, Leberkrankheiten oder Nierenkrankheiten hat. FDP umfasst das Fragment X (Molekulargewicht etwa 260 000) und das Fragment ϊ (Molekulargewicht etwa 160 000), die als frühstufiges FDP bezeichnet werden, sowie das Fragment D (Molekulargewicht etwa 85 000) und das Fragment E (Molekulargewicht etwa 57 000), die als spätstufiges FDP bezeichnet werden, wenn sie nach dem Verlauf der Fibrinolyse klassifiziert werden. Sie haben eine Wirkung zur Hemmung von Thrombin oder eine Wirkung zur Hemmung der Polymerisation des Fibrinmonomeren. Die Fragmente X und Y

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besitzen besondere Beachtung, da ihre Hemmwirkungen stark sind. Die Bestimmung dieser Fragmente stellt eine wertvolle Massnahme zur Diagnose der vorstehenden Krankheiten dar.

FDP wird zur Zeit in zahlreichen Fällen nach verschiedenen immunologischen "Verfahren bestimmt, die die Eigenschaft des FDP ausnützen, mit einem Anti-Fibrinogen-Antikörper zu reagieren und das Serum wird üblicherweise als Versuchsprobe verwendet. Das Fragment X als frühstufiges FDP liegt nicht im Serum vor, da die Hauptmenge hiervon durch Thrombin geronnen ist. Der unter Anwendung des Serums bestimmte FDP-Wert ist deshalb niedriger als der tatsächliche FDP-Wert im Blut, so dass ein grosser Fehler entsteht.

Falls das Fibrinogen aus dem Plasma gemäss der Erfindung zu entfernen ist, kann das Fibrinogen von dem Fragment X schärfer abgetrennt werden. Deshalb enthält der Rückstand mehr Fragment X als die üblichen Serumproben und ist völlig frei von Fibrinogen.

Infolgedessen kann unter Verwendung des auf Grund Abtrennung des Fibrinogens oder dessen Komponenten erhaltenen Rückstandes als Probe zur Bestimmung von FDP ein näher zum echten FDP-Wert im Blut Ixegender FDP-Wert festgestellt werden, was weit günstiger für die Frühdiagnose von fibrinolytisehen Störungen ist. Einige Ausführungsformen der FDP-BeStimmung unter Anwendung der vorstehenden Probe sind nachfolgend beschrieben.

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Ausbildungsform (A.)

Ein aus Fibrinogen aufgebautes unlösliches Material, welches durch Kontaktierung von Plasma mit einer wässrigen Losung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel (I) in Gegenwart eines IonenstärkeSteuerungsmittels, welches zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf 1 bis etwa 2,2 fähig ist, gebildet wurde, wurde aus dem System nach einem bekannten Abtrennverfahren, wie Zentrifugalabscheidunp; oder Filtration, abgetrennt und entfernt. Der Rückstand wurde verdünnt oder konzentriert, nachdem er gewünschtenfalls beispielsweise durch Dialyse gereinigt worden war. Dann wurde der FD'c'-Gehalt der hergestellten Probe nach den bekannten immunologischen FDP-BeStimmungsverfahren, wie der Latexagglutinierreaktion (Gravey, M= B. und Black, J.M., J, Clin. Patholo, Band 25, Seite 680 bis 682, 1972) oder der . Erythrocytenagglutinierhemmreaktion (Michio Fujimaki, Shojiro Ikematsu and Yuriko Baba, Blood and Vessels, Band 5, Seite 1015 bis 1020, 1974-) oder anderen bekannten FDP-Bestimmungsverfahren, wie dem Streptococcus-Agglutiniertest (Kaneo Yamada, Zenzaburo Yamada, Natsuhei Nakazawa, Takashi Meguro, Clinical Blood, Band 13, Seite 4-11 bis 4-14-, 1972) bestimmt.

Ausbildungsform (B)

Das Plasma wird mit einer wässrigen Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel (I) in Gegenwart eines Ionenstärke steuerungsmittels, welches zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf etwa 0,02 bis weniger als 1 fähig ist, kontaktiert. Das aus der Fibrinogenfraktion aufgebaute erhaltene unlösliche Material wird von dem System nach einem bekannten Trennverfahren, wie Zentri-

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fugalabScheidung oder Filtration, abgetrennt und entfernt. Ein Ionenstärkesteuerungsmittel wird zu dem Rückstand zur Einstellung von dessen Ionenstärke auf etwa 1,1 bis etwa 1,6 zugesetzt und das aus der Fibrinogenfraktion 2 aufgebaute erhaltene unlösliche Material wird nach der gleichen Arbeitsweise, wie im Fall der Abtrennung der Fibrinogenfraktion 1 abgetrennt und entfernt. Der erhaltene Bückstand wird verdünnt oder konzentriert, nachdem er gegebenenfalls nach solchen Verfahren wie Dialyse, gereinigt wurde. Der FDP-Gehalt des Rückstandes kann dann nacb den bekannten Verfahren, wie sie vorstehend in Verbindung mit der Ausbildungsform (A) bescbxisbeu wurden, ermittelt werden.

Gemäss der Erfindung ergibt sich auch ein Reagens zur Herstellung oder bestimmung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten in einer wässrigen fibrinogenhaltigen Lösung, wobei dieses Reagens mindestens eine Aminocarbonsäure der formel (I) und ein Ionenstärke steuerungsmittel umfasst. Das Reagens kann vorteilhafterweise sowohl zur Abtrennung von ?ibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten als auch zur Bestimmung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilskompcnenten im Plasma verwendet werden. Der hier verwendete Ausdruck "Reagens" umfasst also diagnostische Mittel für die Diagnose von Leberkrankheiten und von auf Koagulierstörungen des Blutes zurückzuführenden Krankheiten.

Bevorzugt enthält das Reagens ein Ionenstärkesteuerungsmittel von solcher Art und in solcher Menge, dass die Ionenstärke des Systems auf den vorhergehend angegebenen Wert in Verbindung mit dem Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten zum Zeit-

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punkt des Kontaktes der fibrinogenhaltigen wässrigen Lösung mit dem Reagens beschriebenen Wert eingestellt wird« Ferner enthält das Reagens gemäss der Erfindung mindestens eine Aminocarbonsäure aus der Gruppe von Glycin, ß-Alanin und γ-Aminobuttersäure in solcher Menge, dass sich die vorstehende Konzentration im System zur Zeitpunkt der Kontaktierung des fibrinogenhaltigen wässrigen Lösung mit dem Reagens einstellt. Selbstverständlich kann das Reagens auch in konzentrierter J¹Orra vorliegen, die in geeigneter Weise mit einem wässrigen Medium vor dem Gebrauch verdünnt wird.

Das Reagens kann in Form einer "Flüssigkeit oder eines Feststoffes sein. Beispielsweise kann es aus einer wässrigen Lösung bestehen, die mindestens eine Aminocarbonsäure der Formel (I) und ein Ionenstärkesteuerungsmittel enthält oder sie kann aus einem Pulver bestehen, welches die beiden Komponenten in Pulverform enthält. Es kann auch in anderen Feststofformen wie als Granulat, Pellets, Tablette oder Flocken vorliegen» Alternativ kann es auch aus einem Päckchen bestehen, welches aus einem Satz der beiden Komponenten aufgebaut ist, die getrennt oder gleichzeitig in flüssiger oder fester Form vorliegc-n. Pas Reagens zur Diagnose liegt vorzugsweise in der Form vor, dass das Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten in einer bestimmten Menge der Plasmaprobe unmittelbar durch Auflösung einer bestimmten Menge eines festen Reagens, beispielsweise Tabletten, oder eines flüssigen Reagens, beispielsweise einer Lösung in einer Ampulle, bestimmt werden können.

Die vorstehenden und zahlreichen weiteren ähnlichen Ausführungsformen sind für den Fachmann selbstverständlich

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und liegen in dem Bereich des Reagens gemäss der Erfindung.

Gewünschtenfalls kann das vorstehende Reagens geraäss der Erfindung ein pH-Steuerungsmittel, ein Antiseptikum, einen Stabilisator oder andere Hilfsmittel enthalten. Das pH-Steuerungsmittel ist vorteilhafterweise von solcher Art und liegt in solcher Menge vor, dass der pH-Wert des Systems auf den vorstehenden bevorzugten pH-Bereich eingestellt wird, wenn das Reagens mit der PlasmaprcDe kontaktiert wird. Beispiele für pH-Steuerungsmittel umfassen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure und Zitronensäure, Alkalien, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Natriumhydrogencarbonat und Natriumcarbonat, und Puffer, wie Essigsäure-Natriumacetat, Phosphorsäure-Natriumphosphat, Zitronensäure-Natriumeitrat und Salzsäure-Barbi:alnatrium.

Beispiele für antiseptische Mittel sind Natriumazid, Benzoesäure, Benzoesäuresalze, Phenol und Natriummerthiolat.

Stabilisatoren umfassen beispielsweise Triton-X (Produkt der Rohm & Haas Co.) und Polyathylenglykol.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung im einzelnen. Selbstverständlich dienen diese Beispiele lediglich zur Erläuterung und verschiedene Änderungen und Modifikationen sind im 3ereich der vorliegenden Erfindung möglich.

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-AS-

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Beispiel 1

Zu 150 ml eines mit Zitronensäure versetzten menschlichen Plasmas wurden unter Rühren 1,5 1 einer wässrigen 2,1M-Lösung von Glycin (pH 6,2) zugesetzt, deren Tonenstärke auf 0,1 mit Natriumchlorid eingestellt worden war und das Gemisch wurde bei 25° C während 15 Minuten stehengelassen» Dann wurde der erhaltene Niederschlag aurch ein Glasfilter abfiltriert. Der Niederschlag wurde, mit 50 ml

einer vjässrigen Glycinlösung (2,1 M, Ionenstärke = 0.1, pH- 6,2) gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wurde dann in 35 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4· und einer Ionenstärke von 0,15 gelöst und 350 ml der vorstehenden Glycinlösung (2,1 M, Ionenstärke = 0,1, pH 6,2) wurden allmählich unter Rühren zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 25° G während 15 Minuten stehengelassen. Der Niederschlag wurde abfiltriert und erneut in 35 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 und einer Ionenstärke von 0,15 gelöst, der 0,01 M an trans-p-Aminomethylcyclohexancarbonsäure (AMCHA) enthielt. Die Lösung wurde gegen 500 ml eines Phosphatpuffers (Gehalt 0,1 M AMCHA, pH 7,4, Ionenstärke 0,15) während 24 Stunden unter Anwendung eines Visking-Dialyserohrs dialysiert und dann lyophilisiert, wobei 102 mg eines weissen Pulvers erhalten wurden.

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des erhaltenen Pulvers zeigte, dass es lediglich aus dsr Fibrinogenfraktion 1 bestand.

Beispiel 2

Zu 20 ml menschlichem ACD-Plasma wurden allmählich 200 ml einer wässrigen 2,8 M-Lösung von γ-Aminobutteisäure

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zugesetzt, deren Ionenstärke auf 0,3 und deren pH-Wert auf 6,5 mit Phosphatpuffer eingestellt worden war. Das Gemisch wurde bei 20° C 15 Minuten stehengelassen und dann während 15 Minuten mit 3500 U/Min, zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert. Der Niederschlag wurde zweimal mit 5 ml der vorstehenden wässrigen γ-Aminobuttersäurelösung gewaschen und bei 30° C unter verringertem Druck getrocknet, so dass 23 n des getrockneten Produktes erhalten wurden.

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektropborse des erhaltenen Produktes zeigte, dass es lediglich aus der Fibrinogenfraktion 1 bestand.

Beispiel 3

1 g menschliches Fibrinogen (Qualität L, Produkt der Kabi Company) wurde in 100 ml Wasser gelöst. Zu der erhaltenen wässrigen Lösung wurden allmählich 100 ml einer wässrigen 2-25 M-Lösung von ß-Alanin zugegeben, deren Ionenstärke mit Kaliumchlorid auf 0,2 eingestellt war und deren pH mit Natriumhydroxid auf 6,5 eingestellt war. Das Gemisch wurde bei 15° C während 15 Minuten gehalten. D?s erhaltene unlösliche Material wurde während 15 Minuten mit 10 000 U/Min, zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und das unlösliche Material wurde zweimal mit 20 ml des gleichen ß-Alaninlösung wie vorstehend gewaschen, in 100 ml physiologischer Salzlösung gelöst und dann im gefrorenen Zustand gelagert. Nach dem Folin-Lowry-Verfahren wurde die Ausbeute der Fibrinogenfraktion 1 zu 310 mg bestimmt. Bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte die dabei erhaltene Fibrinogenfraktion 1 nur ein einziges Band.

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Beispiel 4

350 mg menschliches Fibrinogen (Qualität L, Produkt der Kabi Company) wurden in 35 ωΐ Wasser gelöst. Zu der Lösung wurden allmählich 35O ml einer wässrigen 2,5 M-Lösung von ß-Alanin zugegeben, deren Ionenstärke auf 0,2 mit Ammoniumchlorid eingestellt war. Das Gemisch wurde bei 25° C während 15 Minuten gehalten. 25,6 g Natriumchlorid wurden zu der nach der Entfernung des löslichen Materials hinterbliebenen überstehenden Flüssigkeit zugesetzt. Das erhaltene unlösliche Material wurde mit 10 000 U/Min, während 15 Minuten gesammelt und mit 10 ml einer wässrigen 2,5 M-Lösung von ß-Alanin mit einer lonenstärke von 1,5 und einem pH von 6,5 gewaschen. Das gewaschene unlösliche Material wurde in einem Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 Λ und einer Ionenstärke von 0,2 gelöst und lyophilisiert und lieferte 66 mg eines getrockneten Produktes.

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese des Produktes zeigte, dass es lediglich aus der Fibrinogenfraktion 2 bestand.

Beispiel 5

Natriumacetat wurden zu 50 ml mit Heparin versetztem menschlichem Plasma zur Einstellung von dessen Ionenstärke auf 2,6 zugesetzt. Dann wurden 100 al einer wässrigen 3,5 M-Lösung von γ-Aminobuttersäure mit einem pH-Wert von 6,3 zugesetzt und das Gemisch bei 20° C während 30 Minuten stehengelassen. Das erhaltene unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren des Gemisches bei 3OOO TJ/Min. während

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15 Minuten abgetrennt. Das unlösliche Material wurde in 10 ml physiologischer Salzlösung gelöst und die Ionenstärke der Lösung auf 0,2 mit Ammoniumsulfat eingestellt. Dann wurden 100 ml einer wässrigen 2,3 M-Lösung von Glycin mit einem pH-Wert von 6,5 zugesetzt und das erhaltene .'κ unlösliche Material wurde abzentrifugiert. Zu der über- /•■■9 ^Stehenden Flüssigkeit .wurden 8,36 g Natriumchlorid zuge- \%- >;-y geben. Die erhaltene Bcrsttng* wurde bei

■ ■*'?/ geben. Die erhaltene Bcrsttng* wurde bei 20 C während /.; .<;'/ 15 Minuten stehengelassen und die ausgefällte Fibrinogenfraktion 2 *'arde gesammelt. Die Ausbeute betrug 20 mg.

Die dabei erhaltene Fibri.nogenfraktion 2 zeigte ein einziges Band bei der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.

Beispiel 6

50 ml einer wässrigen 2,3 M-Lösung von Glycin (pH 6,0), deren Iona^stärke auf 1,4 mit Natriumchlorid eingestellt worden war, wurden zu 10 ml von mit Zitronensäure versetztem menschlichem Plasma zugesetzt und die Lösungen vermischt. Das Gemisch wurde bei 25° C 5 Minuten stehengelassen und dann während 15 Minuten bei 3500 U/Min, zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt und der Niederschlag gut mit 50 ml der gleichen wässrigen Glycinlösung wie vorstehend vermischt. Das Gemisch wurde erneut mit 3500 U/Min, während 15 Minuten zur Abtrennung des Niederschlages zentrifugiert. Die Gerinnbarkeit des erhaltenen Fibrinogens betrug 92 %.

Beispiel 7

Handelsübliches menschliches Fibrinogen mit einer Gerinnbarkeit von 55 % wurde in Wasser zur Bildung einer

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wässrigen Lösung gelöst, die das Fibrinogen in einer Konzentration von 600 rag/dl enthielt. 200 ml einer wässrigen 2,5 M-Lösung von ß-Alanin (pH 6,0), deren Ionenstärke auf 1,4 mit Natriumchlorid eingestellt worden war, wurden zu 10 ml der erhaltenen wässrigen Fibrinogenlösung zugesetzt und die Lösungen wurden vermischt. Nach Stehenlassen bei 37° C während 10 Minuten wurde das Gemisch bei 3500 U/Min. während 15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wur.de entfernt. Der Niederschlag wurde mit 100 ml der gleicher» wässrigen ß-Alaninlösung gewaschen und während 15 Minuten bei 3500 U/Min, zentrifugiert. Die Gerinnbarkeit des erhaltenen Fibrinogens betrug 96 %.

Beispiel 8

Zu 50 ml eines mit Heparin versetztem menschlichem Plasmas wurden 250 ml einer wässrigen 2,8 M-Lösung von γ-Aminobuttersäuro (pH 6,1) zugegeben, deren Ionenstärke auf 1,5 mit Kaliumchlorid eingestellt worden war, und die Lösungen gut vermischt. Das Gemisch wurde bei 25° C während 10 Minuten stehengelassen und dann der Niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wurde in 50 ml Wasser gelöst und 250 ml der gleichen wässrigen Lösung von γ-Aminobut-tersäur« wie vorstehend wurden zugesetzt. Es wurde gut vermischt und das Gemisch 10 Minuten bei 25° C stehengelassen. Dann wurde der niederschlag abfiltriert. Der Niederschlag wurde in etwa 10 ml Wasser gelöst und gegen -physiologische Salzlösung bei 5° C über Nacht in einem Visking-Cellophanrohr dialysiert und dann lyophilisiert. Das erhaltene getrocknete Pulver, enthielt 75 mg Fibrinogen (bestimmt nach dem Folia-Lowry-Yeriahren). Seine Gerinnbarkeit betrug 93 %.

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Beispiel 9

172,6 g Glycin, 5,84 g Natriumchlorid, 1,05 g Kaliumphosphat (einbasisch) und 4,37 S Natriumphosphat (zweibasisch) wurden in destilliertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml (Versuchsreagens) gelöst.

Plasmaartige Probelösungen mit variierenden Gehalten der Fibrinogenfraktion 1 wurden durch Zusatz variierender Mengen der in Beispiel 3 erhaltenen iibrinogenfraktion und 60 mg/dl der in Beispiel 4 erhaltenen Fibrinogenfraktion 2 zu menschlichem Serum hergestellt. Jede dieser Probelösungen wurde in einer Menge von 0,2 ml zu 2,0 ml des vorstehend hergestellten Versucnsreagens zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 3 Minuten stehen-gelassen. Dann wurde die Absorption der Lösung bei 340 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I enthalten.

Tabelle I

Gehalt der Fibrinogen- Absorption bei

fraktion 1 (mg/dl) 340 nm

50 0,065

100 0,135

200 0,270

400 0,540

600 0,810

800 1,08

Eine Eichkurve, die auf der Basis der gemessenen

Werte aufgetragen wurde, zeigte einen linearen Verlauf.

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-yf-

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Die trübe Lösung wurde nach der Messung der Trüb sit während 15 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 10 000 U/Min, zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit und der Niederschlag wurden durch SDS-PoIyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Es wurde gefunden, dass der Niederschlag lediglich die Fibrinogenfraktion enthielt und dass die überstehende Flüssigkeit vollständig frei von der Fibrinogenfraktion 1 war.

Beispiel 10

222,7 S ß-Alanin und 111,3 g Kaliumchlorid wurden in destilliertem Wasser zur Bildung von 1000 ml einer Lösung gelöst. Unter Anwendung dieser Lösung als Versuchsreagens wurde die Fibrinogenfraktion 2 bestimmt.

Plasmaaartige Probelösungen mit verschiedenen Gehalten der Fibrinog^nfraktion 2 wurden durch Vermischen verschiedener Mengen der in Beispiel 5 erhaltenen Fibrinogenfraktion 2 und 150 mg/dl der in Beispiel 1 erhaltenen Fibrinogenfraktion 1 mit menschlichem Plasma hergestellt. Jede dieser Probelösungen wurde in einer Menge von 0,8 ml zu 8,0 ml des in der vorstehenden Weise hergestellten Probereagens zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 25° C 3 Minuten stehengelassen und dann bei 10 000 U/Min, während 15 Minuten zentrifugiert. Dar Niederschlag wurde gesammelt und zweimal mit 3 öl äes vorstehenden Versuchsreagens gewaschen. Dann wurden 2,5n-Natriumhydroxid zugesetzt und die Menge der Fibrinogenfraktion 2 wurde nach dem Folin-Lowry-Verfahren bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II enthalten.

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Tabelle II

Menge der zugesetzten Gehalt der nach dem Folin-Fibrinogenfraktion 2 Lowry-Verfahren bestimmten

(mg/dl) Fibrinogenfraktion

(mg/dl)

50 48

100 102

150 145

200 201

250 248

300 300

Die zugesetzte Fibrinogenfraktion 2 zeigte ein Gewinnunangsverhältnis von nahezu 100 % in sämtlichen Mengen, wenn das durch ß-Alanin ausgefällte Protein nach dem Folin-Lowry-Verfahren bestimmt wurde.

Beispiel 11

Zu 2,0 ml einer wässrigen 2,3 M-Lösung von Glycin, deren Ionenstärke auf 1,4 mit Natriumchlorid eingestellt worden war, wurden 0,2 ml jeder von verschiedenen Plasmaproben mit unterschiedlichen Mengen an Fibrinogen zugesetzt, die nach dem Tyrosinverfahren bestimmt worden waren (Izumi Kanai und Masamitsu Kanai, ed., Essentials of Clinical Testing Methods, 25- Auflage, VII-24-). Das Gemisch wurde bei 25° C während 3 Minuten stehengelassen und die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 340 nm ermittelt.

Als Leertest wurden 2,0 ml Natriumchlorid mit einer Ionenstärke von 1,4 zu 0,2 ml jeder der vorstehend beschrie-

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benen Plasmaproben zugesetzt und die Absorption der Lösung wurde in der gleichen Arbeitsweise im Fall der Anwendung der wässrigen Glycinlösung gemessen. Für jedes der verschiedenen Plasmen mit unterschiedlichen Konzentrationen wurde die durch Subtraktion der Absorption im Leertest von der durch die wässrige Glycinlösung verursachten Ab- _tt, n. sorption erhaltene Differenz auf den Achsen |>der Ordinaten aufgetragen und der Fibrinogengehalt (mg/dl) auf der Achse des Abszisse zum Zeichnen der Eichlinie, welche in Fig. 11 der beiliegenden Zeichnungen gezeigt ist, ermittelt. Gemäss Fig., Ί1 zeigt die Beziehung eine Linearität innerhalb eines Fibrinogengehalts von 0 bis 1000 mg/dl.

Zehn Versuchsproben eines ACD-Plasmas, welches von acht Menschen genommen worden war, wurde auf den Fibrinogengehalt nach einem nepb.elometrischen Verfahren unter Anwendung einer wässrigen Glycinlösung unter den gleichen Versuchsbedingungen wie vorstehend und gleichfalls nach dem Tyrosinverfahren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III und Fig. 12 aufgeführt.

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	Tabelle III	(ms/dl)
Versuchs	Fibrinogengehalt	Tyrosin-
probe Nr.	Erfindungs-	verfahren
	gemässes Verfahren	224
1	218	194
2	195	229
3	230	365
4	378	249
5	271	293
6	312	326
7	298	120
8	102

Auf der Basis der Ergebnisse von Tabelle III und Pig. 12 wurde die Korrelation der bestimmten Werte beim erfindungsgemässen Verfahren (durch nephelometrie) und dem Tyrosinverfahren untersucht. Es wurde eine hohe Korrelation entsprechend einem Korrelationskoeffizienten γ von 0,980 ermittelt.

Beispiel 12

Jede von drei Plasmaproben mit unterschiedlichen Fibrinogengehalten wurde in einer Menge von 0,2 ml au einer wässrigen 2.5 M-Losung (2,0 ml) von ß-Alanin zugesetzt, deren Ionenstärk/* auf 1,4 mit Kaliumchlorid eingestellt worden war. Das Gemisch wurde bei 25 C während 3 Minuten stehengelassen und wie in Beispiel 11 wurde der Fibrinogengehalt nach dem erfindungsgemässen Verfahren (durch Nephelometrie) ermittelt, wie in Beispiel 11 beschrieben.

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Getrennt wurden die gleichen drei Plasmaproben auf den Fibrinogengehalt durch Ammoniumsulfat-Nephelometrie (Parfetnjev. I.A. und Mitarbeiter, Arch. Bioehem., Band 46, Seite 470, 1953) bestimmt.

Bei den vorstehenden beiden Verfahren wurde die Bestimmung zehnmal bei jeder Plasmaprobe wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV enthalten.

Die -Ergebnisse zeigen, dass die Messgenauigkeit beim erfindungsgemässen Verfahren (Nephelometrie) besser ist als bei der Ammoniumsulfat-Nephelometrie.

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Tabelle IV

	Fibrinogengehalt im	3	C	Plasma	(mg/dl)	B	C
	Erfindungsgemässes Verfahren	307	668		305	65*
Plasma Bestimmung	A	295	637	Ammoniumsulfat- Nephelometrie	279	620
1	114	297	648	A	284	657
2	99	280	637	106	302	■637
3	94	301	660	108	309	672
4	108	308	683	108	315	664
5	106	292	657	134	307	647
6 .	96	289	655	121	300	624
7	104	293	655	98	304	661
8	96	291	643	118	300	693
9	97	297,3	654,3	98	300,5	652,9
10	100	8,4	14,2	109	1'I1O	22,1
Durchschnitt	101,4	2,8	2,2	114	3,7	3,4
S.D.	6,4	Beispiel 1?	111,4
CV (%)	6,3	10,9
		9,8

Eine Lösung mit einem künstlich hergestellten Fibrilolysezustana wurde nach dem nachfolgend abgehandelten Verfahren als FDP-haltige Versilchslösung hergestellt. FDP wurde unter Anwendung diese Probelösung bestimmt.

Zu 5 ml einer wässrigen Lösung von menschlichem Fibrinogen (Qualität L, Produkt der Eabi Company) (Gehalt 900 mg/dl Fibrinogen) wurden 0,2 ml Urokinase (24 000 Ein-

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300U35

heiten/ml)zugesetzt und bei 37° C während 15 Minuten umgesetzt. Dann wurden 5 ml einer wässrigen 0,1 M-Lösung A^; von trans-p-Aminomethylcyclocarbonsäure und Prasylol (2500 KIU) als Antiplasminmittel zugegeben.

Zu 1 ml der erhaltenen Lösung wurden 10 ml einer wässrigen 2,3 M-Lösung von Glycin (pH 6,0), deren Ionenstärke auf 1,5 mit Natriumchlorid eingestellt worden war, zugegeben und das'Gemisch bei 20° C während 10 Minuten stehengelassen. Das erhaltene unlösliche Material, das aus Fibrinogen bestand, wurde durch Zentrifugieren bei 10 000 ü/Min. während 15 Minuten entfernt. 0,1 ml der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden genommen und mit verschiedenen Konzentrationen unter Anwendung von "FDPL-Test" (Latexreagenspäckchen zur FDP-ßeStimmung, Produkt der Teikoku Hormone Mfg., Co., Ltd.) verdünnt. Der FDP-Gehalt wurde durch Untersuchung der Agglutinierungsreaktionen ermittelt. Ein Teil der überstehenden Flüssigkeit wurde genommen und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.

Getrennt wurde 1 ml der Probelösung mit 10 ml physio logischer Salzlösung verdünnt und 40 Einheiten Thrombin zugesetzt und bei 37° C während 1 Stunde umgesetzt. Das erhaltene Fibrin wurde durch Zpatrifugation während 12

Minuten bei 3000 U/Min, entfernt. 0,1 ml der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden genommen und ihr FDP-Gehalt unter Anwendung von "FDPL-Test" in der gleichen Weise wie vorstehend ermittelt. Ferner wurde ein Teil der überstehenden Flüssigkeit genommen und der Elektrophorese in der gleichen Weise wie vorstehend unterworfen.

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Die nach den vorstehenden beiden Verfahren hergestellten Proben hatten die folgenden FDP-Gehalte.

Tabelle V
Probe FDP-Gehalt ^ug/ml)

Erfindungsgemäss erhaltene

Probe 120 .

Durch Behandlung mit

Thrombin erhaltene Probe 40

Die erhaltenen Densitograrame sind in Fig. 13 (D (Versuchslösung), Fig. 14 (nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Probe) und Fig. 15 (durch Behandlung mit Thrombin erhaltene Probe) gezeigt.

Die Ergebnisse der Bestimmung zeigen, dass mit der nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Probe ein etwa dreifach so hoher FDP-Wert als im Fall der durch Behandlung mit Thrombin erhaltenen Probe festgestellt wurde.

Wie sich aus dem Densitogramm der Fig. 14 zeigt, enthält die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene Probe kaum Fibrinogen. Wie klar aus den Fig. 14 und 15 ersichtlich, ist der Gehalt an Fragment X in der nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Probe eindeutig höher als bei der durch Behandlung mit Thrombin erhaltenen Probe und liegt nahe zum gesamten FDP-Wert in der in Fig. 13 gezeigten Versuchslösung.

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300H35

r>7

Beispiel 14

Zu 0,2 ml der gleichen Versuchslösung wie in Beispiel 13 wurden 2,0 ml einer wässrigen 2,5 M-Lösung von ß-Alanin (pH 6,0), deren Ionenstärke auf 0,2 mit Natriumchlorid eingestellt worden war, zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 Miruten bei 20° C stehengelassen. Das erhaltene aus Fibrinogen aufgebaute unlösliche Material wurde durch Zentrifugation bei 10000 U/Min, während 15 Minuten entfernt. Natriumchlorid als Pulver wurde in der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit zur Einstellung ihrer Ionenstärke auf •1,5 gelöst. Die Lösung wurde bei 20° G während 30 Minuten stehengelassen und bei 10 000 U/Min, während 15 Minuten zur Entfernung des Niederschlages zentrifugiert. 0,1 ml des erhaltenen Rückstandes wurden auf verschiedene Konzentrationen versünnt und der FDP-Gehalt wurde unter Anwendung eines Erythrocyten-Agglutinierhemmreaktions-Eeagenspäckchen (Produkt der Wellcome Company) bestimmt. Dabei wurde der FDP-Gehalt der "Versuchslösung zu 50/Ug/ml ermittelt, was gut mit dem in Beispiel 13 bestimmten Wert übereinstimmt.

Beispiel 15

172,6 g Glycin, 85,6 g Ammoniumchlorid und 0,3 g Benzoesäure wurden zu destilliertem Wasser zur Bildung von 1000 ml einer wässrigen Lösung zugesetzt. 2 ml Jeder Lösung für Einzelanwendung wurde jaweils in verschliessbare Behälter zur Bildung des Reagens zur Bestimmung des Fibrinogens gebracht.

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Beispiel 16

222,7 g ß-Alanin, 115,6 g Natriuraacetat, 1,0 g Triton-X und 0,025 g Natriummethiolat wurden in destilliertem Wasser zur Bildung von etwa 900 ml einer wässrigen Lösung gelöst. Der pH-Wert der wässrigen Lösung wurde auf 6,3 mit verdünnter Salzsäure eingestellt. Die Lösung wurde dann mit destilliertem Wasser auf ein Volumen von 1000 ml verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde in 5 ml-Anteilen in Ampullen -B -e --ffl3: eingebracht und die Ampullen wurden versiegelt. Das Reagens wurne zur Bestimmung von Fibrinogen verwendet.

Beispiel 17

172.6 g Glycin, 5,84· g Natriumchlorid, 1,05 g Kaliumphosphat (einbasisch), 4,37 S Natriumphosphat (zweibasisch) und 1 g Natriumnitrit wurden in Wasser gelöst und bildeten 1000 ml einer wässrigen Lösung. Wenn 2,0 ml des erhaltenen Reagens verwendet wurden, und 0,2 ml eines mit Zitronensäure versetzten menschlichen Plasmas zugesetzt wurden, konnte die Fibrinogenfraktion 1 bestimmt werden.

Beispiel 18

222.7 S ß-Alanin und 14,9 g Kaliumchlorid wurden in einem Pulverisierer fein zerteilt und 1,20 g des pulverförmigen Gemisches wurden in 5 ml-Ampullen eingewogen und verschlossen. Sie wurden in 5 ml destilliertem Wasser vor dem Gebrauch gelöst und zur Bestimmung der Fibrinogerifraktion 1 verwendet.

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Leerseite

Claims (16)

Patent an sprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten, dadurch gekennzeichnet, dass eine fibrinogenhaltige Masse mit mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

H₂N(CH₂)_nC0₂H , (I)

worin η eine positive Zahl ist, in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines IonenstärkeSteuerungsmittels kontaktiert wird und mindestens eines der Materialien Fibrinogen, Fibrinogenfraktion 1 und Fibrinogenfraktion 2 gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine fibrinogenhaltige Masse mit mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

H₂N(CH₂)_nC0₂H , (I)

vjorin η eine positive Zahi ist, in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines IonenstärkeSteuerungsmittels, welches zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf etwa 0,02 bis weniger als 1 fähig ist, kontaktiert wird und die erhpJ-tene unlösliche Fibrinogenfraktion 1 abgetrennt und gesammelt wird.

3· Verfahren nach Anspruch 2_: dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenstärke des nach der Abtrennung der Fibrinogenfraktion 1 erhaltenen Rückstandes auf Λ bis etwa 2,2 eingestellt wird und die erhaltene unlösliche Fibrinogenfraktion 2 abgetrennt und gesammelt wird.

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300U15

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine fxbrinogenhaltige Masse mit mindestens einer Aminocarbonsäure der folgenden Formel

H₂N(CH₂)_nC0₂H , (I)

worin η eine positive Zahl ist, in einem wässrigen Medium in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerungsmittels, das zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf 1 bis etwa 2,2 fähig id, kontaktiert wird, und das aus der Pibrinogenfraktion 1 und der Pibrinogenfraktion 2 bestehende erhaltene unlösliche Fibrinogen abgetrennt und gewonnen wird.

5. Vei-fahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die fibrinogenhaltige Masse aus der im Anspruch 4 erhaltenen Fibrinogenfraktion 1 und Pibrinogenfraktion 2 aufgebaut ist.

"bis 5

6. Verfahren nach Anspruch 1^ dadurch gekennzeichnet,

dass eine Aminocarbonsäure verwendet wird, worin η in der Formel (I) die Bedautung 1, 2 oder 3 hat.

7. Verfahren zur Bestimmung der Pibrinogenfraktion im Plasma, dadixrch gekennzeichnet, dass

(i) Plasma mit e einer wässrigen Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

H₂N(CH₂)_nC0₂H . (I)

worin η eine positive ganze Zahl ist, in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerungsmittels, das £ur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf einen Wert, bei der die Fibrinogen-

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300T435

fraktion T ausfällt, fähig- ist, kontaktiert wird_r und

(ii) das erhaltene unlösliche, aus der Pibrinogenfraktion 1 im Plasma aufgebaute Material bestimmt wird.

8. Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenfraktion im Plasma nach Anspruch 7> dadurch gekennzeichnet, dass

(i) Plasma mit einer wässrigen Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

worin η eine positive £?.hl ist, in Gegenwart eines Ionenstärke Steuerungsmittels, das zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf etwa 0,02 bis weniger als 1 fähig ist, kontaktiert wird_v und

(ii) das aus der Pibrinogenfraktion 1 im Plasma aufgebaute erhaltene unlösliche Material bestimmt wird.

9· Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Aminocarbonsäure verwendet wird, worin η in der Formel (I) den Wert 1, 2 oder 3 hat.

10. Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen im Plasma, dadurch gekennzeichnet, dass

(i) Plasma mit einer wässrigen Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

(I)

worin η eine positive Zahl ist, in Gegenwart eines lonenstärkesteuerungsmittels, welches zn? Einstellung der Ionenstärke des Systems auf einen Wert, bei dem Fibrinogen

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300H35

ausfällt, fähig ist, kontaktiert wird und

(ii) das aus dem Fibrinogen im Plasma bestehende erhaltene unlösliche Material bestimmt wird.

11. Verfahren zur Bestimmung von Fibrinogen im Plasma nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass

(i) Plasma mit einer wässrigen Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

H₂N(CH₂)_nC0₂H , (I)

worin η eine positive ganze Zahl ist, in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerungsmittels, welches zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf 1 bic etwa 2,2 fähig ist, kontaktiert wird, und

(ii) das aus dem Fibrinogen ia Plasma bestehende erhaltene unlösliche Material bestimmt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass eine Aminocarbonsäure verwendet wird, worin η in der Formel (I) den Wert 1, 2 oder 3 besitzt.

13· Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenfraktion im Plasma, dadurch gekennzeichnet, dass

(i) die Ionenstärke des nach der Abtrennung des geraäss (i) ia Anspruch 8 gebildeten unlöslichen Materials Hinterbliebenen Rückstandes mit einem Ionenstärkesteueerungsmittel auf einen Wert, bei der die Fibrinogenfraktion 2 ausfällt, eingastellt wird, und

(ii) das aus der Fibrinogenfraktion 2 im Plasma aufgebaute erhaltene unlösliche Material bestimmt wird.

Ü J ü ö 3 0 / 0 8 ? ?

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300Ί4Π5

14-, Verfahren zur Bestimmung der Fibrinogenfraktion im Plasma nach Anspruch 13_S dadurch gekennzeichnet, dass

(i) die Ionenstärke des nach der Abtrennung des unlöslichen gemäss (i) im Anspruch 8 gebildeten Materials hinterbliebenen Rückstaudes auf 1 bis etwa 2,2 mit einem Ionenstärkesteuerungsmittel eingestellt wird, und

(ii) das aus der Fibrinogenfraktion 2 im Plasma aufgebaute erhaltene unlösliche Material bestimmt wird.

15· Probemafcerial zur Bestimmung von Fibrinabbauprodukten und Fibrinogenabbauprodukten in einer wässrigen fibrinogenhaltigen Lösung, dadurch gekenrsoiebnet, dass die Lösung als aktive Bestandteile eneweder (i)aus der durch Kontaktierung einer fibrinogenhaltigen wässrigen Lösung mit einer wässrigen Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

H₂N(CH₂)_nC0₂H , (I)

worin η eine positive ganze Zahl ist, in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerungsmittels, das zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf einen Wert, bei der das Fibrinogen ausfällt, und Entfernung des aus Fibrinogen aufgebauten erhaltenen unlöslichen Materials gewonnenen Rückstandsflüssigkeit oder (2) der bei der Ausführung der Kontaktierung gemäss (1) in Gegenwart eines Iocenstarkesteuerungsmxtcels; welches zur Einstellung der lonenstärke des Systems auf einen Wert, bei dem die Fibrinogenfraktion 1 ausfällt, Entfernung des aus der Fibrinogenfraktion 1 aufgebauten erhaltenen unlöslichen Materials, Einstellung der Ionenstärke des Rückstandes mit einem Ionenstärkesteuerungsmittel auf einen Wert, bei dem die Fibrinogenfraktion 2 ausfällt, und Entfernuag des auf der Fibrinogenfraktion 2 ausgebauten unlöslichen Kareri-ils erhc-Loer-i-i SüclcstandsfLässigkeit besteht„

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16. Probe zur Bestimmung von Fibrinabbauprodukten und Fibrinogenabbauprodukten, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe als aktiven Bestandteil entweder aus (1) einer durch Kontaktierung einer fibrinogenhaltigen wässrigen Lösung mit einer wässrigen Lösung mindestens einer Aminocarbonsäure der Formel

E₂N(CHg)_nCO₂H , (I)

worin η eine positive ganze Zahl if¹", in Gegenwart eines Ionenstärkesteuerungsmittels* das zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf 1 bis etwa 2,2 fähig isε, und Entfernung des erhaltenen unlöslichen aus Fibrinogen aufgebauten Materials erhaltenen Rückstandsflüssigkeit oder (2) einer durch Ausführung der Kontaktierung gemäss (1) in Gegenwart eines IonenstärkeSteuerungsmittels, welches zur Einstellung der Ionenstärke des Systems auf etwa 0,02 bis weniger als 1 fähig ist, Entfernung des erhaltenen aus der Fibrinogenfraktion 1 aufgebauten unlöslichen Materials, Einstellung der Ionenstärke des Rückstandes auf 1 bis etwa 2,2 mit einem Ionensfcärkesteuerungsmittel und Entfernung des erhaltenen, aus der Fibrinogenfraktion 2 aufgebauten unlöslichen. Materials erhaltenen Rückstandsflüssigkeit besteht.

17· Reagens zur Herstellung oder Bestimmung von Fibrinogen oder dessen Bestandteilskomponenten in einer wässrigen fibrinogenhaltigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens mindestens eine Iminocarbonsäure der Formel

C0₂H , (I)

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BAD ORfGINAl

300H35

worin η eine positive Zahl ist, und ein Ionenstärkesteuerungsmittel enthält.

(J 3 C 030/0827